ES2332872T3

ES2332872T3 - Inmunoadhesina para la prevencion de la infeccion por rinovirus.

Info

Publication number: ES2332872T3
Application number: ES01930958T
Authority: ES
Inventors: James William Larrick; Keith Lynn Wycoff
Original assignee: Planet Biotechnology Inc
Current assignee: Planet Biotechnology Inc
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-28
Publication date: 2010-02-15
Anticipated expiration: 2021-04-28
Also published as: CA2407426A1; US7951378B2; US20080219999A1; AU2001257445B2; EP1290027B1; WO2001083529A2; ATE442386T1; DK1290027T3; AU5744501A; DE60139864D1; CN1440423A; WO2001083529A3; JP2003531633A; JP5008811B2; EP1290027A2; CN101643512A

Abstract

Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina; en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina permite a dicha cadena pesada unirse a una cadena J; y una cadena J y un componente secretor, en la que dicha cadena J y el componente secretor se asocian con dicha molécula quimérica ICAM-1; y en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior.

Description

Inmunoadhesina para la prevención de la infección por rinovirus.

Prioridad

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo el artículo 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Nº 60/200.298, presentada el 28 de abril de 2000, titulada NOVEL IMMUNOADHESIN FOR THE PREVENTION OF RHINOVIRUS INFECTION, y que designa como inventores a J. W. Larrick y K. L. Wycoff.

Declaración respecto a investigación o desarrollo financiados con fondos federales

Se proporcionó financiación federal a la investigación en forma de una beca SBIR Fase I (R43 AI43122) y una beca SBIR Fase II (2R44AI43122-02).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inmunoadhesinas, fusiones de la proteína del receptor del rinovirus humano e inmunoglobulina, y la expresión de inmunoadhesinas en plantas. También se contempla el uso terapéutico de las inmunoadhesinas para la prevención y tratamiento de la infección por rinovirus.

Antecedentes de la invención

El resfriado común es por lo general una enfermedad relativamente leve, sin embargo, son habituales complicaciones significativas derivadas de los resfriados, tales como otitis media, sinusitis y agravamiento del asma. Los rinovirus humanos (RVH) producen hasta un 50% de todos los resfriados en adultos y un 25% de los resfriados en niños (Bella y Rossmann, J Struct Biol. 128:69-74, 1999, y Sperber y Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32:409-19, 1988). El coste para la sociedad es de miles de millones de dólares anuales. Estos pequeños virus de ARN no evolucionados representan un subgrupo del picornavirus (Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields, y col., Raven Press, Ltd. Nueva York, 1990). La cristalografía mediante rayos x del rinovirus identificó una cápsida de 300 \ring{A} de diámetro (1 \ring{A} = 0,1 nm) con simetría icosaédrica, construida a partir de dieciséis copias de cada una de las proteínas de recubrimiento VP1, VP2, y VP3 (Rossmann, Nature 317:145-153, 1985). Se ha sugerido que una depresión superficial o "cañón" en el RVH es el emplazamiento de unión del receptor (Colonno, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 85:5449-5453, 1985; Rossmann, y col. Nature 317:145-153, 1985). De los 102 serotipos caracterizados de RVH, 91 (conocido como grupo principal) comparten como receptor una glicoproteína de la superficie celular conocida como molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) (Greve, y col., Cell 56:839-847, 1989; Staunton, y col., Cell 56:849-853, 1989); el emplazamiento de unión se ubica dentro de la región N-terminal 1 (Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Staunton, y col., Cell 61:243-254, 1990).

ICAM-1 es una proteína de membrana con cinco regiones extracelulares, una región transmembrana hidrófoba, y una corta región citoplásmica. ICAM-1 se expresa en muchas células importantes en las respuestas inmunes e inflamatorias, y se puede inducir en otras (Casasnovas, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 95:4134-9, 1998). ICAM-1 funciona como ligando de las integrinas leucocitarias LFA-1 y Mac-1 (Springer, Cell. 76:301-14, 1994; Staunton y col., Cell 61:243-254, 1990). En la superficie celular, ICAM-1 es principalmente un dímero debido a la asociación de las regiones transmembrana (Miller, y col., J Exp Med. 182:1231-41, 1995; Reilly, y col. J Immunol. 155:529-32, 1995).

Se demostró que las formas recombinantes solubles de ICAM-1 (sICAM-1) constituidas por las cinco regiones extracelulares eran eficaces para bloquear la infección por rinovirus de células humanas in vitro (Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, y col., Nature. 344:70-2, 1990). La evaluación de la actividad de sICAM-1 frente a un conjunto de cepas de laboratorio y aislados de campo demostró que todas las cepas principales de RVH son sensibles a sICAM-1. Las cepas secundarias, que no usan ICAM como receptor, no resultaron afectadas por sICAM-1 (Crump y col., Antiviral Chem Chemother. 4:323-327, 1993; Ohlin, y col., Antimicrob Agents Chemother. 38:1413-5, 1994).

La actividad antivírica de la ICAM-1 soluble in vitro parece estar mediada por más de un mecanismo. Estos mecanismos incluyen la competición con las células ICAM-1 superficiales por los emplazamientos de unión, interferencia con la entrada o no revestimiento de virus, e inactivación directa por liberación prematura del ARN vírico y la formación de cápsidas vacías (Arruda, y col., Antimicrob Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve, y col., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, y col., Nature 344:70-2, 1990; Martin y col., J Virol. 67:3561-8,1993).

El conjunto de huéspedes del RVH está restringido a los primates. Un reciente estudio demostró que la ICAM-1 soluble era eficaz en la prevención de la infección por rinovirus en chimpancés (Huguenel, y col., Am J Respir Crit Care Med. 155:1206-10, 1997). Aunque los chimpancés no muestran síntomas clínicos, la infección se demuestra midiendo la seroconversión y propagación de virus. Una única dosis de 10 mg de ICAM-1 soluble como pulverización intranasal fue eficaz y evitó la infección por RVH-16 cuando se administró conjuntamente con RVH, o cuando el virus se administró diez minutos después.

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El documento WO 01/64929 se refiere a composiciones y procedimientos para la transformación de plástidos de células de plantas con múltiples genes y asociación o ensamblaje adecuado de proteínas multiméricas que son heterólogas respecto de los plástidos de células de plantas. Se usa una construcción de plásmido que codifica todos los componentes individuales de polipéptido de las proteínas multiméricas. Las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina se ensamblan en inmunoglobulinas activas no glicosiladas en el cloroplasto.

Un ensayo clínico con ICAM-1 soluble demostró que ésta reducía la gravedad de resfriados experimentales por RVH (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804,1999). En este ensayo, un total de 196 sujetos recibieron bien ICAM-1 soluble o bien placebo en diferentes formulaciones. Se proporcionó a algunos sujetos ICAM-1 soluble o placebo siete horas antes de la inoculación con RVH 39 y otros iniciaron tratamiento doce horas después de la inoculación del virus. Los medicamentos se administraron en forma tanto de disolución intranasal o en polvo, administrados en seis dosis diarias durante siete días (un total de 4,4 mg por día). En este estudio, la ICAM-1 soluble no previno la infección, medida tanto por aislamiento del virus o seroconversión (tasa de infección del 92% para tratados con placebo vs. 85% de los tratados con ICAM-1 soluble). Sin embargo, la ICAM-1 soluble tuvo influencia sobre todas las medidas de la enfermedad. La puntuación total de síntomas se redujo en un 45%, la proporción de sujetos con resfriado clínico se redujo en un 23% y el peso de moco nasal se redujo en un 56%. No hubo diferencias significativas entre el uso de formulaciones en polvo o en disolución, o entre los grupos preinoculados o postinoculados. El tratamiento con ICAM-1 soluble no dio como resultado ningún efecto secundario o evidencia de absorción a través de la mucosa nasal. Igualmente, no hubo inhibición del desarrollo de anticuerpos de tipo específico anti-RVH.

Según se ha descrito, ICAM-1 es dimérica en la superficie celular. Martin y col., en J Virol. 67:3561-8, (1993) propusieron por vez primera que la unión multivalente entre RVH y una ICAM multimérica soluble daría por resultado una mayor afinidad eficaz, denominada avidez, y así facilitar el no recubrimiento del virus. Construyeron moléculas multivalentes ICAM-1/inmunoglobulina, postulando que éstas serían más eficaces que la ICAM-1 soluble monovalente en la neutralización de RVH y de esta forma tendrían una mayor eficacia terapéutica. Estas moléculas ICAM-1/inmunoglobulina indujeron regiones 1 y 2 aminoterminales en ICAM-1 fusionadas con las regiones bisagra y constante de las cadenas pesadas de IgA1 (IC1-2D/IgA), IgM (IC1-2D/IgM) e IgG1 (IC1-2D/IgG). Además, se fusionaron cinco regiones extracelulares con IgA1 (IC1-5D/IgA). Estas moléculas ICAM-1/inmunoglobulina se compararon con las formas soluble de la ICAM-1 que tenían dos (sIC1-2D) y cinco (sIC1-5D) regiones en ensayos de unión a RVH, ineficacia y conformación. La inmunoglobulina ICAM-1/IgA (IC1-5D/IgA) resultó 200 veces, y las moléculas inmunoglobulina ICAM-1/IgM (IC1-2D/IgM) e inmunoglobulina ICAM-1/IgG (IC1-2D/IgG) resultaron 25 y 10 veces más eficaces que la ICAM-1 soluble. Estas moléculas fueron muy eficaces en la inhibición de la unión del rinovirus a las células y perturbando la conformación de la cápsida del virus. Las moléculas de inmunoglobulina ICAM-1/IgA fueron eficaces en el intervalo de concentración nanomolar. La comparación con IC1-2D/IgA y IC1-2D/IgG demostró que el tipo de región constante Ig usada tenía una enorme influencia sobre la eficacia.

Un estudio posterior comparó las actividades inhibidoras de ICAM-1 soluble e IC1-5D/IgA frente a nueve serotipos principales de RVH y a una variante de RVH-39 seleccionada por su resistencia moderada a la ICAM-1 soluble (Crump, y col., Antimicrob Agents Chemother. 38:1425-7, 1993). IC1-5D/IgA fue de 50 a 143 veces más potente que la ICAM-1 soluble monomérica en base ponderal, y de 60 a 170 veces en base molar frente a los serotipos estándares. La variante RVH-39 fue 38 veces más resistente a la ICAM-1 soluble que la de tipo natural, y fue sólo 5 veces más resistente a la IC1-5D/IgA. Esto es consistente con la hipótesis esperada de que el virus se escaparía de la inhibición por moléculas multivalentes con una frecuencia inferior al escape del virus de la inhibición por el receptor monomérico soluble (Martin, y col., J Virol. 67:3561-8, 1993). Un ensayo diseñado para medir la inactivación vírica demostró que RVH-39 y RVH-13 no resultaron directamente inactivadas en una extensión significativa por la ICAM-1 soluble (reducción en la ineficacia <0,5 log_{10}). Sin embargo, la incubación con IC1-5D/IgA dio como resultado una reducción en la infectividad de esos mismos virus en aproximadamente 1,0 log_{10} (Crump, y col., Antimicrob Agents Chemother. 38: 1425-7, 1994). Los resultados de Martin y col. (J Virol. 67:3561-8, 1993) sugieren que cuanto mayor es la Valencia, mayor es la eficacia de las moléculas. Las formas diméricas y decaméricas de IC1-2/IgM se pueden separar por sedimentación en gradiente de sacarosa. La forma decamérica fue cinco veces más eficaz que la forma dimérica en el bloqueo de la unión de RVH con células HeLa.

Las moléculas de ICAM-1/inmunoglobulina que se han descrito tienen varios inconvenientes, entre los que se incluyen laboriosas técnicas de producción y costes elevados asociados con dichos procedimientos de producción. Además, las moléculas de ICAM-1/inmunoglobulina anteriormente descritas tienen una estabilidad limitada como multímeros en el complicado entorno en el que la molécula puede activar los rinovirus.

Las inmunoadhesinas de la presente invención tienen ventajas significativas respecto de las descritas en la técnica. Las inmunoadhesinas de la presente invención que se expresan en plantas serían tetraméricas, en lugar de únicamente diméricas. Las inmunoadhesinas que tienen múltiples emplazamientos de unión tienen una mayor afinidad eficaz por el virus, incrementando de esta forma la eficacia de la inmunoadhesina. Además, la asociación de un componente secretor y de la cadena J de la inmunoglobulina con la inmunoadhesina de la presente invención incrementa la estabilidad de la inmunoadhesina en el ambiente mucoso (Corthesy, Biochem Soc Trans. 25:471-475, 1997). La IgA secretora, que está asociada con el componente secretor, es el isotipo de anticuerpo habitualmente encontrado en las secreciones mucosas, incluyendo la leche y el calostro. A diferencia de otros isotipos de anticuerpo, SIgA puede atravesar el intestino con muy poca degradación proteolítica. Es también muy estable en las preparaciones de planta bruta a temperatura ambiente. Una función del componente secretor parece ser para proteger el anticuerpo del complejo ambiente de la mucosa (Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, NY, Third Edition, pp. 303-304, 1993). Adicionalmente, la inmunoadhesina de la presente invención es significativamente menos cara de producir en plantas que en cultivos con células animales, y la producción en plantas sería más segura para uso humano, ya que no se sabe que las plantas alberguen ningún virus animal.

Resumen de la invención

La presente invención contempla una inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica de ICAM-1 que tiene una proteína del receptor del rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de la inmunoglobulina, en la que la cadena J y el componente secretor están asociados con la molécula quimérica de ICAM-1. Las inmunoadhesinas de la presente invención se expresan en una planta y se glicosilan en la misma.

En realizaciones preferidas, la inmunoadhesina de la presente invención está compuesta por una proteína del receptor del rinovirus hecha con cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de la proteína del receptor del rinovirus, ICAM-1, unida a una cadena pesada de inmunoglobulina. También se contemplan en la presente invención inmunoadhesinas de la presente invención en las que la inmunoglobulina es IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE o una cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica hecha de regiones o segmentos procedentes de diferentes isotipos de inmunoglobulina.

En otras realizaciones preferidas de la presente invención, la inmunoadhesina comprende múltiples moléculas quiméricas de ICAM-1 asociadas con la cadena J y el componente secretor. El aumento en la valencia da como resultado una mayor afinidad eficaz por el rinovirus, aumentando de esta manera la eficacia de la inmunoadhesina.

En una realización preferida de la presente invención, todas las proteínas usadas para fabricar la inmunoadhesina de la presente invención son proteínas humanas. Además de la producción en plantas o células de plantas, la presente invención contempla una inmunoadhesina expresada en células de mamífero, cultivos de raíz en cabellera, células de plantas en cultivos de tejido, y células heterólogas derivadas de plantas.

En realizaciones preferidas de la presente invención, las inmunoadhesinas se expresan en plantas, incluyendo plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas, como parte del genoma de las plantas. La expresión en plantas, a diferencia de la expresión en células cultivadas, permite una reducción significativa en el coste de producción de la inmunoadhesina.

La presente invención contempla una inmunoadhesina que tiene una glicosilación específica de planta. Un gen que codifica un polipéptido que contiene en su secuencia de aminoácidos la señal de glicosilación asparagina-X-serina/treonina, en la que X puede ser cualquier resto de aminoácido, se glicosila vía oligosacáridos unidos al resto asparagina de la secuencia cuando se expresa en una célula de planta. Véase Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) y Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974) para una revisión general de las secuencias de polipéptido que funcionan como señales de glicosilación. Estas señales son reconocidas por células tanto de mamífero como de planta. Al final de su maduración, las proteínas expresadas en plantas tienen un modelo de glicosilación diferente que el de las proteínas expresadas en otros tipos de células entre las que se incluyen células de mamífero y células de insecto. Estudios detallados que caracterizan la glicosilación específica de plantas y su comparación con la glicosilación en otros tipos celulares se han realizado en, por ejemplo, los estudios descritos por Cabanes-Macheteau y col., Glycobiology 9 (4):365-372 (1999), y por Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997). Estos grupos y otros han demostrado que la glicosilación específica de plantas genera glicanos que tienen xilosa \beta(1,2) unida a manosa, pero la xilosa no está \beta(1,2) unida a manosa como resultado de la glicosilación en células de mamífero e insecto. La glicosilación específica de plantas da como resultado una fucosa \alpha(1,3) unida a GlcNAc proximal, mientras que la glicosilación en células de mamífero da como resultado una fucosa \alpha(1,6) al GlcNAc proximal. Adicionalmente, la glicosilación específica de plantas no da como resultado la adición de un ácido siálico al extremo terminal de la proteína de glicano, mientras que en la glicosilación en células de mamífero se añade ácido siálico.

En otras realizaciones, la inmunoadhesina de la presente invención es parte de una composición que comprende material de plantas y la inmunoadhesina, asociada con la cadena J y el componente secretor. El material de plantas presente puede ser paredes de células de plantas, orgánulos de plantas, citoplasmas de plantas, células intactas de plantas y similares. Los materiales de plantas o macromoléculas de plantas particulares que pueden estar presenten incluyen ribulosa bisfosfato carboxilasa, complejo ligero del cosechado, pigmentos, metabolitos secundarios o clorofila. Las composiciones de la presente invención puede tener una concentración de inmunoadhesina entre 0,001% y 99,9% en peso excluyendo el agua. En otras realizaciones, la inmunoadhesina está presente en una concentración de 0,01% a 99% en peso excluyendo el agua. En otras realizaciones, las composiciones de la presente invención tienen material de plantas o macromoléculas de plantas presentes a una concentración de 0,01% a 99% en peso excluyendo el agua.

La presente invención también contempla procedimientos para el tratamiento o prevención de la infección por rinovirus humano en un sujeto, incluyendo la reducción de la infección por rinovirus humano en células huéspedes susceptibles a la infección por el virus, o reducir el inicio o diseminación del resfriado común debido al rinovirus humano, mediante un procedimiento que comprende poner en contacto el virus con una inmunoadhesina de la presente invención, en el que la inmunoadhesina se une al rinovirus humano y reduce la infectividad. La inmunoadhesina podría mediar la infección por competición con la ICAM-1 de la superficie celular por los emplazamientos de unión, interferencia con la entrada o no recubrimiento de los virus, y/o inactivación directa por emisión prematura del ARN vírico y formación de cápsidas vacías (Arruda, y col., Antimicrob. Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve, y col., J. Virol. 65:6015-6023, 1991; Martin, y col., Nature 344:70-2, 1990; Martin, y col., J. Virol. 67:3561-8, 1993). En otra realización, la infección por rinovirus humano en un sujeto se trata mediante un procedimiento que comprende administrar intranasalmente al sujeto una cantidad eficaz de una inmunoadhesina de la presente invención, en el que la inmunoadhesina reduce la infectividad por rinovirus humano.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Muestra pSSPHuA2, vector en el que se han fusionado los ADN que codifican una molécula quimérica de ICAM-1 que contiene las primeras cinco regiones de la ICAM-1 humana y la región Fc de la IgA2m(2) humana. Este vector contiene el promotor SuperMas para impulsar la expresión de un péptido señal y las regiones constantes de la cadena pesada de la IgA2m(2) humana. Las secuencias que codifican las regiones 1-5 de ICAM se amplificaron, mediante PCR, para contener emplazamientos de restricción convenientes (5' SpeI y 3' SpeI) para inserción entre el péptido señal y la región Ca1. Se añadió ADN que codifica una señal de retención ER (RSEKDEL) al extremo 3' de la cadena pesada con el fin de impulsar el nivel de expresión del constructo.

Figura 2. Muestra una molécula quimérica de ICAM. 2A muestra el casete de expresión de ADN a partir del cual se ha producido la molécula quimérica de ICAM-1. 2B muestra la secuencia de aminoácidos, tras la escisión del péptido señal, de la forma madura de la proteína de fusión. Los aminoácidos introducidos mediante el procedimiento de clonación están subrayados y marcan la unión entre las cinco regiones extracelulares de ICAM-1 y las regiones Ca1-Ca3 de la cadena pesada de la IgA2m(2). Los números en negrita indican los quince posibles puntos de glicosilación.

Figura 3. Muestra la expresión de la inmunoadhesina en callo de tabaco independientemente transformado. 3A muestra inmunotransferencias de geles no reductores de SDS-poliacrilamida con muestras que contienen diferentes callos de tabaco transformados (C) y extractos acuosos (Aq) probados y sondeados para la presencia de ICAM humana. Los marcadores de peso molecular están indicados, y el patrón de referencia (R) fue una mezcla (\sim75 ng de cada) de ICAM humana (\sim75 kD) y SigA humana (>>250 kD). 3B muestra inmunotransferencias de geles no reductores de SDS-poliacrilamida que contienen diferentes fracciones de inmunoadhesina parcialmente purificada procedente del callo Rhi107-11. Las fracciones analizadas de la purificación fueron jugo (J), la fracción G-100 (G), fracción G-100 esterilizada por filtración (SG), y una mezcla de patrones de referencia de SigA humana (75 ng) (RS). Las transferencias se sondearon con anticuerpos frente a la ICAM humana (\simICAM), cadena pesada de la IgA humana (\sim\alpha), componente secretor humano (\simSC) y cadena J humana (\simJ). Secundariamente, se usaron anticuerpos conjugados con enzimas según necesidad para etiquetar las bandas inmunopositivas con fosfatasa alcalina.

Figura 4. Muestra los resultados de un ensayo con inmunosorbente unido a enzima (ELISA) mostrando competición entre extracto de plantas e ICAM-1 soluble por la unión a un mAb anti-ICAM. Para el ensayo, se revistieron places de 96 pocillos con 0,25 \mug de ICAM-1 soluble/ml. Los cuadrados representan la concentración creciente de sICAM y los círculos representan las cantidades crecientes de extracto de callo (fracción G-100 esterilizada por filtración) usada para competir con la ICAM adherida para una cantidad constante de un anticuerpo de ratón (ICAM anti-humano).

Figura 5. Muestra los resultados de un ensayo que muestra la capacidad de una inmunoadhesina para inhibir la muerte de células HeLa debido a rinovirus humano (efecto citopático, o ensayo CPE). 5A muestra los resultados de un ensayo que compara CPE de rinovirus humano sobre células HeLa en presencia de extractos parcialmente purificados que contienen bien la inmunoadhesina de la fusión ICAM-Fc (IC1-5D/IgA) o que contienen un anticuerpo frente a doxorubicina. (Los triángulos arriba a la derecha y arriba a la izquierda representan dos extractos derivados de Rhi107-11, conteniendo la inmunoadhesina.) 5B muestra los resultados de un ensayo que compara CPE de rinovirus humano sobre células HeLa en presencia de ICAM-1 soluble humana o de un extracto procedente de la inmunoadhesina de la fusión ICAM-Fc (IC1-5D/IgA). La parte inferior muestra la ampliación de la escala en el intervalo de la CI50 de la ICAM soluble (1,35 \mug/ml) y para IC1-5D/IgA (0,12 \mug/ml; 11,3 veces menos).

Figura 6. Muestra una evaluación de las necesidades de producción para fabricar 1 gramo de inmunoadhesina terminada. En este diagrama, se ilustra el número de plantas necesarias para 1 g de inmunoadhesina, con un rendimiento del 20%, con los niveles de expresión y peso de plantas. A diferentes niveles de expresión de inmunoadhesina (mg/kg de peso fresco) y una recuperación global (ajustada al 20%), se puede determinar el peso de cada planta, y de esta manera el número total de plantas para un objetivo de producción específico (1 g/cosecha) contenido en una ventana (cuadro punteado) de posibilidades razonables. El número de plantas necesario disminuye, inversamente, con el número especificado de periodos de crecimiento y recrecimiento. La producción esperada de biomasa, que es función del tiempo y de las condiciones de crecimiento, influye sobre el momento de cosechar y el periodo entre cosechas. Estos periodos de crecimiento se pueden ajustar a las realidades del programa de purificación espaciando las fechas de plantación y cosechado.

Figura 7. Muestra las secuencias de codificación y aminoácidos de cada uno de los genes y proteínas de inmunoglobulina listados en la Tabla 2.

Figura 8. Muestra las secuencias de plásmidos usados para transformar plantas, según se describe en el Ejemplo 2, para uso en los estudios de la expresión de inmunoadhesinas de la presente invención.

Figura 8A. Muestra las secuencias de nucleótidos y proteínas de los plásmidos PSSpICAMHuA2

Figura 8B. Muestra las secuencias de nucleótidos y proteínas del péptido señal de legumina de guisante.

Figura 8C. Muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región de codificación de proteína de pSHuJ.

Figura 8D. Muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región de codificación de proteína de pSHuSC.

Figura 8E. Muestra la secuencia de nucleótidos de los plásmidos pBMSP-1.

Figura 8F. Muestra la secuencia de nucleótidos de los plásmidos pBMSP-1spJSC.

Figura 9. las secuencias de nucleótidos y proteínas SEC DE ID Nº: 1; SEC DE ID Nº: 2; SEC DE ID Nº: 3; SEC DE ID Nº: 4; SEC DE ID Nº: 5; SEC DE ID Nº: 6; SEC DE ID Nº: 7; SEC DE ID Nº: 8, para ICAM-1, y otras IgA2 y otras secuencias de nucleótidos.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Según se usan en el presente documento, las siguientes abreviaturas y términos incluyen, pero no necesariamente se limitan a, las siguientes definiciones.

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están entre las habilidades de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel, y col. eds., (1987)); la serie Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); M.J. MacPherson, y col., eds. Pcr 2: A Practical Approach (1995); Harlow y Lane, eds, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), y H. Jones, Methods In Molecular Biology vol. 49, "Plant Gene Transfer And Expression Protocols" (1995).

Molécula de inmunoglobulina o anticuerpo. Un polipéptido o proteína multimérica que contiene las porciones inmunológicamente activas de una cadena pesada de la inmunoglobulina y de una cadena ligera de la inmunoglobulina covalentemente emparejadas entre sí y capaces de combinarse específicamente con un antígeno. Las inmunoglobulinas o moléculas de anticuerpo son una gran familia de moléculas que incluye varios tipos de moléculas tales como IgD, IgG, IgA, IgA secretora (SIgA), IgM, e.

Constructo o Vector. Un segmento de ADN artificialmente ensamblado para transferir a un tejido o célula de planta diana. Típicamente, el constructo incluirá el gen o genes de interés particular, un gen marcador y secuencias de control adecuadas. El término "plásmido" se refiere a una molécula de ADN extracromosómica autónoma y autoreplicante. En una realización preferida, los constructos de plásmido de la presente invención contienen secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. Los constructos de plásmido que contienen elementos reguladores adecuados se denominan también como "casetes de expresión". En una realización preferida, un constructo de plásmido puede contener también un marcador de cribado o de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico.

Marcador de selección. Un gen que codifica un producto que permite el crecimiento de tejido transgénico en un medio selectivo. Ejemplos no limitantes de marcadores de selección incluyen genes que codifican resistencia a un antibiótico, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, o similar. Otros marcadores de selección serán conocidos de las personas expertas en la técnica.

Planta transgénica. Planta diseñada por ingeniería genética o progenie de plantas diseñadas por ingeniería genética. La planta transgénica contiene normalmente material procedente de al menos un organismo no relacionado, como un virus, otra planta o animal.

Molécula quimérica de ICAM-1: la fusión de cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1 con al menos una parte de la cadena pesada de inmunoglobulina, hecha uniendo la secuencia de ICAM-1 en la dirección 5' de la secuencia genética de una cadena pesada de inmunoglobulina y expresando la proteína codificada desde el constructo.

Cadena pesada de inmunoglobulina quimérica: una cadena pesada derivada de inmunoglobulina que tiene al menos una parte de su secuencia de aminoácidos derivada de una cadena pesada de inmunoglobulina de un isotipo o subtipo diferente o de algún otro péptido, polipéptido o proteína. Típicamente, una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina tiene su secuencia de restos de aminoácidos derivada de al menos dos isotipos o subtipos deferentes de cadena pesada de inmunoglobulina.

Plantas dicotiledóneas (dicots): plantas con flores cuyos embriones tienen dos hojas o cotiledones en las semillas. Ejemplos de dicots son: tabaco; tomate; legumbres incluyendo alfalfa; roble; arces; rosas; mentas; calabazas; margaritas; nogales; cactus; violetas y ranúnculos.

Cantidad eficaz: una cantidad eficaz de una inmunoadhesina de la presente invención es suficiente para inhibir de forma detectable la infección, citotoxicidad o replicación del rinovirus; o de reducir la gravedad o extensión de la infección por rinovirus.

Rinovirus humano (RVH): Un virus de ARN no recubierto que representa un subgrupo del picornavirus, que es la causa principal del resfriado común en seres humanos. Los rinovirus se describen en Rinoviruses, Reoviruses, and Parvoviruses, pp. 1057-1059, Zinsser Microbiology, Joklik y col., eds. Appleton y Lange (1992).

Inmunoadhesina: un complejo que contiene una molécula ICAM-1 quimérica, y conteniendo opcionalmente un componente secretor, y la cadena J.

Cadena pesada de la inmunoglobulina: un polipéptido que contiene al menos una porción de la región de unión a antígeno de una inmunoglobulina y al menos una parte de una región variable de una cadena pesada de la inmunoglobulina o al menos una porción de una región constante de una cadena pesada de la inmunoglobulina. Así, la cadena pesada derivada de la inmunoglobulina tiene regiones significativas de homología en la secuencia de aminoácidos con un miembro de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina. Por ejemplo, la cadena pesada en un fragmento Fab es una cadena pesada derivada de inmunoglobulina.

Cadena ligera de la inmunoglobulina: un polipéptido que contiene al menos una parte de la región de unión a antígeno de una inmunoglobulina y al menos una porción de la región variable o al menos una porción de una región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina. Así, la cadena ligera derivada de inmunoglobulina tiene regiones significativas de homología de aminoácidos con un miembro de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina.

Molécula de inmunoglobulina: una proteína que contiene las porciones inmunológicamente activas de una cadena pesada de la inmunoglobulina y de una cadena ligera de la inmunoglobulina covalentemente emparejadas entre sí y capaces de combinarse específicamente con un antígeno.

ICAM-1: molécula de adhesión intercelular 1. En seres humanos, ICAM-1 funciona como receptor del rinovirus humano.

Cadena J: un polipéptido que está implicado en la polimerización de inmunoglobulinas y en el transporte de las inmunoglobulinas polimerizadas a través de las células epiteliales. Véase The Immunoglobulin Helper: The J Chain in Immunoglobulin Genes, at pg. 345, Academic Press (1989). La cadena J se encuentra en la IgM pentamérica y en la IgA dimérica y típicamente unida mediante enlaces disulfuro. La cadena J se ha estudiado tanto en ratones como en seres humanos.

Plantas monocotiledóneas (monocots): plantas con flores cuyos embriones tienen una hoja o cotiledón en las semillas. Ejemplos de monocots son: lirios; céspedes; maíz; gramíneas, incluyendo avena, trigo y cebada; orquídeas; iris; cebollas y palmas.

Glicosilación: la modificación de una proteína mediante oligosacáridos. Véase, Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) y Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974) para una revisión general de las secuencias de polipéptido que funcionan como señales de glicosilación. Estas señales son reconocidas en células tanto de mamíferos como de plantas.

Glicosilación específica de planta: el modelo de glicosilación encontrado en las proteínas expresadas en plantas, que es distinto del encontrado en las proteínas fabricadas en células de mamífero o de insecto. Las proteínas expresadas en plantas o en células de plantas tienen un modelo de glicosilación diferente del que tienen las proteínas expresadas en otros tipos de células, incluyendo células de mamífero y células de insecto. Se han llevado a cabo estudios detallados caracterizando la glicosilación específica de plantas y comparándola con la glicosilación en otros tipos de células por Cabanes-Macheteau y col., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), Lerouge y col., Plant Molecular Biology 38:31-48 (1998) y Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997). La glicosilación específica de plantas genera glicanos que tienen xilosa \beta(1,2) a manosa. Ni la glicosilación en mamíferos ni en insectos generan xilosa \beta(1,2) a manosa. Las plantas no tienen un ácido siálico unido al extremo del glicano, mientras que las células de mamífero lo tienen. Adicionalmente, la glicosilación específica de plantas da como resultado una fucosa unida \alpha(1,3) al GlcNAc proximal, mientras que la glicosilación en células de mamífero da como resultado una fucosa unida \alpha(1,6) al GlcNAc proximal.

Componente secretor (SC): un componente de inmunoglobulinas secretoras que ayuda a proteger la inmunoglobulina de agentes inactivantes incrementando de esta manera la eficacia biológica de la inmunoglobulina secretora. El componente secretor puede proceder de cualquier mamífero o roedor incluyendo ratón o ser humano.

sICAM: una forma soluble de origen natural de ICAM-1 que carece tanto de la región transmembrana hidrófoba como de la región carboxiterminal citoplasmática de ICAM.

Las inmunoadhesinas de la presente invención contienen moléculas quiméricas de ICAM-1 hechas de una proteína del receptor del rinovirus unida a una porción de molécula de una cadena pesada de inmunoglobulina en asociación con la cadena J y el componente secretor. Las moléculas quiméricas de ICAM-1 de la presente invención contienen dos moléculas derivadas de fuentes distintas: una porción de proteína del receptor del rinovirus y una porción de cadena de una inmunoglobulina. La proteína del receptor del rinovirus de la presente invención se deriva de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1). La secuencia de nucleótidos del receptor del rinovirus humano ICAM-1 fue determinada y caracterizada por Staunton, y col., Cell 52: 925-933 (1988); Greve, y col. Cell 56: 839-847 (1989); Greve, y col. J. Virology 65: 6015-6023 (1991); Staunton, y col., Cell, 61: 243-254 (1990) y descrita en la Secuencia de ID Nº 3 con número de acceso del GenBank M24283.

La molécula ICAM-1 es una proteína de membrana (SEC. ID N^{ros}: 1 y 2) que tiene 5 regiones extracelulares, una región transmembrana hidrófoba y una región citoplásmica corta. Estas características se han descrito por Casasnovas, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 4134-4139 (1998) y por Staunton, y col., Cell 52: 925-933 (1988). De particular uso en la presente invención son las regiones de la molécula ICAM-1 que son responsables de la unión de los rinovirus humanos que se han localizado en las regiones N-terminales 1 y 2 (Greve, y col., J. Virol., 65: 6015-6023 1991, y Staunton, y col., Cell, 61: 243-245 1990. La presente invención también contempla porciones de proteína del receptor del rinovirus que incluyen cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4, y 5 de la molécula ICAM-1. En realizaciones particularmente preferidas, la porción de la proteína del receptor del rinovirus incluye las regiones 1 y 2 de la molécula ICAM-1 y en otras realizaciones preferidas están presentes las regiones 1, 2, 3, 4 y 5 de la molécula ICAM-1.

Las fronteras de las 5 regiones extracelulares son bien conocidas en la técnica y se han descrito en Staunton, y col., Cell 52: 925-933 (1988). Las fronteras aproximadas entre las regiones se muestran en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1

1

Tal como se usa en la presente invención, la región 1 de ICAM-1 es desde aproximadamente el resto 1 hasta aproximadamente el resto 88; la región 2 es desde aproximadamente el resto 89 hasta aproximadamente el resto 105; la región 3 es desde aproximadamente el resto 106 hasta aproximadamente el resto 284; la región 4 es desde aproximadamente el resto 285 hasta aproximadamente el 385; y la región 5 es desde aproximadamente el resto 386 hasta el 453. Una persona experta en la técnica comprenderá que las fronteras exactas de estas regiones pueden variar.

Las moléculas quiméricas ICAM-1 de la presente invención contienen preferiblemente al menos una porción de una cadena pesada de IgM o IgA que permite que la cadena pesada de la inmunoglobulina se una a la cadena J de la inmunoglobulina y por tanto se una al componente secretor. Se contempla que la porción de la molécula quimérica de ICAM-1 derivada de la cadena pesada de la inmunoglobulina de la presente invención puede estar comprendida de regiones individuales seleccionadas entre la cadena pesada de IgA o la cadena pesada de IgM o de algún otro isotipo de cadena pesada. Se contempla también que una región de inmunoglobulina derivada de una cadena pesada de inmunoglobulina diferente de IgA o IgM o procedente de una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar diseñada molecularmente para unirse a la cadena J de la inmunoglobulina y por tanto se puede usar para producir las inmunoglobulinas de la presente invención.

Una persona experta en la técnica comprenderá que las inmunoglobulinas están constituidas por regiones de aproximadamente 100-110 restos de aminoácidos. Estas diferentes regiones son bien conocidas en la técnica y tienen fronteras conocidas. La eliminación de una región única y su sustitución con una región de otra molécula de anticuerpo se consigue fácilmente con la moderna biología molecular. Las regiones son estructuras globulares que están estabilizadas mediante enlaces disulfuro intercadena. Esto confiere una forma discreta y convierten las regiones en una unidad autocontenida que se puede sustituir o intercambiar con otras regiones de forma similar. La cadena pesada de las regiones constantes de las inmunoglobulinas confieren diferentes propiedades conocidas como funciones efectoras de anticuerpos sobre una molécula particular que contiene dicha región. Las de ejemplo incluyen fijación del complemento, trasferencia placentaria, unión a la proteína estafilocócica, unión a la proteína estreptocócica G, unión a células mononucleares, neutrófilos, o mastocitos y basófilos. La asociación de regiones particulares y de isotipos de inmunoglobulinas particulares con estas funciones efectoras es bien conocida y se describe por ejemplo, en Immunology, Roitt y col., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3ª Ed.)

Una persona experta en la técnica será capaz de identificar las secuencias de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Por ejemplo, están disponibles numerosos ADN de inmunoglobulinas y secuencias de proteínas mediante GenBank. La Tabla 2 muestra los números de acceso del GenBank de los genes de la cadena pesada de la inmunoglobulina y las proteínas codificadas por dichos genes. Las secuencias relacionadas en la Tabla 2 se muestran en la figura 7.

TABLA 2

2

3

4

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Las inmunoadhesinas de la presente invención pueden, además de la molécula quimérica de ICAM-1, contener una cadena ligera de inmunoglobulina o la cadena J de inmunoglobulina unida a la cadena pesada derivada de la inmunoglobulina. En realizaciones preferidas, la inmunoadhesina de la presente invención comprende dos o cuatro moléculas quiméricas ICAM-1 y una cadena J de inmunoglobulina unida a al menos una de las moléculas quiméricas ICAM-1. La cadena J está descrita y se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J Chain, en Immunoglobulin Genes, Academic Press, London, pg. 345, (1989) y Matsuuchi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:456-460 (1986). La secuencia de la cadena J de la inmunoglobulina está disponible en diferentes bases de datos en los Estados Unidos.

La inmunoadhesina de la presente invención puede tener un componente secretor asociado con la molécula quimérica de ICAM-1. Esta asociación se puede producir mediante enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro, enlaces covalentes, interacciones iónicas o combinaciones de estos diferentes enlaces. Típicamente, las moléculas quiméricas ICAM-1 se mantienen juntas mediante enlaces disulfuro entre las moléculas. La interacción entre las moléculas quiméricas ICAM-1 puede ser enlace no covalente o disulfuro. La presente invención contempla el uso de un componente secretor procedente de numerosas especies diferentes, incluyendo ser humano, rata, conejo, bovino y similares. Las secuencias de nucleótidos de estas moléculas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos 6.046.037 contiene muchas de las secuencias.

Las inmunoadhesinas de la presente invención que contienen el componente secretor, la molécula quimérica de ICAM-1 y la cadena J están típicamente unidas entre sí mediante uno de los siguientes: enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro, enlaces covalentes, interacciones iónicas o combinaciones de estos enlaces.

La presente invención también contempla inmunoadhesinas que comprenden más de una molécula quimérica de ICAM-1. La inmunoadhesina puede contener moléculas quiméricas ICAM-1 que sean unidades monoméricas y no unidas mediante enlaces disulfuro a otras moléculas quiméricas ICAM-1. En realizaciones preferidas la immunoadhesión contiene moléculas quiméricas ICAM-1 que están en asociación con otras moléculas quiméricas ICAM-1 para formar dímeros y otras moléculas multivalentes. Típicamente, la molécula quimérica de ICAM-1 está presente en forma de dímero debido a la asociación de la porción de la inmunoglobulina de la molécula quimérica. La porción de inmunoglobulina de la molécula quimérica de ICAM-1 permite la asociación de dos moléculas quiméricas ICAM-1 para formar una molécula dimérica que tiene dos porciones de enlace activas hechas con la porción de la proteína del receptor del rinovirus. En realizaciones preferidas, la dimerización se produce mediante las regiones de enlace disulfuro que se encuentran normalmente entre las regiones de inmunoglobulina como parte de una molécula de inmunoglobulina que se produce normalmente y la proteína inmunoglobulina natural. Una persona experta en la técnica comprenderá que estos enlaces disulfuro que están normalmente presentes en la molécula de inmunoglobulina natural se pueden modificar, mover y eliminar manteniendo aún la capacidad de formar un dímero de moléculas quiméricas ICAM-1.

En otras realizaciones preferidas, la inmunoadhesina contiene formas multiméricas de la molécula quimérica de ICAM-1 debido a la asociación de la cadena J con la porción inmunoglobulina de la molécula quimérica ICAM. La asociación de la cadena J con el dímero de dos moléculas quiméricas ICAM-1 permite la formación de formas tetraméricas de inmunoadhesina. En una realización preferida, la porción inmunoglobulina de la molécula quimérica de ICAM-1 se deriva de la molécula IgA, y la adición de la cadena J permite la formación de un complejo tetramérico que contiene cuatro moléculas quiméricas ICAM-1 y cuatro emplazamientos de unión. En otras realizaciones preferidas, la porción de cadena pesada de la inmunoglobulina de la molécula quimérica se deriva de IgM y se pueden formar complejos multivalentes que contienen diez o doce moléculas. En otras realizaciones preferidas, en las que la molécula quimérica de ICAM-1 usa una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina, la molécula quimérica de ICAM-1 puede formar dímeros u otros complejos multivalentes de orden superior mediante las regiones de cualquiera de IgA o IgM que sean responsables de la unión de la cadena J. En otras moléculas quiméricas de inmunoglobulinas las porciones de las inmunoglobulinas responsables de los enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina y/o de los enlaces disulfuro entre una cadena ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada se pueden ubicar en la molécula quimé-
rica de inmunoglobulina para permitir la formación de dímeros y otros complejos multivalentes de orden superior.

La presente invención contempla inmunoadhesinas que contienen una molécula quimérica de ICAM-1 en la que las regiones de inmunoglobulina que comprenden la cadena pesada se han derivado de diferentes isotipos de cadena tanto ligera como pesada de inmunoglobulinas. Una persona experta en la técnica comprenderá que, usando técnicas moleculares, estas regiones se pueden sustituir por una región similar y producir de esta manera una inmunoglobulina que sea un híbrido entre dos moléculas de inmunoglobulina distintas. Estas inmunoglobulinas quiméricas permiten la construcción de inmunoadhesinas que contienen el componente secretor que contienen una variedad de propiedades diferentes y deseadas conferidas por las diferentes regiones de inmunoglobulina.

La presente invención también contempla moléculas quiméricas ICAM-1 en las que la porción de la molécula quimérica derivada de inmunoglobulina, la cadena J pesada o la ligera puede contener menos que una región completa derivada de una molécula de inmunoglobulina diferente. Se pueden emplear las mismas técnicas moleculares para producir dichas moléculas quiméricas ICAM-1.

En realizaciones preferidas, las moléculas quiméricas ICAM-1 de la presente invención contienen al menos las regiones C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, de las IgA1, IgA2 o IgM de ratón o ser humano. Otras realizaciones preferidas de la presente invención contienen regiones de inmunoglobulina que incluyen al menos las regiones C\mu1, C\mu2, C\mu3, o C\mu4 de IgM.

Las moléculas quiméricas ICAM-1 preferidas contienen regiones procedentes de dos isotipos diferentes de inmunoglobulina humana. Las moléculas quiméricas ICAM-1 preferidas que incluyen inmunoglobulinas que contienen regiones incluyendo al menos las C_{H}1, C_{H}2, o C_{H}3 de IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, o IgD humana. Otras inmunoglobulinas preferidas para uso como parte de las moléculas quiméricas ICAM-1 incluyen inmunoglobulinas que contienen regiones procedentes de al menos la región C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, o CH4 de IgM o IgE. La presente invención también contempla moléculas quiméricas ICAM-1 que contienen regiones de inmunoglobulina derivadas de al menos dos isotipos diferentes de inmunoglobulinas de mamífero. En general, se puede usar cualquiera de las inmunoglobulinas de mamífero en las realizaciones preferidas, tales como los siguientes isotipos: cualquier isotipo de IgG, cualquier isotipo de IgA, IgE, IgD o IgM. La presente invención también contempla moléculas quiméricas ICAM-1 derivadas de especies tales como ser humano, ratón u otros mamíferos. En realizaciones preferidas, la molécula quimérica de ICAM-1 contiene la porción de IgA o IgM responsable de la asociación de la cadena J con la IgA y IgM. Así, usando una inmunoglobulina quimérica en la molécula quimérica de ICAM-1, la cadena J se puede asociar con una inmunoglobulina quimérica que es predominantemente de un isotipo que no enlaza la cadena J o el componente secretor.

La presente invención contempla también moléculas quiméricas ICAM-1 que contienen regiones de inmunoglobulina derivadas de dos isotipos diferentes de inmunoglobulina de roedor o primate. Los isotipos de inmunoglobulina de roedor o primate son bien conocidos en la técnica. Las moléculas quiméricas ICAM-1 de la presente invención pueden contener cadenas pesadas derivadas de inmunoglobulina que incluyen al menos una de las siguientes regiones de inmunoglobulina: las regiones C_{H}1, C_{H}2, o C_{H}3 de IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE, o IgD de ratón; las C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 o CH_{4} de IgE o IgM de ratón; la región C_{H}1 de IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, o IgD humana; la región C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, CH_{4} de IgM o IgE humana; la región C_{H}1, C_{H}2, o C_{H}3 de un isotipo de una IgG de mamífero, un isotipo de IgA, IgE, o IgD; la región C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 o CH_{4} de una IgE o IgM de mamífero; la región C_{H}1, C_{H}2, o C_{H}3 de un isotipo de IgG, IgA, IgE, o IgD de roedor; la región C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 o CH_{4} de IgE o IgM de roedor; la región C_{H}1, C_{H}2, o C_{H}3 de un isotipo de IgG animal, un isotipo de IgA, IgE, o IgD; y la región C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, o CH_{4} de una IgE o IgM animal. La presente invención también contempla la sustitución o adiciones de regiones de proteína derivadas de moléculas que sean miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas en las moléculas quiméricas ICAM-1. Las moléculas que pertenecen a la superfamilia de la inmunoglobulina tienen homología de la secuencia de restos de aminoácidos y de secuencia de ácidos nucleicos con las inmunoglobulinas. Las moléculas que forman parte de la superfamilia de la inmunoglobulina se pueden identificar por la homología en la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, p. 361 of Immunoglobulin Genes, Academic
Press (1989).

En realizaciones preferidas, la inmunoadhesina de la presente invención se expresa mediante procedimientos que generan un inmunoadhesina que tiene glicosilación específica de plantas. Es bien conocido en la técnica que la glicosilación es una modificación principal de las proteínas en células de plantas (Lerouge y col., Plant Molecular Biology 38:31-48, 1998). La glicosilación de proteínas también se produce en otros tipos celulares, incluyendo células de mamíferos y de insectos. El proceso de glicosilación se inicia en el retículo endoplasmático mediante la transferencia cotraduccional de un oligosacárido precursor a restos específicos de la cadena de polipéptido nascente. El procesado de este oligosacárido en diferentes tipos de glicanos, que difieren en los tipos de restos presentes y en la naturaleza de los enlaces entre los restos, se produce en la ruta secretora a medida que la glicoproteína avanza desde el retículo endoplasmático hasta su destino final. Una persona experta en la técnica comprenderá que al final de su maduración, las proteínas expresadas en plantas o en células de plantas tendrán un modelo de glicosilación diferente del que tienen las proteínas expresadas en otros tipos celulares, incluyendo células de mamífero y células de insecto. Se han llevado a cabo estudios detallados caracterizando la glicosilación específica de plantas y comparándola con la glicosilación en otros tipos celulares, por ejemplo, en los estudios descritos por Cabanes-Macheteau y col., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), y Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997). Estos grupo y otros han demostrado que la glicosilación específica de plantas genera glicanos que tienen xilosa unida \beta(1,2) a manosa, pero la xilosa no está unida \beta(1,2) a manosa como resultado de la glicosilación en células de mamífero e insecto. La glicosilación específica de plantas da como resultado una fucosa unida \alpha(1,3) a la GlcNAc proximal, mientras que la glicosilación en células de mamífero da como resultado una fucosa unida \alpha(1,6) a la GlcNAc proximal. Adicionalmente, la glicosilación específica de plantas no da como resultado la adición de un ácido siálico al extremo de la proteína glicano, mientras que en la glicosilación en células de mamífero, se añade el ácido siálico.

La inmunoadhesina de la presente invención que está glicosada de una manera específica de plantas puede contener una molécula quimérica de ICAM-1 que incluye cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4, y 5 de la molécula ICAM-1. La figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos de la molécula quimérica de ICAM-1/IgA2 (SEC DE ID Nº: 8) de la presente invención, que contiene las cinco regiones de ICAM-1. Las N en negrita representan restos de asparagina a los que se unen los restos de oligosacárido durante la glicosilación en células de plantas, así como en células de mamífero e insecto. Una persona experta en la técnica sabrá que los emplazamientos de glicosilación son el tripéptido Asn-X-Ser/Thr en el que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y ácido aspártico (Kornfeld y Kornfeld, Annu Rev Biochem 54:631-664, 1985). Por tanto, será conocido de una persona experta en la técnica qué aminoácidos de la proteína con una glicosilación específica de plantas dependerán de qué regiones estén presentes en ICAM-1. Puesto que se conocen las secuencias y los límites de ICAM-1 (véase Staunton y col., Cell 52:925-933, 1988), será evidente para una persona experta en la técnica cómo determinar los emplazamientos de glicosilación específica de plantas en cualquier combinación de cualquiera de las cinco regiones ICAM-1.

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En otras realizaciones preferidas de la presente invención, la inmunoadhesina que tiene una glicosilación específica de plantas y que contiene una molécula quimérica de ICAM-1 que tiene cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1 comprende además una cadena J y un componente secretor asociados con dicha molécula quimérica de ICAM-1. Como era el caso con respecto a la molécula quimérica de ICAM-1, una persona experta en la técnica será capaz de identificar los emplazamientos de glicosilación específica de plantas en las secuencias de la cadena J y del componente secretor.

La presente invención contempla inmunoadhesinas que tienen una glicosilación específica de plantas, que contienen una molécula quimérica de ICAM-1 en la que la cadena pesada de la inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA (SEC. DE ID N^{ROS}: 15-18), IgA1 (SEC. DE ID N^{ROS}: 15-16), IgA2 (SEC DE ID Nº: 17), IgG1 (SEC. DE ID N^{ROS}: 19-20), IgG2 (SEC. DE ID N^{ROS}: 21-22), IgG3 (SEC. DE ID N^{ROS}: 23-24), IgG4 (SEC. DE ID N^{ROS}: 25-26), IgM (SEC. DE ID N^{ROS}: 46-47), IgD (SEC DE ID Nº: 27-32 y 36-41-43), IgE (SEC. DE ID N^{ROS}: 44-45), y una cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica. Una persona experta en la técnica sabrá que dependiendo de qué secuencias de cadena pesada de la inmunoglobulina, o de qué combinación de secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina, estén combinadas en una cadena pesada de inmunoglobulina, se producirá un efecto sobre el número y ubicación de los emplazamientos de glicosilación en la molécula quimérica de ICAM-1 de la inmunoadhesina. Como era el caso con respecto a la molécula quimérica de ICAM-1, una persona experta en la técnica será capaz de identificar los emplazamientos de glicosilación específica de plantas en las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo las varias secuencias de cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica que se pueden construir.

También se proporcionan en el presente documento derivados funcionales de inmunoadhesina. Por "derivado funcional" se entiende un "derivado químico", "fragmento" o "variante", del polipéptido o ácido nucleico de la invención que retiene al menos una parte de la función de la proteína, por ejemplo la reactividad con un anticuerpo específico de la proteína, actividad enzimática o actividad de enlace, que permite su utilidad según la presente invención. Es bien conocido en la técnica que debido a la degeneración del código genético, numerosas secuencias diferentes de ácidos nucleicos pueden codificar la misma secuencia de aminoácidos. Igualmente es bien conocido en la técnica que se pueden realizar cambios conservativos en los aminoácidos para llegar a una proteína o polipéptido que retenga la funcionalidad del original. En ambos casos, se pretende que todas las permutaciones queden abarcadas por esta memoria descriptiva.

Los derivados también se pueden diseñar según procedimientos de rutina para incluir una etiqueta de purificación por afinidad de manera que se pueden producir grandes cantidades y/o cantidades relativamente puras o aisladas de inmunoadhesina. Existen muchas versiones de etiquetas que se pueden incorporar en uno o más componentes de la inmunoadhesina, preferiblemente sin destruir la actividad de enlace deseada de la inmunoadhesina en ausencia de la etiqueta. Dichas etiquetas se pueden diseñar en forma de una secuencia de ácidos nucleicos que se puede expresar fusionada con las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las inmunoadhesinas de la invención. Las etiquetas pueden adicionalmente diseñarse para que se puedan eliminar, por ejemplo, mediante una enzima comercialmente disponible.

Además, es posible borrar codones o sustituir uno o más codones con codones que no sean codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero que tenga sustancialmente la misma utilidad de actividad que el polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico no modificada. Como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos pueden ser funcionalmente equivalentes, ya que son dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso cuando las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no están relacionadas con la degeneración del código genético.

Se pueden implementar manipulaciones de este tipo, así como derivatización química tras la producción, por ejemplo, para mejorar la estabilidad, solubilidad, absorción, efecto biológico o terapéutico, y/o semivida biológica. Los restos capaces de mediar estos efectos se desvelan en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Un derivado funcional que se pretende quede abarcado en el alcance de la presente invención es un polipéptido "variante" que bien carece de uno o más aminoácidos o contiene aminoácidos adicionales o sustituidos en relación al polipéptido nativo. El variante puede derivarse de un componente complejo natural modificando adecuadamente la secuencia de codificación del ADN de la proteína para añadir, eliminar y/o modificar codones de uno o más aminoácidos en uno o más emplazamientos del C-terminal, N-terminal y/o en la secuencia nativa. Se entiende que dichos variantes que tienen aminoácidos añadidos, sustituidos y/o adicionales retienen una o más porciones caracterizantes de la proteína nativa, como se ha descrito anteriormente.

Se puede preparar un derivado funcional de una proteína con restos de aminoácidos borrados, insertados y/o sustituidos usando técnicas convencionales bien conocidas de las personas normalmente expertas en la técnica. Por ejemplo, los componentes modificados de los derivados funcionales se pueden producir usando técnicas de mutagénesis dirigida al emplazamiento (como se ejemplifica por Adelman y col., 1983, DNA 2:183) en la que los nucleótidos de la secuencia de codificación del ADN se modifican de manera que se produce una secuencia de codificación modificada, y posteriormente expresar el ADN recombinante en una célula huésped procariota o eucariota, usando técnicas como las descritas anteriormente. Alternativamente, las proteínas con delecciones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos se pueden preparar convenientemente por síntesis química directa, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los derivados funcionales de las proteínas exhiben típicamente la misma actividad biológica cualitativa que las proteínas nativas.

Además, las inmunoadhesinas de la invención pueden ser no sólo inmunoadhesinas ICAM-1/Ig modificadas, sino también abarcar otros miembros nativos de la familia ICAM, isotipos, y/u otras secuencias de aminoácidos homólogas, por ejemplo de ser humano, primate, roedor, canino, felino, bovino, avícola, etc. Adicionalmente, puede variar el tipo de Ig usado en las inmunoadhesinas, por ejemplo, puede asumir una identidad de un miembro diferente de la familia de las Ig, incluido o no en una especia dada. Las ICAM e Ig son diversas, y tienen secuencias bien conocidas, que una persona experta en la técnica puede aprovechar para crear inmunoadhesinas diferentes que tengan una utilidad más o menos diferente en un organismo dado que esté sometido a tratamiento Una lista ilustrativa no exhaustiva de ejemplos de moléculas que tienen homología con ICAM-1 que se pueden usar para crear inmunoadhesinas incluyen las de la siguiente tabla.

TABLA 3

6

7

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Igualmente, se conocen numerosas regiones constantes de la cadena pesada de diferentes moléculas de Ig, tanto de seres humanos como de otras especies, que se pueden sustituir por aquellas regiones específicas de Ig de las quimeras descritas en el presente documento.

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C. Vectores, células y plantas que contienen inmunoadhesinas

La presente invención también contempla vectores de expresión y clonación, células y plantas que contienen las inmunoadhesinas de la presente invención. La tecnología para aislar los genes que codifican las diferentes porciones de las inmunoadhesinas es bien conocidos de una persona experta en la técnica y se puede aplicar para insertar los diferentes genes necesarios en los vectores de expresión y los vectores de clonación de forma que dichos vectores se puedan introducir en las células y en plantas transgénicas.

Un procedimiento para ensamblar una inmunoadhesina de la presente invención comprende las etapas de: introducir en un organismo un segmento de ADN que codifica una molécula quimérica de ICAM-1, la cadena J de la inmunoglobulina, e introducir en dicho organismo un ADN que codifica un componente secretor. El componente secretor preferido contiene al menos un segmento de los restos de aminoácidos del 1 al aproximadamente 6o6 de la secuencia de aminoácidos del receptor de la poliinmunoglobulina (pIgR) humana o restos de aminoácidos procedentes de otras especies (Mostov, Ann Dev. Immu. 12:63-84 1994).

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La presente invención contempla células eucariotas, incluyendo células de plantas, que contienen inmunoadhesinas de la presente invención. La presente invención también contempla células de plantas que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los diferentes componentes de la inmunoadhesina de la presente invención. Una persona experta en la técnica comprenderá que las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de protección del componente secretor y la molécula quimérica de ICAM-1 y la cadena J típicamente estarán unidas operativamente a un promotor y estarán presentes como parte de un vector o casete de expresión. Típicamente, si la célula eucariota usada es una célula de planta tal que el promotor usado será un promotor que sea capaz de operar en una célula de planta. Una vez aislados los genes de ICAM-1 quiméricos, los genes del componente secretor y los genes de la cadena J, típicamente están unidos operativamente a un promotor transcripcional en un vector de expresión. La presente invención también contempla vectores de expresión que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican una molécula quimérica de ICAM-1 que se ha unido operativamente con una secuencia reguladora para la expresión. Estos vectores de expresión colocan la secuencia de nucleótidos a expresar en una célula particular 3' de una secuencia de promotor que produce que la secuencia de nucleótidos se transcriba y exprese. El vector de expresión puede contener también varias secuencias potenciadoras que mejoran la eficacia de esta transcripción. Además, se pueden incluir secuencias como terminadores, emplazamientos de poliadenilación (poli A) y otras señales de procesado en el extremo 3' para potenciar la cantidad de secuencia de nucleótidos transcrita en una célula particular.

La expresión de los componentes en el organismo de elección se puede derivar de un plásmido de replicación independiente, o de un componente permanente del cromosoma, o de cualquier parte del ADN que transitoriamente pueda dar lugar a transcriptos que codifiquen los componentes. Los organismos adecuados para la transformación pueden ser tanto procariotas como eucariotas. La introducción de los componentes del complejo puede ser por transformación directa del ADN, por administración biológica balística en el organismo, o mediada por otro organismo como por ejemplo mediante la acción de Agrobacterium recombinante sobre células de plantas. La expresión de proteínas en organismos transgénicos normalmente requiere la introducción simultánea de un elemento promotor adecuado y una señal de poliadenilación. En una realización de la invención, el elemento promotor potencialmente da como resultado la expresión constitutiva de los componentes en todas las células de una planta. La expresión constitutiva que aparece en la mayor parte o todas las células asegurará que los precursores pueden ocupar el mismo sistema celular endomembrana según necesidad para que se produzca el ensamblaje.

Se usan vectores de expresión compatibles con las células huésped, preferiblemente aquellos compatibles con las células de plantas para expresar los genes. Los vectores de expresión típicos útiles para expresión de genes en plantas son bien conocidos en la técnica, e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers y col., Meth. in Enzymol., 153:253-277 (1987). Sin embargo, se conocen otros varios sistemas de vectores de expresión que funcionan en plantas. Véase ejemplo, Verma y col., Publicación PCT Nº WO87/00551; y Cocking y Davey, Science, 236:1259-1262 (1987).

Los vectores de expresión descritos anteriormente contienen elementos de control de la expresión que incluyen el promotor. Los genes a expresar están unidos operativamente al vector de expresión para permitir que la secuencia del promotor dirija la unión de la ARN polimerasa y la síntesis del gen que codifica el polipéptido deseado. Son útiles en la expresión de genes los promotores que son inducibles, víricos, sintéticos, constitutivos, y regulados. La elección de qué vector de expresión usar y finalmente a qué promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica una parte de la inmunoadhesina de la presente invención se va a unir operativamente depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo la ubicación y temporalización de la expresión de la proteína, y la células huésped a transformar, siendo éstas limitaciones inherentes a la técnica de construir moléculas de ADN recombinante. Sin embargo, un vector de expresión útil para llevar a cabo la presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación, y preferiblemente también la expresión de la secuencia de codificación del polipéptido incluida en el segmento de ADN al que está operativamente unido.

En realizaciones preferidas, el vector de expresión usado para expresar los genes incluye un marcador de selección que es eficaz en una célula de planta, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a un fármaco. Un marcador preferido de resistencia a fármaco es el gen cuya expresión da como resultado la resistencia a kanamicina, es decir, el gen quimérico que contiene el promotor nopalina sintasa, Tn5 neomicina fosfotransferasa II y la región 3' no traducida de la nopalina sintasa 3' descrita por Rogers y col., in Methods For Plant Molecular Biology, Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988). Un vector de expresión útil en plantas está comercialmente disponible de Pharmacia, Piscataway, N.J. Los vectores de expresión y los promotores para expresar proteínas extrañas en plantas se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos N^{ros} 5.188.642; 5.349.124; 5.352.605, y 5.034.322.

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para unir operativamente ADN a vectores mediante términos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir rastros homopoliméricos complementarios al segmento de ADN a insertar en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación mediante enlaces de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante. Alternativamente, se pueden usar enlazantes sintéticos que contienen uno o más emplazamientos de restricción de endonucleasa para unir el segmento de ADN al vector de expresión. Los enlazantes sintéticos se unen a segmentos de ADN con extremos enromados incubando los segmentos de ADN con extremos enromados con un importante exceso de moléculas de enlazante sintético en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de las moléculas de ADN de extremos enromados, tales como la ADN ligasa del bacteriófago T4. Así, los productos de la reacción son segmentos de ADN que transportan secuencias de enlazante sintético en sus extremos. Estos segmentos de ADN se rompen a continuación con la endonucleasa de restricción adecuada y se unen en un vector de expresión que se ha escindido con una enzima que produce términos compatibles con los del enlazante sintético. Los enlazantes sintéticos que contienen una variedad de emplazamientos de la endonucleasa de restricción están comercialmente disponibles de numerosas fuentes entre las que se incluyen New England BioLabs, Beverly, Mass.

Las secuencias de nucleótidos que codifican el componente secretor, la cadena J, las moléculas quiméricas ICAM-1 de la presente invención se introducen en la misma célula de planta bien directamente o introduciendo cada uno de los componentes en una célula de planta y regenerando una planta e hibridando de forma cruzada los diferentes componentes para producir la célula de planta final que contiene todos los componentes necesarios.

Se puede usar cualquier procedimiento para introducir las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes de las inmunoadhesinas de la presente invención en una célula eucariota. Por ejemplo, los procedimientos para introducir genes en plantas incluyen la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, la transformación de protoplastos, la transferencia de ADN en polen, la inyección en los órganos reproductivos y la inyección en embriones inmaduros. Cada uno de estos procedimientos tiene diferentes ventajas y desventajas. Así, un procedimiento particular para introducir genes en una célula eucariota o especie de planta particular puede no ser necesariamente el más eficaz para otra célula eucariota o especie de planta.

La transferencia mediada por Agrobacterium tumefaciens es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células de plantas puesto que el ADN se puede introducir en los tejidos de la planta completa, soslayando la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores de expresión mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células de plantas es bien conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos por Fraley y col., Biotechnology, 3:629 (1985) y Rogers y col., Methods in Enzymology, 153:253-277 (1987). Además, la integración del Ti-ADN es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocas reordenaciones. La región del ADN a transferir se define por las secuencias frontera y el ADN de intervención se inserta usualmente en el genoma de la planta según se describe por Spielmann y col., Mol. Gen. Genet., 205:34 (1986) y Jorgensen y col., Mol. Gen. Genet., 207:471 (1987). Los modernos vectores de transformación de Agrobacterium son capaces de replicarse tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes como las descritas por Klee y col., en Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn y J. Schell, eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 179-203 (1985). Avances tecnológicos recientes en vectores para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium han mejorado la disposición de los genes y los emplazamientos de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diferentes genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos por Rogers y col., Methods in Enzymology, 153:253 (1987), tienen regiones multienlazantes convenientes flanqueadas por un promotor y un emplazamiento de poliadenilación para la expresión directa del los genes insertados que codifican el polipéptido y son adecuados para los presentes objetivos.

En aquellas especies de plantas en las que la transformación mediada por Agrobacterium es eficaz, es el procedimiento de elección debido a la naturaleza sencilla y definida de la transferencia génica. La transformación mediada por Agrobacterium de discos de hojas y otros tejidos parece estar limitada a la especie de planta que Agrobacterium tumefaciens infecta de manera natural. De esta manera, la transformación mediada por Agrobacterium es más eficaz en plantas dicotiledóneas.

Pocas monocots parecen ser huéspedes naturales de Agrobacterium, aunque se han producido plantas transgénicas en asparagus usando vectores de Agrobacterium según han descrito Bytebier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345 (1987). Sin embargo, granos de cereales comercialmente importantes como arroz, maíz, y trigo se pueden transformar usando procedimientos alternativos. ive. La transformación de protoplastos de plantas se puede conseguir usando procedimientos basados en la precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de dichos tratamientos. Véase, por ejemplo, Potrykus y col., Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985); Lorz y col., Mol. Gen. Genet., 199:178 (1985); Fromm y col., Nature, 319:791 (1986); Uchimiya y col., Mol. Gen. Genet., 204:204 (1986); Callis y col., Genes and Development, 1:1183 (1987); and Marcotte y col., Nature, 335:454 (1988).

La aplicación de estos procedimientos a diferentes especies de plantas depende de la capacidad para regenerar esa especie de planta en particular a partir de protoplastos. Procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos se describen en Fujimura y col., Plant Tissue Culture Letters, 2:74 (1985); Toriyama y col., Theor Appl. Genet., 73:16 (1986); Yamada y col., Plant Cell Rep., 4:85 (1986); Abdullah y col., Biotechnology, 4:1087 (1986).

Para transformar especies de plantas que no se pueden regenerar con éxito a partir de protoplastos, se pueden utilizar otras vías para introducir ADN en células o tejidos intactos. Por ejemplo, se puede realizar la regeneración de cereales a partir de tejidos inmaduros o explantes según describe Vasil, Biotechnology, 6:397 (1988). Además, se puede usar el "canon de partículas" o la tecnología de microproyectiles de alta velocidad. Usando dicha tecnología, el ADN se trasporta a través de la pared celular y al interior del citoplasma en la superficie de partículas metálicas pequeñas (0,525 \mum) que se han acelerado hasta velocidades de uno a varios cientos de metros por segundo según se describe en Klein y col., Nature, 327:70 (1987); Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8502 (1988); y McCabe y col., Biotechnology, 6:923 (1988). Las partículas metálicas penetran a través de varias capas de células y permiten por tanto la transformación de células contenidas en explantes de tejidos. Las partículas metálicas se han usado para transformar con éxito células de maíz y para producir plantas de tabaco y soja fértiles, transformadas de manera estable. La transformación de explantes de tejido elimina la necesidad de pasar por la etapa de protoplasto y acelera por tanto la producción de plantas transgénicas.

El ADN se puede introducir también en plantas mediante transferencia directa del ADN en polen como describen Zhou y col., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo y col., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988). La expresión de los genes que codifican el polipéptido se puede obtener por inyección del ADN en el interior de los órganos reproductores de una planta como describen Pena y col., Nature, 325:274 (1987). El ADN también se puede inyectar directamente en las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones desecados como se describe en Neuhaus y col., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); y Benbrook y col., en Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986).

La regeneración de plantas tanto a partir de protoplastos de planta única o de varios explantes es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye las etapas de selección de células y retoños trasformantes, enraizar los retoños trasformantes y hacer crecer las plántulas en el suelo.

Se puede conseguir la regeneración de plantas que contienen el gen extraño introducido por Agrobacterium tumefaciens desde explantes de las hojas según describen Horsch y col., Science, 227:1229-1231 (1985). En este procedimiento, se hacen crecer trasformantes en presencia de un agente de selección y en un medio que induzca la regeneración de retoños en la especies de plantas que están siendo transformadas según describen Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Este procedimiento produce típicamente retoños en de dos a cuatro semanas y estos retoños transformantes se transfieren a continuación a un medio inductor de raíces adecuado que contiene el agente selector y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Los retoños transformantes que enraízan en presencia del agente selector para formar plántulas se trasplantan a continuación al suelo para permitir la producción de raíces. Estos procedimientos variarán dependiendo de la especie de planta particular empleada, siendo dichas variaciones bien conocidas en la técnica.

Las inmunoadhesinas de la presente invención se pueden producir en cualquier célula de planta incluyendo células de plantas derivadas de plantas que son dicotiledóneas o monocotiledóneas, solanáceas, alfalfa, leguminosas, o
tabaco.

Las plantas transgénicas se pueden producir a partir de cualquier especie de planta que se pueda cruzar sexualmente que se pueda transformar usando cualquier procedimiento conocido de una persona experta en la técnica. Las especies de plantas útiles son dicotiledóneas incluyendo tabaco, tomate, legumbres, alfalfa, roble, y arce; monocotiledóneas incluyendo herbáceas, maíz, granos, avena, trigo y cebada; y plantas inferiores incluyendo gimnospermas, coníferas, equiseto, licopodio, hepática, hornabeque, líquenes, algas, gametofitos, esporofitos o pteridofitos.

La presente invención también contempla expresar la inmunoadhesinas de la presente invención en células eucariotas incluyendo células de mamífero. Una persona experta en la técnica comprenderá los diferentes sistemas disponibles para la expresión de la inmunoadhesina en células de mamífero y puede modificar fácilmente dichos sistemas para expresar las inmunoadhesinas y moléculas quiméricas ICAM-1 de la presente invención en dichas células. En realizaciones preferidas, las moléculas quiméricas ICAM-1, la cadena J y el componente secretor se colocan en un vector pCDM8 que se ha descrito anteriormente en Aruffo, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:8573-8577 (1987). El uso del constructo PCDM8 de ninguna manera es único, y están disponibles muchos otros sistemas que no utilizan el sistema de expresión en células COG. Por ejemplo, las siguientes Patentes de los Estados Unidos describen sistemas de expresión en eucariotas útiles que se pueden usar con la ICAM-1 quimérica y otras moléculas de inmunoadhesina.

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D. Composiciones que contienen inmunoadhesinas

La presente invención también contempla las composiciones que contienen una inmunoadhesina de la presente invención junto con macromoléculas o material de plantas. Típicamente, estas macromoléculas o material de plantas están derivados de cualquier planta útil en la presente invención. Las macromoléculas de plantas están presentes junto con una inmunoadhesina de la presente invención por ejemplo, en una célula de planta, en un extracto de una célula de planta, o en una planta. Las macromoléculas de planta típicas asociadas con la inmunoadhesina de la presente invención en una composición son la ribulosa bisfosfato carboxilasa, pigmentos del complejo cosechado ligero (LHCP), metabolitos secundarios o clorofila. Las composiciones de la presente invención tienen material de plantas o macromoléculas de plantas en una concentración de entre 0,01% y 99% en paso excluyendo el agua. Otras composiciones incluyen las composiciones que tienen las inmunoadhesinas de la presente invención presentes a una concentración de entre 1% y 99% en peso excluyendo el agua. Otras composiciones incluyen inmunoadhesinas a una concentración del 50% al 90% en peso excluyendo el agua.

Las composiciones de la presente invención pueden contener macromoléculas de plantas a una concentración de entre 0,1% y 5% en peso excluyendo el agua. Típicamente, el peso presente en la composición estará constituido por macromoléculas de plantas e inmunoadhesinas de la presente invención. Cuando las inmunoadhesinas de la presente invención están presentes a una concentración superior o inferior respecto de la concentración de macromoléculas de plantas presentes en la composición variarán inversamente. En otras realizaciones, la composición de macromoléculas de plantas está presente en una concentración entre 0,12% y 1% en peso excluyendo el agua.

La presente invención contempla una composición de manera que comprende todo o parte de lo siguiente: una molécula quimérica de ICAM-1, una cadena J o un componente secretor. Estos componentes forman un complejo y están asociados como se ha descrito anteriormente. Típicamente, la composición contiene también moléculas derivadas de una planta. Esta composición puede obtenerse también tras un proceso de extracción que proporciona inmunoadhesina funcional y moléculas derivadas de plantas.

El procedimiento de extracción comprende las etapas de aplicar una fuerza a una planta que contiene el complejo, en el que el compartimiento apoplástico de la planta se rompe liberando dicho complejo. La fuerza implica la cizalladura como procedimiento principal para la liberación del líquido apoplástico.

La planta completa o el extracto de la planta contienen una mezcla de inmunoadhesina y otras macromoléculas diferentes de la planta. Entre las macromoléculas contenidas en la mezcla se encuentra la ribulosa bisfosfato carboxilasa (RuBisCo) o fragmentos de RuBisCo. Otra macromolécula es LHCP. Otra molécula es la clorofila.

Otros procedimientos útiles para preparar las composiciones que contienen las inmunoadhesinas que tienen la molécula quimérica de ICAM-1 incluyen la extracción con diferentes disolventes y la aplicación de vacío al material de plantas. Las composiciones de la presente invención pueden contener macromoléculas de plantas en una concentración entre aproximadamente 0,1% y 5% en peso excluyendo el agua.

La presente invención también contempla composiciones terapéuticas que se pueden usar en el tratamiento de un paciente o animal. La administración de la composición terapéutica puede ser antes o después de la extracción de la planta u otro organismo transgénico. Una vez extraídas, las inmunoadhesinas pueden también purificarse adicionalmente por técnicas convencionales tales como exclusión por tamaños, intercambio iónico o cromatografía por afinidad. Las moléculas de plantas pueden administrarse simultáneamente con el complejo.

La presente invención también contempla que puede variar la proporción relativa entre moléculas derivadas de plantas y moléculas derivadas de animales. Las cantidades de proteínas específicas de plantas, tales como RuBisCo o clorofila pueden ser tan pequeñas como 0,01% de peso o tan grandes como el 99,9% del peso del extracto, excluyendo el agua.

La presente invención también contempla el uso directo del extracto terapéutico de planta que contiene inmunoadhesinas sin ninguna purificación adicional del componente terapéutico específico. La administración puede ser una aplicación tópica, ingestión oral, pulverización nasal, o cualquier otro procedimiento apropiados para dosificar el anticuerpo al patógeno diana de la mucosa.

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E. Composiciones farmacéuticas, formulaciones, y rutas de administración

Las inmunoadhesinas descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica adecuada. Dicha composición puede incluir componentes adicionales a, o en lugar de, los anteriormente descritos. La composición preferiblemente muestra cualquiera o ambas de una propiedad terapéutica y profiláctica cuando se administra. La preparación de tales composiciones se puede realizar según metodologías rutinarias en la técnica, y se puede asumir cualquiera de la variedad de formas, por ejemplo, disoluciones líquidas, suspensiones o emulsiones, y formas sólidas adecuadas para inclusión en un líquido antes de la ingestión. Las técnicas para la formulación y administración de polipéptidos y proteínas se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Usando estos procedimientos, una persona normalmente experta en la técnica puede utilizar las inmunoadhesinas de la invención para alcanzar el éxito sin demasiada experimentación.

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1. Rutas de administración

Las rutas de administración adecuadas para la invención incluyen, por ejemplo, la administración oral, nasal, inhalación, intraocular, faríngea, bronquial, transmucosal, o intestinal. Alternativamente, el compuesto se puede administrar de manera local, por ejemplo, mediante inyección u otra aplicación del compuesto a un lugar preferido de acción.

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2. Formulaciones

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera que es conocida por sí misma, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grajeas, molienda en seco, emulsión, encapsulado, atrapado o liofilización. Se pueden usar uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y/u otros auxiliares que se pueden usar para facilitar el procesado de los compuestos activos en preparaciones farmacéuticas. La formulación correcta depende de la ruta de administración particular elegida.

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Para inyección, los agentes de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer, o tampón fisiológico salino. Para la administración transmucosal, se usan en la formulación penetrantes adecuados a la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares para ingestión oral por un paciente a tratar. Dichos vehículos adecuados incluyen excipientes tales como, por ejemplo, cargas como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, y/o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una de sus sales como alginato de sodio.

Se proporciona a los núcleos de las grajeas un revestimiento adecuado. A este efecto, se pueden usar disoluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente contienen goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, carbopol, gel, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir tintes o pigmentos a los revestimientos de comprimidos o grajeas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas duras de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga como lactosa, ligantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en dosis adecuadas para dicha administración.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos que comprenden la inmunoadhesina de la presente invención pueden dosificarse convenientemente en la forma de una presentación en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para dosificar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de por ejemplo gelatina para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y un polvo base adecuado tal como lactosa o almidón.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos, antes del uso.

Además, los compuestos también se pueden formular como preparación de depósito. Dichas formulaciones de actuación a largo plazo se pueden administrar por implante (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales adecuados poliméricos o hidrófobos (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles pulverizables, por ejemplo, como una sal soluble pulverizable.

Adicionalmente, los compuestos se pueden dosificar usando un sistema de liberación continua, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han señalado materiales de liberación continua y son bien conocidos por una persona experta en la técnica. Las cápsulas de liberación continua pueden, dependiendo de su estructura química, liberar los compuestos durante de pocas semanas a más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos adecuados en fase sólida o gel o excipientes. Ejemplos de estos vehículos o excipientes incluyen pero no se limitan a carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros como polietilenglicoles.

Las sales farmacéuticamente compatibles pueden estar formadas con muchos ácidos, incluyendo pero sin limitarse a los ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, cítrico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en agua u otros disolventes protónicos que las correspondientes formas de base libre. En disoluciones, la manipulación del pH es también una cuestión usada rutinariamente para optimizar determinadas propiedades.

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3. Determinación de las dosis eficaces y las pautas terapéuticas

Las composiciones farmacéuticas que comprenden la inmunoadhesina de la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir un objetivo pretendido, por ejemplo, un uso terapéutico y/o profiláctico. Una cantidad farmacéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una dolencia, o prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La determinación de una cantidad farmacéuticamente eficaz está entre las habilidades de una persona experta en la técnica, y típicamente asumirá una cantidad de entre aproximadamente 0,5 \mug/kg/día y aproximadamente 500 g/kg/día, con dosificaciones individuales que típicamente comprenden entre aproximadamente 1 nanogramo y varios gramos de inmunoadhesina.

Para cualquier compuesto que comprende las inmunoadhesinas de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz a usar se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Por ejemplo, se pueden administrar dosificaciones variables a diferentes animales o cultivos celulares y comparar su efecto. De esta manera, se puede identificar un intervalo deseado de concentraciones, y preparar y administrar dicha cantidad según lo anterior. La optimización es algo rutinario para una persona normalmente experta en la técnica.

La persona experta, además de considerar la eficacia farmacéutica, considerará también la toxicidad según los procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (dosis letal para el 50% de la población) y la CE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). El cociente de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como el cociente entre DL50 y CL50. Se prefieren los compuestos que presentan mayores índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos con cultivos celulares y estudios animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos descansa preferiblemente en un intervalo de concentraciones que incluye la DE50 con poco o nada de toxicidad. La dosificación puede variar en este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación pueden elegirse por cada médico en vista del estado del paciente. (Véase por ejemplo, Fingl y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

Pueden ajustarse la cantidad y la frecuencia de dosificación para proporcionar niveles de inmunoadhesina en la mucosa suficientes para mantener o proporcionar un efecto farmacéutico, por ejemplo, terapéutico y/o profiláctico. La concentración mínima eficaz de (MEC) variará para cada inmunoadhesina y formulación de inmunoadhesina, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro y/o in vivo. Las dosificaciones necesarias para alcanzar MEC dependerán de las características individuales y de la ruta de administración. Sin embargo, se pueden usar ensayos como los descritos en el presente documento para determinar la concentración en la mucosa, que se puede optimizar adicionalmente en cantidad y formulación precisas.

Los intervalos de dosificación se pueden determinar también con el valor MEC. Los compuestos se pueden administrar usando una pauta que mantenga niveles en la mucosa superiores a MEC en un 10-90% del tiempo, 30-90% del tiempo, o, más preferiblemente, 50-90% del tiempo.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede por ejemplo comprender una lámina de metal o plástico, tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para el administrador. El envase o dispensador puede ir también acompañado de un prospecto asociado con el recipiente en la forma prescrita por el organismo gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de los compuestos farmacéuticos, en la que dicho prospecto es sujeto de aprobación por el organismo de la forma de la inmunoadhesina para administración humana o veterinaria. Dicho folleto, por ejemplo, puede ser el etiquetado aprobado por la oficina norteamericana para alimentos y fármacos para fármacos con receta, o el inserto aprobado del producto. También se pueden preparar composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible, colocarse en un recipiente adecuado, y marcarse para el tratamiento de una dolencia indicada, por ejemplo tratamiento o profilaxis de una enfermedad mediada por moléculas ICAM del organismo huésped/paciente.

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F. Procedimientos de tratamiento y prevención de afecciones mediadas por ICAM

Un paciente necesitado de quimeras de inmunoadhesina terapéuticas y/o profilácticas de la invención, por ejemplo, para contrarrestar la infección por rinovirus y/o los síntomas que se producen con los resfriados, puede ser administrado con una cantidad farmacéuticamente eficaz de la inmunoadhesina deseada, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica determinada, producida y administrada como se ha descrito anteriormente. Estas formulaciones y modalidades de dosificación pueden variar ampliamente. Se describen a continuación procedimientos preliminares que se pueden usar para deducir las cantidades eficaces y toxicidad, y que se pueden usar entonces convenientemente para determinar los parámetros y pautas de tratamiento y profilaxis, tanto en seres humanos como en otros animales. Estos procedimientos son meramente ilustrativos, y no se pretende que limiten la invención. Adicionalmente, esos procedimientos son algo rutinario para una persona experta en la técnica.

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1. Capacidad de la inmunoadhesina para reducir la infectividad del rinovirus en seres humanos: estudio de tolerancia con escalado de dosis

Las inmunoadhesinas de la invención pueden ensayarse, por ejemplo, usando ensayos aleatorizados controlados para determinar el efecto de la administración, por ejemplo, intranasal, de la inmunoadhesina sobre la infección. Se pueden usar otras rutas de administración. Existen diferentes ensayos que se pueden usar para vigilar el efecto, por ejemplo, los ensayos de respuesta IL-8 que evalúan los síntomas de la enfermedad, por ejemplo, síntomas del resfriado causado mediante la infección por rinovirus. Estos estudios pueden evaluar la extensión en la que una inmunoadhesina tomada por un sujeto paciente puede prevenir o tratar la infección por rinovirus. Por ejemplo, se puede administrar la inmunoadhesina a sujetos saludables o no saludables y evaluarlos durante un periodo de tiempo, por ejemplo, en tándem con la inoculación del rinovirus y/o progreso de la enfermedad. Los protocolos clínicos usados pueden estar basados en protocolos anteriormente usados en la evaluación de una molécula ICAM-1 recombinante soluble para determinar su eficacia frente a la infección por rinovirus, o sus modificaciones (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804, 1999).

Se pueden evaluar sujetos varones y hembras de cualquier especie, edad, salud o estado de enfermedad. Los sujetos pueden mostrar un título de anticuerpo neutralizante en suero antes del estudio, dicho título fluctuará en respuesta a la infección y a la administración de inmunoadhesina.

La inmunoadhesina de la presente invención se puede formular como una disolución salina tamponada con cantidades variables de inmunoadhesina y administrarse en diferentes intervalos a un paciente. Se pueden usar estudios de dosis única ascendente y de dosis múltiple ascendente para evaluar la seguridad de la inmunoadhesina. En cada caso, se pueden evaluar uno o más sujetos en cada nivel de dosificación, algunos recibiendo la inmunoadhesina, y uno o más recibiendo opcionalmente placebo. En cualquiera de los estudios se pueden evaluar niveles de dosificación múltiple. Los niveles de dosificación pueden variar, pero están típicamente en el intervalo de nanogramo a gramo.

Las dosificaciones se pueden administrar durante segundos, minutos, horas, semanas y meses, y evaluar su toxicidad y/o efecto farmacéutico.

Se pueden evaluar la seguridad y la toxicidad, por ejemplo, por examen visual de la mucosa nasal para signos de irritación o inflamación. También se pueden emplear análisis de sangre de seguridad según procedimientos de rutina y usando ensayos sensibles tales como ELISA para determinar varios componentes de la sangre, incluyendo inmunoadhesina circulante y cantidades de rinovirus. De manera similar, se pueden realizar ensayos de lavado nasal según metodologías de rutina.

Se pueden usar análisis estadísticos y cálculos de rutina para determinar la eficacia y toxicidad predicha en cursos temporales para pacientes únicos y/o poblaciones de pacientes receptores.

Se pueden usar estudios con estímulo como es bien conocido en la técnica para demostrar que el tratamiento protege frente a resfriados clínicos y/o reduce los síntomas del resfriado tras el estímulo vírico, y usar materiales de partida comercialmente disponibles como virus, células, y animales. Véase, por ejemplo, Gwaltney, y col., Prog. Med. Virol. 39:256-263, 1992.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención desvelada. Estos ejemplos no limitan de manera alguna el alcance de la invención reivindicada.

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Ejemplos 1. Construcción de un casete de expresión de inmunoadhesina

Se preparó un casete codificando las regiones extracelulares D1 a D5 de ICAM-1 mediante clonación por PCR. Se amplificó específicamente un fragmento que contiene las cinco regiones extracelulares de tipo Ig de ICAM-1 a partir del plásmido pCDIC1-5D/IgA (inserto Martin, y col. referencia) usando los siguientes cebadores de oligonuicleótido:

8

Estos dos cebadores fueron diseñados para introducir emplazamientos SpeI en los extremos 5' y 3' del fragmento de la PCR (nucleótidos subrayados). Se llevó a cabo la PCR con polimerasa Pfu (Stratagene) para reducir la acumulación de errores. El fragmento de la PCR se clonó en el vector PCRScript (Stratagene), y se secuenció antes de su fusión con los casetes de IgA2 (con y sin SEKDEL en el extremo carboxilo).

Se desarrollaron constructos para la expresión en plantas de la cadena J y el componente secretor humanos, así como de la cadena pesada de la IgA2 humana. Se fabricó un vector casete de expresión de la cadena pesada y se denominó pSSpHuA2 (véase la figura 1). Éste contiene la secuencia que codifica el péptido señal de legumina de guisante (Baumlein y col., Nucleic Acids Res. 14 (6), 2707-2720, 1986). La secuencia de la legumina de guisante se proporciona como Nº de Acceso del GenBank X03677, y la secuencia del péptido señal de la legumina de guisante es la SEC DE ID Nº: 10 (véase igualmente la figura 8) y la región constante de IgA2m(2) con los emplazamientos SpeI y SacI entre medias, y el promotor SuperMas para impulsar la expresión de un péptido señal y las regiones constantes de la cadena pesada de la IgA2m(2) humana.

Los ADN amplificados que codifican las primeras cinco regiones de la ICAM-1 humana, y la región Fc de la IgA2m(2) humana se fusionaron en un casete de expresión en plantas para fabricar un constructo de expresión de la molécula quimérica de ICAM-1, mostrado en la figura 2A. Esta se realizó clonando el fragmento que codifica las cinco regiones extracelulares de ICAM-1 en el vector pSSPHuA2 para generar pSSPICAMHuA2. Los emplazamientos de restricción convenientes (5' SpeI y 3' SpeI) permitieron la inserción del fragmento amplificado entre el péptido señal y la región Ca1. En el constructo resultante, la expresión de la molécula quimérica de ICAM-1 está bajo el control del promotor constitutivo "superMAS" (Ni y col., 1995) y la región de terminación nos 3'.

El constructo resultante de la molécula quimérica de ICAM-1 no contiene región variable. Tras la traducción del ARNm, se predice la escisión del péptido señal para depositar la fusión ICAM-1-cadena pesada en el retículo endoplasmático (ER) de la célula de planta. El ADN que codifica una señal de retención ER (RSEKDEL, SEC DE ID Nº: 5) se añadió al extremo 3' de la cadena pesada con el fin de impulsar el nivel de expresión del constructo. La secuencia de aminoácidos SEKDEL (SEC DE ID Nº: 4) es la secuencia señal de consenso para la retención de proteínas en el retículo endoplasmático de las células de plantas. Se ha demostrado que esta secuencia potencia los niveles de acumulación de anticuerpos en plantas (Schouten y col., Plant Molecular Biology 30:781-793,1996). La secuencia de aminoácidos del constructo de molécula quimérica de ICAM-1 se muestra en la figura 2B. La secuencia de ADN y el marco traduccional del constructo se verificó antes de su uso para el bombardeo de partículas.

Se ha demostrado recientemente que el ensamblaje de la cadena J con IgA tiene lugar en el aparato de Golgi (Yoo y col., J. Biol. Chem. 274:33771-33777, 1999), y por tanto también se han realizado construcciones de cadena pesada sin SEKDEL. El fragmento ICAM-1 se clonó en un casete de expresión que contiene la región constante de IgA2m(2) sin SEKDEL.

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2. Expresión de la inmunoadhesina ensamblada en plantas A. Vectores de expresión de inmunoadhesina

El plásmido pSSPICAMHuA2 (SEC DE ID Nº:9 y figura 8) tiene 6313 pb de longitud. Los nucleótidos 49-1165 representan el Superpromotor (Ni y col., Plant Journal 7:661-676, 1995). Los nucleótidos 1166-3662 comprenden una secuencia que codifica una ICAM-1 humana/IgA2m(2) humana constante híbrida con secuencias enlazantes. Se incluyó una secuencia Kozak de consenso (Kozak, Cell 44 (2):283-92, 1986) (nt 1186-1192) para potenciar el inicio de la traducción, así como el péptido señal procedente de la legumina de V. faba (nt 1189-1257; Bäumlein y col., Nucleic Acids Reg. 14(6):2707-2720 (1986). La secuencia de la región constante de la IgA2m(2) humana (nt 3663-3633) se había publicado anteriormente (Chintalacharuvu, y col., J. Imm. 152: 5299-5304, 1994). Se añadió una secuencia que codificaba la señal de retención SEKDEL del retículo endoplasmático al final de la cadena pesada (nt 3634-3654). Los nucleótidos 3663-3933 derivan del extremo 3' de la nopalina sintasa (terminación de la transcripción y señal de poliadenilación; Depicker y col., 1982). El resto del plásmido deriva del vector pSP72 (Promega).

pSHuJ (SEC DE ID Nº: 11 y figura 8) tiene 4283 pb de longitud. Los nucleótidos 14-1136 representan el Superpromotor (Ni y col., Plant Journal 7:661-676, 1995) y los nucleótidos 1137-1648 se muestran en la figura 8 y comprenden una secuencia que codifica la cadena J humana incluyendo el péptido señal nativo (Max y Korsmeyer, J Imm. 152: 5299-5304, 1985) junto con secuencias enlazantes. Se incluyó una secuencia Kozak de consenso (Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986) (nt 1162-1168) para potenciar el inicio de la traducción. Los nucleótidos 1649-1902 derivan del extremo 3' de la nopalina sintasa (terminación de la transcripción y señal de poliadenilación; Depicker y col., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982). El resto del plásmido deriva del vector pSP72 (Promega).

El plásmido (SEC DE ID Nº:12 y figura 8) tiene 5650 bp de longitud. Los nucleótidos 13-1136 derivan del Superpromotor (Ni y col., Plant Journal 7:661-676, 1995), y los nucleótidos 1137-2981, comprenden una secuencia que codifica el Componente secretor humano incluyendo el péptido señal nativo (Krajci, y col., Biochem. and Biophys. Res. Comm 158:783, 1994) junto con secuencias enlazantes. Se incluyó una secuencia Kozak de consenso (Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986) (nt 1151-1157) para potenciar el inicio de la traducción. Los nucleótidos 2982-3236 derivan del extremo 3' de la nopalina sintasa (terminación de la transcripción y señal de poliadenilación descrita en Depicker y col., J Mol Appl Genet 1(6):561-73 (1982). El resto del plásmido deriva del vector pSP72 (Promega).

El plásmido pBMSP-1 (SEC DE ID Nº: 13 y figura 8) se deriva de pGPTV-KAN. Becker y col., en Plant Molecular Biology 20, 1195-1197, (1992), describe vectores binarios de plantas novedosos con marcadores de selección ubicados proximalmente a la frontera del T-ADN izquierdo y secuencias hacia el exterior de las fronteras izquierda y derecha. Los nucleótidos 18-187 de pBMSP-1 representan la frontera T-ADN derecha y los nucleótidos -775 representan el promotor superMAS. Los nucleótidos 2393-2663 representan el promotor NOS (Depicker y col., J Mol Appl Genet 1(6):561-73, 1982), los nucleótidos 2698-3492 codifican el gen NPTII (que confiere resistencia a la kanamicina), y los nucleótidos 3511-3733 son la señal de poliadenilación procedente del gen 7 de A. tumefaciens (Gielen y col., Embo J 3:835-46, 1984). Los nucleótidos 1768-976 codifican el gen NPTII, y los nucleótidos 4317-4464.

El plásmido pBMSP-1spJSC (SEC DE ID Nº:14 y figura 8) es un derivado de pBMSP, que contiene tanto J como SC bajo el control del superpromotor. En este plásmido, los nucleótidos 1-149 representan la frontera del T-ADN izquierdo. Los nucleótidos 955-733 son la señal de poliadenilación procedente del gen de A. tumefaciens, los nucleótidos 1768-976 codifican el gen NPTII (que confiere resistencia a la kanamicina), y los nucleótidos 2073-1803 representan el promotor NOS. Los nucleótidos 2635-3768 representan el promotor superMAS, los nucleótidos 3774-5595 codifican el Componente secretor humano, y los nucleótidos 5603-5857. Los nucleótidos 5880-6991 representan el promotor superMAS, los nucleótidos 7007-7490 codifican la cadena de unión humana, y los nucleótidos 7504-7757 representan señal de poliadenilación NOS. Los nucleótidos 7886-8057 representan la frontera del T-ADN derecho.

El plásmido pGPTV-HPT, que codifica la enzima que confiere resistencia a la hidromicina, está comercialmente disponible del Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung (Alemania). Fue descrito por Becker en Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 (1992).

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B. Transformación de plantas y expresión de inmunoadhesina en plantas

Los casetes de expresión anteriormente descritos se usaron para producir la inmunoadhesina ensamblada en plantas. Los plásmidos pSSPICAMHuA2, pSHuJ, pSHuSC y pBMSP-1 se bombardearon simultáneamente en tejido de hojas de tabaco (N. tabacum cultivar Xanthi) y los microcallos trasformados se seleccionaron en agar nutriente en presencia de kanamicina. Los microcallos individuales, indicativos de eventos de transformación independiente, se resecaron del tejido pariente y se propagaron en agar nutriente con kanamicina.

Los tejidos del callo se seleccionaron para la expresión transgénica. Se demostró que el callo nº 7132 expresaba una inmunoadhesina quimérica ICAM-1 y la cadena J mediante inmunotransferencia y PCR (no se muestran los datos). Este callo no tiene un ADN que codifica el SC. El callo creció bien en el cultivo y, tras acumulación de suficiente masa, el nº132 fue bombardeado de nuevo, esta vez con dos de los plásmidos anteriormente descritos, PBMSP-1 SpJSC, que contiene un casete de expresión tanto para la cadena J como para SC y pGPTV-HPT, que contiene un casete de expresión para el gen hptI que confiere resistencia a la higromicina. Tras un periodo de selección y crecimiento en agar nutriente, se identificaron varios transformantes individuales, mediante inmunotransferencia, que expresaban la molécula quimérica de ICAM-1, la cadena J y SC en varias etapas de ensamblado.

La figura 3 ilustra la expresión de la molécula quimérica de ICAM-1 en callos de tabaco independientemente transformados. La figura 3A muestra inmunotransferencias de geles SDS-poliacrilamida no reductores en los que las muestras que contienen diferentes callos de tabaco transformados (C) y extractos acuosos (Aq) se han avanzado y sondeado para la presencia de humano:ICAM. La solubilidad de la inmunoadhesina asegura que se puede llevar a cabo la extracción con facilidad, y la similitud de señales llevó a los inventores a creer en la reproducibilidad de la expresión. La figura 3B muestra inmunotransferencias de geles SDS-poliacrilamida no reductores que contienen varias fracciones de inmunoadhesina parcialmente purificada procedente del callo Rhi107-11. Las manchas se sondearon con anticuerpos contra la ICAM humana (\simICAM, cadena pesada de la IgA humano (\sim\alpha), componente secretor humano (\simSC) y cadena J humana (\simJ). En segundo lugar, se emplearon según necesidad anticuerpos conjugados con enzimas para etiquetar bandas inmunopositivas con fosfatasa alcalina. La especificidad de la inmunotransferencia se verificó adicionalmente por un fallo en la detección de las bandas inmunopositivas en extractos de callos sin expresión (no mostrado). El PM esperado para una molécula quimérica de ICAM-1 dimerizada, sin glicosilación, es 173.318; ésta forma está aparentemente presente en la banda que migra justo por debajo del marcador de 250 kD ya que es inmunopositiva para ICAM-1 y la cadena pesada. Esta banda es también inmunopositiva para SC (PM total esperado de \sim248 kD) pero no para la cadena J lo que resulta algo inesperado dada la ruta canónica para el ensamblaje de SIgA, que implica 2 tipos celulares (en mamíferos) y requiere la presencia de la cadena J antes del ensamblaje de SC. Una inmunoadhesina tetramérica, que contiene una única molécula de cadena J y una única molécula de SC, tiene un PM esperado de \sim440 kD, antes de la glicosilación. Son fácilmente evidentes varias especies con pesos moleculares bastantes superiores a 200 kD, inmunopositivas para las cuatro sondas.

Se usó el bombardeo con microproyectiles revestidos de ADN para producir transformantes estables tanto en plantas como en animales (revisado por Sanford y col., Meth. Enz. 217:483-509,1993). La transformación mediada por partículas con los vectores que codifican la inmunoadhesina de la presente invención se llevó a cabo usando el dispositivo de aceleración de partículas PDS-1000/He, fabricado por Bio-Rad. El sistema de aceleración de partículas PDS-1000/He usa helio presurizado para acelerar micropartículas revestidas de ADN hacia células diana. La naturaleza física de la técnica la vuelve extremadamente versátil y fácil de usar. Los autores tuvieron éxito en la trasformación de tabaco con los cuatro componentes de una IgA secretora simultáneamente.

El procedimiento biolístico se realizó como sigue: una suspensión de depósito de microproyectiles se preparó mezclando 60 mg de partículas en 1 ml de etanol absoluto. Esta suspensión se sometió a vortización y se extrajeron 25-50 \mul y se añadieron a un tubo estéril de microcentrífuga. Tras microcentrifugar durante 30 segundos, se eliminó el etanol y el residuo se volvió a suspender en 1 ml de agua estéril y se centrifugó durante 5 minutos. A continuación se eliminó el agua, y el residuo se volvió a suspender en 25-50 \mul de disolución de ADN que contiene una mezcla de ADN de plásmidos, normalmente pero no siempre, en cantidades equimolares. La cantidad de plásmido añadido varía entre 0,5 ng y 1 \mug por preparación. Lo siguiente se añadió de forma secuencial: 220 \mul de agua estéril, 250 \mul de CaCl2 2,5M, y 50 \mul de espermidina 0,1M. Esta mezcla se sometió a vortización durante al menos 10 min y a continuación se centrifugó durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y el ADN/microproyectil se precipitó en 600 \mul de etanol absoluto, se mezcló y se centrifugó durante 1min. El etanol se eliminó y el residuo se resuspendió en 36 \mul de etanol. Diez \mul de la suspensión se aplicaron tan pronto como fue posible al centro de una hoja macroportadora hecha de Kapton (DuPont) y el etanol se evaporó. Se colocaron en la unidad la hoja macroportadora y un disco de ruptura. Se colocó una placa petri con hojas de tabaco con la superficie esterilizada por debajo de la pantalla de detención. La cámara se despresurizó hasta 28-29 mm de Hg (3.74-3,85 kPa) y el objetivo se bombardeó una vez. El protocolo se ha optimizado para el tabaco, pero está optimizado también para otras plantas variando parámetros como la presión de He, cantidad de partículas revestidas, distancia entre la macroportadora y la pantalla de detención y distancia de vuelo entre la pantalla de detención y el tejido.

Los casetes de expresión para las moléculas quiméricas ICAM-1 se ensamblaron también en vectores binarios para uso en transformación mediada por Agrobacterium. Un vector binario de Agrobacterium diseñado para expresión tanto de la cadena J humana como del componente secretor humano, así como la resistencia a la kanamicina, se introdujo en la cepa de A. tumefaciens LBA4404. La molécula quimérica ICAM/IgA de otro vector binario se usó también para trasformar LBA4404. Los cultivos durante la noche de ambas cepas se usaron para un "cultivo simultáneo" con piezas de hojas de tabaco, según un protocolo normalizado (Horsch y col., Science 227:1229-1231, 1985).

Se usó un protocolo normalizado para la regeneración de discos de hojas de tabaco tanto bombardeadas como trasformadas mediante Agrobacterium (Horsch y col., Science 227:1229-1231,1985). Puesto que las plantas transformadas, regeneradas a partir de tejido bombardeado, experimentan frecuentemente el silenciamiento de genes tras la maduración, se prepararon plantas transgénicas de tabaco mediante transformación mediada por Agrobacterium, lo que da lugar a un mayor rendimiento de plantas maduras con expresión.

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3. Purificación de inmunoadhesina ensamblada

Se purificó la inmunoadhesina expresada según el ejemplo 3. Se hicieron crecer callos en grandes cantidades para facilitar el desarrollo de los procedimientos de extracción. Un programa de purificación parcial proporcionó un concentrado estable, disponible en una variedad de condiciones de tamponamiento, para la investigación de las posteriores técnicas cromatográficas para purificación adicional de la inmunoadhesina (véase la figura 3). Los callos se extrajeron en una exprimidora, que aplasta tejido entre dos engranajes de acero, introducidos en un tampón que contiene citrato de sodio (0,6 M, pH 7,4) y urea (concentración final de 2 M). El jugo (\sim1 ml/g de peso fresco) se precipitó, tras filtración grosera a través de estopilla, con 0,67 volúmenes de sulfato de amonio saturado. Se recogió un residuo color verde tras centrifugación y se extrajo completamente, en un pequeño volumen de citrato de sodio (pH 6,6), con un homogeneizador Dounce. Tras centrifugación adicional, se recogió un sobrenadante transparente marrón y se purificó parcialmente, durante el intercambio de tampones en modo de desalado, por paso a través de una columna Sephadex G-100. La etapa de desalado/intercambio de tampón permitió la preparación de un concentrado parcialmente purificado (\sim0,2 ml/g peso fresco de callo) en un tampón deseable; la columna G-100 se eluyó con 0,25 X disolución salina tamponada con fosfato. Este eluato pareció ser estable durante al menos 10 días a 2-8ºC.

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4. La inmunoadhesina inhibe la infectividad del rinovirus humano

Se demostró que la infectividad de las células por el rinovirus humano era inhibida por la inmunoadhesina preparada según el Ejemplo 3. El extracto de callo preparado según el Ejemplo 3 compitió con éxito por el enlace de un anticuerpo monoclonal anti-ICAM respecto de ICAM-1 soluble. La figura 4 muestra los datos de un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Para el ensayo, se revistieron placas de 96 pocillos con 0,25 \mug de ICAM-1 soluble/ml. Los cuadrados representan la concentración creciente de sICAM y los círculos representan las cantidades crecientes de extracto de callo (fracción esterilizada por filtración procedente de G-100) usado para competir con la ICAM adherida por una cantidad constante de un anticuerpo de ratón (ICAM anti-humano). Tras lavar los pocillos, se detectó el anticuerpo de ratón adherente con un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante. La actividad de la enzima adherida se midió a 490 nm, con ortofenilendiamina como sustrato. Los datos (cuadrados, sICAM; círculos, extracto) están bien descritos mediante sigmoideas de la forma DO490 = y =y_{0} + a/[1+e^-{(x-x_{0})/b}], en laque a = y max, y_{0} = y min, b = la pendiente de la porción que cambia rápidamente de la curva y x_{0} = el valor de x en el nivel del 50% de respuesta. Respecto de la ICAM-1 soluble, el extracto de inmunoadhesina aquí ensayado contiene el equivalente de \sim250 \mug ICAM/ml; se trata de una sobreestimación debida a los efectos esperados de la avidez de los ensamblados diméricos y tetraméricos de las fusiones ICAM-1-cadena-pesada. Así, este ELISA demostró que la inmunoadhesina compite con la ICAM-1 soluble por el enlace con un mAb anti-ICAM.

El ELISA competitivo permite la evaluación cuantitativa de la recuperación de la actividad comparando las cantidades normalizadas de diferentes fracciones necesarias para dar un 50% de respuesta. Tras la purificación, el título de una preparación de inmunoadhesina se puede expresar en forma de inverso de la dilución, o el número de mililitros en los que se debe diluir un miligramo de inmunoadhesina para dar una respuesta del 50%. Este ELISA facilitará el desarrollo de un procedimiento de purificación para la inmunoadhesina.

Un ensayo de efecto citopático (CPE) demostró la capacidad específica de la inmunoadhesina parcialmente purificada para inhibir la infectividad de las células humanas por el rinovirus humano (figura 5). Se preincubó el rinovirus serotipo RVH-39 con ICAM-1 humana, una fusión ICAM/IgA (regalo del Dr. Tim Springer), o con extractos procedentes de los callos que expresaban tanto la inmunoadhesina ICAM-1/SIgA de los inventores u otro anticuerpo diferente antes de plaquear cada una de las mezclas con células HeLa S3 a 33ºC. Tras 3 días, las células viables se fijaron y tiñeron con una disolución metanólica de violeta de cristal; la densidad óptica a 570 nm proporcionó una medida proporcional de la viabilidad celular.

Dos extractos derivados de Rhi107-11, que contienen la inmunoadhesina, inhibieron claramente la capacidad del virus para infectar y matar células HeLa S3 (figura 5A, triángulos lado superior e inferior derecho). Puesto que el extracto estaba purificado solo en parte, los autores ensayaron también un extracto preparado de manera similar que contenía IgA2m(2) humana dirigida contra Doxorubicina, un agente quimioterapéutico. Dicho extracto, que contiene una inmunoglobulina similar con una especificidad de enlace no relacionada, fue incapaz de inhibir la infectividad del rinovirus y demuestra que la expresión de la fusión ICAM-1-cadena pesada confiere especificidad a la inhibición. El ensayo CPE demostró, como se esperaba, la capacidad diferencial de la ICAM-1 soluble y un (ICl-5/IgA; Martin, y col., 1993) para inhibir la infectividad vírica (figura 5B). El inserto de la figura 5B es la ampliación de escala en el intervalo de la CI50 para ICAM-1 soluble (1,35 \mug/ml) y para la ICI-5/IgA (0,12 \mug/ml; 11,3 veces menos).

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5. Producción y purificación de inmunoadhesinas para los estudios clínicos y toxicológicos

La producción de inmunoadhesina suficiente para las necesidades clínicas y toxicológicas se llevó a cabo preparando plantas transgénicas de tabaco. Las plantas transgénicas que expresan la inmunoadhesina (sin una señal de retención ER) se generaron mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se anticipó la ausencia de una señal de retención ER para potenciar el ensamblaje debido a que se procesó SigA nascente a través del aparato de Golgi completo, incluyendo, en particular, el trans-Golgi en el que SC se unió covalentemente a digA como se sugirió mediante los experimentos de pulso y caza (Chintalacharuvu y Morrison, Immunotechnology 4: 165-174, 1999). Debido a que es mucho más probable que la transformación mediada por Agrobacterium genere plantas con niveles consistentes de expresión transgénica, es probable que la progenie de estas plantas se use para la producción de inmunoadhesina de calidad clínica.

Con el fin de maximizar los niveles de expresión, y crear una línea de reproducción verdadera, es deseable crear plantas homocigóticas. Las plantas de mayor producción (generación T_{0}) pueden autofertilizarse en el invernadero antes de que se recoja la siembra. Se esperaba que un cuarto de las plantas T1 fueran homocigóticas. Se hicieron crecer éstas en el invernadero y muestras de semillas de diversas plantas se germinaron por separado en medio que contenía kanamicina. Se esperaba que toda la progenie (T_{2}) de las plantas positivas homocigóticas fuera verde. Se esperaba que algo de la progenie de las plantas heterocigóticas fuera blanca o amarillenta. Se confirmó la homocigosidad mediante retrocruzamiento con el tipo natural y las inmunotransferencias sobre los extractos de la progenie.

Se pueden enlazar continuamente la cosecha y el procesamiento durante una campaña de producción, debido especialmente a que se pueden obtener múltiples cosechas de una plantación única, es decir, las plantas cortadas al nivel del suelo en una cosecha vuelven a crecer para cosechas posteriores. En el desarrollo de un sentido de escala para la producción de inmunoadhesina es necesario decidir la cantidad requerida de inmunoadhesina acabada, tener en cuenta los niveles de expresión (mg de inmunoadhesina presentes/kg de peso fresco de tabaco), conocer la velocidad de crecimiento de las plantas y el peso esperado de la planta promedio, y el rendimiento global del programa de purificación (ajustado al 20%). Ajustar la necesidad global a 3 g de inmunoadhesina acabada requiere la preparación de 4 cosechas, cada una con un rendimiento esperado de 1 g de inmunoadhesina acabada.

Dados estos objetivos y parámetros, se determinó el número necesario de plantas, y por tanto las necesidades de espacio para el crecimiento de las plantas. La figura 6 muestra una evaluación de las necesidades de producción para preparar 1 gramo de inmunoadhesina acabada En este diagrama, se ilustra el número de plantas necesarias para 1 g de inmunoadhesina, a un rendimiento del 20%, a los niveles esperados de expresión y peso de la planta. A diferentes niveles de expresión de la inmunoadhesina (mg/kg de peso fresco) y de recuperación global (ajustado al 20%), se puede determinar el peso de cada planta, y de esta manera el número total de plantas para una producción objetivo especificada (1 g/cosecha) dentro de una ventana (cuadrado punteado) de posibilidades razonables. El número de plantas requeridas disminuye, inversamente, con el número de periodos de crecimiento y recrecimiento especificados. La producción de biomasa esperada, función de las condiciones de tiempo y de crecimiento, tiene influencia sobre el momento de cosechar y la separación temporal entre las cosechas. Estos periodos de crecimiento se pueden ajustar a la realidad del programa de purificación planificando las fechas de plantación y cosechado. A partir de la experiencia de los inventores, la producción requiere x número de plantas. Por ejemplo, 1 g de inmunoadhesina acabada procedente de plantas con un nivel de expresión razonable, de 100 mg de inmunoadhesina/kg de peso fresco, requiere 250 plantas cuando se cosecha a un peso de 200 g/planta (\sim 80 días después de la germinación). A esta escala, estas plantas requieren aproximadamente 10 m^{2} de espacio para crecer y se cosechan dos veces durante 150 días.

El procesamiento de + de 50 kg de biomasa a la vez requiere diversas operaciones moderadamente a gran escala que tienen todas sus contrapartes en la industria de procesamiento de alimentos. Estas incluyen la manipulación de materiales voluminosos, reducción del tamaño, la extracción del jugo y la filtración. Se usaron un sistema Vincent Press y una filtración Durco para procesar de manera eficaz estas cantidades. La etapa de extracción del jugo emplea un tampón demostrado y sencillo de citrato de sodio y urea. Estos componentes del tampón del extracto, ayudan a evitar la oxidación de los compuestos fenólicos y su asociación con las proteínas (Gegenheimer, Methods in Enzymology 182: 174-193, 1990; Loomis, Methods in Enzymology, 31: 528-544, 1974; Van Sumere, y col., The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins, 1975.) y aseguran la solubilidad de la inmunoadhesina durante una precipitación ácida posterior.

La filtración de los lípidos insolubles en ácido y de las proteínas (\sim 90% del total) va seguido por la ultrafiltración en flujo tangencial para concentrar la inmunoadhesina y eliminar las proteínas pequeñas, especialmente las fenólicas. La diafiltración potencia la eliminación de las moléculas pequeñas e intercambia el tampón en preparación del almacenamiento a corto plazo y la cromatografía posterior. Tanto la Sefarosa-SP (unión a pH 5,0 o por debajo) como la Sefarosa-Q (unión a pH 5,5 o por encima) están entre los intercambios iónicos que se pueden usar para filtrar la inmunoadhesina. Están fácilmente disponibles, son escalables, robustas y tienen capacidades elevadas. En particular, están disponibles para formatos de lecho fluidizado, que reducen la restricción de las etapas de filtración anteriores. Se usó en primer lugar la cromatografía de intercambio catiónico, que puede ser más selectiva que la cromatografía de intercambio aniónico. Se purificó la inmunoadhesina a partir de diversas especies de proteínas potencialmente presentes, hasta el punto en el que al menos un 95% de la proteína está en forma de ICAM-1/IgA, ICAM-1/dIgA o ICAM-1/SIgA, ya que la presencia de regiones ICAM-1 di y tetravalentes es crítica para una potente actividad antivírica. A continuación se ensayó la inmunoadhesina purificada para los niveles aceptables de endotoxina, alcaloides tales como la nicotina y para la carga ambiental. Además, se vigilaron los niveles de potencia (definidos mediante ensayos ELISA y CPE), la concentración de proteínas, el pH y la apariencia. Posteriormente, se determinó la estabilidad de los lotes clínicos de inmunoadhesina, para asegurar que los pacientes reciben la inmunoadhesina completamente potente. Incluso se han encontrado extractos parcialmente purificados que son estables durante 10 días cuando se refrigeran. Se ensayó también el título y la potencia de la inmunoadhesina clínicamente formulada (en disolución salina tamponada con fosfato), cuando se almacenó a 20ºC, 2-8ºC, durante un periodo de 3 a 6 meses.

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6. Las inmunoadhesinas tienen glicosilación específica de plantas

Se analizaron las inmunoadhesinas producidas para determinar el modelo de glicosilación presente. Cabanes-Macheteau y col., Glycobiology 9 (4): 365-372 (1999), demostraron la presencia de diversos restos de glicosilo, típicos de las plantas, en un constructo de anticuerpo expresado por la planta. Se usaron sus procedimientos para demostrar que las inmunoadhesinas producidas según el Ejemplo 1, 2 y 3 tienen un modelo de glicosilación específico de plantas. Los inventores anticiparon que esta diversidad será también una fuente de variabilidad de la inmunoadhesina. Debido a que se ha demostrado que los extractos brutos tienen actividad antivírica in vitro (no se muestran los datos), la glicosilación, como tal, no parece afectar a la potencia. La glicosilación unida a N (la figura 2 muestra que existen quince emplazamientos potenciales sólo de la molécula quimérica de ICAM-1) contribuye probablemente a la diversidad de bandas que se observan en las inmunotransferencias. Se digirieron las preparaciones de inmunoadhesina con N-Glicosidasa A, antes de la transferencia, mostrando que la diferencia en los modelos de bandas colapsa en una pocas bandas discretas. De esta manera, se caracterizaron inicialmente las glicoformas con geles de poliacrilamida reductores y no reductores. Además, se ensayaron las fracciones digeridas y digeridas en simulación en el ensayo CPE y el ELISA de competición, demostrándose el efecto de la glicosilación unida a N sobre la potencia y el valor in vitro.

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7. La inmunoadhesina inactiva el rinovirus humano

Se ensayó la inmunoadhesina preparada según los Ejemplos 1,2 y 3 para su capacidad y para inactivar el RVH uniéndose al virus, bloqueando la entrada del virus, e induciendo la formación de cápsidas de virus vacías. Para medir la unión de la inmunoadhesina con el VRH, se incubó la inmunoadhesina con RVH-39 marcado con [^{3}H]leucina durante 30 min y a continuación se añadió a células HeLa durante 1 h. Tras el lavado, se separaron las células y los virus unidos con Triton X-100 y se midió el [^{3}H] en un contador de centelleo.

Se comparó la inactivación de RVH-39 mediante incubación con la inmunoadhesina con la inactivación de RVH mediante sICAM-1. VRH-39 no se inactivó directamente en una extensión significativa (< 0,5 log_{10} de reducción en la infectividad) mediante la incubación con sICAM-1 monomérico, mientras que la incubación con IC1-5D/IgA redujo la infectividad aproximadamente 1,0 log_{10} (Arruda, y col., Antimicrob. Agents Chemother. 36: 1186-1191, 1992; Crump, y col., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1425-7, 1994). Con el fin de ensayar la capacidad de la inmuadhesina para inactivar el VRH-39, se incubaron dosis infectivas de 10^{6} de cultivos de tejido al 50% (DICT_{50}) de VRH-39 en medio que contenía una concentración de sICAM-1 o inmunoadhesina igual a diez veces la CI_{50} de cada molécula para este virus, o en medio base, durante 1 a 33ºC en una plataforma de vaivén. A continuación, cada mezcla de virus-inmunoadhesina o virus-medio se diluyeron en serie con diluciones de diez veces, y se determinó el valor en las células HeLa en placas de 96 pocillos.

Se ensayó el efecto de la inmunoadhesina sobre la unión del RVH a las células huéspedes inoculando células Hela con RVH-39 a una MOI de 0,3 en presencia o ausencia de la inmunoadhesina. La absorbancia se desarrolló durante una hora a 4ºC, se lavaron las células, y los medios se sustituyeron más o menos la inmunoadhesina. Se incubaron las células durante diez horas a 33ºC (para permitir un ciclo de replicación), y el virus se cosechó mediante congelación/descongelación de las células. Se valoró el virus en células HeLa.

ICAM-IgA (IC1-5D/IgA) es más eficaz que sICAM-1 induciendo cambios de conformación en VRH, conduciendo a la formación de partículas víricas vacías, no infecciosas (Martin, y col. J. Virol. 67: 3561-8, 1993). Para examinar la capacidad de la inmunoadhesina producida según los Ejemplos 1, 2 y 3 para inducir los cambios de conformación en el RVH, que producen la liberación del ARN vírico, se incubo la inmunoadhesina purificada con RVH-39 marcado con [^{3}H]leucina durante 30 min y a continuación se recubrió el virus en un gradiente de sacarosa del 5 al 30%. Tras la centrifugación durante 90 min a 40.000 rpm, se recogieron las fracciones, se midió el [^{3}H], y se evaluaron las fracciones para la infectividad. (Sedimentos de VRH intactos a 149S en un gradiente de sacarosa mientras que las cápsidas vacías carecían de sedimentos de ARN a 75S (Martin, y col. J. Virol. 67: 3561-8, 1993)). Debido a su aumento de valencia, los inventores esperan que la inmunoadhesina ICAM/SigA sea más eficaz en inducir partículas vacías no infecciosas que ICAM-IgA.

Se examinará el efecto inhibidor de la inmunoadhesina purificada en un panel de serotipos RVH tanto principales como secundarios (que no usan ICAM-1 como receptor) usando el ensayo CPE. La capacidad de ICAM-1 de inhibir la infección por RVH varía entre los aislados víricos. Se ha demostrado (Crump, y col., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1425-7, 1994) que la CE_{50} de sICAM-1 varió desde 0,6 \mug/ml a > 32 \mug/ml cuando se ensayó en un panel de ensayo de los serotipos principales del receptor de RVH usando células HeLa. El panel de los inventores incluye nueve serotipos principales (RVH-3, 13, 14, 16, 23, 39, 68, 73, y 80) y el serotipo RVH-1A del receptor secundario.

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8. Estudios clínicos demuestran la capacidad de la inmunoadhesina para reducir la infectividad en seres humanos; estudio de tolerancia con escalado de la dosis

Se ensayó la inmunoadhesina de la presente invención en dos ensayos controlados aleatorizados para determinar el efecto sobre la infección de la administración intranasal de la inmunoadhesina, la respuesta de IL-8, y la enfermedad en resfriados experimentales por rinovirus. Estos dos estudios evalúan la inmunoadhesina tomada por sujetos antes o después de la inoculación del rinovirus. Los protocolos clínicos usados aquí están basados en los protocolos anteriormente usados para la evaluación de una molécula de ICAM-1 soluble recombinante respecto de la eficacia contra la infección por rinovirus (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804, 1999).

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A. Sujetos

Se reclutaron los sujetos de comunidades universitarias en la Universidad de Virginia, Charlottesville. Se requirió que los sujetos tuvieran buena salud, no ser fumadores, y de edades comprendidas entre los 18 y los 60 años. Se excluyeron sujetos si tenían un historial de enfermedad alérgica o rinitis no alérgica, anatomía o mucosa nasal anormal, o infección del tracto respiratorio en las dos semanas anteriores. Se excluyeron también las mujeres embarazadas o lactantes o las mujeres que no estaban en tratamiento médico para el control de la natalidad. En el estudio experimental de estímulo del virus (Fase I/II, véase a continuación), se requirió que los sujetos fueran susceptibles al virus de estudio según se evidenció mediante un título de anticuerpo neutralizante en suero de 1:4 o menos para el virus, determinado en el periodo comprendido dentro de los 90 días del inicio del ensayo.

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B. Medicación del estudio

Se formuló la inmunoadhesina de la presente invención en forma de una disolución para pulverización de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 2,6 mg/ml. El placebo estaba constituido por PBS y es idéntico en apariencia a la preparación activa. Se administraron las disoluciones usando una botella de medicamento equipada con una bomba para pulverización nasal medida. La bomba dosifica 70 \mul de disolución que contiene 183 \mug de la inmunoadhesina con cada pulverización. Se administró el medicamento en forma de dos pulverizaciones por orificio nasal, seis veces al día (a intervalos de 3 horas) para una dosis diaria total de 4,4 mg. Esta es la misma dosis, en mg de proteína/día que la usada para la ICAM-1 soluble en la infección de estudio con tremacamra (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804, 1999). Un mol de la inmunoadhesina tiene aproximadamente dos veces la masa que un mol de sICAM-1. Sin embargo, dadas las diferencias en la actividad in vitro entre las fusiones de sICAM-1 e ICAM/IgA, la inmunoadhesina es muchas veces más efectiva en una base molar que sICAM-1. De esta manera, esta cantidad es un cálculo conservativo de lo que es necesario. Se usó esta cantidad, excepto en el caso en el que el estudio de escalado de la dosis desveló problemas a esta dosis.

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C. Diseño del estudio

Se usaron estudios de dosis crecientes únicas y dosis crecientes múltiples para evaluar la seguridad de la inmunoadhesina. En cada caso, se evaluaron tres sujetos para cada nivel de dosificación, recibiendo dos la inmunoadhesina y recibiendo uno el placebo. En el estudio de dosis creciente única, se evaluaron cuatro niveles de dosificación. La dosis individual más baja es la mitad de la dosis anticipada que se va a usar en el estudio del estímulo, y la dosis individual más alta es dos veces la dosis anticipada de estudio del estímulo. Los niveles de dosificación son como sigue: una pulverización en cada orificio de la nariz (un total de 366 \mug), dos pulverizaciones en cada orificio de la nariz (un total de 732 \mug), tres pulverizaciones en cada orificio de la nariz (un total de 1098 \mug), cuatro pulverizaciones en cada orificio de la nariz (un total de 1464 \mug).

Se usaron los mismos niveles de dosificación en el estudio de dosis crecientes múltiples. Los sujetos reciben dosis cada tres horas (seis veces por día) durante cinco días. En ambos estudios se evaluaron los sujetos a cada nivel de dosificación, programando el inicio de cada nivel posterior hasta que es claro que no existe toxicidad aguda en el nivel anterior. Todos los sujetos vienen de una dosis única 21 días después de la primera dosis, y a continuación durante una vigilancia a las seis semanas (para la determinación de anticuerpos en suero contra la inmunoadhesina).

Se proporcionó a un grupo separado de doce sujetos una dosis de dos pulverizaciones en cada orificio de la nariz (un total de 732 \mug), y se llevó a cabo un lavado nasal a las 1, 2, 4, 8 y 16 horas (dos sujetos en cada punto temporal). Se evaluaron los lavados en Panorama Research mediante ELISA para la inmunoadhesina con el fin de calcular su semivida in vivo. La cantidad total de la inmunoadhesina que se va a usar en los estudios de escalado de la dosis y la determinación de la semivida (en un total de 28 sujetos) será aproximadamente de 270 mg.

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D. Evaluaciones de seguridad

Además del episodio adverso rutinario registrado, se evaluó la seguridad de la inmunoadhesina de tres maneras. En primer lugar, antes de la primera dosis y después de la última dosis, los investigadores llevaron a cabo un examen visual de la mucosa nasal, observando en particular signos de irritación o inflamación. Se señaló cualquier cambio visible. En segundo lugar, se llevaron a cabo evaluaciones normalizadas de seguridad en sangre en muestras recogidas antes del tratamiento y después de la última dosis en los días del estudio 1, 4, y 8 (y 21 en el estudio de dosis crecientes múltiples). En tercer lugar, se guardaron muestras de suero, se congelaron, y se usaron para determinar si la inmunoadhesina es capaz de pasar a través de la mucosa nasal hasta la sangre. Esto se llevó a cabo de dos maneras. En primer lugar, se midió mediante ELISA la presencia de inmunoadhesina en muestras de suero. En este ensayo, se adsorbieron anticuerpos IgA anti-humanos para capturar en placas de microvaloración cualquier inmunoadhesina en el suero, que se detectó mediante un anticuerpo anti-ICAM. Se determinó la sensibilidad del ensayo usando muestras normales de suero humano repicadas con concentraciones conocidas de la inmunoadhesina. Alternativamente, se pueden adsorber anticuerpos anti-ICAM en las placas para capturar la inmunoadhesina en el suero, que podría detectarse mediante anti-IgA. En segundo lugar, se evaluó la presencia de una respuesta inmune a la inmunoadhesina con un procedimiento ELISA que usa la inmunoadhesina adsorbida en placas de microvaloración. A cualquier anticuerpo anti-inmunoadhesina en suero se une, y se detectan con la IgG anti-humana o la IgM anti-humana. Se compararon el pretratamiento y el postratamiento de las muestras de suero, y se consideró cualquier cambio en el título como evidencia de la captación de la inmunoadhesina. Si existe cualquier evidencia positiva de anticuerpos anti-inmunoadhesina, se llevarán a cabo ensayos adicionales para distinguir la actividad entre anti-ICAM-1 y anti-IgA.

Se rastrearon los pacientes para el desarrollo de una reacción alérgica a la inmunoadhesina. (En estudios anteriores, no hubo episodios de reacciones adversas con ICAM soluble aplicada tópicamente en la nariz o planticuerpos aplicados tópicamente en la cavidad oral). Se ensayaron los síntomas de alergia nasal que presentaban los individuos para los anticuerpos IgE específicos de anti-inmunoadhesina en los fluidos de los lavados nasales usando un ELISA sensible en dos etapas (R & D Systems).

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E. Análisis estadístico

El tamaño de la muestra para estos estudios se basó en estudios anteriores usando el modelo de estímulo del rinovirus. El tamaño de la muestra planificado para los estudios de protección debería ser adecuado para detectar una reducción en la incidencia clínica de resfriados del 75% en grupos de placebo y del 25% en grupos de tratamiento activo a niveles unilaterales de \alpha = 0,5 y 1-\beta = 0,80. Además, el tamaño de la muestra debería ser adecuado para detectar un cambio en la puntuación total de síntomas de 5 unidades suponiendo una DE de 5,8 unidades.

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9. Estudios clínicos que demuestran la capacidad de la inmunoadhesina para reducir la infectividad en seres humanos: Estudios de estímulo

Se usaron los estudios de estímulo para demostrar que el tratamiento con la inmunoadhesina de la presente invención protege contra los resfriados clínicos o reduce los síntomas del resfriado tras el estímulo vírico.

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A. Virus de estímulo

El virus de estímulo usado para este estudio es el rinovirus 39 (RVH-39). El rinovirus de tipo 39 es un grupo principal de rinovirus que requiere ICAM-1 para la unión a las células. Se ensayó la seguridad del combinado vírico de estudio según las directrices de consenso (Gwaltney, y col., Prog. Med. Virol. 39: 256-263, 1992). Se inocularon todos los sujetos con aproximadamente 200 dosis infectivas promedio de cultivo de tejido (DICT_{50}). Se administró el virus en forma de gotas en dos inóculos de 250 \mul por orificio de nariz proporcionados aproximadamente con 15 minutos de separación mientras los sujetos están en posición supina.

TABLA 1

9

B. Diseño del estudio

Se llevaron a cabo dos estudios aleatorizados de estímulo con rinovirus (véase la Tabla 1). Se evaluó la misma formulación de la inmunoadhesina de la presente invención en los estudios de preinoculación y postinoculación. En ambos casos, se administró el medicamento en forma de seis dosis cada día durante cinco días. Se asignaron los sujetos aleatoriamente en el momento del alistamiento en cada estudio para recibir tanto la inmunoadhesina como el placebo correspondiente. El estudio es ciego y todo el personal del ensayo clínico, los sujetos, y los empleados de Panorama Research permanecieron ciegos hasta que se recogieron los datos.

En el estudio de preinoculación, se iniciaron las medicaciones cuatro horas (dos dosis) antes del estímulo vírico. Se administró el estímulo vírico una hora después de la segunda dosis de la inmunoadhesina (o el placebo) y las cuatro dosis restantes del medicamento de estudio durante el primer día se proporcionaron según se había programado. En este estudio dieciocho sujetos recibieron el tratamiento activo y dieciocho sujetos recibieron el placebo.

En el estudio de postinoculación, las medicaciones comenzaron 24 horas antes del estímulo vírico. Se escogió este punto temporal debido a que se había usado en otros estudios de protección del estímulo del virus, y debido a que los síntomas de resfriado están claramente presentes (Harris y Gwaltney, Clin. Infect. Dis. 23: 1287-90, 1996). El estímulo vírico en este estudio se administró en la mañana del día 0 del estudio aproximadamente 24 horas antes de la primera dosis de la medicación de estudio en la mañana del día 1 del estudio. En este estudio, 36 sujetos recibieron el tratamiento activo y 18 sujetos recibieron el placebo.

Se aislaron los sujetos en habitaciones individuales de hotel desde el día 0 del estudio (el día del estímulo vírico) hasta el día 6 del estudio. En cada uno de estos días se llevó a cabo una puntuación de los síntomas y un lavado nasal para el aislamiento del virus en la mañana anterior a la primera dosis de la medicación y se llevó a cabo una segunda puntuación de los síntomas cada tarde. En el día 6 del estudio, se liberó a los sujetos del aislamiento pero se continuó registrando la puntuación de los síntomas cada tarde hasta el día 14. Los sujetos volvieron al lugar del estudio en el día 21 del estudio, en el que se recogerá una muestra final de suero de anticuerpos anti-inmunoadhesina. La cantidad total de inmunoadhesina que se va a usar en los dos estudios de estímulo del virus (en un total de 54 sujetos) es aproximadamente de 1200 mg.

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C. Aislamiento vírico

Se detectó la diseminación vírica mediante el aislamiento del virus en cultivos celulares. Se recogieron especímenes de lavado nasal mediante la instilación de 5 ml de disolución salina al 0,9% en cada agujero de la nariz. A continuación se expelió este lavado en una copa de plástico y se mantuvo frío durante de una a dos horas hasta que se procesó para los cultivos víricos. Se eliminó la inmunoadhesina de los especímenes mediante tratamiento con anticuerpo anti-ICAM-1 adsorbido en un soporte de agarosa (Affi-Gel 10, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se almacenó una porción de cada especímen procesado a -80ºC, y se inoculó otra porción en dos tubos de células HeLa-1, una línea de células HeLa enriquecida para la producción de ICAM-1 (Arruda, y col., J. Clin. Microb. 34: 1277-1279, 1996). Se identificaron los rinovirus mediante el desarrollo del efecto citopático típico. Los sujetos con un cultivo vírico positivo en cualquiera de los días de estudio después del estímulo se consideraron infectados. Se determinaron los títulos víricos en los especímenes almacenados a -80ºC cultivando diluciones en serie de diez veces en placas de microvaloración de células HeLa-1.

Se detectaron los anticuerpos frente al virus del estímulo por los títulos neutralizantes en suero realizado usando procedimientos normalizados (Gwaltney, y col, Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections, p. 579-614, American Public Health Association). Se recogieron los especímenes de suero para el ensayo del anticuerpo durante el rastreo. Inmediatamente antes del estímulo del virus (agudo), y de nuevo 21 días más tarde (convaleciente). Se consideraron infectados los sujetos con un aumento de al menos cuatro veces en el título de anticuerpos respecto al virus del estímulo, cuando la muestra de suero en el periodo de convalecencia se comparó con la muestra de suero en el periodo agudo.

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D. Evaluación de la gravedad de la enfermedad

Se evaluó la gravedad de la enfermedad según se ha descrito anteriormente (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804, 1999). Se registraron las puntuaciones de los síntomas antes del estímulo del virus (nivel inicial) y dos veces cada día a intervalos de aproximadamente doce horas durante los siguientes 6 días. En los días 7 a 14 del estudio cada sujeto registra su puntuación de síntomas una vez al día por la tarde. En cada evaluación, se pidió a los sujetos que juzgaran la máxima gravedad de los siguientes ocho síntomas en el intervalo desde la última evaluación de síntomas: estornudar, rinorrea, obstrucción nasal, irritación d garganta, tos, dolor de cabeza, malestar, y escalofríos. Se asignó a cada síntoma una puntuación de gravedad de 0 a 3 correspondiente a un informe de gravedad de los síntomas en ausentes, suaves, moderados, o graves. Si los síntomas están presentes en el nivel inicial, la puntuación de síntomas del nivel inicial se sustraerá de la puntuación de síntomas registrada. Se toma la mayor de las dos evaluaciones diarias como la puntación diaria de síntomas para cada síntoma. Se sumaron las puntuaciones diarias de síntomas para los ocho síntomas individuales para dar como resultado la puntuación diaria total de los síntomas. Se sumaron las puntuaciones diarias totales de los síntomas durante los primeros 5 días después del estímulo (días 1-5 del estudio) en la tarde del día 5 del estudio, todos los sujetos fueron preguntados, "¿Siente que ha tiene un resfriado?". Los sujetos que tuvieron una puntuación total de síntomas de al menos 6 y cualquiera de al menos tres días de rinorrea o la impresión subjetiva de que tuvieron un resfriado se definieron como que tenían un resfriado clínico.

Se determinó el peso de las secreciones nasales expelidas en los días 1-7 proporcionando a todos los sujetos paquetes prepesados de pañuelos nasales. Después de usar los pañuelos, se almacenaron en una bolsa de plástico hermética al aire. Cada mañana, se recogieron y se pesaron los pañuelos usados, junto con cualquier pañuelo sin usar del paquete original.

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E. Ensayo de IL-8

Recientes estudios han sugerido que la respuesta inflamatoria del huésped, particularmente la interleucina 8 (IL-8), puede jugar un papel en la patogénesis de los síntomas comunes del resfriado debido a la infección por rinovirus. Se determinaron las concentraciones de IL-8 en el lavado nasal con un ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, Minneapolis, Minn) según se describe anteriormente (Turner, y col., JAMA 281: 1797-804, 1999).

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F. Evaluaciones de seguridad

Se llevaron a cabo las mismas evaluaciones en el estudio de estímulo que en el estudio de escalado de la dosis descrito en el Ejemplo 8.

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G. Análisis estadístico

Se llevó a cabo el análisis estadístico de manera similar a la descrita para el estudio con escalado de la dosis en el Ejemplo 8.

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Referencias citadas en la descripción

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Documentos de patente citados en la descripción

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Claims

1. Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina; en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina permite a dicha cadena pesada unirse a una cadena J; y una cadena J y un componente secretor, en la que dicha cadena J y el componente secretor se asocian con dicha molécula quimérica ICAM-1; y en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior.

2. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

3. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgM, y las cadenas pesadas de la inmunoglobulina quimérica.

4. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 que comprende además al menos una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

5. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una porción de una cadena pesada de IgA_{2}.

6. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas transgénicas.

7. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas monocotiledóneas.

8. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en plantas dicotiledóneas.

9. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 en la que todas las proteínas son humanas.

10. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en cultivos con raíces en cabellera.

11. Inmunoadhesina de la reivindicación 1 expresada en células de plantas en cultivo de tejidos.

12. Inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1; una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha inmunoadhesina se produce o expresa en una planta o célula de planta y se glicosila en la anterior y en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.

13. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha inmunoadhesina comprende además una cadena J y un componente secretor asociados con dicha molécula quimérica ICAM-1.

14. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

15. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, y la cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica.

16. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 que comprende además al menos una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

17. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una porción de la cadena pesada de IgA_{2}.

18. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 en la que todas las proteínas son humanas.

19. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en células heterólogas derivadas de plantas.

20. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en cultivos con raíces en cabellera.

21. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresadas en células de plantas en cultivos de tejidos.

22. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en plantas monocotiledóneas.

23. Inmunoadhesina de la reivindicación 12 expresada en plantas dicotiledóneas.

24. Composición que comprende una inmunoadhesina y material de la planta, en la que dicha inmunoadhesina se expresa en una planta y se glicosila en la anterior y comprende una molécula quimérica ICAM-1, comprendiendo dicha molécula quimérica ICAM-1 una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.

25. Composición de la reivindicación 24 que comprende además una cadena J y un componente secretor asociados con dicha molécula ICAM-1 quimérica.

26. Composición de la reivindicación 24 en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1.

27. Composición de la reivindicación 24 en la que dicha inmunoglobulina se selecciona entre el grupo de IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, y una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica.

28. Composición de la reivindicación 24 que comprende además una molécula quimérica ICAM-1 adicional.

29. Composición de la reivindicación 24, en la que dicha proteína del receptor de rinovirus está comprendida por cualquier combinación de las regiones extracelulares 1, 2, 3, 4 y 5 de ICAM-1; y dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una cadena pesada de IgA_{2}.

30. Procedimiento in vitro para reducir la infección por rinovirus humano en células huéspedes susceptibles a la infección por rinovirus humano, comprendiendo dicho procedimiento: poner en contacto el virus con una inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12, ó 24, y en el que dicha inmunoadhesina, se une al rinovirus humano y reduce la infectividad del mismo.

31. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para reducir el inicio de la diseminación del resfriado común debido a rinovirus humano.

32. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de la infección por rinovirus humano en un sujeto humano.

33. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de la infección por rinovirus humano en un sujeto, en un procedimiento que comprende administrar intranasalmente a dicho sujeto una cantidad eficaz de dicha inmunoadhesina.

34. Inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12 ó 24 para el tratamiento o la prevención de una infección por rinovirus humano en un sujeto, en un procedimiento que comprende administrar a través de la cavidad oral a dicho sujeto una cantidad eficaz de dicha inmunoadhesina.

35. Composición farmacéutica que comprende una inmunoadhesina de la reivindicación 1, 12, ó 24 en un tampón farmacéuticamente aceptable.

36. Vector de expresión que comprende un gen que codifica una inmunoadhesina que comprende una molécula quimérica ICAM-1 unida operativamente a un promotor de la planta, dicha inmunoadhesina se expresa en una planta y se glicosila en la anterior y dichas moléculas quiméricas ICAM-1 comprenden una proteína del receptor de rinovirus unida a al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que dicha porción de dicha cadena pesada de inmunoglobulina confiere función efectora de anticuerpo.