PL224732B1 - Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko - Google Patents
Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białkoInfo
- Publication number
- PL224732B1 PL224732B1 PL395796A PL39579611A PL224732B1 PL 224732 B1 PL224732 B1 PL 224732B1 PL 395796 A PL395796 A PL 395796A PL 39579611 A PL39579611 A PL 39579611A PL 224732 B1 PL224732 B1 PL 224732B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- recombinant
- molecule
- cmti
- proteins
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 79
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 30
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 30
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 20
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 20
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 20
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims description 17
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 14
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 14
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 claims description 13
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 claims description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 42
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 32
- 101100506090 Caenorhabditis elegans hil-2 gene Proteins 0.000 description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 14
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 9
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 8
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 6
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 6
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001083548 Anemone Species 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 3
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 108010027805 Azocoll Proteins 0.000 description 2
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 2
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 2
- 102000015833 Cystatin Human genes 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 244000061322 Nicotiana alata Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 108050004038 cystatin Proteins 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPGCGXIZQYAXHI-JIZZDEOASA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O WPGCGXIZQYAXHI-JIZZDEOASA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000655894 Bos taurus Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 229940122644 Chymotrypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710137926 Chymotrypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 101000997784 Cucurbita maxima Trypsin inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219104 Cucurbitaceae Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 241001489135 Globodera pallida Species 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- 241000255990 Helicoverpa Species 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000933179 Homo sapiens Cathepsin G Proteins 0.000 description 1
- 101000635944 Homo sapiens Myelin protein P0 Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000302512 Momordica charantia Species 0.000 description 1
- 235000009811 Momordica charantia Nutrition 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102100030741 Myelin protein P0 Human genes 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 101100386053 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 235000000255 Solanum americanum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 1
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000219977 Vigna Species 0.000 description 1
- 235000010716 Vigna mungo Nutrition 0.000 description 1
- 240000001417 Vigna umbellata Species 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- 101000831238 Zea mays Cystatin-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000001775 anti-pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010062797 equistatin Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 102000052896 human CTSG Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000005892 protein maturation Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy sposobu wytwarzania w roślinach rekombinowanych białek o zmniejszonej wrażliwości na proteazy serynowe. Celem wynalazku jest otrzymanie rekombinowanych białek reprezentujących inhibitor proteaz serynowych, CMTI I oraz fuzje tego peptydu z białkami docelowymi. Ma to na celu stabilizację wszystkich białek komórki eksprymującej konstrukt lub konkretnego białka, wyprodukowanego jako białko fuzyjne z inhibitorem proteaz.
Proteazy są grupą enzymów hydrolizujących wiązania peptydowe. Występują u wirusów i wszystkich żyjących organizmów począwszy od bakterii po ssaki. Biorą udział w tak ważnych procesach biologicznych jak trawienie, wewnątrzkomórkowy metabolizm, dojrzewanie białek, wzrost oraz różnicowanie tkanek i innych. Ze względu na właściwości ich aktywność musi być ściśle kontrolowana w przeciwnym wypadku może prowadzić do wystąpienia poważnych chorób. Jeden z mechanizmów regulacji to hamowanie ich aktywności przez inhibitory proteaz. Szeroko reprezentowaną grupą inhib itorów są inhibitory proteaz serynowych, do których zaliczają się między innymi te występujące w n asionach roślin z rodziny dyniowatych (Cucurbitaceae) (Otlewski i Krowarsch 1996). Są one małymi białkami złożonymi z 27-33 aminokwasów i mają 3 mostki dwusiarczkowe. Przykładowo można tu wymienić inhibitor elastazy z Momordica charantia (przepękla ogórkowata), MCEI oraz inhibitory trypsyny z następujących roślin: (1) Cucurbita maxima (dynia), CMTI I, CMTI III, CMTI IV, (2) Cucurbita pepo var Giromontia (cukinia), CPGTI I, (3) CPTI II, Cucurbita pepo (patison), CPTI I, CPTI III, (4), Cucumis sativus (ogórek siewny), CST Illb, CSTIIV, (5) Ecbalium elaterium (tryskawiec sprężysty), EETI II (Wieczorek i in. 1985, Otlewski i Krowarsch 1996).
CMTI I został bardzo dobrze scharakteryzowany zarówno pod względem struktury, aktywności jak i mechanizmu działania. Wiadomo, że hamuje aktywność trypsyny bydlęcej i wielu innych medycznie istotnych proteaz serynowych. Badania krystalograficzne oraz z wykorzystaniem magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR ang. Nuclear Magnetic Resonance) zarówno samego inhibitora jak i w kompleksie z trypsyną pozwoliły na dokładne poznanie ich struktury (Holak i in. 1989b, Holak i in. 1989a, Nilges i in. 1991). Jest to bardzo małe białko zbudowane z 29 aminokwasów o masie 3,28 kDa. Trzy mostki dwu-siarczkowe stabilizują i usztywniają cząsteczkę. Należy do grupy kanonicznych inhibitorów proteaz serynowych, które oddziałują z centrum aktywnym proteazy poprzez pętlę wiążąca (Krowarsch i in. 2003). Inhibitory niekanoniczne oddziałują poprzez N-koniec białka. W pętli zlokalizowane jest miejsce aktywne Pi-P-f wiążące peptyd, dla CMTI jest to Arg5-Ile6. W kompleksie CMTI:trypsyna zaobserwowano kilka charakterystycznych oddziaływań jak np. (1) anty-równoległa struktura β kartki (antiparallel β sheet) pomiędzy P1-P3 (Cys3) inhibitora a aminokwasami proteazy 214Ser-216Gly, (2) oddziaływania van der Waales pomiędzy P1 a Ser 195, (3) wiązanie wodorowe pomiędzy P1 a Gly193 i Ser195 (Krowarsch i in. 2003, Otlewski and Krowarsch 1996).
Ponad 15 lat temu sklonowano gen CMTI I w systemie do ekspresji w Escherichia coli (Bolewska i in. 1995). Do sekwencji kodującej CMTI I wprowadzono mutację, która powodowała zmianę am inokwasową Met8>Leu. Zmiana ta była konieczna ze względu na użycie na etapie oczyszczania białka bromocyjanu w celu odcięcia sekwencji poprzedzającej właściwe białko CMTI. Uzyskane w ciałkach inkluzyjnych rekombinowane białko wykazywało aktywność biologiczną w testach z bydlęcą β-trypsyną oraz ludzką katepsyną G. Późniejsze badania wykazały, że wprowadzona mutacja de facto w silnie konserwowanej pozycji aminokwasowej wpływa destabilizująco na strukturę oraz zwijanie białka (Zhukov, Jaroszewski i Bierzyński 2000).
Inhibitory znalazły zastosowanie w biotechnologii roślin. W celu walki ze szkodnikami, pasożytami roślin otrzymano rośliny transgeniczne produkujące inhibitory proteaz hamujące głównie aktywność enzymów trawiennych (Mosolov and Valueva 2008) w przewodzie pokarmowym organizmów żywiących się nimi. Pierwszy opisany przypadek uzyskania roślin transgenicznych z ekspresją „obcego” (pochodzącego z innego organizmu) genu inhibitora pochodzi z roku 1987 (Hilder i in. 1987). Były to rośliny transgeniczne tytoniu Nicotiana tabacum z wprowadzonym genem inhibitora trypsyny CpTl z fasolnika chińskiego (Vigna uniguiculata). Przy stwierdzonym poziomie produkcji rekombinowanego białka w liściach tytoniu na poziomie 1%TSP zauważono, że stopień zniszczenia roślin przez larwy Heliothis virescens jest o 50% niższy w porównaniu z kontrolą. W licznych pracach badawczych uzyskano rośliny transgeniczne tytoniu, ziemniaka, ryżu czy truskawki ze zwiększoną odpornością na różne owady czy nicienie poprzez wprowadzenie genu inhibitorów trypsyny, chymotrypsyny, cystatyny
PL 224 732 B1 z ryżu lub soi i innych (Mosolov and Valueva 2008). Wykazano również, że inhibitory proteaz mogą hamować aktywność proteaz wydzielanych przez grzyby np. Fusarium solani, F. cuimorum. Uzyskano również zwiększoną odporność na patogenne mikroorganizmy np. Pseudomonas solanacearum, Botrytis, cinerea (Charity i in. 2005). Jednak stopień ochrony w otrzymanych do tej pory roślinach transgenicznych jest mniejszy niż uzyskany przy zastosowaniu genu bakteryjnej toksyny Bt (Bacillus thuringiensis) lub chemicznych pestycydów (Mosolov i Valueva 2008). Może to być spowodowane zbyt niską skutecznością działania stosowanych inhibitorów oraz zdolnością adaptacji przewodu pokarmowego insektów do ich obecności np. poprzez nadprodukcję własnych proteaz przeciwko którym działają stosowane inhibitory lub nadprodukcję enzymów innej klasy na które te inhibitory nie działają. Uruchamiane są też mechanizmy, które prowadzą do degradacji inhibitorów. W celu zwiększenia efektywności próbowano stosować inhibitory pochodzące z różnych organizmów lub zmodyfikowane. Wprowadzenie delecji Asp86 w Oc-I (cystatyna I z ryżu; ang. Oryzacystatin I) wyrażanej w kulturze korzeni włośnikowatych pomidora wpływa na zwiększenie zaburzeń wzrostu i rozwoju nicienia Globodera pallida (Urwin i in. 1995). Tworzone były również hybrydowe białka inhibitorów np. inhibitor trypsyny z fasolnika chińskiego CpTI ze zmodyfikowaną Oc-I czy białka złożone z kilku domen zwierzęcych i roślinnych cystatyn z ekwistatyną (Mosolov i Valueva 2008, Urwin, McPherson i Atkinson 1998, Outchkourov i in. 2004). Uzyskano również hybrydy inhibitorów z innymi białkami zaangażowanymi w mechanizm obronny rośliny. Transgeniczny tytoń z jednoczesną ekspresją toksyny Bt i inhib itora CpTI wykazywał większą odporność na insekty w porównaniu z samą Bt toksyną (Mosolov and Valueva 2008). Wykazano również, że współekspresja inhibitorów NaPI (inhibitor trypsyny i chymotrypsyny z N. alata) i StPin1A (typ I inhibitora z Solanum tuberosum) chroni rośliny bawełny przed inwazją Helicoverpa znacznie lepiej niż każdy z inhibitorów osobno (Dunse i in. 2010).
Inhibitory proteaz są również wykorzystywane przy produkcji rekombinowanych białek w roślinnych kulturach zawiesinowych w celu zwiększenia poziomu produkcji i stabilności rekombinowanego białka. Jako przykład można tu podać produkcję przeciwciał monoklonalnych w kulturze zawiesinowej korzeni. Przy współsekrecji inhibitora serynowego typu Bowmana-Birka zaobserwowano znacząco wyższy poziom produkcji rekombinowanego białka wydzielanego do pożywki a także jego większą stabilność (Komamytsky i in. 2006). Ekspresja syntetycznego genu sPI-II posiadającego domenę trypsynową i chymotrypsynową z genu inhibitora serynowego II z N. alata w kulturze zawiesinowej ryżu powodowała zmniejszenie aktywności proteolitycznej do 23% w porównaniu z kontrolą (Kim i in. 2007). Pozytywny wpływ tego inhibitora opisano również przy produkcji ludzkiego czynnika stymulacji kolonii granulocytów i makrofagów (hGM-CSF). Przy współekspresji obu białek otrzymano dwukrotnie wyższy poziom rekombinowanego hGM-CSF wydzielanego do pożywki w porównaniu z transgeniczną kulturą zawiesinową bez ekspresji inhibitora (Kim i in. 2008).
Inhibitory proteaz w tym inhibitory trypsyny i ich zastosowanie były przedmiotem zgłoszeń patentowych. Dotyczą one różnych inhibitorów proteaz serynowych i ich prekursorów w celu zwiększenia odporności roślin na insekty i inne patogeny. Głównie otrzymuje się rośliny transgeniczne z wprowadzonym/i genem/ami inhibitorów proteaz. Stosuje się również uzyskane preparaty inhibitorów w połączeniu z innymi aktywnymi czynnikami np. w walce z roztoczami. Uzyskano roślin y transgeniczne z ekspresją genów inhibitorów proteaz SAPin2a lub SAPin2b z Solanum americanum nie tylko w celu ochrony przed insektami lecz także jako potencjalne czynniki chroniące heterologiczne białka produkowane przy współekspresji. W celu zwiększenia efektywności w walce ze szkodnikami roślin zgłoszono również patent obejmujący produkcję białka fuzyjnego złożonego z dwóch komponentów o aktywności anty-patogennej połączonych linkerem (Atkinson i in. 2005). Część patentów dotyczy zastosowań medycznych inhibitorów proteaz serynowych lub cysternowych np. preparat inhibitora z rodziny Kunitz BTL0.10 w leczeniu chorób związanych z uszkodzeniem narządów przez niekontrolowaną proteolizę np. rozedma płuc, idiopatyczne zwłóknienie płuc, mukowiscydoza, reumatoidalne zapalenie stawów.
Pomimo prowadzonych badań i istniejących do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba stworzenia rozwiązania, które umożliwiałoby otrzymanie rekombinowanych białek reprezentujących inhib itor proteaz serynowych, CMTI I oraz fuzje tego peptydu z białkami docelowymi, dzięki czemu możliwa byłaby stabilizacja wszystkich białek komórki eksprymującej konstrukt lub konkretnego białka, wyprodukowanego jako białko fuzyjne z inhibitorem proteaz.
Nieoczekiwanie udało się uzyskać rozwiązanie dotyczące samego CMTI, jego ekspresji w roślinach, bądź jego fuzji. Badania wyróżnia produkcja w roślinie białka fuzyjnego, składającego się z inhibitora oraz białka docelowego, którego przykładem jest cytokina, czyli białko o znaczeniu terapeutycznym.
PL 224 732 B1
Celem tego sposobu produkcji jest zwiększenie stabilności białka docelowego zarówno podczas ekstrakcji i oczyszczania, jak również w przewodzie pokarmowym po podaniu doustnym.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana molekuła DNA, charakteryzująca się tym że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko posiadające aktywność inhibitora proteaz serynowych oraz cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko docelowe, korzystnie wybrane z grupy obejmującej cytokiny zwierzęce, przy czym pomiędzy sekwencjami kodującymi oba białka znajduje się sekwencja kodująca linker białkowy, przy czym wszystkie wymienione elementy tworzą jedną otwartą ramkę odczytu, przy czym białko posiadające aktywność inhibitora proteaz serynowych stanowi CMTI i określone jest sekwencją SEQ ID NO: 2.
Korzystnie, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi obejmującymi promotor i terminator transkrypcji, aktywnymi w komórce roślinnej, przy czym element regulatorowy stanowiący promotor aktywny jest konstytutywny bądź regulowany.
Korzystnie, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi umożliwiającymi stabilną bądź przejściową ekspresję tego kwasu nukleinowego w k omórce roślinnej.
Korzystnie, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z cząsteczką DNA kodującą peptydy, zdolne do skierowania białka do pożądanego przedziału komórki. Korzystnie, gdy molekuła zawiera sekwencję kodującą czynnik zapewniający ochronę białka docelowego przed proteazami serynowymi zwłaszcza trypsyną.
Korzystnie, gdy molekuła zawiera sekwencję kodującą czynnik zapewniający ochronę egzogennych białek przed proteazami serynowymi, zwłaszcza trypsyną.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że posiada co najmniej jedną rekombinowaną molekułę określoną powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane białko powstałe w roślinach z molekuły określonej powyżej, charakteryzującej się tym, że posiada aktywność inhibitora proteaz serynowych.
Korzystnie, gdy rekombinowane białko zapewnia ochronę białka docelowego przed proteazami serynowymi zwłaszcza trypsyną.
Korzystnie, gdy rekombinowane białko zapewnia ochronę egzogennych białek przed proteazami serynowymi.
Korzystnie, gdy rekombinowane białko stanowi „chimeryczne” białko fuzyjne, przy czym oba elementy fuzji - inhibitor proteaz serynowych i białko docelowe połączone są poprzez linker białkowy, korzystnie o sekwencji ADLQKLISEEDLHHHHHHGSG.
Korzystnie, gdy rekombinowane białko stanowi „chimeryczne” białko fuzyjne, przy czym oba elementy fuzji - inhibitor proteaz serynowych i białko docelowe są aktywne biologicznie.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie molekuły kodującej białko, określonej powyżej, do ochrony samej molekuły, w tym białka docelowego oraz egzogennie dodanych białek przed proteazami serynowymi.
Korzystnie, gdy zastosowanie rekombinowanego białka stosuje się do ochrony egzogennych białek.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku posłużono się rysunkiem, gdzie:
figura 1 przedstawia schemat kasety ekspresyjnej CMTI. P RbcSl i T RbcSl oznaczają odpowiednio sekwencję genu promotora i terminatora transkrypcji małej podjednostki RUBISCO z Asteraceous chrysanthemum; PS - sekwencję peptydu Hderowego z Anemone equistation; Inh - sekwencję CMTI; c, His i K - etykiety cmyc, 6x His i KDEL; Ascl, Pad, Ncol, Bglll - miejsca restrykcyjne;
figura 2 przedstawia schemat kasety ekspresyjnej CMTI::cytokina. P RbcSl i T RbcSl oznaczają odpowiednio sekwencję genu promotora i terminatora transkrypcji małej podjednostki RUBISCO z Asteraceous chrysanthemum; PS - sekwencję peptydu Hderowego z Anemone equistation; Inh sekwencję CMTI; GSG peptyd Glicyna-Seryna-Glicyna; cyt-hlL-2 lub GM-CSF; Ascl, Pacl, Ncol, Saclmiejsca restrykcyjne;
figura 3 przedstawia detekcję rekombinowanych białek CMTI, CMTI::hlL-2, CMTI::GM-CSF metodą Western biot. Do wykrywania CMTI stosowano przeciwciała pierwszorzędowe anty-His; do wykrywania białek fuzyjnych odpowiednio przeciwciała anty-hi L-2 i anty-GM-CSF. Kontrola negatywna (K-), ekstrakt z rośliny nietransformowanej; kontrola pozytywna (K+), rekombinowane białko GM-CSF wyprodukowane w E. coli; L. marker wielkości;
figura 4 przedstawia hamowanie aktywności trypsyny przez rekombinowany CMTI wyprodukowany jako pojedyncze lub fuzyjne białko. AEBSF komercyjnie dostępny inhibitor proteaz stosowany
PL 224 732 B1 jako kontrola pozytywna; GM-CSF i hIL-2 ekstrakty z roślin z ekspresją cytokin użyte jako kontrole negatywne;
figura 5 przedstawia ochronę białka fuzyjnego przed trawieniem trypsyną. hIL-2, ekstrakt białkowy pochodzący z rośliny produkującej rekombinowane białko hIL-2; CMTI::hIL-2, ekstrakt białkowy pochodzący z rośliny produkującej rekombinowane białko fuzyjne CMTI::hIL-2; L, marker wielkości;
figura 6 przedstawia aktywność biologiczną rekombinowanej cytokiny hIL-2 wyprodukowanej w roślinach transgenicznych jako pojedyncze białko i w fuzji z inhibitorem proteaz CMTI. Stosowano kolejne dwukrotne rozcieńczenia ekstraktów białkowych z roślin transgenicznych uzyskując odpowiednio następujące stężenia hIL-2 w ekstrakcie: 1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,25 ng/ml i 0,125 ng/ml w rozcieńczeniach (1, 2, 3, i 4). Jako kontrolę pozytywna stosowano komercyjnie dostępną hIL-2 z E. coli w stężeniu 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml i 3,125 ng/ml. Kontrolą negatywną był ekstrakt rośliny nietransgenicznej oraz pożywka bez dodatku hIL-2. Komórki ssacze linii CTLL2 były inkubowane z przygotowanymi rozcieńczeniami, ich proliferacja była określona w doświadczeniu z MTS przy pomiarze OD 490 nm. Linia na poziomie 0,34 oznacza tzw. tło czyli odczyt dla kontroli negatywnej.
Sekwencje
SEQ nr 1 i SEQ nr 2 przedstawiają sekwencję genu i białka CMTI z peptydem liderowym i etykietami. Sekwencję dojrzałego białka CMTI z etykietami cmyc i His podkreślono;
SEQ nr 3, SEQ nr 4, SEQ nr 5 i SEQ nr 6 przedstawiają sekwencje genów i białek fuzyjnych wraz z peptydem liderowym i etykietami. Sekwencję dojrzałego białka CMTI::hIL2 i CMTI::GM-CSF podkreślono. Sekwencję łącznika pomiędzy genami/białkami fuzyjnymi zacieniowano.
W celu lepszego zrozumienia poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.
Przykłady zastosowania wynalazku
Celem wynalazku jest otrzymanie rekombinowanych białek reprezentujących inhibitor proteaz serynowych, CMTI I oraz fuzje tego peptydu z białkami docelowymi. Ma to na celu stabilizację wszys tkich białek komórki eksprymującej konstrukt lub konkretnego białka, wyprodukowanego jako białko fuzyjne z inhibitorem proteaz. Obecność inhibitora proteaz serynowych może stanowić ochronę przed degradacją przez enzymy trawienne np. trypsynę w trakcie doustnego podania takiego białka zwierzętom lub ludziom jako szczepionka lub lek. Peptyd CMTI I oraz białka fuzyjne są korzystnie opatrzone odpowiednimi etykietami, cmyc i His (fig. 1).
Wykazano, że białka fuzyjne niosące domenę CMTI I połączoną z peptydem docelowym zachowują pełną postulowaną aktywność białka fuzyjnego. Oba elementy fuzji czyli inhibitor i białko docelowe są aktywne. Kluczowym elementem w zachowaniu pełnej aktywności obu białek w fuzji wydaje się być sposób ich połączenia poprzez linker na przykład sprawdzany przez nas linker o długości 21 aminokwasów. Z danych literaturowych wiadomo, że CMTI był już wcześniej testowany jako białko fuzyjne produkowane w systemie bakteryjnym (Milner i in. 2007). Otrzymano konstrukty fuzyjne CMTI z genem białka płaszcza (CP) wirusa Y ziemniaka oraz GUS (β-glukuronidaza). W przeciwieństwie do naszych badań nie zastosowano linkera oddzielającego oba geny. Okazało się, że CMTI silnie zaburzał aktywność obu białek fuzyjnych. Co więcej CMTI zachował specyficzną aktywność tylko w fuzji z CP. W przeciwieństwie do tych danych literaturowych w naszym układzie aktywność biologiczną zachowuje zarówno CMTI jak i białko docelowe. Co więcej, rekombinowana interleukina 2 (IL-2) w fuzji z CMTI wykazuje wyższą specyficzną aktywność biologiczną w teście proliferacji komórek CTLL-2 niż IL-2 otrzymana w takim samym systemie roślinnym ale jako pojedyncze białko. Wykazaliśmy aktywność rekombinowanego CMTI polegającą na ochronie przed trypsyną egzogennego białka.
P r z y k ł a d I. Konstrukcja kasety ekspresyjnej zawierającej rekombinowaną molekułę DNA z genem inhibitora proteaz CMTI zaprojektowaną w celu ekspresji w roślinach z kierowaniem białka do ER (siateczka śródplazmatyczna).
Gen CMTI-I kodujący inhibitor trypsyny został namnożony w polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) na matrycy rekombinowanego wektora zawierającego cDNA CMTI z wykorzystaniem pary specyficznych starterów NcoCMTI i BglCMTI. Otrzymany w wyniku reakcji PCR fragment o długości 109 nukleotydów, po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ncol i Bglll został sklonowany w wektorze ImpactVector 1.3 tag. Plazmid ten zawiera promotor i terminator podjednostki rubisco RbcSl, sekwencję kodującą peptyd liderowy z Anemone equistation oraz etykiety c-myc i 6xHis. Następnie uzyskana kaseta ekspresyjna została przeklonowana do wektora binarnego pBIN PLUS w miejsca restrykcyjne Ascl i Pad. Wektor pBINPLUS zawiera roślinny marker selekcyjny, nptll, zapewniający odporność na kanamycynę. Na figurze 1 przedstawiono schemat kasety ekspresyjnej z wymienionymi powyżej
PL 224 732 B1 najważniejszymi elementami. Sekwencje opisane jako SEQ nr 1 i SEQ nr 2 zawierają sekwencję genu CMTI oraz dojrzałego białka.
P r z y k ł a d II. Konstrukcja kasety ekspresyjnej zawierającej rekombinowaną molekułę DNA z genem inhibitora proteaz CMTI w fuzji z genem cytokin IL-2 lub GM-CSF zaprojektowaną w celu ekspresji w roślinach z kierowaniem rekombinowanego białka do ER (siateczka śródplazmatyczna).
Otrzymanie konstruktu fuzyjnego przebiegało w dwóch etapach. W pierwszym, w polimerazowej reakcji łańcuchowej na matrycy sklonowanego w ImpactVector 1.3 cDNA CMTI namnożono gen inhibitora z użyciem dwóch specyficznych starterów (podkreśleniem zaznaczono miejsca restrykcyjne);
1. NcoCMTI: 5'-TATCCATGGCGCGTGTTTGCCCGCGTATCCTGATG-3'
2. HisGSG: 5'-ACCGGATCCGTGATGGTG ATGGTGATGAAGATC-3'
Równocześnie namnożono gen cytokiny na matrycy rekombinowanego plazmidu zawierającego cDNA odpowiedniej cytokiny z użyciem pary specyficznych starterów:
1. Dla IL-2
a. GSGIL2: 5'-CACGGATCCGGTGCACCTACTTCAAGT-3'
b. SacIL2: 5'-AAGAGCTCTTAGAGTTC ATCTTTAGTTAG-3'
2. Dla GM-CSF
a. GSGGMCSF: 5'-CACGGATCCGGTGCACCCACCCGC-3'
b. SacGMCSF: 5'-GGAGCTCTTAAAGCTCATCTTTTTGGAC-3'
W wyniku przeprowadzonych reakcji uzyskano dwa produkty reakcji PCR, które zawierają komplementarny fragment kilku-nukleotydowy od końca 3' CMTI (CACGGATCCGGT) i 5' końca cytokiny (ACCGGATCCGTG) co umożliwia ich połączenie. W drugim etapie polimerazowej reakcji łańcuchowej z parami starterów NcoCMTI, SachIL2 oraz NcoCMTI, SacGMCSF, uzyskano fuzyjne cDNA CMTI::hIL-2 i CMTI::GM-CSF. Produkt PCR po trawieniu Ncol i SacI został sklonowany w wektorze Impact Vector 1.3 tag. Kaseta ekspresyjna została przeniesiona do wektora binarnego jak opisano powyżej w przykładzie I. Na figurze 2 przedstawiono schemat kasety ekspresyjnej, zawierającej prom otor i terminator RbcSl, sekwencje kodujące etykiety cmyc, 6xHis, KDEL, peptyd liderowy oraz gen CMTI i cytokiny. Sekwencję fuzyjnych genów i białek CMTI::hIL-2, CMTI::GM-CSF opisano za pomocą sekwencji SEQ nr 3, SEQ nr 4, SEQ nr 5 i SEQ nr 6.
P r z y k ł a d III. Transformacja roślin tytoniu rekombinowanymi molekułami DNA przy użyciu Agrobacterium tumefaciens.
Opisane w przykładzie I i II rekombinowane plazmidy, pBIN/CMTI-KDEL i pBIN/CMTI::hIL2-KDEL, zostały wprowadzone do komórek szczepu Agrobacterium tumefaciens LBA4404 metodą elektroporacji. Funkcjonalność otrzymanych konstruktów genowych została sprawdzona w systemie ekspresji przejściowej. W tym celu zawiesiny Agrobacterium zawierające opisane plazmidy wstrzyknięto w liście tytoniu Nicotiana benthamiana. Po upływie 72 godzin pobrano próbki liści, z których wyizolowano białka. Następnie wykonano analizę typu Western, która potwierdziła obecność rekombinowanych białek.
Do stabilnej transformacji wybrano tytoń Nicotiana tabacum LA Burley 21 o niskiej zawartości alkaloidów. Obecność rekombinowanych białek potwierdzono metodą Western błot z użyciem poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych anty-hIL-2, anty-mGM- CSF, monoklonalnych anty-His lub cmyc. Wyniki przedstawiono na figurze 3. Spodziewana wielkość dla CMTI, CMTI::hIL-2, CMTI::GMCSF (łącznie z KDEL, His- i cmyc-tag) wynosi odpowiednio 6,14 kDa, 21,75 kDa, 21,35 kDa. Jako kontrolę negatywną zastosowano ekstrakt z rośliny nietransgenicznej. Białka fuzyjne z GM-CSF były w roślinach N-glikozylowane, dlatego ich wielkość jest większa od podanej powyżej.
Poziom produkcji białek fuzyjnych został określony metodą ELISA i był w zakresie 0,48-3,38 pg/g świeżej tkanki (FW) dla CMTI::IL-2 oraz 4-12 pg/g dla CMTI::GM-CSF.
P r z y k ł a d IV. Analiza aktywności rekombinowanych białek CMTI i CMTI::hIL-2 wyprodukowanych w roślinach transgenicznych
Aktywność rekombinowanego białka inhibitora była badana w teście inhibicji trypsyny używając jako substratu Azocollu. Ekstrakty z roślin transgenicznych CMTI i CMTI/hIL2 uzyskane poprzez uci eranie próbek liści w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, 2% PVP, pH 7,5. Różnica w odczycie absorbancji pomiędzy próbką pozytywną a negatywną odzwierciedla aktywność inhibitora. Wyższe o dczyty OD490 świadczą o degradacji standardowego białka czyli Azocollu co oznacza niską aktywność inhibitora. Wyniki przedstawiono na figurze 4. Pokazują one, że zarówno sam rekombinowany inhibitor jak i jego fuzja chronią standardowe białko przed trawieniem trypsyną. Jako kontrolę negatywną
PL 224 732 B1 stosowano ekstrakt z rośliny transgenicznej produkującej rekombinowane białko hIL-2. Kontrolą pozytywną był komercyjny preparat inhibitorów proteaz serynowych, AEBSF [4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride].
Wykazano również ochronę białka cytokiny hIL-2 wyprodukowanej w roślinach w fuzji z inhibitotorem CMTI przed trawieniem trypsyną. Inkubowano ekstrakt białkowy z rośliny transgenicznej transformowanej fuzyjnym genem CMTI::hIL-2 w 25°C przez 30 minut z dodatkiem trypsyny w stosunku wagowym 0,024:1 enzymu (trypsyną) do totalnego białka, czyli 119:1 trypsyny do rekombinowanego białka. W odstępach kilkuminutowych pobierano próbki i sprawdzano obecność rekombinowanego białka fuzyjnego metodą Western blot z wykorzystaniem przeciwciał anty-hlL-2. Zaobserwowano znaczący spadek ilości rekombinowanego białka u ekstrakcie roślinę transgenicznej z ekspresja hIL-2 już po 4 minutach inkubacji. Prawie całkowity zanik białka stwierdzono po 30 minutach inkubacji. Natomiast w przypadku ekstraktu rośliny z ekspresją białka fuzyjnego, zaobserwowano niewielki spadek ilości białka rekombinowanego w ciągu 30 minut inkubacji (fig. 5).
P r z y k ł a d V. Analiza aktywności rekombinowanych białek cytokin w fuzji z inhibitorem CMTl
Aktywność białka hlL-2 otrzymanego w fuzji z CMTI była badana w teście pruł iteracji komórek linii CTLL2 (mysie limfoblasty), które wymagają do wzrostu obecności IL-2 w pożywce. Wyniki przedstawiono na fig. 6. Do przygotowanych zawiesin komórek dodawano kolejne dwukrotne rozcieńczenia; (1) komercyjnego preparatu hlL-2 (oczyszczonego z bakterii Escherichia coli) tak aby stężenie wynosiło 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml i 3,125 ng/ml pożywki; (2) ekstraktów białkowych z roślin transgenicznych hiL-2 oraz CMTI::hIL-2 tak aby stężenie wynosiło 1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,25 ng/ml i 0,125 ng/ml pożywki; (3) ekstraktów z rośliny nietransgenicznej jako kontrola negatywna. Po 72 godzinach inkubacji oszacowano poziom proliferacji używajcie gotowego zestawu Cell-titer 96 Aqueous One solution assay (MIS) firmy Promega. Porównując wyniki uzyskane dla białek wyprodukowanych w roślinach można stwierdzić, że białko hlL-2 w fuzji z CTMI wykazuje nieco wyższa aktywność specyficzną (czyli przypadającą na ng białka) niż niefuzyjne białko hIL-2. Ponadto porównując poziomy odczytu OD można stwierdzić, że hIL-2 pochodzeniu bakteryjnego w stężeniu 3,125 ng ml wyka/uje laką samą aktywność jak biało fuzyjne w stężeniu 6-krotnie niższym co wskazuje nu wyraźnie wyższa aktywność specyficzną rekombinowanej IL-2 fuzyjne i w porównaniu z IL-2 pochodzenia bakteryjnego w przeliczeniu na masę białka.
Literatura
Atkinson H J, McPherson M j & Urwin, P E, 2005, Patent: Proteinase inhibitor fusion proteins, zastrzeżenia HK 1032073. W ispocenet. http://worldwide.espacenrt.com/
Bofewskd, K„ D. Krowarsch, J. Otlewski, t. Jaroszewski & A, Bierzynski (1995) Synthesis, cloning and expression in Escherichia coli of a gene coding for the Met8 >Leu CMTI l -a representative of the squash inhibitors of serine proteinases. FEB5 Lett, 377, 172 4.
Charity, J, A., P. Hughes, M. A. Anderson, D. J. Bittrsmch, M. Whitecross & T, J. V. Higgins (200S) Pest and disease protection conferred by expression of barley beta-hordothionin and Nicotiana afata proteinase inhibitor genes in transgenic tobacco. Functional Plant Biology, 32, 3544.
Dunse, K. M., J. A. Stevens, F, T. Lay.Y. M, Caspar, R. L, Heath & M. A. Anderson (2010) Coexpression of potato type 1 and it proteinase inhibitors gives cotton plants protection against insect damage in the field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107, 15011-15015.
Hilder, V., A. Gatehouse, S, Sheermann, R. Barker & D, Boulter (1987) A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco 330, 180-163.
Holak, T. A,, W. Bode, R, Huber, J, Otlewski & T. Wilusz (1989a) Nuclear magnetic resonance solution and X- ray structures of squash trypsin inlubitoi exhibit the same conformation of the proteinase binding loop. J Mol Biol, 210,649-54.
Holak, T. A„ D. Gondol, J Otlewski & T. Wilusi (1989b) Determination of the complete threedimensional structure of the trypsin inhibitor from squash seeds in aqueous solution by nuclear magnetic resonance and a combination of distance geometry and dynamical simulated annealing, J Mol Biol, 210, 635-48.
Kim, T. 6., H. M. Kim, H, j. Lee, Y. J. Shin, T H. Kwon, N J, Lee, Y. S. Jang & M, S. Yang (2007)
PL 224 732 B1
Reduced protease activity in transformed rice cell suspension cultures expressing a proteinase inhibitor. Protein Expression and Purification, 53, 270-274,
Kim, T. G., H. J. Lee, Y, 5, Jang, Y. j. Shin, T, H. Kwon & M. S. Yang (2008) Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture. Protein Expression and Purification, 61, 117-121.
Komarnytsky, S., N. Borisjuk, N. Yakoby, A. Garvey & I. Raskin (2006) Cosecretion of protease inhibitor stabilizes antibodies produced by plant roots. Plant Physiology, 141,1185-1193.
Krowarsch, D., T. Cierpicki, F. Jeleń & J. Otlewski (2003) Canonical protein inhibitors of serine proteases. Cellular and Molecular Life Sciences, 60, 2427-2444.
Milner. M,, j. Chtoboczek & W. Zagorski Ostoja (2007) Engineered resistance against proteinases. Acta Biochimica Polonica, 54, 523-536,
Mosolov, V. V. & T. A. Valueva (2008) Proteinase inhibitors in plant biotechnology: A review. Applied Biochemistry and Microbiology, 44, 233-240.
Nilges, M, J. Habazettl, A, T. Brtinger & T, A, Holak (1991) Relaxation matrix refinement of the solution structure of squash trypsin inhibitor. J Mol Biol, 219, 499-510.
Otlewski, J. & D. Krowarsch (1998) Squash inhibitor family of serine proteinases. Acta Biochim Pol, 43, 431-44.
Outchkourov, N. 5., W. J. de Kogel, G. L. Wurgers, M. Abrahamson & M. A. Jongsma (2004) Engineered multidomain cysteine protease inhibitors yield resistance against western flower thrips (FranklinieHa occidentalis) in greenhouse trials. Plant Biotechnol J,
2, 449-58.
Urwin, P. E., H. J. Atkinson, D. A. Waller & M. J. McPherson (1995) Engineered oryzacystatin-l expressed in transgenic hairy roots confers resistance to Gtobodera pallida. Plant J,
8, 121-31.
Urwin, P, E., M. J. McPherson & H. J. Atkinson (1998) Enhanced transgenic plant resistance to nematodes by dual proteinase inhibitor constructs. Planta, 204, 472-9.
Wieczorek, M., J Otlewski, J. Cook, K. Parks, j. Leluk, A. Wtlimowska-Pelt, A. Polanowski, T.
Wilusz & M. Laskowski (1985) The squash family of serine proteinase inhibitors. Ammo acid sequences and association equilibrium constants of inhibitors from squash, summer squash, zucchini, and cucumber seeds Biochem Biophys Res Commun, 126, 646-52.
Zhukov, I, L. Jaroszewski & A. Bierzyński (2000) Conservative mutation Met8 Leu affects the folding process and structural stability of squash trypsin inhibitor CMTM. Protein Sci, 9,
Claims (14)
1. Rekombinowana molekuła DNA, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko posiadające aktywność inhibitora proteaz serynowych oraz cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko docelowe, korzystnie wybrane z grupy obejmującej cytokiny zwierzęce, przy czym pomiędzy sekwencjami kodującymi oba białka znajduje się sekwencja kodująca linker białkowy, przy czym wszystkie wymienione elementy tworzą jedną otwartą ramkę odczytu, przy czym białko posiadające aktywność inhibitora proteaz serynowych stanowi CMTI I i określone jest sekwencją SEQ ID NO: 2.
2. Rekombinowana molekuła według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi obejmującymi promotor i terminator transkrypcji, aktywnymi w komórce roślinnej, przy czym element regulatorowy stanowiący promotor aktywny jest konstytutywny bądź regulowany.
3. Rekombinowana molekuła według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi umożliwiającymi stabilną bądź przejściową ekspresję tego kwasu nukleinowego w komórce roślinnej.
4. Rekombinowana molekuła według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z cząsteczką DNA kodującą peptydy, zdolne do skierowania białka do pożądanego przedziału komórki.
PL 224 732 B1
5. Rekombinowana molekuła według zastrzeżeń 1 do 4, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodującą czynnik zapewniający ochronę białka docelowego przed proteazami serynowymi zwłaszcza trypsyną.
6. Rekombinowana molekuła według zastrzeżeń 1 do 4, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodującą czynnik zapewniający ochronę egzogennych białek przed proteazami serynowymi, zwłaszcza trypsyną.
7. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że posiada co najmniej jedną rekombinowaną molekułę określoną zastrzeżeniami 1 do 6.
8. Rekombinowane białko powstałe w roślinach z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6, znamienne tym, że posiada aktywność inhibitora proteaz serynowych.
9. Rekombinowane białko powstałe z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6, znamienne tym, że zapewnia ochronę białka docelowego przed proteazami serynowymi zwłaszcza trypsyną.
10. Rekombinowane białko powstałe w roślinach z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6, znamienne tym, że zapewnia ochronę egzogennych białek przed proteazami serynowymi.
11. Rekombinowane białko powstałe w roślinach z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6. znamienne tym, że stanowi „chimeryczne” białko fuzyjne, przy czym oba elementy fuzji - inhibitor proteaz serynowych i białko docelowe połączone są poprzez linker białkowy, korzystnie o sekwencji ADLQKLISEEDLHHHHHHGSG.
12. Rekombinowane białko powstałe w roślinach z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6, znamienne tym, że stanowi „chimeryczne” białko fuzyjne, przy czym oba elementy fuzji inhibitor proteaz serynowych i białko docelowe są aktywne biologicznie.
13. Zastosowanie molekuły kodującej białko, określonej zastrzeżeniami 1 do 6, do ochrony samej molekuły, w tym białka docelowego oraz egzogennie dodanych białek przed proteazami seryn owymi.
14. Zastosowanie rekombinowanego białka powstałego w roślinach z molekuły określonej zastrzeżeniami 1 do 6 do ochrony egzogennych białek.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395796A PL224732B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395796A PL224732B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395796A1 PL395796A1 (pl) | 2013-02-04 |
| PL224732B1 true PL224732B1 (pl) | 2017-01-31 |
Family
ID=47632519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395796A PL224732B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL224732B1 (pl) |
-
2011
- 2011-07-28 PL PL395796A patent/PL224732B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL395796A1 (pl) | 2013-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Langen et al. | Transgenic expression of gallerimycin, a novel antifungal insect defensin from the greater wax moth Galleria mellonella, confers resistance to pathogenic fungi in tobacco. | |
| ES2332484T3 (es) | Resistencia al estres inducida por un inductor de respuesta hipersensible. | |
| US10285333B2 (en) | Pathogen resistant citrus compositions, organisms, systems, and methods | |
| CA2838523C (en) | Herbicide-resistant protein, encoding gene and use thereof | |
| Li et al. | Molecular cloning and functional analysis of the drought tolerance gene MsHSP70 from alfalfa (Medicago sativa L.) | |
| EP0804065A1 (en) | Transgenic plants and plant cells with enhanced pathogen resistance and related methods | |
| JPH0286783A (ja) | Ｄｎａ組立て体及びそれらを組込んだ植物 | |
| CN105861517A (zh) | 一种三七抗菌肽基因PnSN1及其应用 | |
| AU718274B2 (en) | Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same | |
| EP2449111B1 (en) | Expression of transcription regulators that provide heat tolerance | |
| CN113666993B (zh) | 紫花苜蓿MsSPL12蛋白及其相关生物材料与它们在提高植物抗逆性中的应用 | |
| CN117568384A (zh) | GbOSM34L基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 | |
| US7982098B2 (en) | Environmental stress resistance transcription factor and method for enhancing environmental stress resistance of plants using the same | |
| CN104878019A (zh) | 漾濞大泡核桃类萌发素蛋白基因JsGLP1及应用 | |
| US6677505B1 (en) | Promoter inductible in plants, sequence incorporating same and resulting product | |
| CN108192920A (zh) | 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法 | |
| EP3656784A1 (en) | Chimeric pattern recognition receptor kinases | |
| JP2002530274A (ja) | プロテアーゼ分解に対する安定性の高いペプチド | |
| KR20200063569A (ko) | 고온 내성 관련 유전자 및 이의 용도 | |
| CN108341861A (zh) | 一种来源于杜梨的抗病性相关基因及其编码蛋白与应用 | |
| US6927322B2 (en) | Cabbage proteinase inhibitor gene confers resistance against plant pests | |
| US6750381B2 (en) | Pathogen-resistant plants transformed with a DNA encoding sarcotoxin 1A linked to a signal peptide and a method for production thereof | |
| Choi et al. | Antimicrobial activity of γ-thionin-like soybean SE60 in E. coli and tobacco plants | |
| PL224732B1 (pl) | Rekombinowana molekuła DNA, wektor ekspresyjny, rekombinowane białko oraz zastosowanie molekuły kodującej białko | |
| CN111995690B (zh) | 一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用 |