ES2332960T3 - Anticuerpo monoclonal anti-heparanasa neutralizante de la actividad heparanasa. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa (endo-ß-D-glucuronidasa), siendo dicho anticuerpo anti-heparanasa monoclonal para neutralizar la actividad catalítica de la heparanasa para la fabricación de un medicamento para tratar un estado asociado con la expresión de heparanasa seleccionado de estados autoinmunitarios y trastornos inflamatorios.

Description

Anticuerpo monoclonal anti-heparanasa neutralizante de la actividad heparanasa.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a usos de y a métodos de uso de un anticuerpo anti-heparanasa y, más particularmente, a un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa tal como se caracteriza en las reivindicaciones.

Proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG): Los HSPG son macromoléculas ubicuas asociadas con la superficie celular y la matriz extracelular (MEC) de una amplia gama de células de tejidos de vertebrados e invertebrados (1-5). La estructura básica de los HSPG consiste en un núcleo proteico al que están unidas covalentemente varias cadenas de heparán sulfato lineales. Las cadenas de polisacárido están compuestas normalmente por repeticiones de unidades de disacárido de ácido hexurónico y D-glucosamina que están sustituidas en un grado variable con restos de sulfato N- y O-unidos y grupos acetilo N-unidos (1-5). Estudios sobre la participación de moléculas de la MEC en la unión, el crecimiento y la diferenciación celulares revelaron un papel central de los HSPG en la reparación de tejido, el crecimiento de neuritas, la metástasis, la angiogénesis y la morfogénesis embrionaria (1-5). Las cadenas de heparán sulfato (HS), únicas en su capacidad de unirse a multitud de proteínas, garantizan que una amplia variedad de moléculas efectoras se adhieran a la superficie celular (4-6). Los HSPG son también componentes destacados de los vasos sanguíneos (3). En vasos grandes se concentran principalmente en la íntima y la media interna, mientras que en los capilares se encuentran principalmente en la membrana basal subendotelial en la que ayudan a la proliferación y migración de células endoteliales y estabilizan la estructura de la pared del capilar. La capacidad de los HSPG para interaccionar con macromoléculas de la MEC tales como colágeno, laminina y fibronectina, y con diferentes sitios de unión en membranas plasmáticas, sugiere un papel clave para este proteoglicano en el autoensamblaje y la insolubilidad de componentes de la MEC, así como en la locomoción y adhesión celulares. Por tanto, la escisión del HS puede dar como resultado un desensamblaje de la MEC subendotelial y por tanto puede desempeñar un papel decisivo en la extravasación de células malignas y normales transportadas por la sangre (7-9). Se observa catabolismo de HS en la inflamación, la reparación de heridas, la diabetes y la metástasis del cáncer, lo que sugiere que las enzimas que degradan el HS desempeñan papeles importantes en los procesos patológicos.

Participación de la heparanasa en la metástasis e invasión de células tumorales: Las células tumorales circulantes detenidas en los lechos capilares de diferentes órganos deben invadir el revestimiento de células endoteliales y degradar su membrana basal (MB) subyacente con el fin de escapar hacia el/los tejido(s) extravascular(es) en el/los que establecen metástasis (10). Se cree que varias enzimas celulares (por ejemplo, colagenasa IV, activador del plasminógeno, catepsina B, elastasa, etc.) participan en la degradación de la MB (10). Entre estas enzimas está una endo-\beta-D-glucuronidasa (heparanasa) que escinde el HS en sitios intracatenarios específicos (7, 9, 11-12). Se encontró que la expresión de una heparanasa que degradaba HS se correlacionaba con el potencial metastásico de células de linfoma (11), fibrosarcoma y melanoma (9) de ratón. Lo mismo es cierto para células de carcinoma de mama, vejiga y próstata humanas (documento U.S. 6177545). Además, se detectaron niveles elevados de heparanasa en sueros (9) y orina (documento U.S. 6177545) de animales que llevaban tumores metastásicos y pacientes con cáncer y en biopsias tumorales (12). El tratamiento de animales experimentales con inhibidores de heparanasa, tales como sulfato de laminarina, redujo notablemente (>90%) la incidencia de metástasis de pulmón inducidas por células de melanoma B16, carcinoma de pulmón de Lewis y adenocarcinoma mamario (8, 9, 13), lo que indica que la inhibición de la actividad heparanasa mediante anticuerpos neutralizantes, cuando está disponible, puede aplicarse a la inhibición de la metástasis e invasión de células tumorales.

Posible participación de la heparanasa en la angiogénesis tumoral: Se demostró previamente que la heparanasa no sólo funciona en la invasión y migración celulares, sino que también puede provocar una respuesta neovascular indirecta (15). Estos resultados sugieren que los HSPG de la MEC proporcionan un depósito de almacenamiento natural para bFGF y posiblemente otros factores que promueven el crecimiento mediante unión a heparina. La liberación de bFGF activo mediada por heparanasa de su almacenamiento dentro de la MEC puede proporcionar por tanto un mecanismo novedoso para la inducción de neovascularización en situaciones normales y patológicas (6, 18).

Expresión de heparanasa por células del sistema inmunitario: La actividad heparanasa se correlaciona con la capacidad de células activadas del sistema inmunitario para abandonar la circulación y provocar respuestas tanto inflamatorias como autoinmunitarias. La interacción de plaquetas, granulocitos, linfocitos T y B, macrófagos y mastocitos con la MEC subendotelial está asociada con la degradación del heparán sulfato (HS) mediante la actividad heparanasa (7). La enzima se libera de compartimentos intracelulares (por ejemplo, lisosomas, gránulos específicos, etc.) en respuesta a diversas señales de activación (por ejemplo, trombina, ionóforo de calcio, complejos inmunitarios, antígenos, mitógenos, etc.), lo que sugiere su presencia y participación reguladas en sitios inflamatorios y lesiones autoinmunitarias. Es probable que las enzimas que degradan el heparán sulfato liberadas por plaquetas y macrófagos estén presentes en lesiones ateroscleróticas (16). El tratamiento de animales experimentales con inhibidores de heparanasa redujo notablemente la incidencia de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), artritis por adyuvante y rechazo de injertos (7, 17) en animales experimentales, lo que indica que el uso de anticuerpos neutralizantes para inhibir la actividad heparanasa puede inhibir enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias
(7, 17).

Uso de anticuerpos monoclonales para productos terapéuticos clínicos: Los anticuerpos monoclonales (AcM) están comenzando a obtener un papel destacado en el área terapéutica. Aproximadamente, están en desarrollo clínico 80 AcM que representan más del 30% de todas las proteínas biológicas que están sometiéndose a ensayos clínicos (20, 24). Se espera que la entrada en el mercado de nuevas terapias con AcM se acelere drásticamente. El acicate de este crecimiento ha sido la aparición de tecnologías para crear AcM cada vez más similares a los de seres humanos (humanizados), que oscilan desde quiméricos hasta completamente humanos. Estos nuevos AcM prometen superar la respuesta de anticuerpos humanos frente a anticuerpos de ratón (25).

Los anticuerpos monoclonales, que pueden considerarse como formas propias de la naturaleza de "diseño racional de fármacos", pueden ofrecer un enfoque de descubrimiento de fármacos acelerado para dianas apropiadas. Esto se debe a que producir AcM de alta afinidad que bloqueen específicamente la actividad de una diana antigénica es habitualmente más fácil y más rápido que diseñar una molécula pequeña con actividad similar (23).

Debido a su larga semivida en suero, baja toxicidad y alta especificidad, los AcM comienzan a revelar su verdadero potencial terapéutico, particularmente en oncología, en la que los regímenes terapéuticos actuales tienen efectos secundarios tóxicos que, en muchos casos, requieren dosificación repetitiva en los protocolos de tratamiento respectivos (23).

Hasta hoy sólo dos AcM terapéuticos han sido aprobados para su venta en los EE.UU., el OKT-3 de ratón para la prevención del rechazo de trasplantes de órganos y el fragmento Fab quimérico de ratón-humano, para la prevención de la isquemia cardiaca aguda tras angioplastia coronaria (25). Recientemente, Herceptin, AcM humanizado producido contra el protooncogén HER-2/neu, ha pasado pruebas clínicas de fase III en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama con enfermedad metastásica (23).

Al usar un enfoque anti-angiogénesis en la prevención de la enfermedad metastásica, Genetech introdujo un AcM humanizado recombinante frente al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Se encontró que el AcM rhu anti-VEGF era seguro y se toleraba bien en un estudio clínico de fase I piloto con 25 pacientes (23).

Por tanto, hay una necesidad ampliamente reconocida de, y sería sumamente ventajoso, tener un anticuerpo monoclonal anti-heparanasa contra la actividad heparanasa.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa para la inhibición de la actividad heparanasa y un método para preparar el mismo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo para tratar un estado asociado con la actividad heparanasa, para usar por tanto el anticuerpo como agente terapéutico.

Se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal producido por una proteína heparanasa o una parte inmunogénica de la misma, el anticuerpo monoclonal inhibe específicamente la actividad heparanasa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como principio activo de la misma un anticuerpo monoclonal producido por una proteína heparanasa, el anticuerpo monoclonal inhibe específicamente la actividad heparanasa, y un vehículo farmacéutico aceptable, tal como se caracteriza en las reivindicaciones.

Según características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, la proteína heparanasa es recombinante.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la actividad heparanasa es de heparanasa recombinante o heparanasa natural.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el anticuerpo monoclonal está humanizado.

Se describe además en el presente documento un anticuerpo, en el que al menos aproximadamente el 90% de la actividad heparanasa se suprime mediante la inhibición cuando se utiliza una razón de heparanasa con respecto a anticuerpo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1-40.

El anticuerpo monoclonal se une a una parte C'-terminal de la heparanasa.

Según todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vivo o in vitro de preparación de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa, comprendiendo el método las etapas de (a) exponer células que pueden producir anticuerpos a al menos un epítopo de una proteína heparanasa o una parte inmunogénica de la misma y generar de ese modo células que producen anticuerpos; (b) fusionar las células que producen anticuerpos con células de mieloma y generar de ese modo una pluralidad de células de hibridoma que producen cada una anticuerpos monoclonales; y (c) explorar la pluralidad de anticuerpos monoclonales para identificar un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la actividad heparanasa, en el que dicho al menos un epítopo de dicha proteína heparanasa incluye una parte C'-terminal de la proteína heparanasa.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el método comprende además la etapa de humanizar el anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa.

Según todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa, siendo el anticuerpo anti-heparanasa monoclonal para neutralizar la actividad catalítica de la heparanasa, para la fabricación de un medicamento para tratar un estado asociado con la expresión de heparanasa, tal como se caracteriza en las reivindicaciones.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el estado está asociado con una función alterada de una molécula efectora biológica asociada a HSPG.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la molécula efectora biológica asociada a HSPG se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una quimiocina, una citocina y una enzima degradante.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en HGH, FGF y VEGF.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en PF-4, IL-8, MGSA, IP-10, NAP-2, MCP-1, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-3, TNF\alpha, TNF\beta, GM-CSF e IFN\gamma.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la enzima degradante se selecciona del grupo que consiste en elastasa, lipoproteína lipasa y catepsina G.

Según características todavía adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el estado se selecciona del grupo que consiste en angiogénesis, proliferación celular, proliferación de células tumorales, invasión de células tumorales circulantes, metástasis, trastornos inflamatorios y estados autoinmunitarios.

La presente invención aborda de manera satisfactoria las deficiencias de las configuraciones conocidas actualmente proporcionando un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa, un método para su preparación, identificación y caracterización, una composición farmacéutica que incluye el mismo y el uso del mismo para tratar diversos estados médicos.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe en el presente documento, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra el mapeo de epítopos de los anticuerpos monoclonales HP-130 y HP-239 según la presente invención. Se fraccionaron los diferentes polipéptidos (tal como se indica más adelante) por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Se hizo reaccionar la membrana o bien con anticuerpo HP-130 o bien con HP-239 tal como se indicó anteriormente. Carril 1, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 414 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 130-543, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 2, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 314 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 230-543, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 3, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 176 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 368-543, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 4, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 79 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 465-543, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 5, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 229 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 1-229, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 6, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 347 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 1-347, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 7, extractos celulares que contienen un segmento de heparanasa de 465 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 1-465, SEQ ID NO: 2 del documento U.S.-A-6.177.545). Carril 8, marcadores de tamaño (Bio-Rad).

La figura 2 muestra la neutralización de heparanasa recombinante expresada en células de insecto con anticuerpos monoclonales. Actividad heparanasa tras la incubación previa de la heparanasa recombinante expresada en células de insecto, con cantidades crecientes (tal como se indica bajo cada barra) de anticuerpo HP-130 (130) y anticuerpo HP-239 (239). Se calcula el tanto por ciento de actividad a partir de la reacción control, incubada previamente en ausencia del anticuerpo.

La figura 3 muestra la neutralización de heparanasa natural purificada de placenta humana con anticuerpos monoclonales. Actividad heparanasa tras la incubación previa de heparanasa aislada de placenta humana con cantidades crecientes (tal como se indica bajo cada barra) de anticuerpo HP-130 (130) y anticuerpo HP-239 (239). Se calcula el tanto por ciento de actividad a partir de la reacción control, incubada previamente en ausencia de anticuerpo.

Descripción de las realizaciones preferidas

Se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal anti-heparanasa contra la actividad heparanasa que puede usarse para inhibir la actividad catalítica de la heparanasa. Específicamente, la presente invención puede usarse para tratar estados autoinmunitarios y trastornos inflamatorios.

Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a las descripciones acompañantes y dibujos.

Los resultados experimentales obtenidos mientras se reduce la presente invención a la práctica y que se presentan en el presente documento enseñan que los anticuerpos monoclonales anti-heparanasa pueden usarse como anticuerpos terapéuticos neutralizantes de la actividad heparanasa.

Los anticuerpos neutralizantes pueden usarse para inhibir la actividad heparanasa, que, como resultado, modulan la función de moléculas efectoras biológicas asociadas a HSPG.

Estas moléculas efectoras incluyen: factores de crecimiento, tales como, pero sin limitarse a, HGH, FGF y VEGF; quimiocinas, tales como, pero sin limitarse a, PF-4, IL-8, MGSA, IP-10, NAP-2, MCP-1, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES; citocinas, tales como, pero sin limitarse a, IL-3, TNF\alpha, TNF\beta, GM-CSF e IFN\gamma; y enzimas degradantes, tales como, pero sin limitarse a, elastasa, lipoproteína lipasa y catepsina G (31).

Por tanto, la neutralización de la actividad heparanasa puede, por ejemplo, prevenir la angiogénesis provocada debido a la activación de bFGF, y permitir la inhibición de la proliferación celular, tal como la proliferación de células tumorales.

La neutralización de la actividad heparanasa también puede usarse para inhibir la degradación de la membrana basal, que permite la invasión de células tumorales circulantes, y previene por tanto la metástasis.

En un mecanismo similar, la neutralización de la actividad heparanasa puede prevenir que células activadas del sistema inmunitario abandonen la circulación y por tanto se inhibe la producción tanto de trastornos inflamatorios como de respuestas autoinmunitarias.

Además del uso de anticuerpos neutralizantes para fines terapéuticos, estos anticuerpos pueden usarse para fines de investigación, para permitir una mejor comprensión del papel de la heparanasa en diferentes procesos.

Para futuras aplicaciones clínicas, pueden mejorarse los anticuerpos monoclonales anti-heparanasa, a través de un proceso de humanización, para superar la respuesta de anticuerpos humanos frente a anticuerpos de ratón.

Se han desarrollado recientemente nuevas estrategias rápidas para la humanización de anticuerpos (25, 26, 27) que pueden aplicarse para este anticuerpo. Estas tecnologías mantienen la afinidad y conservan la especificidad de antígeno y epítopo del anticuerpo original (26, 27).

Por tanto, según un aspecto de las enseñanzas de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal producido por una proteína heparanasa. El anticuerpo monoclonal de la presente invención no sólo puede unirse específicamente a, o interaccionar con la heparanasa, sino que también neutraliza o inhibe específicamente la actividad catalítica de la heparanasa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye, como principio activo de la misma, un anticuerpo monoclonal producido por una proteína heparanasa o una parte inmunogénica de la misma y un vehículo farmacéutico aceptable. El anticuerpo monoclonal inhibe específicamente la actividad heparanasa y se une a una parte C-terminal de la heparanasa.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones más adelante, la frase "actividad catalítica de la heparanasa" o su equivalente "actividad heparanasa" se refiere a una actividad de hidrolización de endoglicosidasa animal que es específica para sustratos de proteoglicano de heparán sulfato o heparina, en oposición a la actividad de enzimas bacterianas (heparinasa I, II y III) que degradan heparina o heparán sulfato por medio de \beta-eliminación. La actividad heparanasa que se inhibe o neutraliza según la presente invención puede ser de heparanasa o bien recombinante o bien natural. Tal actividad se da a conocer, por ejemplo, en las publicaciones estadounidenses US 6177545, US 6190875, US 2002 0068061 (WO 99-57244) y
09/113,168.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "proteína" también se refiere a un polipéptido. La proteína puede ser recombinante o natural. La proteína puede ser una parte de la proteína natural o recombinante completa. La preparación de proteína usada para la vacunación puede ser en bruto, parcialmente purificada o sumamente purificada.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier inmunoglobulina monoclonal o policlonal, o a un fragmento de una inmunoglobulina tal como sFv (proteína de unión a antígeno de cadena sencilla), Fab1 o Fab2. La inmunoglobulina podría ser también un anticuerpo "humanizado", en el que, por ejemplo, se fusionan regiones variables animales (es decir, murinas) con regiones constantes humanas, o en el que se injertan regiones determinantes de la complementariedad murinas sobre una estructura de anticuerpo humano (Wilder, R.B. et al., J. Clin. Oncol., 14: 1383-1400, 1996). A diferencia, por ejemplo, de anticuerpos derivados de animales, los anticuerpos "humanizados" a menudo no experimentan una reacción indeseable con el sistema inmunitario del sujeto. Los términos "sFv" y "proteína de unión a antígeno de cadena sencilla" se refieren a un tipo de un fragmento de una inmunoglobulina, un ejemplo del cual es sFv CC49 (Larson, S.M. et al., Cancer, 80:2458-68, 1997). Se encuentran detalles adicionales referentes a la humanización de anticuerpos en las referencias 25-27.

Por tanto, tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "humanizado" y sus derivados se refieren a un anticuerpo que incluye cualquier porcentaje por encima de cero y hasta el 100% de material de anticuerpo humano, en una cantidad y composición suficientes para hacer que sea menos probable que un anticuerpo de este tipo sea inmunogénico cuando se administra a un ser humano. Se entiende que el término "humanizado" se interpreta también en anticuerpos derivados de seres humanos o en anticuerpos derivados de células no humanas modificadas mediante ingeniería genética para incluir partes funcionales de los genes que codifican para el sistema inmunitario humano, que por tanto producen anticuerpos que son completamente humanos.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "inhibir" y sus derivados se refieren a suprimir o restringir la expresión libre de la actividad.

El término "neutralizar" y sus derivados se usan específicamente en el presente documento en el contexto de una única molécula de heparanasa que puede estar o bien activa o bien neutralizada.

Se describen en el presente documento anticuerpos neutralizantes de la actividad heparanasa, en los que al menos aproximadamente el 60-70%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 70-80%, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80-90% de la actividad heparanasa se suprime mediante la inhibición cuando se utiliza una razón de heparanasa con respecto a anticuerpo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1-40, preferiblemente de manera aproximada 2-30, más preferiblemente de manera aproximada 4-20, lo más preferiblemente de manera aproximada 5-15, o bien in situ, in loco, in vivo o bien in vitro.

Tal como se muestra específicamente en la sección de ejemplos a continuación en el presente documento, el anticuerpo neutralizante se une específicamente a la parte C'-terminal de la heparanasa, indicación de que la parte C'-terminal de la heparanasa está implicada en su actividad catalítica.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término parte C'-terminal se refiere a un epítopo o epítopos continuos o discontinuos que implican a aminoácidos derivados de cualquier ubicación o ubicaciones, o bien continuos o bien dispersos, a lo largo de los 100 aminoácidos C'-terminales de la heparanasa. Los epítopos continuos o discontinuos incluyen normalmente 3-8 aminoácidos continuos o discontinuos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vivo o in vitro de preparación de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa. El método se efectúa implementando las siguientes etapas del método, en el que, en una primera etapa, se exponen células (o bien in vivo o bien in vitro) que pueden producir anticuerpos a al menos un epítopo de una proteína heparanasa para generar de ese modo células que producen anticuerpos. En una etapa posterior, las células que producen anticuerpos se fusionan con células de mieloma para generar de ese modo una pluralidad de células de hibridoma, que producen cada una anticuerpos monoclonales. Entonces, se explora la pluralidad de anticuerpos monoclonales para identificar un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la actividad heparanasa. La última etapa va precedida normalmente de una primera exploración para identificar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la heparanasa. El al menos un epítopo de dicha proteína heparanasa incluye una parte C-terminal de dicha proteína heparanasa.

Según una realización preferida de la presente invención, el método comprende además la etapa de humanizar el anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa. Puede efectuarse una etapa de humanización de este tipo siguiendo los procedimientos descritos anteriormente en el presente documento, que se conocen en la técnica. Normalmente, la humanización de anticuerpos implica modificar genéticamente células no humanas para que incluyan genes funcionales y secuencias derivadas del complejo génico del sistema inmunitario humano o el sistema como un todo, que se realiza antes de exponer las células a un inmunógeno, tal como se describió en las etapas del método anterior.

Aún según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa, en el que el anticuerpo anti-heparanasa monoclonal sirve para neutralizar la actividad catalítica de la heparanasa, tal como se caracteriza en las reivindicaciones para la fabricación de un medicamento para tratar un estado asociado con la expresión de heparanasa.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "tratar" o tratamiento y sus derivados incluye revertir, ralentizar o inhibir sustancialmente la evolución de un estado, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos de un estado o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos de un estado.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, la frase "asociado con la expresión de heparanasa" se refiere a estados que dependen al menos parcialmente de la expresión de heparanasa. Se entiende que la expresión de heparanasa en muchos de tales estados puede ser normal, aunque la inhibición de la misma en tales estados dará como resultado la mejora del individuo afectado.

Por tanto, el estado puede estar relacionado con una función alterada de una molécula efectora biológica asociada a HSPG, tal como, pero sin limitarse a, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas y enzimas degradantes. El estado puede ser, o implicar, proliferación de células tumorales, invasión de células tumorales circulantes, metástasis, trastornos inflamatorios y/o estados autoinmunitarios.

Características novedosas, ventajas y objetos adicionales de la presente invención resultarán evidentes para el experto en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos. Adicionalmente, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención tal como se define a continuación en el presente documento y se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención.

Procedimientos experimentales y materiales

Materiales: Se adquirió heparina-sepharose de Pharmacia. Se adquirió azul de 1,9-dimetilmetileno de Aldrich (n.º de cat. 34108).

Producción de anticuerpos monoclonales: Se inmunizaron ratones Balb/C hembra de seis a ocho semanas de edad cada uno por vía intradérmica con 50 \mug (50 \mul) de heparanasa recombinante (preparada y purificada esencialmente tal como se describe en el documento U.S. 2002/0068061 (WO 9957244) emulsionada en 50 \mul de adyuvante completo de Freund con PBS. De dos a tres semanas más tarde, se inyectó por vía subcutánea o por vía intradérmica en múltiples sitios la misma cantidad de la emulsión en adyuvante incompleto de Freund. Tras 3 semanas, se inyectaron por vía intraperitoneal 25 \mug de antígeno en disolución acuosa. De siete a diez días más tarde, se extrajo sangre de los animales y se determinó el título de los anticuerpos relevantes. De tres a cuatro semanas tras el último refuerzo, se inyectaron a uno o dos animales por vía intraperitoneal 20 \mug de antígeno soluble (en PBS) y 3-4 días más tarde se extirparon los bazos.

Fusión y clonación de anticuerpos monoclonales: Se molieron los bazos de ratones inmunizados, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma NSO añadiendo PEG al 41%. Se hicieron crecer las células de hibridoma en medio de crecimiento DMEM selectivo de HAT que contenía HS al 15% (v/v) (Beit Haemek), glutamina 2 mM, disolución de pen.-estrep.-nistatina (penicilina: 10000 unidades/ml, estreptomicina: 10 mg/ml, nistatina: 1250 unidades/ml), a 37ºC en un 8% de CO_{2}. Se clonaron las células de hibridoma mediante dilución limitante. Se identificaron hibridomas que producían AcM frente a la heparanasa humana mediante su reactividad con heparanasa humana inmovilizada en fase sólida (nativa y desnaturalizada (ELISA)).

Cultivo celular: Se cultivaron células de hibridoma en frascos T-175 (Corning Costar, n.º de cat. 430824) en un incubador enriquecido en CO_{2} (8%), a 37ºC en medio DMEM (Beit Haemek, Israel) complementado con suero de caballo al 10% (n.º de cat. de Beit-Haemek 04-124-1A). El volumen del cultivo era de 80 ml.

Producción de anticuerpos mediante el método de privación (28): Se usaron cultivos que alcanzaban una densidad celular de 2x10^{6} células/ml o superior para la producción de anticuerpos. Se retiraron las células de los frascos pipeteándolas y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos con el fin de sedimentar las células. Se suspendieron los sedimentos celulares en DMEM basal (sin suero añadido) y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos. Se repitió este procedimiento una vez más y se suspendieron los sedimentos celulares en el volumen original de medio DMEM basal. Se sembró en placa la suspensión celular en frascos T-175 nuevos y se colocaron dentro del incubador. Tras 48 horas, se sedimentaron las células mediante centrifugación a 3.500 rpm durante 10 minutos. Se filtraron los sobrenadantes de cultivo a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 micras (Nalgene, n.º de cat. 156-4020) y se complementaron con azida de sodio al 0,05%. Se mantuvieron refrigerados los sobrenadantes de cultivo hasta su purificación.

Purificación de anticuerpos monoclonales: Se realizó la purificación mediante cromatografía de afinidad usando proteína G (28, 14). Se usaron 2,5 ml de Protein G Sepharose 4 Fast Flow (n.º de cat. de Pharmacia 17-0618-01) para empaquetar cada columna (Bio Rad, n.º de cat. 737-1517). La velocidad de flujo para empaquetar las columnas era de 4 ml/min. Se equilibró la columna con 100 ml de PBS pH 7,2. Se cargaron los sobrenadantes de cultivo (filtrados y complementados con azida de sodio tal como se describió anteriormente) en la columna a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Tras cargar, se lavó la columna con 80 ml de PBS pH 7,2 a una velocidad de flujo de 4 ml/minuto. Se realizó la elución con 12 ml de tampón glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7, a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Se recogieron fracciones de un ml en tubos que contenían 0,3 ml de Tris 1 M pH 9,0. Se lavó la columna adicionalmente tras la elución con 50 ml del tampón de elución a una velocidad de flujo de 4 ml/min. Se regeneró entonces la columna haciendo pasar 50 ml de tampón de regeneración (tampón glicina-HCl 0,1 M pH 2,5). Tras la regeneración, se neutralizó la columna inmediatamente con 100 ml de PBS pH 7,2, se añadió azida de sodio al 0,1% y se almacenó después de eso la columna en la nevera.

Se analizaron las fracciones eluidas para determinar el contenido en proteínas usando el método de determinación de proteínas de Bradford. Según los resultados obtenidos, se agruparon 4-6 fracciones y se dializaron (tubos de diálisis Spectrum, MWCO 6.000-8.000, n.º de cat. 132653) tres veces frente a 500 ml de tampón PBS pH 7,2 con azida de sodio al 0,05%, o frente a PBS pH 7,2 añadiéndose timerosal al 1% (Sigma, n.º de cat. T-8784). Tras la diálisis, se almacenaron las muestras a 4ºC.

Inmunotransferencias de tipo Western: Se separaron las proteínas en geles de gradiente preparados de poliacrilamida al 4-20% (Novex). Tras la electroforesis, se transfirieron las proteínas a una membrana de nailon Hybond-P (Amershem) (350 mA/100 V durante 90 minutos). Se bloquearon las membranas en TBS que contenía Tween 20 al 0,02% y leche desnatada al 5% durante 1-16 horas y entonces se incubaron con antisueros diluidos en la misma disolución de bloqueo. Se lavaron entonces las inmunotransferencias en TBS-Tween, se incubaron con IgG anti-ratón/anti-conejo conjugada con HRP apropiadas y se revelaron usando reactivos de ECL (Amersham) según las instrucciones del fabricante.

Mapeo de epítopos: Se digirió un fragmento de 1,7 Kb de ADNc hpa (un ADNc hpa clonado en pfastBacHTA, véase la solicitud de patente estadounidense número 08/922.170) mediante diversas enzimas de restricción para crear deleciones en serie a partir de tanto el extremo 3' como el 5' del marco de lectura abierto (ORF) de la heparanasa tal como sigue.

Deleciones en 3': Fragmento de EcoRI - BstEII, que codifica para los aminoácidos 1-465, deleción de un fragmento de NdeI - XbaI que genera un ORF de 347 aminoácidos (1-347) y una deleción de un fragmento de AflII - XbaI que genera un ORF de 229 aminoácidos (1-229).

Deleciones en 5': fragmento de BamHI - XhoI que codifica para 414 aminoácidos, (130-543), un fragmento de
AflII - XhoI que codifica para 314 aminoácidos (230-543), un fragmento de NdeI - XhoI que codifica para 176 aminoácidos (368-543) y un fragmento de BstEII - XhoI que codifica para 79 aminoácidos del marco de lectura abierto de la heparanasa (465-543).

Se expresaron los segmentos de heparanasa en un sistema de expresión de baculovirus, esencialmente tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense número 09/071.618. Se subclonaron los fragmentos en el vector pfastBacHT para generar constructos de fusión marcados con His. Se generaron baculovirus recombinantes que contenían los diversos fragmentos usando el sistema Bac to Bac (GibcoBRL) según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron extractos de células Sf21 que expresaban diversos segmentos de proteína heparanasa. Se detectaron los segmentos de heparanasa recombinante mediante inmunotransferencias de tipo Western.

Ensayo de la actividad heparanasa: Se incubaron 100 \mul heparina-sepharose (suspensión al 50% en agua bidestilada) en tubos eppendorf de 0,5 ml colocados en un agitador de vuelco (37ºC, 17 horas) con preparaciones enzimáticas en mezclas de reacción que contenían tampón fosfato-citrato 20 mM pH 5,4, CaCl_{2} 1 mM y NaCl 1 mM, en un volumen final de 200 \mul. Las preparaciones enzimáticas usadas eran o bien heparanasa recombinante purificada expresada en células de insecto (solicitud de patente estadounidense número 09/071.618), o bien heparanasa parcialmente purificada de placenta humana (30). Al final del periodo de incubación, se centrifugaron las muestras durante 2 minutos a 1000 rpm y se analizaron los productos liberados en el sobrenadante debido a la actividad heparanasa usando el ensayo calorimétrico azul de dimetilmetileno tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense número 09/113.168.

Ensayo de azul de dimetilmetileno (DMB): Se transfirieron los sobrenadantes (100 \mul) a cubetas de plástico. Se diluyeron las muestras hasta 0,5 ml con PBS más BSA al 1%. Se añadió azul de 1,9-dimetilmetileno (32 mg disueltos en 5 ml de etanol y diluidos hasta 1 litro con tampón formiato) (0,5 ml) a cada muestra. Se determinó la absorbancia de las muestras usando un espectrofotómetro (Cary 100, Varian) a 530 nm. Para cada muestra, se incluyó un control al que se añadió la enzima al final del tiempo de incubación.

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Resultados experimentales

Mapeo de epítopos: Como parte de la tarea de caracterizar anticuerpos monoclonales purificados, es necesario determinar si los anticuerpos individuales producidos contra el mismo antígeno se unen a epítopos idénticos o solapantes.

Se usó un método lineal para mapear el epítopo reconocido por cada anticuerpo dentro de la proteína heparanasa. Se realizaron deleciones en serie y se sometieron a ensayo para determinar la producción de fragmentos que pueden reconocerse por cada anticuerpo. En la práctica, este método sólo puede ubicar el sitio de unión en una región pequeña.

Se examinaron los sobrenadantes de dos anticuerpos monoclonales, HP-130 y HP-239, mediante inmunotransferencia de tipo Western para determinar su reactividad con diversos segmentos de heparanasa recombinante expresada en células de insecto infectadas con baculovirus.

Tal como puede observarse en la figura 1, el anticuerpo monoclonal HP-130 reconoció un segmento de 79 aminoácidos en el extremo C-terminal del marco de lectura abierto de la heparanasa (aminoácidos 465-543). El anticuerpo monoclonal HP-239 reconoció un epítopo interno ubicado en los aminoácidos 130-230.

Neutralización de heparanasa recombinante expresada en células de insecto: Se examinó la capacidad de los diferentes anticuerpos monoclonales para inhibir la actividad de una heparanasa recombinante expresada en células de insecto. Se incubaron previamente mezclas de reacción que contenían 5 \mug de enzima durante 30 min. a temperatura ambiente, con cantidades crecientes de anticuerpos (de 25 a 170 \mug, formando razones molares de enzima con respecto a anticuerpo de 1:1,7 a 1:10, para el anticuerpo HP-130, y de 12,5 a 250 \mug, formando razones molares de 1:0,85 a 1:18,5, para el anticuerpo HP-239).

Tras la incubación previa, se determinó la actividad heparanasa usando el ensayo de DMB tal como se describe en procedimientos experimentales. En la figura 2 se presenta el tanto por ciento de actividad medida en presencia de cada cantidad de anticuerpo, en comparación con la actividad de una reacción control que carece de los anticuerpos.

Tal como puede observarse en la figura 2, el anticuerpo monoclonal HP-130, que está dirigido contra el extremo C-terminal de la enzima heparanasa, pudo inhibir casi completamente la actividad heparanasa recombinante a una razón molar de 1:10.

La incubación previa de la heparanasa con concentraciones crecientes de anticuerpo dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la actividad (figura 2). El otro anticuerpo examinado, HP-239, que está dirigido contra un epítopo interno de la heparanasa, no provocó inhibición de la actividad heparanasa incluso a una razón superior de anticuerpo con respecto a enzima (1:18,5), en comparación con la razón que proporcionó una inhibición casi completa con el anticuerpo HP-130. Se prepararon y purificaron estos dos anticuerpos de la misma manera, lo que indica que la inhibición de la actividad heparanasa por el anticuerpo HP-130 es específica. Las razones molares de enzima con respecto a anticuerpo en las que el anticuerpo HP-130 inhibió la actividad heparanasa son similares a las razones molares notificadas en la bibliografía que se usan para la neutralización de otras enzimas (21, 22). El hecho de que un anticuerpo formado contra el extremo C-terminal de la enzima pudiese inhibir casi completamente su actividad, mientras que un anticuerpo dirigido contra un epítopo interno no tenía absolutamente ningún efecto, podría sugerir el posible papel del extremo C-terminal en la actividad heparanasa, y puede indicar la posibilidad de que otros anticuerpos dirigidos contra esta región puedan tener también un efecto neutralizante sobre la actividad heparanasa.

Neutralización de la actividad heparanasa natural purificada de placenta humana: Para examinar la posibilidad de si el anticuerpo monoclonal HP-30 pudiese inhibir una heparanasa natural de la misma manera que inhibe la enzima recombinante, se diseñó un experimento similar tal como se describió anteriormente con heparanasa purificada de placenta humana.

Puesto que la actividad específica de la enzima natural es mucho más alta que su homólogo recombinante, se usaron 5 ng de enzima para este experimento. La actividad de esta cantidad de enzima está en el intervalo lineal del ensayo de actividad heparanasa de DMB.

Se incubó previamente la enzima con cantidades crecientes de anticuerpo mientras se mantenían razones molares similares a las usadas para la enzima recombinante (de 20 a 450 ng de anticuerpo HP-130 formando razones molares de enzima con respecto a anticuerpo de 1:4 a 1:95, y 225 ng de anticuerpo HP-239 formando una razón molar de 1:20). En la figura 3 se presenta el tanto por ciento de actividad que permanecía en presencia de cada cantidad de anticuerpo, en comparación con la actividad de una reacción control que carece de los anticuerpos.

Tal como se muestra en la figura 3, 225 ng de anticuerpo HP-130 pudieron inhibir el 90% de la actividad heparanasa purificada de placenta humana. Esta cantidad de anticuerpo forma una razón molar de enzima con respecto a anticuerpo de 1:20, similar a la razón que inhibió casi completamente la heparanasa recombinante expresada en células de insecto. Por otra parte, el anticuerpo HP-239, usado a la misma razón molar, no tuvo ningún efecto sobre la actividad heparanasa. La capacidad del anticuerpo monoclonal HP-130 para inhibir una enzima heparanasa humana natural ejemplifica la posibilidad de usar heparanasa recombinante para explorar para identificar agentes neutralizantes contra enzimas que se producen de manera natural.

Referencias citadas

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Claims (17)

1. Uso de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa (endo-\beta-D-glucuronidasa), siendo dicho anticuerpo anti-heparanasa monoclonal para neutralizar la actividad catalítica de la heparanasa para la fabricación de un medicamento para tratar un estado asociado con la expresión de heparanasa seleccionado de estados autoinmunitarios y trastornos inflamatorios.

2. Uso de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa (endo-\beta-D-glucuronidasa), siendo dicho anticuerpo anti-heparanasa monoclonal para neutralizar la actividad catalítica de la heparanasa para la fabricación de un medicamento para tratar un estado asociado con la expresión de heparanasa seleccionado de cáncer, una enfermedad inflamatoria y una enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a una parte C-terminal de dicha heparanasa.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho estado está asociado con una función alterada de una molécula efectora biológica asociada a proteoglicano de sulfato de heparina (HSPG).

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicha molécula efectora biológica asociada a HSPG se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una quimiocina, una citocina y una enzima degradante.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en HGH, FGF y VEGF.

6. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha quimiocina se selecciona del grupo que consiste en PF-4, IL-8, MGSA, IP-10, NAP-2, MCP-1, MIP-Ia, MIP-Ib y RANTES.

7. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-3, TNFa, TNFb, GM-CSF e IFN\gamma.

8. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha enzima degradante se selecciona del grupo que consiste en elastasa, lipoproteína lipasa y catepsina G.

9. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho estado se selecciona del grupo que consiste en proliferación celular, proliferación de células tumorales, invasión de células tumorales circulantes y metástasis.

10. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa es humano o está humanizado.

11. Método de preparación de un anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

exponer, in vitro o in vivo, células que pueden producir anticuerpos a al menos un epítopo de una proteína heparanasa (endo-\beta-D-glucuronidasa) y generar de ese modo células que producen anticuerpos, en el que la exposición in vivo no se lleva a cabo en seres humanos;

(b)

fusionar dichas células que producen anticuerpos con células de mieloma y generar de ese modo una pluralidad de células de hibridoma que producen cada una anticuerpos monoclonales; y

(c)

explorar dicha pluralidad de anticuerpos monoclonales para identificar un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la actividad heparanasa,

en el que dicho al menos un epítopo de dicha proteína heparanasa incluye una parte C-terminal de dicha proteína heparanasa.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además la etapa de humanizar el anticuerpo anti-heparanasa monoclonal neutralizante de la actividad heparanasa.

13. Composición farmacéutica que comprende como principio activo un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo de una proteína heparanasa (endo-\beta-D-glucuronidasa), el anticuerpo monoclonal inhibe específicamente la actividad heparanasa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el anticuerpo monoclonal se une a una parte C-terminal de la heparanasa.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que dicho epítopo de dicha heparanasa es un epítopo continuo o discontinuo.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que dicha proteína heparanasa es heparanasa recombinante o heparanasa natural.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que dicho anticuerpo monoclonal se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a)

exponer, in vitro o in vivo, células que pueden producir anticuerpos a dicho epítopo de dicha proteína heparanasa y generar de ese modo células que producen anticuerpos, en el que la exposición in vivo no se lleva a cabo en seres humanos;

(b)

fusionar dichas células que producen anticuerpos con células de mieloma y generar de ese modo una pluralidad de células de hibridoma que producen cada una anticuerpos monoclonales; y

(c)

explorar dicha pluralidad de anticuerpos monoclonales para identificar un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la actividad heparanasa.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que el anticuerpo monoclonal es humano o está humanizado.