ES2332822T3 - Expasion sin suero de celulas en cultivo. - Google Patents

Expasion sin suero de celulas en cultivo. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de identificación de un agente como capaz de evitar la diferenciación mientras promueve la proliferación de una célula madre de mamífero durante el cultivo ex vivo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto un agente con al menos una de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A y detectar la unión de dicho agente a dicha al menos una subunidad.

Description

Expansión sin suero de células en cultivo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos y procedimientos para identificar compuestos capaces de promover la proliferación y evitar la diferenciación de células madre/progenitoras.
Descripción de la técnica relacionada
Las células madre han recibido un interés significativo durante los últimos años debido a su potencial, en microentornos celulares adecuados, para diferenciarse y desarrollarse en un gran conjunto de tipos de células y tejidos. Diversas aplicaciones biomédicas importantes serían posibles gracias a la capacidad de generar suficientes agrupamientos de células madre adultas, incluyendo terapia de sustitución celular, terapia génica, y modificación genética de tejidos. De acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, el uso terapéutico de células madre se convertirá en una piedra angular de la medicina en las próximas dos décadas:
\quad
Dado el enorme potencial de las células madre para desarrollar las nuevas terapias para las enfermedades más devastadoras, cuando se identifica una fuente de células madre fácilmente disponible, no es demasiado poco realista decir que esta investigación revolucionará la práctica de la medicina y mejorará la calidad y duración de la vida (Nacional Institutes of Health. Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions. 17 de junio de 2001).
Sin embargo, el desarrollo de dichas aplicaciones para células madre adultas se ha visto gravemente afectado debido a la incapacidad para propagar y expandir las células madre adultas funcionales en cultivo. Hasta la fecha, esto ha resultado ser un desafío singular en la investigación de las células madre (Sherley, J. (2002) Stem Cells, 20: 561-572). Durante décadas, los científicos han intentado desarrollar células madre en cultivo para aumentar el número de células para transplante. El desafío de esta tarea yace en la predisposición de las células madre para diferenciarse. Este problema puede asociarse con la cinética celular asimétrica inherente de las células madre en tejidos somáticos postnatales (Sherley, J. (2002) Stem Cells, 20: 561-572). Los procedimientos científicos existentes usados para aumentar el número de células madre incluyen cultivar células en capas estromales 2-D y desarrollarlas en presencia de diversos cócteles de citoquina (Rebel, VI, et al. (1994) Blood, 83(1 ):128-136). Sin embargo, ninguno de los procedimientos ex vivo existentes puede evitar la diferenciación de células madre mientras promueve la proliferación (Rebel, VI. et al. (1996) J Hematother, 5(1):25-37). Se conocen procedimientos de selección de compuestos útiles en el cultivo de células madre. Por ejemplo, el documento WO 03/104442 describe un procedimiento de selección de compuestos usando receptores particulares de tirosina quinasa como una diana para seleccionar agentes de unión. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de otros compuestos y procedimientos para identificar compuestos capaces de propagar y expandir células madre adultas en cultivo.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de un agente como capaz de evitar la diferenciación mientras que promueve la proliferación de una célula madre de mamífero durante el cultivo ex vivo. El procedimiento comprende poner en contacto un agente con al menos una de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A y detectar la unión de dicho agente a dicha al menos una subunidad.
La unión puede detectarse por inmunotransferencia. Adicionalmente, el agente puede seleccionarse entre el grupo constituido por compuestos de fórmula 1-5, 7-12, 15 y 17-28.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos no representan directamente realizaciones de la invención, pero demuestran la actividad de compuestos que pueden identificarse de acuerdo con los procedimientos de la invención e indican ensayos que pueden usarse para demostrar la actividad de dichos compuestos.
Figura 1. Las Figuras 1A-D muestran que IQ-1 mantiene el estado no diferenciado de las ESC. Figura 1A, Estructura de IQ-1. Figura 1B, la dependencia de la dosis de IQ-I mantiene la actividad de la fosfatasa alcalina. Figura 1C, la dependencia de la dosis de IQ-I mantiene la expresión de SSEA-1. La expresión de SSEA-1 se analizó 7 días después de la adición de IQ-1. Figura 1D, IQ-1 permitió proliferar a las ESC en el estado no diferenciado durante al menos 65 días, sin suministradores de FEM o FIL. Las ESC, en medios complementados con 4 \mug/ml de IQ-1, se hicieron pasar 2-3 veces cada semana a 1 x 10^{5} -1 x 10^{6} células por platillo de 6 cm y se contaron. Todas las barras de error representan la media \pm DT.
Figura 2. Las Figuras 2A-C muestran que IQ-1 mantenía la auto-renovación de las ESC independientemente de FIL. Figura 2A, IQ-1 aumenta la expresión génica de Nanog significativamente comparado con FIL. Se aisló ARNm de las ESC, se cultivó en un sistema sin suministrador, y en presencia de IQ-1 (4 \mug/ml) o FIL (1000 U/ml) durante 21 h. Se realizó RT-PCR en tiempo real para Nanog. El control del nivel de expresión de Nanog en el día 0 se ajustó a 1. Figura 2B, la retirada de IQ-1 disminuye la expresión génica de Nanog en las ESC. IQ-1 se retiró de las ESC que se habían cultivado en el sistema sin suministrador y en presencia de IQ-1 (4 \mug/ml), durante tres días. Al final de este periodo, el ARNm se aisló y se realizó RT-PCR en tiempo real para ensayar la expresión génica de Nanog. Figura 2C, los efectos de IQ-1 no estaban mediados por la señalización de la ruta Stat3 según se juzgó por un ensayo con informador de luciferasa. Las ESC sin suministrador, transfectadas con el informador pSTAT3-TA-Luc, se expusieron a IQ-1 a las dosis indicadas, o FIL. Todas las barras de error representan la media \pm DT.
Figura 3. Las Figuras 3A-C muestran que IQ-1 modula la señalización de Wnt por interacción con PR72/130. Figura 3A, el aislamiento por cromatografía de afinidad de la diana o dianas moleculares de IQ-1 se realizó como se describe en los Procedimientos Experimentales. Las dos bandas a 72 kDa y 130 kDa (marcado) se identificaron por secuenciación espectral de masa como las subunidades reguladoras PR72/130 empalmadas diferencialmente de la proteína fosfatasa serina/treonina, PP2A. Figura 3B, se realizó la inmunotransferencia, usando antisuero PR72/130, para confirmar la identidad de las dos bandas. Figura 3C, IQ-1 provoca defectos de desarrollo en pez cebra. Los embriones de pez cebra en fase de 1 célula se trataron con IQ-1 1 \muM (Inferior) o DMSO como control (Superior) durante 24 h. Los resultados son representativos de al menos 10 embriones, a partir de tres experimentos independien-
tes.
Figura 4. Las Figuras 4A-D muestran que el mantenimiento con IQ-1 de las ESC es dependiente de Wnt/\beta-catenina/CBP. Figura 4A, Modelo de Cambio de Coactivador Wnt/\beta-catenina. Figura 4B, IQ-1 aumentaba el complejo CBP/\beta-catenina a costa del complejo p300/\beta-catenina. Las células P19 se trataron con Wnt3A complementado con IQ-1, ICG-001 de CBP/\beta-catenina o DMSO como control. Los lisados nucleares se co-inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CBP o anti-p300 y se inmunotransfirieron para \beta-catenina. Figura 4C, la fosforilación de Ser89 de p300, de una manera dependiente de PKC, aumentaba la interacción p300/\beta-catenina. Después de la fosforilación in vitro con PKC\alpha, p300 de tipo silvestre (1-110 aa) y p300 mutante (p300 S89A) se mezclaron con lisados de P19 y se co-inmunoprecipitaron usando el marcador HA. Se realizó el análisis por transferencia de Western para p300 (Superior) o \beta-catenina como control de carga (Inferior). Carril 1, unión p300/\beta-catenina Carril 2, unión de p300 fosforilado con PKC\alpha/\beta-catenina Carril 3, unión de p300 de S89A/\beta-catenina Carril 4, unión de p300 de S89A fosforilado con PKC\alpha/\beta-catenina. Figura 4D, IQ-1 disminuyó la fosforilación de p300, las células P19 se trataron con IQ-1 o DMSO (control) y se expusieron a Wnt3A purificado durante 24 horas. Los lisados celulares se inmunotransfirieron usando anticuerpos específicos para p300, o p300 fosforilado en la posición Ser 89 Carril 1 control negativo Carril 2, Wnt3a más DMSO como control, panel superior inmunotransferencia de p300 con fosfo Ser89, panel central inmunotransferencia de p300 Carril 3, Wnt3a más IQ-1, panel superior inmunotransferencia de p300 con fosfo Ser89, panel central inmunotransferencia de p300.
Figura 5. Las Figuras 5A-C muestran la pluripotencia de ESC cultivadas a largo plazo. Figura 5A, las ESC cultivadas a largo plazo se indujeron para formar cuerpos embrioides en cultivos en suspensión durante 3 días. Las ESC cultivadas en medios en presencia de Wnt3A y IQ-1 (4 \mug/ml) durante 48 días pudieron formar cuerpos embrioides (Izquierda). Las ESC perdieron su capacidad para formar cuerpos embrioides después de 3 días de cultivo en ausencia de IQ-1 (Derecha). Figura 5B, se cultivaron ESC tratadas con IQ-1 derivadas de cuerpos embrioides (cultivo de adherencia) durante 7-14 días para inducir diferenciación adicional. La tinción por inmunofluorescencia para \alpha-fetoproteína, actina de músculo liso, GATA4, MAP2, \beta-III tubulina y oligodendrocitos demostró que el cultivo a largo plazo de las ESC en presencia de IQ-1, mantiene la pluripotencia. Figura 5C, modelo que representa el mecanismo de acción propuesto de IQ-1.
Figura 6. La Figura 6 muestra el análisis del informador génico de FCT/\beta-catenina. La construcción informadora FCT/\beta-catenina TopFlash se transfectó complementariamente con una \beta-catenina constitutivamente activa en células NIH-3T3 - wt, CBP (+/-) y p300 (+/-) - en presencia o ausencia de IQ-1. No hubo efecto de IQ-1 sobre el informador Fopflash.
Figura 7. La Figura 7 muestra un cultivo a largo plazo de las ESC en un sistema sin suministrador con medios sin suero complementados con IQ-1 y Wnt3a purificado. Las ESC se cultivaron en KSR al 15%, 4 \mug/ml de IQ-1 y 100 ng/ml de Wnt3a. Las ESC se hicieron pasar 2-3 veces por semana a 1 x 10^{5} -1 x 10^{6} células por platillo de 6 cm y las células se contaron.
Figura 8. La Figura 8 muestra que el mantenimiento con IQ-1 de la proliferación y pluripotencia de las ESC era dependiente de la señalización de Wnt en medios de KSR al 15%. Actividad FA de las ESC cultivadas durante 7 días en IQ-1 que contienen medios complementados con FCS al 15% o KSR al 15%. La adición de Wnt3a aumenta la actividad FA de las ESC cultivadas durante 7 días en medios que contienen KSR al 15% al mismo nivel que los medios que contienen FCS al 15%. (Las barras de error representan \pm D.T.)
Figura 9. La Figura 9 muestra RT-PCR en tiempo real realizado en ESC cultivadas en KSR al 15% complementado con IQ-1 y Wnt3a durante 42 días sin suministradores de FEM. Tras el periodo de 42 días de cultivo, las ESC cultivadas en los medios en presencia de IQ-1 y Wnt3a mantienen la expresión de los marcadores de pluripotencia, (a) Nanog, (b) Oct3/4 y (c) Rex-1. El nivel de expresión en el día 0 se ajustó como 1.
Figura 10. La Figura 10 es una representación esquemática de dos mecanismos de acción posibles de \beta-catenina, resultantes de la interacción alternativa con CBP o p300 en el núcleo.
Figura 11. La Figura 11 ilustra que ICG-001 a una concentración de 10 \muM inducía la diferenciación de mioblastos C2C 12 en medios de crecimiento, similar a los medios de diferenciación, y comparado con el medio de crecimiento en solitario.
Figura 12. La Figura 12 ilustra que la diferenciación de los mioblastos C2C12 estaba inducida por ICG-001 10 \muM en medio de crecimiento, similar al medio de diferenciación.
Descripción detallada de la invención
Las células madre son responsables de la regeneración y mantenimiento de tejidos equilibrando los procedimientos de auto-renovación (es decir, de creación de nuevas células madre) y diferenciación (es decir, generación de células comprometidas con la diferenciación terminal). Este equilibrio resulta de la integración de señales reguladoras intrínsecas a la célula madre, así como señales extrínsecas del microentorno. Las perturbaciones en el equilibrio entre auto-renovación y diferenciación puede dar como resultado enfermedad, bien como resultado del agotamiento de la célula madre (por ejemplo, anemia aplásica) o bien aumento de la auto-renovación (por ejemplo, cáncer). En la neurogénesis, los factores de transcripción Sox1, Sox 2 y Sox3 desempeñan un papel en el mantenimiento de las células neurales en un estado no diferenciado.
La mayor parte del conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la regulación de células madre en mamíferos procede de estudios del sistema hematopoyético. Hay una comprensión extensiva y en expansión de los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación a lo largo de los linajes terminales. Sin embargo, una comprensión mecanística de los mecanismos que regulan las decisiones determinantes de las células madre hematopoyéticas (CMH) se entiende bastante menos. Se han identificado unos pocos genes que, cuando se suprimen, dan como resultado una perturbación de la auto-renovación de las CMH (por ejemplo, TNF\alpha-p55-Receptor, p21, Rae28, y Bmi-1) o una diferenciación alterada (por ejemplo, TEL, PU.1, Flt-3, y p27). La señalización de HoxB4, \beta-catenina, y Notch, por otro lado, estimulan la auto-renovación de las CMH cuando se sobre-expresan en CMH.
Un trabajo reciente ha demostrado que CBP y p300 desempeñan papeles importantes en la auto-renovación y diferenciación de CMH. CBP y p300 funcionan como integradores moleculares de diversas señales transcripcionales. Cuando se reclutan promotores mediante factores de transcripción, funcionan como co-activadores de transcripción mediante múltiples mecanismos, incluyendo remodelación de cromatina, acetilación de proteínas asociadas, y reclutamiento de la maquinaria de transcripción basal. CBP y p300 son altamente homólogos a un nivel estructural, con hasta un 93% de identidad centro de ciertos dominios de unión a proteína (SEC ID Nº: 1 y 2). Para la mayoría de funciones, las dos proteínas parecen ser funcionalmente redundantes. Sin embargo, los estudios genéricos de pérdida de función en ratones demuestran una diferencia en la función de p300 y CBP en las CMH: la pérdida de CBP da como resultado una auto-renovación de CMH defectuosa, mientras que la pérdida de p300 da como resultado una diferenciación hematopoyética defectuosa.
Se ha mostrado previamente que CBP y p300 interactúan con muchos de los factores de transcripción conocidos que se ha mostrado que son importantes en la regulación de CMH (por ejemplo, HoxB4, \beta-catenina, Notch, AML-1, MLL). Los resultados anteriores sugieren que dentro de las CMH puede haber factores de transcripción que se co-activan específicamente mediante CBP que son críticos para la auto-renovación, y otros que se co-activan preferentemente mediante p300 que se requieren de forma crítica para la diferenciación. Un ejemplo de una ruta de señalización que parece utilizar CBP y p300 diferencialmente es la señalización de la ruta de Wnt. Se ha demostrado que la señalización de la ruta de Wnt desempeña un papel pertinente en el desarrollo y mantenimiento de diversos tejidos, incluyendo sangre, intestinos, y piel. Sus efectos se ejecutan al nivel de las células madre y progenitoras, afectando tanto a la auto-renovación como a la diferenciación. Además, la importancia de la señalización de Wnt para mantener las características no diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) se ha establecido bien. Es importante destacar que, cuando la señalización de Wnt se altera puede conducir al desarrollo de cáncer en estos mismos tejidos.
\beta-catenina (SEC ID Nº: 3) es un homólogo vertebrado del gen armadillo de Drosophila, que funciona tanto en la adhesión celular como, como se analiza en el presente documento, en la ruta de señalización de Wnt. \gamma-catenina (SEC ID Nº: 4) también es un homólogo vertebrado de armadillo. \beta-catenina y \gamma-catenina tienen estructuras y funciones análogas, y tienen la capacidad de regularse mediante el supresor de tumores APC.
La activación de la señalización de la ruta de Wnt requiere la estabilización nuclear de los complejos FCT (factor de célula T)/\beta-catenina y el reclutamiento de co-activadores transcripcionales, tales como CBP y p300. \beta-catenina se produce constitutivamente en la célula, y existen mecanismos inhibidores para mantener los niveles de \beta-catenina por debajo de aquellos que conducirían a una actividad transcripcional aberrante in vivo, que conduce a afecciones patológicas tales como cáncer. En un ejemplo de regulación aberrante, Emami y colaboradores (PNAS, 101,12682-7, 2004) demostraron recientemente que \beta-catenina se asocia preferentemente con CBP en células cancerosas. Sin embargo, cuando se evitaba que \beta-catenina se asocie con CBP, utilizando un inhibidor específico para \beta-catenina/CBP, la \beta-catenina podría unirse a p300. La unión "alternativa" de \beta-catenina a p300 iba acompañada de la ejecución de un programa genético diferenciativo (Teo et al. presentado en PNAS). De esta manera, se cree que la \beta-catenina promueve la proliferación sin diferenciación uniéndose a y activando CBP, e inicia la diferenciación con proliferación limitada uniéndose a y activando p300. Por lo tanto, se espera que la perturbación de la interacción de \beta-catenina con CBP y/o p300 influya en la diferenciación o en la proliferación.
La terapia con células madre se basa en la capacidad de las células madre humanas, fetales o adultas, pluripotentes para diferenciarse en diversos tipos de células. Las células madre pueden usarse para sustituir las células dañadas como un tratamiento para muchas enfermedades diferentes incluyendo cáncer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, quemaduras, diabetes, enfermedad coronaria, artritis reumatoide, y osteoartritis y para terapia génica (Lazic, S.E. et al. J Hematother Stem Cell Res, 12(6):635-642, Gafni, Y. et al. Gene Ther, 11(4):417-426). La terapia con células madre ha sido desde hace tiempo un avance médico potencial excitante. La capacidad de inyectar células madre normales en un paciente, donde pueden generar células específicas para un órgano o sustituir potencialmente los tejidos defectuosos de un paciente, ofrece un enorme potencial.
Las células madre embrionarias (células ES) representan una importante herramienta de investigación y un recurso potencial para la medicina regenerativa. Generalmente, las células ES se cultivan con una capa de células suministradoras de soporte de fibroblastos embrionarios murinos (FEM). La capa de suministrador de FEM suministra factores que mantienen la capacidad de las la célula ES para auto-renovarse y diferenciarse espontáneamente en bloque. Estas condiciones incómodas, así como el riesgo de contaminación xenobiótica de las células ES humanas cultivadas en los FEM, hace prioritario desarrollar medios definidos químicamente que puedan utilizarse de forma segura para la expansión de las células ES. Usando una selección basada en la producción celular, la molécula pequeña IQ-1 se identificó como un compuesto que permitía la expansión de células ES de ratón sin una capa suministradora de FEM o la adición del factor inhibidor de leucemia (FIL), y evitaba la diferenciación espontánea. Se ha determinado también que IQ-1 evita que \beta-catenina cambie el uso del coactivador de CBP a p300. El aumento en la transcripción mediada por \beta-catenina/CBP a costa de la transcripción mediada por \beta-catenina/p300 es crítico para el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre.
Las células ES derivadas de la masa celular interna de los embriones puede cultivarse conjuntamente en capas celulares de fibroblastos embrionarios. Más recientemente, Xu et al. (Xu et al. Nat. Biotech. 2001, 19, 971) demostraron que las células ES humanas pueden desarrollarse en condiciones sin suministrador utilizando un medio acondicionado con FEM. Sin embargo, las variaciones en los medios acondicionados con FEM y FEM, la ausencia de conocimiento sobre qué factores son importantes en los medios acondicionados y preocupaciones sobre la contaminación zoonótica enfatizan la necesidad de condiciones químicamente definidas para expandir las células ES.
La capacidad para mantener células madre adultas de piel in vitro ha permitido el injerto de piel cultiva en víctimas de quemaduras (Green, H. (1991) Sci Am, 265:96-102). Además, actualmente, hay tres células madre adultas relacionadas con los procedimientos de transplante usados para la reconstititución hematopoyética: transplante de médula ósea (TMO), transplante de células madre de sangre periférica (TCMSP) y transplante de células madre de sangre del cordón umbilical (TCMSCU). La dos primeras técnicas de reconstitución hematopoyética, TMO y TCMSP, padecen problemas de correspondencia significativos con los donantes alogénicos. El grado de correspondencia requerido para un transplante exitoso parece ser menos riguroso para TCMSCU que para TMO o TCMSP. Sin embargo, el volumen relativamente menor de células madre recolectadas y la disponibilidad de sólo una unidad de sangre de cordón umbilical recogida por procedimiento de transplante limitan la gran aplicabilidad de TCMSCU (McCaffrey, P. Lancet Oncol., 6 (1): 5, 2005). Una solución a este problema es la expansión ex vivo de las células madre de la sangre del cordón umbilical. Sin embargo, hay un obstáculo significativo que superar para proporcionar esta sencilla solución.
Células Madre y "Células Madre" Cancerosas
Una característica unificadora de todos los cánceres es su capacidad de auto-renovación ilimitada, que es también una característica determinante de las células madre normales. Décadas atrás, se descubrió que la capacidad proliferativa de todas las células cancerosas no era equivalente, y sólo una pequeña minoría de células tumorales era capaz de proliferar extensivamente (Hamburger) AW, et al. (1977) Science, 197 (4302): 461 - 463). Esto dio lugar al concepto de que los tumores malignos están compuestos por Células Madre Cancerosas, que tienen un gran potencial proliferativo, así como otro agrupamiento de células cancerosas más diferenciadas, con capacidad proliferativa limitada. Una implicación importante de la hipótesis de las Células Madre Cancerosas es que hay similitudes mecanísticas entre la auto-renovación de las células madre normales y la proliferación de las células madre cancerosas (Pardal, R. et al. (2003) Nat Rev Cancer, 3(12): 895-902). Estudios recientes han demostrado que productos génicos específicos regulan tanto la auto-renovación de las células madre somáticas normales, como la proliferación de células cancerosas (Park, IK. et al. (2003) Nature 423:302-305; Lessard, J. et al. (2003) Nature, 423(6937):255-260). Esto implica que se utilizan mecanismos similares tanto en células madre como en células cancerosas para mantener un estado proliferativo, no diferenciado.
Señalización Wnt en Células Madre y Cáncer
La ruta Wnt/\beta-catenina inicia una cascada de señalización crítica tanto en el desarrollo normal como en el comienzo y progreso del cáncer (Giles, RH et al. (2003) Biochim Biophys Acta, 1653(1): 1-24; Wodarz, A. et al. (1998) Annu Rev Cell Dev Biol, 14:59-88). Se ha demostrado que la señalización de Wnt y en particular las funciones nucleares de \beta-catenina son importantes en el mantenimiento, proliferación así como en la diferenciación de células madre (Song, X. et al. (2003) Development, 130(14): 3259-3268). Algunas de las características sobresalientes de esta ruta de señalización, se resumen en la Figura 1. La ruta de Wnt/\beta-catenina normalmente regula la expresión de un intervalo de genes implicados en promover tanto la proliferación como la diferenciación. La activación de la ruta de Wnt permite que la \beta-catenina se acumule en el núcleo, se una a miembros de la familia FCT de factores de transcripción, y forme un complejo transcripcionalmente activo, reclutando el coactivador transcripcional CBP o su homólogo muy relacionado, p300. Sin embargo, en más del 85% de cánceres de colon, las mutaciones en esta ruta conducen a la activación y expresión constitutiva de genes diana, por ejemplo c-myc, ciclina D1 y survivina, todos los cuales son críticos para la proliferación celular rápida (Kolligs, FT. et al. (1999) Mol Cell Biol, 19(8):5696-5706; Tetsu, O. et al. (1999) Nature, 398(6726):422-426; Kim, PJ. et al. (2003) Lancet, 362:205-209). De esta manera, la tumorigénesis en el epitelio intestinal parece estar causada por la hiper-proliferación inducida por Wnt/\beta-catenina de células madre crypt intestinales, seguido de la acumulación de las mutaciones adicionales que confieren malignidad y progreso del cáncer. También se ha demostrado que la señalización de Wnt es importante para el mantenimiento de la pluripotencia tanto en células madre embrionarias en cultivo tanto de ratón como humanas (Sato, N. et al. (2004) Nat Med, 10(1):55-63). La expresión de múltiples componentes de la ruta de Wnt es evidente en las líneas celulares de carcinoma embrionario humanas P19, así como en células madre embrionarias (Walsh, J. et al. (2003) APMIS, 111(1):197-211).
Wnt y Células Madre Hematopoyéticas (CMH)
La auto-renovación de células madre hematopoyéticas (CMH) se promueve también por señalización de Wnt. La sobreexpresión de \beta-catenina estabilizada en CMH de médula ósea cultivadas de ratones aumentó el número de estas células en cultivo a largo plazo medido por su capacidad para reconstituir los sistemas hematopoyéticos de ratones después de la irradiación. Además, las Wnt3a purificadas promovían la auto-renovación pero sólo inhibían parcialmente la diferenciación de CMH en cultivo (Reya, T. et al. (2003) Nature, 423(6938):409-414).
Uso del Coactivador Diferencial en la Señalización de Wnt/\beta-catenina
Como se ha analizado anteriormente, las funciones de CBP y p300 se han descrito como redundantes en diversos estudios (revisado en Goodman, RH. et al. (2000) Genes Dev, 14(13):1553-1577) y su patrón de expresión durante el desarrollo del ratón es casi idéntico (Partanen, A. et al. (1999) Int J Dev Biol, 43(6):487-494). Sin embargo, cada vez está más claro que estos coactivadores altamente homólogos no son redundantes en condiciones fisiológicas, y son responsables de distintos programas transcripcionales: Rebel et al. (Rebel, V.I. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci EE.UU., 99(23): 14789-14794), usando células de ratones knockout, demostraron que una dosis completa de CBP, pero no de p300, es crítica para la auto-renovación de CMH. A la inversa, p300 pero no CBP, es esencial para la diferenciación hematopoyética apropiada. Análogamente, Eckner y colaboradores (Roth, J.F. et al. (2003) Embo J, 22(19):5186-5196) demostraron un papel crítico para la actividad histona acetil-transferasa de las p300 (HAT) pero no de las actividades HAT de las CBP. Estos estudios y otros demuestran claramente que CBP y p300 desempeñan papeles no redundantes y distintos durante el desarrollo.
A partir de los estudios quimiogenómicos previos del inventor con el inhibidor de molécula pequeña de la interacción \beta-catenina/CBP y la creación del perfil de la expresión génica adicional, se desarrolló un modelo que describe cómo el uso del coactivador diferencial en la señalización de Wnt controla la proliferación frente a la diferenciación. La característica crítica de este modelo es que el brazo CBP (Figura 10, lado izquierdo) de la ruta es esencial para la proliferación sin diferenciación, por ejemplo en cáncer o células madre, mientras que el brazo p300 (Figura 10, lado derecho) es crítico para la diferenciación, con una proliferación limitada. ICG-001 inhibe específicamente la transcripción dependiente de \beta-catenina/CBP (es decir, el brazo izquierdo de la ruta), induciendo así selectivamente la muerte celular programada en células cancerosas (Emami, K.H. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci EE.UU., 101,12682-7,2004), e induciendo la diferenciación de las células precursoras no tumorigénicas, por ejemplo los mioblastos C2C12 (Figuras 11 y 12) y los preadipocitos 3T3-L1.
Sin ceñirse a un mecanismo específico, la premisa es que inhibir o modular a la baja selectivamente la interacción \beta-catenina/p300 (es decir, el lado derecho de la ruta, Figura 10) permite la proliferación sin diferenciación de células madre pluripotentes. La invención trata en parte también del descubrimiento de un mecanismo que implica la unión selectiva de un compuesto o agente a una o más de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A, como se describe con más detalle en el Ejemplo 1 en el presente documento. El agente puede tener actividad similar a IQ-1.
La serina/treonina fosfatasa PP2A está implicada en la regulación de la señalización intracelular, expresión génica y progreso del ciclo celular. Una función principal de PP2A es regular las cascadas de señalización oponiendo la actividad de serina/treonina quinasas (20). PP2A está constituida por un complejo multisubunidad. Los componentes del núcleo de este complejo trimérico son una subunidad catalítica de 36 kDa, una subunidad reguladora de 65 kDa (PR65) y una tercera una subunidad variable, una de las cuales es PR72/130. PR72/130 representa formas empalmadas diferencialmente selectivas para tejidos del mismo gen (21). PP2A regula la señalización de la cascada de Wnt a múltiples niveles (22,23). Recientemente, se ha demostrado que PR72/130 interacciona con la proteína cutícula desnuda (Nkd), un componente regulador negativo de la señalización de la ruta de Wnt (24), modulando de esta manera la señalización de Wnt (25). Creyghton et al., usando morfolinos en embriones de xenopus, demostraron que PR72 como Nkd, es un regulador "negativo" de la señalización "canónica" de Wnt/\beta-catenina y está implicado en el cambio de la señalización "canónica" de Wnt a la extensión convergente "no canónica" (25).
Para el mantenimiento de la proliferación de células madre hematopoyéticas, un agente puede "modular" la proliferación de las células madre afectando a las modificaciones post-traduccionales de cualquiera de CBP, p300, o \beta-catenina, conduciendo a un aumento selectivo de la interacción de \beta-catenina con CBP o una disminución selectiva de la interacción de \beta-catenina con p300, en la que el agente no se une directamente a CBP o p300. Por "interactuar" e "interacción" se entiende la relación biológica normal entre dos o más moléculas, en este caso \beta-catenina con CBP o p300. El agente puede aumentar la unión de \beta-catenina a CBP, o el agente puede disminuir la unión de \beta-catenina a p300. De cualquier forma, el resultado global desvía la ruta de \beta-catenina hacia el "programa proliferativo/de no diferenciación" de las células diana, que pueden ser células madre adultas, tales como células madre hematopoyéticas, células madre neurales o células madre de la piel. Un agente "modulará" la proliferación de las células madre si las células madre experimentan más proliferación y/o menos diferenciación que en ausencia del agente. Por ejemplo, con referencia a la Figura 5C, la unión preferente de \beta-catenina a CBP, con menor unión a p300, está asociada con el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas en un estado no diferenciado en el que experimentan una proliferación continua, que da como resultado un mayor número de células no diferenciadas útiles para la repoblación del sistema hematopoyético de un mamífero, tal como un ser humano, en necesidad de dicho tratamiento. Dicha modulación puede medirse usando, por ejemplo, los ensayos descritos en los Ejemplos en el presente
documento.
Los agentes adecuados para dicho uso pueden seleccionarse usando procedimientos de co-inmunoprecipitación como se describe en Emami et al. PNAS, 101,12682-7, 2004. En resumen, las células diana, en este caso CMH, se transfectan con \beta-catenina de longitud completa o con p300 de longitud completa. Los lisados nucleares se tratan con un agente de ensayo radiomarcado solo, o con agente de ensayo frío. El agente de ensayo radiomarcado no unido se retira, y se mide la incorporación del agente de ensayo radiomarcado. Los resultados indican si el agente de ensayo interacciona específicamente o no con p300.
Una serie separada de experimentos puede demostrar la inhibición de la interacción de \beta-catenina con p300. El dominio de unión mínimo de CBP (aminoácidos 1-111), p300 (aminoácidos 1-111) y la región C-terminal de \beta-catenina (SEC ID Nº: 3) (aminoácidos 647-781) se expresa en células de mamífero tratadas con los agentes apropiados para modificar la interacción y purificación, \beta-catenina se une a perlas de proteína A-agarosa recubiertas con anticuerpo específico para \beta-catenina e incubadas con CBP o p300. Las proteínas no unidas se retiraron por lavado, después las interacciones específicas entre \beta-catenina y p300, y \beta-catenina y CBP, se estimulan usando el agente de ensayo, para ensayar los compuestos que se unen directamente a CBP o fosfo Ser89 p300. Los agentes que aumentan la unión de \beta-catenina a CBP o disminuyen la unión de \beta-catenina a p300 se ensayan adicionalmente in vitro usando un modelo adecuado de proliferación/diferenciación de células madre hematopoyéticas. Uno de estos modelos se describe en Rebel, V. I. et al., PNAS 99:14789-14794, 2002.
Los agentes adecuados pueden conseguir los efectos biológicos deseados mediante uno de varios mecanismos. En cada caso, la referencia a "aumento" o "disminución" se refiere a los resultados del ensayo o a los efectos biológicos relativos a los valores en ausencia del agente. Por ejemplo, el agente puede aumentar la unión de \beta-catenina a los 110 aminoácidos amino-terminales de CBP, o puede disminuir la unión de \beta-catenina a los 110 aminoácidos amino-terminales de p300. La disminución en la unión de \beta-catenina a p300 puede conseguirse inhibiendo la fosforilación de Ser 89 de p300, en la que la fosforilación está catalizada por la proteína quinasa C-épsilon (PKC), proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CaMK), receptor-4 activado por proteasa (PAR-4), receptor-1 activado por proteasa (PAR-1), u otra proteína serina/treonina quinasa directa o indirectamente a través de una cascada quinasa.
La menor fosforilación de Ser 89 de p300 puede conseguirse aumentando la fosforilación de Ser 90, por ejemplo mediante proteína quinasa 4 activada por mitógenos (MAPK), quinasa dependiente de ciclina (CDK), u otra proteína serina/treonina quinasa.
Un agente preferible puede modular la interacción de Ser 89-p300 fosforilado con proteínas 14-3-3. Dichos agentes pueden ser análogos de Fusicoccina. La Fusicoccina es una toxina fúngica que se usa para estudiar la activación de H+-ATPasa. El mecanismo implica inducir un enlace irreversible entre la parte C-terminal de H+-ATPasa, y la proteína 14-3-3. (Svennilid, F. et al., Plant Cell 11:2379-2392, 1999). Como resultado, el dominio de auto-inhibición C-terminal se desplaza. Análogamente, los análogos de Fusicoccina pueden modular la interacción de Ser-89 p300 fosforilado con proteínas 14-3-3, dando como resultado la reducción de la interacción de p300 con \beta-catenina.
El agente puede modular la interacción de Pin1 con \beta-catenina o con CBP o p300. Por ejemplo, el agente puede aumentar la asociación de Pin1 con \beta-Catenina/CBP. Pin1 (prolil isomerasa) se ha visto implicada en mecanismos del cáncer inhibiendo la interacción de \beta-catenina con el supresor tumoral APC. Se ha informado que la sobreexpresión de Pin1 ocurre en cáncer de mama humano. (Ryo, A. et al., Nat. Cell Biol. 3:793-801 (2001)). Pin1 también se ha visto implicado en la espermatogénesis normal. Atchison, F.W. et al. (Biol. Reprod. 69:1989-1997, 2003) informaron que ratones adultos deficientes en Pin1 mostraban evidencia de un agotamiento acelerado de células madre potenciales, y una posible desviación hacia la ruta de diferenciación en ausencia de Pin1.
La fosforilación afecta a la conformación de proteínas y crea condiciones para unir los transductores de señal a ciertos dominios adecuados capaces de reconocer el resto o restos fosforilados. Pin1 reconoce específicamente enlaces S/T-P fosforilados (motivos Ser/Thr-Pro). Por ejemplo, Pin1 se une directamente al motivo Ser-Pro fosforilado (Ser 246-Pro) cerca del sitio de unión a APC en \beta-catenina, inhibe la interacción de \beta-catenina con la proteína poliposis adenomatosa coli (APC), y aumenta de esta manera su translocación en el núcleo. (Ryo, A. et al., Nature Cell Biol. 3:793-801, 2001).
Pin1 también puede afectar a las interacciones del coactivador con factores de transcripción. p73 es un factor de transcripción relacionado con el supresor tumoral p53. p73 modificado con Pin1 presentaba una mayor afinidad por p300 que p73 no modificado. (Montovani, F. et al., Mol. Cell 14:625-636, 2004). Análogamente, la unión de Pin1 a \beta-catenina fosforilada puede aumentar la interacción \beta-catenina/CBP y, de esta manera, la transcripción génica dependiente de \beta-catenina/CBP que promueve la proliferación a costa de la diferenciación.
Dichos agentes pueden incorporarse en biomateriales en los que se desarrollan las células madre hematopoyéticas. Los ejemplos se describen en Horak et al., Biomateriales 25, 5249-60, 2004 y Harrison et al. Biomaterials 25, 4977-86, 2004.
Aunque las células madre hematopoyéticas se describen en el presente documento como una diana de los procedimientos mencionados anteriormente, los procedimientos son aplicables a cualquiera de las células madre adultas de mamífero (o células ES no derivadas de embriones humanos) que pueden usarse para la regeneración de tejidos. Las células madre adultas constituyen una población de células no diferenciadas que retienen la capacidad de proliferar durante toda la vida postnatal y diferenciarse en células especializadas para sustituir las células que enferman, mueren o se pierden. (Agrawal, S. et al; Trends in Biotechnology 23:78-83, 2005). Además de CMH, las células madre adecuadas para usar en los procedimientos anteriores incluyen células madre neurales, células madre de la piel, células madre del músculo, y células de la isleta pancreática.
El objetivo del tratamiento de la diabetes es restablecer los números normales y la función de las células \beta productoras de insulina. Trucco, M. (J. Clin. Invest. 115:5-12, 2005) analizan la existencia de células precursoras pancreáticas adultas que pueden generar células \beta, y se denominan precursores multipotentes derivados del páncreas. Otras células madre pueden inducirse a dirigir su diferenciación hacia la célula \beta. Para cualquiera de estas fuentes de células \beta, los procedimientos y agentes analizados anteriormente son adecuados para inducir la proliferación y limitar la diferenciación, para conseguir un número adecuado de células para uso terapéutico.
Las células madre neurales adultas pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos, que son los tres linajes principales del sistema nervioso adulto. Puede ser apropiado manipular las células madre neurales adultas in situ para conseguir neurogeneración in vivo. Las células madre activas existen en el cerebro adulto en la región del giro dentado del hipocampo y la zona subventricular del prosencéfalo, y estas células madre pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Además, existen agrupamientos de células madre inactivas en la médula espinal, sustancia negra, nervio óptico, e hipotálamo. (Agrawal, S. et al., 2005). De esta manera, agrupamientos definidos de células madre neurales están disponibles para modulación.
Las células madre de la piel pueden inducirse para proliferar in vivo para potenciar o restaurar el crecimiento capilar. Evidencias recientes sugieren que la ruta de Wnt está implicada en la capacidad de las células epiteliales de la piel para adquirir y/o mantener las características de las células madre multipotentes. (Alonso, L. et al.; PNAS 100:11830-11835, 2003). Las células madre multipotentes en la piel reciben las señales de Wnt antes de ser destinadas a la formación de folículos pilosos. En piel de ratón transgénico en la que \beta-catenina está estabilizada constitutivamente, la epidermis interfolicular adulta asume características de la piel embrionaria, y puede tener la capacidad de desarrollarse en folículos pilosos. (Gat, V., Cell 95:605-614, 1998). De esta manera, los agentes y procedimientos analizados anteriormente son adecuados para potenciar la proliferación de células madre multipotentes en la piel, proporcionando un depósito de células capaz de formar folículos pilosos para aumentar o sustituir el crecimiento del cabello perdido, incluyendo aplicaciones in vivo, por ejemplo mediante uso tópico. La Patente de Estados Unidos Nº 6.419.913 describe composiciones adecuadas para el suministro tópico de agentes terapéuticos incluyendo agentes para el tratamiento de la pérdida del cabello. La Patente de Estados Unidos Nº 6.680.344 describe también el suministro tópico de agentes para tratar la pérdida del cabello.
Además de usar las células madre después de la proliferación inducida por los agentes y procedimientos analizados anteriormente, también es posible alterar las células madre antes de su uso, por terapia génica. Se contemplan procedimientos para potenciar la proliferación de células madre de mamífero que expresan un gen exógeno, antes de la administración de las células para uso terapéutico. La terapia génica puede realizarse también in vivo, por ejemplo, para alterar la diferenciación potencial de células madre neurales. (Gomes, W. A. et al., Dev. Biol. 255:164-177, 2003; Pardridge, W.M., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:683-691, 2003).
Un ensayo adecuado para determinar si las células madre de mamífero se mantienen o no en un estado no diferenciado implica el uso de un informador génico bajo el control del promotor OCT4. OCT4 es un marcador conocido del estado no diferenciado de las células madre/progenitoras, y la región promotora puede unirse funcionalmente a un informador génico tal como PFVP (proteína fluorescente verde potenciada) como se describe en Gerrard, L. et al., Stem Cells 23:124-133 (2005)), o luciferasa. Usando cualquier informador génico, las células se transfectan con una construcción de OCT4-informador génico usando los procedimientos descritos en Gerrard et al. (2005) y puede ensayarse el efecto de agentes adecuado sobre el estado no diferenciado frente al estado de diferenciación de las
células.
Los procedimientos para ensayar el efecto de las moléculas pequeñas sobre células madre in vitro incluyen aquellos descritos por Chen, J. K. et al., P.N.A.S. 99:14701-14076 (2002) y Franlt-Kamenctsky, M. et al., J. Biol 1:10 (2002).
Las células madre embrionarias representan una herramienta importante para la investigación y, en principio, un recurso potencial para la medicina regenerativa (Hori Y et al Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2002, 99, 16105, Kim JH et al. Nature, 2002, 418, 50 Lanza RP et al, Nat Med, 1999, 5, 975). Las células ES murinas (ESm), derivadas de masa celular interna pluripotente, pueden desarrollarse en ausencia de células suministradoras en medios complementados con suero y FIL. La capacidad de FIL para mantener la pluripotencia celular de ESm, requiere la activación de la ruta de señalización STAT3. Sin embargo, FIL no mantiene el estado no diferenciado de las células ESh a pesar del hecho de que activa la ruta de señalización STAT3 (Humphrey R y Beattie G Stem Cells 2004, Daheron L y Opitz S Stem Cells 2004).
Como se muestra en detalle en los Ejemplos, la dependencia de la dosis de IQ-1 mantenía la proliferación celular y pluripotencia de ES, IQ-1 podía mantener la proliferación celular de ES en ausencia de suero si los medios se complementaban con Wnt3a. Es importante destacar que Wnt3a más IQ-1 era suficiente para mantener la proliferación celular y pluripotencia de ES durante periodos de tiempo prolongados en cultivo (al menos durante 48 días). Wnt3a más IQ-1 aumentaba la expresión de Oct4 y Sox2 y disminuía la expresión de c-myc en células de carcinoma embrionario P19. Recientemente, Boyer et al. (Cell 122, 947, 2005) han demostrado que Oct4 y Sox2 co-ocupaban los promotores/potenciadores de una parte sustancial de los genes requeridos para el mantenimiento de células ES humanas. Adicionalmente, c-myc parece tener un papel crítico en el equilibrio entre la auto-renovación de las células madre y la diferenciación y el aumento tras la diferenciación (Wilson A et al Genes Dev 18, 2747,
2004).
La señalización canónica o de Wnt/\beta-catenina desempeña un papel crucial en la regulación de la expansión de poblaciones de células madre tanto humanas como de ratón (Kleber M y Sommer L Current Op Cell Bio 2004, Willert K y Brown J Nature 2003, y Sato N y Meijer L Nat. Med 2004). Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que las Wnt pueden actuar como un factor de crecimiento que mantiene la pluripotencia o como alternativa inducir la diferenciación e influir en las decisiones del linaje celular (Kleber y Sommer 2004, Hie F y Sommer L Cell Mol Life Sci 2005, Murashov A, Pak E Faseb J 2004, Feng Z y Srivastava A BBRC 2004).
Recientemente, los inventores han desarrollado un modelo para explicar esta señalización divergente de las actividades de Wnt/\beta-catenina (Figura 5). Este modelo resalta los diferentes papeles de los coactivadores CBP y p300 en la señalización de la ruta de Wnt/\beta-catenina (Emami et al 2004, Ma et al 2005, Teo et al 2005, McMillan y Kahn 2005). La característica crítica del modelo es que la transcripción mediada por FCT/\beta-catenina/CBP es crítica para la proliferación celular de células madre/progenitoras, mientras que un cambio a la transcripción mediada por FCT/\beta-catenina/p300, inducida o no quimiogenómicamente con ICG-001 o endógenamente, es crítica para iniciar un programa de diferenciación con una capacidad proliferativa más limitada. Basándose en este modelo, se realizaron experimentos para determinar si IQ-1 afectaba al uso del coactivador CBP selectivo en la señalización de la ruta de Wnt/\beta-catenina.
IQ-1 promovía selectivamente la interacción \beta-catenina/CBP a costa de la correspondiente interacción p300/\beta-catenina. Usando un enfoque de cromatografía de afinidad, se muestra en el presente documento que las dianas moleculares de IQ-1 son las subunidades reguladoras empalmadas diferencialmente PR72/PR130 de la proteína fosfatasa PP2A (Bernards R 2004 y publicado). Bernards ha demostrado previamente que PR72 interactuaba con la proteína Nkd, un antagonista de la señalización de Wnt/\beta-catenina inducible por Wnt, y que la pérdida de cualquiera de PR72 o Nkd daba como resultado la activación de la señalización de Wnt/\beta-catenina. IQ-1 tenía efectos drásticos sobre el desarrollo embrionario de pez cebra y la extensión convergente. Identificando PR72/130 como dianas moleculares de IQ-1, la invención proporciona un ensayo para identificar otros agentes útiles para promover y/o mantener la proliferación de las células madre.
La capacidad para expandir poblaciones "madre/progenitora" en condiciones de crecimiento definidas tiene importantes ramificaciones en el área de la medicina regenerativa (Hori Y et al Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2002, 99, 16105, Kim JH et al. Nature, 2002, 418, 50 Lanza RP et al, Nat Med, 1999, 5, 975). La señalización de la ruta de Wnt desempeña claramente un importante papel en la expansión de poblaciones "madre/progenitora" (Reya T et al. Nature, 2005,434, 843). Sin embargo, la señalización de Wnt también es crítica en los procedimientos de diferenciación y desarrollo de células, tejidos y órganos. Estos comportamientos de señalización divergentes de Wnt se controlan aparentemente mediante el uso selectivo de las proteínas coactivadoras CBP o p300 (Ma et al., Teo et al. y McMillan y Kahn 2005). La elección endógena del uso del coactivador parece estar controlada por una serie compleja de modificaciones post-traduccionales diferenciales.
Farmacológicamente, el inventor había mostrado previamente la selección directa del coactivador bloqueando la interacción CBP/\beta-catenina con ICG-001, forzando de esta manera un cambio a la interacción p300/catenina, que tiene efectos divergentes del promotor específico (Ma et al.). Los resultados de la presente invención demuestran que IQ-1, mediante la modulación de las modificaciones post-traduccional y la interacción con los componentes de la retroalimentación inhibidora de Wnt/\beta-catenina, puede manipular también la selección de Wnt/coactivador de \beta-catenina. Potenciar la señalización de Wnt/\beta-catenina/CBP y evitar el cambio al uso de Wnt/\beta-catenina/p300 mediante IQ-1 permite la expansión a largo plazo de células ES mientras se mantiene la pluripotencia en medios definidos sin FEM o suero. La proliferación controlada de células "madre/progenitoras" para la producción de los materiales de partida requeridos para la medicina regenerativa es una aplicación importante.
Los compuestos adicionales útiles para la realización práctica de los procedimientos descritos y reivindicados en el presente documento incluyen los compuestos descritos y mostrados en la publicación de patente japonesa JP2006/180763A2, presentada el 27 de diciembre de 2004. Los compuestos de la publicación de patente incluyen aquellos designados como compuestos con las estructuras como las descritas en el documento JP2006/180763A2; los ejemplos se muestran a continuación.
Los compuestos incluyen los siguientes, designados a continuación como números de fórmula (compuesto).
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1 
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes; y representan un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno. El anillo A indica un anillo de 5 a 8 miembros que contiene dentro del anillo al menos un heteroátomo. X indica un grupo alquileno con de 0 a 10 átomos en la cadena principal. Un grupo alquileno con 0 átomos indica un enlace sencillo. El etileno configurado por al menos uno de dichos grupos alquileno puede estar sustituido con un grupo - C = C- y/o un grupo - N = N - y/o un grupo - CONH -. Además, puede ser un grupo doble enlace que se une con el anillo A. Además, el grupo alquileno puede tener al menos un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno como un grupo de sustitución. G es un grupo aromático que puede tener un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un grupo hidrógeno. Dicho anillo A puede tener al menos un grupo atractor de electrones y/o un grupo donador de electrones como un grupo de sustitución en lugar de un grupo -XG.
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2 
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, X y G son iguales que los definidos en el Compuesto 1 anterior. R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9} pueden ser iguales o pueden ser diferentes e indican un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno.
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3 
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, X y G son iguales que los definidos en el Compuesto 1 anterior. R^{5} y R^{6} pueden ser iguales o diferentes e indican un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno.
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4 
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9} son iguales a los definidos anteriormente. R^{10}, R^{11}, R^{12} y R^{13} pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno. La línea discontinua de lado doble y sencillo indica un enlace sencillo o un doble enlace. Cuando la línea discontinua de lado doble y sencillo indica un doble enlace, está presente un isómero geométrico para la parte de la línea ondulada. No hay restricciones particulares sobre dónde se disponen estos isómeros geométricos y pueden ser independientes entre sí, o pueden ser entidades E o entidades Z.
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5 
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en la que A puede ser un átomo de hidrógeno o la Fórmula 6:
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6 
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9} son iguales a los definidos anteriormente. R^{10}, R^{11}, R^{12} pueden ser iguales o diferentes e indican un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de
hidrógeno.
7
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son iguales a los definidos anteriormente. R^{7}, R^{8} y R^{9} pueden ser iguales o diferentes e indican un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno.
8
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno. Por "un grupo donador de electrones" se entiende un grupo de sustitución que puede donar electrones a un anillo de benceno; por "grupo atractor de electrones" se entiende un grupo de sustitución que tiene la capacidad de atraer electrones sobre un anillo de benceno. Además, el grupo donador de electrones se define como _{\sigma} < o y el grupo atractor de electrones se define como _{\sigma} > o usando la constante del grupo de sustitución de Hammett _{\sigma}. (Fundamental Organic Reaction Theory, Hashimoto Yasunobu, et al., Sankyo Publishing, 1997).
9
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y X y G se definen como en el caso anterior. R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9} pueden ser iguales o diferentes e indican un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno.
10
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y X y G se definen como en el caso anterior, R^{5} y R^{6} pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno.
11
12
en la que A es un átomo de hidrógeno o la Fórmula 13:
13
Para las Fórmulas 11 y 12, R^{1} a R^{13} pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo atractor de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno. Los ejemplos específicos incluyen:
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(4-bromo-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3-bromo-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(4-clor-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3-clor-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-m-tolil azo-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-p-tolil azo-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-metoxi-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)2-(3-metoxi-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-nitro-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(3-nitro-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-sulfamoil-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(3-sulfamoil-fenil azo)-acetamida
2-(4-acetil amino-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)- acetamida
2-(3-acetil amino-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(2-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3, 4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-fenil azo-acetamida
éster de (4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetato de etilo
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-1-il)-acetamida
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)N-metil-acetamida
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-fenil-acetamida
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(2,3,3-trimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
(4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetonitrilo
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N,N-dimetil-acetamida
(4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetato
2-(2-acetil-3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-acetil-fenil azo)-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-p-tolil-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-m-tolil-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-o-tolil-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-(4-metoxi-fenil)-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-(3-metoxi-fenil)-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-(4-nitro-fenil)-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-(3-nitro-fenil)-acetamida
éster de benzoato de 4-[2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden-acetil amino]-etilo
éster de benzoato de 3-[2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetil amino]-etilo
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-fenil-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-(2,4-dimetilfenil)-acetamida
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
14
en la que R^{1} a R^{9} son grupos atractores de electrones, un grupo donador de electrones o un átomo de hidrógeno que pueden ser iguales o diferentes. De estos, R^{1} a R^{9} deberían ser un grupo o un átomo seleccionado entre un grupo constituido por un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo hidroxilo, un grupo nitro, un grupo nitrilo, un grupo acetoxi, un grupo acetoxi alquilo, un grupo amino alquil alquilo cíclico que puede incluir un átomo de oxígeno, un grupo aminoalquil dialquilo, un grupo amino vinil dialquilo, un grupo amino alquil hidroxi alquilo, un grupo aminovinil arilo, un grupo alcoxi carbonilo, un átomo de halógeno y un átomo de hidrógeno. Además, R^{1} y R^{2} deberían ser un átomo de hidrógeno; R^{3} debería ser un grupo hidroxi o un grupo acetoxi; R^{4} debería ser un grupo acetoxi alquilo, un grupo aminoalquil alquilo cíclico que puede contener un átomo de oxígeno, un grupo amino alquilo inferior di-alquilo inferior, un grupo amino alquilo inferior hidroxi alquilo inferior o un átomo de hidrógeno;
R^{5} debería ser un grupo alquilo inferior, un grupo amino vinil di-alquilo inferior o un grupo amino vinil arilo; R^{6} debería ser un grupo nitro; R^{7}, R^{8} y R^{9} deberían ser un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior o un átomo de hidrógeno que pueden ser iguales o diferentes.
Los ejemplos específicos de los compuesto incluyen:
2-metil-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
2-[2-(4-metoxi-fenilo amino)-vinil] -3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
1-(2-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
clorhidrato de 1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-7-morfolina-4-il metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
clorhidrato de 7-[(3-hidroxi-propil amino)-metil]-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-(2-dimetil amino vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dietil amino metil-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol acetato 7-acetoxi metil-2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-il éster
2-(2-dimetil amino vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-metil-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
acetato de 7-dimetil amino metil-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
éster metílico de 6-acetoxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-7-ilo
2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
éster metílico de acetato de 6-acetoxi-2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-7-ilo
1-(4-clor-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
éster metílico de acetato de 2-(2-dimetil amino-vinil)-6-hidroxi-1-(4-metoxil-fenil)-3-nitro-1H-indol-7-ilo
éster de carbonato de 5-hidroxi-2-metil-4,6-dinitro-1-fenil-1H-indol-3-etilo
7-[[bis-(2-hidroxi-etil)-amino]-metil]-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-[[bis-(2-hidroxi-etil)-amino]-metil]-2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
2-(6-hidroxi-3-nitro-1-fenil-1H-indol-2-il metil)-isotio urea
éster de acetato de 2-(N,N'-difenil-carbamimida il sulfanil metil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-6-ilo
éster metílico de acetato de 6-acetoxi-1-(4-acetoxi-fenil)-2-(dimetil amino-vinil)-3-nitro-1H-indol-7-ilo
2-(2-dimetil amino-5-hidroxi-benzofuran-3-il)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-6-ol
5-bromo-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
acetato de 1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
7-dietil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
2-(2-dimetil amino-5-hidroxi-benzofuran-3-il)-6-metoxi-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
6-metoxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
2-(2-dimetil amino-vinil)-6-metoxi-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
5-bromo-6-hidroxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-1H-indol-3-carbonitrilo
5,7-dibromo-6-hidroxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-1H-indol-3-carbonitrilo
6-hidroxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-1H-indol-3-carbonitrilo
6-hidroxi-2-metil-1-p-tolil-1H-indol-3-carbonitrilo
6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-carbonitrilo
1H-furo [2,3-g] indol-3-acetato, 5-hidroxi-1-(4-metoxi fenil)-2,8-dimetilo, éster etílico
\newpage
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éster de acetato de 5-bromo-7-dimetil aminometil-6-hidroxi-1-fenil-2-fenilo sulfanil metil-1H-indol-3-etilo
6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-acetato
éster de acetato de 5-bromo-6-hidroxi-1-fenil-2-fenilo sulfanil metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-5-bromo-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 5-bromo-7-dimetil amino metil-6-hidroxi-1-fenil-2-fenilo sulfanil metil-1H-indol-3-etilo.
éster de acetato de 6-acetoxi-5-bromo-2-bromometil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-2-bromo metil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
pirrolo [2,3-f] [1,3] benzoxadin-3-acetato, 8-etil-1,7,8,9-tetrahidro-2-metil-1-(4-nitrofenil)-, éster etílico
éster de acetato de 6-acetoxi-2-metil-1-(2-trifluorometil-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(2,4-dimetoxi-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-etoxi carbonil-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-ciano-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-(2-trifluoro metil-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-(4-trifluoro metil-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-(4-nitro-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-bromo-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-fluoro-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-(4-nitro-fenil)-5,7-bis-piperidin-1-il metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 5,7-bis-dimetil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1-(4-nitro-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-(4-nitro-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-1-(4-clor-fenil)-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 7-dimetil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1-(4-nitro-fenil)-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 7-dimetil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-p-tolil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-hidroxi-2-metil-1-fenil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-clor-fenil)-7-dimetil amino metil-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-dimetil amino-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(2-clor-fenil)-6-metoxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(2-clor-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-1-(4-clor-fenil)-2-metil-5,7-dinitro-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-clor-fenil)-6-hidroxi-2-metoxi-2-metil-5,7-dinitro-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-5,7-dibromo-1-(4-clor-fenil)-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 5,7-dibromo-1-(4-clor-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 6-acetoxi-5-bromo-1-(4-clor-fenil)-2-metil-1H-indol-3-etilo
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éster de acetato de 5-bromo-1-(4-clor-fenil)-6-metoxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
1-(4-clor-fenil)-6-metoxi-2-metil-1H-indol-3-acetato
éster de acetato de 1-(4-clor-fenil)-6-metoxi-2-metil-1H-indol-3-etilo
éster de acetato de 1-(4-clor-fenil)-6-hidroxi-2-metil-1H-indol-3-etilo.
Los ejemplos del grupo alquilo inferior representado por R son los siguientes: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, 1-metil propilo, n-hexilo, isohexilo, 1,1-dimetil butilo, 2,2-dimetil butilo, 3,3-dimetil butilo, 3,3-dimetil propilo, 2-etil propilo y similares. Metilo es especialmente adecuado. Los ejemplos del grupo alcoxi inferior representado por R son los siguientes: metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi y similares. Metoxi es especialmente adecuado.
Los ejemplos del átomo de halógeno representado por R son los siguientes: flúor, cloro, bromo, yodo y similares aunque cloro o bromo son especialmente adecuados. Los ejemplos del grupo acilo inferior representado por R son los siguientes: formilo, acetilo, propionilo, butirilo y similares y acetilo es especialmente adecuado. Los ejemplos del grupo alquilo inferior que pueden formar la estructura cíclica representado por R son los siguientes: ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo y similares. Ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo son especialmente adecuados.
Los ejemplos del alcoxi inferior carbonilo representado por R son los siguientes: metoxi carbonilo, etoxi carbonilo, propoxi carbonilo y similares, siendo metoxi carbonilo o etoxi carbonilo especialmente adecuados. Los ejemplos del amino carbonilo representado por R son los siguientes: -CONR_{2} (R es un átomo de hidrógeno que pueden ser iguales o diferentes; representa el grupo alquilo inferior ilustrado previamente, y un grupo fenilo que puede tener un grupo de sustitución).
Los ejemplos del grupo aminocarbonilo secundario representado por R son -CONHR (R indica un grupo alquilo inferior ilustrado previamente y un grupo fenilo que puede tener un grupo de sustitución). Además, el grupo amino carbonilo terciario puede ser -CONR_{2} (R representa el grupo alquilo inferior que se ilustró previamente que pueden ser iguales o diferentes, y un grupo fenilo que puede tener un grupo de sustitución). Los ejemplos del grupo amino alquilo representado por R son: -(CH_{2})_{n} -NR_{2} (donde n es un número entero de 1 a 8 y preferiblemente 1). R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo inferior, o un grupo alquilo inferior que puede formar una estructura cíclica que pueden ser iguales o diferentes (pueden incluirse de 1 a 3 heteroátomos de nitrógeno y oxígeno en la estructura cíclico), y un grupo fenilo que puede tener un grupo de sustitución) y similares.
Un ejemplo del acetoxi alquilo representado por R es: -(CH_{2})_{n} -Oac (donde n es un número entero de 1 a 8) y n es preferiblemente 1.
Otros ejemplos específicos incluyen los compuestos de fórmulas 17-28 a continuación.
3,3-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinoliniden-1-acetamida (fórmula 17)
15 
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2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida (fórmula 18)
16 
\newpage
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2-(3-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida (fórmula 19)
17 
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2-(4-acetil-fenil azo)-2-(2,3,3-trimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida (fórmula 20)
18 
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2-(2-acetil-3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-acetil-fenil azo)-acetamida (fórmula 21)
19 
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(4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetonitrilo (fórmula 22)
20 
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(4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetato (fórmula 23)
21 
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éster de acetato de (4-acetil-fenil azo)-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-etilo (fórmula 24)
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22 
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2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-metil-acetamida (fórmula 25)
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23 
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2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N,N-dimetil-acetamida (fórmula 26)
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24 
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2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-fenil-acetamida (fórmula 27)
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25 
\newpage
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-1-il)-acetamida (fórmula 28)
26 
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Otros ejemplos de compuestos incluyen:
2-ciano-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-N-p-tolil-acetamida
2-(4-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3-clor-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3,3-dfinetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(3-metoxi-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(3-nitro-fenil azo)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-(4-tolil-azo-fenil azo)-acetamida
2-(3-acetil-fenil azo)-2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-acetamida
2-(3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-iliden)-2-en-tolil-azo-acetamida 2-metil-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol 2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
2-[2-(4-metoxi-fenilo amino)-vinil]-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol 1-(2-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-7-morfolina-4-il metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-[(3-hidroxi-propil amino)-metil]-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol
éster de acetato 7-acetoxi metil-2-metil-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-7-piperidin-1-il metil-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil -2-metil-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
7-dimetil amino metil-1-(4-metoxi-fenil)2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
éster metílico de acetato 6-acetoxi-1-(4-metoxi-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-7-ilo
2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-p-tolil-1H-indol-6-ol
2-(2-dimetil amino-vinil)-3-nitro-1-fenil-1H-indol-6-ol
éster de acetato 6-acetoxi-2-(2-dimetil amino-vinil)-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-7-il metilo
1-(4-clor-fenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol
éster de acetato 2-(2-dimetil amino-vinil)-6-hidroxi-1-(4-metoxi-fenil)-3-nitro-1H-indol-7-il metilo
éster de carboxilato de 5-hidroxi-2-metil-4,6-dinitro-1-fenil-1H-indol-3-etilo.
Dichos compuestos pueden ensayarse como se describe en los Ejemplos en el presente documento para su adecuabilidad para la realización práctica de los procedimientos descritos en el presente documento.
Debe entenderse que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son sólo para propósitos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos se les ocurrirán a las personas especialistas en la técnica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no se incluyen dentro del alcance de la invención actualmente reivindicada pero ayudan a entender la invención demostrando la actividad de un compuesto que puede identificarse usando el procedimiento de la invención.
Procedimientos Experimentales usados en los Ejemplos 1-7
Cultivo celular. Se mantuvieron ESC, D3ES (ATCC CRL-1934) en FEM tratados con mitomicina C en medio de ESC de ratón que contenía DMEM (Invitrogen) complementado con FBS al 15% (Invitrogen), aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Invitrogen), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma), L-glutamina 2 mM (Invitrogen) y 1.000 U/ml de FIL (CHEMICON). Para retirar los FEM, las células se recogieron por tripsinización y se colocaron en placas en platillos de cultivo recubiertos con gelatina durante 20 min. Las células no adherentes que consistían principalmente en ESC se volvieron a colocar en placas en platillos de cultivo recubiertos con gelatina de nuevo. Las células no adherentes se usaron para experimentos adicionales. Se cultivaron células P19 de acuerdo con las condiciones recomendadas por la ATCC. Las células se incubaron a 37ºC en una incubadora al 5% de CO_{2}. El Wnt3a purificado se adquirió (R&D Systems).
Selección de Compuestos. Para la selección de molécula pequeña, se determinó la actividad de fosfatasa alcalina de las ESC. Las ESC se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon) a una densidad de 316-1.000 células por pocillo en medio de ESC sin FIL. Los compuestos se añadieron a una concentración final de 4 \mug/ml. Las células se trataron con compuestos durante 7 días y las poblaciones de células de ensayo se lavaron con PBS y se añadieron 100 \mul de solución de fosfato de p-nitrofenilo (MOSS Inc.). La absorbancia a 405 nm se midió mediante un espectrofotómetro (Spectramax, Molecular Devices).
Citrometría de Flujo. El análisis de la expresión de SSEA-1 de las ESC se realizó por citometría de flujo de acuerdo con Zandstra et al. (35). La población de células de ensayo se lavó en solución salina equilibrada de Hanks (Invitrogen) enfriada con hielo que contenía FCS al 2% (HF) y se resuspendió durante 10 min en HF que contenía anticuerpo monoclonal anti-ratón CD16/CD32 a 1 \mug/100 \mul (Phamingen) para bloquear la unión no específica. Las células bloqueadas se incubaron después a 1x10^{7} células/ml durante 40 min en hielo con anti-SSEA-1 (Kyowa Medex) seguido de anticuerpo FITC-Cabra anti Ratón IgM (ZYMED). Las células a analizar para su expresión de SSEA-1 se lavaron entonces dos veces en HF, añadiendo 2 \mug/ml de yoduro de propidio (Dojindo) en el lavado final. Las células se resuspendieron después en HF para su análisis en un FACS Calibur (Becton Dickinson).
Las células NIH-3T3 (wt), las células NIH-3T3 CBP (+/-) y las células NIH-3T3 p300 (+/-) se transfectaron como se describe en (26). En resumen, las células se transfectaron con TOPFLASH o FOPFLASH, usando Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals). Las eficacias de transfección se normalizaron con el plásmido de luciferasa pRL-nulo. Los ensayos con luciferasa se realizaron con el Sistema de Ensayo de Informador DUAL-Luciferasa (Promega).
RT-PCR en Tiempo Real. El ARN total se aisló y se transcribió en fase inversa usando Superscript III (Invitrogen). Se realizó RT-PCR en tiempo real (Sybr Green; BioRad) usando los cebadores específicos para genes:
Nanog-F agggtctgctactgagatgctctg
(SEC ID Nº: 5)
Nanog-R caaccactggtttttctgccaccg
(SEC ID Nº: 6)
GAPDH-F ggtgaaggtcggtgtgaacgga
(SEC ID Nº: 7)
GAPDH-R tgttagtggggtctcgctcctg
(SEC ID Nº: 8)
\newpage
En algunos experimentos, se transcribieron 2 \mug del ARN total extraído en fase inversa usando el sistema Superscript III RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se amplificó 1 \mul de ADNc por PCR con uno o más de los cebadores específicos para genes de las SEC ID Nº: 5-18 usando ciclos de PCR optimizados para obtener reacciones amplificadas en el intervalo lineal.
Oct-3/4-F ggcgttctctttggaaaggtgttc
(SEC ID Nº: 9)
Oct-3/4-R ctcgaaccacatccttctct
(SEC ID Nº: 10)
Rex-1-F gtcttatcgatgctggagtg
(SEC ID Nº: 11)
Rex-1-R aaagctcttctcgcagccat
(SEC ID Nº: 12)
Sox-2-F gcatgtcctactcgcagcag
(SEC ID Nº: 13)
Sox-2-R gctgatcatgtcccggaggt
(SEC ID Nº: 14)
C-Myc-F accaacagcaactatgacctc
(SEC ID Nº: 15)
C-Myc-R aaggacgtagcgaccgcaac
(SEC ID Nº: 16)
MDR-1-F tgcttatggatcccagagtga
(SEC ID Nº: 17)
MDR-1-R ttggtgaggatctctccgcgt
(SEC ID Nº: 18)
Transfección y ensayo con Luciferasa. Se cultivaron ESC en platillos de cultivo celular de 96 pocillos recubiertas con una solución de gelatina acuosa al 0,1% y se transfectaron con 0,2 \mug/pocillo de pSTAT3-TA-Luc (CLONTECH), usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de 6 horas, las células se lavaron y se expusieron a IQ-1 a las dosis indicadas, o FIL, durante 24 horas. Las eficacias de transfección se normalizaron con el plásmido de luciferasa pRL-nulo. Los ensayos con luciferasa se realizaron con el Sistema de Ensayo Informador DUAL-Luciferasa (Promega).
En algunos experimentos, las células NIH-3T3 (wt), las células NIH-3T3 CBP (+/-) y las células NIH-3T3 p300 (+/-) se transfectaron como se describe en (26). En resumen, las células se transfectaron con TOPFLASH o FOPFLASH, usando Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals). Las eficacias de transfección se normalizaron con plásmido de luciferasa pRL-nulo. Los ensayos con luciferasa se realizaron con el Sistema de Ensayo Informador DUAL-Luciferasa (Promega).
Detección de CBP, p300, y fosfo-serina89-p300 en células P19. Las células P19 se expusieron a Wnt3A o vehículo de control, después de lo cual se añadió IQ-1 a una concentración final de 10 \muM. El DMSO de control era del 0,025%. Las células se incubaron durante 24 horas. Al final de este periodo de incubación, las células se lavaron, se lisaron y se sometieron a SDS-PAGE. Se detectaron CBP y p300 usando el anticuerpo policlonal de conejo (A-22) (1:5000); y (C-20) (1:5000) (Santa Cruz), respectivamente. Se detectó fosfo-serina89-p300 usando antisuero habitual a una dilución de 1:100.
Co-inmunoprecipitación de \beta-catenina con CBP o p300 en células P19. La co-inmunoprecipitación se realizó como se describe en (27). En resumen, las células P19 se trataron con ICG-001 10 \mum o IQ-1 10 \muM (el DMSO de control era del 0,025%) durante 24 horas, después de lo cual se lavaron y lisaron usando. La fracción nuclear se aisló y preaclaró con anticuerpos para CBP (A-22) o p300 (N-15). Se detectó la \beta-catenina usando un anticuerpo monoclonal de ratón (Becton Dickinson) a una dilución de 1:5000.
Afinidad de p300 fosforilado in vitro con 3-catenina. p300 recombinantes (1-110 aa) condensadas con un marcador HA se incubaron con PKC\alpha en tampón quinasa (Hepes 20 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 10 mM, ditiotreitol 1 mM, ATP 100 \muM). La co-inmunoprecipitación se realizó en lisados de P19 mezclados con el p300 fosforilado in vitro usando un anticuerpo del marcador HA, se detectó p300 usando el anticuerpo policlonal de conejo (C20), 1:5000, se detectó 3-catenina usando un anticuerpo monoclonal de ratón (Becton Dickinson) a una dilución de 1:5000.
Purificación por Afinidad de Proteínas Diana. Se cultivaron células P19 a una confluencia del 90-100%. Las células se lisaron en tampón de unión a proteína [PBB, Hepes 20 mM, pH 7,9/NaCl 100 mM/EDTA 0,5 mM/Nonidet P-40 al 0,5%/MgCl_{2} 6 mM/2-mercaptoetanol 5 mM/un comprimido de mezcla de inhibidor de proteasa completo (Roche Molecular Biochemicals)]. Se unió IQ-1 biotinilado durante una noche a temperatura ambiente a una suspensión al 50% de perlas de estreptavidina-agarosa (Amersham Pharmacia) en tampón que contenía DMSO al 50% y PBB al 50%. Las perlas se lavaron para retirar IQ-1 no unido y después se incubaron con lisados celulares completos. Las proteínas que eluyeron por ebullición en SDS se tiñeron por Coomassie para detectar proteínas diana, o inmunotransferidas.
Experimentos con pez cebra. La cepa de pez cebra de tipo silvestre (AB) en la fase de 1-célula se trató con IQ-1 a una concentración final de 1 \muM en medio embrionario durante 24 h. Se incubaron embriones de pez cebra de control a una concentración equivalente de DMSO. Al final de este tratamiento de 24 h, los embriones se decloraron manualmente y se crearon imágenes. Los embriones de pez cebra se mantuvieron a 28ºC. Los resultados mostrados son representativos de aquellos obtenidos de al menos 10 embriones para cada grupo, a partir de 2 experimentos independientes.
Inmunocitoquímica y Anticuerpos. Las células se fijaron durante 20 min con paraformaldehído al 4% en PBS. La inmunotinción se realizó usando protocolos convencionales. Se usaron anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: monoclonal de ratón anti \alpha-fetoproteína (R&D sistemas, 10 \mug/ml), anti-Actina, monoclonal de ratón Ab-1 para músculo liso (LAB VISION, 1:1), monoclonal de ratón anti-GATA4 (SANTA CRUZ, 1:100), monoclonal de ratón anti-MAP(proteína asociada a microtúbulos)2 (Chemicon, 1:200), monoclonal de ratón \betaIII-tubulina (Chemicon, 1:200), monoclonal de ratón anti-Oligodendrocito (Chemicon, 1:1,000). Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 o 594 IgG de cabra anti-ratón (H+L) (lnvitrogen, 1:200). Se crearon imágenes de las células usando un microscopio Olympus IX 70 con un aumento x 40-200.
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Ejemplo 1
PR72/130 y proliferación de células ES
La molécula pequeña IQ-1 (Asahi Kasei Pharma, Figura 1) aumentó selectivamente el uso de \beta-catenina de CBP como un coactivador a costa del uso de p300, manteniendo de esta manera las células embrionarias (ES) en un estado no diferenciado. La combinación de Wnt3a e lQ-1 permitió la proliferación y el mantenimiento de la pluripotencia como se juzga mediante la expresión de Oct4, Nanog y Rex1, mientas que IQ-1 solo no era suficiente para provocar la proliferación y mantener la pluripotencia de las células ES.
El presente ejemplo se refiere a la identificación de la diana molecular de IQ-1. Para identificar la diana molecular de IQ-1, lisados celulares completos de células de carcinoma embrionario P19 se trataron con IQ-1 biotinilada. Comparada con un compuesto biotinilado de control (Figura 3A, carril 2), la IQ-1 biotinilada se unió selectivamente a tres proteínas (Figura 3A, carril 3). Las dos bandas a 72 y 130 kDa se identificaron por secuenciación espectral de masa como las subunidades reguladoras PR72/130 empalmadas diferencialmente de la proteína fosfatasa serina/treonina, PP2A. Esto se confirmó posteriormente por inmunotransferencia (Figura 3B).
El hecho de que IQ-1 se una selectivamente a estas proteínas se correlaciona bien con los efectos observados sobre la modulación de la señalización de Wnt, ya que previamente se había demostrado que PR72/130 interacciona con la proteína cutícula desnuda, un componente de la ruta de señalización de Wnt, regulando de esta manera la señalización de Wnt (Creyghton, M. P. et al., Genes and Dev 19:376-386 2005). Usando morfolinos en embriones de xenopus, se demostró también que PR72, como cutícula desnuda (Nkd), es un regulador negativo de la señalización de Wnt/\beta-catenina y está implicado en el cambio a una extensión convergente no canónica (Creyghton et al.).
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Ejemplo 2
IQ-1 mantenía el estado no diferenciado de las ESC
Se seleccionaron ESC murinas (D3 ES) con una biblioteca química (Asahi Kasei) para identificar compuestos que potenciaran la producción de Fosfatasa Alcalina (FA), un marcador de las ESC no diferenciadas (12). A partir de esta selección, se identificó IQ-1 (PM = 362,42, Figura 1 A), cuya dosis aumentaba de forma dependiente la actividad de FA (Figura 1B), en medios que contenían FCS al 15% sin la adición de factor inhibidor de leucemia exógeno (FIL). El tratamiento con IQ-1 dio como resultado una expresión potenciada del marcador de ESC no diferenciado, Stage Specific Embryonic Antigen 1 (SSEA-1) de una manera dependiente de la dosis (Figura 1C).
IQ-1 permitía la expansión a largo plazo de las ESC en cultivo sin FEM y sin la adición de FIL exógeno. Se cultivaron ESC D3 de ratón en medios que contenían FCS al 15% más 4 \mug/ml de IQ-1 durante 65 días. Las ESC continuaron proliferando a una velocidad constante con un aumento aproximado de 2 log cada diez días (Figura 1D).
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Ejemplo 3
IQ-1 mantenía la auto-renovación de ESC murina independientemente del FIL
La citoquina FIL, activando la ruta de transducción de señales Stat3, mantiene la auto-renovación simétrica de ESC murina y bloquea la diferenciación (13, 14, 15). FIL no mantenía la auto-renovación de ESC humana (16, 17). Nanog es un factor de mantenimiento de la pluripotencia de la homeoproteína divergente para las ESC (18, 19). Se ha demostrado que Nanog actúa en paralelo con la estimulación accionada por FIL de Stat3 para accionar la auto-renovación de ESC. Además, una elevada expresión de Nanog es suficiente para la expansión clonal de las ESC y el mantenimiento de expresión del factor de transcripción de la célula madre clave Oct4, en ausencia de activación de Stat3 (19).
Para investigar adicionalmente el mecanismo de acción de IQ-1, se determinaron los efectos de IQ-1 sobre la expresión de Nanog. Mientras las ESC sin suministrador tratadas con FIL sólo aumentaban ligeramente los niveles de Nanog, IQ-1 aumentó y mantuvo significativamente la expresión de Nanog en cultivo según se juzgó por RT-PCR en tiempo real (Figura 2A). La retirada de IQ-1 del cultivo condujo a la caída precipitada en el nivel de Nanog (Figura 2B). La pérdida de expresión de Nanog se había correlacionado previamente con la diferenciación de ESC (18, 19). Para confirmar adicionalmente que los efectos de IQ-1 no estaban mediados por la señalización de Stat3, se utilizó una construcción de Stat3/informador génico de luciferasa. Mientras IQ-1 elevaba significativamente la expresión de Nanog, no afectó a la expresión de Stat3/luciferasa a diferencia de FIL, que como se había anticipado, suscitó una respuesta significativa (Figura 2C). A partir de este Ejemplo, puede concluirse que los efectos de IQ-1 sobre el mantenimiento de la pluripotencia de ESC murina son independientes de la ruta de FIL/Stat3.
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Ejemplo 4
IQ-1 modula la señalización de WNT por interacción con PR72/130
Este ejemplo se realizó para examinar los efectos de IQ-1 sobre la señalización "no canónica" de Wnt examinando la extensión convergente durante el desarrollo de pez cebra (danio rerio). Los embriones de pez cebra tratados con IQ-1 1 \muM mostraron defectos de desarrollo significativos (Figura 3C). En particular se observó una cola acortada, consistente con la inhibición de la extensión convergente y similar a los efectos de morfolinos de PR72, (25). A partir de este Ejemplo y del Ejemplo 1, puede concluirse que la diana molecular de IQ-1 es PR72/130. La interacción de IQ-1 con PR72/130 da como resultado la alteración del complejo PR72/130/Nkd, e inhibe la regulación "negativa" de la señalización canónica de Wnt/\beta-catenina y un cambio concurrente a una extensión convergente "no canónica".
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Ejemplo 5
El mantenimiento mediante IQ-1 de las ESC depende de WNT/\beta-catenina/CBP
Se ha demostrado que la señalización de Wnt/\beta-catenina inhibe la diferenciación neuronal y mantiene la pluripotencia en células madre (1-3) y es crítica para la expansión de progenitores (4). Sin embargo, la señalización de Wnt/\beta-catenina se requiere también para la diferenciación neural de las ESC y las células madre neurales (5-6). Usando ICG-001, un antagonista específico recién caracterizado de la interacción \beta-catenina/CBP, se desarrolló un modelo para explicar las actividades divergentes de señalización de Wnt/\beta-catenina (7, 8, 26, 27). La característica clave de este modelo es que la transcripción mediada por \beta-catenina/CBP es crítica para la proliferación de células "madre/progenitoras", mientras que un cambio hacia la transcripción mediada por \beta-catenina/p300 es crítica para iniciar un programa de diferenciación con una capacidad proliferativa más limitada.
Las construcciones informadoras de Wnt/\beta-catenina TOPFLASH y FOPFLASH en células NIH-3T3 de tipo silvestre (wt), células NIH-3T3 CBP (+/-) y células NIH-3T3 p300 (+/-) se usaron para determinar si IQ-1, dirigiendo la subunidad PR72/130 con PP2A, estaba aumentando selectivamente el uso de \beta-catenina de CBP como un coactivador a costa de p300, manteniendo de esta manera las ESC en el estado no diferenciado (Figura 4A). Se usó un mutante puntual que transloca constitutivamente \beta-catenina (pt-mut wt-cat) para estimular la actividad informadora (28). Aunque IQ-1 no afecta a la actividad de TOPFLASH o FOPFLASH en cualquiera de las células wt o CBP (+/-), se observó un aumento de 2-3 veces en la actividad de TOPFLASH en las células p300 (+/-) (Figura 6). Esto sugiere que los efectos de IQ-1 son específicos para el coactivador y dependen del nivel de expresión de p300.
Para evaluar directamente los efectos de IQ-1 sobre el uso del coactivador de \beta-catenina, se realizó la co-inmunoprecipitación con anticuerpos para cualquiera de CBP o p300, seguido de inmunotransferencia para \beta-catenina asociada con el coactivador utilizando células de carcinoma embrionario P19 tratadas con Wnt3a en presencia o ausencia de IQ-1. IQ-1 provocaba un aumento drástico en la cantidad relativa de \beta-catenina asociada con CBP comparado con las células tratadas con Wnt3a y cualquiera de DMSO o el antagonista de CBP/\beta-catenina ICG-001, ICG-001, que induce la diferenciación celular (7), potenciando significativamente la interacción p300/\beta-catenina a costa de la interacción CBP/\beta-catenina (Figura 4B).
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Ejemplo 6
IQ-1 reduce indirectamente la fosforilación de SER89 de P300 y, de esta manera, la interacción \beta-catenina/P300
Se sabe que la señalización mediante la ruta Wnt "no canónica" puede aumentar la actividad de PKC (29) y que Ser89 de p300 pueden fosforilarse de una manera dependiente de PKC (30). El presente ejemplo se realizó para evaluar los efectos de la fosforilación con PKC\alpha de Ser89 de p300 sobre la unión de p300 a \beta-catenina. Se fosforiló p300 recombinante (1-110aa) con PKC\alpha purificado. El p300 fosforilado in vitro se añadió después a lisados celulares de células P19 y los complejos \beta-catenina/p300 se co-inmunoprecipitaron. Antes de la fosforilación con PKC\alpha se potenció la interacción p300/\beta-catenina (Figura 4C, compárese el carril 2 con el carril 1), para determinar si la interacción potenciada era dependiente de la fosforilación de Ser89 de p300 mediante PKC\alpha, habiendo mutado el resto serina a alanina en el fragmento de p300 recombinante. La mutagénesis de Ser89 a Ala89 abrogaba por el aumento dependiente de PKC\alpha en la unión a \beta-catenina (Figura 4C, compárese la diferencia entre los carriles 3 y 4 a carriles 1 y 2). Esto indica que la fosforilación de Ser89 de p300 potencia la afinidad de la interacción \beta-catenina/p300.
Para determinar la relevancia fisiológica de este mecanismo dependiente de fosforilación para aumentar la interacción \beta-catenina/p300 en las células, se expusieron células P19 a Wnt3a purificado y se trataron con IQ-1 o con DMSO como control. Según se juzgó por inmunotransferencia, el tratamiento con IQ-1 de Wnt3a estimuló las células P19 provocando una disminución drástica en el nivel de fosforilación de Ser89 de p300 (Figura 4D Superipor, compárense los carriles 2 y 3) mientras que la cantidad total de p300 no se vio afectada por IQ-1 (Figura 4D Centro, compárese los carriles 2 y 3). Basándose en estos resultados, puede concluirse que IQ-1 regulando negativamente la fosforilación de Ser89 de p300 disminuye así la afinidad de la interacción \beta-catenina/p300 y aumenta el uso de \beta-catenina/CBP.
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Ejemplo 7
Mantenimiento a largo plazo de ESC en medios sin suero que contienen IQ-1 y WNT3A
RT-PCR en tiempo real de células P19 tratadas con Wnt3a y IQ-1 reveló un aumento de la expresión de marcadores "madre/progenitor" incluyendo Oct4, Sox2 (31) y MDR-1 (32) y una disminución en la expresión de c-myc (33) comparado con células tratadas con Wnt3a + DMSO (Tabla 1). La adición de Wnt3a purificado (100 ng/ml) a KSR al 15% (medio de sustitución del suero) junto con 4 \mug/ml de IQ-1 fue suficiente para aumentar los niveles de fosfatasa alcalina y mantener la pluripotencia de ESC a largo plazo (48 días), similar a los resultados obtenidos con IQ-1 y FCS al 15% (Figura 7). Ni Wnt3a ni IQ-1 en solitario eran suficientes para mantener el estado no diferenciado de las ESC en medios de KSR (Figura 8). Wnt3a solo indujo proliferación, pero no era suficiente para mantener la expresión de los marcadores de las células madre Oct4, Nanog o Rexl. Sin embargo, la combinación de Wnt3a y IQ-1 permitió la proliferación y mantenimiento de la pluripotencia según se juzga mediante la expresión de Oct4, Nanog y Rexl (Figura 9A, B, y C). El tratamiento de las ESC con IQ-1 y Wnt3a mantuvo la pluripotencia de las ESC según se juzgó por su capacidad para formar cuerpos embrioides después el día 48 (Figura 5A, panel izquierdo) y la capacidad para diferenciar los tres tejidos derivados de la capa germinal (Figura 5B). La retirada de IQ-1 condujo a una rápida pérdida (en 3 días) de pluripotencia y la incapacidad de formar cuerpos embrioides (Figura 5A, panel derecho). Basándose en este ejemplo, puede concluirse que IQ-1 aumentando la señalización de Wnt/\beta-catenina/dependiente de CBP y evitando el cambio a transcripción mediada por Wnt/\beta-catenina/p300 era suficiente para mantener la pluripotencia murina de ESC a largo plazo.
TABLA 1
27
En la Tabla 1, anterior, se muestran los efectos del tratamiento con IQ-1 sobre genes asociados con el mantenimiento de la célula madre, según se miden por RT-PCR. Los valores se representan como \Delta\DeltaCT del gen de control \beta-actina.
Estos Ejemplos demuestran que IQ-1 junto con Wnt3a purificado es suficiente para mantener la proliferación y pluripotencia murina de ESC durante periodos de tiempo prolongados en cultivo (al menos 48 días) en ausencia de suero. IQ-1 más Wnt3a regulaba positivamente la expresión de los factores de transcripción Oct4 y Sox2, que son críticos para el mantenimiento de las ESC. Recientemente, Boyer et al. demostraron que Oct4 y Sox2 co-ocupaban los promotores/potenciadores de una parte sustancial de los genes requeridos para el mantenimiento de ESC humanas (31). Como se muestra en los Ejemplos, IQ-1 regula negativamente la expresión de c-myc. C-myc parece tener un papel crítico en el equilibrio entre la auto-renovación y la diferenciación de las células madre y aumenta tras la diferenciación (33).
Usando en enfoque de cromatografía de afinidad, se determinó que las diana o dianas moleculares de IQ-1 son las subunidades reguladoras empalmadas diferencialmente PR72/PR130 de la proteína fosfatasa PP2A. Esto es extremadamente interesante porque PR72 interactúa con la proteína Nkd (25), un antagonista inducible por Wnt de la señalización "canónica" de Wnt/\beta-catenina (24). Similar a los resultados observados con morfolinos de PR72 (25), IQ-1 tenía efectos drásticos sobre la extensión convergente "no canónica" durante el desarrollo embrionario del pez cebra. La cuestión de los papeles de las dos variantes de empalme PR72 y PR130 en el cambio de señalización de wnt "canónica" a "no canónica" parece ser bastante compleja. Recientemente, Bernards et al. mostraron que, a diferencia de PR72, PR130 puede antagonizar algunos de los efectos de Nkd en diversos ensayos. Sin embargo, morfolinos de PR130 afectaba al desarrollo somático y a la formación de la cola en embriones de xenopus (34). Por lo tanto, los efectos de IQ-1 sobre el desarrollo embrionario de pez cebra son consistentes con la inhibición potencial de ambas variantes de empalme. Sin ceñirse a un mecanismo particular, los resultados son consistentes con un modelo en el que la interacción de IQ-1 con PR72/130 da como resultado la alteración del complejo PR72/130 Nkd modulando así la señalización de Wnt. Los efectos morfológicos sobre el desarrollo del pez cebra son consistentes con un modelo en el que IQ-1 inhibe la regulación "negativa" de la señalización canónica de Wnt/\beta-catenina y un cambio concurrente a una extensión convergente "no canónica" (Fig. 5C).
La fosforilación in vitro de p300 recombinante mediante PKC, una enzima activada por la señalización "no canónica" de Wnt, aumentó la afinidad de la \beta-catenina por p300. Adicionalmente en células, IQ-1 disminuyó significativamente la fosforilación estimulada por Wnt de p300 en Ser89, sin afectar al nivel celular global de p300. El mecanismo mediante el que IQ-1 puede reducir el estado de fosforilación de p300 en Ser89 sigue sin estar claro y es el asunto de investigaciones en curso.
IQ-1 promovía selectivamente la interacción \beta-catenina/CBP a costa de la interacción correspondiente \beta-catenina/p300. IQ-1 potenciando la transcripción mediada por Wnt/\beta-catenina/CBP y evitando el cambio a la transcripción mediada por Wnt/\beta-catenina/p300 permite la expansión a largo plazo de ESC murinas mientras mantiene la pluripotencia sin FEM o suero.
El uso de un coactivador diferencial en la señalización de Wnt/\beta-catenina parece ser un regulador crítico en el mantenimiento del estado de la célula "madre/progenitora", el inicio de la diferenciación con una capacidad proliferativa más restringida, así como el cambio de señalización "canónica" a "no canónica" de Wnt. Los efectos de IQ-1 sobre la pluripotencia mediada por Wnt están asociados con la inhibición de la regulación "negativa" de la señalización canónica de Wnt/\beta-catenina mediante el complejo Nkd/PR72/PP2A, aumentando de esta manera la transcripción accionada por \beta-catenina/CBP a costa de la transcripción accionada por \beta-catenina/p300.
La capacidad para expandir las poblaciones de "madre/progenitora" en condiciones de crecimiento definidas tiene importantes ramificaciones en el área de la medicina regenerativa, y los Ejemplos en el presente documento sostienen dicho uso.
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<120> EXPANSIÓN SIN SUERO DE CÉLULAS EN CULTIVO
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<130> 67648-17
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<150> 60/740.173
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<151> 28-11-2005
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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
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<210> 1
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<211> 2440
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
40 
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<210> 4
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<211> 745
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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41 
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<220>
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<223> oligonucleótido
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ttggtgagga tctctccgcg t 
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Claims (3)

1. Un procedimiento de identificación de un agente como capaz de evitar la diferenciación mientras promueve la proliferación de una célula madre de mamífero durante el cultivo ex vivo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto un agente con al menos una de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A y detectar la unión de dicho agente a dicha al menos una subunidad.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha unión se detecta por inmunotransferencia.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho agente se selecciona entre el grupo constituido por compuestos de fórmula 1-5, 7-12, 15 y 17-28.
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