JPH04506148A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター発明の分野 本発明は、は乳類、特にヒトにおいて局在する蛋白質分解活性の阻害または打ち 消し方法に関するものであり、この方法は、は乳類においてウロキナーゼ型プラ スミノーゲン活性化因子（以後、ｕ−ＰＡと呼ぶ）のレセプター結合形態がｕ− ＰＡレセプターへ結合するのを阻止し、それによってｕ−ＰＡがプラスミノーゲ ンからプラスミンへ変換するのを妨げることにより、プラスミノーゲンからプラ スミンへの活性化を阻止することを含む。本発明はまた、純粋なＵ　−ＰＡレセ プター（以後、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒと呼ぶ）、ｕ−ＰＡＲをコードするＤＮＡ、治 療用または診断用成分として使用されるｕ−ＰＡＲまたはその一部分の製造、ｕ 　−Ｐ　Ａ　Ｒ抗体および治療用または診断用成分として使用されるｕ−ＦＡレ セプター結合性ｕ−ＰＡ分子の製造に関するものである。別の態様において、本 発明は、ｕ−ＰＡのレセプター結合形態の活性の調節、プラスミンによるプロー ｕ−ＰＡからｕ−ＰＡへの活性化および細胞上のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの数およびｕ −ＰＡＲ／ｕ−ＰＡ結合の結合親和力の調節並びにこれらの発見の治療的態様に 関するものである。さらＩこ別の態様において、本発明は、標識ｕ−ＰＡによる ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの検出に関するものである。 全般的背景 文献によると、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ　−ＰＡ）は、 これまでに調査されたあらゆる種類のは乳類から見出されている。幾つかの発見 は、ｕ−ＰＡが、他の蛋白質分解酵素をプラスミンと一緒に用いた場合に誘発さ れる、恐らくは細胞外マトリックスの分解による組織分解および／または細胞移 動に関係あることを示している。この関係は、乳腺の泌乳後退縮および子宮にお ける受精卵着床後の栄養芽層侵入の初期においてほぼ充分に研究されてきた。組 織分解および細胞移動におけるｕ−ＰＡの役割に関する仮説は、退縮している乳 腺の上皮細胞、乾せんでの組織分解を伴う領域、精子形成中の精母細胞の放出と の関連、および創傷治癒中の上皮生長のケラチン生成細胞におけるｕ−ＰＡの免 疫細胞化学的発見により可能となったより正確な位置測定によりさらに支持され ている（ダノ等（１９８８）、グロンダルーハンセン等、（１９８８）参照）。 また、ｕＰＡが炎症の退化相においである役割を演じていることが考えられ、ま た、ｕ−ＦＡが様々な細胞に対するリンパ球介在細胞毒性を妨害するという報告 も存在し、天然キラー細胞の細胞毒性作用におけるｕ−ＰＡの直接的役割が提案 されている。ｕ−ＰＡの役割は、血管形成および上皮細胞移動、すなわち腫よう 増大における重要なプロセスにおいて提案されている。 ｕ−ＰＡは、新生物由来の多くの培養細胞をにより産生される。 腫よう組織の外植体は、対応する正常組織よりも多くのｕ−ＦＡを放出すること が見出された。ｕ−ＰＡは、ヒト肺、結腸、子宮内膜、胸部、前立腺および腎臓 癌腫、ヒト・メラノーマ、ネズミ乳癌、ネズミ・ルイス肺腫ようからの抽出物お よびヒト腹膜癌腫症からの腹水において同定された。マウスにおいて侵襲的に増 大および転移しているルイス腹癌腫に関する免疫組織化学試験は、ｕ−ＰＡの存 在を−貫して示したが、また、個々の腫ようの異なる部分におけるＵ−ＰＡの含 有量の顕著な不均一性をも示した。高いｕ−ＰＡ含有量は周囲の正常組織の侵襲 的増大および分解を伴う領域で見出されたが、他の領域は検出可能なｕ−ＰＡを 欠いていた。ｕ−ＰＡは、腫よう細胞の細胞質および正常細胞の周囲に細胞外的 に局在していた。 周囲正常組織の分解は、悪性腫ようの侵襲性の中心的特徴である。 悪性腫ようにおけるｕ−ＦＡの定常的発見およびｕ−ＰＡが正常な生理学的事象 における組織分解である役割を演じていることを示す発見により、ｕ−ＰＡは癌 発生においても似た役割を演じていることが仮定される。ｕ−ＰＡが組織破壊に おいである役割を演じているという仮説は、プラスミンが他の蛋白質分解酵素と 一緒になって細胞外マトリックスを分解するという仮定を含む。この状況では、 細胞外マトリックスの大部分の成分がプラスミンにより分解され得ることに注目 すべきである。これらには、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、 および全部ではないが、恐らくは幾つかのタイプのコラーゲンが含まれる。さら に、バエスおよび共同研究者により最初に報告された通り、プラスミンは、一方 で他のタイプのコラーゲンを分解し得る潜在コラゲナーゼを活性化し得る（ダノ 等、（１９８８）参照）。 処置失敗群における癌患者の大多数は、転移の直接作用または転移の処置に伴う 合併症で死亡する。従って、多くの研究は、診断的または治療的ストラテジーに 関する基礎であり得る特異的な生化学的因子の同定に集中してきた。細胞外マト リックスは、糖蛋白質、例えばフィブロネクチンおよびラミニン、コラーゲンお よびプロテオグリカンにより構成される。細胞外マトリックスは、組織治癒およ び改造、炎症および新生組織形成中のみ細胞の動きに対して集中。 的に透過性になる。リオッタ（１９８６）は三段階仮説を提案した。 第一段階は、細胞表面レセプターによる腫よう細胞の結合である。 次に、固定された腫よう細胞は、マトリックスを局所的に分解し得る（結合成分 の分解を含む）加水分解酵素を分泌する（または宿主細胞を誘導して酵素を分泌 させる）。マトリックス溶解は、はぼ確実に腫よう細胞表面に近い高局在領域で 行なわれると思われる。第三段階は、蛋白質分解により修飾されたマトリックス 領域への腫よう細胞の移動である。すなわち、マトリックスの侵襲性は、受動的 生長圧に起因するだけでなく、能動的生化学機構を必要とする。 多くの研究グループは、侵襲性態よう細胞がマトリックス分解性プロテアーゼを 分泌することを提案した。セリンプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼを含 むプロテアーゼのカスケードは全て、腫よう侵襲の容易化の一因となっている。 重大なカスケードの一つは、プラスミノーゲン活性化システムである。蛋白質分 解の調節は、腫よう細胞−宿主細胞相互作用および宿主または腫よう細胞そのも のにより産生されるプロテアーゼ阻害物質を含め、多くのレベルで行なわれ得る 。マトリックス分解酵素の発現は、腫よう細胞特異的ではない。活動的侵襲性態 よう細胞は、単にそれらの非侵襲性対照細胞と比べて異なる調節シグナルに応答 し得る（リオツタ、１９８６）。 プラスミノーゲン活性化システムが、細胞外マトリックス蛋白質の分解を通して 、悪性腫ようの増大中に正常組−の侵襲および破壊においである役割を演じてい るという仮定は、様々な発見により支持されている。これらの発見、に（よ、発 癌性ウィルスによる細胞の形質転換およびｕ−ＰＡの合成間の密接な関係、ｕ− ＰＡが多くの非悪性状態における組織破壊に関与するという発見、および腫よう の侵襲領域におけるｕ−ＰＡの免疫組織化学的位置測定が含まれる（概説として ダノ等（１９８５）、サクセラ（１９８５）参照）。 この仮説を支持する別の発見は、侵襲および転移のモデルシステムにおけるｕ− ＰＡに対する抗触媒的抗体による試験から生まれている。上記抗体は、チキン胚 芽のしよう尿膜へ移植されたヒトＵ　−ＰＡ産生腫よう、ＨＥｐ−３から肺への 転移（オツソブスキーおよびライヒ、１９８３、オツソブスキー、１９８８）、 Ｂ１６メラノーマ細胞による羊膜の浸透（ミグナラティ等、１９８６）、新生物 に由来する幾つかのヒトおよびネズミセルラインによる基底膜侵襲（ライヒ等、 １９８８）およびマウスにおけるＢ１６メラノーマ細胞の静脈内注射後の肺転移 の形成（ヒアリング等、１９８８）を減少させることが見出された。これらの試 験の中には（ミグナラティ等、１９８６、ライヒ等、１９８８）、プロコラゲナ ーゼのプラスミン触媒による活性化（トリグベーソン等（１９８７）参照）は、 プラスミノーゲン活性化作用の重大な部分であると思われるものがあった。 細胞外プロセスにおける蛋白質分解カスケード・システムの調節に関する必要条 件は、その開始および進行の正確な位置測定である。 例えば、補体および凝結システムでは、様々な成分に対する細胞レセプターが公 知であり、それらは反応連鎖を促進または終結させる反応の位置測定に役立って いる（ミューラーーエーベルハルト、１９８８、マン等、１９８８）。プラスミ ノーゲン活性化システムでは、組織型プラスミノーゲン活性化因子０−ＰＡ）に より触媒されたプラスミノーゲン活性化の位置決定におけるフィブリンの役割が よく知られている（トールセン等、１９７２、ホイラーツ等、１９８２）。 免疫細胞化学試験は、腫ようの侵襲性領域では、ｕ−ＰＡが腫よう細胞の膜に位 置することを示唆しており（スフリバー等、１９８４）、最近の発見は、細胞表 面において、ｕ−ＰＡが一般的に特異的レセプターに結合していること、および この局在性は、時間および空間の点でｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化の調 節に重大であり得ることを示している（ブラシ等（１９８７）参照）。予備報告 は、ｔ−ＰＡもまた、細胞表面レセプターに結合し、その酵素活性を保持し得る ことを示唆している（ベーベ、１９８７、バルナーサン等、１９８８、バジャー およびナハマン、１９８８、クイパー等、１９８８）。しかしながら、この現象 は、結合部位の性質に関するさらに明確な説明を要する。 ｕ−ＰＡに対する表面レセプター ｕ−ＰＡに対する細胞レセプター（ｕ−ＰＡＲ）は、最初、血液単核白血球およ び単核白血球様Ｕ９３７セルラインにおいて同定され（バッサ−り等、１９８５ ）、その存在は、幾つかの型の悪性細胞（ストッページ等、１９８５、バッサー リ等、１９８５、プロー等、１９８６、ボイド等、１９８８ａ、ニールセン等、 １９８８）、ヒト繊維芽細胞（バジパイおよびベーカー、１９８５）を含む様々 な培養細胞およびヒト胸部癌腫組織（ニードハム等、１９８７）において立証さ れている。レセプターは、活性５４ｋＤｕ−ＰＡ、その−ポリペプチド鎖プロ酵 素、プローｕ−ＰＡ（下記参照）および活性部位試薬ＤＦＰにより阻害された５ ４ｋＤｕ−ＰＡに結合するが、活性ｕ−ＰＡの低分子量（３３ｋＤ）形態の結合 性は全く示さない（バッサ−り等、１９８５、タペンス等、１９８６）。すなわ ち、レセプターへの結合はｕ−ＰＡの触媒部位を必要とせず、これらの発見に従 って、ｕ−ＰＡの結合決定基は、−次構造が触媒部位とは大きく異なる領域であ る酵素のアミノ末端部分において同定された。レセプター結合ドメインは、ｕ− ＰＡ分子の１５ｋＤアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ。 残基１−１３５）、より正確には、表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターへの結合 に関与するＥＧＦの部分と相同性を示す領域であるため成長因子領域と呼ばれる システィン濃厚域内に位置する。結合に非常に重要であると思われるアミノ酸残 基は、配列１２−３２内に位置する（アラペラ等、１９８７）。非常に低濃度（ １００ナノモル）の結合を阻害する合成ペプチドが構築された。ネズミおよびヒ トペプチド間の交差反応性の欠如は、ｕ−ＰＡおよびｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ間の結合 が強度に種特異的であることを示す。 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合は、ｔ−ＰＡおよびプラスミノーゲンを含むｕ− ＰＡに構造上関連した幾つかの蛋白質について試験されたにせよ（ストツペーり 等、１９８５、バッサ−り等、１９８５、ニールセン等、１９８８）、レセプタ ーへの結合についてきっ抗する他の蛋白質がまだ全く見出されていないという意 味では特異的である。レセプター結合ドメインのみを含むｕ−ＰＡの７ラグメン ト、例えばＡＴＦは、ｕ−ＰＡと結合し得る他の分子（プロテアーゼ・ネキシン およびプラスミノーゲン活性化因子阻害物質ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２）が触 媒活性領域を認識するため、レセプターへの結合特異性を確実にする（ストツベ ーり等、１９８５、ニールセン等、１９８８）。ＰＡＩ−１は、ｕ−ＰＡとは共 有結合複合体を形成し得るが、プローｕ−ＰＡとは形成し得ない（アンドレアー ゼン等、１９８６）。 報告されたレセプターの数は、正常単核白血球では１細胞当たり数十個の分子（ マイルズおよびプロー、１９８７）からある種の結腸癌腫セルラインでは３ＸＩ Ｏ’（ボイド等、１９８８ａ）といった範囲で、試験された細胞型間で強度に変 動し、また、結合親和力については０．１−１０ナノモルの範囲で見かけ上ある 程度の変動が生じる（概説については、ブラシ（１９８８）参照）。さらに、あ る種のセルラインでは、レセプター数は、様々な薬剤、例えばＵ９３７細胞では ホルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡＸストツベーリ等、１９８５、 ニールセン等、１９８８）、Ａ４３１細胞（ブラシ等、１９８６）およびヒーラ 細胞（エストレイヒエル等、１９８９）では表皮成長因子並びに結腸癌腫細胞で はジメチルホルムアミド（ボイド等、１９８８ｂ）を加えることにより調節され 得る。第一に述べたケースでは、リガンドに対する親和力が大きく減少すると同 時にレセプター数が増加する（ニールセン等、１９８８、ピコン等、１９８９） 。 ｕ−’ＰＡレセプターに関する予備分子試験が行なわれた。ｕ−ＰＡレセプター 検定が開発ｄれ、代謝標識物質および固定プローｕ−ＰＡによるアフィニティー ・クロマトグラフィーを用いて、約２２００倍の精製が達成された（ニールセン 等、１９８８）。部分精製蛋白質の特性検定は、レセプターが５５−６０ｋＤＩ ！蛋白質であり、その分子量はジスルフィド結合の開裂後に変化しないことを示 し、それが単一ポリペプチド鎖から成ることを示唆した。本発明まで、リガンド への結合に関与する、レセプターの構造特性については全く知られていなかった 。ニールセン等の試験では、精製ｕ−ＰＡＲ製品は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで オートラジオグラフィー後に本質的に一つの放射性標識バンドを示す。しかしな がら、この分析は、ｕ−ＰＡＲよりも高い場合もあり得る量で存在し得る非標識 蛋白質を検出しないため、製品の純度を示さない。同様の考察は　１！Ｉ　Ｉに より表面標識された細胞からｕ−ＰＡＲ精製の試みが行なわれた、エストレイヒ エル等（１９８９）による最近の試験についても当てはまる。デタージェント分 離し、次いでジイソプロピルフルオロホスフェート標識ｕ　−Ｐ　Ａ（Ｄ　Ｆ　 Ｐ　−ｕ　−Ｐ　Ａ）とインキュベージｉｉ７し、ｕ−ＰＡに対する固定化抗体 とアフィニティー・クロマトグラフィーを行うことにより、５ＤＳ−ＰＡＧＥお よびオートラジオグラフィー後に約４５０００’ｋＤの標識バンドが得られた。 このバンドがＵ−ＰＡＲを表すか否かは明白ではない。精製製品に関する交差結 合試験は全く行なわれず、その見かけ上の分子量は、ニールセン等（１９８８） により報告され、また本発明の試験で見出される通り（実施例１参照）、ｕ−Ｐ ＡＲの場合よりも明らかに低い。さらに、汚染性非標識蛋白質が存在するか否か は評価され得ず、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるレーンの一部分しか示されていない ため、汚染性標識蛋白質が存在するか否かの評価さえ不可能である。 現在までのところ、ｕ−ＰＡＲに対する抗体の製造は報告されていない。 ｕ−ＰＡに対するプロ酵素（プローｕ−ＰＡ）幾つかの試験結果は、ｕ−ＰＡが 、プラスミノーゲン活性化能力をほとんどまたは全くもたない１本鎖プロ酵素と して多くの型の培養細胞から放出されることを示している（ニールセン等、１９ ８２、スフリバー等、１９８２、イートン、１９８４、カサイ等、１９８５、パ ネルおよびギュアウィッチ、１９８７）。触媒量のプラスミンによる制限され′ ｔ；蛋白質分解により、このプロ酵素は、その活性２本鎖対応物質に変換され得 る。また、１末鎖ｕ−ＰＡのプロ酵素の性質は、それが本質的に合成基質による アミド分解活性をもたず（ラン等、１９８２、イートン等、１９８４、リジネン 等、１９８６、スタンプ等、１９８６ａ、１９８６ｂ、ネレス等、１９８７、パ ネルおよびギュアウィッチ、１９８７）、それが巨大分子阻害物質（イートン等 、１９８４、バッサ−り等、１９８５、アンドレアセン等、１９８６、ステフェ ンズ等、１９８７）および合成阻害物質（ニール　−セン等、１９８２、スフリ バー等、１９８２、ラン等、１９８２、ギュアウィッチ等、１９８４、カサイ等 、１９８５）との反応性をほとんどまたは全くもたないという発見において反映 されている。 本質的不活性プロ酵素としての１末鎖ｕ−ＰＡのこの概念は、数名の他の研究者 （コレン等、１９８６．リジネン等、１９８６、スタンプ等、１９８６ａ、１９ ８６ｂ）が到達した解釈とは対立する。 彼等は、幾つかの供給源から得られた１末鎖ｕ−ＰＡがかなりのプラスミノーゲ ン活性化能力を何し、組換え１末鎖ｕ−ＰＡが２末鎖Ｕ−ＰＡの場合よりも一層 高い活性を有するという結論に達した。これらの試験を行うため、生成されたプ ラスミンの活性を色素原基質により測定する結合プラスミノーゲン活性化検定を 使用した。プローｕ−ＰＡに関する上記検定は、自己活性的であり、少量の汚染 性または生成された２末鎖ｕ−ＦＡまたはプラスミンにより強く影響される。従 って、他の場所で詳細に検討されている通り（ベーターセン等、１９８８）、こ れらの試験で見出される１末鎖ｕ−ＰＡの高い活性は見かけ上のものであり、１ 末鎖ｕ−ＰＡの固有の活性によるものではなかったといえる。部位突然変異によ りプラスミン開裂に対する部分的耐性が加えられた組換え１末鎖ｕ−ＰＡの変異 体に関する報告は、この解釈と一致する。１末鎖ｕ−ＰＡのこの変異体は、結合 検定において２本鎖ｕ−ＰＡの場合よりも２００倍低い活性を有していた〔ネレ ス等、１９８７）。 プローｕ−ＰＡに関する検定において自己活性化を阻止する方法を含む最近の動 力学試験は、プローｕ−ＰＡの低い固有活性を確認した（エリス等、１９８７、 ベーターセン等、１９８８、ウラン等、１９８８）。ＨＴ−１０８０線維肉腫細 胞から得られたプローｕ−ＰＡの高度精製製品による一試験では、プローｕ−Ｐ Ａが、２末鎖Ｕ−ＰＡの２５０倍低濃度の場合より低いプラスミノーゲン活性化 能力を有することが示されｔ；。この低い活性が固有のものであるのか、汚染に よるものであるのかを決定することは出来なかった（ベーターセン等、１９８８ ）。 インタクトな生物では、プローｕ−ＰＡは、細胞内貯蔵におけるＵ−ＰＡの主形 態であり、また、それは、細胞外流体中でｕ−ＰＡのかなり大きなフラクシヨン を構成する（スフリバー等、１９８４、キールベルブ等、１９８５）。従って、 プローｕ−ＰＡの細胞外活性化は、プラスミノーゲン活性化のｕ−ＰＡ経路の生 理学的調節における非常に重要な段階であり得る。プローｕ−ＰＡのプラスミン 触媒による活性化によって、少量のプローｕ−ＰＡの活性化作用を加速および増 幅する積極的なフィードバック機構が提供される。しかしながら、生理学的条件 下におけるプラスミノーゲン活性化のＵ−ＰＡ経路の開始は、この明細書に記載 されている通りプローｕ−ＰＡを活性化するトリガー因子を必要とする。す、ジ ン１５８が別のアミノ酸（例、ＧｌｕまたはＧｕｙ）へ改変されたヒト１本鎖プ ローｕ−ＰＡの突然変異体は、全くまたは低い程度にしか活性２本鎖ｕ−ＰＡに 変換されない（ネレス等、１９８７）。 焦点接触部位におけるｕ−ＰＡ ＨＴ−１０８０繊維肉Ｉｌ細胞およびヒト繊維芽細胞の表面において、ｕ−ＰＡ は、不均−Ｉこ分布し、明らかに細胞−細胞接触部位および細胞および培養基盤 間の最も近接した部位である焦点接触部位に位置していることが見出された（ポ ーラーネン等、１９８７．１９８８、ヘブールおよびベーカー、１９８８）。ｕ −ＰＡは、他の２タイプの細胞−培養基盤接触部位、すなわち近接接触部位およ びフィブロネクサスからは検出されなかったことから、焦点接触部位における固 有成分といえる（ポーラーネン等、１９８８）。焦点接触部位のｕ−ＦＡはレセ プター結合している（ヘプールおよびベーカー、ｌ９８８）。焦点接触部位は、 いわゆるストレス線維またはアクチン・ケーブルである、アクチン含有マイクロ フィラメント管束の末端に位置する（ブリッジ、１９８６）。これらの部位は、 幾つかの構造成分（アクチン、タリノ）および調節因子（チロシンキナーゼ原始 腫ヨウ遺伝子生成物Ｐ６０ｓｒ０、Ｐ１２♂ａｇ−ａ５１、Ｐ９ｏｇａｇ−ｙ６ ｓ、ｇａｇ−ｙｅｓ Ｐ２Ｏ）を含み、それらは全て細胞質側に位置する（ブリッジ（１９８６）参照 ）。 細胞表面上のプラスミノーゲン結合部位プラスミノーゲンおよびプラスミンは、 血小板、内皮細胞および新生物に由来する幾つかの細胞型を含め、多くのをの培 養細胞に結合する（マイルズおよびプロー、１９８５、バジャー等、１９８６、 プロー等、１９８６、マイルズおよびプロー１９８７、パーチンおよびフォンダ ネチェ、１９８８）。結合は、プラスミノーゲンに対するかなり低い親和力（Ｋ 　１２Ｍ）で飽和可能である。少なくとも細胞タイプによっては、プラスミンの 結合はプラスミノーゲンと同じ部位を利用すると思われるが、プラスミンに関す る結合パラメーターは、プラスミノーゲンおよびプラスミンに関する複数タイプ の結合部位が存在し得ることを示している。すなわち、プラスミンおよびプラス ミノーゲンがほぼ等しい親和力で結合する細胞タイプもあれば（プロー等、１９ ８６）、明らかにプラスミンがプラスミノーゲンよりも高い親和力（Ｋ　５０ナ ノモル）で結合する細胞タイプもある（パーチンおよび７オンダネチエ１．４９ ８８）。この結合は、低量のリジンおよびリジン類縁体により阻止され、プラス ミノーゲンおよびプラスミンの重鎮のクリングル構造を含むと思われる（マイル ズ等、１９８８）。 結合能力は細胞タイプ間で変動し、多くの細胞タイプでは非常に高い（１細胞当 たり１０’−１０’結合部位）。結合部位の化学的性質は知られていない。膜蛋 白質Ｇ　Ｐ　Ｉｌｂ／　ｌ１ｌａは、血小板へのプラスミノーゲンの結合に関与 すると思われ（マイルズ等、１９８６）、特にトロンビン刺激血小板では、フィ ブリンもプラスミノーゲン結合に関与し得る（マイルズ等、１９８６）。その精 製形態において、血小板蛋白質トロンポスボンデインは、プラスミノーゲン・と 複合体を形成する（Ｋ　３５ナノモル）（シルバースタイン等、１９８４）。ま た、固定化ラミニン（サロネン等、１９８４）およびフィブロネクチン（サロネ ン等、１９８５）もプラスミノーゲンと結合する（それぞれに３ナノモルおよび ９０ナノモル）。 表面プラスミノーゲン活性化 ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの両方に結合する細胞タイプもある（プロー等 、１９８６、マイルズおよびプロー、１９８７、パーチンおよび７オンダネチエ 、１９８８、エリス等、１９８８）。 レセプター結合プローｕ−ＰＡは、プラスミンにより活性化され得（タペンス等 、１９８６）、少なくとも部分的に、レセプター結合２本鎖ｕ−ＰＡはプラスミ ノーゲン活性化能力を保持している（バッサーリ等、１９８５）。 両分子に対する結合部位をもつ細胞へｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンを加える と、細胞結合プラスミンが発生する（プロー等、１９８６、パーチンおよび７オ ンダネチエ、１９８８）。これらの試験によって、溶液中で行なわれる活性化プ ロセス間または表面結合反応体間の厳密な区別はできなかった。 ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの結合部位間の相互作用は、２つのセルライン におけるｕ−ＰＡ結合がプラスミノーゲンに対する高い結合能力を誘導するとい う発見により示唆されている。これらの試験におけるプラスミノーゲンの結合は 、ｕ−ＰＡに関する結合能力に全く影響を与えなかった（プロー等、１９８６） 。また、２つの試験で立証されたプラスミノーゲン結合部位は見たところ同一で はないが（上記参照）、プラスミノーゲンにより誘発されるｕ−ＰＡ結合性の向 上が、新生物由来のセルラインにおいてパーチンおよび７オンダネチエ（１９８ ８）により見出された。 最近、オツソブスキ−（１９８８）は、表面ｕ−ＰＡレセプターを有するが、ｕ −ＰＡを産生しないヒト腫よう細胞の（インビボ検定における修飾ひな胚しょう 尿膜への）侵入能力が、外因性ｕ−ＰＡでそれらのレセプターを飽和させること により増強され得るという発見を発表した。しかしながら、この発見は（著者の 意見では）暗示的なものにすぎず、それはレセプター自体への結合が必要である ことを立証してはいない。細胞に加えられｆ；ｕ−、ＰＡは、レセプターが結合 しているため侵襲性部位へ運ばれｔ；が、その活性化が行なわれる前にレセプタ ーから放出された可能性がある。さらに、この試験は２末鎖ｕ−ＰＡにより行な われたため、１本鎖形態の内在性ｕ−ＰＡを擬態することはない。また、オツソ ブスキーの試験では、ヒト加熱ショック・プロモーターの制御下でマウスｕ−Ｐ Ａ　ｑＤＮＡによりトランスフェクションされたヒト細胞におけるマウスｕ−Ｐ Ａの生産性が高くても侵襲性は高められないことが見出された。マウスｕ−ＰＡ はヒトｕ−ＰＡＲに結合しないが、公表されたデータは、このマウスｕ−ＦＡ作 用の欠如がこのレセプター結合の欠如に起因するということの証明になるとは考 えられ得ない。その理由としては、幾つかの他の説明、例えばｌ）マウスｕ−Ｐ Ａはヒトｕ−ＰＡはど有効にはチキン・プラスミノーゲンを活性化しない、２） このシステムには、１重鎖マウスｕ−ＰＡから２本鎖形態へ変換する機構が欠如 している、３）加熱ショックそのものが細胞の侵入能力を低下させる、４）加熱 ショック処理の後に、細胞の微環境を変える内植を行った場合、マウスｕ−ＰＡ の生産性は高められないといった説明が可能である。この試験において、ｕ−Ｐ Ａをそのレセプターから移動させる侵入性に対する作用を調べる試みは全く為さ れなかった。 エリス等（１９８９）は、最近、プラスミノーゲン活性化を誘導する反応が、１ 末鎖ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンをＵ９３７［１へ加えた場合に行なわれ得 ること、および、それらの反応が、プラスミノーゲンおよびプローｕ−ＰＡの両 方を表面に結合させた場合にさらに有効に行なわれることを示す証拠を発表した 。しかしながら、この実験は、血清の非存在下、すなわちエリス等が使用した製 品によるプラスミノーゲン活性化が同じく溶液中で行なわれる（エリス等、１９ ８７）条件下で行なわれた。これらの試験は、ｕ−ＰＡがレセプター結合してい ない場合に、関与するプロセス（例、２末鎖ｕ−ＰＡにより触媒されるプラスミ ノーゲン活性化）の一つまたはそれ以上が実際に行なわれる可能性を排除するも のではない。さらに、これらの試験は、他のグループ（パネルおよびギュアウィ ッチ、１９８７、ウラン等、１９８８、ベーターセン等、１９８８）により１末 鎖ｕ−ＰＡについて発見されたものよりもかなり高度に触媒活性を有する１末鎖 ｕ−ＰＡの精製製品を使用した。従って、エリスの製品は２末鎖ｕ−ＰＡにより 汚染され得るため、正常部位で細胞により産生された内在性１本鎖ｕ−ＰＡとは 明らかに異なり得る。 エリス等（１９８９）による実験では、レセプターに対する加えられた１末鎖ｕ −ＰＡの結合は、ｕ−ＰＡのアミノ末端７ラグメントと細胞のブレインキュベー ションにより阻止された。従って、これらの実験は、後記実施例と同様、この方 法の治療用途に関する先行条件である、内在的に産生されたｕ−ＰＡの転置を立 証していない。 発明の要旨 本発明は、インタクトな生物において細胞外的に存在する場合と類似した条件下 （すなわち、プラスミン阻害物質およびプラスミノーゲン活性化因子を含む血清 の存在下）、内在性ｕ−ＰＡにより開始されるプラスミノーゲン活性化が、純粋 なｕ−ＰＡレセプターが提供され、組換えＤＮＡ技術によりｕ−ＰＡレセプター またはその特有かつ貴重な配列またはその配列と似た配列が製造される可能性が 与えられ、ｕ−ＰＡがレセプター結合している場合にのみ行なわれるという発見 に基づくものである。これらの発見および開発に基づいて、新規で、潜在的に非 常に貴重な治療、予防および診断方法および生成物が、関連した基本的方法およ び生成物と一緒に、本発明により提供される。 プラスミノーゲンは細胞表面に結合し、驚くべきことに、細胞表面プラスミノー ゲン活性化の全部ではないとしても、大部分は表面結合ｕ−ＰＡにより触媒され 、表面へのプラスミンの結合はプローＵ−ＦＡの活性化に必要であることが判っ た。プラスミノーゲンの非存在下では、細胞表面ｕ−ＰＡの大部分はその１本鎖 プロ酵素形［（プローｕ−ＰＡ）に存在するが、プラスミノーゲンを加えると、 レセプター結合２本鎖ｕ−ＰＡの形成が誘導される。後者の反応は細胞結合プラ スミンにより触媒される。レセプター結合ｕ−ＰＡは内在性ＦＡ　Ｉ　−１およ び加えられたＦＡＩ−２による阻害の影響をうけ得るが、細胞結合プラスミンは 血清阻害物質に接近できない。 細胞へのプラスミノーゲン結合後、痕跡量の結合活性ｕ−ＰＡによるプラスミノ ーゲン活性化が行なわれることにより、結合プラスミンが形成され、今度はそれ が結合プローｕ−ＰＡからさらに活性の高いｕ−ＰＡの生成に利用される、細胞 表面プラスミノーゲン活性化モデルが作成され得る。この指数関数的プロセスは 、内在性ＦＡＩ−１による調節に付され、細胞周囲空間に制限される。 新しい発見には、プラスミノーゲンの結合に関する血清の存在下での必要条件、 これらの条件下における結合ｕ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能力、細胞上に おけるプローｕ−ＰＡの存在、結合プラスミンのプローｕ−ＰＡ活性化能力、お よび内在性プラスミノーゲン活性化因子阻害物質ＦＡＩ−１および加えられたプ ラスミノーゲン活性化因子阻害物質ＦＡＩ−２の表面プラスミノーゲン活性化調 節能力が含まれる。これらの意味によると、腫よう細胞は、血清プロテアーゼ阻 害物質により不活化から保護された形で表面に結合し、細胞周囲マトリックスの 分解における使用にとって理想的に位置した、プラスミンの広範囲な蛋白質分解 活性を獲得し得る。 ｕ−ＰＡがそのレセプターへ結合すると、ｕ−ＰＡは細胞表面に対して局在する だけでなく、それは少なくともある種の細胞タイプにおいては細胞−細胞および 細胞−培養基盤接触部位である表面の独特の部分へ集中する。焦点接触部位にお けるプローｕ−ＰＡの位置は、ｕ−ＰＡ触触媒プラスミノーゲン活性化、例えば 細胞移動中における接触部位の分解に関与していることを示す。これらの部位に おけるプローｕ−ＰＡの選択的活性化は、指向性細胞周囲蛋白質分解を達成する 手段を提供する。プローｕ−ＰＡ活性化は、細胞内で開始され、ｕ−ＰＡレセプ ターを通って経膜的シグナルにより伝達され得る。 ヒト騰よう細胞は、ごく一般的にウロキナーゼ整のプラス与ノーゲン活性化因子 （ｕ−ＰＡ）を分泌することが見出されている。この意味によると、それらは、 血清および他の体液中高濃度のプラスミノーゲンにおいて利用可能な蛋白質分解 能を増強させることができる。騰よう細胞の侵襲特性は、少なくとも部分的には プラスミンの広スペクトルの活性により伝達され、他の潜在プロテアーゼ、例え ばコラゲナーゼの活性化における間接的作用を含むそれらの蛋白質分解能に左右 され得る。腫よう細胞によりプロテアーゼ活性が発現されると、基底膜、毛管壁 および間質結合組織への貫通が容易になることにより、他の部位へ拡散し、転移 が確立される。 細胞移動に連動した細胞周囲蛋白質分解の段階的経路は予見され得る。細胞表面 へのｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの結合により、細胞外蛋白質分解および細 胞−細胞および細胞−培養基盤結合の局所切断が誘導される。従って、細胞のこ の領域は自由に移動し、これはＰＡｌｌが存在する領域へｕ−ＰＡを転移させる 。ＦＡＩ−１はｕ−ＰＡを不活化し、局所蛋白質分解活性の非存在下、細胞はマ トリックスと新たな結合を形成する。これは、さらに移動するのに要求されるプ ロセスである。 ｕ−ＰＡＡ伝子の発現は、細胞生長に影響する様々な薬剤により細かく調節され る。しかしながら、最近になるまでｕ−ＰＡＲＡ能および合成の調節については ほとんど知られていなかった。ｕ−ＰＡレセプターの親和力は、例えば腫ようプ ロモーターＰＭＡにより修飾され得ることが知られている。これは、細胞がｕ− ＰＡ：ｕ−ＰＡＲＡ互作用を変調する機構を賦与されていることを示す。この相 互作用はレセプター自体のレベルで作用すると思われ、プラスミノーゲン活性化 因子阻害物質の作用は、変調の第２レベル、すなわち活性リガンド自体のレベル で示される。２つのレベルの調節が現実に相互連結され得ること、すなわち、表 面結合ｕ−ＰＡへの阻害物　。 質の結合がレセプターの親和力に影響する可能性がある。 親和力の変動は、可溶性および表面結合ｕ−ＰＡ間の割合を修飾、すなわちｕ− ＰＡの位置を調節し得る調節機構である。ｕ−ＰＡＲの合成および親和力に対す る作用は、通常具なる細胞または同じ細胞で行なわれるが、異なる刺激に応答す る可能性がある。親和力調節機構に関する生理学的シグナルは、細胞表面におけ るｕ−ＰＡ活性のレベルおよび恐らくは局在性と連結され得る。 ｕ−ＰＡレセプターにおけるＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡＡ合体の形成後、複合体の少 なくともｕ−ＰＡ部分が内面化および分解され、すなわち細胞表面からのｕ−Ｐ Ａ活性の新たな排除方法が示される。実施例８の結果は、ｕ−ＰＡレセプターま Ｉ；はＦＡＩ−１および／またはＰＡＩ−２阻害物質への結合が遮断された結果 、治療的に投与されｔ；プローｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの半減期が当然増加し、 すなわち治療有効用量が低減化され得ることを示す。 ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの相互作用についてさらに特性確認するタメ、ｕ−Ｐ ＡＲの精製が必要であった。単核白血球様細胞Ｕ９３７により産生されるｕ−Ｐ ＡＲの数は、ホルボールエステル、例えばＰＭＡにより数倍に増加し得る。この 事実を用いて、充分な量の精製用レセプターを製造した。実施例１では、細胞か らのデタージエント抽出物の温度誘導相分離および固定ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡｊ ：よるアフィニティー・クロマトグラフィーを含め、ｕ−ＦＡレセプターの完全 な精製方法が記載されている。この結果、負荷がレセプター約ｌμｇである、５ ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色後に約５５−６０ｋＤで一つのバンドを示す製品が 得られた。 精製蛋白質は化学的にｕ−ＰＡと交差結合し得る。そのアミノ酸組成およびＮ− 末端配列が決定された（３０残基、それらのうちある程度不離かなものもある） 。それは重度にＮ−グリコジル化されていることが見出され、脱グリコジル化の 結果、約３Ｏ−３５ｋＤの見かけ上の分子量を有する蛋白質が生じた。異なるセ ルラインおよびＰＭＡ−刺激および非刺激Ｕ９３７細胞由来のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ の見かけ上の分子量は幾分変化した。この不均一性は脱グリコジル化後に消失し たため、様々な供給源から得られたｕ−ＰＡＲのグリコジル化における差異によ るものであった。 同じレセプターの幾つかの変異体の存在は、は乳類細胞ではむしろ一般的である と思われる。実施例１で立証されたｕ−ＰＡＲ分子の変調は、細胞移動および侵 襲性の中心にあるプロセスである、細胞外蛋白質分解の調節、すなわち細胞外マ トリックスおよび基底膜成分の分解における重要な特徴を表し得る。相異なる細 胞タイプが、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの蛋白質部分が異なる方法でグリコジル化されて いる相異なる種類のレセプターを有する場合、局在した蛋白質分解活性の阻害に 必要とされる細胞タイプを区別することが可能であり、それは、癌細胞が、正常 細胞のｕ−ＰＡＲのグリコジル化とはかなり異なる方法でグリコジル化されたｕ −ＰＡＲを産生するときに特に貴重であり、例えばｕ−ＰＡＲ抗体により区別さ れ得る。 実施例２では、ｕ−ＰＡＲのリガンド結合ドメインの単離が同定および特性検定 された。これは、リガンド結合を阻止し得るペプチドに関する潜在的に治療上貴 重な情報を提供する。 実施例３で詳細に説明されている通り、ｕ−ＰＡレセプターのｍＲＮＡのｃＤＮ Ａコピーのクローニングにより、完全ｕ−ＰＡＲ分子の一次構造の特性確認が達 成された。 誘導されたアミノ酸配列は、ｕ−ＰＡＲが、２８２残基長親木性Ｎ末端部分（恐 らくは細胞外）、次いで２１個のかなり疎水性のアミノ酸（恐らくは経膜的ドメ イン）を伴う３１３残基長蛋白質として生成されることを示した。潜在的細胞外 部分は、特にシスティンのパターンに関して著しい相同性を有する３反復単位で 組織される。これは、異なるリガンドに結合し得る別個のドメインの存在を示し 得る。 レセプター精製およびｃＤＮＡクローニングにより、ｕ−ＰＡＲが少なくとも場 合によっては、末端プロセッシングされ、糖脂質アンカーにより細胞表面に固定 されること、および表面位置は、ホスホリピダーゼＡ２およびＤによってではな く、ホスホリピダーゼＰＩ−ＰＬＯにより調節され得ることが認識され得た（実 施例４）。さらに、処置されなかった細胞からの採取流体もまたある程度遊離Ｕ −ＰＡＲを含むことが見出され、このことは、内在性ホスホリピダーゼにより仲 介され得る細胞からの放出を示した。これは生理学的機構であり得、例えば血清 中における遊離レセプターの測定結果が何等かの病的プロセスの診断上貴重な指 標であり得る可能性がある。 ｕ−ＰＡＲｃＤＮＡを用いることにより、ｕ−ＰＡＲ＋ｍＲＮＡは、細胞タイプ によっては例えばＰＭＡ、デクサメタゾーン、ＩＩＩＥＧＦおよびＴＧＦ−β− １といった物質により調節され得ることが示された（実施例５）。これらの発見 は、これらおよび類似物質がｕ−ＰＡＲ合成の調節において治療上有用であり得 ることを示す。 さらに、ｕ−ＰＡＲｃＤＮＡを用いることにより、正常部位ハイブリダイゼーシ ョンによる組織片からのｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの検出に有用であることが判ったｕ 　−Ｐ　Ａ　ＲアンチセンスｍＲＮＡの７ラグメントを製造した。特に興味深い のは、ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡが、ヒト結腸癌腫に一貫して存在し、腫ようの侵襲正 面にある細胞に位置するという発見であり、すなわち、これらの細胞によるｕ　 −Ｐ　Ａ　Ｒの産生およびこれらの部位でのｕ−ＰＡの位置選定におけるｕ−Ｐ ＡＲの役割を示す。 実施例７では、血清含有層地中精製天然ヒトプラスミノーゲンとヒトＨＴ−１０ ８０線維肉腫細胞の単層培養物とのインキュページ璽ン後、結合プラスミン活性 が、リジン類縁体であるトラネキサム酸により細胞から溶離され得ることが示さ れている。結合プラスミンは、細胞表面におけるプラスミノーゲン活性化の結果 である。血清含有培地へプラスミンを慎重に加えた後、プラスミン活性が細胞へ 吸収されることはない。細胞表面プラスミン形成は、ｕ−ＦＡに対する抗触媒性 モノクローナル抗体により阻害され、これはこの酵素が活性化に関与することを 示している。 線維肉腫細胞により分泌され、細胞表面に存在するｕ−ＰＡの大多数は１末鎖プ ロ酵素形態であった。天然プラスミノーゲンを加えた後、結合ｕ−ＰＡは２本鎖 形態であることが見出された。これはプラスミンにより触媒されることが知られ ている反応である。しかしながら、血清培養条件下、大過剰のプラスミン阻害物 質の存在下では、細胞表面へのプラスミノーゲンおよびその活性化産物（プラス ミン）の結合は、２末鎖ｕ−ＰＡの形成に関する先行条件であった。 プローｕ−ＰＡの活性化は、それが実際に表面結合しているときに行なわれると 思われる。しかしながら、細胞結合プラスミンは細胞の直接環境においてプロー ｕ−ＰＡを活性化し、続いて形成されたＵ−ＰＡは結合プローｕ−ＰＡと交換さ れ得ることが考えられる。 プラスミンの結合および後続の保護は、低濃度のリジン類縁体、トラネキサム酸 により破壊された。従って、グラスミン結合は、プラスミンの重鎮クリングルに 位置するリジン親和部位を必要とする。 細胞から放出されたプラスミンは、血清培地中で部分的に不活化された。プラス ミンが結合状態である間、それは血清阻害物質から保護されたが、アプロチニン または抗触媒性モノクローナル抗体により阻害され得た。 この結果は、ある種の治療適用、例えば角膜潰ようの治癒促進におけるアプロチ ニンの有効性に関する可能な説明を提供する。プラスミンはこの状態で生成され ることが示されたが、依然としてそれが血清阻害物質により不活化されることは 予想される。しかしながら、重要なフラクションが細胞に結合している場合、こ れは、有効な阻害物質が外部適用されるまで、阻害を免れ、組織治癒の進展を遅 らせ得る。 血清培地におけるプラスミン取り込みおよび放出による実験は、細胞から培地へ の（この逆はあり得ない）プラスミン活性の一方向移動の存在を明らかに確立し た。プラスミノーゲンの天然製品を加えずに細胞を血清培地中で生長させたとき 、プラスミン形成は検出されなかった。 実施例７では、細胞とＤＦＰ−インキュベーションｕ−ＰＡとのプレインキュベ ージ１ンにより、表面結合プラスミンの減少が誘導されることが示されており、 これは、細胞表面プラスミノーゲン活性化の全部ではなくても大部分が表面結合 ｕ−ＰＡにより触媒されたことを示す。 細胞によって、例えばＵ９３７細胞では、プラスミノーゲン活性化因子活性は、 外因性ｕ−ＰＡの添加に大きく左右される。実施例８では、ｕ−ＰＡを結合段階 で投与し、次いで細胞を洗浄し、検定する。活性は、レセプター結合ｕ−ＰＡア ンタゴニスト、例えば合成ペプチドおよびＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡにより競合され 得、ＦＡＩ−１の添加により阻害され得る。すなわち、ＦＡＩ−１はまた、Ｕ９ ３７細胞においてレセプター結合ｕ−ＰＡに結合し、その活性を阻害する。 また実施例８は、ＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体が遊離ｕ−ＰＡと同じ特異性およ び親和力によりＵ９３７細胞のレセプターと結合することを示している。ＦＡＩ −１は、Ｕ９３７細胞上のレセプターにおいて予め結合したｕ−ＰＡとも相互作 用し得る。この結果、検出可能な形では内面化されていない典型的な共有結合Ｆ ＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体が形成され、ｕ−ＰＡ活性が阻害される。複合体化ｕ 　−ＰＡの親和力は遊離ｕ　−Ｐ　Ａと比べて僅かに減少している。可能なこと として、巨大なＦＡＩ−１分子の存在は、立体障害の問題を提起し得る。 実施例８では、さらに、ｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−１複合体がＵ９３７細胞に結合して いるとき、それらは続いて分解および内面化されることが示されている。 実施例９では、ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２はレセプター結合Ｕ−ＰＡをかなり 急速に阻害するが、各会合比定数は溶液中におけるｕ−ＦＡの阻害に関する場合 よりも低いことが示されている。 さらに、可溶化（実施例１０）または精製（実施例１３）ｕ−ＰＡＲへのｕ−Ｐ Ａの結合は、ｕ−ＰＡがプラスミノーゲンの表面結合と同時に細胞表面上のｕ− ＰＡＲに結合している場合に観察される活性の刺激とは対照的に、ｕ−ＰＡのも つ溶液中でのプラスミノーゲン活性化能力を阻害することが立証されている。ま た、精製ｕ−ＰＡＲは、溶液中におけるプラスミン触媒プローｕ−ＰＡ活性化を 阻害する（！ｌ！施例１３）。ｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化を細胞表面 のレセプター結合部位に限定する重要な調節的生物機構に対する指摘に加えて、 これらの発見は、可溶化ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒまたはその誘導体が、ｕ−ＰＡ活性の 阻害に関する貴重な治療試薬であることが判明し得ることを示している。 ポリクローナル抗体は、精製ｕ−ＰＡＲによるマウスの免疫化により開発された （実施例１１）。これらの抗体は用量依存方式で１．ｓ■標識精製ｕ−ＰＡＲを 沈澱させ、重要な沈澱は１　ニア　５００の希釈率での抗血清により得られた。 逆相放射線免疫検定法では、抗血清は放射性標識ｕ−ＰＡＲを免疫捕獲すること が見出され、ＥＬＩＳＡでは、ｌｏｇの量の固定化ｕ−ＰＡＲが１　：８０００ に希釈した免疫血清により検出された。ウェスタン・プロッティングによると、 抗体は、精製ｕ−ＰＡＲおよびＰＭＡ処理Ｕ９３７細胞抽出物の粗デタージェン ト相におけるｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの両方を検出した。後者の場合、ｕ　−Ｐ　Ａ　 Ｒとは異なる電気泳動移動度を有する蛋白質との反応が検出され、抗体の高度特 異性を示していた。実施例はまた、抗体産生用ハイブリドーマのスクリーニング に関する上述の方法を用いたモノクローナル抗体の開発方法の記載を含む。 さらに、実施例１１は、ｕ−ＰＡＲに対する抗体を用いることにより、リガンド 結合を特異的に阻止し得ることを報告している。さらに、ｕ−ＰＡＲ抗体は、ｕ −ＰＡ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止することが示されている（５ Ｉ！施例１０）。これらまたは類似抗体を用いても、潜在的転移性腫よう細胞の 破壊を目的として細菌性または植物性毒素を特異的に標的とすることができる。 実施例１２では、ビオチニル化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡを使用し、次いでストレプト アビジン−フルオレシン・インチオシアナートとインキュページ璽ンする、細胞 および組織片におけるｕ−ＰＡＲの可視化方法が記載されている。この方法は非 常に高感度であり、その特異性は、（例、ｕ−ＰＡ（ＡＴＦ）、ｔ−ＰＡ、ＥＧ Ｆ等のアミノ末端フラグメントとの）きっ抗実験により容易に試験され得る。 本発見に基づいて、本発明は、局在した蛋白質分解活性、例えば癌細胞の侵襲性 および転移、炎症性腸疾患、前癌状態の結腸腺腫、敗血性関節炎、骨関節炎、リ ューマチ様関節炎（過剰ｕ−ＰＡ生産の直接関与が立証されている）、オステオ ポローシス、コレステリン騰よう並びに過剰のプラスミノーゲン活性化が病因で あることが示された若干の皮膚および角膜疾患、例えば角膜潰よう、角膜炎、表 皮水はう症、乾せんおよび天ぼうそうの治療的予防に関して生理学的機能のいず れかを阻害する手段としてｕ−ＰＡのレセプター結合の阻害を提供する。ｕ−Ｐ Ａレセプターは幾つかの血液および内皮細胞に存在するため、それらの調節はま た、生理学的、病理学的および薬理学的状態における血管内線維溶解活性に重要 な影響を与え得る。上述の疾患は、細胞表面プラスミノーゲン活性化を遮断また は低減化する物質の投与に基づく治療にとって第一の明確な標的となる。受精卵 の着床におけるｕ−ＦＡの役割故に、レセプター結合を阻害する手段から避妊効 果が期待される。治療および予防は、例えば下記で説明されている、レセプター 結合プラスミノーゲン活性化因子活性を遮断または低減化する薬剤による全身的 または局所的処置を含む。 本発明はまた、診断または研究用の貴重な試薬および方法、例えば下記で説明さ れている化学的、生物学的または合成手段により得られる、例えばｕ−ＰＡレセ プター（ｕ−ＰＡＲ）、ｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ１抗ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ抗体およびｕ −ＰＡアンタゴニスト、例えば修飾Ｕ−ＰＡおよびプローｕ−ＰＡ分子を特徴す る請求の範囲を含む本明細書は主としてウロキナーゼ梨プラスミノーゲン活性化 因子（ｕ−ＰＡ）に関するものであるが、同じ方法が組織をプラスミノーゲン活 性化因子（ｔ−ＦＡ）についても使用され得、当然使用されることは明らかであ る。ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡは、両方とも血栓塞栓治療で広範に使用されている 。ｕ−ＰＡ／１−ＰＡレセプター並びにこれらのレセプターに対するｕ−ＰＡ／ １−ＰＡの結合および／または内面化および分解を阻止する薬剤の同定法を開発 することによって、心臓血管系においてレセプターへの物質の結合を阻止または 低減化する薬剤と一緒に物質を投与することによ）′セ与物質の半減期を増加さ せ、従って用量およびそれらの副作用を低減化することができる。 発明の詳細な開示 一態様において、本発明は、は乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性 の阻止または打ち消し方法であって、は乳類においてｕ−ＰＡレセプター（ｕ− ＰＡＲ）へのｕ−ＰＡの結合またはそのレセプター結合形態の特異的分解の誘導 を阻止することによるプラスミノーゲンからプラスミンへの活性化阻止を含む方 法に関するものである。 請求の範囲を含む本明細書において、「局在した蛋白質分解活性」という語は、 実質的に体内のあらゆる場所で作用する全体的蛋白質分解活性とは反対に、人体 の一つまたは幾つかの別個の領域または別個の細胞に位置する蛋白質分解活性を 指すものとする。局在した蛋白質分解活性は、は乳類、特にヒトでは広範に、ま たは局所的に阻害され得る。「阻止または打ち消す」という語は、ｕ−ＰＡＲへ のＵ−ＰＡの結合が完全に阻止されている状況、または結合が充分に阻害されて いることによりプラスミノーゲン活性化因子の望ましくない作用が阻止される状 況を指すものとする。「特異的分解を誘導する」という語は、ｕ−ＰＡのレセプ ター結合形態が特異的方法で分解される、例えば、特異的分解がＦＡ　Ｉ　−１ を加えることにより誘導される実施例８に記載された形で内面化されるプロセス を指すものとする。 この前後関係において、ｒｕ−ＰＡのレセプター結合形態」という語は、ｕ−Ｐ ＡＲでの部位へ結合する部位を有するｕ−ＰＡのあらゆる形態を包含し、すなわ ちｕ−ＰＡがｕ−ＰＡＲ結合部位を含むことを意味するものとする。すなわち、 ｕ−ＰＡのレセプター結合形態は、プローｕ−Ｐ　Ａｓ　ｕ−Ｐ　Ａ％　ｕ　Ｐ 　Ａのアミノ末端フラグメント、例えばジイソプロピルフルオロホスフェート（ ＤＦＰ）、ｐ−ニトロフェニル−ｐ″−グアニジノベンゾエート（ＮＰＧＢ）ま たは他の阻害物質もしくはｕ−ＰＡＲに結合し得るｕ−ＰＡの他の修飾形態によ り不可逆的に阻害されるｕ−ＰＡであり得る。 ｒｕ　−Ｐ　Ａ　ＲＪという語の使用は、ある種類におけるｕ−ＰＡＲのポリペ プチド部分が全ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒについて同じであり得ても、例えばＵ−ＰＡＲ の炭水化物部分または表面結合機構が異なり得るため、複数のｕ−ＰＡＲが存在 することを示す。非病的細胞のｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合に影響を及ぼすこ となく癌細胞に存在するｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒへのｕ−ＰＡの結合を遮断するか、ま たはｕ−ＰＡＲを発現する癌細胞を特異的に殺すことは可能であり得るため、あ る種の細胞、例えば癌細胞が、重要な治療的意義を有し得る実質的に異なるｕ− ＰＡＲを有することさえ同様にあり得る。 酵素ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）は、唯一の充分に 規定された巨大分子基質、すなわちプラスミノーゲンを有する。Ａｒｇ”’での 開裂により、プラスミノーゲンは、広スペクトルのプロテアーゼ・プラスミンに 活性化される。従って、［Ｕ−ＦＡがプラスミノーゲンからプラスミンへの変換 するのを阻止する」という語は、ｕ−ＰＡによるこの活性化が実質的に阻害され ること、または活性化が充分に阻害されることによりプラスミンの望ましくない 作用を阻止または低減化し得る状況を意味する。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止は、例えば、 好適にはｕ−ＰＡＲへ結合する物質をは乳類へ投与することにより、ｕ−ＰＡの レセプター結合形態が通常結合するレセプターの部位を占領することによってｕ −ＰＡＲを遮断することにより行なわれ、上記物質は、レセプターに対するｕ− ＦＡのレセプター結合形態の結合を低減化するのに有効な量で投与される。この 状況において、ｒｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを遮断する」という語は、プラスミノーゲン からプラスミンへ活性化させ得ない物質を、好ましくは実質的に不可逆的な結合 によってｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合させることにより、ｕ−ＰＡのレセプター結合 形態がプラスミノーゲンからプラスミンへの変換を触媒するのを阻止することを 意味する。ｒｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒへの結合によりｕ−ＰＡのレセプター結合形態が 通常結合するレセプターの部位を占領する」という語は、物質がｕ−ＰＡＲへ結 合する結果、ｕ−ＰＡのレセプター結合形態がｕ−ＰＡＲへ結合され得ないこと を意味するものとする。 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止は、は乳類に対し、 ｕ−ＰＡＲへの結合能を保持してはいるが、グラスミノーゲンからプラスミンへ 変換し得ないｕ−ＰＡの修飾形態を投与することにより行なわれ得る。ｕ−ＰＡ の上記修飾形態の重要な例は、実質的に不可逆的な阻害物質、すなわち実質的に 不可逆的な結合により触媒活性部位へ結合する物質により触媒活性部位が阻害さ れたｕ−ＰＡである。若干の若干阻害物質は公知であり、不可逆的阻害物質の一 例はジイソプロピルフルオロホス７エートでアル（コの阻害物質により阻害され たｕ−ＰＡをＤＦＰ−ｕ−ＰＡと呼ぶ）。 特に興味深いのは、ｕ−ＰＡのレセプター結合を阻止するためのＵ−ＰＡおよび ＰＡＩ−１間の複合体の投与である。これらの複合体は、ｕ−ＰＡＲへ結合する だけでなく（実施例８）、複合体（および同じく恐らくはｕ−ＰＡＲ）の内面化 を誘発する。すなわち、それらが示すｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒのｕ−ＰＡ結合能力の不 活化は、不可逆的であるという特徴を有する。実施例８および９に記載された発 見は、ｕ−ＰＡ−ＦＡＩ−２複合体が似た効果および有用性を有するという予想 に対して充分な根拠を示している。 また、ｕ−ＰＡの修飾形態は、抗体をその触媒活性部位領域へ結合させることに より得られる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得 、下記でさらに詳述されている要領で製造され得る。 ｕ−ＰＡの別の有用な修飾形態は、ｕ−ＰＡのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ −ｕ−ＰＡ）である（ストツペーり等、１９８５参照）。 また、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止は、ｕ−ＰＡ Ｒへ結合するｕ−ＰＡの部位と同一または実質的に同一の配列を含む物質を投与 することにより行なわれ得る。上記物質は、例えばｕ−ＰＡアミノ残基１２−３ ２のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ結合部位と同一または実質的に同一の配列を含む分子であ り得、これはｕ−ＰＡのレセプター結合に関与することが知られている。 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合を阻止する別の方法は、は 乳類に対してｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒまたはそのｕ−ＰＡ結合修飾形態を投与し、その 結果ｕ−Ｐ入の細胞レセプター結合部位を占領することにより、ｕ−ＰＡのレセ プター結合形態が細胞結合レセプターへ結合するのを阻止する方法である。通常 、完全なｕ−ＰＡＲではなく、その水溶性形態、言い替えればｕ−ＦＡ結合配列 を含むその一部分を投与する方が好ましい。上記部分は、ヒトｕ−ＰＡＲｃＤＮ Ａを含むプラスミド・ベクターのｃＤＮＡ配列の一部分を除去することによる大 きい配列の先端切除により作成されることが多い（実施例３参照）。特に興味深 いのは、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒが、例えば実施例４で示されたリパーゼによるグリセ リン−ホスホイノシトール・アンカーの除去により可溶化され得るという発見で ある。ｕ−ＰＡＲの可溶性形態、例えば上述の先端切除形態はまた、それらが化 学的方法または組換えＤＮＡ方法によりプラスミノーゲン活性化因子阻害物質１ 型（ＦＡＩ−１）または２塁（ＦＡＩ−２）へ結合され得、その結果、レセプタ ー遮断またはリガンド遮断またはそれら両方を含む興味深い二重効果が得られる という点で有用である。 また、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻害は、ｕ−ＰＡ Ｒへの結合能を保持してはいるが、ｕ−ＰＡへ変換され得ないプローｕ−ＰＡの 修飾形態を投与することにより達成され得る。一般的には、プローｕ−ＰＡの上 記修飾形態は、プラスミンにより通常開裂可能なｕ−ＰＡの配列が改変された結 果ｕ−ＰＡがプラスミンにより開裂不可能になった形態である。これの−例は、 部位突然変異誘発によりＬｙｓ１８１１がＧｌｕまたはＧｌｙによって置換され たプローｕ−ＰＡである。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合を阻止することによ って細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する非常に興味深い方法は、例えば 実施例１１（結合の阻止）および実施例１０（細胞表面プラスミノーゲン活性化 の阻害）で立証されたｕ−ＰＡＲに対する抗体の使用である。抗体は、好ましく は高い特異性を有するポリクローナル抗体、例えば実施例１１で説明された抗体 、またはモノクローナル抗体であり得る。抗体はｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの非炭水化物 部分と反応する抗体であり得るか、またはそれはｕ−ＰＡＲの炭水化物部分と反 応する抗体であり得、後者は、ｕ−ＰＡＲの独特の変異体を発現する細胞が望ま しくない蛋白質分解に関与する細胞である標的細胞間の貴重な区別を可能にし得 る。抗体は、下記の様々な方法で投与され得る。 は乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻害まｔこ

【よ打ち消しに 関する別のストラテジーは、プラスミノーゲンの活性イヒ阻害に充分な量でプラ スミノーゲン活性化因子阻害物質をＣ１乳類へ投与することによって、ｕ−ＰＡ のレセプター結合形態の活性を実質的に低減化することによりプラスミノーゲン カ萌プラスミンへの活性化を阻止することを含む。プラスミノーゲン活性化因子 阻害物質は、本発明に従い、同じくそれがレセプター結合してしする場合にｕ− ＰＡを阻害することが見出されたＦＡＩ−１また４よＦＡＩ−２であり得る。 は乳類、特にヒトにおいて局在した蛋白質分解活性を阻止また（ま打ち消す別の ストラテジーは、例えば、特異的阻害物質の投与またはホルモン（エストロゲン 、グルココルチコイド、ポリペプチドホルモン）、サイトカイン（インターロイ キン、インターフェロン、ＴＮＦ）または成長因子（ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧ Ｆ−２、ＰＤＧＦ。 ＦＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ）およびＦＡＩ−１合成を誘導する他の因子による ＦＡＩ−１合成の増強によりその活性を遮断することによって、ｕ−ＰＡ分解お よび内面化を誘発することにより、レセプター結合ｕ−ＰＡの選択的内面化を誘 導することを含む。 細胞内ｕ−ＰＡ分解を誘導する別のストラテジーは、他のレセプターにおいてダ イマー化が内面化に関与すると思われるため、レセプターのダイマー化を誘導す る（例、ＦＡＩ−１ダイマー）化合物の投与により構成される。 局在した蛋白質分解活性を阻止または打ち消す別のストラテジーは、グリセリン −ホスホイノシトール・アンカーを破壊する薬剤、例えばホスホリパーゼ、例え ば実施例４記載のＰＩ−ＰＬＣを用いた処理による細胞表面からのｕ−ＰＡＲの 除去である。この薬剤は、好ましくは局所投与される。 は乳類、特にヒトにおいて局在した蛋白質分解活性を阻止または打ち消すさらに 別のストラテジーは、は乳類におけるｕ−ＰＡＲの修飾により（例、ホルボール エステルＰＭＡまたはＥＧＦ処理により）ｕ　−Ｐ　Ａ／ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの結 合親和力を改変することによって、Ｕ−ＰＡがプラスミノーゲンからプラスミン へ変換するのを阻止することによる、プラスミノーゲンからプラスミンへの活性 化の阻害を含む。 細胞周囲流体中断定濃度のｕ−ＰＡでは、親和力が低減化することによって、結 合ｕ−ＰＡ分子の数も減少し、従って蛋白質分解活性も減少するため、結合親和 力の最も有効な改変は、結合親和力の低減化であると考えられている。結合親和 力の低減化は、ホルモン、成長因子（例えば表皮成長因子［Ｅ　Ｇ　Ｆ　］）ま たはササイトカイから成る群から選択された物質を投与することにより達成され 得る。 また、レセプター結合ｕ−ＦＡのＦＡＩ−１誘導内面化を利用して、細菌性また は植物性毒素へ（化学的または遺伝学的方法により）共有結合しているＦＡＩ− １誘導体を投与することにより腫よう細胞を選択的に殺すことができる。ｕ−Ｐ Ａ−ＰＡＩＬ毒素複合体が内面化されると、細胞は毒素の作用により選択的に殺 される。 疾患の中には、ｕ−ＰＡＲの最減少または機能障害に関連したものもあると思わ れる。これらは、創傷治癒障害の症例および同じく血栓塞栓疾患の症例を含み得 る。ある条件下での血栓溶解におけるｕ−ＰＡ（従って、恐らく同じ（ｕ−ＰＡ Ｒ）の役割は、急性炎症中および癌においてｕ−ＰＡが内皮細胞に存在するとい う本発明発明者による発見により示唆されている。正常条件下では、内皮細胞は 、ｕ−ＰＡではなくｔ−ＦＡを含む。さらに興味深いのは、激発性夜間ヘモグロ ビン尿症という疾患がグリセリン−ホスホイノシトール・アンカーの形成能力の 障害と関連していること、およびこの疾患は血栓塞栓疾患を伴うことが多いこと である（セルバラージ、１９８８およびそこに引用された参考文献参照）。従っ て、本発明によると、治療効果は、ｕ−ＰＡＲまたはｕ−ＰＡＲ機能を有するそ の誘導体を投与するか、またはｕ−ＰＡＲｃＤＮＡまたはその変異体によるトラ ンスフェクションによって機能的に完全なｕ　−Ｐ　Ａ　ＲまたはＵ−ＰＡＲ機 能を有するその誘導体の産生能力を患者の細胞に付与することにより達成され得 ると予測される。別法として、ｕ−ＰＡＲの合成は、実施例５記載の発見が示す 通り、様々なホルモン、成長因子またはサイトカイン、例えばデクサメタゾーン 、ｍＥＧＦおよびＴＧＦ−β−１の投与により増強され得る。 ｕ−ＰＡＲ，可溶化ｕ−ＰＡＲおよびその変異体の完全に異なる、潜在的に治療 上非常に貴重な適用は、溶液中におけるｕ−ＰＡ触触媒プラスミーゲン活性化の 阻害物質としてである。現在既知のプラスミノーゲン活性化因子の特異的阻害物 質、すなわちＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２は、ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡの両方を 阻害する。精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒおよびグリセリン−ホスホイノシトール・アン カーの除去により可溶化されたｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒは、実施例１０および１３で立 証された通り溶液中でｕ−ＰＡを阻害する。すなわち、ｕ−ＰＡＲは、Ｕ−ＰＡ の特異的阻害が必要とされる場合、ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２よりもさらに有 利であると予測される。また、潜在的に非常に貴重なのは、活性２本鎖ｕ−ＰＡ への事実上不活性な１末鎖プローＵ−ＰＡ分子の活性化阻害に関するｕ−ＰＡＲ ，可溶化ｕ−ＰＡＲおよびその変異体の治療用途である。 ｕ−ＰＡＲの細胞外部分がかなりの相互相同性を伴う３反復単位により構成され るという発見（実施例３）から、それが相異なるリガンドに結合し得る、すなわ ち、立証されたｕ−ＰＡの結合に加えて、それが他のリガンドとも結合し得るこ とが予想される。実施例７に記載されている通り、強い増強効果が細胞表面に対 するｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの同時結合により得られるため、当然、こ れらの中にはまだ未知のプラスミノーゲン・レセプターまたはプラスミノーゲン 結合部位を含み得るものもあることが仮定される。また、ｕ−ＰＡＲに関する潜 在的代替的リガンドは、細胞−細胞および焦点細胞−培養基盤接触部位に位置す る蛋白質であり得、それは、細胞盤によっては、これらの部位にレセプター結合 ｕ−ＰＡが優先的に位置する場合もあるためである。上記リガンドの結合を阻害 するＵ−ＰＡＲの変異体または一部分は、細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻 害において貴重であり得、上記リガンドへのｕ−ＰＡＲの結合の阻止は、広範囲 の疾患において機能的に重要かつ治療上貴重であり得る。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒは、様々な形態、例えば実施例１記載のグリコジル化変異体、 実施例４記載の発見により示唆されているリパーゼＰｌ−ＰＬＯに対して異なる 感受性を示す変異体、および各々実施例１０に記載されたＰＭＡ刺激およびＰＭ Ａ非刺激Ｕ９３７細胞において見出される細胞表面プラスミノーゲン活性化を刺 激し得ない変異体で存在する。ｕ−ＰＡＲＡ能の増加または減少を伴う幾つかの 疾患において、これらの形態の中で優先的に変更され得るものもある。 従って、異なる形態の補正を指向した療法は、上記疾患において特に治療上貴重 であり得る。 は乳類、好ましくはヒトに対する様々な上述の要素の投与は、蛋白質またはペプ チドまたは抗体の投与に適しＩ；投与方法により遂行され得る。典型的な投与経 路は、非経口、経口、経鼻、局所または直腸投与である。各場合とも、投与され る有効成分は、有効成分を特に酵素による分解から保護する形で製剤化されるべ きである。多くの場合、非経口投与は、蛋白質およびペプチドの最も安全な投与 方法である。非経口投与経路は、活性成分が放出される場所に従い、例えば静脈 内、筋肉内または皮下部から選択されるべきである。また、 ｌ）適当な時間充分な治療濃度レベルを達成し、２）初回通過代謝を回避し、 ３）アレルギー性および免疫学的反応を回避し、そして４）望ましくない副作用 を回避し、そのために５）作用部位への有効成分の輸送を達成させるため、適当 な方法で有効成分を「バッキング」する必要性を考慮することも重要である。 有効成分を経口投与するとき、適当な措置をとることにより、例えば有効成分が その活性を局所的に発揮させるべき部位（すなわち消化管）または吸収が行なわ れ得る部位（例、結腸におけるＭ細胞）へ到達するまで有効成分が製剤（すなわ ち医薬組成物）から放出されない方法でそれをバッキングすることにより、有効 成分を消化管での酵素分解から保護すべきである。 直腸投与を行うとき、ペプチド型の有効成分に対し、直腸粘膜を通過させること によって吸収させ得るいわゆる促進剤を用いるのが望ましい場合が多い。 経鼻投与は、鼻腔からペプチド型の物質を吸収させるために現在集中的に研究さ れている投与形態である。原則として、これは２つの方法、第一に促進剤を使用 し、第二に有効成分が鼻の適当な領域で長い期間維持され得る生物粘着性成分を 使用することにより行なわれ得る。 局所投与は、有効成分を膏薬、軟膏、ローシ璽ン、クリーム等に製剤化すること により行なわれ得る。 本発明の医薬組成物は、例えば上記検討に従い有効成分の特徴に適合した医薬的 に許容し得る賦形剤を含み得る。適当な賦形剤は、リポソームおよび／またはミ クロスフェアを含み得る。医薬組成物の製造は、この明細書に記載されたタイプ の組成物に関する文献に記載されｔ；方法に従い実施され得る。 実施例７におけるＤＦＰ−ｕ−ＰＡの用量関連効果に関する発見に基づくと、そ の好適な細胞周囲（細胞外）濃度はｌμｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌよりかなり大 の範囲、例えば１００μｇ／ｍｌであると考えられるが、また図１１から明らか なように、実際の下限は０．１ｇｇ／ｍｌに設定され得るためｌｐｇ／ｍｌより 小さい濃度でも顕著な効果を示す。これは、平均的成人の場合的１　、４　ｍｇ ないし１．４ｇの単位用量に対応し、好ましくは約５０〜３００ｍｇの範囲、例 えば約１５０ｍｇである。同じ考察は、ＮＰＧＢ−ｕ−ＰＡＳｕ−ＰＡのアミノ 末端フラグメント、およびプラスミンにより開裂され得ないように修飾されてい るプローｕ−ＰＡについても当てはまる。明らかに、レセプターへ結合している 修飾形態の親和力が高い場合、要求される用量は低い。上記データに基づくと、 当業界の熟練者であれば、予備インビトロおよびインビボ実験から適当な用量範 囲を決定することができる。 通常、これらの処置は数週間または多くの場合数箇月の間続行され、好適には問 題の状態に対する他の薬剤によるも置と組み合わされる。 上述の状態および疾患の処置に関する別のストラテジーは、薬剤により表面上に ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを含む細胞を標的とすることであり、ｕ−ＰＡＲへ結合する物 質へ結合させた薬剤の投与を含む。この物質はｕ−ＰＡのレセプタ「結合形態で あり得るか、またはそれは、ｕ−ＰＡＲに対する抗体、例えばポリクローナルま たはモノクローナル抗体、例えば癌細胞タイプに存在するｕ−ＰＡＲの変異体を 特に指向した抗体であり得る。 薬剤は、典型的には抗癌剤、例えばアルキル化剤、例えばメルフアラン、タロラ ムブシノ呟ブスルファン、シスプラチン、チオテーパ、代謝きっ抗物質、例えば メトトレキセート、フルラシル、アザチオプリン、細胞分裂阻止物質、代表的に はビンクリスチン、ビンブラスチン、または抗生物質、例えばドクソルビシン、 ダウノルビシンまたはプレオマイシンであり得る。薬剤はまた細菌性または他の 毒素を含み得る。 本発明の別の重要な態様は、診断薬によって表面にｕ−ＰＡＲを含む細胞を標的 とする方法であり、ｕ−ＰＡのレセプター結合形態に結合した診断薬の投与を含 む。診断薬は生理学的に耐容性のある放射性物質、例えばテクネチウムであり得 る。 本発明の重要な分野は若干の診断方法であって、方法またはその重要性は本発明 による発見に基づくものである。その重要な一態様は組織片におけるｕ　−Ｐ　 Ａ　Ｒの検出方法であり、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合する物質で組織片を処理し、 結合物質の存在を視覚化することを含む方法である。この物質は、原則としてｕ 　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合する上記物質のいずれかであり得るが、物質が抗体、特に 標識抗体または続いて免疫染色方法により検出される非標識抗体であるのが特に 好ましい。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得、特に興味 深い抗体は、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの様々な形態を識別する抗体である。 抗体に基づく診断キット、材料および方法については下記で詳記する。 また、ｕ−ＰＡＲに結合する物質は、ｕ−ＰＡの標識形態、例えば続いてストレ プトアビジン−フルオレシン・インチオシアナートにより検出されるビオチニル 化ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡ、または続いて免疫染色により検出される非標識形態で あり得る。 本発明の別の分野は、ｕ−ＰＡＲに対する抗体を用いた生物材料におけるｕ−Ｐ ＡＲの定量を目的とするｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対する抗体の使用である。この方法 はポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて遂行され得るが、興味深い 実施態様はポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組み合わせを使用するも ので、モノクローナル抗体の方が特異性が高く、ポリクローナル抗体の方が一般 に高い結合親和力を有する。 定量方法はＥＬ　Ｉ　ＳＡタイプに属し得るか、または放射線免疫検定法であり 得る。これらの検定法は自体公知の方法により製造され得る。 本発明の一態様は純粋なｕ−ＰＡＲの製造方法であって、ｕ−ＰＡＲ含有材料を ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対する固定化抗体によるアフィニティー・クロマトグラフィ ーに付し、例えば酸性条件下でｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを溶離することを含む方法に関 するものである。 また本発明は純粋なｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに関するものである。上述した通り、純粋 なｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒは本発明に従い初めて製造された。グリコジル化形態の純粋 なｕ−ＰＡＲは、負荷的１μｇでの５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約５５−６０ｋ Ｄの範囲の見かけ上の分子量を有する実質的に一つで唯一の銀染色バンドを示す 。この５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける実質的に一つで唯一の銀染色バンドの存在は、 ｕ−ＰＡＲの純粋さの証明である。ｕ−ＰＡＲの純粋さの別の証明は、精製ｕ− ＰＡＲ製品における単一アミノ末端アミノ酸配列の存在である。異なる細胞は異 なるグリコジル化を有するｕ−ＰＡＲを産生じ得ることが見出されたが、グリコ ジル化ｕ−ＰＡＲは、脱グリコジル化後に全て同一の電気泳動移動度（ＳＤＳ− ＰＡＧＥで約３Ｏ−３５ｋＤにおける実質的に一つかつ唯一のバンドに対応する ）を有することが見出され、分子のペプチド部分が全場合とも同一であることが 示された。 実施例から明らかな通り、グリコジル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲは、デタージェ ント抽出物の温度誘発性相分離、次いで固定化ＤＦＰ−ｕ−ＰＡによるアフィニ ティー・クロマトグラフィー精製によりｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを含む生物材料から製 造され得る。デタージェントは、好ましくは非イオン性デタージェント、例えば ポリエチレングリコールエーテル、例えばトリトンＸ−１１４である。温度は、 １０分間３４−４０℃の範囲、例えば約３７℃で比較的厳密であることが見出さ れた。 非グリコジル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲは、例えばペプチド／Ｎ−グリコシダー ゼＦによる脱グリコジル化により製造され得る。 本発明はまた、培地中でホスホリパーゼＣのレセプター放出能力を発揮させるこ とにより、ｕ−ＰＡに結合し得、ｕ−ＰＡスカベンジャーとして使用され得るｕ 　−Ｐ　Ａ　Ｒの細胞外可溶性形態の直接的製造および精製方法を提供する、ｕ −ＰＡＲの新規精製方法に関するものである。 純粋ｕ−ＰＡＲのアミノ末端アミノ酸配列に基づいて、２４量体ヌクレオチド・ プローブを合成し、これを用いてライブラリーをスクリーニングし、ｕ−ＰＡＲ に関するｃＤＮＡをもつ組換えクローンを同定および単離した。このｃＤＮＡク ローンのヌクレオチド配列を精製ｕ−ＰＡＲのアミノ末端配列と比較することに より、そしてマウスＬ細胞で前記ｃＤＮＡを発現させ、それらのｕ−ＰＡ結合特 性を検定することによりｃＤＮＡクローンの同一性を確認した。 この明細書で使用されているアミノ酸の省略形は次の通りである。 アミノ酸　３文字省略形　１文字記号 アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギンまたはアスパラギン酸　Ａｓｘ　Ｂシスティン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミンまたはグルタミン酸　Ｇｌｘ　Ｚグリシン　Ｇｌｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ インロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ 本発明の一態様はｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒから誘導された特有のアミノ酸配列を含むポ リペプチドであって、クローンｐ−ｕ−ＰＡＲ−１のＤＮＡ配列および誘導され たアミノ酸配列として下記に示されてしする通りｕ−ＰＡＲの少なくとも５個の アミノ酸なシル完全配列を含むポリペプチドに関するものである。シグナルペプ チドには下線が引し１てあり、アブライド−バイオシステムズ・ガス相シーケン サ−（実施例１参照）により精製蛋白質において配列が決定された最初の３０ア ミノ酸には上線が引かれている。推定的経膜ドメインは二重下線部である。星印 は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を示す。 酩Ｍ赫儲φπ儲■軸ｃｃニーＣ鉱線藁はＧｃｃα命閃ＡＣ４６ＡＴＣｃａｒ　ｃ Ａｃ　ｃｃｃ　ｃｃａ　ｅｒａ　ｃｉａ　ｃｃａ　ｃｒａ　ＣＴ（：　ａｒｃ　 ＣＴＣｃｒｃ　ｃａｃ　ａｃｃ　ｗｃ　ｅ■ ＡＣＯムτＣＧＴＯＣＣＣＴ１’Ｇ’ｍ　ＧＡＡＧＡＡ　（ａ　（ｊｋＡＧＭ： 　ＣＴＣａ（：　ＣＴＣ（ｍ　ＧＡＧ　２３１１Ｔｈｒ　ＩｌａＶａｌ　Ａｒｇ 　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｃ１ｕ　Ｃ１ｕ　Ｏｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　（ｌｕ 　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕＡＡＡ　Ａｃｃ　ＴＧＴ　ＡＣＣＣＡＣＴＣＡ　ＧＡ Ｇ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＡＣＡＧＯＡＣＣＣＴに　ＡＧＣＴＡＴ　ＣＣＯ２１１６ Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　）ｌｉｔ　Ｓａｒ　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ 　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｔａｕ　Ｓｅｒτｙｒ　Ａｒｇ５　ＡＣＴ　ＧＯ（ ：　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＴＣＡＣＣＡｃｃ　Ｃｒｒ　ＡＣＣＧＡＧ　（Ｔｒ　（Ｔ ＣＴにＴ　ＧＣに　ＴＴＡ　ＧＡＣ３３S τｈｘ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 にＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　Ａｓ■ ５Ｑ　７０ 丁τＧ　ＴにＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＧＧＣＭＣＴＣＴ　ＧＧＣＣＧＧ　（：ＣＴ　 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１９０＊ ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＣＴＣＴ　ＯＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＴＴＣＣＴＣ ＡＴｒ　ＧＡｃ　Ｔｌｌ：ＣＣＧＡ　Ｃｄ；ＣＣＣＣ７６６５ＨＬｓ　Ｃ１ｙ　 Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｓｕ　Ｘｉｓ　 Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＰｒB ＡＴＣＡＡＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣ（ｉＡ　（：ＣＣＡＣＣＧＣＧ　ＡＣＴ 　ＣＡＣｃＡＡＣＣＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＣＡＡ　１１１４にａｔ　ｋｓｎ　Ｇｉ ｎ　Ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌ ｕ　ｉ’ｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　に１■ １０　ＡＣＣτ＾τＡＴＣにτ＾ＡＧＡ　ＣＯＣＴ（Ｔ　ＣＣＡ　ＡＣＣＣＣＣ ＴＣＡ　ＡＴＣＴＧＣＣＡＡ　ＣＡＴ　ＧＣＣ８６２Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｍａｔ　 Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａ１１　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｘ　Ｍａｅ　 Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ａ１ｍＣＡＣＣＴＧ　Ｇｌｉ　ＧＡＣＣＣＣＴｒＣＡ ＣＣＡＴＧ　ＡＡＣＣＡＣＡＴＴ　ＣＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＭＴ　９１０Ｈ１ ｓ　Ｌａｕ　Ｏｌｙ　ｋｓｐ＾ｌａ　Ｆｂ＠８４１１？　Ｈａｔ　Ａｇｎ　Ｈｌ ｓ　Ｘ１＊　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ１５　２６Ｇ ＡＣＴ　ＡＡＡ　Ａ（Ｔ　ＩＩＪｃ　ＴＧＴ　ＡＡＣＣＡＣＣＣＡ　弘ＣＣＴＧ 　（ＪＴ　ＧＴＣＣＡＧ　ＴＡＣＣＧＣＡＧＴ　９５８Ｔｈｒ　Ｌｙｇ　Ｓａｒ 　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌａｕ＾ｓｐ　Ｖａｔ　 Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　５ｉｒＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　Ｃ ＣＴ　（：ＣＣＣＣＴ　ＧＣＣＣＡＴ　ＣＴＣＡｌｌ：ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡ ＣＣ１ｏ０６２０　Ｇａｙ＾１ｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　（：ｌｎ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ 　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　ｔａｕ　Ｓｉｒ　Ｉａｕ　Ｔｈｒ　ｌ１４１@Ｔｈ ｒ ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＣＣＡＧＡ　ＣＴＣＴにＧＣＣＧＡ　ＣＧＣ ＡＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＴｌｌ；に　ＡＣＣＴＡＡ　１０５４Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｍ ａｔグｒｈｒ　Ａｌａ＾ｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｃｒｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａ ｕムＵτｒｐ　Ｔｈｒ　ＥｎｄにＴＣＣＣＩＩ；ＡＣＣ’Ｔ　ＣＴＣＴＧＣＣＣ ＣＴ　（：ＡＧＴｍＣＣＣＡにＣＴＡτＧＡＡＡ　ＡＣＭ；ＣＴＡＴＣＴ　１２ ０４ＣＡＣＡＡＡ（ＴＴＧ　ＴＧＴ（ＪｕＧＣＡＣＡＡＱＡＧＡＡＡＡＧ　ＣＴ ＧＧＡＧＧＡＡ（：　ＧＣＣＣＴＧＧＧ（−Ａ　１２５４丁ＡＣＣＡｃＴＧＧＡ 　ＡＡＡ−Ｊｖし〜−＾Ａ　ＡＡＡＡ−ＡＡＡＡＡＡ　Ａ講ＡＡＡ１１〜−ＡＡ 　ＡＡＡＡＡＡ　１４ｏ０またはその類縁体。 本発明は、アミノ酸１〜３１３までのｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの少なくとも５債のアミ ノ酸ないし完全配列を含むポリペプチドおよび前記ポリペプチドに対する類縁体 に関するものである。 ポリペプチドは炭水化物または脂質部分に結合され得る。それは代表的には上述 した通りグリコジル化され得る。 本明細書において、ｒ、−ＰＡＲから誘導された特有のアミノ酸配列」という語 はアミノ酸配列、例えばエピトープを意味するものとし、ｕ−ＰＡＲにおいて実 質的連続伸長（−次的または空間的立体配座に関して）を構成するアミノ酸、ま たはｕ−ＰＡＲにおけるある程度の非連続立体配座において見出されるアミノ酸 であって、例えば治療薬または診断薬として興味深く有用な特性を有する２次ま たは３次立体配座を構成するアミノ・酸が含まれる。すなわち、ｕ−ＰＡＲにお いて異なる位置に存在するが、例えば化学的または物理的結合によって、例えば ジスルフィド架橋によって一緒にされることにより、Ｊｌｌ末深い３次立体配座 を形成するアミノ酸は、「特有のアミノ酸配列」として理解される。特有のアミ ノ酸配列は、さらに大きいか小さい長さのｕ−ＰＡＲのアミノ酸配列の連続部分 配列またはＵ−ＰＡＲとは関係のない１つまたはそれ以上のアミノ酸配列により 分離され得る前記部分配列の２つまたはそれ以上の部分の組み合わせを含み得る 。別法として、特有のアミノ酸配列は互いに直接結合され得る。 本明細書において、「エピトープ」という語は、免疫能細胞を刺激またはそれと 相互作用し得る本発明のポリペプチドまたはその誘導体もしくは類縁体の配列ま たは部分配列、特に診断に関して望ましい特性を示す抗体が産生され得るエピト ープを指す。 この明細書で使用されている「類縁体」という語は、類縁体の免疫原性に対して 副作用を示さないささいな変形が行なわれ得る、Ｕ−ＰＡＲから誘導された特有 のアミノ酸配列と類似したアミノ酸組成または配列を有する蛋白質またはポリペ プチドを示す。類似ポリペプチドまたは蛋白質は、は乳類から誘導され得るか、 または部分的または完全に合成され得る。 また本発明は、上記アミノ酸配列を含むポリペプチドに対して産生されたかまた はそれと反応する抗体により認識される実質的に純粋なポリペプチドに関するも のである。 本明細書において、「実質的に純粋な」という語は、問題のポリペプチドが、ポ リペプチドの製造および／または回収により生じるか、または他の方法でポリペ プチドと一緒に見出され得る他の成分、例えば他のポリペプチドまたは炭水化物 を実質的に含まないことを意味するものと理解される。本発明のポリペプチドの 高純度は、ポリペプチドが例えば抗体製造に使用される場合に有利である。また 、その高純度故に、実質的に純粋なポリペプチドは、たいていの用途において慣 用的低純度のポリペプチドよりも低量で使用され得る。 本発明ポリペプチドの精製は、当業界の熟練者に知られた方法により遂行され得 るが、特に生物材料におけるｕ−ＰＡＲの低濃度およびレセプターの強い疎水性 は、現在までその精製の障害となっていた。しかしながら、現在、細胞のデター ジェント抽出物の温度誘発性相分離および固定化ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡにょるア フィニティー・クロマトグラフィーを組み合わせることにより、部分的アミノ酸 配列決定およびさらに特性検定を可能にするのに充分な程度多量（１００−２０ ０μｇ）での精製に成功した。 別の態様において、本発明は、上記ｕ−ＰＡＲをコードするヌクレオチド配列を 含むＤＮＡ７ラグメントに関するものである。ＤＮＡフラグメントは、組換えＤ ＮＡ技術によりｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの製造方法で、または診断剤（すなわち、ＤＮ Ａプローブ）として使用され得る。 組換えポリペプチドの製造における本発明のＤＮＡフラグメントの使用は（例、 フラグメントを適当なベクターへ挿入し、ベクターを適当な宿主生物体（微生物 または培養動物細胞）へ形質転換し、生物体を培養することによってポリペプチ ドを生産させ、統いて生物体からポリペプチドを採取することによる）、若干の 利点を含む。大量のｕ−ＰＡＲまたはそのフラグメントの供給が可能であり、製 造されたｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒポリペプチドは、汚染物質を含まない実質的に純粋な 形態で単離され得る。また、本発明のＤＮＡフラグメントは、試料からｕ　−Ｐ 　Ａ　ＲをコードするｍＲＮＡまたはその一部分を検出するだめの診断剤として 使用され得、前記診断剤はｕ−ＰＡＲの少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配 列と相同性を示す標識ＤＮＡ配列を含む。 本発明の純粋なｕ−ＰＡＲ（天然または組換え）は、ポリクローナルまたはモノ クローナル抗体の製造において使用され得る。抗体は、試料中に存在する上記ポ リペプチドの少なくとも一部分の同定および／または定量に使用され得、すなわ ちは乳類細胞の表面における異常な数のｕ−ＰＡＲの存在に関連した疾患の診断 を可能にする。 前記試料は人体のいずれかの部分であり得、例えばポリペプチドを含む体液また は組織部分、例えば組織試料、例えば生検、例えば骨髄組織試料、血液試料、床 試料、髄液、血清、血しようまたは血液もしくはリンパ分泌物から製造された生 成物の試料またはｕ−ＰＡレセプターを伴う細胞を含むヒト腔部から得られる試 料であり得る。 本発明ポリペプチドは、炭水化物、脂質部分に結合または他の方法で修飾、例え ば燐酸化またはヒドロキシル化され得る。特にポリペプチドはグリコジル化され 得、結合した炭水化物部分は天然分子で２Ｏ−３０ｋＤの分子量を有する。１つ またはそれ以上の部分へのポリペプチドの結合は、例えばポリペプチドを生産す る生物体により行なわれるポリペプチドの翻訳後修飾または化学合成による修飾 に起因し得る。 また、本発明のポリペプチドは、ｕ−ＰＡＲからの特有のアミノ酸配列（複数も あり得る）が別のポリペプチド配列と融合している融合蛋白質であり得る。ｕ− ＰＡＲからの特有のアミノ酸配列（複数もあり得る）と融合するポリペプチドは 、結果的に生物体での発現時に蛋白質の発現を増強するか、またはさらに容易か つ経済的な回収に関して上記生物体からの融合蛋白質の精製および回収を簡易化 もしくは改良するか、または（ｕ−ＰＡＲ−ＦＡ　Ｉ　−１融合体の場合のよう に）ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒにｕ−ＰＡ阻害特性を付与するものであり得る。 場合によっては、融合蛋白質を開裂することにより、実質的にＵ−ＰＡＲからの 特有のアミノ酸配列（複数もあり得る）を含むだけのポリペプチドを得るのが有 利であり得る。これらの場合、ｕ−ＰＡＲ由来の特有のアミノ酸配列（複数もあ り得る）は、好ましくは開裂剤、例えば化学薬剤、例えば臭化シアン、ヒドロキ シルアミンおよび２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート、または酵素、例え ばペプチダーゼ、プロテアーゼまたはプロテアーゼ、例えばトリプシン、クロス トリパインおよびスタフイロコツカル・プロテアーゼまたは因子Ｘａにより特異 的に認識され得るポリペプチド配列に融合される。 上述した通り、本発明の一態様は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡフ ラグメントに関するものである。特に、本発明は、実質的にヌクレオチド配列（ １）を含むＤＮＡフラグメントまたは本発明のポリペプチドの部分配列をコード するその部分配列に関するものである。 上記配列のヌクレオチドの各々は、一般に使用されている省略形により表され、 すなわち、 Ａはアデニンを表し、Ｔはチミジンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシン を表す。 このヌクレオチド配列は、ｕ−ＰＡＲの完全蛋白質部分をコードする。上に示さ れｆ−Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、実施例３の記載に従い確立された。 ｕ−ＰＡＲのｃＤＮＡは、それが多くとも８０００００分子／細胞の割合で発現 されるという事実に基づくかなり稀なりローンを表す。 事実、それは６Ｘ１０−＠未満の頻度で見出された。ｃＤＮＡは、その制限地図 （図４Ｂ）に基づくと約１．４ｋｂ長であり、約４０残基の５′非翻訳配列およ び３′末端に約４０ヌクレオチド長のポリーＡ伸長部分を有する。 ｕ−ＰＡＲに関連しないＤＮＡおよびｕ−ＰＡＲの少なくとも一部分をフードす る遺伝子の関係を調べるためには、ＤＮＡハイブリダイゼーションは有用な方法 である。ハイブリダイゼーションは次の要領で実施され得る。マニアチス等（１ ９８２）８６−９６頁に記載された大規模方法を用いて、プラスミドｐ−ｕＰＡ Ｒ１からのＵ−ＰＡＲをコードする遺伝子を含む純粋なりＮＡを製造する。さら に具体的には、ｕ−ＰＡＲ遺徴子を、適当な制限酵素によるグラスミドＤＮＡの 消化によりプラスミドから取り出し得る。次いで、アガロース・ゲル電気泳動の 使用により、挿入体をプラスミドＤＮＡから分離する。挿入体を標識成分、例え ばこの明細書に開示された成分により標識する。調べるべき外来ＤＮＡをマトリ ックス、例えばニトロセルロース・フィルターに結合する。フィルターを使用す るマトリックスの種類に適した適当な処理に付すことにより、すなわちニトロセ ルロース・フィルターの場合例えば２時間８０℃の温度でフィルターを焼くこと によりＤＮＡをマトリックスに結合させる。 問題の膜に合わせた推奨される時間、温度で組成のプレハイブリダイゼーション 溶液に膜を暴露する。次いで、膜を、ｐ−ｕＰＡＲ−１プラスミドから得られた 標識変性ＤＮＡプローブ（ｕ−ＰＡＲ遺伝子）を含むハイブリダイゼーション溶 液に入れる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは一夜適当な温度で実施され る。次いで、膜を洗浄し、３０分間６５℃で５０ｍ１容量の２ＸＳＳＣとインキ ュページ厘ンする。この手順を１回反復する。次に、膜を、０．Ｉ　ＳＤＳ含有 ２ＸＳＳＣ１５ｍｌ中でインキュベージ理ンする。インキュページ目ンは３０分 間６５℃で行なわれる。プレハイブリダイゼーシ厘ンおよび洗浄を含む全インキ ュベーションは、穏やかに撹はんしながら行なわれる。フィルターを風乾し、適 当なプラスチック・ラップ（例、サランラップ）に包み、次いでフィルターをＸ 線フィルムに適用することにより、オートラジオグラフィー像が得られる。暴露 は、好ましくは使用される陽性対照により決定される時間、強化スクリーンによ り一７０℃で行なわれる。外来ＤＮＡおよびｕ−ＰＡＲ遺伝子のハイブリダイゼ ーシヨンは全て、２つのＤＮＡプローブの類似性の指標であり、すなわち外来Ｄ ＮＡが本発明のＤＮＡフラグメントであることを示す。ＤＮＡ配列間の類似性の ２りの測定方法は、慣用的ＤＮＡ配列決定分析により本発明のＤＮＡ配列と比較 されるＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定し、本発明のＤＮＡ配列との相同性 度合を比較することによる方法である。好ましくは、少なくども約７０％、例え ば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９５％の相同度が得られる。 本発明のＤＮＡ７ラグメントは、融合ポリペプチドを製造する目的で特有のアミ ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に枠内融合させたポリペプチドをコード するヌクレオチド配列を含み得る。組換えＤＮＡ技術を使用する場合、融合配列 は、適当な宿主生物体へ形質転換される適当なベクターへ挿入され得る。別法と して、本発明のＤＮＡフラグメントは、ベクターがもつ遺伝子との枠組内でベク ターに挿入され得、前記遺伝子は適当なポリペプチドをコードする。真核生物ま たは原核生物に由来し得る宿主生物体、例えば酵母またはは乳類セルラインは、 融合配列の発現を確実にする条件下で生育された後、融合ポリペプチドは物理化 学的方法により培養物から回収され得、融合ポリペプチドは、ゲルろ過および融 合ポリペプチドの抗原性部分（複数もあり得る）を指向する抗体を用いたアフィ ニティー・クロマトグラフィーに付され得る。精製後、本発明のポリペプチドお よびそれに融合されるポリペプチドは、例えば適当な蛋白質分解的開裂により分 離され得、本発明のポリペプチドは、例えばアフィニティー精製または別の適当 な方法により回収され得る。 また、ＤＮＡ７ラグメントは、ＤＮＡ７ラグメントの発現を制御する適当なヌク レオチド配列を含み得る。調節ヌクレオチド配列は、上記発現ベクターが使用さ れる場合、好都合にはポリペプチドの製造に使用される発現ベクターの一部分で ある。 上記ＤＮＡフラグメントは、直接ゲノムＤＮＡから、またはｍＲＮＡを単離し、 ｃＤＮＡを生じる逆転写酵素を用いてそれを対応するＤＮＡ配列へ移すことによ り得られる。ゲノムＤＮＡからＤＮＡフラグメントを得る場合、それは、ｕ−Ｐ ＡＲの完全または部分的アミノ酸配列に基づいて製造されたＤＮＡプローブとハ イブリダイゼーションさせる、ゲノム配列に関するスクリーニングにより直接誘 導される。ＤＮＡが相補的Ｄ　Ｎ　Ａ（ｃＤ　Ｎ　Ａ）に由来する場合、それは 、ｕ−ＰＡＲまたはその一部分を含む細胞からのｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡラ イブラリーを製造することにより得られる。次に、プローブとして合成オリゴヌ クレオチドを用いてハイブリダイゼーション実験を実施することにより、ｕ−Ｐ ＡＲまたはその一部分をコードするｃＤＮＡ配列が同定され得る。ｃＤＮＡは、 例えばそれがある種の転写制御要素および暗号化ＤＮＡ配列内の非暗号化配列で あるイントロンを欠くという点でゲノムＤＮＡとは異なる。これらの要素および イントロンは、通常ゲノムＤＮＡに含まれる。ＤＮＡフラグメントはまた、合成 的に得られ、すなわち例えばヌクレオチド合成装置を用いて慣用的ＤＮＡ合成方 法により製造され得る。また、ＤＮＡ７ラグメントはこれらの方法の組み合わせ を用いて製造され得る。 同じく興味深いのは、上記ＤＮＡ配列またはその一部分または前記ＤＮＡ配列に 対応するｍＲＮＡに相補的な配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ７ラグメントである 。本発明のポリペプチドに対応するｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なりＮ ＡまたはＲＮＡフラグメントは、ヒト細胞におけるポリペプチドの翻訳を阻止す ることにより、ｕ−ＰＡＲポリペプチドの合成を阻止するのに有効であると考え られる。他の系において、所定の蛋白質をコードするｍＲＮＡに相補的なりＮＡ またはＲＮＡフラグメントは、蛋白質の翻訳を阻止し得ることが示された。すな わち、ヒトセルラインにおけるアンチセンス−発癌遺伝子（ホルト、Ｊ、Ｔ、等 、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリカ」、１９８６．８ ３．４７９４−４７９８に記載）およびトランスジェニック植物における植物酵 素（クロール、「ネイチャー」、１９８８．３３３．８６６に記載）の挿入は、 この効果を有することが見出された。さらに場合によっては、ウィルスｍＲＮＡ に相補的なアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、エシェリヒア・コリ株における ５Ｐ−７アージ（ヒラシマ、Ａｏ等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク ・オプ・アメリカ」、１９８６．８３．７７２６−７７３０に記載）、または感 染ヒトＣＤ４セルラインにおけるＨＩＶ−ウィルス（ライン、Ｍｌ等、「プロシ ーディンゲス・オブ・ザ・ナシ理ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ」、 １９８７．８４．７７０６−７７１０）の感染率を阻止し得ることが示された。 上記ＤＮＡまたはＲＮＡ７ラグメントは、当然、所望の特異性および本発明のポ リペプチドに対応するｍＲＮＡへのＤＮＡまたはＲＮＡ７ラグメントのハイブリ ダイゼーションを達成するのに充分な若干のヌクレオチドを含む。好ましくは、 ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントは、細胞膜を通してフラグメントを安全に輸送 させ得る、すなわち膜を通って輸送されるフラグメントの実質的破壊を伴わない サイズを有する。７ラグメントの一次的または空間的構造に関して充分な特異性 および／またはハイブリダイゼーションを達成するため、ＤＮＡまたはＲＮＡフ ラグメントは、少なくとも約５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレ オチドのサイズを有するべきであると考えられる。細胞膜を通るＤＮＡまたはＲ ＮＡフラグメントの安全な輸送を確保するため、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメン トは、多くとも約１００ヌクレオチド、好ましくは多くとも約８０７ラグメント のサイズを有するべきであると考えられる。すなわち、約１０−６０ヌクレオチ ド、例えば約１２−５０ヌクレオチド、例えば約１４−４０ヌクレオチド、好ま しくは約１５−２５または１５−２２ヌクレオチドのサイズを有するＤＮＡまた はＲＮＡフラグメントが有用であると考えられる。ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメ ントは、ｍＲＮＡのいずれかの部分、例えば本発明のポリペプチドをフードする 遺伝子におけるリポソーム結合部位もしくはその一部分または出発コドンを含む ｍＲＮＡの一部分、または１回またはそれ以上反復された配列に相補的であり得 る。 ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントは、ヌクレアーゼに対する耐性または細胞膜を 通る輸送を改良するための多数の燐酸修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド、例 えばオリゴ−アルキルホスホトリエステル、オリゴメチルホスホネートまたはオ リゴホスホロチオエートを含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ７ラグメントは、慣用 的方法、例えば上記で概説した方法により製造され得る。 別の態様において、本発明は、宿主生物体において複製し得、上記ＤＮＡフラグ メントを有する発現ベクターに関するものである。 このベクターは、好都合には組換えＤＮＡ技法に付され得るあらゆるベクターで あり得、ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞に左右されることが多い。 すなわち、前記ベクターは、自律複製し得るベクター、すなわち複製が染色体の 複製とは無関係である染色体外物体として存在するベクター、または宿主染色体 と一緒に複製されるベクター、例えばバクテリオファージであり得る。 宿主生物体として微生物またはは乳類セルラインが使用される場合、有用なベク ターの例は、プラスミド、例えば天然または合成プラスミド、例えばｐＢＲ３２ ２に関連したプラスミド、例えばｐＥｘｌ−３、ｐＲＩＴ群、ｐＵＣ群など、お よびウィルス、例えばアデノウィルス、ワクシニアウィルス、レトロウィルス、 バクロウィルス、エプスタイン−バール・ウィルス、５ｖ４０関連ウイルスおよ びウシ・パピローマウィルスである。適当なバクテリオファージの例としては、 Ｍ２Ｓおよびラムダがある。 本発明はまた、上記ＤＮＡ７ラグメントをもち、そしてこれを発現し得、天然形 態では前記ＤＮＡフラグメントを発現しない生物体に関するものである。ＤＮＡ フラグメントは、上記ベクターに担われ得るか、または生物体のゲノムに組み込 まれ得る。適当な生物体の例には、微生物、例えば細菌、酵母、真菌並びに植物 およびは乳類細胞を含むより高等な真核生物または細胞がある。しかしながら、 高度生物体、例えば動物、例えばヒツジ、ウシ、含り、ブタ等もまた、本発明ポ リペプチドの製造用宿主生物として有用であると考えられる。 本発明はまた、上記ポリペプチドの製造方法に関するものである。 好適には、ポリペプチドは、組換えＤＮＡ工学技術、例えばマニアチス等（前出 ）により開示された方法を用いて製造される。さらに具体的には、ポリペプチド は、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ由来の特有のアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメン ト、例えば上記ＤＮＡフラグメントをもつ生物を、上記ＤＮＡ７ラグメントの発 現を誘導する条件下で培養または増殖させ、続いて生物体からポリペプチドを回 収することを含む含む方法により製造され得る。 上述した通り、ポリペプチドの製造に使用される生物体は、高等生物、例えば動 物、または下等生物、例えば微生物であり得る。ポリペプチドの製造に使用され る生物体のタイプとは関係なく、ｕ　−ＰＡＲからの特有のアミノ酸配列をコー ドするＤＮＡフラグメントは、当然生物体で導入される。好都合には、ＤＮＡフ ラグメントは、発現ベクター、例えば上記ベクターに挿入され、続いて宿主生物 へ導入される。ＤＮＡフラグメントはまた、宿主生物のゲノムに直接挿入され得 る。ゲノムにおけるＤＮＡフラグメントの挿入は、ＤＮＡ７ラグメントそのもの の使用により達成されるか、またはＤＮＡフラグメントをもち、宿主生物ゲノム への挿入を仲介し得る、細菌、７アージ・ラムダまたは他のベクターでクローン 化され得る。発現ベクターまたは宿主生物ゲノムへのＤＮＡ７ラグメントの挿入 は、例えばコルベールーギャラパンＦ０等、「ジャーナル・オプ・モレキュラー ・バイオロジー」、１５０、ｌ−１４（１９８１）：ｒア・ニュー・ドミナント ・ハイブリッド・セレクティブ・マーカー・フォー・バイアー・ユーカリオティ ック・セルズ」による記載に従い達成され得る。 高等生物、例えば動物もまた、本発明ポリペプチドの製造に使用され得る。それ らの場合、当業界で公知のトランスジェニック技術がポリペプチドの製造に使用 され得る。適当な動物の例は、ヒツジ、ウシ、ブタ等である。トランスジェニッ ク技術を使用する場合、本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡは、好適には、 本発明ポリペプチドが、本質的にその動物により発現されるポリペプチド、好ま しくは動物から容易に回収されるポリペプチド、例えば動物により分泌されるポ リペプチド、例えば乳蛋白質などと一緒に発現される位置関係で動物のゲノムへ 挿入される。好適には、本発明のＤＮＡフラグメントは、動物固有のポリペプチ ドをコードするＤＮＡフラグメントと枠を形成する形で動物のゲノムに挿入され ることにより、一方では本発明ポリペプチドおよび他方では宿主生物、例えば動 物に関連したポリペプチドを含む融合蛋白質の発現が達成される。次いで、生成 された融合蛋白質に翻訳後修飾を加えることにより、本発明ポリペプチドが得ら れる。 同様に、本発明ポリペプチドの製造用発現ベクターを使用するとき、ＤＮＡフラ グメントを、別のポリペプチドをコードするＤＮＡ７ラグメントと枠を形成する 形で挿入することにより、融合蛋白質の発現が達成され得る。 本発明ポリペプチドが、例えば一方ではｕ−ＰＡＲ由来の特有のアミノ酸配列（ 複数もあり得る）および他方ではｕ−ＰＡＲとは関係のないポリペプチドを構成 するアミノ酸配列（複数もあり得る）を含む融合蛋白質である、１つまたはそれ 以上の独特な部分を含む場合、これらのポリペプチドの各々をコードするＤＮＡ フラグメントは、ゲノムまたは発現ベクターに別々に挿入され得るか、または挿 入前に例えばマニアチス等（前出）により記載された慣用的ＤＮＡ技術の使用に よりゲノムまたは発現ベクターへ結合され得る。 勿論、本発明ポリペプチドを生産する生物が培養または増殖される条件は、使用 される生物に適合されるべきである。慣用的培養および増殖技術が使用され得る 。微生物の場合、培養は、例えばマニアチス等（前出）による開示に従い、例え ば好都合には発酵目的に使用される培養培地、例えばルリア・プロス培地中、問 題の微生物のタイプに適したｐＨｓ温度、曝気等に関する条件下で行なわれる。 宿主生物におけるポリペプチドの発現に続いて、ポリペプチドは生物から回収ま たは単離される。ポリペプチドは、一つまたはそれ以上のアフィニティー・クロ マトグラフィーおよび／またはサイズ・クロマトグラフィ一段階を含み、所望に よりポリペプチドと反応するか、および／またはそれに対して産生される抗体を 用いた段階を使用する方法により培養物から単離または回収され得る。勿論、ポ リペプチドの回収に使用される方法は、使用される宿主生物の種類および製造さ れたポリペプチドにより異なる。 ポリペプチド製造するためトランスジェニック技術を使用する場合、ポリペプチ ドは、例えば動物性物質、例えば乳から回収され得、この場合、それは、抽出、 遠心分離、アフィニティー・クロマドグ用ポリペプチド単離および精製技術によ り製造される。 本発明ポリペプチドが宿主生物として微生物を用いて製造される場合、同じくポ リペプチドの回収および単離は勿論使用される微生物の種類により異なる。好適 には、微生物からのポリペプチドの回収は、例えば部分的または全体的な微生物 の破裂による、ポリペプチドを放出させるための微生物処理、続いてよく知られ た方法、例えば沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ 逆相クロマトグラフィーまたは免疫アフィニティー・クロマトグラフィーなどに よるポリペプチドの回収を含む。 さらに具体的には、本発明ポリペプチドは、ポリペプチドを含む生物材料、例え ばポリペプチドを産生する細胞の懸濁液から、この明細書に記載された固定化モ ノクローナルまたはポリクローナル抗体を含むマトリックスに生物材料を吸着さ せ、マトリックスからポリペプチドを溶離し、溶離液からポリペプチドを回収す ることを含む方法の使用により単離され得る。ポリペプチドの単離方法の例は次 の通りである。 ａ）高い収率および純度でのｕ−ＰＡＲ含有フラクションの獲得に適したｕ　− Ｐ　Ａ　Ｒ化合物またはｕ−ＰＡＲ反応性化合物（例、ｕ−ＰＡ自体またはその 誘導体）と反応する抗体を用いる方法。この方法は、特異的抗体、好ましくはモ ノクローナル抗体をマトリックスに固定し、放出されたｕ−ＰＡＲ化合物を含む 製品とマトリックスを接触させ、洗浄し、最後にマトリックスに固定された抗原 抗体複合体を処理して、純粋形態のｕ−ＰＡＲ化合物を放出させることにより行 なわれ得る。好ましい方法は、カラム・マトリックスに固定させた抗体を含むカ ラム・アフィニティー・クロマトグラフィーによりＵ−ＰＡＲ化合物を単離する 方法である。 ｂ）様々な形態のアフィニティー・クロマトグラフィー、ゲルろ過、イオン交換 または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む方法。 Ｃ）プレバラティブ電気泳動方法、例えば次の方法：遠心分離酵素処理した細胞 またはセルライン製品から得た上溝を、ゲル電気泳動、例えばドデシル硫酸ナト リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥＸラエムリ、Ｕ、 に、ｒネイチャー」、２２７：６８０−６８５（１９７０）参照）、またはアガ ロースゲル電気泳動に付す。続いて、ｕ−ＰＡＲと反応する標識抗体、例えばモ ノクローナル抗体を用いて、主として単離されたｕ−ＰＡＲ化合物により構成さ れるバンドを同定する。例えば、抗体は、あらゆる慣用的免疫ブロッティング技 術で使用され得る。マーカーは、適切な感度のフィルムにより検出され得る放射 性同位元素またはフルオレセイン標識であり得る。同定後、ゲルのｕ　−Ｐ　Ａ 　Ｒ含有バンドは、ゲルからＵ−ＰＡＲ化合物を放出させる処理、例えばゲルの 切り取りおよび後続のｕ−ＰＡＲ化合物の溶離を含む手順に付され得る。所望に より、得られたｕ−ＰＡＲ蛋白質のアミノ酸配列が決定され得る。 ｄ）ホスファターゼＣおよび／またはＤを用いた発現性細胞からのｕ−ＰＡＲの 可溶化、および上述の精製方法の使用を含む方法。 微生物培養の前に、本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントには、 ＤＮＡフラグメントがベクターへ挿入された前後に修飾が加えられ得る。生成さ れたポリペプチドにも修飾が加えられ得る。この修飾は、ＤＮＡ７ラグメントお よびポリペプチドにおける各々１個またはそれ以上のヌクレオチドおよびアミノ 酸の置換、付加、挿入、欠失または転位、またはこれらの修飾の組み合わせを含 み得る。「置換」という語は、完全なアミノ酸またはヌクレオチド配列における １個またはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、１個またはそれ以上の他 のアミノ酸と置き換えることを意味するものとし、「付加」は、完全なアミノ酸 またはヌクレオチド配列のいずれかの端部に１個またはそれ以上のアミノ酸また はヌクレオチドを付加することを意味するものと理解され、「挿入」は、完全な アミノ酸またはヌクレオチド配列内への１個またはそれ以上のアミノ酸またはヌ クレオチドの導入を意味するものとし、「欠失」は、配列のいずれかの端部まｔ ；は配列内の適当な点において１個またはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチ ドが完全なアミノ酸またはヌクレオチド配列から前途されたことを示すものとす る。「転位」は、１個またはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドまたは配列 が互いに交換されたことを示すものとする。しかしながら、ＤＮＡ７ラグメント はまた、前記フラグメントに突然変異を起こさせるため、ＤＮＡフラグメントを もつ生物を突然変異誘発、好ましくは部位突然変異誘発に付すことにより修飾さ れ得る。生物体が微生物である場合、突然変異誘発は、慣用的突然変異誘発手段 、例えば紫外線照射、イオン化照射または化学的突然変異原、例えばマイトマイ シンＣ，５−ブロモウラシル、メチルメタンスルホネート、窒素イペリットまた はニトロフランまたは当業界で公知の突然変異原、例えばミラー、Ｊ、Ｈ，、ｒ モレキュラー・ジェネティクス」、ユニットＩＩＩ、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−（１９７２）に開示されたタイプの突然変異原を用いるこ とにより遂行され得る。 ＤＮＡ配列の適当な修飾の例は、蛋白質の別のアミノ酸配列には生じないが、例 えば配列が挿入されている特定生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換、 異なるアミノ酸配列、従って恐らくは異なる蛋白質構造に生じるが、ＤＮＡ配列 によりコードされるポリペプチドの重大な特性を損なうことのないヌクレオチド 置換、天然ｕ−ＰＡＲのレセプター特性を保持したポリペプチドをコードする上 記ＤＮＡ配列の部分配列、またはｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの生物特性を有するポリペプ チドをコードするとの条件で、上に示したＤＮＡ配列に基づいて製造されたＤＮ Ａの少なくとも一部分とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列である。 上記に従い製造されるポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば熱処理、化学物質、 例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたは適当な蛋白質分解酵素、例 えばペプチダーゼまたはプロテイナーゼ、例えばトリプシン、ホスホリパーゼ、 グリコペプチダーゼによる処理が行なわれ得る。 トランスジェニック技術を含む組換えＤＮＡ技術の使用は、自然環境で生成され る場合のポリペプチドのプロセッシングよりもポリペプチドの別の種類のプロセ ッシングを随伴し得ることはよく知られている。すなわち、細菌、例えばエシェ リヒア・コリを本発明ポリペプチドの製造に使用する場合、ポリペプチドのアミ ノ酸残基はグリコジル化されていないが、別の微生物または生物で製造される場 合ポリペプチドはグリコジル化され得る。 しかしながら、問題の宿主生物により誘発されるプロセッシング特性を除去また は改変するのが有利であり得、ポリペプチドおよびＤＮＡ配列の翻訳後修飾はこ の目的に役立ち得る。 「切頭ポリペプチド」という語は、結果的にポリペプチドの特性、例えば溶解度 の変化を誘発する１個またはそれ以上のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドを 包含する。別の意味において、「切頭ポリペプチド」という語は、全て一ポリペ プチドから誘導されたか、または前記ポリペプチドをコードする遺伝子から発現 されるポリペプチドの混合物を包含する。前記切頭ポリペプチドは、例えばｃＤ ＮＡの一部分が制限酵素消化または他の適当な方法により欠失されたベクターお よび／または宿主細胞系で生じ得、結果的にその系では通常生成されない蛋白質 が発現され得る。 また、本発明ポリペプチドは、ポリペプチド配列の個々のアミノ酸の連続的結合 またはポリペプチド配列の７ラグメントを形成する個々のアミノ酸の結合（続い てフラグメントを結合することにより所望のポリペプチドが生成される）を利用 する液相または固相ペプチド合成のよく知られた方法により製造され得る。固相 ペプチド合成は、例えばＲ，Ｂ、メリフィールド、「ジャーナル・オブ争アメリ カン・ケミカル−ソサエティー」、８５．１９６３．２１４９頁の記載に従い遂 行され得る。固相合成では、アミノ酸配列は、最初のアミノ酸を固体支持体に結 合し、次いでペプチド結合によって所望の長さが達成されるまで配列内の他のア ミノ酸を付加するすることにより構築される。この態様において、固体支持体は また、下記ワクチン製造における本発明ポリペプチドの担体としても機能し得る 。 合成ペプチドの製造は、本質的にシニック、「アニュアル・レビュー・オブ・マ イクロバイオロジー」、３７．１９８３．４２５−４４６頁の記載ｌこ従い行な われ得る。 本発明の別の態様は、ｕ−ＰＡＲ化合物と反応するモノクローナルまたはポリク ローナル抗体およびそれらの製造方法である。「抗体」という語は、本発明ポリ ペプチドへの暴露に対する応答としてを推動物またはより正確にはを推動物起源 の免疫系に属する細胞により産生される物質を指す。 抗体の変異ドメインは可変および定常配列により構成される。ドメインの変異部 分は抗体のイディオタイプと呼ばれる。抗体のこの部分は抗原との相互作用、抗 原結合に関与する。 イディオタイプ構造は抗原性であるため、イディオタイプ構造を指向した特異抗 体に対して生じ得る。これはマウスで行なわれた。 イディオタイプに対して生じた抗体、抗イデイオタイプ抗体は、もとの抗原の構 造を模倣し得るため、もとの抗原として機能することにより、もとの抗原と反応 する抗体を生じ得る。この方法は、問題の蛋白質の重要な免疫原性部分の特性検 定および合成と関連した問題をめぐるものであるため、有利であり得る。これは 立体配座エピトープの場合に最も重要であり、他の方法であれば同定が困難であ り得る。それは、防御免疫性がこの方法で誘導され得る若干の生物について示さ れた（例、トリパノゾーマ・デュルゼイ、トリパノゾーマ・ブルセイ、８塁肝炎 ウィルスおよびプラスモデイウム・ノウレジ）。 本発明の抗体は、免疫原形態で本発明ポリペプチドの少なくとも天然または合成 部分を投与することにより、前記ポリペプチドと反応する抗体産生細胞を得、生 物または細胞から抗体含有物質を単離することを含む方法により製造され得る。 本発明抗体の製造方法については後で詳述する。 上記抗体は、好ましくは単一特異的抗体である。単一特異的抗体は、適当な動物 へ本発明ポリペプチドの実質的に純粋な製品を注射し、初回採血前の４まＩ：は ５か月まで適当な間隔（例、■または２週間ないし１箇月）で１回またはそれ以 上のブースター注射をすることにより生成され得る。確立された免疫化スケジュ ールを続行し、各ブースター免疫化の約１週間後動物から採血し、抗体を適当な 方法で血清から単離する（例、バーボーおよびインギルド、５ｃａｎｄ。 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　２（補遺ｌ）、１９７３．１６１−１６４頁参照）。 高い検定特異性を要求しないのであれば、抗体はポリクローナル抗体であり得る 。ポリクローナル抗体は、例えばバーボーおよびインギルドの記載（上記参照） に従い得られる。さらに具体的には、ポリクローナル抗体を得る予定の場合、好 ましくは適当なアジュバント、例えば７０インド不完全または完全アジュバント を加えた後、ｕ−ＰＡＲ化合物製品を動物に注射する。免疫原がヒ）ｕ−ＰＡＲ 化合物である場合、動物はウサギであり得る。動物を定期的、例えば１週間間隔 で採血し、得られた血液を抗体含有血清７ラクシ履ンに分離し、所望ならば前記 ７ラクシ甘ンをさらに別の慣用的抗体精製方法、および／または精製ｕ−ＰＡＲ 化合物の使用を含む方法に付す。 別の好ましい態様では、モノクローナル抗体が得られる。モノクローナル抗体は 、ｕ−ＰＡＲ化合物の必須成分、すなわちエピトープに対してまたは実質的にそ れを指向して産生され得る。モノクローナル抗体は、慣用的技術（例、ケーラー およびミルスタインによる「ネイチャー」、２５６．１９７５．４９５頁記載） により、例えばハイブリドーマ・セルラインの使用により、またはクローンもし くはそのサブクローンまたは前記モノクローナル抗体コードするハイブリドーマ ・セルラインからの遺伝情報をもつ細胞により製造され得る。モノクローナル抗 体は、モノクローナル抗体を産生ずる細胞を適当なセルラインの細胞と融合し、 生成した前記モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を選抜およびク ローニングすることにより製造され得る。別法として、モノクローナル抗体は、 前記モノクローナル抗体を産生ずる非融合細胞を不死化し、続いて細胞を適当な 培地で生長させて前記抗体を産生させ、生長培地からモノクローナル抗体を採取 することにより製造され得る。 本発明の抗体の製造に使用される免疫化動物は、好ましくはウサギ、サル、ヒツ ジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットから成る群から選択さ れる。本発明の抗体を産生する細胞は、ひ臓細胞またはリンパ細胞、例えば末梢 リンパ球であり得る。 本発明の抗体の製造においてハイブリドーマ細胞を使用する場合、これらはイン ビトロまたは動物の体腔で生育され得る。抗体産生細胞を動物、例えばマウスに 注射すると、動物の腹水中で高濃度の抗体を放出する腹水腫ようが形成される。 動物は同じく正常抗体を産生ずるが、これらは、標準的精製方法、例えば遠心分 離、ろ過、沈澱、クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせにより腹水から 精製され得るモノクローナル抗体の僅かなパーセンテージに達するにすぎない。 モノクローナル抗体が製造され得る適当な方法の一例は、結果として常襄技術（ 例、Ｒ，ダルチャウ、Ｊ、キルクレイ、Ｊ、Ｗ、ファープルによる「モノクロー ナル・アンティボディー・トウ・ア・ヒユーマン・ロイコサイト−スペシフィッ ク・メンプラン・グリコプロティン拳プロバブリイ・ホモロガス・トウ・ザ・ロ イコサイト−コモン（Ｌ−Ｃ）アンティゲン・オブ・ザ・ラット」、「ヨーロピ アン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー」、１０，１９８０．７３７−７４４ 頁に記載）を用いた免疫化マウス（例、Ｂａ１ｂ／ｃマウス）からのひ臓細胞と ミエローマ細胞を融合する方法である。得られた融合体を慣用的技術、例えば上 記方法で単離されたｕ−ＰＡＲ化合物を用いる結合検定によりスクリーニングす る。 別の態様において、本発明は、試料においてｕ−ＰＡＲまたはその誘導体を検出 および／または定量し得る診断剤に関するものである。 上記検討によると、前記診断剤は、癌および組織侵入および組織改造を伴う他の 疾患のプロセスにおけるｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの関与を考慮すると、これらの診断に 貴重であり得る。ここで実施例６で示されているｕ−ＰＡＲｍＲＮＡが結腸癌腫 における侵入正面から一貫して見出されるという発見は、この考えを強く支持し ている。この関係において、胸部癌患者からの血清が正常個体と比べて高濃度の Ｕ−ＰＡを有すること（グレンダールーハンセン等、１９８８）、および胸部癌 組織におけるｕ−ＰＡ含有量は、例えば本出願の優先権年度に公開されたように この疾患における貴重な予後マーカーであることが示されたこと（ヤーニツケ等 、１９８９、ｌ　９９０）も興味深い。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの存在がｕ−ＰＡ機能にとって先行条件であるという事実によ り、癌組織におけるｕ−ＰＡＥ含有量はいっそう優れた診断的および予後マーカ ーであると考えられる。ｕ−ＰＡＲ測定結果の潜在的な診断および予後用途の新 しい態様は、外来的に加えられるホスホリパーゼの非存在下でさえ行なわれる培 養細胞からのｕ−ＰＡＲの放出である（実施例４に記載）。この発見により、ｕ 　−Ｐ　Ａ　Ｒもまた何等かの生理学的および異常生理学的条件下および特に癌 において体液中へ放出されるという可能性が生じる。従って、体液、例えば血清 、尿および腹水中におけるｕ−ＰＡＲまたはその分解生成物の濃度の測定は、診 断的および／または予後的に貴重であることが判明し得る。 診断剤は、例えば上記抗体であり得る。別法として、診断剤は、容器中に、ｕ− ＰＡＲの特有のアミノ酸配列、例えば配列（１）を含むかまたはこれに含まれる 配列を含むポリペプチドを含む試験キット形態であり得る。診断剤は、細胞上に 存在する異常な数のｕ−ＰＡＲに関連した疾患の診断において使用され得る。 上記診断剤は、抗体が結合する固体粒子が、試験に付された試料中本発明ポリペ プチドの存在下で凝集する凝集検定での使用に適したものであり得る。このタイ プの試験では、抗体の標識は必要ではない。しかしながら、大部分の用途の場合 、抗体に結合抗体検出用の標識を付すのが好ましく、または別法では（例えば二 重抗体検定において）、標識および非標識抗体の組み合わせが使用され得る。 標識として使用される物質は、それ自体検出可能であるかまたは別の物質と反応 して検出可能な生成物を生じ得るあらゆる物質から選択され得る。すなわち、標 識は、放射性同位元素、酵素、発色団、蛍光性または化学発光性物質および複合 体形成剤から選択され得る。 標識として有用な酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース オキシダーゼ、炭酸脱水酵素、ペルオキシダーゼ（例、西洋わさびペルオキシダ ーゼ）、ホスファターゼ（例、アルカリ性または酸性ホスファターゼ）、グルコ ース−６−燐酸デヒドロゲナーゼおよびリボヌクレアーゼである。 酵素はそれ自体では検出不可能であるが、検出可能な最終生成物が得られる反応 を触媒するｔ；めには基質と組み合わせなければならない。すなわち、基質を反 応混合物に加えることにより、着色した蛍光性または化学発光性生成物または色 の変化または色、蛍光または化学発光の強度の変化が得られる。上述の酵素に対 する基質として本方法で有用な基質の例は、Ｈ，Ｏ，、ｐ−ニトロフェニルホス フェート、乳糖、尿素、β−Ｄ−グルコース、ｃｏｔｓ　ＲＮＡ、澱粉またはマ レエートである。基質は、例えば供与体または受容体である発色団と組み合わさ れ得る。 本発明方法により使用される成分検出用標識として使用され得る蛍光性物質は、 ４−メチルアンペリフェリルーホスフェート、４−メチルアンペリフェリルーロ ーガラクトピラノシドおよび３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸であ り得る。これらの物質は、蛍光分光光度計により検出され得る。化学発光性物質 は、ペルオキシダーゼ／エオシン／ＥＤＴＡ、インルミノール０！およびそれら の基質であり得る。 発光団は、０−フ二二レンジアミンまたは類似化合物であり得る。 これらの物質は分光光度計により検出され得る。放射性同位元素は、検出可能か つ研究室で許容され得る同位元素、例えば１．＄　１．１１１１、”Ｈ％　”Ｐ Ｓ”Ｓまたは＋４０であり得る。放射能は、γ−計数管もしくはシンチレーシ３ ン計数管またはラジオオートグラフィー、次いでデンシトメータ一手段により測 定され得る。 複合体形成剤は、プロティンＡ１プロテインＧ（免疫グロブリンと複合体を形成 する）、ビオチン（アビジンおよびストレプトアビジンと複合体を形成する）お よびレクチン（炭水化物決定基、例えばレセプターと複合体を形成する）であり 得る。この場合、複合体はそれ自体直接には検出され得ず、複合体形成剤が複合 体を形成する物質の標識を必要とする。標識付けは、上記標識性物質のいずれか により行なわれ得る。 本発明の実施態様において、本発明の抗体またはポリペプチドは、固体支持体に 結合させた架橋性化合物と結合され得る。固体支持体および抗体を結合させるべ く設計された架橋性化合物は、ヒドラジド、プロティンＡ、グルタルアルデヒド 、カルボジイミドまたはリジンであり得る。 使用される固体支持体は例えばポリマーであり、それはポリマー被覆されｔ；マ トリックスであり得る。マトリックスは、適当な固体材料、例えばガラス、紙ま たはプラスチック族であり得る。ポリマーは、可塑性セ゛ルロース、例えば特殊 処理紙、ニトロセルロース紙または臭化シアン−活性化紙であり得る。適当なプ ラスチック製品の例は、ラテックス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリ ウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテートおよびそれらの適当なコ ポリマーである。シリコーンポリマーの例にはシロキサンがある。 固体支持体は、トレイ、プレート、例えばマイクロタイタープレート、例えば薄 層または、好ましくはストリップ、フィルム、糸、固体粒子、例えばビーズ、例 えばプロティンＡ被覆細菌または紙の形態であり得る。 本発明のポリペプチドおよび抗体は、試料中に存在するポリペプチドの少なくと も一形態および／または一部分の同定および／または定量を目的とする検定で使 用され得る。本発明用途により遂行される同定および／または定量は、ｕ−ＰＡ Ｒ化合物またはｕ−ＰＡＲ化合物の一形態を伴う同定および／または定量であり 得る。すなわち、ｕ−ＰＡＲ化合物の定性的および定量的測定は、両方とも本発 明の使用により達成され得る。同定および／または定量は、ともに科学的、臨床 的および産業的目的で実施され得る。下記でさらに詳述されている通り、ｕ　− Ｐ　Ａ　Ｒ化合物の同定または定量は、臨床的常法において特に重要である。 試料は、生きている生物体、例えばヒトまたは動物から得られた標本であり得る 。標本は、血液、例えば赤血球濃厚分画、または例えば肝細胞を含む組織試料で あり得る。本発明の非常に興味深い実施態様では、標本は尿である。 本発明の好ましい一実施態様では、本発明方法で使用される抗体は、一般に検定 のより高い精度および正確さが達成されると同時に恐らくは実施時間も少なくて すむと考えられることから、モノクローナル抗体であるのが好ましい。さらに、 試験の検出限界および感度を高め得ることから、２種またはそれ以上のモノクロ ーナル抗体から成る混合物が使用され得る。モノクローナル抗体は下記方法によ り得られる。高い総合活性を有する抗体は、捕獲技術に関して選択され得る。 本方法で使用される抗体は、本発明の検定の精度および／または正確さを改良す るために、好ましくは実質的に純粋な形態（適当な技術または本発明方法により 精製、下記参照）である。 例えば上記の通り、試料中に存在し、本発明ポリペプチドと反応する抗体の測定 は、試料を本発明ポリペプチドと接触させ、前記接触により生じる結合抗体の存 在を検出し、結果を基準値と相関させることを含む方法の使用により行なわれ得 る。 本発明ポリペプチドが、試料中のｕ−ＰＡＲ化合物の存在を測定するための検定 で使用される場合、それは診断試薬または診断剤形態であり得る。当業界の熟練 者には明らかなことであるが、幾つかの技術が上記診断試薬と結びつけて適用さ れ得る。 本発明に従い、上記ポリペプチドのいずれかの部分を固体支持体に結合させると 、次いでその成分に対する抗体が固体支持体に加えられ得る。別法として、抗体 は固体支持体に結合される。 さらに別法として、試料中に存在するｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ化合物を全て固体支持体 に結合させる。次いで、固体支持体に成分を加えた後、検出可能なマーカーで標 識した抗体を加えることにより、それをポリペプチド成分とインキユベーシミン させ得る。 腫ようまたは他の疾患におけるｕ−ＰＡＲに関連した修飾転位ＤＮＡ配列の存在 の検出におけるＤＮＡフラグメントの使用は、ランダル等、「サイエンス」、１ ９８５．２３０：１３５０−１３５４頁、ランダル等、「サイエンス」、１９８ ８．２３９：４８７−４９１頁、およびストアレット等、「サイエンス」、１９ ８８．２３９：４９１−４９４頁に記載されたポリメラーゼ連鎖反応の原理を用 いて有利に行なわれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試料中に存在す るＤＮＡの増幅に使用される方法である。この方法は、増幅されるＤＮＡ７ラグ メントに近接する２つのオリゴヌクレオチド・プライマーの使用を必要とする。 オリゴヌクレオチド・プライマーは、例えば１０〜２０量体であり、ｕ−ＰＡＲ 遺伝子の近接領域を含むかまたはｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ遺伝子の一部分であり得る。 オリゴヌクレオチド・プライマーは、標的ＤＮＡのプラス鎖５′と一方のプライ マーを、そして標的ＤＮＡのマイナス鎖５′ともう一方のプライマーをハイブリ ダイゼーションさせ得るべく構築される。２つのプライマー間の好ましい距離は 、診断用途の場合５００−２０００塩基対であり、調製目的の場合さらに長い距 離でも許容され得る。プライマーを増幅すべき反対のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼ ーションさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラ ーゼ！または別の有用なりＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ のフレノウ断片を用いて伸長させることにより、プライマーがアニーリングされ るＤＮＡ配列に相補的なりＮＡ配列を合成する。これらの相補的配列の合成に続 いて、合成されたＤＮＡを例えば加熱により「親ＤＮＡストリング」から変成さ せ、親ストリングおよび新たに合成されたＤＮＡストリングを、新たなＰＣＲ増 幅サイクルに付す。この方法で、試料中に存在する特異的ＤＮＡ配列のかなりの 増幅の達成が可能となる。ＰＣＲ増幅方法の使用により、試料中に存在するもと もと非常に小さく検出不可能な量のＤＮＡ配列の増幅すなわち検出が可能となり 、その結果例えば癌細胞が同定され得る。 図に対する凡例。 図１１アブイニテイ精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的リガン ドへの化学架橋 Ａ）　ＰＭＡ処理ｕ９３７ａ細胞からの膜蛋白含有トリトンＸ−１１４７ラクシ １ンは固定化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡを用いるアフィニテイクロマトグラフイに付し た。中性化カラム溶出液を０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥により濃縮し た。精製前２×１８・細胞を表現する蛋白を還元条件下６−１６公配５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥを続けた（レーンｌ）。ゲルを銀染色した。マーカー蛋白の分子量（レー ン２）を示す。 Ｂ）アフイニテイ力ラム溶出液を希釈して検定の間、ｌｎＭのＵ−ＰＡＲのほぼ 等濃度を得た。試料をブレインキュベートのみ（レーン２）又は以下の非標識化 試薬の存在下、ｌｏｏｎＭの濃度でインキュベートした。ウシ血清アルブミン（ レーン３）、ｔ−ＰＡ（レーン４）、プラスミノーゲン（レーン５）、マウス表 皮性生成因子（レーン６）、ＡＴＦ（レーン７）、活性５４ＫＤｕ−ＰＡ（レー ン８）、ＤＦＰ−不活化５４ＫＤｕ−ＰＡ（レーン９）。室温で１５分間インキ ュベーション後、■−標識化ＡＴＦ（約１ｎＭ）を加え、次いで４℃で１時間イ ンキュベーションした。インキュベーション後、化学架橋をＤＳＳでなしとげ、 その後試料を非還元条件下、６−１６％公配ゲル上５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオート ラジオグラフィにより分析した。レーン１は、”’Ｉ−ＡＴＦを伴う架橋コント ロール及びｕ−ＰＡＲ又は競合物の不添加を示す。分子量標準蛋白の電気泳動可 動性を示す（ｋＤ）。 Ｃ）中性化アフィニテイ力ラム溶出液を（Ａ）におけるように濃縮して、約１５ μｇ／罰のｕ−ＰＡＫ濃縮物を得、５０　／７９／ｌｌｌ２ＤＦ　Ｐ−処理ｕ− ＰＡの存在下、ＤＳＳと（レーン３）、又はそれのみ（レーン４）と架橋した。 コントロールとも二精製ｕ−ＰＡＲのみ、化学架橋なしくレーン５）、ＤＦＰ処 理ｕ−ＰＡのみ、化学架橋なしくレーン１　）；Ｄ　Ｆ　Ｐ−処理ｕ−Ｐ　Ａ　 ｓ架橋のみ（レーン２）。試料は非還元条件下、Ｐｈａｓｔ−３ＤＳ−ＰＡＧＥ を続けた。ゲルを銀染色した。化学架橋はＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡのみの移動速度 で少しの増加となり、多分、内側架橋によるものであるが、ｕ−ＰＡＲのみのも のではない。分子量標準蛋白の電気泳動可動性（レーン６）を示す（ｋ　Ｄ）。 図２、精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの酵素脱グリコジル。アフィニテイ精製＋２ｆｉＩ −標識化ｕ−ＰＡＲを緩和な還元条件下（実験方法参照）変性による脱グリコジ ルのための前処理し、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処理しくレーン２）又 は直接分析した（レーン１）。分析は６−１６％公配ゲル上、還元条件下、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより行ない、次いでコダックＸＡＲフィルム上オートラジオグラ フィを行なった。 標準蛋白の電気泳動可動性を示す（ｋ　Ｄ）。 図３、架橋”Ｉ−ＡＴＦの脱グリコジル：ＰＭＡ−処理及び非処理ｕ９３７細胞 からのｕ−ＰＡＲコンプレックス。ＰＭＡ−処理（レーンｌ及び３）及び非処理 （レーン２及び４）細胞を酸処理し、０．５％ＣＨＡＰＳで溶解した。溶解質を ”’Ｉ−ＡＴＦとインキュベートし、ジサクシニミジルスベリン酸塩で架橋し、 緩和な還元条件下変性し、次いでペプチド二Ｎ−グリコシダーゼＦの存在下（レ ーン３及び４）又は不存在下（レーンｌ及び２）、さらにインキュベートし、還 元条件下５ＤＳ−ポリアクリルアミド（６−１６％）ゲル電気泳動により分析し 、次いでオートラジオグラフィに付した。標準蛋白の電気泳動可動性を示す（ｋ 　Ｄ）。 図４はｕ−ＰＡＲのキモトリプシン断片の直接電気泳動分析を示す。精製ｕ−Ｐ ＡＲの試料を以下を用い３７℃で退化させた。キモトリプシンの最終濃度：　８ 　ｎｙ／ａＱｃレーン１）、４０　ｎｇ／ｉＱ（レーン２）又は２００　ｎｇ／ ｍｆｆ（レーン３）、或いは酵素を添加することなく同一条件でインキュベート した（レーン４及び５）。７時間のインキュベーション後（レーン１−４）又は インキュページ町ンすることなく直ちに（レーン５）、フェニルメチルスルフオ ニルフルオリド（１ｍＭ最終濃度）を加えた。試料を還元条件下、トリシン−５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、次いで銀染色した。分子量マーカー蛋白の電気泳 動可動性を示す（ｋ　Ｄ）。 図５は”’Ｉ−ＡＴＦへの化学架橋により分析したｕ−ＰＡＲのキモトリプシン 断片を示す。試料の調製及びレーンのナンバリングは図４におけると同じである 。試料を５０倍に希釈して”Ｉ−ＡＴＦへの化学架橋により、次いで還元条件下 ６−１６％公配ゲル上５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、そしてオートラジオグラフィに より分析した。分子量マーカー蛋白の電気泳動可動性を示す（ｋＤ）。 図６はＡＴＦに架橋したキモトリプシン断片の脱グリコジルを示す。精製ｕ−Ｐ ＡＲの試料を、フェニルメチルスルホニルフルオリドによる終結を含む、図４に 対する凡例に記載したように８ｎｇ／ＩＩＩＱキモトリプシン（レーン１及び４ ）又は４０ｎｇ／ｍＱキモトリプシン（レーン２及び５）で退化に付した。酵素 を受けないレーン３及び６の試料はインキュベートせず、同量のフェニルメチル スルホニルフルオリドを受けた。試料を５０倍に希釈し、”Ｉ−ＡＴＦへの化学 架橋に付した。架橋試料をＮ−グリカナーゼによる酵素脱グリコジルに付すか（ レーン４−６）平行して、Ｎ−グリカナーゼの添加なしで処理した（レーン１− ３）。分析は還元条件下６−１６％公配ゲル上５ＤＳ−ＰＡＧＥにより実施し、 次いでオートラジオグラフィに付した。分子量マーカー蛋白の電気泳動可動性を 示す（ｋ　Ｄ）。 図７、パネルＡは初アミノ末端アミノ酸配列情報及びライブラリイスクリーニン グ用に合成し用いたオリゴヌクレオチドを示す。■はイノシンを表わす。パネル Ｂはｐ−ｕＰＡＧの制限地図及び完全二本鎖配列用に用いた方法を示す。パネル Ｃは疎水性プロットを示す。 横座標はアミノ酸残基位置を示す、縦座標は、ホップ及びウッド（１９８１）並 びにカイト及びドーリトル（１９８２）のアルゴリズムを用いて計算した疎水性 の程度を示す。 図８はプラスミドｐ−ｕＰＡＲ−１の地図を示す。プラスミドはＮ−末端ペプチ ドから構成される２４−ｍａｒオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーシヨン によるオカヤマーベルダｃＤＮＡから分離した。 図９、ｐ−ｕＰＡＲ−ＩＤＮＡが移入したＬＢ６細胞に結合するＵＰＡのカゼイ ンプラク検定。プレートＡ及びＣ−ＦはクローンＬＢ６／−Ｐ−ｕＰＡＲ−１を 指し、一方プレートＢはクローンＬＢ６／Ｒ３ＶＣＡＴを指す。グレートＡには ｕＰＡは加えなかった。別に（プレートＢ−Ｆ）細胞は３７℃で１時間０．２％ ＭヒトｕＰＡとの結合段階に付した。結合段階の間に存在する以下の競合物を用 いた：なしくプレートＢ、Ｃ）：１００％ＭＡＴＦ（プレートＤ）：２００　ｐ ｔＭ合成ペプチドヒトｕＰＡ［１２３２（ａｌａｌ　９２）］（プレートＥ）： １００μＭ合成ペプチドマウスｕＰＡ［１３−３３（ａｌａ２０）］（プレート Ｆ）。 図１０Ａ％Ｒ５ＶＣＡＴ（閉環状）及びｐ−ｕＰＡＲ−ＩＤＮＡ（閉環状）を移 入したマウスＬＢ６細胞へのヒト１２″Ｉ−ＡＴＦの結合。 特異的結合は１１００ｎ非標識化ＡＴＦ（この実験では約１０１０００ｃｐによ り競合しない計数を引くことにより計算した。 図１０Ｂ、ＬＢ６／ｐ−ｕＰＡＲ−１細胞に架橋したＩＩＪ−ＡＴＦの還元５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミド（１２，５％）ゲル電気泳動分析。レーン１は分子量マ ーカーを有する（方法参照）。レーン２は標識化ＡＴＦ（３，０００ｃｐｍ）の 移動を表わす。レーン３及び４はリガンドと架橋した重複ＬＢ６／ｐ−ｕＰＡＲ −１抽出物を示す。レーン５及び６は非標識化ＡＴＦ（ｌｏｏｎＭ最終濃度）に よるリガンドへのＬＢ６／ｐ−ｕＰＡＲ−１細胞の架橋の競合を示す。右への最 後のレーンは同一リガントとｐ−ｕＰＡＲ−１を分離するために用いたＣＤＮＡ ライブラリィに対するＲＮＡの超厚として役立つヒトＧＭ６３７細胞とで得られ る（別の実験）架橋を示す。 図１１はＬＢ６細胞内に移入されたｐ−ｕＰＡＲ−ＰＦＬＭ　ｌ変異体のＳＤＳ 　−ＰＡＧＥ（１２，５％）電気泳動分析を示す。細胞はヨード化ＡＴＦとイン キュベートし、トリトンＸ−１１４で洗浄、抽出し、３００，０００細胞に対応 する抽出物の量が前に記載したようにＤＳＳと架橋して、ゲルを続けた（図のパ ートＣ）。同様に順化培地を１００．ＯＯＯｘｇで遠心し、上溝（１５，０００ 細胞に対応する容量）をヨード化ＡＴＦとインキュベートし、ＤＳＳと架橋し、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図のパートＢ）。レーンａ及びｂは異なる密 度で成長した細胞からの重複である。 図１２は酸加水分解後ｕ−ＰＡＲから放れたアミノ酸の陽イオン変換クロマトグ ラフィからの溶出プロフィルを示す。蛋白は、トリトンＸ−１１４デタージエン ド相分離及びアフイニテイクロマトグラフ４（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡセファロース） により、ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞（６Ｘ１０’細胞）から始めに精製した。純度 を改良し、アミン酸分析上、低分子量化合物から干渉を排除するために、このレ セプター調製物は０．１％酢酸に対して徹底的に透析し、凍結乾燥し、次いでト リシン−５ＤＳ−ＰＡＧＥ４ｍ付し、続いて０．４５／ＪＩＩＰＶＤＦ膜（８ｃ ＴＲ×８ｃｍ）上電気伝導に付しｔ；。挿入物はクーマシーブリリアントブルー Ｒ−２５０による染色後、固定化ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを示す。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの可動性の少しの低下がこの実験で見られ、凍結乾燥調製物中 のツイッターイオンデタージエントＣＨＡＰＳの大過剰による。ｕ−ＰＡＲを表 わすＰＶＤＦ膜の染色域を切除し、３．３′−ジチオジグロビオン酸（ＤＴＤＰ Ａ）の存在下、１１０”で２０時間、真空で加水分解した。Ｃｙｓ−Ｘは加水分 解の間システィンとＤＴＤＰＡの間で形成される生成物であり、ＧｆｆｃＮはグ ルコサミンであり、ＥｔＮはエタノールアミンである。 Ｆ１ａは、バシルス・セレウスからのホス７アチジルイノシトールー特異性ホス ホリラーゼＣ（Ｐ　Ｉ　−ＰＬＯ）による付着ＰＭＡ−刺激ｕ９３７細胞からの １１８１−標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの遊離を示す。始めに内因的に生成したｕ −ＰＡを酸処理によりＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞（２Ｘ１０’細胞／皿）から溶出 する。外因的に加えた１２６１標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡ（１ｎＭ及び４．５　 Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ）の結合を、２５ｍＭＨＥＰＥＳ％ｐＨ７，４を含む５顧血 清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地中４℃で２時間実施した。細胞をこの緩衝液 で３回洗浄後、１つの皿を５％ＳＤＳで抽出し、１００％細胞結合放射活性を明 らかにし、一方、他をもう一度酸処理して、酸抽出化活性を測定した（このレベ ルは縦座標で矢で示す）。２つの皿は各々０．６μ１ＰＩ−ＰＬＣ／ｒａＱを受 け（△）、一つは８μｇ／ｌａＱホスホリパーゼＡ２を受け（０）、一方、最後 の皿は緩衝液コントロールを構成した（・）。 培地の２つのアリコツト（１００μＩ２）を多血から、３７℃で撹拌テーブル上 でのインキュベーションの間にとり、放出放射活性を遠心（２０，０００ＸｇＳ 分間）後、上清中で測定した。試料は図１４に示すように５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り後で分析した。 図１４はコンプレックス形成及び１■！−標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの５ＤＳ− ＰＡＧＥによる分子分析及びＰ　Ｉ−ＰＬＯによる培地に放出されたｕ−ＰＡＲ を示す。図１３に記載される実験からの上清のアリコツトは、非還元条件下、直 接（Ａ）又は続＜１ｍＭジサクシニミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）と架橋し、サ ンプリン後直ちに実施して（Ｂ）、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ｌ　Ｏ％Ｔ、２．５％Ｃ ）により分析した。別の実験（Ｃ）で、２皿のＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞を、図１ ３に対する凡例に記載されるように培養し、酸処理する。中和後、−皿を５＋１ （２の血清のない培地（２５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭ１１６４０、ｐＨ７， ４）中０．６μｇＰＩ−ＰＬＣとインキュベートし、一方、他を５＋ｉＱの培地 のみでインキュベートした。リパーゼの添加及び直ちに遠心（２０，０ＯＯＸ９ ．５分間）後、アリコツトを０分、３０分及び６０分に抜き取った。上清を１１ ■標識化ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡ（ｌｎＭ）と４℃で１時間ブレインキュベートし 、次いで１ｍＭＤＳＳと架橋した。最も右のレーン（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ）はｕ− ＰＡＲの不存在で架橋した１！ｌ！標識化リガンドを表わす。試料は上のように ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 図１５は、ＰＩ−ＰＬＯで処理による精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの疎水性性魁理する ことなく（ＮＯＮＥ）又は全くホスホリパーゼがない（ＭＯＣＫ）か又は２０μ ｍ２／ＩＩ＋１２／　Ｐ　Ｉ　−Ｐ　Ｌ　Ｏの存在下（Ｐ　Ｉ−ＰＬＣ）、５Ｑ ｍＭ）リエチルアミン／ＨＣ（１（ｐＨ７，５）、５ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ トリトンＸ−１００中、３７℃で３０分間インキュベートした。一つの試料を５ ０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６，０）、ｌ　ＯｍＭＣａ（ｌｚ中生キヤベツら精製した２ ００μｇ／ｒａＱホスホリパーゼＤと共に（ＰＬＤ）、そして他は５０ｍＭＨＥ ＰＥＳ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭＣａＣα２中ハチ毒から精製した１００μｇ／ ｌａＱホスホリパーゼＡ２で（Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚ）インキュベートした。これらの ｕ−ＰＡＲ調製品は次いで１％トリトンＸ−１１４中、温度誘発デタージエント 相分離に付した。この相分離を、それぞれ余分のトリトンＸ−１１４及び０．１ Ｍ）リス（ｐＨ８，１）の添加により水及びデタージエント相を得るのに一度繰 り返した。最後に、１ｎＭ”！標識化ＡＴＦとの架橋分析を水（Ａ）及びデター ジエント（Ｄ）相の同時のアリコツト上で実施し、次いで非還元条件下、５ＤＳ −ＰＡＧＥ（１０％Ｔ及び２．５％Ｃ）により行なった。”’Ｉ−ＡＴＦ／ｕ− ＰＡＲコンプレックス（Ｍｒ７０．０００）に相当する領域をポリアミドゲルか ら切険し、放射活性を測定した（各レーンの底にＡ＋Ｄで全放射活性の％として 示す）。 図１６は、ＧＰＩ−膜沈降の間プロセシング部位が既知である蛋白からのＣ０Ｏ Ｈ末端アミノ酸配列のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに関し予言されたものに対する（アミノ 酸分析を基礎として、表５）比較を示す。グリコリピドへの付着に含まれるアミ ノ酸が目たつ。ＶＳＧ及びＰＡＲＰは変異体表面グリコプロティン及びトリパノ ゾマ・プルケイからのプロサイクリック酸性反復蛋白を表わす。ＣＥＡは癌胎児 性抗体である。ＰＬＡＰは胎盤アルクリホスファターゼであり、’ｒｈｙはラッ ト胸腺細胞から分離した表面グリコプロティンを表わす。 図１７はＰＭＡで処理したｕ９３７細胞中、ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡのノーザンプロ ット（Ａ及びＢ）分析を示す。細胞は１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０培地 に０．５Ｘ１０”／＋ｍ４で接種し、１５０ｎＭＰＭＡと示した数の時間インキ ュベートした。インキュページ覆ン後、粘着性及び非粘着性細胞を採り、集めて 、全ＲＮＡを材料及び方法に記載したように分離した。ノーザンプロット分析用 に、全ＲＮＡの３０μ９を変性条件下１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ニ トロセルロースフィルター上にプロットした。フィルターを任意感作（ｐｒｉｍ ｅｄ）標識化ｃＤＮＡプローブ（Ａ）又はｐ−アクチンｃＤＮＡグローブ（Ｂ） にハイブリッド形成した。ノーザンプロットのりポゾームＲＮＡは左に示す。 図１８は、異なる時間期間ＰＭＡで処理した、ｕ９３７細胞からのトリトンＸ− １１４相分離抽出物からの”Ｉ−ＡＴＦに化学架橋したデタージエント相の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥを示す。非処理細胞及びＰＭＡ（１５０ｎＭ）処理細胞を酸処理し て溶解した。デタージエント相を”’Ｉ−ＡＴＦとインキュベートし、Ｄｓｓと 架橋して、６−１６％５ＤＳ−ＰＡＧＥ公配ゲル中で移動し、次いでオートラジ オグラフィに付した。分子量標準蛋白の電気泳動可動性は左に示す。１１非処理 細胞、２、＋　Ｐ　Ｍ’Ａ　３時間、３、＋ＰＭＡ９時間、４、＋ＰＭＡ２時間 、５、＋ＰＭＡＪ８時間、６、ブラインド、７、ＨＥｐ２細胞からの１％トリト ンＸ−１１４総溶解質（１／２５希釈）図１９は、ＰＭＡ、デキソメサゾン、ｍ ＥＧＦ及びｐ’ｒｃＦ−β１で処理したＡ３４９及びＲＤ細胞中のｕ−ＰＡＲｍ ＲＮＡのザンプロット分析を示す。細胞はＤＭＥＭ中０．５ＸＩＯ’／ｉαで接 種し、集合に成育し、血清のない条件下に４８時間保ち、次いで不添加（１，６ ）Ｄｅｘ（１０−’ＭＸ２．７）ＰＭＡ（１５０ｎＭＸ３．８）ｍＥＧＦ（２０ ０ｎｙ／　＋ｏｌＸ　４　、９　）及びＴＧＦ−β１（７−５ｎｇ／ｍＱＸ５． ｌ　Ｏ）の添加で４８時間処理した。インキュベーション後、粘着性及び非粘着 性細胞を取り、集め、全ＲＮＡを材料及び方法に記載したように分離した。ノー ザンプロット分析として、全ＲＮＡの３０μζを１．５％アガロースゲルに変性 条件下電気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にプロットした。フィルター を任意感作標識化ｕ−ＰＡＲｃＤＮＡグローブにハイブリッド形成した。ノーザ ンにおけるリポゾームＲＮＡの位置は左に示す。 図２０は、異なる時間期間、ジプッリルｃ　Ａ　Ｍ　Ｐで処理したｕ９３７細胞 からのトリトンＸ−１１４相分離抽出物からの、”’Ｉ−ＡＴＦに化学架橋した デタージェント相の５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 非処理細胞及びジブッリルｃＡＭＰ（１ｍＭ）処理細胞を材料及び方法に記載し たように酸処理し、溶解した。デタージェント相は１４８　Ｉ−ＡＴＦとインキ ュベートし、ＤＳＳによって架橋し、６−１６％５ＤＳ−ＰＡＧＥ公配ゲル内を 移動し、次いでオートラジオグラフィに付した。分子量標準蛋白の電気泳動可動 性は左に示す。１、非処理細胞、２、＋ジブツリルｃＡＭＰ１２時間、３、＋ジ ブッリルｃＡＭＰ２４時間、４、＋ジブツリルｃＡＭＰ４８時間、５、＋ジプッ リルｃＡＭＰ７２時間。 図２１は、ｃＤＮＡサブクロンｐＨＵＲＯ６から生じたアンチセンスＲＮＡを用 いたヒト結腸腺癌のパラフィン部分へのハイブリダイゼーシ２ンを示す。侵入フ ォーカス（ａ及びｂ）での分裂腫瘍線は、腫瘍細胞のストランドの前縁での細胞 へのハイブリッド形成を示す（ｂ中の矢印：ｂはａにおける正方形領域の拡大で ある）。密着細胞よりなる腫瘍線において、ハイブリッド形成信号は、悪性上皮 のアブルミンの（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）表面に上記細胞を示す（ｃ：矢印）、か 、あるいは上記細胞は、腺の囲りの間質組織に位置する（ｄ：矢印）。新血管新 生の領域において、−見して間充織由来の細胞はハイブリッド形成を示す（ｅ） 。拡大：２１６Ｘ（ａ）、５・４０×（ｂ−ｄ）、８７０Ｘ（ａ）。 図２２、添加自生ヒトプラスミノーゲン、の濃縮物での血清培地中のプラスミン 形成の依存。ＨＴ−１０８０細胞の融合層を、１０％熱不活化及びプラスミノー ゲン枯渇胎児ウシ血清を含むＭＥＭ培地（０，５＋１Ｉ２）中、自生ヒトプラス ミノーゲンを示した濃度まで加えて、３時間インキ−ユベートした。調整培地を 収集して細胞をＦ’Ｂ、Ｓで３回すすいだ。細胞をＰＢＳ中１ｍＭ）ラネキサム 酸で処理してプラスミンの結合フラクションを得た。プラスミンをチオエステラ ーゼ活性として細胞結合フラクション（０−−０）及び培地（・−一・）で検定 した。 図２３、血清を含まない、及び血清含有培地からＨＴ−１０８０細胞へのプラス ミン取込み。ヒトプラスミン（０−５μｇ／禦ａ）を、血清ヲ含！ないＭＥＭ培 地（ＳＦＭＯ，５ｍｆｆＸ○−−０）又は１０％熱不活化胎児ウシ血清（ＳＭＸ ・−−・）を含むＭＥＭ培地のいずれかで生育したＨＴ−１０８０細胞層に加え た。３７℃でインキュベージ１ン３時間後、結合フラクション（Ａ）及び調整培 地（Ｂ）のグラスミンをチオエステラーゼ活性として検定した。図９Ｂにおいて ＳＦＭアンドＳＭ中活中上性て用いた異なるスケールに注意されたい。 図２４、ＨＴ−１０８０細胞から血清を含まない及び血清含有培地へのプラスミ ン放出。ＨＴ−１０８０細胞の融合層は、ヒトプラスミン（０−５μ９／ＩＩＱ ）を含む血清を含まないＭＥＭ培地（０，５１１１２）中、３７℃で１時間イン キュベージ厘ンによりプラスミンをのせた。 細胞層を３回すすいだのち、それらは、血清を含まない培地（０−−Ｏ）、１０ ％熱不活化及びプラスミノーゲン枯渇胎児ウシ血清含有培地（・−一・）又はト ラネキサム１（１００μＭ）を伴う後者（■−−■）と３７℃で２時間インキュ ベートした。次いでプラスミンを細胞結合フラクション（Ａ）及び培地ＣＢ）中 で検定した。新培地への移入の時に、２．５μ９のプラスミン／ウェルによる前 処理から約２８ｎｇの細胞へのプラスミン結合があった。 図２５、□血清培地中、結合プラスミンを生成する結合ｕ−ＰＡ活性及び能力へ のＤＦＰ−ｕ−ＦＡによるＨＴ−１０８０細胞の前処理の効果。ＨＴ−１０８０ 細胞の融合細胞層を血清含有培地（０，５ＩＩＱ）中ＤＦＰ−ｕ−ＰＡの示した 濃度と、３７°Ｃで１８時間ブレインキュベートした。３回すすいだ後、細胞を 、自生ヒトプラスミノーゲン（４０μｇ　、＋１１１２）を添加した１０％熱不 活化及びプラスミノーゲン枯渇胎児ウシ血清を含むＭＥＭ培地と３７°Ｃで１時 間インキュベートした。インキュベージコン後、増殖ウェルの半分を酸−グリシ ンですすぎ、処理して、Ｄ　Ｆ　Ｐ　−ｕ　−Ｐ　Ａ％　ｐｒｏ−ｕ　−Ｐ　Ａ 及び活性Ｕ−ＰＡを含む全結合ｕ−ＰＡ（０−一〇）を回収した。他のウェルは トラネキサム酸による溶出により結合プラスミン（・−一・）を回収した。 図２６、プラスミノーゲンの添加後、血清培地中、細胞結合Ｕ−ＦＡプロ酵素の 活性化。ＨＴ−１０８０細胞の融合層を３５Ｓ−メチオニンで３７℃で５時間前 標識化した。１０％熱不活化及びプラスミノーゲン枯渇胎児ウシ血清で完全培地 を回復後、自生ヒトプラスミノーゲン（５０μｇ／ｗｒＱ）を加えてインキュベ ージジンを３時間続けた。アプロチニン（２００Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｒｓＱ）を培地の 回収前加え、すすいだ細胞を酸−グリシンで処理して結合ｕ　−Ｐ　Ａ　７ラク シヨンを回収した。酸溶出物を中和し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ前、還元条件下にｕ− ＰＡに対するヤギ抗体で免疫沈降した。蛍光ダラムは、：レーン１において、プ ラスミノーゲンがなく、ヒトも−ＰＡに対するヤギ抗体による培養物のコントロ ール免疫沈降、レーン２、ヤギーＵ−ＰＡ抗体で免疫沈降したプラスミノーゲン のない培養物、レーン３、ｕ−ＰＡ抗体により免疫沈降したプラスミノーゲンに よる培養物を示す。 図２７、プラスミノーゲンの添加後、血清培地中、細胞結合ｕ　−ＰＡプロ酵素 の活性化。ＨＴ−１０８０細胞の融合層を１０％熱不活化及びプラスミノーゲン 枯渇胎児ウシ血清並びに自生ヒトプラスミノーゲン（４０μｅ／ｍｆｆ）を含む ＭＥＭ培地とインキュベートした。 示した期間の時間後、アプロチニン（２００Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＱ）を加えてすすい だ細胞を酸−グリシンで処理してｕ−ＰＡの結合フラクションを回収した。中和 溶出液中のｕ−ＰＡを、測定ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ指数（方法参照）へのＮＰＧＢ不 活性化段階を用いる免疫捕獲法により検定しｔ；。図２７Ａは、プラスミノーゲ ン（○−−〇）プラスミノーゲンあり（・−−・）培養に関するｐｒｏ−ｕ−Ｐ Ａ積指数示す。プラスミノーゲンを伴うゼロ−タイム試料は、細胞の作り上げ（ ｗｏｒｋ−ｕｐ）の間すでにいくらかの変化が起きたことを示す。図２７Ｂは、 プラスミノーゲンなしく○−−〇）、プラスミノーゲンあり（・−一・）及びプ ラスミノーゲンとヒトＰＡＩ−１（１０μｇ／ＷＩＱ）に対する中和モノクロー ナル抗体あり（■−−■）の培養物からの溶出ｕ−ＰＡ活性を示す。 図２８、細胞表面プラスミノーゲン活性化用モデル。この提案されたモデルでは 、ｕ−ＰＡレセプター（ｕ−ＰＡ−Ｒ）及びプラスミノーゲンレセプター（ｐｉ ｇ−Ｒ）は細胞膜上に描かれる。プラスミノーゲン（ｐｉｇ）にさらす前に、事 実１全ての結合ｕ−ＰＡはｐｒｏ−ｕ−ＰＡ（開放四方形）として存在するが、 いくつかの活性ｕ−ＰＡ分子が存在する（閉鎖四方形）と仮定する。プラスミノ ーゲン（開放長方形）、結合（トラネキサム酸の存在により妨げうる）上、プラ スミン（ｐｉ。 閉鎖長方形）は結合活性ウロキナーゼの作用により細胞上に形成する。この段階 は、ＦＡ　Ｉ　−１及びＦＡＩ−２により並びにｕ−ＰＡに対する抗−触媒モツ クローナル抗体（抗−ｕ−ＰＡ−ａｂ）により阻害しうる。このように形成した 結合プラスミンは血清培地中に存在するアルファー２＝抗プラスミンによる阻害 に抵抗性であるが、アプロチニン及びプラスミンに対する抗触媒モノクローナル 抗体（抗−ｐｉ−ａｂ）による阻害に感受性である。活性プラスミンは入手可能 となるので、それは活性ｕ−ＰＡへのより結合ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性化を触媒 し、かくして蛋白分解系を増幅する。ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性化は、トラネキサ ム酸（これはプラスミノーゲン結合を阻止する）、アプロチニン及びプラスミン に対する抗触媒モノクローナル抗体により阻害される。 図２９、ヒトｕ９３７細胞への”Ｉ−ＡＴＦの結合の非標識化Ｕ−ＰＡ（・−− ・）又はｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１コンプレツクス（０−−Ｏ）による競合。［競合 者］は、含まないか又はＦＡ　Ｉ　−１複合化Ｕ−ＰＡの濃縮である。ＦＡＩ− １／ｕ−ＰＡコンプレックス形成のため、５０倍過剰のＦＡＩ−１をｕ−ＰＡと 室温で１時間ブレインキュベートした。レセプター結合は、４℃で９０分間実施 した。挿入物は、ｕ９３７細胞とのインキュベーションの前（レーン３及び６） 及び後（レーン１．２．４．５）のｕ−ＰＡ及びＰＡＩ−１／ｕ−ＰＡ溶液のザ イモグラフィック分析を示す。レーン１−３では、ＰＡＩは存在しなかった。レ ーン４−６では、５０倍過剰のＦＡＩ−１が存在した。レーン１　４：ｌ　Ｏｎ Ｍｕ−ＰＡル−ン２．３．５及び６：３．３ｎＭｕ−ＦＡ０即ち、ＰＡＩ−１の 存在で全てのｕ−ＰＡはコンプレックス形である。 図３０、ｕ９３７細胞への”’Ｉ　−ｕ−ＰＡ／ＰＡ　Ｉ　−１’：１ンプレッ クスの結合の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。３つの最も右のレーンは、５０又は１５０ 倍ＰＡ　Ｉ　−１過剰でコンプレックスを形成する前又は後、結合に用いる標準 化ｕ−ＰＡ調製物を示す。各レーンのトップで、非標識化競合者と”’Ｉ−ｕ− ＰＡ以上の倍過剰ＦＡＩ−１の同一を示す。右への矢印は、高分子量（ＦｆＭＷ ）、低分子（ＬＭＷ）ｕ−ＰＡの及びｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１コンプレツクスの移 動を示す。左の数は、分子量マーカーの移動を示す。 図３１．ｕ９３７細胞中、レセプター結合ｕ−ＦＡへのＰＡ−１の結合の５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析。ｐｒｏ　−ｕ　−Ｐ　Ａを記したレーンは結合に月いた”’　 Ｉ　−ｐｒｏ−ｕ　−Ｐ　Ａを示す。レーンＣは、不活化、ヨード化ｐｒｏ−ｕ −ＰＡのみとインキュベートした細胞抽出物の分析を示す。トップの数は結合混 合物のＦＡＩ−１のｎＭ濃度を示す。「パインディングのスパン」及び「細胞− 結合」を多肥した４つのレーンの２つのセットは上溝及び細胞の分析を指す。「 溶液」を記した４レーンのセットは、細胞の不存在下、ＦＡＩ−１と活性ｐｒｏ −ｕ−ＰＡのコンプレックス化で得た結果を示す。 図３２、レセプター結合ｕ−ＰＡのＦ’Ａｌ−１阻害のカゼイノリチック（ｃａ ｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ）プラーク検定。 第１列：細胞は、ａ：ｏ、１％ＢＳＡ、ｂ：ｏ、１％ＢＳＡ中１０ｎＭｕ−ＰＡ 、ｃ：ｏ、１％ＢＳＡ中１０ｎＭＤＦＰ−ｕ−ＰＡ、ｄ：ｏ、１％ＢＳＡ中Ｉ　 Ｑ　ｎＭｕ　−Ｆ　Ａプラス７５　ＯｎＭＰＡ　Ｉ　−１と、４℃で１時間イン キュベートした。 第２列：細胞は２シリーズのインキュベーションに付し、まず４℃で６０分、次 いで洗浄し、室温で２０分間さらに再びインキュベートした。ｅ：ＢｓＡ中１０ ｎＭＤＦＰ−ｕ−ＰＡと共に、次いでＢＳＡ中］ＯｎＭｕ−ＰＡと共に、ｔ：ま ずＢＳＡ中１０ｎＭｕ−ＰＡと共に、次いでｌ　ＯｎＭＤＦＰ−ｕ−ＰＡ及び７ ５０ｎＭＰＡＩ−１と共に、ｇ：まずＢＳＡ中１０ｎＭｕ−ＰＡと共に、次いで ｌｏｎＭＤＦＰ−ｕ−ＰＡと共に。 インキュベージコンの終りに、細胞を完全に洗浄し、カゼイン及びプラスミノー ゲンを含む寒天で覆い（方法欄参照）３７℃で３時間インキュベートした。 図３３は、４℃から３７℃への温度の変更後レセプター結合リガンドの宿命（ｆ ａｔｅ）を示す。ｕ９３７１Ｂ胞は示したリガンドと４℃で９０分間インキュベ ートし、次いで細胞を洗浄し、示した温度でリガンドの不存在で３７℃でインキ ュベートした。データはステップ２インキユベージ１ンのゼロ時に回収した総数 のパーセンテージで表わす。開放円：レセプター結合リガンド、つまった円：細 胞結合、非酸抽出性リガンド。開放三角形二上清におけるＴＣＡ可溶性放射活性 。レセプター結合及び細胞結合放射活性は常にすべてＴＣＡと沈澱性であった。 図３４は、全実験例の間（ステップ１１ステツプ２及び洗浄緩衝）、５０ｎＭ低 分子量ｕ−ＰＡの存在下レセプター結合ｕ−ＰＡの宿命を示す。開放記号は全体 の放射活性を表わす。埋めた記号はＴＣＡ沈澱性数を表わす。四角形：レセプタ ー結合ｕ−ＰＡ（即ち酸抽出）。三角形：上清中の放射活性、円：非酸抽出細胞 結合ｕ−ＰＡ、縦座標（ｃｐ畷％）は、ステップ１インキユベーシヨンの終りで 回収した数のパーセントを表わす。 図３５は、ｕ９３７によるｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１退化へのクロロキン処理の効果 を示す。Ａ部：コントロール（添加なし）、８部ニステップ１及びステップ２イ ンキユベージ覆ンの間０　、５　ｍＭクロロキン。 開放円：レセプター結合リガンド。三角形：非酸抽出性、細胞結合リガンド。埋 めた円；上清中の退化リガンド。縦座標（ｃｐｍ％）は、ステップ１インキユベ ーシヨンの終りに回収した数のパーセントを表わす。 全数は従って加えて１００％となる。欠けている量は、上清に存在する退化しな いリガンドを表わす（挿入参照）。全ての場合、レセプター結合及び細胞結合、 非酸抽出性リガンドはＴＣＡにより１ｏ。 ％沈澱性であった。 図３６はｕ９３７細胞へのｕＰＡＲ結合ｕ−ＰＡにょるプラスミノーゲン活性化 を示す。データは、緩衝液のみで洗浄したｕ９３７について示され、即ち、内因 性結合ｕ−ＰＡと（△）、ｕ−ＰＡとブレインキュベートした細胞（ロ）、酸洗 浄し次いでｕ−ＰＡとブレインキュベートした細胞（）、酸洗浄細胞（◇）及び ｕ−ＰＡに対する抗触媒モノクローナル抗体とブレインキュベートした細胞（１ ０μ９／ｙａＱ６０分間）（■）。示したデータは単一インキュベーシヨンから で、少くとも４回測定から得たデータの代表である。 図３７はＦＡＩ−１によるｕＰＡＲ結合ｕ−ＰＡの阻害を示す。ＰＡＩ−１濃度 はＯ−０−１８ｎ）、０．４６ｎＭ（◇）、１．８４ｎＭ（ロ）、４．６０ｎＭ （△）、１８．４ｎＭ（◆）であった。ＦＡ　Ｉ　−１不存在下のプラスミン出 現も示す（■）。描かれた線は、Ｋ　ａｐｐ’　ｓが計算された非直線回帰分析 による等式１（材料及び方法参照）への各インヒビター濃度での実験データの最 高適合を表わす。示される実験データは、各インヒビター濃度での単一インキュ ベーションからであり、４回測定から得たデータの代表であった。 図３８は、ＦＡ　Ｉ　−２によるｕＰＡＲ結合ｕ−ＰＡの阻害を示す。 ＦＡＩ−２濃度は１．１３ｎＭ（）、５．６７ｎＭ（◇）、１１．３ｎＭ（ロ） 、２８．３ｎＭ（Δ）及び５６．７ｎＭ（◆）であった。ＦＡＩ−２の不存在下 でのプラスミン出現も示す（■）。線は、図２に対する凡例に記載したように描 いた。示される実験データは、各インヒビター濃度での単一インキュベーシヨン からであり、３回測定から得たデータの代表であった。 図３９は、ＦＡＩ−１及びＦＡＩ−２によるｕＰＡＲ結合及び液相ｕ−ＰＡの阻 害の比較を示す。等式１（材料及び方法参照）から測定したＫ　ａｐｐ’　ｓは 、二重相反手順でインヒビター濃度番；対してプロットした。結合速度定数は、 ＦＡ　Ｉ　−１（口、■）及びＦＡＩ−２（Δ、ム）によりレセプター結合ｕ− ＰＡ（開放記号）及び溶液中（閉鎖記号）ｕ−ＰＡの阻害のため、これらの線の スロープの逆数力１ら計算しｔ；。 示されるデータ点は、少くとも３回測定の平均である。 図４０は、ｕ９３７細胞上、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡ結合によるプラスミノーゲ ン活性化の運動性を示す。ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ及び抗Ｕ−ＰＡＲ抗体による競合に よるｕ−ＰＡＲへの特異的結合であることが証明されたｕ−ＰＡとブレインキュ ベートしたｕ９３７細胞は、ＧＱｕ−プラスミノーゲン（０，０９−２，２６μ Ｍ）とインキュベートした。プラスミン出現の速度は、二重逆数手順でプラスミ ノーゲン濃度に対してプロットした。Ｋｍを０．６７μＭとして及び０．０４３ ｎＭｍｉｍ−’としてＶ　ｗａｘ測定した。これは、７．７ＰＭの実験的に測定 した細胞結合ｕ−ＰＡ濃度で５　、６　ｍｉｍ−’のＫｃａｔに相当する。 図４１は、ｕ−ＰＡ活性について、Ｐ　Ｉ−ＰＬＣによるＰＭＡ刺激ｕ９３７細 胞から放れたｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの効果を示す。ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞はＰＩ− ＰＬＣで１２０分間処理し、次いでＦＡＩ−２に対する抗体と共に又は、なしに ブレインキュベートした。ｕ−ＰＡによる残余プラスミン出現は、１００μａの 容量中、ｕ−ＦＡと、上溝の変る濃度のインキュベーション後、示す。 図４２、′２６Ｉ標識化精製ｕ−ＰＡＲの放射免疫沈降。縦座′ｊｌＡ：％ｌ” Ｉ−ｕ−ＰＡＲ沈澱。横座標：免疫／非免疫血清Ｌニア５、ｌニア５０、ｌニア ５００及びに７５０００゜ バー１−１１は、１）各試料に加えた”’　Ｉ　−ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの総量、４ ４０　Ｑ　Ｏｃｐｍ：２）試験管への放射活性の結合のコントロール：３）プロ ティンＡセファロースへの１２″Ｉ−ｕ−ＰＡＲの結合のコントロール：４−７ ）非免疫血清への”Ｉ−ｕ−ＰＡＲの結合：８−１１）免疫血清への１２Ｊ−ｕ −ＰＡＲの結合を表わす。 図４３方法のもとで記載したと同じ逆固相ラジオイムノアッセイ。 免疫／非免疫血清による′２Ｊ−・Ｕ・−ＰＡＲのキャッチング。縦座標：　ｃ ｐｍ結合、横座標：抗体の２倍系列の希釈、ｌ　：５００−１　＝３２００、Ｘ −Ｘ免疫二〇−〇非免疫。各試料に添加した”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲの総ｉｔ　：３ ３０００　Ｃｐｍ。 図４４エリサ。精製ｕ−ＰＡＲをｌ　ｎｇ／ウェルの濃度で覆った。 免疫、／非免疫血清（−次抗体）を１＋５００から］：２５６０００の範囲で２ 倍系列希釈に添加した。ｉ：ｓｏｏ希釈したペルオキシダーゼ接合二次抗体を用 いた。基質はＯＰＤであった。酵素基質反応からの色彩発達を４９０ｎｍで読ん だ。反応は１０分後停止した。ｙ軸：ＯＤ４９０ｎｍ０ｘ軸：免疫／非免疫血清 の希釈。×−×免疫−〇−〇非免疫。 図４５、精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対して作った抗体により結合する細胞性ＡＴＦ の明言。５×１０″ｕ９３７ａ細胞を精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対して作ったマウ ス抗血清と共に（・−・）又は、ブタムチンに対して作ったコントロールマウス 抗血清と共に（○−０）４℃で１時間ブレインキュベートし、続いて２．２ｎＭ ”’Ｉ−ＡＴＦを加えて、同一温度でさらに１時間インキュベートした。次いで 細胞を３回洗浄し、細胞結合放射活性をガンマカウンターで測定した。横座標は 、１：１５３．６００からｌ：３００の範囲の最終希釈の、抗血清の２倍希釈系 列を表わす。縦軸は抗血清が存在しないで得た値のパーセンテージとして細胞結 合放射活性を表わす。７００ｎＭ非標識化ｕ−ＰＡによる抗血清の置換は、結合 の９０％阻害となった。 挿入：ウェスタンプロットは用いた抗血清の反応性を示す。５０Ｏｎ９の精製ｕ −ＰＡＲ（レーン２及び４）又は２．５Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＰＭＡ刺激ｕ９刺激線９３ ７細胞トリトンＸ−１１４デタージエント相（レーン１及び３）を、６−１６％ 公配ゲル上還元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。そしてウエスタンブロ ッティ〕／グは、１：２５０に希釈した一次抗血清マウス抗−ｕ−ＰＡＲ血清（ レーン１及び２）又は同一希釈で上記コントロール血清（レーン３及び４）とし て用いた。 図４６はｕ−ＰＡＲに対するポリクローナルウサギ抗体の反応性を証明するウェ スタンプロットを示す。ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞の溶解質からのトリトンＸ−１ １４デタージエント相の７５μＱ試料はそれだけで（レーン１）、ＤＦＰ処理ｕ −ＰＡと混合後（突施例１：最終濃度１０μｇ／罰）（レーン４）又は同一量の ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡと混合後、化学架橋しくレーン３）分析した。コントロール として同一量のＤＦＰ処理ｕ−ＰＡのみを、架橋実施例（レーン５）又は直接（ レーン６）分析した。レーン２の試料は、７５μＱの細胞溶解質デタージエント 相を含み、それは、ＤＦＰ処理ｕ−Ｆ’Ａを添加することなく化学架橋に付した 。試料は非還元条件下６−１６％公配ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上で移動し、次いでニ トロセルロース上エレクトロブロッティングしｔ；。ンートは、ウサギ抗−ｕ− ＰＡＲ血清からの精製及び吸収ｔｇＧ（Ａ）と、又は、同一ウサギからの免疫前 血清からの精製及び吸収１ｇＧ（Ｂ）とインキュベートした。インキユベーシヨ ンの間のＩｇＧ濃度は、両場合とも１２μｇ／＋ｌｌＩ２であっＩ；。シートを ウサギＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ結合抗体ど共に発達させ、次いで アルカリホスファターゼ活性の検出を行なった。 図４７、ＰＭＡ処理ｕ９３７細胞の表面上ｕ−ＰＡレセプターの視覚化。酸によ る結合ｕ−ＰＡの除去後、細胞を、ビオチン処理（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ） Ｄ　Ｆ　Ｐ不活化ｕ−ＰＡと（図４７Ａ）又はビオチン処理ＤＦＰ不活化ｕ−Ｐ Ａと共に非標識化ｕ−ＰＡの余剰と（図４７Ｂ）インキュベートした。細胞に結 合したｕ−ＰＡは、ＦＩＴＣ標識化標識化ストレジタビジンて検出した。 ｒＭ４８、ヒト絨毛膜のクリオスタットセクシ１ンでのり−ＰＡレセプターの視 覚化。酸による結合ｕ−ＰＡの除去後、セクションを、ビオチン処理ＤＦＰ不活 化ｕ−ＰＡと（図４８Ａ）又はビオチン処理ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡと共に非標識 化ｕ−ＰＡの余剰と（図４８Ｂ）インキュベートした。細胞に結合したｕ−ＰＡ は、ＦＩＴＣ標識化標識化ストレジタビジンて検出した。 実施例１ ｕ−ＰＡＲの精製および特性決定 物質および方法 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　：特に説明シナイ場合、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　ｌ ｅｔ、Ｕ、に、ラエムリの方法［「クリーベイジ・オン・ストラクチュラル・プ ロテインズ・デユアリング・ジ・アセンブリー・オン・ザ・ヘッド・オン・バク テリオファージＴ４」、ネーチャー、２２７巻、６８０〜６８２頁（１９７０年 ）］により、］６−１６％勾の平板ゲルを使用して実施した。試料の前処理は、 非還元条件下では煮沸せずに実施しｌ：。還元条件を使用した場合は、試料を２ ＱｍＭＤＴＴの存在で５分間煮沸した。 ７アスト・ゲル５ＤＳ−ＰＡＧＥは７アスト・ゲル装置（７アーマシア）で既製 の１０−１５％勾配ゲルを使用して実施した。電気泳動は製造業者の指示にした がい実施した。銀染色はホイヶスボーフェンおよびデルニックの方法（１９８８ 年）により実施した。 アミノ酸分析またはＮＨ，末端アミノ酸配列決定のｔ；め、電気プロットする試 料のトリシン−５ＤＳ−ＰＡＧＥは、シェーガーおよび７オン・ヤゴフ（１９８ ７年）にしｔこがい、ミニ・プロチアンＩＩ装置（バイオ・ラド）で、０．７５ ｍｍの均質な７．７％Ｔ％　３％Ｃゲルで実施した。スカベンジャーどして１２ ｍＭ３−メルカプトプロパン酸を添加したゲル緩衝液中で、ゲルを１５ｍＡで３ 時間予備電気泳動した。４０ｍＭジチオトレイトールを還元剤として含有する試 料緩衝液５０μｌへ、凍結乾燥した試料を直接溶解し、２分間煮沸した。 予備電気泳動に使用したゲル緩衝液を電気泳動用緩衝液と取り換えたのち、６０ Ｖで電気泳動を４時間実施した。 アミノ酸分析またはＮＨ，末端アミノ酸配列決定のための試料の電気プロッティ ング：電気泳動ののち、半乾燥電気プロッティングｆｉ置（ＪＫＡ・インストル メンツ、デンマーク）を使用し、）・リシン−５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル を二７フ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリボア）上へ電気プロットした。 電気プロットは、０　、４　ｍＭジチオエリトリトールおよび１０％メタノール を含有する１０ｍＭ　ＣＡＰＳ　［３（シクロへキシルアミノ）−１−プロパン スルホン酸］中で、ｐＨ１１，ｏで起こり、０．８ｍＡ／ｃｍ”で２時間実施し た。タンパク質をクーマシーＲ２５０で２分間染色し、短時間脱染色し、ついで 水洗することにより位置を突き止めた（マツダイラ、１９８７年）。 電気プロットしたタンパク質のアルギル化およびアミノ酸配列決定：クーマシー 染色したタンパク質バンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、暗所、室温で、５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中、２５關ヨード酢酸アミドで１時間処理しＩ ；。反応後、水で十分に洗浄し、アルゴン大気下で乾燥した。乾燥フィルター上 のタンパク質をアプライド・バイオシステムダ４フフＡＷタンパク質配列解析器 で配列決定した。ＰＴＨアミノ酸誘導体のためのオン・ラインＨＰＬＣ同定シス テムはカルボキシメチルシスティンの誘導体を含有していた（変換中にアミドメ チル誘導体の脱アミド化によって生成）。 この誘導体の正確な同定は、これと平行して行ったニワトリ・リゾチーム（６番 目の残基にシスティンを有する）の調製用電気泳動、電気プロッティング、およ びアルキル化したのち、試験的配列決定によって確認した。 アミノ酸組成およびアミン糖の測定：電気プロットしたｕ−ＰＡＲの加水分解の ｔ；め、ローマシー染色し、その位置でアルキル化したタンパク質を含有するＰ ＶＤＦ膜の領域を、真空下に０．０５％フェノール含有６Ｍ塩酸で１．１０’ｃ ！で２０時間処理した。ポストカラム−〇−７タルジアルデヒド同定システムを 装備したウォーターズ・アミノ酸分析装置でアミノ酸分析を実施した（バークホ ルトおよびジエンセン、１９８９年）。 分析研究のための細胞培養：下記のピト細胞系を括弧内に示した供給源から得た 。組織球性リンパ腫細胞系Ｕ９３７　（Ｕ９３７ａと命名）（Ｅ、に、Ｏ，クリ ュイトフ、ユニバージティー・ホスピタル・センター、ローザンヌ、スイス）、 この細胞系の変異株（Ｕ９３７ｂと命名）（Ａ、ファトロッシ、リサーチ・ラボ ・オブ・アエロナウティカ・ミリターレ、ローマ、イタリア）、前骨髄性白血Ｍ ｍ胞系ＨＬ−６０（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ ））　、膀胱癌細胞系５６３７　（ＡＴＣＣ）　、喉頭表皮癌細胞系ＨＥｐ−２ （ＡＴＣＣ）　、表皮癌細胞系Ａ−４３１（Ｅ、ヘルセス、ユニバージティー・ オブ・トロンハイム、ノルウェー）、子宮頚癌１ｍｌ！ｌ系ヒーラ−（ＡＴＣＣ ）　、大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ）　、結膜細胞系チャック（ＡＴＣ Ｃ）　、絨毛膜癌細胞系ＪＥＧ−３（Ａ、バヘリ、ユニバージティー・オブ・ヘ ルシンキ、フィンランド）、羊膜細胞系ＡＶ３　（ＡＴＣＣ）　、繊維肉腫細胞 系ＨＴ−１ｏｓｏ（Ａ、バヘリ）。Ｕ９３７ａおよびｂ８よびＨＬ−６０細胞は 懸濁で増殖したが、他のすべての細胞は単層で増殖した。ＨＴ−１０８０および Ａ−４３１細胞は、加熱失活させたｌＯ％ウシ胎児血清を含有するダルベツコの 修飾したイーグルの培地で増殖した。他のすべての細胞系は加熱失活させた５％ ウシ胎児血清および２ｍＭＬ−グルタミンを含有するＲＰＭ１１６４０培地で増 殖した。 すべての培地はペニシリン２００単位／Ｉ０１、ストレプトマイシン２５μｓ／ ｍｌを添加した。すべての細胞は５％ＣＯ１を加えた加湿大気下で３７℃で培養 した。付着細胞はゴムかき取り器で回収した。Ｕ９３７ｂ細胞のＰＭＡ誘発は、 （０，５〜１）Ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／ｍｌの密度で１５０ｎＭＰＭＡで実施した。 細胞がプラスチック表面へ付着する場合は、４日間処理を行った。ＰＭＡ誘発し た付着性Ｕ９３７ｂ細胞はゴムかき取り器で回収した。 Ｕ９３７ａ細胞の大規模生産：ｌリットルのスピンナーフラスコ中で、２ｍＭＬ −グルタミン、５％ウシ胎児血清（加熱失活）、ペニシリン２００単位／ｍｌ、 ストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを補給した（または抗生物質を加えない）Ｒ ＰＭＩ　１６４０培地で、Ｕ９３７ａ細胞を（１，０〜］、、５）Ｘ　Ｉ　Ｏ’ 細胞／ｍ１（７）密度に達するまで増殖した。各フラスコは細胞培養５００ｍ１ を含んでいた。 Ｕ９３７ａ細胞のホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ ）誘発および回収：ｌスピンナーフラスコの５００ｍ１細胞浮遊液を、新たに調 製した無血清培地１リツトルへ加えた。 ジメチルスルホキシドで貯蔵しｆ：　Ｐ　Ｍ　Ａ貯蔵液（１〜］当たりＰＭＡｌ ｌｍｇ）１５０μｍを最終濃度１５０ｎＭ　ＰＭＡに達するまで添加した。 培養を１０層の重層細胞培養装置（ヌンク、デンマーク）へ移し、この装置で３ ．５日間増殖させた。ＰＭＡ溶液を添加すると、細胞は分裂を停止し、表面へ付 層した。 付着性の少ない多数の細胞をなお含んでいる１、５リツトルの上溝を回収した。 一層強く付着している細胞は、装置を０．１％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（Ｃａ −およびＭ　ｇ　＋＋を含有せず）５００ｍｌで洗浄し、激しく振とうすること によって回収した。２つの細胞浮遊液をプールして合計２リツトルの回収液を得 た。細胞を遠心によって採取した。 細胞溶解および界面活性剤層分離：　ＰＭＡ刺激したＵ９３７ａ細胞をニールセ ンらの報告（１９８８年）のように洗浄し、酸処理した。細胞溶解緩衝液２０Ｉ Ｉｌｌ　［０，Ｉ　Ｍ　）リス／ＨＣ１（ｐＨ８，１）、１％トリトンＸ１１４ ．１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｉ　Ｏμｇ／ｍｌアプロチニン］および１００ｍＭフェ ニルメチルスルホニルフルオリドのジメチルスルホキシド溶液０．２〜］を、酸 処理細胞１０争へ０℃で加えた。 懸濁液を完全に混合し、氷上で５分間放置し、再混合してさらに５分間０℃で放 置しｔ；のち、４℃、１６０００Ｘｇで、１０分間遠心により液を透明にした。 透明にした細胞溶解物を、３７℃で１０分間インキュベーションして熱誘発によ る層分離処理（ポージャー、１９８１年）をしたのち、２０°ＣＳ　１８００Ｘ ｇで１０分間遠心によって、界面活性剤層を採取した。上層を棄てた。０．１Ｍ トリス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）１８ｍｌを下層（約２１１１１）へ０°Ｃで加 えることによって洗浄し、ついで完全混合によって透明な単一層の溶液を回復さ せ、前記のように加熱・遠心によって層分離を繰り返した。 新しい上層を除去後、０．ＩＭＦリス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）の添加により下 層を２０ｍ１とした。その後の操作および精製の間に、新たな層分離を避けるた め、３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニウム）−１−プロパ ンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）（１０％ｗ／ｖ）５００μｌを添加して、透明単 一な層の界面活性剤画分を得た。微量の不溶性物質を、４℃で３３００Ｘｇ、１ ５分間の遠心によってこの溶液から除去した。 これと同様な方法で、ただし一層少量の細胞物質を使用して、他の細胞型（前掲 ）から細胞溶解物および界面活性剤層を作成した。 すべての試薬量を比例的に減量した。１実験では１％トリトンｘ１１４の代わり に０．５％ＣＨＡＰＳを細胞溶解界面活性剤として使用した。この実験では、層 分離は起こらなかった。 アフィニティーマトリックスの作ｆｆ：ｕ−Ｐａ（セロノ）　２．５Ｘ１０”Ｉ Ｕ（約２５ｍｇ）を０．１Ｍ１−リス／ＨＣｌ　（ｐＨ８，１）、０．１％ツイ ーン８０２５ｍ１に溶解した。新しい５００ｍＭジイソプロピルフルオロホス７ エート（ＤＦＰ）のインプロパツール保存溶液２５０μｌを添加し、３７℃で４ 時間インキュベートし、最初の２時間後、さらに同量のＤＦＰを追加することに よって、酵素を失活０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ，，０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ トリトンＸ−１００（ｐＨ８，５）に対して０℃で十分に透析することによって 反応を停止させた。 容量合計５０ｍ１中の透析した物質を、０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ，，０，５Ｍ　 ＮａＣ１（ｐＨ８，５）（カップリング緩衝液）で新たに平衡化したＣＮＢ　ｒ −活性化セファロース（７アーマシア）１２゜５ｍｌへ結合した。反応を４°Ｃ で１夜道行させ、ＩＭエタノールアミン／ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）でマトリック スを平衡化し、４℃で２４時間インキュベートすることにより反応を停止させた 。マトリックス（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ−セファロース）をカップリング緩衝液で洗 浄し、使用前、好適な溶出緩衝液（後出、参照）で予備溶出した。 アフィニティー精製：Ｕ９３７ａ細胞６ＸｌＯ’から得られた透明にした界面活 性剤画分を洗浄緩衝液−１［１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリ ウム、０．１％ＣＨＡＰＳ　（＋）Ｈ７，４）］ｌ容量で希釈し、上記と同じ緩 衝液で平衡化したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ−セファロース８ｍｌを含有するカラムでク ロマトグラフィー精製を行った。試料を適用後、カラムを洗浄緩衝液−１で洗浄 し、ついで洗浄緩衝液−２［１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、 ０．１％ＣＨＡＰＳ　（＋）Ｈ７，４）］で洗浄した。カラムを溶出緩衝液［０ 、１Ｍ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ＣＨＡＰＳ　（ｐＨ２，５）］ で下方から溶出した。溶出後、直ちに０．１Ｍリン酸ナトリウム、１．０Ｍ炭酸 ナトリウム（ｐＨ９，０）の好適な容量を溶出画分へ添加することによりｐＨ７ ，５に調節した。ウロキナーゼのｌ２ｓＩ−標識アミノ末端（ＡＴＦ）断片へ化 学的に橋架けし、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって、ｕ −ＰＡＲ含有画分を同定した。アミノ酸分析またはＮＨ，末端アミノ酸配列決定 のため精製したｕ−ＰＡＲ試料を、０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した 。 １、ｓ　Ｈによるタンパク質の標識：ＡＴＦのＩｌ＄　１−標識を、先の報告と 同様ににニールセンら、１９８８年）、ただし０．１％トリトンＸ−１００を０ ．０１％ツイーン８０で置き換えて実施した。０゜１％酢酸に対して透析後、凍 結乾燥によって濃縮した精製ｕ−ＰＡＲタンパク質Ｌ５ｇｇを、容量２ｉＩＩ中 、”’　Ｉ　２５０μＣｉテｊＬ理して同様の方法によりヨウ素化した。 化学的な橋架は検定：複合体混合物または精製した画分中のｕ　−ＰＡＲの１２ ｓ！−標識ＡＴＦへの橋架は反応を、可溶化した受容体に関して報告した方法（ ニールセンら、１９８８年）と同様に、架橋剤として２ｍＭジスクシンイミジル スベリン酸（ＤＳＳ）を使用して実施した。５Ｄ５−ＰＡＧＥおよび銀染色によ る分析のため、精製したｕ−ＰＡＲのＤＦＰ処理したｕ−ＰＡへの橋架は反応を 、これと同じ方法で、ただし非標識ＤＦＰで処理したｕ−ＰＡをリガンドとして 使用して、実施した。 酵素的脱グリコジル化：細胞溶解物および界面活性剤画分中のＵ−ＰＡＲに対す る脱グリコジル化研究のため、分解前に、受容体をＩ！１１１−標識したＡＴＦ への化学的橋架は反応により選択的に標識し、た。 凍結乾燥し５、精製したｕ−ＰＡＲは直接放射性ヨウ素化された。 Ｎ−結合した炭水化物を完全に除去するため、ＳＤＳおよびジチオトレイトール を、それぞれ最終濃度０．５％および１．６ｍＭまで添加して３分間煮沸する緩 和な還元条件下で、試料を変性させた。変性させた試料のアリコート（１０μｌ ）を、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ　１本位（Ｎ−グリカナーゼ、ゲンザイ ム）添加または酵素無添加で、容量合計３０μ】で、２００ｍＭリン酸ナトリウ ム（ｐＨ８，６）、１８５％トリトンＸ−１００、ｌｏｎ＋Ｍ１．ＩＯ−フェナ ントロリン（メタノール貯蔵液から添加）を含有するように調節した。 脱グリコジル化を３７℃で２０時間実施した。ＣＨＡＰＳで溶解後、得られた非 分画の細胞溶解物の研究では、還元のため、ジチオトレイトールの代わりに１０ ０ｍＭβ−メルカプトエタノールを使用し、脱グリコジル化では、１．１０−７ エナントロリンの代わりにＬｏｗＭ　ＥＤＴＡを含有させた。 脱シアル酸するため、”’ｒ−ＡＴＦへの橋架は反応によって標識した細胞溶解 物７０μｍを０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）で２００μｌへ増量した 。混合物の９０１Ｌｌアリコートを３３ｎｇ／μｌノイラミニダーゼ（ベーリン ガーーマンハイム）１４μｍまたは無酵素で処理した。脱シアル酸は３７℃で１ 夜実施した。 結果： 精製：　ＰＭＡ刺激したＬＪ９３７ａ細胞を酸処理して、表面結合したｕ−ＰＡ があれば除去し、緩衝液を含有するトリトンＸ−１１４で細胞溶解した。界面活 性剤抽出物を温度誘発層分離で処理し、単離した界面活性剤層をアフィニティー クロマトグラフィーの原料として使用した。酸溶出物を中和して、直接または０ ．１％酢酸に対する透析により濃縮し凍結乾燥したのち、これを分析した。Ｍ製 物質の電気泳動の挙動を第１図に示す。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色のあと（第１Ａ図）、溶出したタンパク質は１本 の幅広いバンドとして約５５〜６０ｋＤａの範囲を含んで移動した。この範囲の 外側では、タンパク質物質は検出されなかった。５ＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件 下で実施すると、同一の見掛けの分子質量を有する単一のバンドが認められた（ 第１ｃ図、レーン５）。 ＡＴＦに対するウロキナーゼの結合活性の分析を　１２８　■−標識したＡＴＦ への化学的橋架は反応、ついで５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー により実施した。ＡＴＦ結合活性が銀染色可能なタンパク質と一緒に溶出した。 ＡＴＦと精製タンパク質との間に生成した複合体は、電気泳動の間、７０〜７５ ｋＤａのＬ成分として移動した（第１Ｂ図、レーン２）。部分的に精製しｆ：　 ｕ　−ＰＡＲで以前に示したように（ニールセンら、１９８８年）、生成した複 合体は、無傷のＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞でＡＴＦによって生成した橋架は反 応生産物（成績は示さない）、およびこれと同じ細胞からの未精製の界面活性剤 抽出物中の橋架は反応生産物と判別ができなかった。１２５Ｉ−標識したＡＴＦ への結合および橋架は反応は、特異的であり、かつ可飽和であった。即ち、この 結合は過剰の非標識ＡＴＦ、活性なｕ−ＰＡｌまたはＤＦＰ処理したｕ−ＰＡに よって競合できたが、例えばウシ胎児血清アルブミンのような無関係なタンパク 質、またはｔ−ＰＡ、プラスミノーゲン、または上皮細胞増殖因子のような関連 タンパク質では競合が得られなかっ！；（第１Ｂ図）。 精製したタンパク質の機能的完全性および純度を研究するため、橋架は実験を非 標識成分で実施した（第１Ｃ図）。このリガンドが高分子量であるＩ；め、精製 したタンパク質自身から５ＤＳ−・ＰＡＧＥから明瞭に分離し得る複合体を生じ るはずであるので、この実験ではＡＴＦの代わりに、ＤＦＰ処理したｕ−ＰＡを ｕ−ＰＡＲ特異的なリガンドとして選んだ。精製した標品中に存在しているすべ てのタンパク質物質が、非標識リガンドへ結合できることが認められ（レーン４ および３を比較）、したがってｕ−ＰＡＲに対する本質性（ニールセンら、１９ ８８年）、および精製したタンパク質の純粋性が確かめられた。実際、結合能は 標品中で銀染色によって検出され得るタンパク質だけの特性であった。 アミノ酸分析による定量化の結果、６Ｘ１０”細胞からの精製収率はポリペプチ ド６〜９μｇ（ｕ−ＰＡＲ糖タンパク質約１０〜１５μｇに対応する、後記）で あることが判明した。 アミノ酸組成およびＮＨ，末端アミノ酸配列ニ調製用電気泳動、電気プロッティ ング、およびヨード酢酸アミドによるアルキル化後の精製タンパク質のアミノ酸 組成を第１表に示す。この組成は、注目すべき高含量のシスティン残基を含んで いる。ざらにリシン残基の存在が若干少ないことが注目される。使用した分析系 では、アミノ酸以外にもグルコサミンおよびガラクトサミンの定量ができる。 グルコサミンは加水分解中の損失分を補正すると、タンパク質１モル当たりＮ− アセチルグルコサミン約３０モルに対応する量で検出された。これに反して、ガ ラクトサミンは全く同定されなかった。 酸加水分解後、極めて多数のグルコサミン残基が検出可能であること、およびペ プチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ処理（後記）によって見掛けの分子質量の著しい 減少が生じたことは、Ｎ−結合した炭水化物の大きい側鎖がタンパク質に存在し ていることを示している。 ガラクトサミンが全く検出できなかったことは、この型の〇−−合炭水化物がｕ −ＰＡＲに存在しないことを示している。然し、アミノ酸分析による検出をまぬ がれ得るその他の〇−結結合オリ精糖存在を除外することはできない。 ２種類のアミノ酸配列決定実験を実施した。第１の配列決定実験では、透析およ び凍結乾燥ののち、アフィニティー精製したｕ−ＰＡＲの直接的なＮＨ，末端配 列決定を実施した。部分配列（第２Ａ表）が得られ、このことはｌ配列だけが精 製した物質に存在していることを示している。 第２の配列決定実験では、透析し、凍結乾燥し、精製したｕ−ＰＡＲをトリシン −５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜上へ電気ブロンドし、クーマシー染色し 、アルキル化して、上記のように切り出して、ついでＮＨ２末端配列決定を行っ た。この配列を第２Ｂ表に示す。 第２表に示されるように、この２つの配列を比較すると、同定したすべてのアミ ノ酸残基が同一であることが判る。また第２の実験だけで同定された３位、６位 、１２位は、すべてシスティンであることが判った。即ち、最初の実験でこれら 位置の同定が何れもできなかったのは、アルキル化が欠けていることに起因して いた。標品中で唯一検出可能なＮＨ，末端配列は、ｕ−ＰＡＲの電気泳動の移動 を伴っていた。したがって、例えばポリペプチド主鎖に伴う低分子量のペプチド 成分の形で隠されている追加的な配列はなかった。 ジョージタウン・ユニバージティー・タンパク質データベースによる探索では、 ｕ　Ｐ　Ａ　ＲＮ　Ｈ！末端アミノ酸配列の本質は明らかにならず、また既知の どのタンパク質との際立った相同性も明らかにならなかった。 アミン末端は、タンパク質全体のアミノ酸組成と同様にシスティン残基に富んで いる。 プローブ組み立てのためのデータ（実施例２）を第２Ａ表に示した配列から誘導 した。この組み立てのため、アミノ酸配列の６位は試験的にＡｓｎを割り当てた （第２Ａ表の脚注ａ参照）。 グリコジル化：精製した＋２Ｊ−標識したｕ−ＰＡ受容体をペプチド：Ｎ−グリ コシダーゼＦで処理した。この酵素はあらゆる種類のＮ−結合炭水化物を除去す ることができ、その切断部位はアスパラギン側鎖と最も内部のＮ−アセチルグル コサミン残基との間テする（クレソチンら、１９８５年）。第２図に脱グリコジ ル化したタンパク質の電気泳動の挙動を示す。１２５１−標識したタンパク質の オートラジオグラフィー後に観察された電気泳動のバンドは、直接タンパク質染 色後に見られるより常に僅かに幅広いバンドを示した。 然し、反応が、不均一な５５〜６０ｋＤａ受容体（レーン１）を遥かに尖鋭なバ ンドとして移動する３５ｋＤａだけの脱グリコジル化されたタンパク質（レーン ２）へ変えるので、したがって最初の不均一な物質は、すべて同一のタンパク質 の変異体を現していることがさらに確認された。 細胞系間のグリコジル化の不均一性および変異：別の実験系で、受容体を含有し ている細胞溶解物からの未精製の界面活性剤画分、または未分画の溶解物を、上 記で使用したのと同一の酵素で処理した。これらの実験では、ウロキナーゼの１ ２５Ｉ−標識したアミノ末端断片（ＡＴＦ）への化学的橋架は反応によりにニー ルセンら、１９８８年）、脱グリコジル化反応の前に、ｕ−ＰＡＲの選択的な標 識を実施した（ニールセンら、１９８８年）。 第３図から、受容体を精製した細胞溶解物は、７０〜７５ｋＤａのｕ−ＰＡＲ− ＡＦＴ複合体を生じ（レーンｌ）、これは脱グリコジル化されて約５０ｋＤａの 生産物を生じ得ることが判る（レーン３）。ＡＦＴがＮ−結合炭水化物を含有し ていることは知られていない。即ち、見掛けの分子質量で起こる変化は、前記の 精製したタンパク質で見られｔ；変化と同一であるので、この実験は、認められ た大量のグリコジル化が、事実、これらの細胞の界面活性剤溶解物中で、唯一有 意なＡＦＴ結合成分の特性であるということの独立した証拠を提供した。 刺激されていないＵ９３７ａ細胞抽出物で橋架は反応を実施すると（第３図、レ ーン２）、生成した複合体は、ＰＭＡ刺激後に認められるより僅かに高い電気泳 動移動度で再現性をもって移動し、その場合の見掛けの分子質量は７０ｋＤａで あった。然し脱グリコジル化すると、ＰＭＡ処理した細胞および未処理の細胞か らの複合体は判別できなくなった（レーン３および４を比較）。したがってＰＭ Ａ刺激したＵ９３７ａ細胞から精製した受容体は、無刺激細胞に存在している受 容体のグリコジル化変異体であった。 他の細胞系から得られた界面活性剤による細胞溶解物をＡＦＴへの化学的橋架は 反応によって分析すると、ある場合には、放射能標識した生産物の電気泳動移動 度における変化が観察された。これらの分析で、比較のため、種々の細胞型間の ｕ−ＰＡＲ含量の大きな変化を補正するには希釈要素の個々の調節が必要であっ た（ニールセンら、１９８８年）。ただし別々の実験では、希釈が個々の複合体 の移動に対して影響を与えないことが確かめられた。 上記のパタンを含め、合計４種類の区別できる電気泳動パタンか判明した。以前 報告したようににニールセンら、１９８８年）、細胞系の大多数は、例えばＰＭ Ａで処理しなかったＵ９３７ａ細胞の場合のように７０ｋＤａの単一の複合体バ ンドを生じた（第３図、レーン２）。即ち、このパタンは、例えばＡ−４３１表 皮癌細胞、ヒーラ−子宮頚癌細胞、５６３７膀胱癌細胞、ＨＣＴ　ｌ　ｌ　６大 腸癌細胞、ＡＶ３羊膜細胞、ＪＥＧ−３絨毛膜癌細胞、およびチャック結膜細胞 で認められた。 線維肉腫細胞系ＨＴ−１０８０は第３のｕ−ＰＡＲ変異体を含んでおり、僅かに 低分子量の単一な複合バンドを生じた（約６５ｋＤａ１データは示さず）。 第４のパタンは、精製の原料として使用した株とは異なったＵ９３７９３７細胞 究で見いだされた。ＰＭＡで処理しないと、この株（Ｕ９３７ｂと命名する）は 、上記のＵ９３７ａ細胞が示したのと同一の複合体バンドを示しＩ：。然しＰＭ Ａ処理に対する反応は、再現性を伴って異なっていた。即ち、ＰＭＡ処理したＵ ９３７ｂ細胞は２つの複合バンドを生じた。最高のバンドはＰＭＡ処理したＵ９ ３７ａで認められたものと同一であるようであった。低い方のバンドは尖鋭に出 現し、５５ｋＤａ成分として移動した（データは示さ　′ず）。このバンドは可 溶化した物質で橋架は反応後にだけ認められた。無傷の細胞で橋架は反応を実施 すると（ニールセンら、１９８８年）、最高のバンドだけが存在しくデータは示 さず）、シたがって低い方のバンドは細胞内前駆体、または受容体の分解産物を 現したものであり得ることを示唆している。 然し上記の４種類のパタンを現す試料を”’Ｉ−ＡＴＦへ橋架は反応したのち、 酵素的な脱グリコジル化で処理すると、分子量の変化は消失した。生じた複合体 バンドは、親細胞系の本質とは無関係に尖鋭で、５０ｋＤａ成分として移動した （データは示さず）。 即ち、Ｎ−結合グリコシル化は、ＰＭＡ刺激したＵ９３７系の範囲内、およびＰ ＭＡ刺激したＵ９３７ｂ系で２つのバンドを生じる分子ｕ−ＰＡＲの不均一性に 起因しているだけでなく、無刺激のまたはＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞からのｕ −ＰＡＲ間の電気泳動上の差異、および異なった細胞系間の変異にも起因する（ 即ち試験した他の細胞系とＨＴ−１０８０線維肉腫細胞を比較して）。 シアル酸の除去：上述した未精製の界面活性剤画分中のｕ−ＰＡＲのための橋架 は標識方式を、酵素的な脱シアル酸の研究に使用した（データは示さず）。ＰＭ Ａ刺激したＵ９３７ａ細胞からの橋架は界面活性剤画分のノイラミニダーゼ処理 によって、ＡＴＦ−ｕ−ＰＡＲ複合体の見掛けの分子量で約５ｋＤａの減少が生 じた。即ちグリコジル化は数個のシアル酸残基を含んでいた。ＰＭＡ刺激してい ないＵ９３７ａ細胞を脱シアル酸実験に使用すると、分子量の変化は疑いもなく 存在するが、若干小さく出現した。然しなから予備的な比較では、シアル酸化は で無刺激のｕ　−Ｐ　Ａ　ＲとＰＭＡ刺激された細胞との間の全体的な差異を説 明することはできないことが示唆された。 ［第１表］　ト’）シン−３ＤＳ−ＰＡＧＥＳＰＶＤＦ膜上ヘノ電気プロッティ ング、およびアルキル化ののちに測定したアフィニティー精製したｕ−ＰＡＲの アミノ酸配列Ａｓｐ／？、Ｓｒ、　３３．２ （第１表つづき） Ｔｈｒ”　２１．４ Ｓｅｒ”　２６．３ Ｇ　Ｉ　ｕ／Ｇ　Ｉ　ｎｅ４３−２ Ｐ　ｒ　ｏ　１１，４ ｃ　ｌｙ　２８．２ Ａ　ｌ　ａ　８．４ Ｃｙ　ｓ　（Ｃｙ　ｓ（Ｃｍ）として）２８．４Ｖａｔ　１１．ｇ Ｍｅｔ’　７．７ Ｉ　Ｉ　ｅ　６．７ Ｌ　ｅ　ｕ　２６．５ Ｈｉ　ｓ　１２．８ Ｌ　Ｆ　Ｓ　１１．Ｉ Ａ　ｒ　ｇ　２０．０ グルコサミン”　３０．８ １加水分解中の５％損失を補正 ゝ加水分解中の１０％損失を補正 ８アミノ酸標準混合物におけるピローグルタミン酸の生成のため、わずかに過剰 刺激の可能性 ４電気泳動およびプロッティング（３５）の間に通常観察される３０％損失を補 正 ０加水分解中の５０％損失を補正 タンパク質７０ピコモルの加水分解をＰＶＤＦ膜上で、２０時間直接実施した。 残基数を計算し、合計３１０残基と推定した。同一条件下で分析した標準的なタ ンパク質で見いだされる補正要素にしたがい、電気泳動および電気プロッティン グ（Ｍｅｔ）および加水分解中の損失（Ｔ　ｈ　ｒ　ｓ　Ｓ　ｅ　ｒ　１　グル コサミン）に対する補正を実施した。 ［１ｇ２表］　ｕ−ＰＡＲのＮ−末端アミノ酸配列。括弧内は試験的に分類した 同定を示す。疑問詞は同定しなかったことを表す。脚注がある場合は、最良の推 定を示す。 Ａ、０．１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥後、アフィニティー精製したｕ−Ｐ ＡＲの直接配列決定。最初の収量は第１段階で７０ピコモルのＰＴＨ−Ｌｅｕで あった。直接配列決定でシスティン残基の同定ができなかったことに注意。 研究番号　１’２３４５６７８９１Ｑ アミノ酸残基　Ｌｅｕ　？　？　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　？″　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｙ研究番号　１１　１２　１３　１４　１５　１６アミノ酸残基　Ａｓ ｐ　？　Ａｒｇ　Ｖａｔ　（Ｇｌｕ）　Ｇｌｕ’Ａｓｎ？ Ｂ、トリシン−３ＤＳ−ＰＡＧＥ、電気プロッティングおよびアルキル化後に得 られた配列。ＰＶＤＦ膜は、平行して実施したアミノ酸分析実験から推定してｕ −ＰＡＲ３５ピコモルを含有している（第１表）。最初の収量は第１段階でＰＴ Ｈ−Ｌｅｕｌ９．５ピコモルであった。反復した収量はＬｅｕｌ、Ｌｅｕｌ９、 およびＬｅｕ２３に基づき９６％であった。Ｃｙｓはアルキル化したタンパク質 におけるカルボキシメチルシスティンのＰＴＨ誘導体の同定を示す。 研究番号　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０アミノ酸残基　Ｌｅｕ　 ７　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ研究番 号　１１　１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０アミノ酸残 基　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　（Ａｒｇ）Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　（Ｈｉｓ）Ａｌａ　 Ｌａｕ　Ｇｌｙ研究番号　２１　２２　２３　２４　２５　２６　２７　２８　 ２９　３０アミノ酸残基　にＩｎ　？’　Ｌｅｕ　？’　（Ａｒｇ）Ｔｈｒ　（ Ｔｈｒ）Ｉｌｅ　Ｖａｌ　？’’Ａｓｐ？ 実施例２ ｕ−ＰＡＲのリガンド結合するドメインの単離および同定方法： 酵素分解：アフィニティー精製したｕ−ＰＡＲを、実施例１で説明したように０ ．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥物質をインキュベーション 緩衝液［０，０５Ｍ）リス／ＨＣＩ。 ０．０５％ＣＨＡＰＳ　（ｐＨ８，１））に再溶解し、約２５μｇ／ｍｌのタン パク質濃度とした。このｕ−ＰＡＲ溶液の９μｌ試料へ、インキュベージタン緩 衝液に溶解したキモトリプシンの好適な貯蔵溶液１μｌを添加することによりキ モトリプシンで処理した（ウォー・シントン、最終濃度範囲８〜２００ｎｇ）。 試料を３７℃で１６時間インキュベートしたのち、ジメチルスルホキシドに溶解 した２０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド０．５μｍを添加することに よって、分解を停止した。試料を分析するまで、−８０℃で貯蔵した。 分析：試料を還元処理後、１０％Ｔ、３％Ｃゲル上でトリシン−３ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより直接電気泳動分析を実施した（実施例１）。 銀染色のため、ヘンケスホーフェンおよびデルニック（１９８１−）の試薬系を 使用した。 ”Ｉ−ＡＴＦへ化学的に橋架けすることによって分析する試料を０．１Ｍ１−リ ス／ＭＣＩ、１％トリドアＸ−１１４（ｐＨ８，１）で５０倍に希釈した。希釈 した試料を０．２５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡｐｓｃＲ終濃度）の添加または１回だけ の温度誘発層分離（実施例Ｉ）の何れかにより、透明にした。希釈した試料の１ 容量を層分離したのち、各層（即ち、それぞれ界面活性剤および緩衝液画分）へ ０．１Ｍトリス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）を添加することによって、これを１容 量に増量し、０．２５％ＣＨＡＰＳ　（最終濃度）の添加によって透明にした。 試料の脱グリコジル化、”Ｉ−ＡＴＦへの橋架け：実施例１の方法により、ただ し実際の脱グリコジル化段階の濃度を０．０８％ＳＤＳ、０．２６ｍＭジチオト レイトール、０．１１Ｍリン酸ナトリウム、０．９％トリトンＸ−１ｏｏ、５． ３ｍＭ１．１０−フェノーントロリン、３３．３単位／ｍ１Ｎ−グリカナーゼと して、Ｎ−グリカナーゼ（ゲンザイム）による酵素分解を実施した。 キモトリプシン！こよって生成した結合ドメイン断片の同定：ｕ−ＰＡＲの１６ ｋＤキモトリプモ 照）が、受容体の結合ドメインであることの同定の直接的な確認には、既に採用 した方法を用いて、非標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡまＩ；はＡＴＦをリガンドとして使 用する橋架は実験、および５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による分析が必要であ る（実施例１参照）。さらに分析を進めるため、断片を調製用の規模で生成させ る（即ち、精製タンパク質２０〜５０μｇを出発物質として使用）。断片のＮ− 末端アミノ酸配列は実施例１で説明した方法によって得られる（即ちトリシン− ３ＤＳ−ＰＡＧＥ、電気プロッティング、およびアミノ酸配列決定）。引き続き 断片の同定をｕ−ＰＡＲｃＤＮＡから誘導されたアミノ酸配列と比較することに よって行う。結合決定基の一層精密な同定のため、キモトリプシン処理断片を包 含して合成ペプチドを組み立てる。ｕ−ＰＡＲおよびリガンド間の結合反応に対 する阻害活性の可能性について、ペプチドを、細胞結合検定に−ルセンら、１９ ８８年、およびアベラら、１９８７年）または化学的橋架は検定による研究とし て検定する。 上記で特に説明しなかった方法は実施例１と同様に行う。 結果； 精製したｕ−ＰＡＲの試料をキモトリプシンで分解し、引き続きトリシン−３Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによって分析を行った（第４図）。８〜２００　ｎｇ／ｍｌの濃度 範囲で酵素処理すると（レーン１〜３）、尖鋭なバンドで移動する１６ｋＤの分 解産物、および４５〜６５ｋＤに広がる幅広いバンドが出現した［６７ｋＤの尖 鋭なバンドは還元試料処理に起因するものであり（ハシモトら、１９８３年）、 Ｕ−ＰＡＲとは無関係である点に注意。これらのバンドはタンパク質無添加試料 でも同様に存在した（データは示さず）］。それ以外の生産物は検出されなかっ た。分解されなかったｕ−ＰＡＲ試料は、この電気泳動系で６０〜７０ｋＤの範 囲を含む１本の幅広いバンドを示した（レーン４および５）。追加的な成分は観 察されなかった。 これと平行して、”Ｊ−ＡＴＦをリガンドとして使用する化学的な橋架は検定で 試料を分析した（第５図）。分解されなかった試料（レーン４および５）は無傷 のｕ−ＰＡＲの特徴である７０〜７５ｋＤの結合バンドを示したが（実施例１参 照）、このバンド強度は分解した試料では著しく弱まった（レーン１〜３）。対 照的に、分解した試料では約３０ｋＤの橋架は結合を示し、即ちこれは１６ｋＤ 　ｕ−ＰＡＲ分解生産物と１５ｋＤ　ＡＴＦとの間で生成した上述の複合体で予 測し得た大きさであった。無傷のｕ−ＰＡＲに対応する微弱な結合活性の存在は 、僅かに不完全である開裂に起因する（第４図の分子量バタンと比較）。トリト ンＸ−１１４系における層分離によって分析を進めると、緩衝液層に優先的に存 在する生産物によって３０ｋＤの結合が生成し、一方、無傷のｕ−ＰＡＲに対応 する結合活性は界面活性剤層へ分配された（データは示さず）。 電気泳動分析の前に、架橋した試料を酵素的な脱グリコジル化で処理するど、生 成した複合体の分子量は低下した（第６図）。したがってキモトリプシン処理し た試料の約３０ｋＤ結合は（レーン１および２）、Ｎ−グリカナーゼ処理後、約 ２２ｋＤの生産物へ変化するが（レーン４および５）、酵素処理しない試料の脱 グリコジル化（レーン３および６）では、実施例１と一致した結果をもたらしｔ こ。 結論として、試験した濃度範囲では、キモトリプシンによって生成した低分子量 領域（即ち、４０ｋＤ以下）で唯一検出可能なｕ　−ＰＡＲ断片は１６ｋＤの生 産物であり、”’Ｉ−ＡＴＦへ橋架は反応後に観察された結合活性を有する断片 で予測される大きさと一致した。無傷のｕ−ＰＡＲとは異なり、リガンド結合し 、た断片はトリトンＸ−１１４系で親水性を示し、この断片がタンパク質のジア セチルグリセロール部分を含まないことを示唆している（実施例４参照）。脱グ リコジル化実験から、リガンド結合断片はグリコジル化されていることが判明し 、断片のポリペプチド部分が、約５０〜９０アミノ酸残基に対応する６〜１０ｋ Ｄだけを含んでいることが示唆された。 実施例３ ｕ−ＰＡＲのクローン化 使用したｃＤＮＡライブラリー二 ヒトｃＤＮＡライブラリーを、）ＢＲ３２２（アンピシリン耐性遺伝子を保有） に基づいたプラスミドベクターでＳＶ４０形質転換したヒトＧＭ６３７線維芽細 胞から作成した［Ｈ，オカヤマ、Ｐ、バーク、「ハイーエフイシエンシー争クロ ーニング・オブ骨フルーレングス・ｃＤＮＡＪ　、モレキュラー・アンド・セル ラー・バイオロジー、２巻、１６１〜１７０頁（１９８２年）］。このライブラ リーはオカヤマ博士の好意により供与された。このライブラリーを０Ｍ６３７細 胞で既知の多数のｕ−ＰＡＲに基づいて選抜した（ブラシ、未発表）。 プラスミドベクター（第８図）はＳＶ４０プロモーターを使用した。このベクタ ーは種々の真核細胞で高度に発現するが、原核細胞では極めて低く、または全く 発現しない。 スクリーニング方法： 精製した受容体タンパク質からのアミノ酸配列データ（第４〜５表）に基づいて 作成した合成オリゴヌクレオチドで、ライブラリーをスクリーニングした。融解 温度はレーダの報告［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１８３ 巻、１〜１２頁（１９８５年）］により計算しＩ；。使用した等式はｔ、、＝　 １６．６　１　ｏ　ｇＭ＋０．４１　（％ｃ＋ｃ）＋８１．５［式中、Ｍは５Ｘ ＳＳＣ溶液中の１価のカチオン濃度（モル濃度）、１６．６　１ｏｇＭは−２の 価を有し、％Ｇ＋Ｃは塩基組成である］から修飾した。等式から計算した融解温 度を、ＤＮＡの無限に長い鎖に当てはめる。プローブの長さおよび相同度のため 、下式％式％） ［式中、１はＤＮＡの長さく塩基数）、ｈは相同性％である］を適用した。 ついでパイロット実験で、ノイズ比に対するシグナルが最大となるようにハイブ リッド形成条件をさらに試験した。要約すると、プラスミドライブラリーからの ＤＮＡを含有するニトロセルロースフィルターを、末端標識したオリゴヌクレオ チドグローブへ、種々の温度および塩濃度（すべてレーダの式（前掲）から計算 した範囲）でハイブリッド形成した。フィルターはグランスタインおよびホグネ スの報告［「コロニー・ハイブリダイゼーションニア・メソッド・フォア・ジ・ アイソレーション・オプ・クローンド・ＤＮＡ５・ザット・コンテイン・ア・ス ペシフィック・ジーン」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、７２巻、３９６１頁（１９７５ 年）］により作成した。スクリーニングＪこ使用したハイブリッド形成条件は、 バックグラウンド・ハイブリダイゼーションが最小量となるようなものを選んだ 。第３表に、精製したｕ−ＰＡＲの予備的なアミノ末端配列決定（寅施例１）か ら誘導したアミノ酸配列および誘導されたオリゴヌクレオチド配列を示す。 ［第３表Ｉ　Ｎ−末端ペプチドのアミノ酸配列および誘導された合成オリゴヌク レオチド アミノ酸配列 Ｌｅｕ　、、、　、、、　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ａｓｐ誘導されたオリゴヌクレオチド ５’　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＣＸ　ＡＡＴ　ＧＧＸ　ＧＡＴ　３ ’ＣＧＣＣ 合成したプローブ ５’　ＡＴＣＩｃｃ　ＡＴＴ　ＩＧＴ　；ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　３ ’ＧＣＧＣＴＧＴ このグローブに使用したハイブリッド形成条件は、５×ｓｓｃおよび５０℃であ る。 スクリーニング方針の概要 最初にグランスタインおよびホグネスの方法（前掲）を用いて、プラスミド・ラ イブラリーをＮ−末端プローブでスクリーニングした。その方法の詳細は以下の 通りである。数個の陽性クローンを見いだしたが、第３次スクリーニングの後、 Ｌ側だけが残った。クローンの純度を検査し、このクローンからＤＮＡを作成し た（後段のＤＮＡの大規模生産の項参照）。ＤＮＡを数種の異なった制限酵素で 消化し、クローン内で判明した制限部位の地図を組み立てた［マニアティスらの 方法、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド ・スプリングハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）参照１゜さらにＤＮＡ配列 決定によって挿入体を分析した（以下の手法参照）。クローンは２４量体プσ− ブを組み立てるのに使用したＮ−末端ペプチドで、８アミノ酸のうち７個を暗号 化することができた。プローブ内の配列はＡで始まるが、クローンではこの位置 にＴを有し、そのため、Ｍｅｔの代わりにＣｙｓ置換を生じた。したがって特異 的なハイブリダイゼーションによってクローンを単離したが、正しいペプチドは 暗号化できなかった。 さらにＤＮＡ配列分析により、すべての読み取り枠で終止コドンが分かり、クロ ーンをｕ−ＰＡ受容体のための遺伝子として限定的に省略した。このクローンを もう一度見つける問題を解消するため、クローンの内部配列からオリゴヌクレオ チド（ＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡ）を組み立て、その後のスク リーニングで単離したクローンを試ついでプラスミドのクロラムフェニコール増 幅を利用してライブラリーを再選抜しくマニアティスら、前掲）、シグナル強度 を増大させｔ；。この手法により合計７個の陽性クローンを生じ（第４表）、そ のうちの２つは、もとの偽陽性クローンから作成されたプローブへのハイブリダ イゼーションに基づいて省略した。 ＤＮＡ配列決定方針の概要ニ プラスミドＤＮＡの配列決定： ５Ｖ４Ｑプライマー ５’　ＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣ３’このプライマーは発明者ら の実験室でアプライド・バイオシステムズ・３９１Ａ−ＤＮＡシンセサイザーで 作成した。ｐＥＭＢＬ１８ベクターのためのプライマーはバイオラブズから購入 した。 配列決定方法： 配列決定に使用した手法は、２本鎖配列決定のためのハラトリらの方法［ヌクレ イツク・アシッズ・リサーチ、１３巻、７８１３頁（１９８５年）〕に従った。 プラスミドＤＮＡの大規模生産： 大規模のプラスミドＤＮＡ生産は、単離したクローンの制限酵素分析、およびさ らに配列分析するｔ；めの断片の単離に使用した。使用したクローニングベクタ ー（ｐＥＭＢＬ１８、バイオラブズ社）も同様にこの方法で生産した。プラスミ ドＤＮＡは報告された方法に従って生産した（マニアナイス、前掲）。 ＤＮＡプローブの放射能標識： Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−”Ｐ−ＡＴＰを使用して合成オリゴヌ クレオチドを末端標識した。ゲル精製したＤＮＡ断片をＢＲＬニックトランスレ ージ１ンキットおよびα−”Ｐ−ＡＴＰを使用してニックトランスレートした。 グローブを不シソルブ２０カラム（Ｎ　Ｅ　Ｎ）で製造業者の仕様書に従って精 製した。ニックトランスレートしたプローブを、使用前に１００℃で１０分間加 熱・変性した。 結果： クロラムフェニコール増幅したオカヤマ・バーグｃＤＮＡライブラリーのスクリ ーニング結果を第４表に示す。 ［第４表］　オカヤマ・バーブ・プラスミド・ライブラリーのスクスクリー　第 １次　第２次　第３次 ニング数　スクリーニング　スクリーニング　スクリーニング１０’　２７　１ ４　７ 大規模ＤＮＡ様品は２個の偽陽性を省いたのち、残りの５種類のプラスミドクロ ーンから作成した（前記）。制限酵素を使用してクローンを地図化し、ベクター へハイブリッド形成したＳＶ４０プライマーを使用して５′末端を配列決定した 。すべてのクローンは約１４００ｂｐの挿入体を含んでおり、地図および配列に 基づいて、クローンが同一であることを決定した。１クローンを完全に配列決定 した。ＤＮＡ配列に基づいて（１）、ｐ−ｕＰＡＲ−１と命名したこのクローン はｕ−ＰＡ受容体を暗号化できることが判明した。 このクローンをプラスミドの形で、ザ・ブダペスト・トリティー・フォア・ジ・ インターナショナル・レコグニション・オブ・ザ・デポジット・オブ・マイクロ オーガニズムス・フォア・ザ・パーバシーズ・オブ・パテント・、プロシデュア の規定に従い、ドイツチェ・ザンムルンク・７オン・ミクロオルガニスメン（マ シェローダー・ベーゾ１ｂ％Ｄ−３３００、ブラウンシュバイク、ドイツ連邦共 和国）へ１９８９年４月５日に寄託し、受入れ番号ＤＳＭ５２７７のもとに受理 された。 ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１ｃＤＮＡの完全配列：単離したクローンの１つ（ｐ−ｕ−Ｐ ＡＲ−１）の完全配列を、ｐＥＭＢＬ１８の商業的なプライマ−（Ｍ１３プライ マー）および内部合成のプライマー（前記参照）を使用し、２本鎖ＤＮＡについ て両方の方向付けで得た。この配列を発明の詳細な説明の項の配列（１）に示す 。制限酵素地図および配列決定ストラテジーを第７図に示す。ｃＤＮＡクローン は５′末端からポリＡ鎖の開始点まで１３６４ヌクレオチドの鎖長である。５′ 末端では、４６ヌクレオチドが最初のＡＴＧコドンに先行し、そのあとに転写解 読枠を有する１００５ヌクレオチドの配列が続き、２つの枠組み終止コドンを含 む９ヌクレオチドで終わる。３′の翻訳されない３１２配列のヌクレオチドは最 初の終止コドン（ＴＡＡ）をポリＡ配列から分離している。ＡＴＧをヌクレオチ ド４７位の翻訳開始部位とする帰属は、先に説明した開始領域に関する合意と一 致している（コザツク、１９８７年）。翻訳された配列は、シグナルペプチドの 法則に適合して疎水性配列で始まる（７オン・７％イジン、１９８６年、前記） 。 推定シグナルペプチドは３１３アミノ酸残基が続く。配列（１）で示した配列を 最初のアミノ末端配列と比較しく第７Ａ図）、事実、もとの配列は６位に誤りを 含んでいることが判明したが（Ｃｙｓの代わりにＡ　Ｓ　ｎ　）　、これは正し いｃＤＮＡクローンの単離を妨げなかった。これは実際に、精製したタンパク質 ［配列（１）で相同領域を下線で示す］のカルボキシメチル化および電気プロッ ティングのあと、この研究の間に測定された、ｃＤＮＡから誘導された固有のＮ −末端タンパク質配列を有する配列（実施例１）の２５／２６の一致によって証 明される。計算上のアミノ酸含量はＵ９３７タンバク質で測定したものとよく一 致する（実施例１）。また計算上の分子量（３４６３３）は脱グリコジル化され たタンパク質の移動（実施例１）とよく一致する。 ヒトｕ−ＰＡＲは３１３アミノ酸残基からなる比較的小さいタンパク質である。 アミノ酸配列は、このタンパク質の高度のグリコジル化（実施例１）と一致して 、５カ所の可能性あるＮ−結合グリコシル化部位を含んでいる。アミノ酸２８２ 位で始まる隣接したアルギニン残基で挟まれた２１個の疎水性アミノ酸配列は、 ｕ−ＰＡＲの膜に繋がるドメインを表し得る（第７Ｃ図）。推定される膜に繋が るセグメントのＣ−末端側（恐らく細胞内）で、このアルギニンに、カルボキシ 末端トレオニンで終わる９個の追加的な疎水性アミノ酸が続いている。１０個の カルボキシ末端側残基の高い疎水性から、ｕ−ＰＡＲは細胞質内ドメインを全く 含み得ず、即ちカルボキシ末端の１０個の残基は膜に埋まっていることもあり得 る。またカルボキシ末端の約３０アミノ酸残基の配列は、糖脂質を繋ぎ止めるホ スホリパーゼＣ−感受性膜付着のｔ；めのシグナルペプチドに適合し得るはずで ある（ファガソンおよびウィリアムス、１９８８年）。 ｕ−ＰＡＲは僅かに酸性のタンパク質であり（６実効酸電荷）、極めてシスティ ンに富み、グリシンおよびロイシンに富み、リシンに乏しい。またｕ−ＰＡＲは セリンおよびトレオニン残基に富み、これは〇−結合グリコシル化を示している のかもしれない（ラッセルら、１９８４年）。然しなから脱グリコジル化および 糖組成の研究では、この受容体がＮ−結合炭水化物だけを含んでいることを示し ている（実施例１）。 ｕ−ＰＡＲ配列は既知のどのタンパク質とも類似していない。ジ層−ジタウン・ ユニバージティー・データバンクによる探索では、何ら広範囲の相同性は得られ なかった。特にｕ−ＰＡＲが、組織因子、凝固経路の第Ｖｌ＋因子の受容体と類 似点を共有しないことは、ｕ　−ＰＡＲが低分子量で、異常に広範囲のグリコジ ル化を有していることと共通している（モリセイら、１９８７年）。然しながら システィン残基の極めて高い比率は、上皮細胞増殖因子受容体（ヤーデンおよび ウルリッチ、１９８８年）、上皮細胞増殖因子前駆体（ベルら、１９８６年）、 および多数のその他の受容体（アベラら、１９８８年）のような多くの受容体の 細胞外部分と共通している。然しこれらのタンパク質でシスティン面間隔の共通 バタンは認められなかった。 ざらにｕ−ＰＡＲアミノ酸配列配列究で、この分子の細胞外部分全体が、下記の ような３種のシスティンに富んだ相同的なドメイン（１〜９２．９３〜１９１、 および１９２〜２８１）で組織されていることが明白になった。 ２　Ｇａｙ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｇｌｎ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　にｉｎ　％　ＡＤＬ、 Ｓａｒ　Ｐｒｏ　にＧｌｕ　Ｇｌｕ　にＩｎ　Ｃ）２　Ｌａ■ ３　曽Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　Ａｓｐ　シＡｙ　Ｇｌｙ　Ｐ ｒｏ　Ｍａｔ　ｊ４ｓｎ　Ｇｉｎ　（、ｚｚ　Ｌｅｕｉ５　３　Ｖａｌ　Ａｌａ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。 Ｉ　ＶＪＩＩ　（：２ｕ　Ｌｙｓ　Ｅａｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　１４１ｉ　Ｓａｒ 　にＧｌｕ　、Ｌｙｍ　Ｔｈｒ　Ｉｙｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒムt Ｌ　Ｅａｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　（：ｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｍ　Ｔ ｈｒ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ２０　２　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ａ ｇｎ　三ハＰｈ＊　ＨＬｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ｈａ　Ｈｌｓ　 ｈａ　Ｌａｕ３　Ｇｉｎ　ＨＬｓ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　シｋｓｐ　Ａｌａ 　Ｐｈａ　Ｓｓｒ　Ｍａｔ＾ｓｎ　ｉ［、ｓ　Ｉｌａ　ｕｐ　Ｖａｌｉ　ＶＪＬ Ｉ　ＶＪＬＩより　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｃｙｚ　Ａｓｎ　にｉｎ 　止Ａｓｎ　Ｓａｔ　にｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ２　Ｌｙｓ　Ｃ１５Ｃ１ＨＡｓｎ 　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｃ）２　Ａｚｎ　にＧｌｕ　９ｊｚ　Ｐｒｏ　１１ ＊　ＬＪＪ　Ｇｌｕ　Ｌａ■ ３　Ｓａｒ：　三ヒ庭Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｅａｒ　ＧＬ）Ｊ　Ｃ７１ＡＥｎ　Ｈｌ ｍ　Ｐｒｅ）　Ａｓｐヒｒｕ　Ａｓｐ　Ｖａ１２５　ｉ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙ ｒ　Ｓ＠ｒ＾ｒｇ　Ｅａｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ２　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＩＪｕ　！’ ｒｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　（：１ｙ３に１ｎＴｙτ＾τｇ （少なくとも２つの反復配列で同一であるアミノ酸残基を下線およびイタリック で示し、保存型置換を単にイタリックで示す）。 第２および第３の反復配列は最も密接に関連している（約２５％の同一性）。注 目すべきことは、システィンのバタンかこれら２つの反復配列で著しく類似して いることである。これらの知見から、ｕ−ＰＡＲの細胞外部分は類似した２次構 造をもった３つの独特なドメインを有するが（例えば、これらがリガンドのため の結合部位であることを反映している）、やはり異なっている（例えば、これら が異なったりガントへ結合することを反映している）ことを示している。 マウスＬＢ６細胞におけるｐ−ｕ−ＰＡＲｌ　ｃＤＮＡのトランスフェクション ： ｐ−ｕ−ＰＡＲＩクローンをマウスＬ、Ｂ６細胞へトランスフェクトし、これを カゼイン分解プラーク検定で試験することにより、このクローンの機能性を試験 した。この検定は不透明なバックグラウンドで透明なプラークを生じるプラスミ ンのカゼイン分解能に基づいている。ＬＢ６細胞はプラスミノーゲン活性化因子 を産生じないから、プラスミンを産生できない。然しｕ−ＰＡ受容体の存在で、 細胞はｕ−ＰＡを結合でき、したがってカゼイン分解能を獲得することができる （バサリら、１９８５年）。マウスＬＢ６細胞はプラスミノーゲン活性化因子を 産生しないが（未公開の観察）、ｕ−ＰＡ受容体をもっている。然し結合は厳密 に種特異的であり（ベリンおよびバサリ、個人的盲信、アペラら、１９８７年、 エストライヒャーら、１９８９年）、ＬＢ６細胞はヒトｕ−ＰＡを結合できない 。 ＬＢ６細胞によるヒトｕ−ＰＡＲｃＤＮＡの発現は、カゼイン分解プラーク検定 で、透明なプラークの生成により可視化することができるヒトｕ−ＰＡへの結合 能を有するＬＢ６細胞を提供するはずである。ｃＤＮＡライブラリーで使用した ベクターは、５′末端でＳＶ４０プロモーターを含み、３′末端でポリアデニル 化部位およびスプライス部位を含んだ発現ベクターである（オカヤマおよびバー ブ、１９８３年）。したがってトランスフェクトした細胞でのヒトｕ−ＦＡ受容 体の発現は、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１クローンが完全なＣＤＮＡ配列を暗号化してい ることを証明する。 物質および方法： 細胞培養および試薬： マウスＬＢ６細胞（コルサロおよびピアソン、１９８１年）を、ｌＯ％ウシ胎児 血清、２ＩＩＩＭグルタミン、およびｌ０ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよびストレ プトマイシンを補給したダルベツコの修飾した最少必須培地（ＤＭＥＭ）で培養 した。ヒト高分子量ウロキナーゼおよびプロウロキナーゼはレベチット社から提 供された（ノリら、１９８９年）。ヒトｕ−ＰＡのアミノ末端断片（ＡＴＦ）は アボット・ラボラトリーズから供与された。合成ペプチド・ヒトｕ−ＦＡ［１２ −３２（ａｌａ１９）］およびマウスｕ−ＰＡ　［１３〜３３（ａｌａ２０）］ は前記のようにして得た（アペラら、１９８７年）。プラスミノーゲンはシグマ ・ケミカル社から入手した。 トランスフェクシヨンおよびカゼイン分解プラーク検定：ＬＢ６細胞２Ｘ１０’ を、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡ９μｇ＋ｐＲ３Ｖｎｅｏ　ＤＮＡ１ｇｇ、また はｐＲｓＶｃＡＴ９μｇ＋ｐＲ５ＶｎｅｏＤＮＡｌμｇの何れかで、リン酸カル シウム共沈技術（ポザッティら、１９８６年）の修飾を用いてトランスフェクト した。細胞を０．８ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８含有ＤＭＥＭ％　１０％ウシ胎児血清 プレートに塗布し、約１３日後、コロニーを単離した。トランスフェクトしたク ローンのプールをカゼイン分解プラーク検定（バサリら、１９７７年）によって 試験しくｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡの場合）、陽性クローンを選び出した。１ サブクローン化を行ったのち、これと同じ技術を用いて、各トランスフェクショ ンからそれぞれ数種のクローンをヒトｕ−ＰＡ結合について試験した。細胞（１ 皿当たり１０００００個で１日前に播種）をＰＢＳで洗浄し、（Ｌ２ｎＭヒトｕ −ＰＡの存在で３７℃で１時間インキュベートし、十分に洗浄し、１．３％カゼ インおよび１７μｇ／ｍｌプラスミノーゲンを含有する薄い寒天層で覆った。プ レートを３７℃で３時間インキュベートし、クーマシー・ブリリアント・ブルー Ｒで染色し、写真撮影した。幾つかの実験では特異的な競合体を結合段階の間で 使用した。 結果： ｐ−ｕ−ＰＡＲｌのマウス細胞での発現：物質および方法の項で説明したように 、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１およびｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＤＮＡをマウスＬＢ６細胞へ一緒 にトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性クローンのプールを巣離して、カゼイン分 解プラーク技術によりヒトｕ−ＰＡ結合（０゜２　ｎＭ）について分析した。こ の検定で、対照実験ではｕ−ＦＡまたはグラスミノーゲン無添加ですべての細胞 が陰性であった。プラスミノーゲンの存在でヒトｕ−ＰＡとインキュベートした のち、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡを導入したＧ４１８耐性細胞のプールは、多 数のカゼイン分解プラークを生じた。対照細胞（ｐ　ＲＳ　Ｖ　ＣＡ　Ｔおよび ｐＲ３Ｖｎｅ。 ＤＮＡでトランスフェクトした）は陰性であった（データは示さず）。トランス フェクトしＩ；細胞をサブクローン化し、各トランス７エクシ３ンからの単一コ ロニーを試験した。そのようなりローンの１つで得られた結果をｌＪ９図に示す 。ｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡでトランスフェクトしたＬＢ６細胞は、ヒトｕ− ＰＡの結合によりカゼイン分解プラークを生じたが（パネルＣとＡ）、ｐＲ３Ｖ ＤＮＡでトランスフェクトした細胞は陰性であった（パネルＢ）。特殊だったの はｕ−ＰＡのアミノ末端断片（ＡＴＦ）の反応性で、即ち先端を切り取ったｕ− ＰＡ分子は結合能を保持していたが、触媒活性を失い（ストッペリら、１９８５ 年）（第９図、パネルＤ）、合成ペプチド・ヒトｕ−ＰＡ　［１２＝３２　（ａ ｌａ１９）］ではヒトｕ−ＰＡと競合を示した（第９図、パネルＥ）。対照的に 、マウスｕ−ＰＡ　［１３〜３３　（ａｌａ２０）］は結合に対して競合しなか った（第９Ｆ図）。これらのことはｕ−ＰＡ結合の種特異性に基づいて予測され た結果である（ストツベリら、１９８５年、アベラら、１９８７年、エストライ ヒャーら、１９８９年）。 マウスＬＢ６細胞におけるｐ−ｕ−ＰＡＲｌ　ｃＤＮＡ発現の評価： ｐ−ｕ−ＰＡＲＩでトランスフェクトしたマウスＬＢ６細胞によ６ｔ＝　トｕ− ＰＡＲの発現を、未標識およびヨウ素化したＡＴＦｔ−使用する結合競合実験に よってさらに分析した。トランスフェクトした細胞によって発現されたｕ−ＰＡ Ｒの分子特性を、ヨウ素化したＡＴＦへ橋架は反応したこれらの細胞からの物質 の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびラジオグラフィーによって分析した。 物質および方法： 細胞培養および試薬： マウスＬＢ６細胞をこの実施例で説明したようにＤＭＥＭで増殖させた。ＡＴＦ のヨウ素化は、以前にストツベリらが報告した（１９８５年）。架橋試薬ジスク シンイミジルスベリン酸はピアス・ケミカル社から入手した。 ”Ｉ−ＡＴＦの結合： ３０ｍｍの皿で、約３０００００のＬＢ６／Ｒ３ＶＣＡＴ、またはＬＢ６／ｐ− ｕ−ＰＡＲ−１細胞を、ｌＩＩＩｇ／ｍｌウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで洗浄 し、これを無血清培地で３７℃で１時間インキュベートし、ついで細胞を１″’ 　Ｉ　−ＡＴＦ　（１５００ｃｐｍ／　１モル）４７０００ｃｐｍと、種々の濃 度の未標識ＡＴＦの存在で３７℃で６０分間インキュベートした。実験は２組ず つ実施した。インキュベーションの終了時に、細胞をＰＢＳ−ウシ血清アルブミ ンで洗浄し、０．５Ｎ　ＮａＯＨ中で３７°Ｃで１５分間インキュベートし、細 胞溶解物を採取し、カウントした（ストッペリら、１９８５年）。１０ＱｎＭＡ ＴＦによって競合されない放射能を差し引いて、特異的結合を計算した。 ｌ！Ｊ−ＡＴＦのｕ−ＰＡＲへの橋架は反応：以前に報告されたように（ビフン ら、１９８９年）、ジスクシンイミジルスベリン酸（ＤＳＳ）を使用して、Ｌ　 Ｂ　６　／　ｐ　−ｕ　−Ｐ　ＡＲ−１細胞の”’Ｉ−ＡＴＦとの橋架は反応を 実施した。２．６ＸｌＯｓ細胞の２組ずつの皿を、ＰＢＳ−ウシ血清アルブミン （１ｔａｇ／ｍｌ）で洗浄し、２５ｍＭＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）を補給した 無血清ＤＭＥＭ中で、”’ｆ　−ＡＴＦ　（１５００ｃｐｍ／　１モル＞６００ ０００ｐｍと３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ−ウシ血清アルブミン 溶液で４回洗浄し、１ｍＭＤＳＳと室温で１５分間橋架は反応させた。１０ｍＭ 酢酸アンモニウム（最終濃度）で橋架は反応を停止し、１０分間室温でインキュ ベートした。１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ＩｍＭＰＭＳＦを含有するＰＢＳで細胞を掻き 取り、遠心によって採取し、蒸留水２５μｌに再浮遊し、これをカウントした。 ついで細胞を、５％β−メルカグトエタノールを含有するラエムリ緩衝液（ラエ ムリ、１９７０年）で直接溶解した。対照試料では、結合段階中に、未標識の１ ００ｎ１００ｎを存在させた。還元条件下に５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１２ ，５％）ゲル電気泳動によって（ラエムリ、１９７０年）、細胞抽出物を分子量 マーカー（レインボー、アマ−ジャム）（ミオシン、ホスホリラーゼｂ１ウシ血 清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、トリプシンイン ヒビター、リゾチーム）と−緒に分析した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムへ露光 した。 結果： ＬＢ６細胞におけるｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡの発現は、１．ｓ　１−ＡＴＦ との定量的な結合データによって支持される。第１０Ａ図は結合競合プロットを 示した図で、対照ＬＢ６細胞（Ｌ　Ｂ　Ｓ／Ｒ５ＶＣＡＴ）　は”’Ｉ−ＡＴＦ を結合しないが、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−ＩＤＮＡでトランスフェクトしたＬＢ６細胞 は結合する。結合は未標識ＡＴＦによって特異的に競合される。データのスキャ ッチャードプロットから、Ｋａは約１０１モル−１で、受容体は１細胞当たり約 ２５０００であった。 トランスフェクトしたＬＢ６細胞で発現したｐ−ｕ−ＰＡＲ−１が正しい分子特 性を有することを確かめるため、橋架は反応研究をＬＢ６／ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１ 細胞で実施した。細胞をヒトｌ！Ｊ−標識ＡＴＦとインキユベートシ、結合した ＡＴＦをジスクシンイミジルスベリン酸で架橋し、細胞を溶解して、５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。その結果を第１０Ｂ図に示す 。リガンドは約１７０００ダルトンの分子で移動したが、架橋したリガンドの移 動は６９０００より僅かに小さい分子量に対応し、ヒト０Ｍ６３７細胞で得られ た値と同一である（この細胞からｃＤＮＡクローンを誘導する）。これは無傷の ＡＴＦｕ−ＰＡＲ複合体で予想された分子量である（ニールセンら、１９８８年 ）、グリコジル化で起こり得る細胞依存性の差異、および細胞の高いグリコジル 化の程度から、ＰＭＡ処理しｔ；細胞がそれより僅かに高い分子量のｕ−ＰＡＲ を有する事実を考慮すると、第１０Ｂ図で示したデータは精製したｕ　−Ｐ　Ａ 　Ｒで得られたデータ（ニールセンら、１９８８年）と完全に一致する。 ついで本実施例では下記に挙げた知見により、マウスＬＢ６細胞におけるヒトｕ −ＰＡＲ遺伝子の発現を示す。即ち、直接結合検定（第１０Ａ図）およびカゼイ ン分解プラーク検定（第９図）によって判るように、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮ ＡでトランスフェクトしたＬＢ６細胞は標識したヒトＡＴＦおよび未標識ヒトｕ −ＰＡを結合する。ヒトＡＴＦ、ヒト合成ペプチドｕ−ＰＡ［１２〜３２（ａＩ ａ１９）］の結合能によって判るように、結合は特異的であり、ただシマウス合 成ペプチドｕ−ＰＡ　［１３〜３３　（ａｌａ２０）］では結合せず、結合に対 して競合する（第９およびｌｏａ図）。ＡＴＦ−ｕ−ＰＡＲ複合体は正しい分子 量を有する（第１０Ｂ図）。 ウロキナーゼに対する結合部位を含む可溶性受容体タンノ（り質の生産： 受容体は疎水性アミノ酸鎖（膜貫通領域）または糖脂質アンカーによって形質膜 で繋がっている。最も内在性の膜タンパク質は、多重膜貫通領域の例も報告され ているが、単一の膜貫通領域を有している。多くの場合、膜貫通領域はタンパク 質配列の中間、即ち、カルボキシ末端部分（一般に細胞内）およびアミノ末端（ 一般に細胞外、大多数の受容体の場合、リガンドのための結合部位を含んでいる ）の間に存在する。またカルボキシ末端の疎水性領域は、糖脂質アンカープロセ ッシングのためのシグナルである。 ｕ−ＰＡＲの構造に関する入手可能な情報から、この受容体は約３５０００ダル トン、即ち、約３３０アミノ酸からなるタンパク質であることが判る。 瞑貫通領域および糖脂質アンカーシグナルの双方に適合するアミノ酸配列はカル ボキシ末端に存在する。 可溶性受容体を生産するためには、疎水性の膜に繋がるドメインまたは糖脂質ア ンカーシグナルを省き、ｕ−ＰＡＲの分泌のためのシグナル配列、および細胞外 のりガント結合部分をともに保持するような態様でタンパク質を修飾することが 必要である。この目的のため、２つの組み立て体を作成した。その１つでは、ｕ −ＰＡＲｃＤＮＡの独特のＰＦＬＭ−１部位で終止コドンを挿入することにより 、カルボキシ末端の最後の８アミノ酸を消去した。下記の配列は、正常なｕ−Ｐ ＡＲのカルボキシ末端領域を示したものである。 ＧＣＣＡＧＡ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＡＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＴＧＧ　 ＡＣＣＴＡＡＡｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ終止コドン制限エンドヌクレアーゼＰＦＬＭ−１に よって切断される配列はＣＣＡＮＮＮＮＮＴＧＧ であり、ｕ−ＰＡＲ配列でＮを置換する塩基は、上記の配列で下線をもって示し た。ｐ−ｕ−ＰＡＲ−Ｉ　ＤＮＡをＰＦＬＭ−１で切断すると、 ５’　ＡＧＡＧＴ Ｃ および Ｔ ３’　ＴＧＡＣＡ の末端を生じる。 をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで修復して を作り、すべての枠で、ナンセンスコドンを含んだ下記のリンカ−（ＣＴＡＧＴ ＣＴＡＧＡＣＴＡＧ）を挿入して、ＡＧＡ　ＣＴＣＴＡＧ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　Ｃ ＴＡ　ＧＡＣＴＧＴを得た［この配列はＡｒｇ　Ｌｅｕで終わるｕ−ＰＡＲ分子 を暗号化しており、したがって最後の８アミノ酸を欠いている（変異体ｐ−ｕ− ＰＡＲ−ＰＦＬＭ−１）］−このクローンを、ザ・ブダペスト・トリティー・フ ォア・ジ・インターナシ曹ナル・レコグニシ２ン・オブ・ザ・デポジット・オブ ・マイクロオーガニズムス・フォア・ザ・パーパシズ・オブ・パテント・プロシ デュアの規定に従い、プラスミドＤＮＡとして、ドイツチェ・ザンムルンク・７ オン・ミクロオルガニスメン（マシエローダー・べ−”ｌｂ、’Ｄ−３３００、 ブラウンシュバイク、ドイツ連邦共和国）へ１９９０年３月２７日に寄託し、受 入れ番号ＤＳＭ５８６５のもとに受理された。 上記と同様に、ｐ−ｕ−ＰＡＲ−ＰＦＬＭ−１クローンをＬＢ６細胞へトランス フェクトし、その発現を野生型ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１ｃＤＮＡと比較した。第１１ 図に示したように、この変異体は、培地で部分的に回収され、細胞で部分的に保 持されたｕ−ＰＡＲ分子を発現した。事実、ヨウ素化したＡＴＦへの橋架は反応 は、培地で単一のバンドを示し、トリトンＸ−１１４抽出物（実施例１の説明と 同様にして作成）では２つのバンドを示した。非グリコジル化Ｕ−ＰＡＲの分子 量は低い方の分子量バンドに対応する。高い分子量バンドだけが細胞表面上に存 在する（下記）。第１１図に示したデータから、細胞内に保持されているものと 比べて、約１０倍多いタンパク質が培地内に存在することが判る。 ｕ−ＰＡＲ受容体から、カルボキシ末端の３６アミノ酸が欠失しており、したが って膜貫通領域、および糖脂質アンカー領域がないタンパク質を放出する第２の 変異体を作成した。この変異体を得るため、オリゴヌクレオチドへ指向する突然 変異を採用し、アマ−ジャムから商業的に入手可能なシステムを使用して、単一 のＥｃｏＲＶ部位を挿入した。この目的のため、ｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ配列のヌク レオチド９３５〜９５２ヘハイブリツド形成する下記のオリゴヌクレオチドを使 用した。 ＧＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＴＡ ［下線の配列はＥｃｏＲＶ部位を示し、奇抜なヌクレオチドは突然変異の部位（ Ｔ　−Ｇ）を示す１゜この変異体（ｐ−ｕ−ＰＡＲ−ＩＩｅ２７８）は、そのま ま２７８位でＶａｌのｌｉｅ置換を生じる。 ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１１ｅ２７８ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断し、すべての枠に終止 コドンを含んでいる同じリンカ−を挿入する。これは膜貫通領域および糖脂質ア ンカー領域を欠いた２７８分子だけの受容体タンパク質を生じる。この変異体（ ｐ−ｕ−ＰＡＲ−２７８終止コドン）は細胞表面へ付着できず、培地に分泌され 、一般に正常なｕ−ＰＡ受容体によって結合される同じ分子、プロｕ＝ＰＡ、Ａ ＴＦ、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ、活性ｕ−ＰＡを結合することが期待される。したがっ てこの変異体はｕ−ＰＡ活性の低下が望ましいあらゆる場合に、ｕ−ＰＡまたは プロｕ−ＰＡスカベンジャーとして有用である。 実施例４ ｕ−ＰＡＲはグリコシルーホス７アチジルイノシトール・アンカーを有し、Ｃ− 末端でプロセスされる 物質および方法： 物質： ＰＶＤＦ膜（イモピロ７−Ｐ）ハミｊＪボアカら、ＮＷ、　Ｎ−ｌｌ−ジメチル −Ａｒｇはシグマから、Ｎｗ−モノメチル−Ａｒｇはカルビオケムから入手し、 Ｎ”、Ｎ”−ジメチル−ＡｒｇはＴ、オガワ博士（徳島大学、日本）の好意によ り贈与された。エタノールアミンはメルクから入手した。Ｎａ”’Ｉ、［９，１ ０（ｎ）−３Ｈ］　−ミリスチン酸（５３Ｃ４／ミリモル）、ミオ−［２−ｓＨ ］　イノシトール（１８，３Ｃｉ／ミリモル）、［１−”ＨＥエタノールアミン 塩酸塩（１９Ｃｉ／ミリモル）はアマ−ジャムから入手しＩ；。 タンパク質： ヒトおよびウシ赤血球からのアセチルコリンエステラーゼ、ミツバチ毒液からの ホスホリパーゼＡ２、ウシ脳からのミニリン塩基性タンパク質はシグマから入手 した。キャベツからのホスホリパーゼＤおよびバシラス・セレウスからのホス７ アチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（Ｐ　Ｉ−ＰＬＣ）はベーリン ガー・マンハイムから入手した。ｕ−ＰＡＲは実施例１で示したようにＰＭＡ刺 激したＵ９３７細胞から精製した。活性なヒトｕ−ＰＡは上口ノから購入し、報 告したようにＤＦＰで阻害しただにニールセンら、１９８８年）。ｕ−ＰＡのア ミノ末端（ＡＴＦ）はＧ、カサニ博士（レペチット、イタリア）から好意的に贈 与された。ＡＴＦ、ｕ−ＰＡＲおよびＤＦＰ失活させたｕ−ＰＡは、報告したよ うに放射能標識した（ニールセンら、１９８８年）。ただしｕ−ＰＡＲの場合は 、ｏ、ｉ％（ｖ／ｖ））リドンＸ−１００の代わりに０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡ ＰＳで、またＡＴＦおよびＤＦＰ−ｕ−ＰＡの場合は、０゜０１％（ｖ／ｖ）ツ イーン８０で置き換えた。ヒトｕ−ＰＡＲに対するポリクローナル家兎抗体の作 成は実施例１１で説明したようにして実施した。 無傷なＵ９３７細胞のホスホリパーゼ処理：付着性のＰＭＡ刺激したＵ９３７細 胞（約２Ｘ１０’／皿）を、まず２５ｍＭＨＥＰＥＳを含有する無血清ＲＰＭＵ １６４０培地（ｐＨ７，４、緩衝液Ａ）で洗浄した。ついで細胞を、５０ｍＭグ リシン／ＭＣＩ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ　（ｐＨ３，０）で室温で３分間酸処理し て、内因的に生産されたｕ−ＰＡをすべて解離し、その受容体へ自己分泌のやり 方で結合させた。０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ　Ｎａｃｔ　（ｐＨ７，５） の０．２容量で中和後、直ちに上溝を除き、細胞を緩衝液Ａで２回洗浄した。幾 つかの実験では、外来性に添加した１１１１−標識したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ　（１ ｎＭ）を未標識のｕ−ＰＡＲへ緩衝液Ａ中で４℃で２時間インキュベーションに より再結合させ、リガンド無添加のこれと同一の緩衝液で３回洗浄した。これら の付着性Ｕ９３７細胞の種々のホスホリパーゼとのインキュベーションを、緩衝 液Ａ中、３７℃で振とうテーブル上で実施した。 生体内標識： 実施例１の報告と同様に細胞培養を実施した。ｕ−ＰＡＲの発現を増大させるた め、ヒ＋−Ｕ　９３７細胞（５Ｘ１０’細胞／皿）の代謝的標識に先立ってＰＭ Ａ　（１５０％Ｍ）で５時間刺激した。［３Ｈ］エタノールアミンおよび［３Ｈ １ミリスチン酸で標識するため、細胞をＲＰＭＩ　１６４０培地で培養し、ミオ −［’Ｈ］　イノシトールによる標識はイーグルの最少必須培地で実施した。ど ちらの培地とも、２ｍＭＬ−グルタミン、５ｍ１Ｊピルビン酸ナトリウム、２０ ０単位／ｍｌペニシリン、２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５ｍＭＨＥＰ ＥＳ　（ｐＨ７，４）、０．５ｍｇ／ｍｌ脱脂ＢＳＡ、４Ｘｉ定濃度の非必須ア ミノ酸類を補給した。すべてのトレーサーは、２５ｍｇ／ｍｌ脱脂ＢＳＡ、０． １Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）の貯蔵溶液から、最終濃度０．］ｍＣｉ／ｍ ｌで培地１０ｍ１に添加し、代謝標識を３７°Ｃで１５時時間性させた。ついで 付着細胞を酸処理し、１％前濃縮したトリトンＸ−１１４、Ｏ，１Ｍ）リス（ｐ Ｈ８，１）、１０　μｇ／ｍｌ　ｌ−ラジロール、ｌｎＭＰＭＳＦ、および０． ２ｍＭ　Ｚ　ｎ　Ｃｌ　ｘの氷冷溶液５ｍｌで洗浄し、細胞溶解した。最後に界 面活性剤層分離を実施例１で報告したように実施した。 生合成的に標識したｕ−ＰＡＲの免疫沈降：透明な界面活性剤層の２ｍｌアリコ ートへ免疫前家兎ＩｇＧ１２μｇを添加し、混合物を４°Ｃで２時間インキュベ ートした。０．１Ｍトリス（ｐＨ８，１）、０．１％ＣＨＡＰＳ、および０．１ ％脱脂ＢＳＡ・＼、プロティンＡセファロース（ファーマシア）を５０％（Ｖ／ Ｖ）で懸濁しだ液１００μｌを添加したあと、同時混合しながら４℃でインキュ ベーションを２時間続けた。遠心（５０００ｘｇ、５分間）によって上溝を回収 し、ポリクローナル抗ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ家兎ＩｇＧ１２μｇを添加してインキュ ベーションを４℃で１夜道行させ、最後にプロティンＡセファロースの新しいア リコートで、さらに３時間インキュベートした。ついで不動化した免疫複合体を 、０．１％（ｗ／ｖ）脱脂ＢＳＡ　（１回）、０．１％脱脂ＢＳＡ／ＩＭＮａＣ １（１回）を含有し、または無添加（２回）の何れかの０．１Ｍトリス（ｐＨ８ ，１）１０．１％ＣＨＡＰＳで十分に洗浄した。このように洗浄したプロティン Ａセファロースを遠心によって採取し、最後に２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する ０、１Ｍ）リス（ｐＨ６，８）５０μｌに懸濁し、５分間煮沸したのち、５ＤＳ −ＰＡＧＥにより分析した。 トリシン−５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸分析：シェーガーおよび７オン・ヤ コフの方法（１９８７年）に従い、トリシン−５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル をバイオ・ラド・ミニプロチアン■！装置（８ｃｍＸ　７ｃｍＸ　Ｏ，７５Ｍｍ ）で調製した。均質なゲル（７，５％Ｔおよび３％Ｃ）を１日前に流し込み、０ ．５Ｍトリス、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤｓ、および１２ｍＭ３−メルカプトプロ ピオン酸（スカベンジャーとして添加）（ｐＨ８，４５）で１５＋ＩＩＡ／ゲル で４時間予備電気泳動を行った。精製し、凍結乾燥したＵ−ＰＡＲを、４％（ｗ ／ｖ）ＳＤＳ、１２％（Ｗ／ｖ）グリセリン、５０ＩＩＩＭトリス、および４０ ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ６，８）で２分間煮煮沸により還元した。予備電 気泳動に使用したゲル緩衝液を本来の電気泳動緩衝液（シエーガーおよびフォツ ・ヤコフ、１９８７年）と取り換え、ただし１ｍＭ３−メルカプトプロピオン酸 をカソード緩衝液へ含有させた。電気泳動を６０Ｖで４時間実施した。 以前報告されｔ；ように（プラグら、１９８９年）、半乾燥方法により０．４５ μｍ　ＰＶＤＦ膜上で、１０ｍＭ３（シクロへキシルアミノ）−１−プロパンス ルホン酸、１０％（Ｖ／Ｖ）メタノール、および０　、４　ｍＭジチオトレイト ール中（ｐＨ１１）で、電気移動を０゜３ｍＡ／ｃｍ”で２時間実施した。 アミノ酸分析のために、０．０５％（Ｗ／Ｖ）フェノールを含有する再蒸留した ６ＭＨＣ＋　１００μｌおよび１％（ｗ／ｖ）ＤＴＤＰＡの２Ｍ　ＮａＯＨ溶液 ５μｌ中で、先に報告されたように（プラグら、１９８９年）、切り出したＰＶ ＤＦ膜上で１１０℃で、クーマシー染色したｕ−ＰＡＲを作成した。主として報 告された（バークホルトおよびジエンセン、１９８９年）、Ｏ−フタルジアルデ ヒド誘導体化を備えたウォーターズ・アミノ酸分析器でアミノ酸分析を実施した 。ただしクロマトグラフィー系は、塩基性アミノ酸の分離能を増大するため若干 修飾した。溶出は／１０ゲン化物を含まない２種の緩衝液ＡおよびＢ（組成につ いては、バークホルトおよびジエンセン、１９８９年参照）の混合液から得られ たｐＨ勾配により実施したが、勾配は下記の直線状セグメントからなっていた。 最初の溶離液１００％Ａ１１５分で８８％八および１２％Ｂ１２４分で６０％Ａ および４０％Ｂ１２６分で５５％Ａおよび４５％Ｂ、３６分で５０％Ａおよび５ ０％Ｂ１４０分で３０％Ａおよび７０％Ｂ、　６４分で２５％Ａおよび７５％Ｂ １６５分で１００％Ａ１６５〜７０分で１００％Ａであった。 種々の分析： 実施例１で報告したように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ジスクシンイミジルスベリン酸 （ＤＳＳ）による化学的橋架は反応、および分析的界面活性剤層分離をトリトン Ｘ−１１４で実施した。 直接オートラジオグラフィー（Ｉ′ｓ　■）および蛍光光度法（”Ｈ）を増感紙 （クロネックス）を使用して一８０℃でＸ線フィルム（コグツクＸ−オーマット ）で実施した。蛍光光度法の場合は、Ｘ線フィルムを予備露光しく０．２〜０． ３Ａ）、製造業者の指示により、ポリアクリルアミドゲルを増感剤で含浸させた 。 結果： 精製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸分析： 精製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸分析では（実施例１）、酸加水分解物の中にＯ− フタルジアルデヒドと反応し、カチオン交換クロマトグラフィーで、アンモニア のすぐ後に溶出する未確認の化合物の存在が明らかになった（第２図）。刺激し ないＵ９３７細胞（２×１０１０細胞）からｕ−ＰＡＲを精製すると、類似のピ ークが観察されＩ；が、その他の方法で処理すると同一であった（データは示さ ず）。この未知の化合物は、これを２％ＳＤＳで煮沸し、ついでｌ・リシン−５ ＤＳ−ＰＡＧＥ、および０．４５μｍポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ） 膜上で１０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨの存在で電気ブロッティングしても、精製され たタンパク質内に残存しているので、ｕ−ＰＡＲの共有結合的な構成成分として 挙動した。さらにこの化合物は、タンパク質が染色された領域のすぐ上下でＰＶ ＤＦ膜の好適な切片を切り出し、アミノ酸分析のために同一の方法で調製すると 存在しなくなるので、クーマシー染色したｕ−ＰＡＲの特殊な構成成分であった （第１２図、挿入体）。そのうえ以前にこの手法で、分析した数種の染色された タンパク質およびペプチドでは、この特殊な成分の存在が顕在化されなかった（ プラグら、１９８９年）。 この研究でアミノ酸分析のため、一般的なものばかりでなく、さまざまな滅多に ない塩基性アミノ酸を、その保持時間の再現性を損なうことなく、分離を増大さ せることができる特殊な勾配をカチオン交換クロマトグラフィーのために設計し た（物質および方法の項、　。 参照）。この方法によって、ｕ−ＰＡＲ中の同定できなかった化合物を、アンモ ニア（５３，５分）およびアルギニン（６０，８分）の間で５５．３分後に再現 性をもって溶出した。種々の物理的に生じるアルギニン誘導体が、はぼ類似の保 持時間を有することが予想されるノテ、Ｎ１１．　Ｎｗ−ジメチルアルギニ／（ ５３，８分）　、Ｎ”、　Ｎ″−ジメチルアルギニン（５４，４分）、Ｎ”−モ ノメチルアルギニン（５８，６分）等を含む数種のメチル化アルギニン誘導体を 試験した。これらの保持時間は、何れもｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ中の同定できなかった 化合物の値と一致しなかった。然し基準的なエタノールアミンを試験すると、同 定できなかったｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ中の化合物とまさに同一の保持時間を示した。 そのうえヒトおよびウシの双方の赤血球のアセチルコリンエステラーゼを加水分 解すると、この保持時間を有する化合物が同様に観察され、一方、例えばミニリ ン塩基性タンパク質からの加水分解物ではこの化合物は存在しなかった。赤血球 から単離されたアセチルコリンエステラーゼは糖脂質膜アンカーに共有結合成分 としてエタノールアミンを含有しているが、ミニリン塩基性タンパク質は部分的 にメチル化されたアルギニン残基を有している。したがってｕ−ＰＡＲは、酸に 不安定な結合（例えばエステルまたはアミド結合）によってタンパク質と共有結 合的に結合しているエタノールアミンを含有していると結論した。第１２図の定 量分析データは、各ｕ−ＰＡＲ分子が２〜３個のエタノールアミン残基を含んで いることを示している（第５表参照）。 Ｐ　Ｉ−ＰＬＯ処理による細胞表面からのｕ−ＰＡＲの放出：精製したｕ−ＰＡ Ｒｊこエタノールアミンが存在することは、この細胞受容体がグリコジルホスフ ァチジルイノシトール（ＧＰＩ）によって形質膜へ繋ぎ止められていることこと を示唆している。そのようなＧＰＩ−アンカー型タンパク質の大多数は、細菌性 ホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（Ｐ　Ｉ−ＰＬＯ）感受 性であり、糖脂質のジアセチルグリセロール部分を途去することによって、タン パク質を培地へ放出する（ロー、１９８９年）。したがって発明者らは、最初、 ＰＭＡ刺激されたＵ９３７細胞の細胞表面へ結合した、ｌ！Ｊ−標識ＤＦＰ処理 したｕ−ＦＡをＰＩ−ＰＬＯが放出できるかどうかを研究した。第１３図に示し たように、細胞に伴っている放射能の約５０％が、ＰＩ−ＰＬＣによって最初の １５分以内に放出された。さらにＰＩ−ＰＬＣ濃度が僅か５０ｎｇ／ｍｌまで低 下したときでも、放出速度はごく僅か低下するだけであった（データは示さず） 。これとは対照的に、ホスホリパーゼＡｘ（第１３図）およびホスホリパーゼＤ （データは示さず）は、これらのホスホリパーゼが比較的高濃度で存在していて も（〉５μｇ／ｍＬ第１３図）、生試料と比べて、細胞表面からのＩｌｌ　１− 標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ遊離の促進を何ら誘発できなかった。これに反して、トリ プシンはすべての細胞表面に付随している放射能を効率的に放出しくデータは示 さず）、即ち、受容体へ結合しているｕ−ＰＡの物理的な接近を証明した。 第１４Ａ図に示したように、ＰＩ−ＰＬＣによって培地へ放出されたｕ−ＰＡは 本質的に分解されず、少量のそのアミノ末端断片（ＡＴＦ、Ｍｒ　１７０００） と−緒に、主として無傷な２末鎖ｕ−ＰＡ（Ｍｒ５００００）からなっていた。 ｕ−ＰＡの受容体結合ドメインはこれらの同成分にともに備わっている（アペラ ら、１９８７年）。したがってこれら２つの分子種は１ｆｆｉｓ　１−標識ＤＦ Ｐ−ｕ−ＰＡと前インキユベーシヨンの間に細胞表面へ結合した。対照的に受容 体結合ドメインを欠いているｕ−ＦＡの低分子量形（Ｍｒ３３０００）は、洗浄 操作によって消失した。これらの成績から、ｕ−ＰＡおよびＡＴＦは、ＰＩ−Ｐ ＬＣによって細胞表面から放出されるが、これらは特異的にｕ−ＰＡＲを伴って いることが判る。 この実験で、サンプリングと同時に、固数した上清へＩｍＭジスクシンイミジル スベリン酸（ＤＳＳ）を添加することによる橋架は分析を実施すると、複合体を 含有している可溶性ｕ−ＰＡはＰＩ−ＰＬＣ処理したＭｉ胞からの培地でだけ検 出された（第１４Ｂ図）。５ＤＳ−ＰＡＧＥで、この複合体の電気泳動による移 動度（Ｍｒｌｌｏｏｏｏ）は、ｕ　ＰＡ／ｕ　ＰＡＲ複合体の移動度と同じであ った（ニールセンら、１９８８年）。模擬的に処理した試料では培地中に遊離の ｕ−ＦＡだけが認められ、このことはｕ−ＰＡＲからの緩徐な一過性のｕ−ＰＡ の解離を反映していた。この実験は、ＰＩ−ＰＬＯによって放出されたｕ−ＰＡ が、ｕ−ＰＡＲとの複合体を作るという解釈をさらに支持するものである。 最後にＰ　Ｉ−ＰＬＣによるｕ−ＰＡＲタンパク質の特異的な放出そのものが、 観察した＋ｚｓ　Ｉ−標識リガントの放出の真の原因であることを直接的に証明 した。この実験では、ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞を、まず酸処理して内因性の ｕ−ＰＡを陰き、ついでＰｌ−ＰＬＯとインキュベートした。ついで培地へ放出 された何らかのＵ−ＰＡ結合成分の存在を、′２５　Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ への橋架は反応によって検定した。この実験で、ＰＩ−ＰＬＣは、遊離形Ｕ−Ｐ ＡＲが、膜結合形から、′″ｆ′Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（第１４Ｃ図）およ び＋２Ｊ−標識ＡＴＦ　（データは示さず）に対する高い親和性をなお発現し得 る可溶性タンパク質（Ｍｒ６００００）へ急速に変換するのを誘導することが判 った。さらにＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞のＰ　Ｉ−ＰＬＣ処理後、無血清培地 で、精製したヒトｕ−ＰＡＲ＃こ対して生じさせたポリクローナル・マウス抗血 清を使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロッティングにより、類似のＭｒを 有するタンパク質を検出した（データは示さず）。したがってこの可溶性タンパ ク質は機能性（結合特異性）および構造関係（Ｍｒ８よび抗原性）の双方の点か ら細胞結合ｑ　ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに似ている。 懸濁液中の非刺激Ｕ９３７細胞の分析によって、類似したＰＩ−ＰＬＣ依存性の ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの放出が明らかになった（データは示さず）然しＰ　Ｉ−ＰＬ Ｏで処理しない無血清培地で長期間インキュベーションしたのちに、ｕ−ＰＡＲ の緩徐な内因性の放出が検出された（第１４Ｃ図）。この知見は、細胞が可溶性 ｕ−ＰＡＲを産生じたのか、あるいは分泌したのかの何れかであることを示し得 るが、一層可能性があるのは細胞がＧＰＩ特異的なホスホリパーゼを産生したこ とである。 精製したｕ−ＰＡＲのＰ　Ｉ−ＰＬＣ処理後に変化した疎水性：精製したｕ−Ｐ ＡＲをトリトンＸ−１１４による界面活性剤層分離にかけると、ｌ２ＳＩ−標識 ＡＴＦへの橋架は反応による試験で、はとんど定量的に界面活性剤層へ分配され （第１５Ａ図）、即ち、受容体の極めて疎水性な特性が証明されｔ；。Ｐ　Ｉ− ＰＬＯとインキュベーションすると、ＡＴＦ結合活性の５０％以上は水層で回復 され、実質的にタンパク質を結合するｕ−ＰＡの疎水性を変化させた（第１５Ｂ 図）。Ｐ　Ｉ−ＰＬＯの濃度増加によって、精製したｕ−ＰＡＲ標品でこの変換 の水準をさらに高めることは不可能であることが判った。これらの成績は、以前 の実験で無傷のＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理によって、放出 されたｕ−ＦＡを伴う細胞の分画と一致している（第１３図）。この知見は、細 菌性ＰＩ−ＰＬＯに対する部分的抵抗性（約５０％）が生体内ｕ−ＰＡＲ集団の 真の特徴であることを示し得る。他のホスホリパーゼ（ＰＬＤおよびＰＬＡｚ） は精製しｆ：　ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの疎水性に何ら有意な変化を誘発しなかった（ 第１５Ｃ図）。 ＋１１１−標識したｕ−ＰＡＲの試料を種々のホスホリパーゼで酵素的に処理し たあと、電荷シフト電気泳動によって分析すると、類似の挙動が認められた。Ｐ 　Ｉ−ＰＬＯだけが、ポリアクリルアミドゲルで界面活性剤組成と独立して移動 する標識ｕ−ＰＡＲ（約５０％）の意味のある部分を疎水性形へ変えることがで きた（データは示さず）。この実験は、Ｐ　Ｉ−ＰＬＯが誘発したＡＴＦ結合活 性の層分配の変化が、全体的にｕ−ＰＡＲタンパク質そのものの疎水性の同一の 変化に起因することを示している。 生体内標識： ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞の［３Ｈ１−エタノールアミン、ミオ−［’Ｈ］　 −イノシトール、または［３Ｈ］−ミリスチン酸の何れかとのインキュベーショ ンのあと、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡＲへ結合可能な成分（Ｍｒ５０〜６００００）の生 合成的な標識が得られた（データは示さず）。ｕ−ＰＡＲに特異的なポリクロー ナル抗体との免疫沈降によって、このタンパク質をＵ９３７細胞の界面活性剤溶 解物から単離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度法によって分析した（物質お よび方法の項参照）。 カルボキシル末端の翻訳後プロセッシング：約２モルのエタノールアミン７１モ ルのｕ−ＰＡＲの存在を証明することとは別に（第１２図および第５表）、アミ ノ酸分析によって、この膜受容体の翻訳後プロセッシングの可能性に関する追加 的な情報が明らかになった。精製したｕ−ＰＡＲに対して計算したアミノ酸組成 をｃＤＮＡ配列からの発生期タンパク質に対する予測値と比較すると、幾つかの 再現性のある有意な矛盾が生じた（第５表）。特にＡｌａおよびＬｅｕの実測値 はあまりに低く、ＴｙｒおよびＰｈｅの値はあまりに高かった（第５表）。然し 、興味深いことに、何か翻訳後の出来事の間に２９〜３１ＣＯＯＨ末端残基が除 去されたと仮定すると、計算した値と予測したアミノ酸組成とは完全に一致する ことが可能であった（第５表）。即ち、測定したアミノ酸組成、および通常この 装置で得られる正確さ／精度に基づけば、ｕ−ＰＡＲにＣ０ＯＨプロセッシング 部位が存在することが推定される。 このモデルにしたがい、プロセッシングは、第１６図に示したように、Ｓ　ｅ　 ｒ　ｘ＊ｘ、Ｇｌｙ２ｅｓ、ま！；はＡ　ｌ　ａ、　２＠４残基の１カ所で起こ ることが予測される。 ［第５表］　精製されたｕ−ＰＡＲのアミノ酸組成と提案されたＣ０ＯＨプロセ ッシング前後のｃＤＮＡから推定されたものとの比較 （Ａ）　完全なｕ−ＰＡＲ配列（Ｌ　ｅ　ｕ　Ｉ＝Ａ　１　ａ　ｔｓａ）アミノ 酸　ｃＤＮＡからの　酸加水分解後の　ＳＤ予測値　測定値 （Ｂ）　プロセッシング後に推測したｕ−ＰＡＲの配列（Ｌ　ｅ　ｕ　＋−Ａ　 Ｉ　ａ　ｚａ＋）アミノ酸　ｃＤＮＡからの　酸加水分解後の　ＳＤ予測値　測 定値 Ｌａｕ　２４　２４．５　０．６ 第５表の注 ａ、精製したｕ−ＰＡＲは第１２図の解説で説明したアミノ酸分析のために作成 した。示した値は３つの独立した測定の平均値をて正常化した。発生期ｕ−ＰＡ Ｒでは合計数３０９残基であり、完全にプロセスされたタンパク質では２８２と 推定した（４および２トリプトフアン残基をそれぞれ除いた）。アミノ酸数はシ グナル配列を除いてｕ、　−Ｐ　Ａ　ＲのためのｃＤＮＡ配列に基づいている（ 実施例３）。 ｂ、これらのヒドロキシアミノ酸の値は加水分解中の分解を補正した［５ｅｒ（ ５％）およびＴｈ、ｒ（１０％）１゜Ｃ，アミノ酸標準混合物にピログルタミン 酸の生成のため、僅かな過剰評価が予想される。 ｄ、ｌ試料では、システィンを加水分解前にヨード酢酸アミドを使用してそのま まアルキル化して誘導体化し、その後、酸加水分解してＳ−カルボキシシスティ ンとして定量化した。一般にこのアルキル化の収量は９５％である（プラグ、１ ９８９年）。別法として、加水分解の間、３．３’−ジチオジプロピオン酸（Ｄ ＴＤＰＡ）の存在でシスティンを誘導体化し、システィンとＤＴＤＰＡの間に生 成した混合ジスルフィド化合物（Ｃｙｓ−ｘ）として定量化した。 ｅ、ｎｄ−測定しなかった。 ｆ、ｓＤ−標準偏差（残基の絶対数） この実施例の結果から、ｕ−ＰＡＲはグリコジル化したホス７アチジルイノント ールアンカーを有し、Ｃ末端をプロセスされていることが明白に証明された。 実施例５ ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒおよびｕ−ＰＡＲｍＲＮＡ濃度の調節材料および方法 材料 ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）、デキサメタシ ンおよびジブチル−サイクリックＡＭＰはシグマ社から入手した。デオキシシチ ジン−５′−［α−３２Ｐ］三リン酸塩（特異的活性３０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）、およびレインポウ［”ＣＩプロティン分子量マーカーをラジオケミカルセン ター、アメルシャム、英国から買った。ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍ　ｐ ｒｉ＋ｎｅｄ）標識反応用キットおよびマウス上皮成長因子（ｍＥ　Ｇ　Ｆ　） はベーリンガーマンハイム、ＢＲＧ、ブタ変態（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）成 長因子β−タイプ１（ＴＧＦ−βｌ）はＲアンドＤシステム、ミネアポリス、Ｍ Ｎ、ＵＳＡから得た。 細胞培養 ひと細網肉腫セルラインＵ９３７（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ ＡＴＣＣ）、ＣＲＬ１５９３）は、Ａ、ファトルシ博士（リサーチラボラトリ・ オブ・アエロナウチ力・ミリターレ、ローマ、イタリー）から得、実験着手時、 ０．５Ｘ１０’細胞／ｍｌの密度でｌＯ％熱不活性うし胎児血清および２ｍＭ　 Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地で培養した。培地はペニシリ ン１００単位／ｍｌおよびストレプトマイシン２５μｇ／ｍ！で補足した。 ひと横絞筋肉［（ＲＤ）＆よびリンパ腺癌（Ａ５４９）セルライン（各々ＡＴＣ ＣＣＣＬ　１３６およびＡＴＣＣＣＣＩ　１８５）を７０−・ラボラトリ−、ア ービン、英国から得て、前記（ランドら、１９８８）と同様に、１０％うし胎児 血清で補足したダルベコ修正イーグル培地中で融合（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｃｙ） まで維持した。セルラインは試験してマイコプラズマ感染がないことを確認した 。各実験につき示したように、ＰＭＡおよび他の化合物は種々の時期に、様々な 濃度で存在した。付着細胞はゴムポリスマンで分離し、前記と同様にＲＮＡ分析 のために採取した。 ＲＮＡ分析 全細胞ＲＮＡをコムシンスキーおよびサツキ（１９８７）記載と同様に細胞から 分離した。ＲＮＡをランダムプライマー標識プラスミドプローブを用いる以外は 、前記（ランドら、１９８７）と同様にハイブリッド形成ノザーンブロッティン グにより分析した。ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡ（ｐ−ｕ　ＰＡＲ−１）のためのグロー ブとして用いたプラスミドは全コード領域および３′−および５′−非翻訳領域 を含むＣＤＮＡを担持している（実施例３）。 実施例１記載と同様の化学的架橋（Ｃｒｏｓｓ　−ｌｉｎｋｉｎｇ）分析を行っ た。 結果 ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルに対するＰＭＡの効果全ＲＮＡを対照Ｕ９３７細胞お よび種々の時期にＰＭＡで処理したＵ９３７細胞から抽出した。ｕ−ＰＡＲ特異 的ｍＲＮＡのサイズと相対濃度をノザーンブロットフィルターにより分析し、こ れをＵ−ＰＡＲをコードする全ｃＤＮＡを含むプラスミドでハイブリッド形成し た（図１７）。 ノザーンブロッティングにおいて、ｕ−ＰＡＲのシグナルは対照細胞に対して非 常に弱いが、長時間暴露により検出が可能である（結果は示さず）。ＰＭＡ処理 ３時間後、ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの可視シグナルがＰＭＡ処理２４時間後の最大効 果を伴って観察された。 同じＲＮＡを担持する対照として、ノザーン・フィルターをとり除き、ひとβ− アクチンｃＤＮＡプローブで再ハイブリッド形成した（ポンチら、１９８３）。 ＰＭＡ処理後β−アクチンｃＤＮＡとのハイブリッド形成のレベルには全く、ま たはほとんど効果が見られなかった。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ蛋白レベルに対するＰＭＡの効果ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ蛋白生産に 対するＰＭＡの効果を架橋試験により検討した。ウロキナーゼのＩｌｌ　Ｉ−標 識アミノ末端７ラグメント（ＡＴＦ）を、種々の時期につきＰＭＡで処理したＵ ９３７細胞から調製した層分離トリトンＸ−１１４抽出物の洗浄相と化学的に架 橋させた。 図１８は対照Ｕ９３７細胞中のｕ−ＰＡＲに架橋した”Ｊ−ＡＴＦの弱いシグナ ルを示す。ＰＭＡｆｉ理時間の延時間、シグナル強度が増大し、より低い電気永 動移動への変化が観察された。 Ａ３４９およびＲＤ細胞中のｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルに対するＰＭＡ、デキサ メタシン、ｍＥＧＦおよびＴＧＦ−β−１の効果図１９は、Ａ３４９およびＲＤ 細胞中ＰＭＡ（１５０ｎＭ）、ｍＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＧＦ−βｌ （７−５ｎｇ／ｍｌ）の刺激４８時間後、ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルが増大して いることを示す。４８時間デキサメタシン処理（１０−’Ｍ）はＲＤ細胞中にの みｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルを増加させた。 Ｕ９３７細胞中ｕ−ＰＡＲ蛋白レベルに対するジブチリルｃＡＭＰ処理の効果 ｕ−ＰＡＲ蛋白生産に対するジブチリルｃＡＭＰの効果を上記と同様に架橋試験 により検討した。図２０は、対照Ｕ９３７細胞中のＵ−ＰＡＲに対する”Ｉ−Ａ ＴＦ架橋の弱いシグナルを示す。ジブチリルｃＡＭＰの処理時間増大後、シグナ ル強度の増大および電気永動移動のより低い方への変化が観察された。 実施例６ ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡ用時ハイブリッド形成材料および方法 材料　下記の材料は表記した供給源から得た：Ｔ７およびＴ３ポリメラーゼ、ｐ ブルースクリプト（Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｋ　Ｓ　（＋　）プラスミドベク ター（ストラタジン、ＣＡ、ＵＳＡ）；ＲＮアシンおよびＤＮアーゼエ（プロメ ガ、Ｗｌ、ｕＳＡ）；［３５］５−ＵＴＰ（１３００Ｃｉ／ｍｍｏｌＸＮ　Ｅ　 Ｎデュポン、ＭＡ％ＵＳＡ）、ジチオスレイトールおよび制限エンドヌクレアー ゼ（ベーリンガーマンハイム、マンハイム、Ｆ　ＲＧ）；Ｋ　５オートラジオグ ラフイクエマルジヨン（イル７オード１、チェシャー、英国）：ホルムアミド（ フル力、ブッチス、スイス）；さけ精子ＤＮＡ（タイプ■、シグマ、ＭＯ，ＵＳ Ａ）、他のすべての材料は既述と同様である（クリステンセンら、１９８４；ク リステンセンら、１９９０）か、十分入手可能な等級のものである。 組織調製　手術後、結腸の腺癌を有する１３人の患者からの組織標本を切取し、 ４％または１０％（！！量／容量）ホルマリン−０，９％ＮａＣ１溶液中に２４ −４８時間放置した後、パラフィンワックスに固定した。 ＲＮＡグローブの調製　完全なひとｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ（実施例３参照）は標準 的技術を用いてサブクローンしくマニアチスら、１９８２）、２種のサブクロー ンを調製した：ｐジブルースクリプト中）ＨＵＲ０４：Ｐｓｔｌ（１８４）−Ｐ ｓｔＩ（４５１）７ラグメントおよびｐＨＵＲ０６：Ｂａｎ＋ＨＩ（４９７）Ｂ ａｍＨＩ（１０８１）フラグメント、塩基対数は実施例３中に表記した配列に対 応している。精製プラスミド調製物はＣｓＣｌ勾配中でバンドとしくｂａｎｄｉ ｎｇ）プラスミドをＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ（ｐ　ＨＵＲＯ４）または ５ｐｅＩおよびＥｃ。 ＲＩ（ｐＨＵＲＯ６）を用いて転写のために直線状にした。直線状プラスミド５ μｇをフェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールＣ２５：１）を用 いて抽出し、エタノールで沈澱させ、水に再溶解した。各転写反応は直線状ＤＮ Ａ鋳型（Ｉｐｇ）、ＲＮアシン（４０Ｕ）、４０ｍＭトリス−Ｃ１％ｐＨ７，６ ，６ｍＭ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭＮａＣ１，２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ　Ｄ ＴＴ、１ｍＭ　ＣＴＰ。 １ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＣＴＰ、４μＭ［３５］５ＵＴＰおよび関連（ｒｅｌ ｅｖａｎｔ）ポリメラーゼ（Ｔ３またはＴ７．４０Ｕ）を含む。ｐＨＵＲＯ４鋳 型はＴ３ポリメラーゼを用いて転写し、ＥｃｏＲＩで直線化されたｐＨＵ’ＲＯ ６鋳型はＴ７ポリメラーゼで転写し、アンチセンス転写物を生成する。５ｐｅｌ による消化により直線化したｐＨＵＲＯ６鋳型はＴ３ポリメラーゼで転写し、セ ンス転写物を生成する。 １２０分３７℃にて転写後、鋳ＷＤＮＡを、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（ＩＵ ）、酵母ｔ−ＲＮＡ（２０μｇ）、ＲＮアシン（２０Ｕ）の添加および３７℃、 １５分間のインキュベーションにより除去した。 フェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコール（２５：１）で抽出後、 ＲＮＡをエタノールで沈澱させ、酢酸アンモニウム（最終濃度２Ｍ）添加後、１ ５０００Ｘｇ、４℃、１０分間遠心分離し、１０ｍＭ　ＤＴＴに再度溶解した。 ＲＮＡをｌＱｍＭ　ＤＴＴを含む、ｐＨ］、０−２のＯ，１Ｍ炭酸ナトリウム緩 衝液中で、平均１００ｂｐに加水分解した。加水分解時間は前記（コックスら、 １９８４）と同様に計算した。加水分解後、ｌｏｍＭ　ＤＴＴを含む、同量のｐ Ｈ６゜２の０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を添加して中性とし、ＲＮＡを上記と 同様にエタノールで２度沈澱させた。ＲＮＡプローブを１０ｍＭ　ＤＴＴに再溶 解し、放射活性をシンチレーション計数管を用いて測定した。プローブ調製物は 常に４　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／μｍ以上を含み、ＴＣＡ沈澱可能物の量は通常約 ９０％であった。ｐＨＵＲＯ６プラスミド鋳型の向い合っている鎖から転写され た２種の対応ＲＮＡプローブを１０ｍＭ　ＤＴＴの添加により、同じ放射活性濃 度に調製し、脱イオンしたホルムアミドを最終濃度５０％になるように添加し、 プローブを使用時まで一２０℃にて保存した。 用時（Ｉｎ　５ｉｔｕ）ハイブリッド形成　用時ハイブリッド形成を多数の公知 方法（コックスら、１９８４）から採用した方法を用いて行った。スライドを０ ．５％ゼラチン、０．５％クロムミョウバン中に浸し、室温で乾燥、１８０℃に て３時間焼成し、はこりのない状態で室温にて保存した。パラフィン断片を切断 し、スライド上に置き、６０°Ｃにて３０分間加熱し、キシレン中で脱パラフィ ンし、等級化アルコール（ｇｒａｄｅｄ　ａｌｃｏｈｏｌ）を通して、ＰＢＳ（ ０，１４Ｍ　ＮａＣ１を含むＯ，ＯＩＭりん酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４）に 再水和した。 ついでスライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、０．２Ｍ　ＨＣＩ中２０分間酸処理し 、ＰＢＳ中で５分間洗浄した。その後、５０ｍＭトリス−ＣＩ、　ｐＨ８，０中 プロテアーゼに５μｇ／ｍｌプロテアーゼにおよび５ｍＭＥＤＴＡ中で７．５分 間インキュベーションし、Ｐ　Ｂ　Ｓ（２分間）中で２回洗浄し、ＰＢＳ中、４ （重量／容量）パラホルムアルデヒド中２０分間で固定した。固定化剤はＰＢＳ 中で洗浄して除き、スライドをビーカー中１００ｍＭトリエタノールアミンに、 マグネチックスターチー上で浸漬した。溶液を攪拌しながら、無水酢酸を添加し く最終濃度０．２（容／容）％）、添加を５分後くり返す。最後にスライドをＰ ＢＳ中で洗浄しく５分）、等級化アルコール中で脱水し、室温にて風乾した。プ ローブを８０℃にて３分間加熱し、放冷し、ハイブリッド形成混合物に添加した 。最終ハイブリッド形成溶液はＲＮＡプローブ（８０ｐｇ／μｌ）、脱イオンホ ルムアミド（５０％）、硫酸デキストラン（１０％）、ｔ−ＲＮＡ（１，ｕｇ／ μｌ）、フィニル４００（０，０２（１１量／容量）％、ポリビニルビＣＦ　１ Ｊドア（０，０２（重量／容量）％、ＢＳＡ７ラクシｇンＶ（０，０２（重量／ 容量）％）、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ｌ　０ｍＭトリス−ｃｉおよび１０ｍＭ　ＮａＰＯ４（１）Ｈ６，８）を含む。 ハイブリッド形成溶液をスライドに適用しくセクション当り、約２０μｌ）、ア ルコール洗浄、高圧滅菌カバースリップ（ｃｏｖｅｒ　５ｌｉｐ）で覆った。セ クションを、プローブ、硫酸デキストラン、ＤＴＴおよびｔ−ＲＮＡを除き、ハ イブリッド形成溶液と同じ混合物（洗浄混合物）ｌｏｍｌＶいて湿潤化した室内 で、４７℃にて一夜（１６−１８時間）ハイブリッド形成させた。ハイブリッド 形成後、セクション上にところどころ形成された気泡の位置をマークし、洗浄混 合物中で１時間５０℃にてインキュベーションしてカバースリップを除いた。洗 浄混合物をとり替え、１時間５０℃にて洗浄を継続した。セクションを０．５Ｍ 　ＮａＣｌ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ）リス−Ｃ１（ｐＨ７。 ２、ＮＴＥ）および１０ｍＭ　ＤＴＴ中で３７°Ｃにて１５分間洗浄し、ＲＮア ーゼ（２０μｓ／ｍりでＮＴＥ中３７℃にて３０分処理した。 ついでＮＴＥ中３７℃にて（２Ｘ３０分）洗浄し、１５ｍＭ塩化ナトリウム、１ ．５ｍＭ＜えん酸ナトリウム、ｐＨ７，０および１ｍＭＤＴＴの２リツトル中で 室温にて攪拌しながら洗浄した。ついで、セクションを、すべて３００１ｔ１Ｍ 酢酸アンモニウムを含む９９％エタノールまでの等級化アルコール溶液中で脱水 し、風乾した。最後に、製造業者の推せんに従って、オートラジオグラフエマル ジョンを適用し、セクションを乾燥剤入り暗密室箱中で１〜２週間週間曝露像現 像るまで４℃にて保存する。 結果 組織を２種の非重複クローンｐＨＵＲＯ４およびｐＨＵＲＯ６からのアンチセン ス転写物およびｐＨＵＲＯ６からのセンス転写物を用いて分析した。 外観が正常な粘膜の領域はすべての場合にハイブリッド形成の徴候がなかった（ 示さず）。 腫瘍の浸潤性病巣には、ｐＨＬＪＲＯ６アンチセンス転写物を用いた時はハイブ リッド形成シグナルが常に見られた。特に顕著なハイブリッド形成シグナルが細 胞上の、明瞭な炎症の徴候と周囲の開業組織の崩壊の領域内の破裂腫瘍線の先端 に観察された（図２１ａ−ｂ）。 腫瘍腺がより組織的な構造を示す浸潤腫瘍の他の領域では、ハイブリッド形成シ グナルが腫瘍細胞の付着糸状体に密接に結合する細胞上（Ｆ　ｉｇ２１−ｄ）か 、または腫瘍性乳首自体の莱膜表面に集中した細胞上に見られた（図２ｌ−ｃ） 。セクションから問題となっている細胞型（類）を確実に同定することも、ハイ ブリッド形成シグナルを示した新生血管形成領域内の細胞の同定も確定的に確認 することはできなかった。さらに腫瘍の当該領域の拡大写真（４００−１０００ Ｘ）による検討の後、臭化銀結晶を過ヨウ素酸に５分間浸漬して除き、スライド を再検査した。この方法によって、ハイブリッド形成を示す細胞をより詳細に検 討することができ、現在、この方法で細胞型（類）の最終的評価を行っている。 ｐＨＵＲＯ６アンチセンス転写物で得られたハイブリッド形成シグナルは、ｐＨ ＵＲＯ４からのアンチセンス転写物を用いて、隣接セクション上に確認された（ 示さず）。放射活性プローブの非特異的結合はｐＨＵＲＯ６からのセンス転写物 を用いて示し、分析したすべての腫瘍中に、組織セクション上に不均一に分散し たシグナルが生じており、非ハイブリッド形成領域（例えば、正常に見える粘膜 ）でｐＨＵＲＯ６アンチセンス転写物で得られたものと比較すると顕著であった （示さず）。 実施例７ 細胞表面プラスミノーゲン活性化に８けるｕ、−ＰＡＲの役割材料および方法 細胞培養 ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０、ＣＣＬ　ｌ　２１）をアメリカンタイプカ ルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド、から入手した。融合性細胞 をプラスチックリンプロウェル（２ｃｍ”；：ｙロー・ラボラトリーズ）中に、 １０％熱不活性化（５６℃、６０分間）うし胎児血清、ｌ　００１　Ｕ／ｍｌペ ニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足したイーグル最小必須 培地（ＭＥＭ）中で生長させた。融合が達成された後、細胞を３回、うし血清ア ルブミン（ＢＳＡ）を含むＭＥＭで洗浄し、ついで血清無含有培地（０，５ｍ１ ）が、または各実施例に記載と同様のｌＯ％熱不活性化およびプラスミノーゲン −途去（すなわち、リジン−セファローズ：ファルマシア、アブサラ、スウェー デン）うし胎児血清を含む培地に変えた。 培地からの細胞に結合するプラスミノ一ゲンに関する実験において、ひとプラス ミン（約１８　ＣＵ／ｍｇ；カビジアグノスチ力、ストックホルム、スウェーデ ン）を最終濃度０−５μｇ／ｍｌで培養物に添加した。細胞を３時間３７℃にて インキュベートし、細胞結合および上溝プラスミンを測定した（下記参照）ａプ ラスミン放出実験につき、細胞を０−５μｇ／ｍｌの濃度で１時間３７℃にて血 清無含有培地に添加し、ついで、３回ＭＥＭで洗浄した。 ひとプラスミノーゲン（およびグルタミン酸Ｎ−末端）をリジン−セファローズ 上アフイニティクロマトグラフイーにより（ドイチュ、Ｄ、Ｇ、およびＥ、Ｔ、 メルフ、「プラスミノーゲン：アフィニティクロマトグラフイーによるひと血漿 の精製」、サイエンス、１７０：１０９５−１０９７．１９７０）、１０ＰＭｐ −ニトロフェニルグアニジノベンゾアート、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフ ルオリドおよびひとｔ−ＰＡに対する抗−触媒性（ａｎｔｉ−ｃａｔａｌｙｔｉ ｅ）マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（ＥＳＰ−２；マクブレゴール、Ｉ−Ｒ， ら、「モノクローナル抗体群により認識されるひと組織プラスミノーゲン活性剤 に対するエピトープの特徴」、スロンポシス・アンド・ヘモスタシス、５３：４ ５−５０．１９８５）；アメリカン・ディアグノスチ力・グリーンヴイッチ、コ ネチカット）０．１μｇ／ｍｌで前処理した新鮮分離かつ非凍結ひと血漿から調 製した。 細胞培養物に添加した下記試薬を用いた阻害の検討：ひとプラスミンに対する抗 触媒的マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（アンチ−ｐ１ｇ１２０μｇ／　ｍ　ｌ 　；シム、Ｐ−３，ら、「ひとプラスミンに対するモノクローナル抗体抑制：ウ ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性剤のプロ酵素活性におけるプラスミンに対す る役割の限定的証明」、ユーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー 、１５８：５３７−５４２．１９８６）：アプロチニン（トラシロール、バイエ ル、レベルクーゼン、ＦＲＧ；２００　ＫＩＵ／ｍｌ）；トラネキサン酸（シク ロカプロン、カビ、ビトラム、ストックホルム：１０μＭおよび１００μＭ）： ひとタイプ−２プラスミノーゲン活性化物質阻害剤ミナクチビン（ボルダ−、Ｊ 、Ｐ、ら、「ミナクチビン；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性剤を特異的に 不活性化する、ひと単球産生物」、ユーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー、１３６：５１７−５２２．１９８３）、ひとＵ−９３７細網肉腫細 胞の培養物から精製したＦＡＩ−２Ｃロイング、Ｋ−Ｃら、「クラスＦＡＩ−２ 阻害剤（ミナクチビン）による不活性化に対するフィブリン−刺激組織プラスミ ノーゲン活性化物質の拮抗」、スロンボーシス・リサーチ４６：７５５−７６６ ．１９８７参照）、適意当量３．６ＩＵｕ−ＰＡ／ｍｌ；ひとｕ−ＰＡに対する 抗−触媒的なマウスモノクローナルＩｇＧ抗体（クローン２（１０μｇ／ｍｌ） 、ニールセン、Ｌ、Ｓ、ら「ひとウロキナーゼ−塁プラスミノーゲン活性剤およ びモノクローナルおよびポリクローナル抗体の組合せを用いるプロ酵素の酵素結 合免疫吸Ｓ測定」、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ、７：２０９−２２８． １９８６）；ひとｔ−ＦＡに対するアンチ−触媒的モノクローナル抗体（１０μ ｇａｏｌ）；ひとＰＡＩ−１に対する中和マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（ニ ールセン、Ｌ、Ｓ、ら、「線維肉腫細胞からの分子量５４０００のひとプラスミ ノーゲン活性化物質阻害剤に対するモノクローナル抗体−阻害剤中和およびワン −ステップアフィニティー精製」、スロンボーシス・アンド・ヘモスタシス、５ ５：２０６−２１２．１９８６　Ｘ　１０　μｇ／ｍｌ）およびジイソプロビル フルオロホスフアート（ＤＥＰ）−不活性化ｕ　−Ｐ　Ａ（０−１０μｇ／ｍｌ ）。 競争研究のためのＤＦＰ−不活性化ｕ−ＦＡ活性２本鎖ｕ−ＰＡ（ウキダン、ゼ ロｌ）を０．１Ｍｌ−リス−ＨＣ１１ｐＨ８、１，０，１％ツイーン８０（トリ ス／ツイーン）中に溶解した。 新たに調製したインプロパツール中に５００ｍＭ　ＤＦＰ（シグマ）溶液を添加 し、最終ＤＦＰ濃度を５＋ａＭにした。十分混合した後、試料を２時間３７℃に てインキュベートし、その後、上記と同様にＤＦＰの添加をくり返した。さらに ２時間３７℃にてインキュベートした後、反応をトリス／ツイーンに対して、０ ℃にて透析して反応を終了させた。調製物を可溶性ウロキナーゼの活性測定中測 定した時は残留性ＤＦＰ阻害剤は検出されなかった。 細胞結合性ｕ−ＦＡの代謝標識 ＨＴ−１０８０細胞の融合層を３回、０．２％ＢＳＡ含有メチオニンー無含有Ｍ ＥＭ培地で洗浄し、ついで５時間３７℃にて、１７０　ｉｔ　Ｃｉ／ｍｌ（”　 Ｓ　）メチオニン（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アメルシャム）で前標識した。ひと プラスミノーゲン（５０μｇ／ｍｌ）およびヒトＰＡＩ−１に対する中和モノク ローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を２個の培地の１個に添加し、さらに３時間イ ンキュベートを継続した。アブロニチン（２００Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）を両方の培 地に添加し、培地を除去し、その後、細胞を３回、０．２％ＢＳＡを含むダルベ コ培地で洗浄した。ついで、細胞−結合ｕ−ＰＡを、０．１Ｍ　ＮａＣ１を含む ５０μｌＭグリシン／ＨＣＩ（ｐＨ３，０）で３分間２３℃にて溶出させた（ス トツペリら、１９８６）。酸性溶出物を０゜５Ｍ）リス−ＨＣＩ（りＨ７，８） で中和し、ひとｕ−ＦＡに対するやぎＩｇＧ抗体３μｇ／ｍｌ（アメリカン・シ アグノスチ力）、または対照として、ひとｔ−ＰＡに対するやｆｆＩｇＧ抗Ｉｇ Ｇｇ／ｍｌで２時間２３℃にて免疫沈降させた。免疫錯体をエンド−オーバーミ キサー中で１時間、プロティンへ−セファローズに吸着させて集めた。免疫沈降 物を１００ＫＩＵ／ｍｌアブロニチンを含む免疫沈降緩衝液［１０ｍＭトリス− ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％デオキシコール酸ナトリ ウム、０．５％ＮＰ−４０，０，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］で数 回、ＰＢＳで２回、最後に２０ｍＭトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）にて洗浄した 。 免疫錯体はレムリサンプル緩衝液（レムリ、止揚）中で減圧条件下沸とうさせて 溶解しく１０％β−メルカプトエタノール）、１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル中で電気泳動にかけた。固定化ゲルをアムプリファイ（商標）（アメルシ ャム）で処理し、コダックＸＡＲ−５フィルに一７０℃にて曝露した。 ｕ−ＰＡ測測 定胞培養物上清をｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよび活性ｕ−ＰＡにつき、下記の修正免疫 捕獲方法（スチーフンスら、１９８８、スチーフンスら、１９８７）により測定 した。ポリスチレンイムノプレートのマイクデ、ダンマーク）を、ひとｕ−ＰＡ に対するやぎＩｇＧ抗体の溶液５０μｍで３７℃にて一夜漬った（ｃａｔ、　３ ９８　、アメリカン・ジアグノスチ力）。被覆溶液は０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ ｐＨ９、８）のｍｌ当りＩｇＧ２．５μｇを含む。すすいだ後、ウェルを順化培 地（５０ｍｌ）で２時間２３℃にて処理し、ついで再びすすいだ。ついでウェル の半分を新しく調製した２μＭｐ−ニトロフェニルグアニジノベンゾアート（Ｎ 　Ｐ　Ｇ　Ｂ、シグマ）（デネ、Ｋ、およびＥ、ライヒ「腫瘍ウィルスにより形 質転換された細胞からのプラスミノーゲン活性剤−活性化物質反応の阻害剤、バ イオヒミカ、バイオフイジカ・アクタ、５６６：１３８−１５１，１９７９）５ ０μｌで２０分間３７℃にて処理した。他の半分（対照）を洗浄緩衝液（ＰＢＳ 中０．０５％ツイーン２０）を添加した。すすいだ後、ｕ−ＰＡをすべてのウェ ルにつきプラスミノーゲン溶液（５０ｍＭナトリウムグリシン（ｐＨ７，８）、 ０．１％トリトンｘ−ｉｏｏ、０．１％ゼラチンおよび１０＋ｍＭ６−アミノカ プロン酸からなる非常に低濃度のプラスミン（１０ｎｇ／ａ＋１）を含む測定緩 衝液中１００μｇ／ｍ１）４０μｌを添加し、３０分間３７℃にてインキュベー トして測定した。プラスミノーゲンインキュベート中のプラスミンの濃度はｐｒ ｏ−ｕ−ＰＡの有効活性を発現させるに十分であった（ピータ−センら、１９８ ８、参照）。インキュベートによって生成したプラスミンはチオエステラーゼ活 性により（グリーン、Ｃ，Ｄ、Ｇ、、およびＥ、シ３つ、「チオベンジルベンジ ルオキシカルボニル−し一リジン、トリプシン様酵素の高感度比色定量のための 基質」、アナリティカル・バイオケミストリー、９３：２２３−２２６．１９７ ９）、２００ｍＭりん酸カリウム（ｐＨ７，５）、２００−ＭＫＣｌ、０．１％ トリトンＸ−１，００，２２０μＭＺ−リジンチオベンジルエステル（ペニンス ラ・ラボラトリーズ、ベルモット、カリホルニア）および２２０μＭ５．５’− ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（シグマ）を含む溶液２００μｌを添加して 測定した。この混合物を３０分間３７℃にてインキュベートシ、ウェルの吸光度 を４０５ｎｍにて読み取った。活性化ｕ　−Ｐ　Ａ（６０、０００１Ｕ／ｎ＋ｇ ）はカルビオケムーベーリング（う・ジ確う、カリホルニア）から購入し、ｐｒ ｏ−ｕ−ＰＡ（有効活性９００００ＩＵ／ｍｇ）はアメリカン・ジアグノスチカ から入手した。 細胞層結合ｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよび活性化ｕ−ＰＡを、代謝的標識（上記参照） で用いたと同様の方法により、免疫捕獲方法により採取しｔ；。各培養ウェル（ ２ｃ＋ｍつをｐＨ３で酸性グリシン１５０μｌにより溶出した（ストツペリら、 １９８６）。順化培地および細胞結合−Ｕ−ＰＡについて、Ｎ、　Ｐ　ＣＢ処理 後に測定されたｕ−ＰＡ活性をＮＰＧＢ処理なしで得られた総活性の百分率とし て表し、この百分率はｐｒｏ−ｕ−ＰＡ金含有指標として用いた（ｐｒｏ−ｕ− Ｐ　Ａインデックス）。 ＮＰＧＢ処理のために用いた条件はすでに確立されており（スチーフンら、１９ ８８）、活性化υ−ＰＡの選択的不活性化を可能にするものであり、一方、ｐｒ ｏ−ｕ−ＰＡを不変のままに、しておくことも、さらに未処理ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ と同程度に、添加プラスミンにより活性化することも可能であった。 プラスミン評価 培養物上清サンプル（５０μｌ）のプラスミン活性を、チオエステル基質溶液（ ２００μｌ）以上とともに、３０分（血清無含有上清）または３時間（血清−含 有上清）、３７℃にてインキュベートし、直接評価した。活性プラスミン量の推 定を、該当する活性範囲を含む血清焦合を培地中でひとプラスミン稀釈を用いた 検量曲線から行った。 細胞結合プラスミン層を回収し、下記のようにして評価した。培養培地を採取し た後、細胞を３回ＰＢＳですすいだ（さらにすすぐとプラスミン評価は陰性）。 ついで結合プラスミンを限定して（マイルスら、Ｌ、Ａ、およびＥ、Ｆ、プロウ 、血小板表面上プラスミノーゲンの結合および活性化」、ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー、２６０：４３０３−４３１１，１９８５）、同じ 洗浄溶液（１５０μｍ／ウェル）中１ｍＭ　トラネキサン酸溶液で溶出させた。 プラスミン活性は、３時間３７℃のインキュベート時間で上記と同様に溶出サン プル（５０μｌ）を用いて評価した。これらの評価において、１ｍＭのトラネキ サン酸はプラスミンのチオエステラーゼ活性に効果を示さなかった。 結果 プラスミノーゲン細胞表面上で活性化される。 １０％プラスミノーゲン−途去うし胎児血清とともに培地中で生長させたびと線 維肉腫細胞の培養物に、ひとプラスミノーゲンの精製調製物を添加後、プラスミ ン活性は細胞層からの結合画分どして回収することができた。添加プラスミノー ゲンの濃度を変えると、結合プラスミン活性は投与量依存的に増加した（第２２ 図）。結合は特異的であり、等張緩衝液で細胞をすすいだ後、プラスミンをＩｎ Ｍトラネキサン酸で遊離させた。この試剤は、重鎮クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ ｓ）　Ｃマイルス、上掲）のリジン親和性部位を含むプラスミノーゲンまたはプ ラスミンとの相互反応と競争的である。ＨＴ−１０８０細胞表面から遊離したプ ラスミンは便宜的に、そのチオエステラーゼ活性、トラネキサン酸の存在により 影響を受けない方法により測定した。プラスミン活性は培地中でも検出されるも のもある。融合２ｃｍ”細胞層上培地０．５ｍｌに添加したひとプラスミノーゲ ン４０μｇ／ｍｌの濃度で、プラスミン２８ｎｇに対応する活性がトラネキサン 酸で細胞から回収され得、一方、３時間３７℃のインキュベート後、培地中でｌ ｏｎｇが測定可能であった。プラスミノーゲンの濃度は、正常なひと血漿中に存 在する２００μｇ／ｍｌよりはるかに小さかった。 細胞表面プラスミンが、前形成プラスミン（プラスミノーゲン調製物とともに微 量混合物として添加された）か培地中で生成し、その結果細胞に結合したプラス ミンのいずれに由来するものかを検討するために、プラスミンをＨＴ−１０８０ 細胞の培養培地に添加した。図２３中に示すように、実際、プラスミン活性は、 培地が１０％うし胎児血清を含むとき、細胞表面に検出されなかったが、血清が 存在しないときに、かなりの投与量依存プラスミン結合が存在しｔこ。 これらの結果は、図２２に示した実験中に観察される細胞結合プラスミン活性が 細胞の表面のプラスミノーゲンの活性化により形成されることを示した。 新鮮血清無含有培地とプラスミンを有する細胞の２時間３７℃のインキュベート 後、活性の約４０％が結合したままであることを示している（図２４Ａおよび２ ４Ｂ）。細胞を１０％血清含有培地中でインキュベートしたとき、この活性と同 じ画分（４０％）を細胞から回収することができた；結合プラスミンは血清によ って不活性化されない。しかし、約１１％だけ（血清無含有培地の６０％と比較 すると）が血清含有培地中に検出されｆ−Ｃ図２４Ｂ）。１ｍＭｈラネキサン酸 を血清含有培地に添加したとき、プラスミン活性は細胞からは検出できなかった （図２４Ａ）。 細胞表面プラスミノーゲン活性化は細胞結合ｕ−ＰＡにより触媒される。 ＨＴ−１０８０細胞はｕ−ＰＡの増殖的産生体であるが（サクセラ、０、ら、「 培養正常および罹患ひと細胞により生産されたプラスミノーゲン活性物質、活性 阻害剤およびアルファー２−マクログロブリン」、インターナシ■ナル・ジャー ナル・オブ・キャンサー、３３：６０９−６１６．１９８４）、これらはｔ−Ｐ Ａを合成し、これは発現せずに隠ぺいされている（Ｒ，ステイーフン、未発表） 。どの活性化物質が細胞−表面プラスミノーゲン活性化に応答し得るのかを検討 するために、細胞を、各活性化物質を阻害するモノクローナル抗体の存在下にプ ラスミノーゲンとインキュベートした。表５の結果はｕ　−Ｐ　Ａの酵素活性の 阻害は、事実上細胞表面上に検出されるプラスミン活性をもたらさないが、ｔ− ＰＡの阻害はプラスミン活性量を減少させないことを示しており、細胞表面プラ スミノーゲン活性化はｕ−ＰＡにより触媒されることを示している。結合プラス ミン活性はまたＦＡＩ−２含有培養物中（ボルダ−上掲）のアプロチニンまたは ひとプラスミンに対する抗触媒的モノクローナル抗体を減少させた。 ＨＴ−１０８０細胞培養物中、ｕ−ＰＡは培地中に存在し、また細胞表面に結合 している（ニールセンら、１９８８）。表面結合Ｕ−ＰＡが血清培養物中細胞表 面プラスミノーゲン活性化物中に含まれるのかを検討するために、細胞を抗触媒 的ｕ−ＰＡ抗体またはＰＡｔ−２のいずれかとともにブレインキュベートし、つ いで細胞をざっと洗浄し、血清培地中でプラスミノーゲンとともにインキュベー トした。両方の阻害物質は結合プラスミン活性中に顕著な減少を生じさせるが、 培地中のｕ−ＰＡ活性の阻害は検出されなかった（表６）。 遊離ｕ　−Ｐ　Ａに対する細胞結合ｕ−ＰＡの役割を検討する別法を図２５に具 体的に示す。ｕ−ＰＡはそのレセプター、ｕ−Ｐ　Ａ　Ｒと、ＨＴ−１０８０細 胞の表面で結合しているにニールセンら、１９８８）。 この結合はｕ−ＰＡの活性部位を含まず（ブラシ、Ｆ８．１９８８）、したがっ て、ｕ−ＰＡＲもまた、不可逆的活性部位滴定試薬、ＤＦＰ（ニールセンら、１ ９８８）で処理しておいたｕ−ＰＡに結合する。 レセプター結合触媒的活性化ｕ−ＰＡの量を減少させるために、ＨＴ−１０８０ 細胞を１８時間、大過剰存在するとき、酸処理により遊離する表面結合ｕ−ＰＡ 中約７０％の減少をもたらすところの、ＤＦＰ−不活性化ｕ　−Ｐ　Ａとともに １８時間ブレインキュベートした。付随的に、細胞表面上に産生したプラスミン 量に同程度の減少があった（図２５）。 これらの結果は、すべてでないとしても、血清培養物物の細胞表面活性化の大部 分が表面結合−ｕ−ＰＡによって触媒されていることを示すものである。 表面結合プラスミンはプロｕ−ＰＡを活性化する：ｕ−ＰＡは、ＨＴ−１０８０ 細胞の培地中へ１本鎖プロ酵素であるプロｕ−ＰＡとして放出され、これはプラ スミンにより２本鎖活性Ｕ−ＰＡに変換され得る（ニールセン等、１９８２年、 シム、前掲）。 プロ酵素の酵素活性は２末鎖ｕ−ＰＡより少なくとも２５０倍低く（ピータース ン等、１９８８年）、ＦＡＩ−１とも（アンドリーセン等、１９８６年）ＦＡＩ −２とも（ステ７アンス等、１９８７年、ラン等、１９８７年）とも反応しない 。代謝性標識、酸処理によるレセプター結合ｕ−ＦＡ採取、免疫沈降、還元条件 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーの使用により、レセプター結合ｕ− ＰＡは、細胞をプラスミノーゲン非添加血清培地中でインキュベートするとほと んど１本鎖形でのみ存在することが見出された（図２６）。これと異なり、細胞 を５０μｇ／ｍｌのひとプラスミノーゲンと共に血清培地中で３時間インキュベ ートすると、はとんど全部が２本鎖形であった。 プロｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡを区別するための別法として、ｕ−ＰＡに対する低 分子量活性部位試薬はプロｕ−ＰＡに結合しないという事実（ニールセン等、１ ９８２年）を用いることができた。その１つであるＮＰＧＢを、免疫捕獲アッセ イにおいて２種のｕ−ＰＡを区別する好便な試験に使用した。試料中に存在する ｕ−ＰＡをまずマイクロタイターウェルに結合したｕ−ＰＡ抗体に吸収させた。 各試料のウェルの半数をＮＰＧＢで処理し、残りの半数を対照処理した。未処理 のウェル中の総ｕ−ＰＡ活性（プロｕ−ＰＡ十活性ｕ−ＰＡ）および処理ウェル 中のプロｕ−ＰＡ活性を出発濃度１０ｎｇ／ｍｌのプラスミンの存在下連結プラ スミノーゲン活性化因子アッセイにより測定し、結果をプロｕ−ＰＡ指数で表わ した。図２７Ａは、細胞を血清培地中でひとプラスミノーゲンと共にインキュベ ートした場合、プラスミノーゲンを欠乏培地に較べて、プロｕ−ＦＡとして存在 する総表面結合ｕ−ＰＡの割合が（約９０％から約ｌＯ％へ）大きく減少したこ とを示す。 これらの知見は、表面結合プロｕ　−Ｐ　Ａから活性ｕ−ＰＡへの変換が細胞表 面プラスミノーゲン活性化において役割を果たしていることを示唆する。 図２７に示す実験において、プラスミノーゲンとインキュベートした細胞上の総 ｕ−ＰＡは著しく少量であった（図２７Ｂ）。ＨＴ−１０８０細胞は活性ｕ−Ｐ Ａに結合するがプロｕ−ＰＡには結合しないＦＡＩ−１を大量に放出する（ニー ルセン等、前掲）。それ故、プラスミノーゲン添加インキュベート後の総ｕ−Ｐ Ａの一見明白な減少（図２７Ｂ）は細胞表面上の活性ｕ−ＰＡに対するＦＡＩ− １の結合とその後のアッセイにおける活性阻害に帰せられる。 ＦＡＩ−１による妨害を除くため、次に行なった実験であるプロｕ−ＰＡから活 性ｕ−ＰＡへの変換に対するプラスミン阻害剤アプロチニンの効果およびひとプ ラスミンに対する抗触媒モノクローナル抗体の効果を調べる実験では、中和性Ｆ ＡＩ−１抗体を含有させた。 第７表に示すように、これら阻害剤は何れもプロｕ−ＰＡの相対量の増加をもた らし、細胞結合プロｕ−ＰＡの活性化はプラスミンで触媒されることを示した。 これが細胞結合プラスミンの効果であるかどうかを調べるため、１００μＭ濃度 のトラネキサミン酸の効果を試験したが、この濃度は細胞に対するプラスミンの 結合を完全に阻害するが溶液中のプロｕ−ＰＡを活性化するプラスミンの能力に は影響しないものである（Ｒ，ステファンス、未公開の結果）。この処理は、活 性ｕ−ＰＡの相対量を著しく減少させ、細胞表面プロＵ−ＰＡの活性化が表面結 合プラスミンにより触媒されることを示す。 第６表 血清培地中におけるＨＴ−１０８０細胞中結合プラスミンの生成に対するプラス ミンおよびｕ−ＦＡ阻害剤の効果対照　３．５　７．１　１００　１１００Ｐｉ 　１００　１００　Ｉｌｌ　８３Ｐｉｇ十抗ｕ−ＰＡ　６．２　１１　９．９　 ２９Ｐ　Ｉｇ＋ｘＪＩｔ−Ｐ　Ａ　１０１　１２３　１０２　８１ＰＩｇ＋ＦＡ Ｉ−２４８１９８９７７ Ｐｉｇ＋アプロチニン　１３．２　７．８　９３　９９Ｐｉｇ十抗−Ｐｉｇ−１ 　２．８　６．４　９０　８８Ｐ１ｇ＋ＴＡ（ＩＱＰＭ）　９．７　３４　１１ ６　８７ＰＩｇ＋ＴＡ（１００μＭ）　２．２　１３　９２９５ＩＯ％熱不活化 、プラスミノーゲン欠乏子うし血清含有ＭＥＭ培地（０，５ｍ１）中で生育する 細胞層に以下のものを添加した。未変性ひとプラスミノーゲン（Ｐ　Ｉｇ、　４ ０　ｐｇ／ｍｌ）、ひとｕ−ＰＡ抗触媒モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ） 、ＦＡＩ−２（３，６Ｕ　Ｉｕ−ＰＡ／ｍｌ力価相当」、ひとプラスミン抗触媒 モノクローナル抗体（２０Ｐｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２００Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍ ｌ）、トラネキサミン酸（ＴＡ。 示す量）。培養物は、細胞結合プラスミンアッセイ前に記載の時間インキュベー トした。プラスミノーゲン使用の培養物を、結合プラスミンの１００％対照とし た。 血清培地中における結合プラスミン産生能力に対するＨＴ−１０８０ｍ胞のｕ− ＰＡ前処理の効果 対照　２．２　１００ 対照　＋　１００　８６ 抗ｕ−ＰＡ＋３２９６ ＦＡＩ−２＋　５４　８８ 血清培地（０，５ｍ１）中全面培養細胞層を、３７°Ｃで１時間、ひとｕ−ＰＡ に対する抗触媒モノクローナル抗体（１０μｓ／ｍｌ）またはＰＡｌ　２（３， ６１Ｕｕ−ＰＡ／ｍｌ力価相当）と共に前インキュベートした。ついで細胞を血 清欠乏ＭＥＭ培地で３回すすぎ、１０％熱不活化プラスミノーゲン欠乏子うし血 清および未変性、ひとプラスミノーゲン（Ｐ　Ｉｇ、　４０　、ｕｇ／ｍｌ）含 有ＭＥＭ培地と３７℃で３時間インキュベートした。プラスミノーゲン使用の培 養物を結合プラスミンの１００対照とし、ｕ−ＰＡの対照はプラスミノーゲンな しのインキュベーションとした。 第８表 血清培地中におけるプロｕ−ＰＡ活性化およびＨＴ−１０８０表面プラスミンの 効果 対照　８５　０ Ｐｉｇ　５０　１２ Ｐ１ｇ＋抗−ＰＡｉｌ　２１　３３ μ１ｇ＋抗−ＰＡＬＬ＋アプロチニン　９３　３．３μ１ｇ＋抗−ＦＡＩ−１＋ 抗−Ｐｉｇ−１７２２，１ＰＩｉ＋十片−ＰＡＴ−１＋ＴＡ（１（１０ＰＭ）８ ８　０全面細胞層を、１０％熱不活化プラスミノーゲン欠乏子うし血清含有ＭＥ Ｍ培地（０，５ｍ１）に以下のものを加えて３７℃で２時間インキュベートした 。未変性ひとプラスミノーゲン（Ｐｌｇ、４０Ｐｇ／ｍｌ）、ひとＰＡＩ−１に 対する中和性モノクローナル抗体（１０Ｐｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２００Ｋ 　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）、ひとプラスミンに対する抗触媒モノクローナル抗体（２０Ｐ ｇ／ｍｔ）、およびトラネキサミン酸（ＴＡ１示す量）。ついでウェルの半数を アプロチニン（２００ＫＩＵ／ｍｌ）で処理し、結合ｕ−ＦＡおよびそのプロｕ −ＰＡ係数のアッセイに使用した。残りの半数は結合プラスミンの溶離とアッセ イに使用した。 実施例８ ＦＡ　Ｉ　−１に対するレセプター結合ｕ−ＰＡの利用可能性およびＵ−ＰＡ／ ＰＡＩ−１複合体の内在化。 （材料および方法） 試薬：ＰＡ　Ｉ　−１は以前に報告されたように精製した（ニールセン等、１９ ８６年）。プロｕ−ＰＡはコーティ等、プチチド・オブ・バイオロジカル・フル イド、３３巻６２３−６２６頁（１９８５年）記載のようにして、ひとＡ４３１ 類表皮がんから精製したが、これはＥ、ｆルビおよびＡ、ソフィエンチニから贈 与されたものである。 ２本鎖ｕ−ＰＡおよびＰＡアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ）精製（ストベリ等 、１９８５年）並びにＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの製造（アンドリーセン等、１９８６ 年）は以前に報告されている。ひとプラスミン（４単位／ｍｇ）、びとプラスミ ノーゲン（６Ｕ／ｍｇ）、アプロチニン（１５Ｔ　Ｉ　Ｕ／ｍｇ）＃よびベンズ アミジン・セファロースはシグマ社から購入した。合成ペプチドひとｕ−ＰＡ［ １２３２（アラ２０）］はアベラ等Ｃｌ９８７年）に報告されている。 細胞および細胞培養：　組織球性リンパ腫由来のひと単球様Ｕ９３７細胞（サン ドストローム、Ｃおよびエルシンｌ　Ｋ　％インターナショナル・ジャーナル・ オブ・カンサー第１７巻第５６５−５７７頁、１９７６年）を、１０％子うし血 清補足ＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。ｕ−ＰＡ／ＰＡＩ　１温合体の製造 ：ＰＡ　Ｉ　−１を使用前に４ＭグアニジンＨＣＩで３７℃、１時間処理した活 性化した（ヘクマン、Ｃ，ＭＢよびロスクトフ、Ｄ、Ｊ、ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー第２６０巻第１１５８１−１１５８７頁（１９８５ 年）。グアニジンを、セントリコン１０（アミコン社、マサチュセッツ州ダンバ ース）による遠心で除去した。ｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−１温合体は、結果の部に示す 比率で蛋白質を１温、１時間インキュベーション後生成した。 よう素化：３０ｍＭりんナトリウム酸緩衝液（ｐＨ２，４）中の蛋白質（ＡＴＦ 、ｕ−ＰＡまたはプｔ７ｕ−ＰＡ）１．／Ｊｇ部分をＮａ”■（アマージャム社 、英国アマ−ジャム）Ｉｍｃｉ８よびヨードゲン（ピアス・ケミカル社、イリノ イ州ロックホルト）５μｇにより４℃、４分間よう素化し、反応を過剰のＮ−ア セチルチロシンで停止させた。よう素化蛋白はセファデックスＧ−２５上でのゲ ル濾過により非結合放射能から分離した。よう素化ｕ−ＰＡはベンズアミジン・ セファロース上でのクロマトグラフィーによりさらに精製して酵素活性を保持す る分子を分離した。 結合アッセイ：　結合前に、Ｕ９３７細胞を０．１％うし血清アルブミンおよび ５０ｍＭヘベス（ｐＨ７，４）補足（ＲＰＭ１１６４０培地中で４°Ｃ，１時間 インキュベートした。ついで、細胞を５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、１００　ｍＭ −’ＮａＣ１（ｐＨ３）中で４０’０，３分間酸処理し、０．５Ｍヘベス、１０ ０ｍＭＮａＣ１（ｐＨ７，４）の半量で迅速に中和した。細胞■ＯＯ万個をよう 素化リガンド（ＡＴＦ　Ｏ、１ｎＭ１プロｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡｏ、０５ｎＭ に対応する約５０．０００ｃｐｍ）を含む結合緩衝液（０，１％うし血清アルブ ミン補足りん酸緩衝食塩水）Ｏ−２＋ｎ＋中に再けんだくし、４℃、指示時間イ ンキュベートした。 結合後、細胞を遠心し、冷りん酸緩衝食塩水・０．１％うし血清アルブミンで洗 浄した。非特異結合は１００ｍＭ非標識ｕ　−Ｐ　Ａの存在下で測定した。 プロｕ−ＰＡのプラスミン解裂、１！Ｊプロｕ−ＰＡを上記のように細胞に結合 させた。洗浄後、細胞をプラスミン（１０μｇ／＋ｍｌ）の存在下で室温、１０ 分間インキュベートした。溶液中のよう素化プロｕ−ＰＡを同一条件で活性化し た。反応を、最終濃度１２５μｇ／ｍｌのアプロチニン添加により停止させた。 アミド溶解アッセイ：ｕ−ＰＡを、０．０５Ｍ１−リスＨＣ１（ｐＨ７。 ５）、４０ｍＭ−ＮａＣ１，０，０１％ツイーン８０中、１ｍＭプラスミン特異 性基質５２３９０（カビ・ビトラム社、スウェーダン）および０．５μＭプラス ミノーゲン、最終容量０．３ｍｌ中で、結合混合物または結合アッセイ上清１０ ０μｍとインキュベートしてアッセイした。発色の時間依存性は４０５ｎｍの吸 収（ビータ−セン等、１９８８年）にしたがって測定した。 ゲル電気泳動：　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を７．５−１５％ポリ アクリルアミド勾配ゲル中で実施した。試料をあらかじめ還元および熱変性する ことなくレムリ緩衝液（レムリ、前掲）中で適用した。ゲルを乾燥し、コダック ＸＡＲ−５フィルムにさらした。 １６Ｃ−標識分子量操単品（レンボー混合物、アマージャム社、英国）を側方に 流した。ザイモグラフィーおよびカゼイン溶解プラークアッセイ：　電気泳動ゲ ル中でのプラスミノーゲン活性化因子活性を、ザイモグラフィーＣグラネリービ ペルノ、ＡおよびＥ、ライヒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディ スン第１４８巻第２２３−２３４頁、１９７８年）により、ポリアクリルアミド ゲルを２５５ｍＭトリスＨＣＩ（ｐＨ７，５）中、カゼイン（２％脱脂粉乳）お よびプラスミノーゲン（４０μｇ／、ｍｌ）含有アガロースゲル（１％）上に重 層して発現した。 カゲイン溶解プラークアッセイは、はぼゴールドバーブ、　Ａ、　Ｒ（セル第２ 巻第９５−１０２頁、１９７４年）に記載されたように実施した。略述すると、 Ｕ９３７細胞を、０．８％寒天、１．３％脱脂粉乳および１３μｇ／ｍｌプラス ミノーゲンを含むＲＰＭ１１６４０培地に再けんだくし、３０ｍ＋ｏプラスチッ ク皿中に層状に入れた。 ３７℃で３時間インキュベーション後、プレートを視覚評価し撮影した。ついで 全プレートを乾燥し、７０％メタノール、１０％酢酸および０．２％クーマシー ブルーで染色した。 イムノアティニティーク口マトグラフイ一二　細胞の酸洗浄液中におけるＰＡｌ −１／ｕ−ＰＡ複合体の証明のため、これら洗浄液を０．１Ｍ１−リスＭＣＩ緩 衝液（ｐＨ８，１）−０，１Ｍ−ＮａＣＩで５倍に希釈し、同緩衝液で平衡化し た１ｍｌのポリクローナル抗−ＰＡＩ−１１ｇＧセファロース４Ｂカラムに２回 通した。カラムをｌｏ倍容重　の緩衝液で洗浄し、Ｏ，１Ｍ酢酸中ＩＭ−ＮａＣ １（ｐＨ２−７）で溶１ｔｌし、０．０３％ＳＤＳに対して透析し、凍結乾燥し 、ＳＤＳゲル電気泳動（前記）にかけた。 （結果） ミ　あらかじめ形成したＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体とｕ−ＰＡレセプターの相 互作用を、ＦＡＩ−１とレセプター結合ｕ−ＰＡの場合と同様に、ｕ−ＰＡが同 時に阻害剤とレセプターに相互作用するかどうか、およびｕ−ＰＡの２つの部分 であるレセプター結合アミノ末端と阻害剤結合触媒活性カルボキシ末端（ストペ リ等、１９８５年）ｉ　が完全に独立しているかどうかを評価するために研究し た。ＦＡＩ−１がレセプター結合ｕ−ＰＡに結合し阻害する能力は、後者が主と して可溶性ｕ−ＰＡとして調節され得ることを示し、結合ｕ−ＰＡが触媒活性を もつことを強（示唆した。 ｕ−ＰＡレセプターへの”’Ｉ−ＡＴＦの結合Ｉ；対するｕ−ＰＡおよびｕ−Ｐ 　Ａ／　Ｐ　Ａ　１−１複合体の効果：ＦＡＩ−１とレセプター結合ｕ−ＰＡの 相互作用を研究するｔ；めに、まず精製ＦＡＩ−１がＵ９３７細胞上のレセプタ ーに対する結合についてＡＴＦと競合するかどうかを研究し、１０００：１過剰 でも競合しないことを見出したくデータ略）。ついで、レセプター結合について 、”’Ｉ−ＡＴＦに対してｐｍｉ識ｕ−ＦＡおよびあらかじめ形成したｕ−ＦＡ ／ＦＡＩ−１複合体が競合する能力を比較した。 図２９は非標識ｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体の濃度に対する”’ Ｉ−ＡＴＦとＵ９３７細胞の結合阻害の依存性を示す。 ＦＡＩ−１はｕ−ＰＡと化学当量での共有結合複合体を形成する（ヘクマン等、 前掲）ので、ＦＡＩ−１の５０倍一定過剰を用いた。全ての場合にｕ−ＰＡ活性 の完全阻害が見られ（図示せず）、図２９の挿入に示すように、競合結合混合物 中の全ｕ−ＦＡはザイモグラフイーでＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体として挙動し た。図２９に示すデータは、ＦＡＩ−１によるｕ−ＰＡの複合が、レセプター結 合についてのＡＴＦとの競合能力を大きくは変えないことを示している。 ｕ−ＰＡがｕ−ＰＡ／ＰＡＩ　−１複合体に較べて２−３倍すぐれたＵ−ＦＡＴ リガンドであることを示唆するわずかな差異が常に見られたが、これは解離定数 の実際の差を反映している可能性がある。 ｕ−ＰＡに対するｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−１複合体の結合：ＦＡＩ−１／ｕ−ＦＡ複 合体がｕ−ＰＡレセプターに結合することを直接確認するため、あらかじめ形成 した”’Ｉ　−ｕ−ＰＡ／ＰＡ　Ｉ−１複合体をＵ９３７細胞と４℃で１時間イ ンキュベートした。結合工程後、細胞を洗浄し、溶解し、細胞付着放射能を非還 元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図３０に示すように、ＰＡ　ｒ　−１お よび非標識競合剤の不存在下では細胞結合放射能はほとんど５０ｋＤバンドとし て泳動した。しかし、あらかじめ形成したｕ−ＰＡ／ＰＡｒ−１複合体の場合、 細胞結合９０ｋＤバンドが、ｕ−ＰＡ／ＰＡｌ−１複合体の泳動に対応して出現 した。このバンドは、非標識８５ｎＭＡＴＦまたはｕ−ＰＡにより競合されるの で、レセプター結合ｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体である。 図３０をさらに分析すると、この実験に用いた＋　２１　Ｉｕ　−ｐ　Ａは実際 には３３ｋＤの低分子量ｕ−ＰＡで汚染されていたことがわがる。 ＰＡｉ−１の５０または１５０倍過剰の存在下では、結合混合物のｕ−ＰＡの大 部分が複合化して７５ｋＤおよび９０ｋＤのＰＡＩ−１複合体を生じ、そのうち 前者が低分子量ｕ−ＰＡを示す。しかし、結合混合物中および結合インキュベー ションの上清中に存在するが、７５ｋＤバンドはＵ９３７細胞に結合することが 見られず、このことは、ｕ−ＰＡが低分子量ｕ−ＰＡで欠失しているアミノ末端 ドメインでレセプターに結合するとの説を維持させる。 驚くべきことに、結合混合物中にＦＡＩ−１が存在しない場合、分子量約６９お よび９０ｋＤの弱いバンド２個が検出された。この背景は細胞の存在に依存する ものであり、種々の細胞前処理によっては除去できなかった。これらのバンドは 抗ＦＡＩ−ＩＩｇＧと結合したセファロース４Ｂカラム上に保持されなかった。 このことは、あらかじめ形成したＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体とインキュベート した細胞にみられる複合体と対照的であり、このものは、予期されるように、細 胞酸洗液からアフィニティクロマトグラフイーにより分離できた（データ省略） 。これは、Ｕ９３７細胞においてＦＡＩ−１が極めて低レベルであることと一致 するものである（バンド等、１９８８年）。それ故、２種の汚染バンドの性質は 未知のままであり、さらに研究をまたねばならない。これらは、レセプター結合 Ｕ−ＰＡとＦＡＩ−２との複合体（ゲントン等、１．９８７年）またはプロテア ーゼネキンン１との複合体（ベーカー等、セル第２１巻第３７−４７頁、１９８ ０年）を表わすのかも知れない。 ｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−１複合体とｕ−ＰＡレセプターの結合の特異性をさらに研究 した。ｕ−ＰＡはアミノ未満の先端によりレセプターに結合し、・その結合はＡ ＴＦまたはｕ−ＦＡによって同程度によく競合される（ストベリ等、１９８５年 ）。したがって、ｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−］複合体の結合はＡＴＦおよびｕ−Ｆ’Ａ により同程度に競合され得、５０％競合は約１１−２ｎで達成され得るとの知見 を得た（データ略）。すなわち、阻害剤と複合していても、ｕ−ＰＡはなおその レセプターに特異的に結合する。 レセプター結合ｕ−ＰＡに対するＦＡ　Ｉ　−１の結合：上記の実験は、ｕ−Ｐ Ａ／ＦＡＩ−１複合体はｕ−ＰＡレセプターに特異的に結合し得ることを示す。 そこで、ＦＡＩ−１が前結合Ｕ−ＦＡに結合し得るかどうかを試験した。外的添 加ＦＡＩ−１の不存在下における複合体形成を減少させる目的で、１末鎖プロｕ −ＰＡをＵ９３７細胞に結合させ（４°Ｃ１１時間）、ついでレセプター結合プ ロｕ−ＰＡをプラスミンにより２本鎖ｕ−ＰＡに変換した（タペンス等、１９８ ６年）。ついで、プラスミン阻害剤トラシロールおよびＦＡＩ−１を加えた。さ らに、前に会合したプロｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡの再会合を防ぐため過剰のレセ プター結合合成ペプチドを存在させた（タペンス等、１９８６年）。最後に、細 胞を溶解し非標識ｕ−ＰＡの状態を非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した 。 結果を図３１に示す。 プラスミンもＦＡ　Ｉ　−１も加えない細胞は１個の５０ｋＤバンド（プロｕ− ＰＡ）のみを示した。プロｕ−ＰＡのプラスミン活性化は９０ｋＤバンドの出現 と一致し、その強度は加えたＦＡ　Ｉ　−１の量に比例する。しかし、またこの 場合、弱いものではあるが、外来ＦＡＩ−１の不存在下で細胞結合９０ｋＤバン ドも認められた。これはプロＵ−ＰＡの活性化後にのみ出現するものであるから 、ｕ−ＰＡとプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の複合体を表わす可能性が強い 。プロｕ−ＰＡから２本１１１ｕ−ＰＡへの活性化の度合は、還元条件下の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより平行的に分析し、すべての場合に、はとんど全部の結合プロ ｕ−ＰＡが２本鎖形に変換されたことを示した（データ省略）。プロｕ−ＰＡの 活性化と細胞存在下および不存在下のＰＡｌ−１に対する結合の比較からは、大 きな差は呈示されなかった（図３１の細胞結合レーンと溶液レーンを参照のこと ）。結論として、この実験はＦＡ　Ｉ　−１がレセプター結合していてもｕ　− Ｆ　Ａ　２本鎖と相互作用し得ることを示す。 Ｕ９３７細胞の細胞結合ｕ−ＰＡ活性に対するＦＡＩ−１の効果：ｕ−ＰＡ／Ｆ ＡＩ−１複合体形成はレセプター結合ｕ−ＦＡ活性を阻害する。これを研究する ため、細胞をプラスミノーゲンとカゼインの存在下に寒天上に置くカゼイン溶解 プラークアッセイを使用した。プラスミノーゲン活性化因子活性の存在は、プラ スミンによるカゼイン消化に基づく明確なプラーク出現により可視化される。図 ３２において、個々のＵ９３７ｍ胞の周囲に観察されたカゼイン溶解プラークを 示すが、これは全細胞集団を代表するものである。全ての場合に、プラーク形成 はプラスミノーゲン依存性である（図示せず）。Ｕ９３７細胞は極めて少量のｕ −ＰＡを産生するので、いくつかの極めて小さいプラークが外来酵素の不存在下 で観察される（図３２ａ）、また全プレートは実際上陰性のスコアを示す（図示 せず）。 Ｕ９３７細胞をｌＯｎＭのｕ−ＰＡと６０分間インキュベートし、洗浄しプレー トに置くと、今度は明確に陽性のスコアを示す（図３２ｂ）。ＤＦＰ処理したｕ −ＰＡは明らかにＵ９３７細胞に対する活性を付与せず、ｕ−ＰＡをＦＡＩ−１ の７５倍過剰と前インキュベートすると活性を完全にブロックする（図３２ｄ） 。すなわち、ｕ−ＰＡ／ＦＡＩ−１複合体は細胞に結合した場合でも不活性であ る。ついで、これらのアッセイでみられた活性が本当にレセプター結合したもの であるかどうかを試験した。Ｕ９３７細胞をまず１０ｎＭＤＦＰ−ｕ−ＰＡと６ ０分間インキユベートシ、洗浄し、活性ｕ−ＰＡと再びインキュベートする。こ の条件下では、活性は検出されない（図３２ｅ）。すなわち、前に測定した活性 （ｆｆｉ３２ｂ）は活性部位がブロックされたｕ−ＰＡ類似体と競合し得る。逆 の実験として、まずｕ−ＰＡとインキュベートし、ついでＤＦＰ−ｕ−ＰＡど第 ２のインキュベーションをすると、後者はプラーク形成を妨げない（図３２ｇ） 。 すなわち、実験中にレセプター結合ｕ−ＰＡの解離は極めて僅かしか起こらない 。最後に、Ｕ９３７細胞をまずｕ−ＰＡとインキュベートしついで過剰のＦＡＩ −１とＤＦＰ−ｕ−ＰＡの存在下にインキュベートすると、活性は完全にブロッ クされる（図３２ｆ）。すなわち、ＦＡＩ−１は実際にけんだく増殖Ｕ９３７細 胞においてレセプター結合ｕ−ＰＡの活性を阻害する能力を有する。 レセプター結合ｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体の運命：細胞表面に結合しているレ セプター結合ｕ−ＰＡは検出可能なほど内在化また分解されず、緩和な酸処理で 表面から解離し得ることが知られている（ストベリ等、１９８５年、ストベリＬ １９８６年、バサリ等、１９８５年）。レセプター結合ｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複 合体が同様な運命をもつか否かについて研究した。 基本的実験は２段階で行なった。まず、標識リガンドを酸洗浄細胞と４°Ｃで９ ０分間インキュベートしたく第１段階）。すべての場合に、第１段階中に起る結 合の９０％以上がｕ−ＰＡまたはＡＴＦで阻害されたのに対し、低分子量ｕ−Ｐ Ａでは全く阻害が認められず、相互作用の特異性を示す（データ略）。第２段階 として、細胞をリガンドなしの結合緩衝液中、３７°Ｃで３時間インキュベート した。リガンドの量の状態を第２段階の種々の時点で放射能（およびＴＣＡ沈澱 性の度合い）の定量により検定した。このため、細胞結合形および上溝中の回収 放射能を測定した。前者は、レセプター結合リガンドを表わす酸洗浄抽出液放射 能（方法の項参照）と、細胞捕獲内在化リガンドを表わす酸洗浄抵抗放射能に区 別された（ハイグラ−１１９８０年、ストベリ等、１９８６年）。 ４種の異なるよう素化リガンドを試験した。すなわち、２末鎖Ｕ−ＰＡ（ｕ−Ｐ Ａ）、ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡ（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ）、ｕ−ＰＡのアミノ末端フラ グメント（Ａ　Ｔ　Ｆ　）およびあらかじめ形成したり−ＰＡ：ＰＡＩ−１複合 体である。レセプター結合リガンド（細胞結合、酸抽出放射能）、細胞捕獲リガ ンド（細胞結合、酸抽出放射能）および分解（すなわちｌＯ％ＴＣＡ非沈澱）リ ガンド（上清中）の量を第２段階インキュベーションの種々の時点で測定した。 すべての場合に、酸抽出および細胞結合放射能は全時点、全リガンドにつき９０ ％以上ＴＣＡ沈殿性で、そのＳＤＳゲル電気泳動分析における泳動は無傷のリガ ンドを示した（図示せず、後記参照）。 図３３は、３７℃における２段階インキュベーション中のリガンドの運命を示す 。ＡＴＦおよびＤＦＴ−ｕ−ＰＡの場合、レセプターの結合フラクションは以前 のデータ（ストペリ等、１９８５年）と同じく徐々に減少した。ｕ−ＰＡでは、 減少は若干早かった。Ｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１の場合、レセプター結合リガンドの 開始時の急減がインキュベーション中続き、３７℃で２〜３時間後には、なお表 面に結合している複合体は極めて僅かしかみられなかった。非分解、内在化リガ ンドはＡＴＦの場合小さなフラクションを構成するが、明らかに他の金側よりも 高い。特にｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１複合体の場合、急激に増加して３０分附近では 全放射能の約４０％に達し、その後減少する。ＡＴＦおよびＤＦＴ−ｕ−ＰＡの 場合極めて僅かのりガントしか分解しないが、ｕ−ＰＡでは分解するフラクショ ンはより大きく（３時間後２０％）、ｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−］複合体の場合さらに 大きい（３時間後６５％）。後者では、経時変化は細胞捕獲および分解リガンド 間に、前駆体・生成物関係が存在することを示唆する。それ故、ＡＴＦおよびＤ ＦＴ−ｕ−ＰＡではなくｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１複合体が内在化されついで分解さ れる可能性がある。図３３に示す実験において、ｕ−ＰＡは中間的な場合（低レ ベルの内在化と分解）を示すのかもしれない（後記参照）。ｕ−ＰＡの低レベル 分解はまた、Ｕ９３７の細胞がこの阻害剤を産生するので共有ｕ−ＰＡ：ＰＡＩ −２複合体の内在化を反映している可能性がある。この仮説を試験するＩ；め、 内在ｕ−ＰＡ結合ＰＡＩ様蛋白を定量する目的で段階１．２および全洗浄緩衝液 に５０％Ｍ低分子量ｕ−ＰＡを含ませて実験をくり返した。この条件下で得られ た定量データ（図３４）は、表面結合リガンドの時間依存減少、ペレット中非蓄 積および段階２上清におけるＴＣＡ沈殿形での放射能の完全回収を示した。すな わち、ｕ−ＰＡでみられた低レベル分解（図３３）は、内外性低分子量ｕ−ＰＡ 滴定可能阻害剤との共有結合複合体形成によるものと思われる。それ故、この実 験条件下では、リガンドの分解はｕ−ＰＡが外来性ＦＡＩ−１およびおそらく内 外性ＦＡＩ−２と複合体形成した場合にのみ起ると結論される。 ｕ−ＰＡ：ＰＡＩＩの分解におけるリソソームの役割を試験するため、リゾソー ム蛋自分解阻害薬であるクロロキンを使用した（ドデューブ等、１９７４年カー ペンタ−およびコーヘン、１９７６年、マツカナ等、１９７９年）。クロロキン の不在下では（図３５、Ａ部）、第２段階においてペレット中非酸抽出形リガン ドの蓄積速度と上溝中（ＴＣＡ可溶可溶分解リガンドの放出速度間に典型的な前 駆体・生産物関係がみられた。後者は、３時間後に結合リガンドの６０％に達し た。０．５ｍＭクロロキンの存在はｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１複合体が第２段階イン キュベージタン中に（図３５、Ｂ部）Ｕ９３７細胞（図示せず）結合する能力に 影響を与えなかっ・たが、レセプター結合のリガンドの消失速度およびそのベレ ット中蓄積の僅かな減少がみられた。しかし、注目すべきことに、リガンドの分 解は強く阻害された（３時間後６０から２０％）。これらのデータは、ｕ−ＰＡ ：ＰＡＩ−１複合体の分解が細胞内、リゾソーム中で起ることを示唆する。 結論： 結果は、ＡＴＦＳＤＦＰ処理ｕ−ＰＡおよび遊離・活性ｕ−ＰＡ（特に過剰の低 分子量ｕ−ＰＡが存在して内在性阻害剤を中和する場合）は内在化も分解されな いが、ｕ−ＰＡ：ＰＡＴ−１複合体は内在化され、多分リゾソーム中で、分解さ れることを示す。 以前のデータはレセプター結合ＡＴＦ、ｕ−ＰＡおよびプローＵ−ＰＡの内在化 不存在を示した（バサリ等、１９８５年、ストペリ等、１９８５年、バジバイお よびベーカー、１９８５年ａ１ストペリ等、１９８６年）。これらのデータは本 研究でも完全に確認された。 また、遊離ｕ−ＰＡは、遅い速度ではあるが、明らかにｕ９３７細胞に内外化さ れ分解される（図３３）。これは、ｕ−ＰＡと、Ｕ−ＰＡ活性部位に相互作用す る内在蛋白、おそらく阻害剤ＦＡＩ−２との間に形成された複合体の内在化によ るものである（バサリ等、１９８４年、ゲントン等、１９８７年）。 溶液中で形成され、ついで細胞に結合し、未知のレセプターを経て内在化される ネキシン・プロテアーゼ複合体の内在化と異なり（ベーカー等、１９８０年）、 ｕ−ＰＡ：ＰＡＩ−１複合体はレセプター自体と結合しく実施例８参照）、つい で内在化および分解を受ける。それ故、このレセプターは、２種の可能な配置間 で交代しなければならない。その一方は、活性ｕ−ＰＡに結合し、細胞表面上で のプラスミノーゲン活性化を指示し、他方は、阻害された酸素に結合し、リガン ドの内在化および分解を有利にするものである。この性質は、毒素の内在化、し たがってｕ−ＰＡレセグターを発現する細胞を特異的に殺すことに、またはＦＡ 　Ｉ　−１もしくはＦＡＩ−１類似体により、レセプターの状態を一方の状態（ すなわち露出）から他方の状態へ強制することにより、利用され得る。 実施例９ ＦＡ　Ｉ　−１およびＦＡＩ−２による受容体結合ｕ−ＰＡの阻害材料および方 法 プラスミノーゲンは、以前に報告されたとおり新鮮なヒト血しょうより精製しく ダノーおよびライヒ、１９７９年）、さらに６−アミノヘキサノン酸の直線グラ ジェントでリジン−セファロースから流出することにより、２個の同一の分画に 分離した。プラスミノーゲンの同一分画２を本明細書に記載されている全ての実 験に用いた。 ｕ−Ｐ　Ａ（Ｍ＋　５５０００　）はプＯ−ｕＰ　Ａのプラスミン活性化によル （エリスら、１９８７年）かまたはウキダン（七ロノ）として得られた。 調製物は両者とも、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気分解によると、９５％高 分子量ｕ−ＰＡよりも大きかった。これらの調製物中の活性ｕ−ＰＡ濃度を、ｐ −ニトロフェニル−ｐ−グアニジノベンゾエート（シグマ・ダム。コーポレーシ ョン）で活性部位滴定することにより決定した。ＤＦＰ−不活性化ｕ−ＰＡは実 施例１記載のとおり調製した。ネズミのｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体は ニールセンら、１９８６年に報告されたクローン２であった。活性ＦＡＩ−１は 、ＨｅｐＧ２細胞の血清不合条件培地から、固定化無水ウロキナーゼの親和性ク ロマトグラフィーにより精製した（ラーンら、１９８９年）。ＦＡＩ−２はＵ９ ３７細胞リゼイトから、既に報告されたりＯ？ドアｆ−カッシング（ｃｈｒｏｍ ａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇＸクルイトフら、１９８６年）により精製した。種々Ｆ ＡＩ調製物中の活性阻害物の濃度は、反応速度実験に用いる直前に、ｕ−ＰＡに 対する滴定により決定した。ＰＡＩ−１まＩ；はＰＡ　Ｉ−２を１ｎＭ−１００ ｎＭの種々の濃度で、活性部位滴定したｕ−ＰＡ（２０ｎＭ）と共に、０゜２％ ウシ血清アルブミン含有０．０５Ｍトリス、０．１Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，４中 ３７℃１時間恒温培養した。残存するｕ−ＦＡ活性は、０．２ｍＭ　Ｇｌｕ−Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（”ゲム、スイス）の加水分解により測定した。 Ｕ９３７細胞は、加熱した不活化した５％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭ１１６４ ０培地の懸濁液中で成長させた。Ｕ９３７細胞のＰＭＡ刺激は、セル密度０．５ Ｘ１０’セル／ｍｌで、１５０ｎＭ　ＰＭＡを用いて４日間行った。粘着細胞群 をゴム製のスフラッパ−（ｓｃｒａｐｅｒ）で収穫し、ＰＢＳに再懸濁した。 これらを反応速度実験に用いる前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２ｍｇ／ｍｌ の脂肪酸不合ウシ血清アルブミン（シグマ・ケム、コーポレーション）を含有す るＰＢＳに再懸濁し、細胞をｕ−ＰＡと前もって恒温培養する実験では、ｕ−Ｐ Ａ濃度１．４ｎＭ、および２Ｘ１０’セル／ｍ＋、３７°Ｃで２０分間実施し、 続いて２ｎ＋ｇ／ｍｔ脂肪酸不合ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで３回洗浄した 。次いで細胞を０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ、０．ＩＭＮａＣ１中最終濃度ｌＸｌ ０’セル／ｍｌで、プラスミノーゲン２（０，１７５μＭ）および０．２ｍＭプ ラスミン特異性蛍光厘性ペプチド基質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ （ハゲム、スイス）と共に恒温培養した。これらの恒温培養は、１０關プラスチ ツク製の蛍光光度計のキュベツト（吸収セル）中で行い、それをマイクロマグネ チックスターラー（微小磁気撹拌機）を装備したパーキン・エルマーＬＳ−５分 光蛍光光度計中で３７℃に維持しながら、穏やかに撹拌した。励起波長３８０ｎ ｍおよび発光波長４８ｎｍで、共にスリットは５ｎｍに調節して、１分間隔で蛍 光を測定した。 各測定時間の間の蛍光の変化率を計算し、活性部位滴定したプラスミンを用いて 作図した測定値曲線と比較することにより、これらの測定結果をプラスミンの濃 度に変換した。 細胞結合性ｕ−ＰＡの活性に及ぼすＦＡＩの効果は、種々濃度のＦＡ　Ｉ　−１ （０，１８−１８，４ｎＭ）またはＦＡＩ−２（１，１３−５６，７ｎＭ）をプ ラスミノーゲンの添加と同時に恒温培養物に添加して決定した。プラスミン濃度 の時間に対する曲線を作図した。 これらの研究に用いた阻害物の濃度は、細胞結合性ｕ−ＰＡの濃度より少なくと も１００倍濃く、これは恒温培養を、擬１次反応条件下で実施したことを意味す る。以下の一般式は、このような条件下で実施された反応の漸次的阻害曲線を描 く：［ｐｌｎ］ｔ＝　［ｐｌｎ］＝（１−ｋｅ　ａｂｐ　）　式１、式中Ｋ　ａ ｌ）りは、見かけの擬１次速度定数であり、［ｐｌｎｌｔおよび［ｐｌｎ１ωは 各々、時間ｔ１およびｕ−ＰＡが完全に阻害される無限時間におけるプラスミン 濃度である。 ［ｐｌｎ］ｏ＝は以下の関係式より計算した：［ｐｌｎｌ　”　＝　ｌ　／　Ｋ 　ａｐｐ（Δ［ｐｌｎｌｏ）　式２、式中Δ［ｐｌｎｌ。は、阻害剤を加えない 対照恒温培養物中で測定される初期のプラスミン発生速度である。実験的に得ら れたプラスミン発生曲線は、非直線的回帰により式ｌに合致した。 相関速度定数（２次速度定数）は、阻害剤濃度に対するＫ　ａｐｐの二重逆数の グラフの直線の傾きから算出した。 結果 細胞結合ｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化細胞受容体結合ｕ−ＰＡのＦＡ Ｉ−１およびＦＡＩ−２との関係を研究するために、受容体結合ｕ−ＰＡの、そ の生理学的基質プラスミノーゲンに対する活性を決定することが最初に必要であ った。 この研究に用いられたＵ９３７細胞は、低濃度のｕ−ＰＡを分泌し、これが細胞 表面のｕ−ＰＡＡ容体のいくつかを占領することが明らかになっている。この内 因性結合ｕ−ＰＡはプラスミノーゲンを活性化することが実証され、プラスミン 発生速度は直線的であった（図３６）。このことは、ｕ−ＰＡが活性な２本鎖の 形態であることを示唆し、その他の研究結果と一致する（ステ７エンズら、１９ ８８年）。 ｕ−ＰＡに対する非触媒モノクローナル抗体により完全に阻害されることから、 結合酵素はｔＰＡまたは同定されていない活性化物というよりむしろｕ−ＰＡで あると同定された（図３６）。細胞を外因的に添加したｕ−ＰＡと恒温培養する と、その結果プラスミノーゲン活性化の速度が上昇する（図３６）。これは先に 占領されていなかった受容体の飽和によるものである。また別に、内因性結合ｕ −ＰＡは短時間の酸処理により細胞から流去することができ（ストツペリーら、 １９８６年）、次に細胞を外因的に添加したｕ−ＰＡで飽和すると、プラスミン 発生率が約５０％上昇した（図３６）。ｕ−ＰＡの細胞への結合は、酸で洗浄し た細胞をモル濃度が１００倍過剰のＤＦＰ不活性化ｕ−ＰＡと前もって恒温培養 することにより競合され（プラスミノーゲン活性化を８７％阻害）、これは結合 がｕ−ＰＡＡ容体との特異的な相互作用を介していることを実証している。これ はさらに、細胞を精製したヒトｕ−ＰＡ受容体に対して上昇したポリクローナル 抗体２５μｇ／ｍｌと前もって恒温培養することにより証明され、結果としてプ ラスミノーゲン活性化を８２％阻害する。詳細は実施例１０に記載するとおりで ある。この抗体が上昇した同一の動物の免疫前１ｇＧは、ｕ−ＰＡ結合に影響を 及ぼさなかった。対照実験では、上述の各々の方法により調製した細胞は、ＦＡ Ｉによる阻害に関して識別できるものではないことが明らかになった。従って、 以下に記載する研究は、内因性結合ｕ−ＰＡを伴う細胞を用いて実施した。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ結合ｕ−ＰＡのＰＡＬ−１による阻害ひれらの実験に用いたＦ ＡＩ−１は、ＨｅｐＧ２細胞の条件培地から精製したが、その他の細胞型から精 製したＦＡ　Ｉ　−ｆｉｌｌ製物と対照的に、阻害活性の変性剤で前処理する必 要がない。この調製物は、ＦＡＩ−１活性を安定化することができるビトロネク チン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）のＮ　Ｈ２−末端の断片（複数の断片）を含有 する。このＰＡＩ−１調製物の、細胞結合ｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性 化に及ぼす影響を、図３７に示す。ＦＡ　Ｉ　−１は、細胞表面で一時に、およ び濃度依存的にプラスミノーゲン活性化を触媒するｕ−ＦＡを阻害し、また用い たＰＡｉ−１か高濃度であるとき、実験の経過時間内でｕ−ＰＡ活性を完全に阻 害することが認められる。これらの測定値より、４．５Ｘ１０’１モル濃度・秒 のＦＡＩ−１による細胞結合ｕ−ＰＡ阻害の相関速度定数が得られる（図３９） 。溶液中のｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化の、ＦＡＩ−１による阻害は 、７゜９ＸＩＯ’１モル濃度・秒であり（図３９）、ｕ−ＰＡの阻害をｕ−ＰＡ 特特異的蛍光性性ペプチド基質用いて直接的に測定すると７．６ＸＩＯ’１モル 濃度・秒であった（測定値は提示していない）。細胞の受容体に結合したｕ−Ｐ Ａは、従って、ＦＡＩ−１により非常に効果的に、溶液中のｕ−ＰＡの速度の約 ６０％の速度で阻害されるようである。 ビトロネクチンはＡｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｓｐ粘着配列を通して細胞と相互に 影響し合うことができ、それにより細胞を付着し、−面に広げるのを促進する。 この配列は、明らかにＦＡＩ−１／ビトロネクチン複合体でも利用可能であり（ サロネンら、１９８９年）、従って細胞結合ｕ−ＰＡの阻害でも役割を担うこと ができる。これが起こるかどうかを決定するために、ＦＡＩ−１調製物（０，９ または４．５ｎＭ）と恒温培養する前に、Ｕ９３７細胞をペプチドＧ　Ｉｙ　− Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ｓ　ｅｒ（０、５ｍｇ／　ｍｌ）と共に ３０分間前もって恒温培養した。 細胞結合ｕ−ＦＡの阻害速度はペプチド存在下またはペプチド不存在下で同じで あるこが見出された。 ＦＡＩ−２によるｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡの阻害これらの研究で用いたＦＡＩ− ２は、Ｕ９３７細胞リゼートから精製した。従って細胞内の、主に非グリコジル 化形態のＦＡＩ−２から成る。既に報告された研究によると、ＦＡＩ−２のグリ コジル化および非グリコジル化形態は機能的に同一であることが示されている（ ウォールウエンドら、１９８７年）。図３８では、種々濃度のＦＡＩ−２による 細胞結合ｕ−ＰＡの阻害を示す。もう一度、濃度および時間依存的プラスミノー ゲン活性化の阻害が見られ、ＦＡＩ−２が高濃度の時、実験の経過時間内でプラ スミノーゲン活性化の完全な阻害が観察された。これらの濃度はＦＡＩ−１で用 いられた濃度より約１０倍高く、相関速度定数がＦＡ　Ｉ　−１では４．５Ｘ１ ０６１モル濃度・秒であったのと対照的にＦＡＩ−２では３．３Ｘ１０５１モル 濃度・秒であったのと合致する（図３９）。Ｐ／ｌ−２による溶液中のｕ−ＰＡ の阻害速度をプラスミノーゲン活性化により決定すると５．３ＸＩＯ’１モル濃 度・秒であり（図３９）、直接検定によると５．２Ｘ１０’１モル濃度・秒であ った（測定結果は提示していない）。この測定結果より、ＦＡＩ−２は溶液中の ｕ−ＰＡで得られたものの約６０％の相関速度定数で細胞結合性ｕ−ＰＡを阻害 することが実証され、これはＦＡ　Ｉ　−１で観察された効果と非常に類似して いる。従って、ＦＡＩ−１と同様、ＦＡＩ−２は実質的に、溶液中のｕ−ＦＡの 効果的な阻害剤であるように、細胞結合ｕ−ＦＡの効果的な阻害剤である。 ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞上でｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡの阻害Ｕ９３７細胞 をＰＭＡで刺激すると、細胞あたりのｕ−ＰＡ受容体の数がそれに伴って増加し 、ｕ−ＰＡに対するこれらの受容体の親和性が付随して減少することが示された 。このことは、これらの条件下に観察される受容体のグリコジル化の増加に関連 してしするのであろう。従って、Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡ受容体は、ＰＭＡ刺 激において幾分異なった特性を有していると思われるので、受容体のこの形態が 結合ｕ−ＰＡの阻害に何らかの変化をもたらすのかどうかを決定した。ＦＡＩ− １は細胞結合ｕ−ＰＡを非刺激細胞でより低い相関速度定数で、すなわち４．５ ＸｌＯ″１モル濃度・秒に対して１．７Ｘｌｏ”１モル濃度・秒で（表９）阻害 することが認められ、これは溶液中のｕ−ＰＡの阻害速度の約２０％を示した。 ＦＡＩ−２による細胞結合ｕ−ＰＡの阻害は、細胞のＰＭＡ刺激におし１ても同 程度、すなわち３．３Ｘ１０’１モル濃度・秒から１．ｌＸ１０’１モル濃度・ 秒まで減少した（表９）。 表９ ＦＡＩによる遊離およびｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ結合ｕ−ＰＡの阻害の相関速度定数 溶液中　７．９ｘｌＯ’　５．３ｘｌＯ’Ｕ９３７細胞　４．５ｘｌＯ＠　３． ３ｘｌＯ’か仏１（ユニ」ｌ−ユユエ」上−−Ｌ且」工！実施例１Ｏ ｕ−ＰＡＲ抗体による細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害および可溶化ｕ− ＰＡＲによる溶液中のｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化の阻害 材料および方法 Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化を、実 施例９に詳細に記載されているとおりに決定した。簡単に述べると、種々濃度の プラスミノーゲン（０，０９μＭおよび２゜２６μＭ）をプラスミン特異性蛍光 原性基質Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−ＡＭＣ（バケム、スイス）の存在下、 Ｕ９３７細胞（活性ｕ−ＦＡと共に前もって恒温培養し続いて洗浄した）と共に 恒温培養した。プラスミン発生は基質の加水分解による蛍光の増加の変化率から 決定した。 蛍光は励起および発光波長を各々３８０ｒ＋ｍおよび４８０ｎｍで測定した。こ れらのプラスミン発生率は次いで、二重逆数法でプラスミノーゲン濃度に対して プロットし、反応に対する個々の反応速度定数、ＫＩ！ｌおよびＶ　ｍａｘを決 定しｌ；。最高反応速度Ｖ　ｍａｘは、Ｖ　ｍａｘをｕ−ＰＡＲに結合したｕ− ＰＡの濃度で割ることにより、触媒反応速度定数Ｋ　ｃａｔに変換しｔ；。 Ｕ９３７細胞上のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合したｕ−ＰＡの濃度は、反応速度実験 と平行して＋ｚｓ　１−ｕ−Ｐ　Ａ（実施例８記載のとおり調製）を細胞と恒温 培養し反応速度実験と同じ処理をして決定した。ｕ−ＰＡＲに結合した”Ｉ−ｕ −ＰＡは一般的なガンマ−・カウンティング技法を用いて定量した。 Ｐ　Ｉ　−ＰＬＯ（ホス７アチジルイノシトールーホスホリバーゼＣ１ベーリン ガー・マンハイム・バイオへミカ）で処理して細胞から放出されるｕ−ＰＡＲの 、ｕ−ＰＡの酵素活性に及ぼす効果を研究する実験では、以下の方法を用いた。 Ｕ９３７細胞を１５０ｎＭ　ＰＭＡ（ホオルポール・ミリステート・アセテート ）で４日間処理した。 細胞層をＰＢＳで３回洗浄し、２Ｘ１０’セルを３，３μｇＰＩ−ＰＬＣと共に ５ｍ１ＰＢＳ中恒温培養しｔ；。次に、種々の測定時間に分画を採った。これら の上清中のｕ−ＰＡＲの存在は、実施例１記載のとおりＤＳＳを用いて”Ｉ−Ａ ＴＦに架橋することにより確認した。この可溶形態のｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡ酵素 活性に及ぼす効果を、種々濃度の上清を０．０５Ｍ１−リスｐＨ７，４，０，１ Ｍ　ＮａＣ１，０゜２％ラウン血清アルブミン中０ｐＭｕ−ＰＡと共に恒温培養 することにより決定した。いくつかの実験では、上清をまず最初にＦＡＩ−２（ ＭＡＩ−２１：バイオポール、ウメア、スウェーダン）に対するモノクローナル 抗体５μｇ／ｍｌと共に３０分間前もって恒温培養した。上清中のｕ−ＰＡおよ び可溶性ｕ−ＰＡＲの恒温培養３０分後、残存するｕ−ＰＡ活性を、０．０５Ｍ トリスｐＨ７，４，０，１Ｍ　ＮａＣ１，２ｍＭトランス−４−（アミノメチル ）−シクロヘキサン・カルボキシル酸（シグマ・ダム。コーポレーション）中、 ０．２ｍｇ／ｍｌＧ　１ｕ−７’ラスミノーゲン（カビ、ストックホルム、スウ ェーダン）および０．２ｍＭ　Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣを含有する溶液 を等量添加することにより決定した。蛍光原性基質の加水分解を、励起および発 生波長を各々３８０ｎｍおよび４８０ｎｍにしたベルキン−エルマーＬ５５分光 蛍光光度計で連続的に監視した。残存ｕ−ＰＡ濃度は、既知濃度のｕ−ＰＡを用 いて作図した標準曲線を参照してこれらの測定値から算出した。 結果 Ｕ９３７上でｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化の反 応速度論 Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡは、ｕ−ＰＡＲが存在しない場 合に示すのとは異なる反応速度特性を示して天然基質プラスミノーゲンを活性化 することが認められた。ｕ−ＰＡＲ結合Ｕ−ＰＡによるＧｌｕ−プラスミノーゲ ンの活性化は、明らかにミカエリス・メントン型反応速度機構に従った。これは Ｋｍが０．６７μＭ１ｋｃａｔが５．６／分であることに特徴づけられた（図４ ０）。これらの両者の定数は溶液中、すなわちＵ９３７細胞が不在のときにｕ− Ｐで得られたものとは異なっていた。この場合、Ｋｍは２５μＭ（細胞関与ｕ− ＰＡＲが不在の場合のプラスミノーゲン親和性が約４０倍低いことと等価である ）と非常に高く、ｋｃａｔは４４／分（細胞関与Ｕ−ＰＡＲが不在の場合の触媒 速度が約８倍高いことと等価である）と高かった。従って、Ｕ９３７細胞上でｕ −ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡはプラスミノーゲン活性化を誘起し、溶液中でより も低いプラスミノーゲン濃度で飽和されるが、触媒反応速度の低下を伴う。しか しながら、全体的な効果をみると、Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲに結合している 場合、触媒効率（ｋｃａｔ／　Ｋｍ）が５倍増加する（表１０）。 プラスミノーゲン（およびプラスミン）はＵ９３７細胞およびその他広範な種類 の細胞（エリスら、１９８９年；プロウら、１９８６年）に結合することが知ら れているので、これらの定数はｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを有する細胞の表面で起こるプ ラスミノーゲン活性化、すなわち細胞表面プラスミノーゲン活性化の程度を表す 。 図１０でも、ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞上でｕ−ＰＡＲに結合したＵ−ＰＡによる プラスミノーゲン活性化の類似の測定結果を示す。プラスミノーゲン活性化のＫ ｍは今回は１．４３μＭであり、溶液中の反応の場合に比べるとまだかなり低い 。しかしながら、ｋｃａｔもまた５、６／分から１．２３／分に低下するので、 非刺激細胞と比較した場合、全体的にはプラスミノーゲン活性化（ｋｃａｔ／　 Ｋ　ｍ）は約１０倍低下する結果となる。 表１０ ｕ−ＰＡＲ関与Ｕ９３７の存在下、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン活性化の反応速度 定数 Ｋ　ｍ　ｋｃａｔ　ｋｃａｔ／　Ｋ　ｍ溶液中のｕ−ＰＡＲ２５μＭ　４４／分 　１．７６／ｐＭ・分Ｕ９３７細胞上の　０．６７　５．６　８．３６ｕ−ＰＡ 　−ｕ−ＰＡＲ ＰＭＡ−０９３７上の　１．４３　１．２３　０．８６ｕ−ＰＡ−ｕ−ＰＡＲ ｕ−ＰＡＲのポリクローナル抗体による細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害 精製したｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対して上昇したポリクローナルウサギ抗体（実施例 １１参照）を用いて、前章で実証されたｕ−ＰＡの細胞表面プラスミノーゲン活 性化活性が、確かにｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合したｕ−ＦＡによるものであること を証明し、またこの抗体が溶液中ｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの結合を実際に妨 害することをも証明した。 最初に、溶液中のｕ−ＰＡ活性に及ぼすこの抗体の効果を決定した。４回の実験 で抗ｕ−ＰＡＲ（ｌｏｏμｇ／ｍＬ　３０分）により残存ｕ−ＰＡ活性は９０． １　＋９．３％になり、それに対して同じ動物から採った免疫前１ｇＧでは８８ ．６＋１２．３％であった。従って、抗ｕ−ＰＡＲ抗体はｕ−ＰＡ活性を特異的 に阻害することはなかった。 ２５μｇ／ｍｌの濃度で３０分間口９３７細胞と前もって恒温培養した場合、抗 ｕ−ＰＡＲ抗体は結果的におこるプラスミノーゲン活性化活性を７６％（３回の 実験の平均、６６％−８２％の範囲）に減少させた。免疫前１ｇＧが１％未満し か阻害しないのに対して、一方ＤＦＰ−ｕ−ＰＡは９０％阻害した（３回の実験 で７４％−１００％の範囲）。従って、抗ｕ−ＰＡＲポリクローナル抗体は細胞 表面プラスミノーゲン活性化を効果的に阻害する。 Ｐ　Ｉ−ＰＬＯ処理により細胞から放出されたｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒのｕ−ＰＡ活性 に及ぼす効果 ＰＩ−ＰＬＯ処理したＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞の上清には、可溶形態のｕ−ＰＡ Ｒが含まれ、”’Ｉ−ＡＴＦにＤＳＳ交叉架橋することにより決定される。これ らの上溝をｕ−ＰＡと恒温培養すると、Ｕ−ＰＡ活性は濃度依存的に減少しく図 ４１）、これは対照のすなわちＰ　Ｉ−ＰＬＣ処理をせず、可溶性ｕ−ＰＡＲを 有意な量含有していない、上溝により誘起されるｕ−ＰＡ活性の減少よりもはる かに大きい。両者の上溝の阻害活性の比は、細胞から分泌されるＰＡ、Ｉ−２に 帰因するものであり、この阻害活性はＦＡＩ−２に対する抗体で中和することが できた（図４１）。この処理後も、ＰＩ−ＰＬＯ処理した上清によるｕ−ＰＡ阻 害は明白であった。この阻害活性が、実際に細胞から遊離されるｕ　−Ｐ　Ａ　 Ｒに帰因するものであることを実証するために、上溝はまた、ＤＦＰ−不活性化 ｕ−ＰＡ（ｕ−ＰＡの１００倍過剰）かまたはｕ−ＰＡＲのポリクローナル抗体 ２５μｇ／ｍｌと共に３０分間前もって恒温培養した（実施例１１参照）。結果 は表１１に示す。ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合をはずすこれらの試薬のいずれ かと前もって恒温培養しても、Ｐ　Ｉ　−ＰＬＯ処理上清の阻害活性をも約４０ ％まで減少させることが認められる。対照上清とでもわずかな効果が観察され、 これは”Ｊ−ＡＴＦ架橋により試料中に観察される低量のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒによ るものである。 これらの知見は、グリコシルーホスファチジルイノシトール固定剤を除去するこ とにより可溶化されたｕ−ＰＡＲが溶液中のプラスミノーゲンを活性化するｕ− ＦＡの能力を阻害することが、明らかに実証される。 表１１ 残存ｕ−ＰＡ活性 −ＰＩ−ＰＬＣ＋ＰＩ−ＰＬＣ −８８％　３４％ ＋ＤＦ　Ｐ　−ｕ−ＰＡ　Ｉ　Ｏ０％　７５％＋抗ｕ−ＰＡＲ抗体　１００％　 ７２％ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞をＰ　Ｉ−ＰＬＣと１２０分処理した。処理細胞 および対照細胞の両者の上溝をＦＡＩ−２に対するモノクローナル抗体と共に恒 温培養した。上溝２０μｌを最終容量を１００μｌにしてｕ−ＰＡと恒温培養し た。 実施例１１ ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対する抗体の産生 マウスの免疫化 ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスを、ジイソプロピルフルオライド・ウロキナーゼ型プラス ミノーゲン活性化物（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ）リガンド親和性カラム上で精製しｆニ ーｕ−ＰＡＲで免疫した。マウスは３週間間隔でｕ−ＰＡＲ５μｇを腹腔的注射 した。最後の注射後８−１０日で、血清を、ｕ−ＰＡＲに対する反応性を見るた めにＥＬ　Ｉ　ＳＡおよびウェスタンブロッティングの両方で試験した。陽性の 反応が検出されたとき、ｕ−ＰＡＲ１０１５μｇを腹腔内に最終的に補助注射し た。 モノクローナルマウス抗体の産生 融合のための標準的な実験計画に従ったが、筒車な概要は以下のとおりである１ ａ）　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスから単離した牌臓を機械的に粉砕し、均一 な細胞懸濁液を血清不合溶媒中調製した。 ｂ）指数増殖期の骨髄腫細胞およびＸ６３−Ａｇ３．６５３細胞（ケルニー、ジ ャーナル・オブ・イムノロジー、１２３巻、１５４８−１５５０頁、１９７９年 ）を単離し、ＢＡＬＢ／ｃ牌臓リンパ球との融合に供した。骨髄膜細胞は血清不 合溶媒に再懸濁した。 Ｃ）牌臓リンパ球および骨髄腫細胞を１：１の比率で混合した。 ｄ）細胞は３７°Ｃで５０％（重量／容量）ポリエチレングリコール４０００（ ＰＥＧ）１ｍｌを流加することにより融合した（１ｍｌ／１０’セル）。 ｅ）血清不含溶媒を穏やかに添加して融合を停止させた。 ｆ）遠心後、上溝を除去し、細胞を血清含有溶媒で１回洗浄した。 次いで、細胞をヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）含有溶媒 中注意深く再懸濁した。 ｇ）融合した細胞を約５ＸＩＯ’セル／ウエルの濃度で、１５０μｌの選択溶媒 中２．５ＸＩＯ’マクロフアージを含有する平底マイクロタイタープレートのウ ェルに５０μｌずつ分配した。 ｈ）細胞を加湿恒温培養器中５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で恒温培養した。 ｉ）選択溶媒は１週間後かまたは必要な時に新しくした。 ｊ）ハイブリドーマの成長を見るために、ウェルを検査した。膨大に成長し色が 黄色に変化したのが観察された時、上溝を採り抗体活性のふるい分けに供した。 ｋ）融合後１０−１４日に、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に置き換え、その後、例えば １０日後に普通の培地に置き換えた。 ｌ）陽性のウェルを２４−ウェルプレートのカップに移し、次に小さい（２５ｃ ｍ”）の培養フラスコに移した。 耐　望まし、い抗体を分泌するハイブリッド細胞を、液体窒素中できるだけ早く 凍結した。 ｎ）陽性のハイブリドーマクローンは制限希釈によりクローン化し、再試験し、 唯一の型のモノクローナル抗体を分泌する７〜イブリドーマが確立されるまで再 びクローン化し再試験した。 モノクローナルｕ−ＰＡＲ抗体産生のためのふるい分は方法放射性免疫沈澱検定 （ＲＩ　ＰＡ）。精製された抗厚の量が限られているので、この検定および逆相 固相放射性免疫検定を展開した。 材料 １）”！−ヨード化精製ｕ−ＰＡＲ（ヨードジエン法）。 ２）反応用緩衝液＋　ＰＢＳ中０．１％ウシ血清アルブミン＋０．１％トライト ンＸ−１００（０，１％ＢＳＡ、０．１％トライトンｘ−１００／ＰＢＳ）。 ３）洗浄用緩衝液：反応用緩衝液＋０．５Ｍ　ＮａＣ１４）反応用緩衝液中膨潤 し、１：１に希釈したプロティンＡセファロースＣＬ　４Ｂ（プロティンＡセフ ァロース溶液）。 ５）エッベンドル７プラスチック管 方法 １）反応用緩衝液で希釈した放射性標識化ｕ−ＰＡＲ（約３−５×１０　’ｃｐ ｍ／　ｍｌ）　１００μｌをエッペンドルフ管に添加する。 ２）反応用緩衝液で連続希釈した免疫血清／非免疫血清１００μｍ添加し、適切 な対照も含める。 ３）振とうせずに４℃で１時間恒温培養する。 ４）プロティンＡセファロース溶液５０μｌを加える。 ５）エンド・オーバー−ｚンド撹拌器（ｅｎｓ　−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ　ｒｏｔｏ ｒ）上、４℃で１時間恒温培養する。 ６）最後の恒温培養の後、試験管に反応用緩衝液１ｍｌを加え、プロティンＡセ ファロース溶液を沈澱させる。上清を除去する。 ７）反応用緩衝液を洗浄用緩衝液１ｍｌに置き換え、段階６を繰り返す。 ８）段階６を繰り返す。 ９）試験管のふたを切除し、計測する。 逆相固相放射性免疫検定 材料 １）　９６ウエル・プレート（コスタ−）。 ２）被覆用緩衝液：　Ｏ，１Ｍ　Ｎａ＝ＣＯｓ、ｐＨ９，８゜３）ウサギ抗マウ スｒ　ｇ（ＲａＭ　Ｔ　ｇ　１１．６ｍｇ／ｍｌＸダコ、２１０４）妨害用緩衝 液ＣＰＢＳ中２５％ウシ胎児血清（２５％　ＦＣ５／ＰＢＳ）。 ５）希釈用緩衝液：　ＰＢｓＳｐＨ７，４（ＰＢＳ）。 ６）洗浄用緩衝液二ＰＢＳ十〇、１％トウイーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢＳ／ト ウィーン２０）。 ７）　１２Ｊ−ヨード化精製ｕ−ＰＡＲ。 方法 １）　０．］、Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９，８で濃度２０μｇ／ｍｌに希釈した ＲａＭ　Ｉｇ　１００μｍでウェルを被覆する。 ２）振とう機上４℃で一晩恒温培養する。 ３）翌日、Ｐ″ＢＳ／ｌＢＳ／ｌウイーン２０ルを洗浄する。 ４）　２５％　ＦＣ３／ＰＢＳ　２００μｌ／ウエルで、室＠（ＲＴ）で１ｘ２ 時間、ウェル中に残存する活性部位を妨害する。穏やかに振とうする。 ５）ＰＢＳ／トゥイーン２０で４回洗浄する。 ５）ＰＢＳまたは１％ＢＭＰ／ＰＢＳで連続希釈した免疫／非免疫血清１００μ ｌ／ウエルを添加し、適切な対照も含める。 ７）穏やかに振とうしながら３７℃で１時間恒温培養する。 ８）ＰＢＳ／トウイーン２０で４回洗浄する。 ９）　ＰＢＳ（３−５ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｐｍ／ｍｌ）または１％ＢＭＰ／ＰＢＳ で希釈した放射性標識化ｕ−ＰＡＲをｔｏｏｌｌｌ／ウェル加える。 １０）３７°Ｃで１時間、穏やかに振とうしなから恒温培養する。 １１）　ＰＢＳ／ｌ−ウィーン２０で４回洗浄する。 １２）ウェルを計測する。 酵素連結した免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）材料 ｊ）　９６ウエルプレート（高度な結合能力のあるＵ型、タンク）。 ２）精製したｕ−ＰＡＲ（１０μｇ／ｍｌ）。 ３）西洋ワサビペルオキシダーゼ・複合ウサギ抗マウスＩｇ（ＨＲＰ　−ＲＥ　 Ｍ　Ｉ　＆）。 ４）ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）。 ５）　ＰＢＳ＋Ｏ，１％トウイーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢＳ／）ウィーン２０ ） ６）妨害用緩衝液ｎ　ＰＢＳ中２５％ウシ胎児血清（２５％ＦＣ３／’ＰＢＳ） またはＰＢＳ中２％脱脂粉乳（ＳＭＰ）。 ７）クエン酸塩緩衝液：　Ｏ，１Ｍクエン酸塩、ｐＨ５，Ｏ。 ８）基質溶液：クエン酸塩緩衝液中１．２−フェニレンジアミン−ジヒドロクロ ライド（ＯＰＤ）錠、ｌ；とえばクエン酸塩緩衝液１５ｍ１＋１（２０２５μｍ 中ＯＰＤ　３錠（３０％）。 ９）停止用緩衝液：　ＬＭ　Ｈ２ＳＯ。 方法 １）　０．１Ｍ　Ｎａ２ＣＯｘ、ｐＨ９，８で希釈して濃度を１０ｎｇ／ｍｌに した精製ｕ−ＰＡＲ１００μｍでウェルを被覆する。 ２）　４°Ｃで一晩恒温培養する。 ３）翌日、ウェルをＰＢＳ／トゥイーン２０で４回洗浄する。 ４）ウェル中に残存する活性部位を２５％ＦＣ３／ＰＢＳまたは１％ＳＭＰ／Ｐ ＢＳ、２００１１Ｉ／ウェルで、室温で１ｘ２時間妨害する。穏やかに振とうす る。 ５）段階３のように洗浄する。 ６）ＰＢＳ中連続希釈した免疫／非免疫血清１００μｌ／′ウエルを加え、適切 な対照を含める。 ７）穏やかに振とうしなから３７°Ｃで１時間恒温培養する。 ８）段階３のように洗浄する。 ９）　ＰＢＳでｌ：５００に希釈した２次抗体ＨＲＰ−ＲａＭ　Ｉｇ１００μＬ ／ウェルを添加する。 １０）　段階７のように恒温培養する。 １１）　段階３のように洗浄する。 １２）　Ｏ，１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ５，０で１回洗浄する。 １３）基質溶液１００μｍ／ウェルを添加する。 １４）鮮やかな黄色が現れた時、ＩＭ　Ｈ，５０４１５０μｍ／ウェルで１５− ３０分間反応を停止させる。 １５）　４９０ｎｍフィルターの付いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ読み取り機を読む。 ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対するポリクローナルウサギ抗体の調製精製したヒトｕ−Ｐ Ａ受容体の試料（実施例１）を非還元条件下、６−１６％のグラジェントゲル上 で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。蛍光分子量標識を隣接す るレーンを走らせて使用することにより、抗原に相当する電気泳動の部位を切除 した。 ゲルの断片を凍結乾燥し、続いてミクロ−ディスメンブレーター■機（Ｂ、ブラ ウンＡＧ、西ドイツ）中温側させた。ポリアクリルアミド粉末をトリスで緩衝し た生理食塩水中に再構成し、７０インドの不完全アジュバントと混合し、ニュー シーラント白ウサギの注射に用いた。この動物に約３μｇの抗原を含有する注射 をＩＯ日日間５回注射し、さらに７週間後、８μｇを１回注射した。最後の注射 の１週間後、血清を採取し、プロティンＡ−セファロース・クロマトグラフィー によりＩｇＧを調製した。注射した抗原中のわずかな不純物に対する抗体を除去 するために、固定化したヒトｕ−ＰＡおよびＰＭＡ刺１１１Ｕ９３７細胞からの トライトンＸ−１１４デタージエント相から成るタンパク混合物（実施例１参照 ）を各々含有するカラムに連続的に通して、抗体を吸着させた。得られた抗体調 製物は、溶液中のｕ−ＰＡのアミド溶解まＩ；はプラスミノーゲン活性化活性を 阻害しなかった。 ウェスタンブロッティングにより評価されるｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ抗体の特異性 電気泳動。５ＤＳ−ＰＡＧＥを、ラエムリ（上述）に準じて直線的６−１６％ポ リアクリルアミド濃度グラジェントの付いた平板ゲルで実施した。試料は還元条 件下で走らせた。２−メルカプトエタノールを１００℃で３分間ジチオスレイト ールと置換したとき以外は、ラエムリ緩衝液中の電気泳動の直前に試料を還元し た。以下の分子量標識を用いた：ホスホリラーゼｂ（分子量約９４０００）、ウ シ血清アルブミン（分子量６７０００）、卵アルブミン（分子量約４３０００） 、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量約３００００）、大豆トリズシン阻害剤 （分子量約２０１００）、およびζ−ラクトアルブミン（分子量約１４４００） 。 ウェスタンブロッティング−親和性精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ試料またはＰＭＡ刺激 Ｕ９３７細胞のトライトンＸ−１１４抽出物のデタージェント相を、６−１６％ グラジェントゲル上、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをニトロセ ルロース薄板薄板に電気ブロッティングしｔ；。この薄板をすすぎ、トリス緩衝 生理食塩水ｐＨ７，４中３０％ウシ胎児血清で妨害した。薄板をマウス抗ｕ−Ｐ ＡＲ血清または対照血清（すなわちブタムチンに対するマウス抗血清）と共に恒 温培養し、トリス緩衝生理食塩水中ウシ胎児血清で希釈した。薄板をすすぎ、２ 次抗体（アルカリ性ホスファターゼ複合ウサギ抗マウスＩｇ（ダコパッツ、コペ ンハーゲン）と共に恒温培養し、ニトロ−ブルー・テトラゾリウム１５−ブロモ −４−クロロ−３〜インドリル嗜ホスフエート／レバミンールで展開した。 ウサギｕ−ＰＡＲ抗体のウェスタンブロッティング分析は以下の変法を陳いて同 じ方法で行った：　５ＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下で行った。新生仔ウシ血清 を、ウシ胎児血清の代わりに用いた。初期の抗体恒温培養段階では１０％血清の みを含有した。アルカリ性ホスファターゼ複合ブタ抗ウサギＩｇ（ダコバッツコ ード３０６）、１００倍希釈を２次抗体として用いた。 細胞性ＡＴＦ結合の阻害検定−既に報告されたとおりに−ルセンら、１９８８年 ）Ｕ９３７細胞を洗浄し、酸処理した。細胞を２８３１００μｍ、０．１％ウシ 血清アルブミン、および前もって希釈した抗ｕ−ＰＡＲ血清１００μｌに再懸濁 した。対照試料には前もって希釈した対照血清（すなわちブタムチンに対して上 昇したマウス抗血清）１００μｌを加えた。試料を４℃で１時間、穏やかに撹拌 しながら恒温培養した。恒温培養後、１２’Ｉ−ＡＴＦを添加し、さらに１時間 恒温培養を続けた。反応容量３００μｌ中、”Ｉ−ＡＴＦの最終濃度は２．２ｎ Ｍであり、抗ｕ−ＰＡＲ血清／対照血清の最終希釈の範囲は１：３００−１：１ ５３６００であった。次に細胞をＰＢＳ−ラン血清アルブミン１ｍｌで３回洗浄 し、結合した放射活性をガンマ−カウンターで測定した。これらの条件下、抗血 清を添加しなかった場合、細胞結合した放射活性は１２％であった。細胞を非標 識化ｕ−ＰＡ　７００ｎＭと共に前もって恒温培養した場合、結合しｔ；放射活 性の９０％が置換された。 結果 図４２に示すとおり、免疫マウスの血清は、１′■−標識化精製Ｕ−ＰＡＲを沈 澱させた。ｌニア５．１ニア５０．１ニア５００および１ニア５０００に希釈し た抗−ｕ−ＰＡＲは各々２５％、１８％、５％および１％沈澱した。同じ希釈を した非免疫血清およびその他の対照では、０．５−１％の範囲で沈澱した。 逆相固相放射性免疫検定を用いる場合、１．！　■−標識化精製ｕ−ＰＡＲを免 疫捕獲するために抗血清が用いられた（図４３）。抗ｕ−ＰＡＲ血清１：５００ −１：３２０００の２倍連続希釈では、同量の目Ｊ−ｕ−ＰＡＲ（全体の約２％ ）が１：４０００までの血清希釈で捕獲され、１：３２０００で半量まで低下し た。非免疫血清およびその他の対照の同じ連続希釈では、全体の約０．５％のｌ ！Ｊ−ｕｐＡＲが捕獲される結果となった。 ＥＬ　ｒＳＡにおける免疫対非免疫反応は図４４に示す。ウェルごとに被覆した 精製ｕ−ＰＡＲはｌｎｇで１：８０００に希釈した免疫血清で検出されるのに十 分であった。全希釈における非免疫血清およびその他の対照では、両者共に反応 値は背景の水準であつｔ；。 ヒトｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに対するマウス抗血清を競合実験に用いた。その実験では Ｕ９３７細胞を抗血清と恒温培養し、続いて１２５１　ＡＴＦを添加した。図４ ５に示すように、”５Ｉ−ＡＴＦの抗ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ血清は細胞に対する特異 的結合を完全に阻害することができた。１：２４００希釈で５０％阻害が得られ た。同じ条件下で、対照血清はわずかな阻害、すなわち使用した最高濃度（１： ３００希釈）で約２０％の阻害しか示さなかった。ウェスタンブロッティングで は、ＰＭＡ処理Ｕ９３７細胞のデタージエント相、および精製ｕ−ＰＡＲに含有 されるｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒが、抗ｕ−ＰＡＲ血清により検出された（図４５、挿入 、レーン１および２）。対照免疫血清は同じ調製物と反応しなかった（レーン３ および４）。 ウサギポリクローナル抗体は、結果的に予備の５ＤＳ−ＰＡＧＥに供していた親 和性精製ｕ−ＰＡＲを含有するポリアクリルアミドゲル物質でウサギを免疫して 調製した。ＩｇＧ分画を、得られた抗血清から単離し、固定化ヒトｕ−ＰＡおよ びＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞に由来する固定化膜タンパク混合物のカラムを各々に 通して吸着させた。抗体はＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞のトライトンＸ−１１４デタ ージエント相中のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒであると認識された（図４６ＸＡ）。 従って、５０−６５キロダルトンの範囲にあるタンパクが認識された（レーン１ および２）。これは、化学的架橋を行った（方法は実施例１参照）後、ＤＦＰ処 理したｕ−ＰＡと１００−１００キロダルトン複合体を形成する能力があること から、ｕ−ＰＡＲと同定できた（レーン３）。ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡ単独では染色 帯は得られず（レーン５および５）、ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡを添加しなければ、架 橋法はｕ−ＰＡＲの電気泳動の発現に変化を及ぼさなかった（レーン２）。同じ 方法で調製された、同じウサギの免疫前ＩｇＧでは、試量巾乗色帯は１本もなか った（Ｂ）。 ウサギ抗体の、ｕ−ＰＡＲのリガンド結合能力に及ぼす効果を、異なる実験で研 究した（提示していない）。この実験ではｕ−ＰＡＲの精製試量（実施例１；約 ２０ｎｇ／ｍｌ）をウサギ抗ｕ−ＰＡＲ血清の精製し、吸着したＩｇＧと共に前 もって恒温培養した（恒温培養中の最終１ｇＧ濃度は９０μｇ／ｍｌ）。この処 理は、引き続いて１２Ｊ　ｐ。 ＴＦとの架橋複合体を形成するのを完全に妨害した。免疫前血清の１−ＡＴＦは 同じ濃度で架橋検定に影響を及ぼさなかった。 実施例１２ ｕ−ＰＡ受容体の可視化 方法：ｕ−ＰＡをモノクローナル抗体の親和性クロマトグラフィーで精製し、プ ラスミンで処理して活性化した（ニールセンら、１９８２年）それとは別に、２ 末鎖ｕ−ＰＡの市販品を入手した（七ロノｕ−ＰＡ）。ｕ−ＰＡは受容体精製用 カラムを調製するために、既に報告されたとおりにＤＦＰ不活性化しＩ；。 ｕ−ＰＡは０．１％トライトンＸ−１００を含むＯ、ｌ　Ｍ　Ｎａ１ＨＣＯ８で 一晩透析した。Ｎ−ビオチンーヒドロキシサクシンイミドを、Ｎ、Ｎ−ジメチル ホルムアミド（５ｍＭ）に溶解した。ｕ−ＰＡ調製物にｕ−ＰＡ　μｇあたりこ の溶液０．１μｍを加え、室温で１時間反応させた。過剰の標識化化合物を０　 、５　Ｍ　ＮａＣ，Ｉおよび０．１％ドライド７Ｘ−１００を含む０．１Ｍ　Ｎ ａＨＰＯ，ｐＨ８，０で一晩透析することにより除去した。 培養細胞（ＰＭＡ処理Ｕ９３７）または新鮮凍結ヒト絨毛膜の凍結部位（ｃｒｙ ｏｓｔａｔ　５ｅｃｔｉｏｎｓ）を室温で３分間、Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１含有０゜ ０５Ｍグリシン、ｐＨ３，０で処理し、０．１Ｍ　ＮａＣ１含有０．５ＭＨＥＰ ＥＳ、ｐＨ７，５で中和し、ｏ、ｉ％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ ）に溶解したビオチニル化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡ２００ｎＭと４℃で恒温培養した 。ビオチニル化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡ（２００ｎＭ）および精製した非標識化ｕ− ＰＡ（２μＭ）と同時に恒温培養することにより競合実験を実施した。 恒温培養後、スライドをＰＢＳ−ＢＳＡで２分間５回洗浄し、４％パラホルムア ルデヒドで５分間固定した。ＰＢＳ−ＢＳＡで３分間５回洗浄した後、非特異的 結合部位をＴＢＳ中２中２５生新生仔ウシ血清分間恒温培養することにより妨害 した。分画を短時間ＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳ−ＢＳＡでｌ：ｌｏｏに希釈したス トレプトアビジン・フルオレシン・インチオシアネート（アメルシャム）と共に ３０分間恒温培養した。ＴＢＳで短時間すすぎ、２分間１０回洗浄した後、スラ イドをＴＢＳ−ＢＳＡ中のビオチニル化抗アビジン（ベクトル）（５μｇ／ｍｌ ）と共に３０分間恒温培養した。ＴＢＳですすぎ２分間ｌＯ回洗浄した後、スト レプトアビジン・フルオレシン・イソチオシアネートとの恒温培養を繰り返した 。最後にその分画をＴＢＳですすぎ、２分間１０回洗浄し、メヤーのヘキサトキ シリンで（標準的な方法）、Ｕ９３７細胞の場合はエリオクロ−ムーブラック（ 参考：シェンクＥＡおよびチュルキンＣＪ、”免疫蛍光対比染色”サイトケム、 ２２巻、９６２−９６６頁、１９７４年；ジョンソンＧＤら、′顕微鏡使用中の 免疫蛍光の退色：現象およびそれの修復の研究”ジャーナル・オブ・イムノロジ ー、メソッズ５０巻、２３１−２４２頁、１９８２年）でも対比染色した。分画 をＤＡＢＣＯ−グリセロールを用いて載せ、ＬＥＩＴＺエピフルオレッセンス− マイクロスコープ（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ） を用いて可視化した。 結果 ｕ−ＰＡ受容体は、図４７Ａに示すように、Ｕ９３７９３７細胞で可視化するこ とができた。信号は、とりわけ細胞拡大中に顕著であった。過剰の非標識化ｇ− ＰＡと恒温培養すると信号の競合が認められた（図４７Ｂ）。 ヒト絨毛膜の凍結部位（（ｒｙ０５Ｌ１ｔｓｅｃｔｉｏｎｓ）は細胞の層上で拡 散信号を示した（図４８Ａ）。精製ｕ−ＰＡとの競合はこの結合を阻害した（図 ４８Ｂ）。 実施例１３ ｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化およびプラスミン触媒プローｕ−ＰＡ活性 化に及ぼす精製 ｕ−ＰＡＲの効果 添加した精製ｕ−ＰＡＲの、ｕ−ＦＡ介在プラスミノーゲン活性化およびプラス ミン介在プローｕ−ＰＡ活性化の検定に及ぼす効果の研究方法 再検定は、色素原性基質を用いてマイクロタイタープレート中で実施しく以下参 照）、これの開裂に続いてＥＬ　Ｉ　ＳＡ読み取り機で４０５ｎｍの吸収を測定 した。タンパク質加水分解用緩衝液（０，１Ｍトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８、１，０ ，１％トライトンＸ−１００）を反応用緩衝液として、および全試料の希釈用に 用いた。親和性精製Ｕ−ＰＡＲ（実施例１参照）を指示通りに加えるかまたは同 じ組成の緩衝液のタンパクを含まない試料で代替とした。以下に特定しない材料 および方法は、ピータ−センら（１９８８年）に報告されたものである。全試料 は３回ずつ分析した。 プラスミノーゲン活性化の検定 ヒト５４キロダルトンの２末鎖ｕ−ＰＡ（ウキダン、セロ））をＵ−ＰＡＲまた は緩衝液と共に、指示された濃度で１５分間室温で、前もって恒温培養した。プ ラスミノーゲン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）および、以下では基質Ｓ１と称する Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−口イシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（カビ ・プロダクトＳ−２２５１Ｘ最終濃度４００μＭ）を最終反応容量２５０μｌで 加えると、３７℃で恒温培養中に基質が開裂した。以下のｕ−ＰＡ最終濃度の検 定から標準曲線を描いた：８．１６．３２．６４．１２８および２５６ｐｇ／ｍ ｌ。 プローｕ−ＰＡ活性化の検定 ヒトプローｕ−ＰＡをｕ−ＰＡＲとまたは緩衝液と共に室温で１０分間、前もっ て恒温培養した。プラスミン（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、試料を３７° Ｃで恒温培養した。以下の恒温培養時間の後分画を採取した：　１．２．５．１ ０，２０．３０および６０分。指示された時間の後、各試料中のプラスミン活性 を、トラジロール（最終濃度ｌＯμｇ／ｍｌ）を添加して停止させた。各分画は 、Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 （カビ・プロダクトＳ−２４４４：以下基質Ｓ２と称する）４００μＭ（最終濃 度）を最終反応容量２００μｌで添加して、ｕ−ＰＡのアミド加水分解活性を検 定した。続いて３７℃で恒温培養し、吸収を測定した。吸収値は５４キロダルト ンの２末鎖ｕ−ＰＡ（ウキダン、七ロノ）の既知濃度で、同じアミド加水分解活 性同時に行い、しかも、同じ組成の緩衝液を用いて行って得られた標準曲線と比 較した。 結果 精製ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡプラスミノーゲン活性化活性に及ぼす影５４キロダル トンの２末鎖ｕ−ＰＡの試料（最終濃度が８８−２５６ｐ／ｍｌ範囲）を、親和 性精製ｕ−ＰＡＲ（最終濃度約１ｎＭ）存在下または不在下、前もって培養した 。前もって恒温培養した後、プラスミノーゲン（′Ｒ終濃度１０μｇ／１ｎｌ） を加え、プラスミン発生を、色素原性グラスミン基質Ｓｌ（“方法”参照；最終 濃度４００μＭ）を添加し、３７°Ｃで２時間恒温培養した後、分光光度計で測 定した。 この検定では、使用したｕ−ＰＡＲ濃度で、３２−２５８ｐｇ／ｍｌと広範なｕ −ＰＡ濃度範囲のｕ−ＰＡ活性を明らかに５０％阻害した。 従って、ｕ−ＰＡＲ存在下または不在下で得られる標準曲線は、ｕ　−ＰＡＲ存 在下任意のｕ−ＰＡ濃度での活性がｕ−ＰＡＲ不在下の同じ濃度での活性の５０ ％と等価であるモデルに相応して重ねることができた。 精製ｕ−ＰＡＲのプラスミン介在プローｕ−ＰＡ活性化に及ぼす効果 プローｕ−ＰＡの試料（最終濃度６３　ｎｇ／ｍｌ）を、親和性精製ｕ−ＰＡＲ （最終濃度約２ｎＭ）の存在下または不在下、前もって恒温培養し、続いてプラ スミン（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。試料を３７°Ｃで恒温培養した 。種々時間間隔で、分画をとり、プローｕ−ＰＡ活性化を停止させるためにトラ ジロールと混合した。 各分画における発生したｕ−ＰＡ活性を、色素原性ｕ−ＰＡ基質（Ｓ２）を添加 （方法参照；最終濃度４００ｐＭ）し、３７℃で１９時間恒温培養した後、分光 光度計で測定した。活性は、市販２本鎖Ｕ−ＰＡと等価の濃度として（方法参照 ）、同時に並行して行った実験から描かれた標準曲線の読みとして表現した。 ｕ−ＰＡ活性対プラスミン処理時間の曲線は、２−２０分の範囲で直線であっｌ ；。ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ不在下では、ｕ−ＰＡ活性は分あたり０゜６０％ｇ／ｍｌ の２末鎖ｕ−ＰＡと等価の速度で発生した。用いられた濃度でｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ が存在する場合、活性化速度は分あたりの０．１８％ｇ／ａｔの２末鎖ｕ−ＰＡ と等価の速度まで低下した。この低下は、ｊローｕ−ＰＡ活性化を実際に阻害し ているためであり、なぜならば、ｕ−ＰＡＲの存在が基質Ｓ２に対する２末鎖ｕ −ＰＡの活性には影響を及ぼさなかったからである。 反応速度結果とｕ−ＰＡＲの疎水性の独自性（原理および方法は実施例４参照） 精製ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ試料をＰＩ−ＰＬＣ（最終希釈はベーリンガー・マンハイ ム調製物の５００倍）と、３７℃で３０分間処理した。この処理により、トライ トンＸ−１１４相分離法においてＡＴＦが緩衝液相に架橋する活性が移動するこ とから判断されるようｔ二、ｕ−ＰＡＲの約５０％が脱脂された（実施例１参照 ）。 ｕ−ＰＡプラスミノーゲン活性化活性およびプローｕ−ＰＡ活性化のための上述 の検定は各々、５０％脱脂ｕ−ＰＡＲ調製物の存在下、再現された。結果は、同 時に再現されたもとのままのｕ−ＰＡＲで得られた結果と同一であった。 これらの結果は、純粋なｕ−ＰＡＲが、グリセロール−ホスホイノシトール固定 剤を除去した後でも溶液中のｕ−ＦＡ活性を阻害することを実証する。これは実 施例１０で得られた結論と完全に一致する。 アンドレアセンＰＡ、ニールセンＬＳ、クリステンセンＰ１グレンダールーハン センＪ１スクリバーＬ１ダネＫ（１９８６年）ヒト線維肉腫細胞からのプラスミ ノーゲンアクチベーターインヒビターは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアク チベーターを結合するが、そのプロ酵素とき結合しない。ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー２６１ニア６４４−７６５１アンゲ一ルＬＭ、スト ーラＭＨ，アンゲールＲＣＣ１９Ｂ７年）注釈き調理法。もとの場所のハイブリ ダイゼーション。神経生理学への応用。オツクス７オード・ユニバーシティ・プ レス、オツクスフォー、ｐｐ−７１−９６ アペラＥ１０ビンソンＥＡ、ウルリッチＳＪ、ストベリーＭＰ、コルティＡ１カ ツサー二Ｇ１ブラーシＦ　（１９８７年）ウロキナーゼのレセプター結合配列。 プロテアーゼの成長因子モジュールのための生物学的作用。ジャーナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストリー２６２　：　４４３７−４４４０ アペラＥ１ウエヴ−ルＩＴ、ブラーシＦ（１９８８年）蛋白中の表皮性成長因子 様部分の構造と作用。ＦＥＢＳレタース２３１：１−４゜ バイバイＡ１ベーカーＪＢ（１９８５年）ヒト前皮膚繊維芽細胞上の陰性ウロキ ナーゼ結合部位。バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ ュニケーションズ１３３　：　４７５−４８２バイパイＡ１バ力−ルＪＢＣ１９ ８５ａ年）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ ーションズ１３３：バカールＪＢ、ロウＤＡ、スイマールＲＬ、キュニンガムＤ Ｄ（１９８０年）セル２１：３７−４５ バルクホルトｖ１ジエンセンＡＬ（１９８９年）アミノ酸分析：付加物としての ジスルフィド化合物との塩酸加水分解後、蛋白中のシスティンプラス半システィ ンの検定 アナリティカル・バイオケミストリー１７７　：　３１８−３２２バルナザンＥ Ｓ、シネＤＢ、バロネに１クオＡ１ラルセンＧＲ（１９８８年）ヒト肉皮細胞に 対するリコンビナント型及び変異ｔ　−ＰＡの特異結合。フィブリノリスイス２ 、補遺１：２８ビーベＤＰ（１９８７年）ヒトへそ静脈付肉皮細胞への組織プラ スミノーゲン活性因子の結合。ソロンボスイス・リサーチ４６：２４ヘルＧ！、 ７オンＮＭ、ステンピアンＭＭ、ウルムステドＭＡ、カプユＤ１りＬ１ウーダＭ Ｓ、ラルＳＢ、サンチェーベスカドールＬ（１９８６年）（ヒト表皮性成長因子 グレカーサー：ＣＤＮＡ配列、インヒドロ発現及び遺伝子体制）ヌクレック・ア シド・リサーチ１４　：　８４２７−８４４６ ブラーシＦ（１９８８年）フィブリノリスイス２ニア３−８４ウロキナ一ゼプラ スミノーゲンアクチベーター用表面レセプタープラーシＦ１ストベリーＭＰ、キ ュベリＭＶ（１９８６年）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター用レセ プター。ジャーナル・オブ・セル・バイオロジカル３２　：１７９−１８６プラ ーシＦ１ヴアサリ−Ｊ−ＤＰ、ダネＫ（１９８７年）ウロキナ−ゼ型プラスミノ ーゲン活性化因子：プロ酵素、レセプター及びインヒビター。ジャーナル・オブ ・セル・バイオロジカル１０４：８ポルディアＣ（１９８１年）トリトンＸ−１ １４溶液中完全膜蛋白の相分離。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー２５６　：１６０４−１６０７ ボイドＤ１フロレントＧ１キムＰ、ブラティンＭ　（１９８８ａ年）ウロキナー ゼのレベルの検定及びヒト直腸癌細胞系のそのレセプター。キャンサー・リサー チ４８：３１１２−３１１６ボイドＤ１フロレントＧ１ムラノＧ１ブラティンＭ （１９８８ｂ年）Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドによるヒト直腸細胞系中のウロ キナーゼレセプターの変調。バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・アク タ９４７　：　９６−１００ デ・ブラインＰＡＦ、クレイマーボウボウスＧ１ウェルスパゲＨＷ。 ヴエルイエンＪＨ，ドウビイエールＧ１エタルマンＩＴ、ラマールＣＢＨＷ（１ ９８８年）ソロンポスイス・アンド・ハエモスタスイス６０：２；２６２−２６ ６ ブリッジＫ（１９８６年）正常及び形質転換線維芽細胞：病巣接触での細胞骨格 膜及び外細胞マトリックス成分の体制及び調節キャンサー・リサーチ４：１８− ７８ プルテインＰ１フオンダネチ工Ｍ−Ｃ（１９８８年）ヒト癌細胞上プラスミンへ のレセプター。ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンセル・インスティテユー ト８０　：　７６２−７６５カーペンタ−Ｇ１コエン５（１９７６年）ジャーナ ル・オブ・セル・バイオロジカル７１　：１５９−１７１コムシンスキーＰ１サ クチ、Ｎ（１９８７年）酸公配チオシアナートー７エノールークロロホルム抽出 によるＲＮＡ分離の単一段階方法。アナリティカル・バイオケミストリー１６２ 　：　ｌ　５６−１５９コレンＤ１ザマロンＣ１リヨネンＨＲ，ホイルアルッＭ （１９８６年）プロウロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化。ジャーナル ・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１７１２５９−１２コルサロＣＭ、 ペアザンＭＬ（１９８１年）哺乳動物細胞中ＤＮＡ−仲介遺伝子転移の効率の増 強。ツマティック・セル・アンド・モルキュシー・ジェ不ティックス７：６０３ −６１６コクスＫＨ，ディリオンＤＶ、アンダ一層ＲＣ（１９８４年）不斉ＲＮ Ａプローブを用いるそれ自体のハイブリダイゼーションによるシー・ウルチン・ エンブイオス中のｍＲＮＡ５の検免。デイベロプメント・バイオロジカル１０１ 　：　４８５−５０２キュペリＭＶ、ノリＭＬ、カサ二Ｇ１ブラーシＦ（１９８ ６年）ヒトのウロキナーゼレセプターへの単一プロウロキナーゼの結合。ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１＝１５８１９キュペリＭＶ、 アンドレアセンＰＡ、ラグノＰ１メイエルＭ１ダネに１ブラーシＦ（１９８９年 ）プロスイーダング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスイズＵ ＳＡ８６　：　４８２８−４ダネに１アンドレアセンＰＡ、グレンダールーハン センＪ１クリステンセンＰに−ルセンＬＳ、スクリバーＬ（１９８５年）プラス ミノーゲン活性化因子、組織連化及び癌アドバンスドウ・キャンサー・リサーチ ４４　：１３９−２６６ダネに、ニールセンＬＳ、　ピケＣおよびキラルマンＧ Ｍ（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子及び新形成。フィジオロジカル・ アンド・クリニカル・アスペクトＣ１クル７ト編、ＣＲＣ出版、ポカ・レイトン １９８８年ｐｐ、１９−４６デ・デユープＣ１デユ・バルスイＴ１ポーレＢ１　 トユルーエＡ、トｚルケンズＰ１ヴアン・オー７Ｆ（１９７４年）バイオロジカ ル・ファーマコロジー２３：２４９５−２５３１イートンＤＬ、スコツトＲＷ、 ベーカーＪＢ（１９８４年）ヒト繊維芽細胞ウロキナーゼプロ酵素の精製及びプ ロテアーゼ及びプロテアーゼネキシンによるその調節。ジャーナル・オプ・バイ オロジカル・ケミストリー２５９　：　６２４１−６２４フイリスｖ１　スカー リーＭＦ、カキャ−ルＶＶ　（１９８７年）機能分離中単鎖ウロキナーゼによる プラスミノーゲン活性化。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２ ６２：１４９９８−１５０イリスＶ１スカーリーＭＦ、カキャールＶＶ（！９８ ８年）調節単鎖ウロキナーゼ初発プラスミノーゲン活性化におけるヒトＵ９３７ 単核球の役割。フィブリノリスイス２：サブルメント１．１イリスｖ１スカーリ ーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８９年）単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活 性化因子により開始したプラスミノーゲン活性化。ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー２６４　：　２１８５−８８ エストリシャールＡ１ウールエンドＡ１ベリンＤ１スクリーニングＷ−Ｄ、ヴア サリＪ−Ｄ（１９８９年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した 細胞結合の特徴づけ。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６４ 　：１１８０−１１８９７アグソンおよびウィリアムス（１９８８年）グリコシ ルーホスファチジルイノシトル構造を経る蛋白の細胞表面沈降。アニューアル・ レヴユー・バイオケミカル５７　：　２８５−３２０ゲントンＣ１クリユイト７ ＥＫＯ、スクリーニングＷ−Ｄ（１９８７年）ジャーナル・オブ・セル・バイオ ロジカル１０４ニア０５−グレンダールーハンセンＪ１アゲーリンＮ１ムンクホ ルムーラーセンＰ１バ＋Ｆ、ニールセンＬＳ、ドンベルノスキーＰ、　タネＫ　 （１９８８年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した、感受性で 特異的酵素結合免疫吸着剤検定及び胸痛を伴う患者からの血漿への応用。ジャー ナル・オブ・ラボラトリ−・アンド・クリニカル・メディシン１１１：４２−５ １ グレンダール−ハンセン１１ランＩ−’ＬＲ，ラル７キアＥ１オッテヴアンゲル Ｖ、タネに１　（１９８８年）インビボで傷いた再上皮形成の間、ケラナノサイ ト中のウロキナーゼ及び組織型グラスミノータン活性化因子。ザ・ジャーナル・ オブ・インベスティガティブ・ダマトロジー９０　：　７９０−７９５ グアウイツチＶ１パネルＲ１ルイＳ１ケリーＰ５サデイチＲＬ、　グリーンリー Ｒ（１９８４年） ウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）のチモーゲンレセプターによる有効かつフィ ブリン特異的血餅溶解。インビトロ及び２動物種での研究。ジャーナル・オブ・ クリニカル・インベスティガティブ７３：　１７３１−１７３９ ヘイグラ−ＨＴ、マックスフィールドＦＲ，ウィリンガムＭＣ。 バスタンＩ　（１９８０年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー ２５５　：１２３９−１２４１アジャールＫＡ、アーペルＰＣ，ジャフエＥＡ、 ナチマンＲＬ　（１９８６年）プラスミノーゲンの培養ヒト内皮細胞への結合。 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１　：１１６５６−アジ ャールＫＡ、ナチマンＲＬ、（１９８８年）培養ヒト内皮細胞上の線維溶解系の 組み立て。フィブリノリスイス２、補遺１：ｌ１８ハシモトＦ１ホリゴメＴ１力 ンバヤンＭ１ヨシダに１スガノＨ（１９８３年）ナトリウムドデシルスル７アー トポリアクリルアミドゲル中の電気泳動による低分子量ポリペプチドの分離改良 法。アナリティカル・バイオケミストリー１２９　：１９２−１９９アーリンＶ Ｊ、ロウＬＷ、コルティＡ１アペラＥ１ブラーシＦ（１９８８年）ネズミメラノ ーマ細胞の細胞表面ウロキナーゼによる転移可能性の変調。キャンサー・リサー チ４８　：　１２７０−１２７８エベールＣＡ、ベーカーＪＢ（１９８８年）細 胞外プラスミノーゲン活性化因子の繊維芽細胞骨格への結合、ピングリンによる 細胞表面ウロキナーゼのコロカリゼーシぼン。ジャーナル・オブ・セル・バイオ ロジカル１０６：１２４１−１２４７ユークシヨーベンＪ、デルニックＲ（１９ ８８年）ファスト系発展単位における着色染色用改良銀染色方法。ファスト・シ ステム・ディヘロフメント・ユナイテッド・エレクトロ７オレスイス９：２８− ホップＴＰ、ウッズＫＲ（１９８１年）アミノ酸配列からの蛋白抗原決定基のプ ロディクション。プロスイーダング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンスイスＵＳＡ７８　：　３８２４−３ホイルアーツＭ１　リーケンＤＣ， リーネンＨＲ，コレンＤ（１９８２年）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に よるプラスミノーゲンの活性化の運動性。フィブリンの役割。ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー２５７：２９１２−２９１９ジＨニクＦ１スク ミットＭ１アフテルＡ１オールリーダーＡ１バビクＲ１ウルムに１ゲスナーＷ１ グラフＨ（１９９０年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（Ｕ　−Ｐ 　Ａ）抗原は胸痛の卑い再発の予言諸である。フィブリノリスイス１−ＩＯジａ ニクＦ１スクミットＭ１ウルムに１ゲスナーＷ１グラフＨ（１９８９年）ウロキ ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及び胸痛での早い再発：ザ・ランセット、 １０４９カサイＳ１アリムラＨ１ニジムラＭ１スヤマＴ（１９８５年）単一プロ ウロキナーゼの蛋白分解切断は、チモーゲン及びフィブリンに対するその高親和 性の減少の活性化が起こる形態的変化を含む。ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー２６０：１２３７７キールバーグＶ、アンドレアセンＰＡ、グ レンダールーハンセンＪに−ルセンＬＳ、スクリバーし、タネＫ（１９８５年） マウス・インビボのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に対するプロ酵 素。ＦＥＢＳレタース１８２　：　４４１−４４５クリステンセンＰ１ラーソン Ｌ−Ｉ、ニールセンしＳ１グレンダールーハンセンＪ１アンドレアセンＰＡ、タ ネＫ（１９８４年）ヒト内皮細胞はプラスミノーゲン活性化因子の一タイプを含 む。ＦＥＢＳレタース１６８：３３−３７ クリステンセンＰ１ピケＣ１ランドＬＲ，アンドレアセンＰＡ、タネＬ　（１９ ９０年）ルイス肺癌におけるプラスミノーゲン活性化因子インヒビター型１゜ル イス・ラング・カルシツマ・ヒストケミストリー コザクＭ（１９８７年）６６９を推動物メツセンジャーＲＮＡからの５′−非コ ーディング配列の分析。ＲＮＡ　ｓ　、ヌクリア・アクタ・リサーチ１５　：　 ８１２５−８１３２ク一ベルＪ１オツタールＭ１リー’７−：／ＤＣ，ヴアン・ バーケルＴＪＣ（１９８８年）ラット腎細胞との組織型プラスミノーゲン活性化 因子のインビボ相互反応。フィブリノリスイス２、補遺１：２８ キテＪ１　ドリッテルＲＦ（１９８２年）蛋白の水油療法特性を展示する簡単な 方法。ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー１５７　：　１０５−１ ３２ ラミリＵＫ（１９７０年）バタテリオファージＴ、のヘッドの組み立ての間、構 造蛋白の切断。ネイチャー２２７　：　６８０−６８５！Ｊ−＊ンＨＲ，ｆマロ ンＣ１ブラペルＭ１ウィンクラ−ＭＥ、　コレンＤ（１９８６）プロウロキナー ゼ！、メクニズムによるプラスミノーゲンの活性化。ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー２６１　：１２５３−１２５８ リオツタＬＡ（１９８６年）腫瘍侵入及び転移−細胞外マｌ−ＩＪラックス役割 二ロード会メモリアル・アワード・レフチャー。キャンサー・リサーチ４６：１ −７ ０つＭＧ（１９８９年）膜蛋白のグリコシルーホス７アチジルイノシトール沈降 。バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ９８８：　４２７−４５４ ランドＬＲ，リチオＡ１アンドレアセンＰＡ、ニールセンＬＳ、クリステンセン ＰルイホーＭ１サクセラ０、ブラーシＦ１ダネＫ（１９８７年）形質転換成長因 子−Ｂは、Ｗｌ−３８ヒト肺線維芽細胞中、タイプ−１プラスミノーゲン活性化 因子インヒビターのレベルの強く固い作用の陽性調整物である。Ｗｌ−３８ヒユ ーマン・ラング・フィブロブラストＥＭＢＯＪ６：１２８１−１２８６ランドＬ Ｒ，ジョージＢに−ルセンＬＳ、メイエルＭ１ダネに１アンドレアセンＰ（１９ ８８年）モルキュラー・セル・エンドクリノール６０　：　４３−５３ マニアティス等（１９８２年）モルキュラー・クローニング：ラボラトリ−・マ ニュアル・コールド・スプリング１ハーノ（−・ラボラトリー マンＫＧ、ジエニーＲＧ、クリシュナトウェミ５（１９８８年）組み立てにおけ るコファクター蛋白及び血液凝固酵素コンプレックスの発現。アニューアル・レ ヴユー・バイオケミカル５７：９１５−マツダイラＰ　（１９８７年）ポリビニ リデンジフルオリド膜上に電気泳動じた蛋白のピコモル量からの配列。ジャーナ ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２　：１００３５−１００３８マ ツオ○、タナカＳ１キクチＨ（１９８８）骨関節炎への尿トリプシンインヒビタ ーの効果。トロンボスイス・リサーチ５２：２３７メイエルＭ１ランドＬＲ，リ チオＡ１スクーヴＪに−ルセンＬＳ。 スタッシーＳＮ、タネに、アンドレアセンＰＡ（１９８８年）プラスミノーゲン 活性化因子インヒビター型１蛋白、ｍＲＮＡ及び遺伝子転写は、ヒト横絞筋肉腫 細胞において、ホルボールエルテル類により増加する。ジャーナル・オブ・バイ オロジカル・ケミストリー２６３　：　１５６８８−１５６９３ ミグナツテイＰ１０ビンズＥ１　リフキンＤＢ（１９８６年）ヒト羊水膜を経る 腫瘍侵入：プロティナーゼ力スケードの要求。セル４７マイルズＬＡ、ダウルバ ーグＣＭ、プロウＥＦ　（１９８８年）プラスミノ−ケンの細胞結合ドメイン及 び血漿中のそれらの機能。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２ ６３　：Ｌ１９２８マイルズＬＡ、ギンズバーグＭＨ，ホワイトＪＧ、プロウＥ Ｆ　（１９８６年）２つの明白なメカニズムによるヒト血小板とのプラスミノー ゲン相互反応。ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイガティブ７７　： 　２００１−２００９マイルズＬＡ、プロワＥＦ（１９８５年）血小板表面での プラスミノーゲンの結合及び活性化ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー２６０　：　４３０３−４３１１マイルズＬＡ、プロワＥＦ　（１９８６ 年）特異的抗体プローブで定義されたのと同じ、プラスミノーゲンの高親和リジ ン結合部位の地形図。バイオケミストリー２５　：　６９２６−６９３３マイル ズＬＡ、ブロクＥＦ（１９８’／’年）末梢血液細胞に対する線維素溶解成分、 プラスミノーゲン及びウロキナーゼのレセプター仲介結合。ソロンボ・ハエモス タ５８　：　９３６−９４２モリスイＪＨ，ファルライＨ１エトキントンＴＳ　 （１９８７年）　組織因子、凝固プロティナーゼ力スケードの開始のための細胞 レセプター用ｃＤＮＡの分子クローニング。セル５０：１２９−１３５ミユーラ ーーエバーハードＨＪ　（１９８８年）補体系の分子体系及び機能。アユューア ル番しヴユー・バイオケミカル５７：３２１−ニーダムＧＫ、シャーベＧＶ、フ ァーンドンＪＲ，ハリスＡＬ　（１９８７年）ヒト胸痛膜上特異的レセプター部 位でのウロキナーゼの結合。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンセル５５ ：１３−不ルズＬ１　り一不ンＨＲ，コレンＤ１ホルムズＷＥ（１９８７年）リ ジンの部位特異的変異誘発により生じた組換型ヒト一本鎖ウロキナーゼ型プラス ミノーゲン活性化因子変異体の特徴づけ。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー２６２　：　５６８２−５６ニールセンＬＳ、ハンセンＪＧ、スク ライバ−Ｌ５ウィルソンＥＬ。 ヵルト７トに１ズーサンＪ１ダネＫ（１９８２年）モノクローナル抗体によるア フニティクロマトグラフイによるヒトグリア芽腫細胞からのプラスミノーゲン活 性化因子に対するチモーゲンの精製。ノ（イネケミストリー２４：６４１０−６ ４１５ニールセンＬＳ、ケレアマンＧＭ１ベーレントＮ１ピコ−＊Ｒ，ＷネＫ、 ブラーシＦ（１９８８年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した ５５．０００−６０．０００Ｍ　ｒレセプター蛋白。ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー２６３　：　２３５８−２３ニールセンＬＳ、アンドレ アセンＰＡ、グレンタール−／１ンセンＪ１ファンＪ−Ｙ、クリステンセンＰ１ ダネＫ（１９８６年）ソロンポ・ハエモスト５５：２Ｑ６−２１２ ノリＭＬ、サルビＥ１コルティＡ５０ビアーティＦ１ソフィエンティー二Ａ１ブ ラーシＦ１バレンティＦ１カッサー二Ｇ（１９８９年）マウス細胞からのヒト組 換型−末鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の製造及び特徴づけ。フ ィブリノリスイス３：ｌＯＩオカヤマＨ１バーグＰ（１９８３年）ｒＩＩ８乳動 物細胞中にｃＤＮＡ挿入の発現を詳すｃＤＮＡクローニングベクター。モルキュ ラー・アンド・セル・バイオロジー３７２８０−２８９オツソウスキ−Ｌ（１９ ８８年）ニワトリ胚中ヒト腫瘍細胞の播種におけるプラスミノーゲン活性化因子 依存通路。セル５２：３２１オツソウスキーＬ１リーヒＥ（１９８３年）プラス ミノーゲン活性化因子阻害ヒト腫瘍転移に対する抗体。セル３５：６１１−６１ ９パネルＲ１グレビヒＶ（１９８７年）１本鎖ウロキナーゼが低触媒活性（プロ ウロキナーゼ）を有する１本鎖ウロキナーゼによる、又は２本鎖ウロキナーゼに よるプラスミノーゲンの活性化。プロット６９　：　２２−２６ ペテルセンＬＣ，ルンＬＲ，ニールセンＬＳ、タネに１スクリーバ−Ｌ（１９８ ８年）ヒト肉腫細胞からの１本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は 、少しの又は全く内因性活性のないプロ酵素である。ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー２６３：１１１８９−１１１９５ ピコーネＲ１カンタニアツクＥＬ、ニールセンＬＳ、ベーレントＮ１マストロニ コラＭＲ，タペンスＭＶ、ストツペリＭＰ、　べ−ＩＩ−センＳ１ダネに１ブラ ーシＦ（１９８９年）ホルボールエステルＡによる単核球様Ｕ９３７細胞中のウ ロキナーゼレセプターの調節。 ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１０８　：　６９３−７０２プロ一グＭ １ジエンセンＡＬ，パークホルトＶＣ１９８９年）トリシン−ナトリウムドデシ ルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からのＰＶＤＦ膜上に電気プ ロットしたペプチドのアミノ酸成分及びＮＨ，末端配列の決定。アニューアル・ バイオケミカル１８１：３３−３９ プロウＥＦ１フレアネＤＥ，ブレシアＪ１マイルズＬＡ（１９８６年）プラスミ ノーゲン系及び細胞表面：同じ細胞型上プラスミノーゲン及びウロキナーゼレセ プターに対する証拠。ジャーナル・オブ・バイオロジー１　０３　：　２４　１ １−２４２０ボラ不ンＪ１バズマンににールセンＬＳ，タネに１ヴアエリＡ（１ ９８８年）病巣接触での血漿膜結合ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 の超構造局在。ジャーナル・オブ・バイオロジー１０ポラネンＪ１サクセラＥ− Ｍ，アンドレアセンＰにールセンＬＳ。 タネに，ヴアエリＡ（１９８７年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 の明白な局在と培養ヒト線維芽細胞及び肉腫細胞下のそのタイプ−１インヒビタ ー。ジャーナル・オブ・バイオロジー１０４　：　１　０８５−１０９６ ボンテＰ１ゲニンＰ１プラウＨ１ケデスＬ（１９８３年）ヒトアクチン遺伝子は 、α−心臓アクチンに対する単一コピーであるが、β−及びα−細胞骨格遺伝子 に対するマルチコピーである：３′〜非翻訳部分は同位元素特異的であるが進化 において変換する。モルキュラー・アンド・セル・バイオロジー３　：１７８３ −１　７９　１ポツアツテイＲ１マセルＲ１ウイリアムズＳＪ，バドマナバンＲ １ハワードＢ１リオッタＬ１コウリーＧ（１９８６年）■又は２オンコシンによ り形質転換した一次ラット胎児は異なる転移潜在性を示す。 ライヒＲ１　トンプソンＥ１イワモトＹ１マーティンＧＲ，ディーソンＪＲ，フ ラーＧＣ，ミスキンＲ（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子、セリンプロ テナーゼ及びコラゲナーゼルの阻害は、転移細胞による基部膜の侵入を防ぐ。ラ ッセルＤＷ，シュナイダーＷＪ，ヤマモトＴ１ラスキーＫＬ，ブラウンＭＳ，ゴ ルトーシュタインＪＬ　（１９８４年）ＬＤＬレセプターのドメインマップ二表 皮性成長因子プレカーサーによる配列類似点。セル３７　：　５７７−５８サク セラ○（１９８５年）細胞凋囲蛋自分解のプラスミノーゲン活性化と調節。バイ オケミカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ８２３　：　３５−６５ サロネンＥ−Ｍ、サクセラ０、ヴアルテイオＴ１ヴアエリＡに−ルセンＬＳ、ツ ォイテンＪ（１９８５年）プラスミノーゲン及び組織型プラスミノーゲン活性化 因子は固定化フィブロネクチンに結合する。ジャーナル・オン・バイオロジカル ・ケミストリー２６０＝サロネンＥ−Ｍ、ツィッティングＡ、ヴアエリＡ（１９ ８４年）ラミニンはプラスミノーゲン及びその組織型活性化因子と相互作用する 。ＦＥＢＳレタース１７２：２９−３２シエガーＨ１フオン・ヤゴーＧ（１９８ ７年）１　１００ｋＤａの範囲の蛋白の分離のためのトリシン−ナトリウムドデ シルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。アナリテイカル・バイオ ケミストリー１６６　：　３６８−３７９セルヴアライＰ１０ツセＷ１シルバー Ｒ１スプリンガーＴＡ　（１９８８年）血液中の主なＦｃレセプターはホスファ チジルイノシトール沈降を有し、発作用夜間ヘモグロビン尿症に欠損である。ネ イチャー３３３　：　５６５−５６７ シルバーシユテインＲＬ、ロイングＬＬＫ、バーペルｐｃ、　ナハマンＰ（１９ ８’４年）プラスミノーゲンとの血小板トロンポスポンジンのコンプレックス形 成。組織活性化因子による活性化の変調。ジャーナル・オン・クリニカル・イン ベステイガテイブ７４二１６２５スフリーバ−し、ラーションＬ−１，キールベ リＶに−ルセンしＳ１アンドレアセンＰＢ、クリステンセンＰ１ダネＫ（１９８ ４年）ルイス肺癌中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の免疫細胞化 学局在。ジャーナル・オン・セル・バイオロジー９９　：　７５スフリーバ−Ｌ に−ルセンＬＳ、ステフェンＲ１ダネＫ（１９８２年）肉腫ウィルスにより形質 転換したネズミ細胞から不活性プロ酵素として放出されたプラスミノーゲン活性 化因子。ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー１２４　：　４ ０９−４１４ステフエンズＲＷ、アリタロＲ１タビオヴアーラＨ１ヴアエリＡ（ １９８８年）白血病細胞系による活性ウロキナーゼの製造：固体腫瘍の細胞系か らの新規識別。リュケミア・リサーチ１２：４１９−４ステ７エンズＲＷ、７オ ルダムＣＪ、ドウＷＦ（１９８７年）ヒト直腸癌中のウロキナーゼ型プラスミノ ーゲン活性化因子に対するプロ酵素：蛋白分解活性化後、単核球ミナクチビンに よるインビトロ阻害。ヨーロピアン・ジャーナル・オン・キャンセル・クリニカ ル・オンコロジー２３：２１３−２２２ ステフェンズＲＷ、ロイングに−Ｃ，ポラネンＪ１サロネンＥ−Ｍ。 ヴアエリＡ（１９８７年）プラスミノーゲン活性化因子及びそれらの特異的イン ヒビターのミクロ７レート免疫捕獲（ｉｍｍｏｃａｐｔｕｒｅ）検定。ジャーナ ル・オン・イムノロジカル・メソッド１０５：２４ストソベリＭＰ、コルティＡ 、ソフイエンテイーニＡ１カ・７サーニＦ１アソイアンＲＫ（１９８５年）Ｕ９ ３７単核球上特異的レセプターへのヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因 子のアミノ末端断片の分別増強結合。プロスイーディング・オン・ナショナル・ アカデミ−・オン・サイエンスイズＵＳＡ８２　：　４９３９−４９４ストツベ リＭＰ、タチェテイＣ１タペンスＭＶ、コルティＡ１ヘアリングｖＪ１カツサー 二Ｇ１アッペラＥ１ブラーシＦ（１９８６年）ヒトＡ４３１細胞上プロウロキナ ーゼレセプターのオートタリン飽和。 セル４５　：　６７５−６８４ スタンプＤＣ，レイネンＨＲ、コレンＤ（１９８６ａ年）ヒト細胞培養からの単 鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の精製及び特徴づけ。ジャーナル ・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６１　：１２７４−１２７８ スタンプＤＣ，ティアンポンＭ１コレンＤ（１９８６ｂ年）ヒト尿のウロキナー ゼ関連蛋白。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミスドリー２６１　：１２ ６７−１２７３タレンティーノＡＬ、ゴメスＣＬ、プラマーＴＨ（１９８５年） ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼによるアスパラギン結合グリカンの脱グリコンン 化。Ｆ・バイオケミストリー２４　：　４６６５−４６７１トーセンＳ１グラス ーグリーンヴアルトＰ１アストロツプＴ（１９７２年）ウロキナーゼ及びプラス ミノーゲン活性化因子のフィブリンへの結合における相違。ソロンボス・ディア ス・ハエモロ７２８：６５−７４ トリュグヴアソンに１ホイヒテヤＭ１サロＴ（１９８７年）腫瘍侵入における細 胞外マトリックスの蛋白分解退化。バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル ・アクタ９０７：１９１−２１７ウラノＴ１デ・セラノｖＳ１ジャフニーＰＪ、 カステリーノＦＪ（１９８８年）ヒト単鎖ウロキナーゼによるヒト（Ｇ　ｌｕ’ 　）プラスミノーゲンの活性化。アーチプ・オン・バイオケミストリー・アンド ・バイオフィジックス２６４　：　２２２−２３０ヴアサリＪ−Ｄ１ハミルトン Ｊ、レイチＥ　（１９７７年）マクロファージプラスミノーゲン活性化因子：コ ンカナバリンＡ及びホルボールミリステートアセテートによる誘導。セル１１　 ：　６９５−７０５ヴアサリＪ−Ｄ、バッチーノＤ１べりンＤ（１９８５年）ヒ トプラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼのＭ　ｒ　５５　、０００形にに 対スる細胞結合部位。ジャーナル・オン・セル・バイオロジー１００：８ヴアサ リＪ−Ｄ、ダイエールＪ−Ｍ、ウールエンドＡ１ベリンＤ（１９８４年）培養ヒ ト単核球マクロファージによるプロウロキナーゼの及びプラスミノーゲン活性化 因子の随伴分泌。ジャーナル・オン・イクスペリメンタル・メディシン１５９： １６５２−１６６８ウンＴ−Ｃ，オンウスキーＬルイチＥ（１９８２年）ヒトウ ロキナーゼのプロ酵素形。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー１ ５７　：　７２６２−７２６８ウンＴ−ＣルイチＥ　（１９８７年）ヒト胎盤か らのプラスミノーゲン活性化のインヒビター。ジャーナル・オン・バイオロジカ ル・ケミストリー２６２　：　３６４６−３６５３ヤーデンＹ１ウルリツチＡ（ １９８８年）成長因子による単一トランスダクションの分子分析。バイオケミス トリー２７：３１１３−−！　−雫 ＮＨ２−Ｌｅｕ　Ｘ　Ｘ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　ＡｓｐＦｉｇ、　９　（９１５４） 特異的１２５−１−ＡＴＦ 結合（ｃｐｍ） ａｂ　ａｂ 相対的蛍光 Ｆｉｇ、　１３ インキュベーション（分） Ａ　Ｏｏ、５１．５３　ｅ　９２４３６４８コ Ｆｉｇ、　２４Ａ Ｆｉｇ、　２４　Ｂ Ｆｉｇ、　２５ インキュベーション時間（ｈ） インキュベーション時間（ｈ） Ｆｉｇ、　２Ｂ 活・眺イヒの図式 プラスミノーケン結合前 ＡＴＦ特異結合％ Ｆｉｇ、　３３ Ｆｉｇ、　３４ ｃｐｍ、全体（７）９，６ Ｆｉｇ、　３５ ３７°での時間（分） Ｆｉｇ、　４５ １２５１−ＡＴＦの拮合％ ロ ロ 寸 へ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項）

Claims (130)

【特許請求の範囲】
1. （１）負荷が約１μｇのＳＤＳｐａｇｅにおいて、約５５−６０ｋＤの範囲の見 かけ上の分子量を有する実質的に一つで唯一の銀染色バンドを示し、ｕ−ＰＡＲ がｕ−ＰＡに結合し得る、グリコシル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲ。
2. （２）実施例１の記載に従い行なわれたＳＤＳｐａｇｅにおいて、約５５６０ｋ Ｄの範囲の見かけ上の分子量を有する実質的に一つで唯一の銀染色バンドを示し 、ｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結合し得る、グリコシル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲ。
3. （３）ＳＤＳｐａｇｅにおいて、約３０−３５ｋＤの範囲の見かけ上の分子量を 示す非グリコシル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲ。
4. （４）ホスホリパーゼＰＩ−ＰＬＣを用いた処理により水溶性にされ得る、請求 項１−３のいずれか１項記載のｕ−ＰＡＲ形態。
5. （５）ホスホリパーゼＰＩ−ＰＬＣを用いた処理により水溶性にされ得ない、請 求項１−３のいずれか１項記載のｕ−ＰＡＲ形態。
6. （６）ｕ−ＰＡＲ含有エタノールアミンおよびホスホリパーゼＰＩ−ＰＬＣ処理 により水溶性にされ得るｕ−ＰＡＲにより立証されたグリコシルーホスファチジ ルイノシトール・アンカーを含み、可溶性が、実施例４に記載された１％トリト ンＸ−１１４中における温度誘発デタージェントー相分離後の水相に存在する前 記処理から生じた誘導体により立証される、請求項１−３のいずれか１項記載の ｕ−ＰＡＲ形態。
7. （７）水溶性であり、可溶性が、実施例４記載の１％トリトンＸ−１１４におけ る温度誘発デタージェントー相分離後の水相中に存在する誘導体により立証され る、ｕ−ＰＡＲの純粋な誘導体。
8. （８）ホスホリパーゼＰＩ−ＰＬＣを用いた請求項６記載のｕ−ＰＡＲの処理に より生成され得る、請求項７記載の誘導体。
9. （９）試料からの抽出物、例えば組織抽出物、細胞抽出物または徴生物からの抽 出物をデタージェントおよび相分離、次いで固定化形態のｕ−ＰＡ、例えばＤＦ Ｐ−ｕ−ＰＡによるアフイニティー精製に付すことを含む、請求項１または２記 載のグリコシル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲの製造方法。
10. （１０）請求項１、２および４−８のいずれか記載のｕ−ＰＡＲ形態または変異 体または請求項９に従い製造されたｕ−ＰＡＲの製品を、例えば酸素、例えばペ プチド：Ｎ−グリコシダーゼＦにより脱グリコシル化することを含む、非グリコ シル化形態の純粋なｕ−ＰＡＲまたはその変異体もしくは誘導体形態の製造方法 。
11. （１１）ｕ−ＰＡＲ含有試料、例えば完全な細胞、微生物抽出物を含む細胞抽出 物または部分もしくは完全精製ｕ−ＰＡＲ製品を、グリセリン−ホスファチジル イノシトール・アンカーを開裂または除去する薬剤、例えばリパーゼ、例えばＰ Ｉ−ＰＬＣで処理することを含む、ｕ−ＰＡＲの水溶性誘導体の製造方法。
12. （１２）明細書中に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として示さ れたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
13. （１３）明細書中に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として示さ れた完全配列を有するポリペプチドのｕ−ＰＡ結合修飾を含み、前記修飾におい て１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失または別のアミノ酸（複数もあり得る） により置換されている、ポリペプチド。
14. （１４）明細書中に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として示さ れたアミノ酸配列を有するポリペプチドの対立遺伝子修飾形であるポリペプチド 。
15. （１５）同じ遺伝子により生成されるが、例えばオルターナティプ・スプライシ ング故に異なる明細書中に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３とし て示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの修飾形であるポリペプチド。
16. （１６）請求項１２−１５のいずれかで定義されたポリペプチドの特有な部分配 列を含み、前記部分配列が少なくとも３個、特に少なくとも４個、好ましくは少 なくとも５個のアミノ酸を含むポリペプチド。
17. （１７）リガンド、例えばｕ−ＰＡに結合し得る、請求項１６記載のポリペプチ ド。
18. （１８）実施例１の記載に従いインタクトｕ−ＰＡＲのキモトリプシン消化によ り得られたｕ−ＰＡＲの約１６ｋＤフラグメント、およびｕ−ＰＡと結合し得る 前記ポリペプチドのサブフラグメントを含む、請求項１７記載のポリペプチド。
19. （１９）実施例３記載の第１反復、すなわちアミノ酸配列１−９２、またはその 特有の部分配列を含み、実質的に第２または第３反復を含まない、請求項１７記 載のポリペプチド。
20. （２０）実施例３記載の第２反復、すなわちアミノ酸配列９３−１９１、または その特有の部分配列を含み、実質的に第１または第３反復を含まない、請求項１ ７記載のポリペプチド。
21. （２１）実施例３記載の第３反復、すなわちアミノ酸配列１９２−２８１、また はその特有の部分配列を含み、実質的に第１または第２反復を含まない、請求項 １７記載のポリペプチド。
22. （２２）請求項１２記載のポリペプチドの部分配列により構成されるかまたはそ れを含む水溶性ポリペプチドであって、部分配列が、アミノ酸配列１−２８０、 アミノ酸配列１−２８１、アミノ酸配列１−２８２、アミノ酸配列１−２８３、 アミノ酸配列１−２８４、アミノ酸配列１−２８５およびアミノ酸配列１−２８ ６、特にアミノ酸配列１−２８２、アミノ配配列１−２８３およびアミノ酸配列 １−２８４から成る群から選択されるポリペプチド、および１個またはそれ以上 のアミノ酸が別のアミノ酸（複数もあり得る）により置換されるという修飾が加 えられた前記ポリペプチドのｕ−ＰＡ結合性修飾形、前記ポリペプチドの対立遺 伝子修節形、および同じ遺伝子により生成されるが例えばオルターナティプ・ス プライシング故に異なる前記ポリペプチドの修飾形であるポリペプチド。
23. （２３）さらにグリセリン−ホスファチジルイノシトール・アンカーまたはその 一部分を含む、請求項２２記載のポリペプチドの誘導体。
24. （２４）第１ポリペプチドの結合能を妨害しない別のポリペプチドに融合させた 、請求項１２−２３のいずれか１項記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド 。
25. （２５）ほ乳類においてｕ−ＰＡＲに対する免疫応答を発し得る、請求項１６記 載のポリペプチド。
26. （２６）ｕ−ＰＡＲから誘導された特有のアミノ酸前列を含む実質的に純粋なポ リペプチドであって、ｕ−ＰＡＲの下記Ｎ−末端配列：【配列があります】 を含むポリペプチドまたはその類縁体。
27. （２７）炭水化物または脂質部分に結合した、請求項１２−２６のいずれか１項 記載のポリペプチド。
28. （２８）グリコシル化されている、請求項１２−２６のいずれか１項記載のポリ ペプチド。
29. （２９）配列（１）に示されたヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメント、お よび少なくとも９個、特に少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１５個のヌ クレオチドを含むその特有の部分配列。
30. （３０）請求項２９記載のフラグメントと同じポリペプチドをコードする請求項 ２９記載のＤＮＡフラグメントの修飾形、および少なくとも９個、特に少なくと も１２個、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含むその特有の部分配 列。
31. （３１）明細書に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として示され た完全配列を有するポリペプチドのｕ−ＰＡ結合性修節をコードする請求項２９ 記載のＤＮＡフラグメントの修節形であって、１個またはそれ以上のアミノ酸が 欠失または別のアミノ酸（複数もあり得る）により置換されている修節形、およ び少なくとも９個、特に少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１５個のヌク レオチドを含むその特有の部分配列。
32. （３２）明細書に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として示され たアミノ酸配列を有するポリペプチドの対立遺伝子修節形であるポリペプチドを コードする請求項２９記載のＤＮＡフラグメントの修飾形、および少なくとも９ 個、特に少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含む その特有の部分配列。
33. （３３）同じ遺伝子により生成されるが例えばオルターナティプ・スプライシン グ故に異なる、明細書に示された配列（１）においてアミノ酸１−３１３として 示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの修飾形であるポリペプチドをコー ドする請求項２９記載のＤＮＡフラグメントの修飾形、および少なくとも９個、 特に少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含むその 特有の部分配列。
34. （３４）明細書に記載された２×ＳＳＣおよび６５℃の条件下、請求項６５記載 の配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％ の相同性を示すＤＮＡフラグメント。
35. （３５）請求項１６−２２のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするＤＮ Ａフラグメント。
36. （３６）下記アミノ酸配列： 【配列があります】 を含むポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントまたはその部分配列。
37. （３７）第２ポリペプチドまたはその一部分をコードする１個またはそれ以上の 第２ＤＮＡフラグメントを伴う枠内に請求項２９−３６のいずれかに記載のＤＮ Ａフラグメントを含むことにより融合蛋白質をコードするＤＮＡフラグメント。 （３７）ｕ−ＰＡＲポリペプチドをコードする組換え挿入体を含むプラスミド・ ベクター。 （３７）ｐ−ｕＰＡＲ−１である、請求項３６記載のプラスミド・ベクター。
38. （３８）ｐ−ｕ−ＰＡＲ−１−ＰＦＬＭ−１である、請求項３６記載のプラスミ ド・ベクター。
39. （３９）宿主生物において複製し得、請求項２９−３６のいずれかに記載のＤＮ Ａフラグメントをもつ発現ベクター。
40. （４０）ヒト以外であり、請求項２９−３６のいずれかに記載のＤＮＡフラグメ ントをもち、それを発現し得る生物。
41. （４１）微生物、好ましくは細菌、酵母、真菌、原生動物、昆虫細胞、植物細胞 、ほ乳類細胞またはセルラインである、請求項４０記載の生物。
42. （４２）バチラス属の細菌、例えばバチヲス・サチリス、エシェリヒア、例えば エシェリヒア・コリまたはサルモネラである、請求項４１記載の微生物。
43. （４３）ポリペプチドの発現を誘導する条件下、請求項４０−４２のいずれかに 記載された生物を培養または繁殖させ、ポリペプチドを回収することを含む、請 求項１−２８のいずれかに記載されたポリペプチドの製造方法。
44. （４４）請求項１−２８のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、 次の段階、すなわち、 ａ）発現ベクターに、所望により適当に修飾された形態でもよい、請求項２９− ３６のいずれかに記載のＤＮＡフラグメントを挿入し、ｂ）段階ａ）で製造され たベクターにより適当な宿主微生物を形質転換し、 ｃ）ポリペプチドの発現に適した条件下、段階ｂ）で製造された微生物を培養し 、 ｄ）培養物からポリペプチドを採取し、そしてｅ）所望によりポリペプチドに翻 訳後修飾を加え得ることを含む方法。
45. （４５）ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、フラグメントにおけ る１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入、欠失または転位によ り修飾されている、請求項４３または４４記載の方法。
46. （４６）生物を突然変異に付す、請求項４３−４５記載の方法。
47. （４７）ポリペプチドが、例えば固定したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ、ＡＴＦ、ブローｕ −ＰＡまたは前記ポリペプチドと反応する抗体を用いた１つまたはそれ以上のア フィニティー・クロマトグラフィー段階および／またはサイズ・クロマトグラフ ィー段階を含む方法により培養物から単離される、請求項４３−４６のいずれか に記載の方法。
48. （４８）請求項１−２８のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、 液相または固相ペプチド合成の実施を含む方法。
49. （４９）ほ乳類におけるｕ−ＰＡレセプター（ｕ−ＰＡＲ）へのｕ−ＰＡのレセ プター結合形態の結合を阻止することによってプラスミノーゲンからプラスミン ヘの活性化を阻止することにより、ｕ−ＰＡがプラスミノーゲンからプラスミン へ変換するのを阻止することを含む、ほ乳類、特にヒトにおける局在蛋白質分解 活性の阻害または打ち消し方法。
50. （５０）ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合を 阻止することによってプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化を阻止するこ とにより、ｕ−ＰＡがプラスミノーゲンからプラスミンへ変換するのを局所的に 阻止することを含む、ほ乳類、特にヒトにおける局在蛋白質分解活性の阻止また は打ち消し方法。
51. （５１）ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合阻止が、ｕ−ＰＡ Ｒに結合する物質をほ乳類へ投与することによって、ｕ−ＰＡのレセプター結合 形態が通常結合するレセプターの部位を占拠することによりｕ−ＰＡＲをブロッ クすることにより行なわれ、前記物質がレセプターへのｕ−ＰＡのレセプター結 合形態の結合を底減化するのに有効な量で投与される、請求項４９記載の方法。
52. （５２）ｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止が、ｕ −ＰＡＲへの結合能を保持してはいるが、プラスミノーゲンからプラスミンへ変 換できないローＰＡの修飾形をほ乳類へ投与することにより行なわれる、請求項 ５１記載の方法。
53. （５３）ｕ−ＰＡの修飾形が、実質的に不可逆的な阻害剤によりその触媒活性部 位が阻害されたｕ−ＰＡである、請求項５２記載の方法。
54. （５４）ｕ−ＰＡの修飾形がジイソプロピルアルオロホスフェートｕ−ＰＡ（Ｄ ＦＰ−ｕ−ＰＡ）により阻害されたｕ−ＰＡである、請求項５３記載の方法。
55. （５５）ｕ−ＰＡの修飾形が、その触媒活性部位領域へ結合した抗体を有するｕ −ＰＡである、請求項５２記載の方法。
56. （５６）ｕ−ＰＡの修飾形がｕ−ＰＡのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ−ｕ− ＰＡ）である、請求項５２記載の方法。
57. （５７）ｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止が、ｕ −ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡの部位と同一または実質的に同一の配列を含む物質 を投与することにより行なわれる、請求項５１記載の方法。
58. （５８）物質が、ｕ−ＰＡアミノ酸残基１２−３２のｕ−ＰＡＲ結合部位と同一 または実質的に同一の配列を含む分子である、請求項５７記載の方法。
59. （５９）ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止が、ほ乳類 へｕ−ＰＡＲまたはそのｕ−ＰＡ結合性修飾形を投与することによってｕ−ＰＡ の細胞レセプター結合性部位を占拠させ、それによりｕ−ＰＡのレセプター結合 性形態が細胞結合レセプターへ結合するのを阻止することにより行なわれる、請 求項５７記載の方法。
60. （６０）ｕ−ＰＡＲの修飾形が、ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ結合性部位へ結合し得る その切頭可溶性形態、例えば請求項７または８記載のｕ−ＰＡＲ誘導体である、 請求項５９記載の方法。
61. （６１）ｕ−ＰＡＲの修飾形が請求項１８記載のポリペプチドである、請求項６ ０記載の方法。
62. （６２）切頭可溶性形態が特異的プラスミノーゲン活性化因子阻害剤タイプ１ま たはタイプ２に結合している、請求項６０記載の方法。
63. （６３）ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止が、ｕ−Ｐ ＡＲへの結合能を保持してはいるがｕ−ＰＡへ変換され得ないブローｕ−ＰＡの 修節形を投与することにより行なわれる、請求項５１記載の方法。
64. （６４）ブローｕ−ＰＡの修飾形が、プラスミンにより通常開裂され得るｕ−Ｐ Ａの配列を、ｕ−ＰＡがプラスミンにより開裂されない状態に変化させたもので ある、請求項６３記載の方法。
65. （６５）部位突然変異によってＬｙｓ１５８がＧｌｕまたはＧｌｙにより置換さ れた、請求項６４記載の方法。
66. （６６）ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合性形態の結合の阻止が、ほ乳 類へｕ−ＰＡＲに対する抗体を投与することにより行なわれる、請求項５１記載 の方法。
67. （６７）抗体がポリクローナル抗体である、請求項６６記載の方法。
68. （６８）抗体がモノクローナル抗体である、請求項６６記載の方法。
69. （６９）ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻止または打ち消 し方法であって、ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲを修節し、それによってｕ−ＰＡが プラスミノーゲンからプラスミンへ変換するのを阻止することによりｕ−ＰＡ／ ｕ−ＰＡＲの結合親和力を改変するか、または生成されるｕ−ＰＡＲの量を低減 化することにより、プラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化を阻止すること を含む方法。
70. （７０）結合親和力を修飾するか、またはホルモン、成長因子またはサイトカイ ンから成る群から選ばれる物質を投与することによりｕ−ＰＡＲ生産を低減化さ せる、請求項６９記載の方法。
71. （７１）結合親和力の改変またはｕ−ＰＡＲ生産の低減化が、表皮成長因子（Ｅ ＧＦ）の投与により行なわれる、請求項７０記載の方法。
72. （７２）ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻止または打ち消 し方法であって、ｕ−ＰＡＲの内面化を誘発することによって細胞表面上のｕ− ＰＡＲの量を低減化することによりプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化 を阻止することを含む方法。
73. （７３）内面化が、ｕ−ＰＡおよびＰＡＩ−１間の複合体および／またはＰＡＩ −１単独を投与することにより誘発される、請求項７２記載の方法。
74. （７４）内面化が、ｕ−ＰＡおよびＰＡＩ−２間の複合体および／またはＰＡＩ −１単独を投与することにより誘発される、請求項７２記載の方法。
75. （７５）薬剤により表面上にｕ−ＰＡＲを含む細胞を標的とする方法であって、 ｕ−ＰＡＲに結合する物質に結合させた薬剤を投与することを含む方法。
76. （７６）物質がｕ−ＰＡのレセプター結合性形態である、請求項７５記載の方法 。
77. （７７）物質が、ｕ−ＰＡおよびＰＡＩ−１またはｕ−ＰＡおよびＰＡＩ−２間 の複合体である、請求項７５記載の方法。
78. （７８）物質がｕ−ＰＡＲに対する抗体である、請求項７５記載の方法。
79. （７９）物質が、癌細胞タイプに存在するｕ−ＰＡＲの変異型を特に指向した抗 体である、請求項７５記載の方法。
80. （８０）ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻止または打ち消 し方法であって、ほ乳類へ、プラスミノーゲンの活性化を阻止するのに充分な量 のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１を投与することによってｕ−Ｐ Ａのレセプター結合形態の活性を実質的に低減化することにより、プラスミノー ゲンからプラスミンヘの活性化を阻止することを含む方法。
81. （８１）診断剤により表面上にｕ−ＰＡＲを含む細胞を標的とする方法であって 、ｕ−ＰＡのレセプター結合性形態に結合させた診断剤を投与することを含む方 法。
82. （８２）結腸癌の診断に使用される、請求項８１記載の方法。
83. （８３）診断剤が放射性物質である、請求項８１または８２記載の方法。
84. （８４）診断剤がテクネチウムである、請求灰８３記載の方法。
85. （８５）ほ乳類において溶液中ｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化を阻止する 方法であって、ｕ−ＰＡＲ、特にｕ−ＰＡＲの水溶性誘導体の有効量をほ乳類へ 投与することを含む方法。
86. （８６）ほ乳類において事実上不活性の１本鎖ブローｕ−ＰＡから活性２本鎖ｕ −ＰＡへの変換を阻止する方法であって、ｕ−ＰＡＲ、特にｕ−ＰＡＲの水溶性 誘導体の有効量をほ乳類へ投与することを含む方法。
87. （８７）ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲ欠乏または損なわれたｕ−ＰＡＲ機能により 誘発される状態の処置方法であって、ｕ−ＰＡＲ、特にｕ−ＰＡＲの油溶性形態 の有効量をほ乳類へ投与することを含む方法。
88. （８８）ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲ欠乏または損なわれたｕ−ＰＡＲ機能により 誘発される状態の処置方法であって、ほ乳類においてｕ−ＰＡＲの活性形態をコ ードするｃＤＮＡを導入することを含む方法。
89. （８９）状態が血栓溶解障害である、請求項８７または８８記載の方法。
90. （９０）血栓溶解障害が発作性夜間ヘモグロビン尿症を患うほ乳類におけるもの である、請求項８９記載の方法。
91. （９１）状態が創傷治癒障害であり、投与が特に局所的に行なわれる、請求項８ ７または８８記載の方法。
92. （９２）ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻止または打ち消 し方法であり、ほ乳類へ、ｕ−ＰＡＲのグリコシルーホスファチジルイノシトー ル・アンカーを開裂または除去する物質、例えばリパーゼ、例えばＰＩ−ＰＬＣ を投与することによってｕ−ＰＡのレセプター結合形態の活性を実質的に低減化 することによりプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化を阻止することを含 む方法。
93. （９３）ｕ−ＰＡＲへ結合する物資で組織片を処理し、結合物質の存在を視覚化 することを含む、組織片におけるｕ−ＰＡＲの検出方法。
94. （９４）物質が抗体である、請求項９３記載の方法。
95. （９５）抗体が、ｕ−ＰＡＲの様々な形態を識別する抗体である、請求項９４記 載の方法。
96. （９６）物質がｕ−ＰＡの一形態である、請求項９３記載の方法。
97. （９７）ｕ−ＰＡの形態が標識されている、請求項９６記載の方法。
98. （９８）標識ｕ−ＰＡがビオチニル化ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡであり、続いてこれ がストレプトアピジン−フルオレシン・イソチオシアネートにより検出される、 請求項９７記載の方法。
99. （９９）ｕ−ＰＡの形態が標識されておらず、続いてこれが免疫染色により検出 される、請求項９６記載の方法。
100. （１００）ｕ−ＰＡＲに対する抗体をｕ−ＰＡＲへ特異的に結合させ、結合抗体 の存在を検出または結合抗体の量を評価することを含む、生物材料におけるｕ− ＰＡＲの定量方法。
101. （１０１）結合抗体の量の評価がＥＬＩＳＡタイプの方法により行なわれる、請 求項１００記載の方法。
102. （１０２）結合抗体の量の評価が放射線免疫検定法により行なわれる、請求項１ ００記載の方法。
103. （１０３）生物材料が組織であり、癌の診断および／または癌における予後の評 価に使用される方法である、請求項１００−１０２のいずれかに記載の方法。
104. （１０４）癌が結腸癌である、請求項１０３記載の方法。
105. （１０５）生物試料が体内流体、特に血清である、請求項１００−１０２のいず れかに記載の方法。
106. （１０６）ｕ−ＰＡＲ含有材料を、ｕ−ＰＡＲに対する固定化抗体を用いたアフ イニティー・クロマトグラフィーに付すことを含む、純粋なｕ−ＰＡＲの製造方 法。
107. （１０７）ｕ−ＰＡＲ含有材料を、ｕ−ＰＡＲのグリコシジル−ホスファチジル イノシトール・アンカーを開裂または除去する物質、例えばリパーゼ、例えばＰ Ｉ−ＰＬＣで処理することを含む、水溶性形態の純粋なｕ−ＰＡＲの製造方法。
108. （１０８）請求項１−２８のいずれかに記載のポリペプチドと反応するポリクロ ーナル抗体。
109. （１０９）請求項１−２８のいずれかに記載のポリペプチドと反応するモノクロ ーナル抗体。
110. （１１０）検出可能な標識が付された請求項１０８または１０９記載の抗体。
111. （１１１）検出可能な標識が付された請求項１−２８のいずれかに記載のポリペ プチド。
112. （１１２）標識が、酵素、蛍光団、放射性同位元素および複合体形成剤例えばビ オチンから成る群から選択される、請求項１１１記載のポリペプチドまたは請求 項１１０記載の抗体。
113. （１１３）固体支持体に結合させた、請求項１−２８のいずれかに記載のポリペ プチドまたは請求項１０８または１０９記載の抗体。
114. （１１４）支持体が、プレート、ストリップ、ビーズ、粒子、フイルムおよび紙 から成る群から選択される、請求項１１３記載のポリペプチドまたは抗体。
115. （１１５）固体支持体が、例えばプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレ ン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ナイロンまたはボリビニリデンジフルオ リド、セルロース、シリコーンおよびシリカから成る群から選択されたポリマー を含む、請求項１１４記載のポリペプチドまたは抗体。
116. （１１６）試料におけるｕ−ＰＡＲ分子の存在の測定方法であり、試料を固体支 持体に結合させたｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体および／またはポリク ローナル抗体と、続いて標識が付された請求項１−２８のいずれかに記載のポリ ペプチドとインキュベーションするか、または試料を固体支持体に結合させた請 求項１−２８のいずれかに記載のポリペプチドと、続いて標識が付されたｕ−Ｐ ＡＲに対するモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体とインキュベー ションする方法。
117. （１１７）ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの検出および／または定量方法であって、細胞ま たは組織からＲＮＡを抽出し、特にノーザン・ブロットまたはドット・ブロット 分析により、ｐ−ｕＰＡＲ−１組換えｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ挿入体の一部または全 部を含む標識ＤＮＡ配列へのＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出および／ま たは測定することを含む方法。
118. （１１８）組織片におけるｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの存在の検出方法であって、ｐ− ｕＰＡＲ−１組換えｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ挿入体の一部または全部を含む標識ＤＮ Ａ配列または対応する標識アンチセンスｍＲＮＡプローブとの正常部位ハイブリ ダイゼーションを含む方法。
119. （１１９）ほ乳類、特にヒトにおいて、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結 合性形態の結合を阻止し、それによってｕ−ＰＡがプラスミノーゲンからプラス ミンへ変換するのを阻止することによりプラスミノーゲンからプラスミンヘの活 性化を阻止することを含む、ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性 の阻止または打ち消しを目的とする医薬組成物であって、ｕ−ＰＡＲへ結合する ことによりｕ−ＰＡのレセプター結合性形態が通常結合するレセプターの部位を 占拠する物質を、生理学的に許容し得る担体または賦形剤と合わせて含む組成物 。
120. （１２０）物質がｕ−ＰＡＲ抗体である、請求項１１９記載の組成物。
121. （１２１）物質が、ｕ−ＰＡＲへの結合能は保持しているが、プラスミノーゲン からプラスミンへ変換し得ないｕ−ＰＡ修飾形である、請求項１１９記載の組成 物。
122. （１２２）リボソームおよびミクロスフェアから選択された医薬的に許容し得る 賦形剤および請求項１１９−１２１のいずれかに記載の物質の医薬有効量を含む 非経口投与用医薬組成物。
123. （１２３）リボソームおよびミクロスフェアから選択された医薬的に許容し得る 賦形剤および請求項１１９−１２１のいずれかに記載の物質の医薬有効量を含む 経口投与用医薬組成物。
124. （１２４）リボソームおよびミクロスフェアから選択された医薬的に許容し得る 賦形剤および請求項１１９−１２１のいずれかに記載の物質の医薬有効量を含む 直腸投与用医薬組成物。
125. （１２５）リボソームおよびミクロスフェアから選択された医薬的に許容し得る 賦形剤および請求項１１９−１２１のいずれかに記載の物質の医薬有効量を含む 経鼻投与用医薬組成物。
126. （１２６）リボソームおよびミクロスフェアから選択された医薬的に許容し得る 賦形剤および請求項１１９−１２１のいずれかに記載の物質の医薬有効量を含む 局所投与用医薬組成物。
127. （１２７）心臓血管系においてレセプターへのプラスミノーゲン活性化因子の結 合を阻止または低減化する物質と一緒にプラスミン活性化因子を投与することを 含む、投与されたプラスミン活性化因子の半減期を増加させる方法。
128. （１２８）プラスミノーゲン活性化因子および心臓血管系においてレセプターへ のプラスミノーゲン活性化因子の結合を阻止または低減化する物質の組み合わせ を含む医薬組成物。
129. （１２９）組織が癌組織または潜在的癌組織である、請求項１１７または１１８ 記載の方法。
130. （１３０）組織が結腸癌組織または潜在的結腸癌組織である、請求項１２９記載 の方法。