ES2332596T3 - Preparacion de un producto a base de masa. - Google Patents
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Abstract
Proceso para preparar un producto a base de masa, comprendiendo la adición de una xilanasa a una masa, la fermentación, y el calentamiento de la masa, donde la xilanasa es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2 o está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1 bajo condiciones de hibridación que comprenden la prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado, seguida de la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45º C., seguidas de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC.
Description
Preparación de un producto a base de masa.
La presente invención se refiere a un proceso
para preparar un producto a base de masa, y a una xilanasa para su
uso en el proceso.
K.B. Kubata et al., Biosci. Biotech.
Biochem., 56 (9), 1463-1464 (1992) describe la
Xilanasa 1 de Aeromonas caviae ME-1. Su
secuencia de aminoácidos fue presentada por T. Suzuki et al.
en 1994 a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ donde recibió el
número de accesión Q43993.
WO 0039289 describe una xilanasa de Bacillus
subtilis supuestamente adecuada para preparar masa no
pegajosa.
Los inventores han identificado una xilanasa a
partir de una cepa bacteriana de Paenibacillus pabuli y han
descubierto que la xilanasa puede aumentar el tiempo de
conservación de los productos horneados. Más específicamente, la
xilanasa en combinación con una amilasa maltogénica mejora además
la blandura de la miga de pan sin tener efectos perjudiciales sobre
la elasticidad.
Por consiguiente, la invención proporciona un
proceso para preparar un producto con una base de masa,
comprendiendo la adición de una xilanasa con una alta identidad con
la SEC ID nº: 2 a una masa, fermentando, y calentando la masa. Más
específicamente, la xilanasa es un polipéptido con al menos un 90%
de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en
las posiciones 1-182 de la SEC ID nº: 2 o está
codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo las
condiciones definidas en la reivindicación 1 con la cadena de
nucleótidos complementaria 85-630 de la SEC ID nº:
1.
La invención proporciona además una composición
de masa que comprende harina junto con la xilanasa y un aditivo
para mejorar el pan y/o la masa comprendiendo la xilanasa en forma
de un polvo granulado o aglomerado.
La invención también proporciona un polipéptido
que tiene actividad xilanasa. Puede ser un polipéptido codificado
por el genoma presente en la DSM 16232 de Paenibacillus que
puede amplificarse con los cebadores (SEC ID nº.: 3) y (SEC ID nº.:
4) o que tiene una secuencia de aminoácidos según se muestra en las
posiciones 1- 182 de la SEC ID nº 2, o puede ser idéntica a uno de
estos en al menos un 95%. El polipéptido también puede codificarse
por una secuencia de ácido nucleico que hibrida a 49ºC en 0.1 x de
SSC con la cadena de nucleótidos complementaria
85-630 de la SEC ID nº: 1.
De forma alternativa, la xilanasa puede ser un
polipéptido conteniendo una secuencia de aminoácidos que puede
obtenerse a partir del polipéptido maduro de la SEC ID nº: 2
mediante sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más
aminoácidos y un polinucleótido con una secuencia que puede
derivarse de la SEC ID nº: 1 mediante sustitución, deleción, y/o
inserción de uno o más nucleótidos.
La invención también proporciona un
polinucleótido que codifica la xilanasa, un vector de expresión que
comprende el polinucleótido, una célula huésped transformada que
comprende el vector, al igual que un método para producir la
xilanasa mediante el cultivo del transformante.
El organismo fuente de la xilanasa de la
invención es una cepa bacteriana aislada a partir de muestras de
tierra recogidas en Nueva Zelanda en 1991. La cepa se clasificó
como perteneciente a Paenibacillus pabuli. Los inventores han
depositado la cepa según los términos del Tratado de Budapest del
17 de febrero de 2004 como DSM 16232 con el DSMZ - Deutsche
Sammlung von Micro-organismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig
DE.
El vector de expresión de la invención incluye
normalmente secuencias de control que codifican un promotor,
operador, sitio de unión de ribosoma, señal de iniciación de
traducción, y, opcionalmente, un marcador seleccionable, un
terminador de transcripción, un gen represor o diferentes genes
activadores. El vector puede ser un vector de replicación autónoma,
o puede estar integrado en el genoma de la célula huésped.
El polipéptido de la invención puede producirse
transformando una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN
que codifique la enzima de xilanasa, cultivando el organismo
transformado bajo condiciones que permitan la producción de la
enzima, y recuperando la enzima a partir del cultivo.
El organismo huésped puede ser particularmente
una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, tal
como las bacterias gram positivas incluyendo una célula de
Bacillus, p. ej., Bacillus lentus, Bacillus
licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
subtilis o una célula de Bacillus alcalofílico, o una
célula de Streptomyces, o bacterias gram negativas tales
como E. coli y Pseudomonas sp.
El polipéptido y el polinucleótido de la
invención pueden tener identidades con las secuencias descritas de
al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%.
Para los propósitos de la presente invención,
los alineamientos e identidades de las secuencias proteínicas se
analizan con el programa Vector NTI (Invitrogen Corporation). Los
alineamientos se crean usando el algoritmo Clustal W (Nucleic Acid
Research, 22 (22): 4673-4680, 1994).
Los parámetros de alineación usados para los
alineamientos polipeptídicos son: penalización para el primer
residuo en un espacio 10; penalización para residuos adicionales en
un espacio 0.1; ninguna penalización para espacios introducidos al
final de una secuencia.
Las condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda nucleótida y una secuencia homóloga de
ADN o ARN implican el preremojo del filtro que contiene los
fragmentos de ADN o el ARN para hibridar en 5 x de SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del
filtro en una solución de 5 x de SSC (Sambrook et al. 1989),
5 x de solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), un 0.5%
de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y
desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguidos de una
hibridación en la misma solución conteniendo un cebado aleatorio
(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13), una sonda marcada como
^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 x
10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro se
lava entonces dos veces durante 30 minutos en 0.1x de SSC, un 0.5%
de SDS a una temperatura de 25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC, 49ºC o
55ºC. Las moléculas que hibrida la sonda de oligonucleótidos bajo
estas condiciones pueden detectarse usando una película
radiográfica.
La composición de harina puede comprender
particularmente harina de trigo. Puede ser una mezcla seca que
comprenda harina y la xilanasa, particularmente en forma del
aditivo anteriormente descrito. La composición de harina también
puede ser una masa, la cual puede estar fresca, congelada o
pre-horneada. Puede ser una masa laminada.
La xilanasa puede añadirse a la composición de
harina o masa en una dosificación de 0.1-10 mg de
proteína enzimática por kg de harina, particularmente de
0.2-5 mg/kg.
La masa puede comprender también otros
ingredientes de masa convencionales, p. ej. proteínas, como leche
en polvo y gluten; huevos (tanto huevos enteros, como yemas de
huevo o claras de huevo); un oxidante como p. ej. ácido ascórbico,
bromato de potasio, yodato de potasio,
(adenosina-desaminasa) de azodicarbonamida o
persulfato de amonio; un aminoácido tal como
L-cisteína; azúcar; sal, como p. ej. cloruro
sódico, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La
masa puede contener grasa (triglicéridos) tal como grasa granulada o
manteca.
Opcionalmente, se pueden añadir una o más
enzimas adicionales a la masa junto con la xilanasa de la
invención. La enzima adicional puede ser una amilasa, una enzima
lipolítica (p. ej. como se describe en WO 9953769) o una segunda
xilanasa.
La amilasa puede ser una
alfa-amilasa maltogénica exoactiva. Un ejemplo es
una alfa-amilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837
de B. stearothermophilus, disponible a través de Novozymes
A/S bajo el nombre comercial Novamyl®;
descrito en WO 9104669 y teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID nº: 1 de US6162628A1. Otro ejemplo es una variante de Novamyl, p. ej. según se describe en WO 9943794. La amilasa maltogénica puede añadirse en una dosificación de 100-1000 MANU por kg de harina (unidad de actividad MANU definida en WO 9104669).
descrito en WO 9104669 y teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID nº: 1 de US6162628A1. Otro ejemplo es una variante de Novamyl, p. ej. según se describe en WO 9943794. La amilasa maltogénica puede añadirse en una dosificación de 100-1000 MANU por kg de harina (unidad de actividad MANU definida en WO 9104669).
\newpage
La invención proporciona un método para preparar
un producto a base de masa fermentando la masa y calentándola, p.
ej. por cocción o vaporización. La masa puede fermentarse p. ej.
añadiendo agentes de fermentación química o levadura, normalmente
Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería). El producto
puede ser de naturaleza blanda o crujiente, ya sea de tipo blanco,
claro u oscuro. Son ejemplos el pan horneado o vaporizado (en
particular el pan blanco, integral o de centeno), normalmente en
forma de barras o panecillos.
Un 0.2% de Arabinoxilano AZCL a partir de trigo
(Megazyme) en un tampón de 0.2 M de Na-fosfato a pH
6.0 + un 0.01% de Triton-x-100.
BioFeed Wheat (producto de Novozymes A/S),
diluido en un 0.01% de Triton X-100. FXU/ml: 0.05;
0.10; 0.15; 0,20; 0.25; 0.30; 0.40.
1. Se precalienta un sustrato de 900 \mul a
37ºC en un termomezclador
2. Se añade una muestra de 100 \mul
3. Se incuba durante 15 min a 37ºC a velocidad
máxima
4. en hielo durante 2 min
5. se agita durante 1 min a 20.000 x G
6. Se transfieren 2 x 200 \mul de sobrenadante
a una placa de microtitulación
7. Se mide el punto final OD 590 nm.
Se aisló el ADN cromosómico de la cepa DSM 16232
de Paenibacillus pabuli mediante el QlAmp Tissue Kit
(Qiagen, Hilden, Alemania). Se usó un sistema de vectores de
integración lineal para clonar la expresión del gen. El constructo
de integración lineal fue un producto de fusión por PCR conseguido
mediante la fusión del gen entre dos regiones cromosómicas
homólogas de Bacillus subtils junto con un promotor fuerte y
un marcador de resistencia de cloranfenicol. La fusión se realizó
por SOE-PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N.,
Pullen, J.K. and Pease, L.R. (1989), Engineering hybrid genes
without the use of restriction enzymes, gene splicing by overlap
extension, Gene 77: 61-68). El método
SOE-PCR también se describe en WO 2003095658. El
gen se expresó bajo el control de un sistema promotor triple (según
se describe en WO 99/43835), consistiendo en los promotores del gen
de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis
(amyL), el gen de alfa-amilasa de Bacillus
amy-loliquefaciens (amyQ), y el promotor
cryIIIA de Bacillus thuringiensis incluyendo una
secuencia estabilizante. El gen que codifica la acetiltransferasa
de Cloranfenicol se usó como marcador. (Descrito p. ej. en
Diderichsen, B.; Poulsen, G.B.; Joergensen, S.T.; A useful cloning
vector for Bacillus subtilis. Plasmid 30:312 (1993)). El
constructo de gen final se integró en el cromosoma de Bacillus
mediante recombinación homóloga en la posición de la pectato
liasa.
Los primeros 3 fragmentos se amplificaron por
PCR: el fragmento de gen con los cebadores específicos oth62 (SEC
ID nº.: 3) y oth63 (SEC ID nº.: 4) en el ADN genómico del
Paenibacillus pabuli. El fragmento flanqueante ascendente se
amplificó con los cebadores 260558 (SEC ID nº.: 5) y UpN 1361 (SEC
ID nº.: 6) y el fragmento flanqueante descendente se amplificó con
los cebadores 260559 (SEC ID nº.: 7) y DwC 1361 (SEC ID nº.: 8) del
ADN genómico de la cepa iMB1361 (descrita en WO 2003095658).
Los fragmentos de ADN se amplificaron con el
"Expand High Fidelity PCR System" (Boehringer Mannheim,
Alemania) usando las condiciones siguientes: 94ºC durante 2 min
seguido de 10 ciclos de (94ºC durante 15 seg, 55ºC durante 30 seg,
68ºC durante 4 min) seguidos por 20 ciclos de (94ºC durante 15 seg,
55ºC durante 30 seg, 68ºC durante 4 min (+20 seg por ciclo)) y
finalizando con un ciclo a 68ºC durante 10 min. Los 3 fragmentos
resultantes se mezclaron en iguales proporciones molares y se
inició una nueva reacción por PCR bajo las condiciones siguientes:
primero 2 min. a 94ºC, seguido de 10 ciclos de (94ºC durante 15
seg., 55ºC durante 45 seg., 68ºC durante 5 min.), 10 ciclos de
(94ºC durante 15 seg., 55ºC durante 45 seg., 68ºC durante 8 min.),
15 ciclos de (94ºC durante 15 seg., 55ºC durante 45 seg., 68ºC
durante 8 min. además de 20 seg. extra por ciclo). Después del
primer ciclo se añadieron los dos cebadores terminales 260558 (SEC
ID nº.: 5) y 260559 (SEC ID nº.: 7) (20 pMol de cada uno). Dos
micro-I del producto de PCR se transformaron en
Bacillus subtilis y se seleccionaron transformantes sobre
placas LB conteniendo cloranfenicol (un medio de 6 \mug/ml). Se
seleccionó un clon conteniendo el constructo sin mutaciones dando
como resultado cambios aminoácidos para su fermentación en medios
líquidos.
En el sobrenadante se analizó la actividad
xilanasa con arabinoxilano AZCL modificado como sustrato mediante
el ensayo descrito anteriormente y tenía alrededor de 150
FXU/ml:
El clon se veteó en una placa de agar LB con 6
micro g/ml de cloranfenicol a partir de materia prima a -80ºC, y
germinada durante la noche a 37ºC. Las colonias se transfirieron a
100 ml de medios PS-1 suplementados con 6 micro g/ml
de cloranfenicol en un matraz de agitación de 500 ml.
Composición del medio PS-1:
El cultivo se agitó a 30ºC a 275 r.p.m. durante
3 días. Las células se detuvieron y la enzima se purificó a partir
del sobrenadante.
\vskip1.000000\baselineskip
El caldo de fermentación del Ejemplo 1 se filtró
a través de papel de filtro y se obtuvo una filtración blanca. El
sulfato de amonio se añadió a una concentración final de 3.0 m y se
incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de 30 min de
centrifugado a 10000 g, el precipitado se solubilizó con 10 mM de
acetato de sodio a pH 5.0 y se dializó contra 10 mM de acetato
sódico a pH 5.0. Después de la diálisis se aplicó la muestra sobre
una columna de S-Sefarosa (Amersham Pharmacia
Biotech 2.6 cm x 10 cm) equilibrada con 10 mM de acetato sódico a
pH 5.0. La elución se realizó con un gradiente lineal a partir de 0
- 1 M de NaCl en 10 mM de acetato sódico a pH 5.0. Se agruparon
fracciones conteniendo actividad de xilanasa y se almacenaron a
-20ºC. Esta preparación se usó en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hornearon los panes según el método del
esponjado de la masa.
Se ajustan los ingredientes, se añade la
levadura, el agua, la harina, el SSL y el aceite en el bol de
mezclado Mixing a 90 r.p.m. durante 1 minuto, a 150 r.p.m. durante
4 minutos. Se pesa el esponjado, se mide la temperatura y se coloca
el esponjado en un bol y se fermenta durante 3 horas a 27ºC, con un
86% de RH.
Se añaden los ingredientes y el esponjado en el
bol de mezclado. Se mezclan el esponjado y los ingredientes a 90
r.p.m. durante 9 minutos
Se mide la temperatura, se evalúan las
características de la masa, se reduce la masa a pedazos más
pequeños de 435 g cada uno.
La masa reposa sobre la mesa durante 10
minutos
Las masas se laminan y moldean.
Fermentación durante 55 minutos a 42ºC y con un
86% de RH.
Los panes se hornean a 200ºC durante 22
minutos
Las enzimas se dosificaron en 2 mg de la
xilanasa de la invención por kg de harina junto con 400 MANU/kg de
Novamyl. Se llevó a cabo un control con 200 FXU/kg de la xilanasa
Shearzyme del estado anterior de la técnica (producto de Novozymes
A/S) junto con 400 MANU/kg de Novamyl.
El pan se almacenó a temperatura ambiente hasta
el análisis.
Se midieron la textura y la migración del agua
mediante RMN los días 7, 14 y 21. Se realizó una pequeña evaluación
sensorial de blandura y humedad el día 21.
Se midió la solidez de las hogazas como se
describe en WO 9953769 Los resultados fueron los siguientes:
\newpage
La elasticidad de las hogazas se midió como se
describe en US 6162628. Los resultados fueron los siguientes:
Los datos muestran que el efecto de la xilanasa
de la invención junto con Novamyl sobre la solidez y la elasticidad
supera a la combinación de la xilanasa del nivel anterior de la
técnica y Novamyl.
La movilidad de agua libre se determinó como se
describe por P. L. Chen, Z. Long, R. Ruan y T. P. Labuza, Nuclear
Magnetic Resonance Studies of water Mobility in Bread during
Storage. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 30:
178-183 (1997). Los resultados fueron los
siguientes:
Los datos muestran que la xilanasa de la
invención aumenta más la cantidad de agua libre que la xilanasa del
nivel anterior de la técnica. La cantidad de agua libre se ha
descrito en la bibliografía para correlacionar según la humedad de
la miga de pan.
La clasificación de la pequeña evaluación
sensorial sobre la blandura y la humedad del día 21 mostró que la
miga de pan hecha con la xilanasa de la invención junto con Novamyl
se percibió más húmeda que el pan hecho con la xilanasa del nivel
anterior de la técnica y Novamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\bullet WO 0039289 A [0003]
\bullet WO 9953769 A [0021] [0047]
\bullet WO 9104669 A [0022] [0022]
\bullet US 6162628 Al [0022]
\bullet WO 9943794 A [0022]
\bullet WO 2003095658 A [0027] [0028]
\bullet WO 9943835 A [0027]
\bullet US 6162628 A [0048]
\bullet K.B. Kubata et al. Biosci.
Biotech. Biochem., 1992, vol. 56, no. 9.
1463-1464 [0002]
\bulletNucleic Acid Research,
1994, vol. 22, no. 22. 4673-4680 [0015]
\bulletFeinberg, A. P.
Vogelstein, B. Anal. Biochem., 1983, vol. 132,
6-13 [0017]
\bulletHorton, R.M. Hunt, H.D.
Ho, S.N. Pullen, J.K. Pease, L.R. Engineering
hybridgenes without the use of restriction enzymes, gene splicing by
overlap extension Gene, 1989, vol. 77,
61-68 [0027]
\bulletDiderichsen,B. Poulsen,
G.B. Joergensen,S.T. A useful cloning vector for Bacillus
subtilis Plasmid, 1993, vol. 30, 312- [0027]
\bullet P. L. Chen Z. Long R.
Ruan T. P. Labuza Nuclear Magnetic Resonance Studies
of water Mobility in Bread during Storage Lebensmittel
Wissenschaft und Technologie, 1997, vol. 30,
178-183 [0050]
<110> Novozymes A/S
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Preparación de un Producto a Base de
Masa
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<130> 10582-wo
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 630
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus pabuli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(84)
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<220>
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<221> SCD
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<222> (1)..(630)
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<220>
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<221> mat_péptido
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<222> (85)..(630)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 210
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<212> TPR
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<213> Paenibacillus pabuli
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador oth62
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgttcatcgat cgcatcggct acagattact ggcagaactg gacagatg
\hfill48
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<210> 4
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<211> 49
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador oth63
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador 260558
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgagtatcgcc agtaaggggc g
\hfill21
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador UpN 1361
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipagccgatgcg atcgatgaac
\hfill20
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<210> 7
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador 260559
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgcagccctaa aatcgcataa agc
\hfill23
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<210> 8
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Cebador DWC 1361
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatcgcatg ttcaatccgc tcc
\hfill23
Claims (10)
1. Proceso para preparar un producto a base de
masa, comprendiendo la adición de una xilanasa a una masa, la
fermentación, y el calentamiento de la masa, donde la xilanasa es
un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de
aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182
de la SEC ID nº 2 o está codificada por una secuencia de ácidos
nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de nucleótidos
85-630 de la SEC ID nº: 1 bajo condiciones de
hibridación que comprenden la prehibridación en una solución de 5 x
de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml
de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado, seguida de
la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45º
C., seguidas de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante
30 minutos a una temperatura de 49ºC.
2. Proceso de la reivindicación 1 que además
comprende la adición de una alfa-amilasa
maltogénica exoactiva a la masa.
3. Composición que comprende harina junto con
una xilanasa la cual es un polipéptido con al menos un 90% de
identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las
posiciones 1-182 de la SEC ID nº: 2 o está
codificada por una secuencia de ADN que puede hibridar a la cadena
complementaria de nucleótidos 85-630 de la SEC ID
nº: 1, bajo condiciones de hibridación comprendiendo una
prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de
Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma del
salmón sonicado y desnaturalizado, tenida lugar a continuación la
hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC.,
seguida de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30
minutos a una temperatura de 49ºC.
4. Composición de la reivindicación precedente
que es una masa.
5. Polvo granulado o aglomerado que comprende
una xilanasa la cual es un polipéptido con al menos un 90% de
identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las
posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2 o está codificada
por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena
complementaria de los nucleótidos 85-630 de la SEC
ID nº: 1, bajo condiciones de hibridación que comprenden una
prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de
Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma del
salmón sonicado y desnaturalizado, seguido por la hibridación en la
misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC., seguido de dos
lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una
temperatura de 49ºC.
6. Polipéptido conteniendo actividad xilanasa
seleccionado del grupo que consiste en:
- a)
- un polipéptido codificado por la parte codificante de la xilanasa del genoma presente en la DSM 16232 del Paenibacillus que puede amplificarse con los cebadores (SEC ID nº.: 3) y (SEC ID nº.: 4)
- b)
- un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2;
- c)
- un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con el polipéptido definido en (a) o (b),
- d)
- un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de los nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 11 bajo condiciones de hibridación comprendiendo una prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y desnaturalizado, seguido de una hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC., seguida de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 55ºC.
7. Polinucleótido que comprende una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en:
- a)
- la parte codificante de la xilanasa del genoma de Paenibacillus que puede amplificarse con los cebadores (SEC ID nº.: 3) y (SEC ID nº.: 4) presentes en la cepa DSM 16232;
- b)
- los nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1;
- c)
- unos polinucleótidos que codifican los aminoácidos 1-182 de la SEC ID nº 2;
- d)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad xilanasa y que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido de a), b) o c),
- e)
- una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad xilanasa y cuya secuencia de ácidos nucleicos hibrida con la cadena complementaria del polinucleótido de a), b) o c) bajo condiciones de hibridación comprendiendo una prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y desnaturalizado, seguido de una hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC., seguido de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC,
- f)
- la cadena complementaria del polinucleótido de a), b), c), d) o e).
8. Vector comprendiendo el polinucleótido de la
reivindicación 7 operativamente enlazado a una o más secuencias de
control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped
adecuado.
9. Célula huésped transformada comprendiendo el
vector de la reivindicación 8.
10. Método para producir una xilanasa, el cual
comprende
- a)
- cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 bajo condiciones apropiadas para la expresión de la xilanasa, y
- b)
- recuperar la xilanasa.
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