ES2333014T3 - Uso de ciclolignanos especificos. - Google Patents

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Abstract

El uso de un compuesto de la fórmula I ** ver fórmula**en la que R1, que puede ser igual o diferente, es OH o OCH3, n es 0, 1 ó 2, R2 es OH, y R3 y R4 juntos son un éter o una lactona, y en la que los carbonos de las posiciones 9 y 9'' tienen una configuración cis y los enlaces 8-9 y 8''-9'' son enlaces beta, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un sarcoma de Ewing, glioblastoma, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, cáncer gástrico, carcinoma pancreático, cáncer ovárico y carcinoma endometrial.

Description

Uso de ciclolignanos específicos.
La presente invención se refiere al uso de ciclolignanos específicos que inhiben el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1, el IGF-1R, para el tratamiento de tipos de cáncer específicos, dependientes de IGF-1R.
Antecedentes de la invención
El receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) desempeña un papel importante en la proliferación, la protección contra la apoptosis y la transformación de las células malignas. El IGF-1R es importante también para el mantenimiento del fenotipo maligno de las células tumorales, y está implicado en la protección de las células tumorales frente a la terapia antitumoral. En contraste, el IGF-1R no parece ser un requerimiento absoluto para el crecimiento celular normal.
El IGF-1R consiste en dos subunidades \alpha extracelulares idénticas que son responsables de la unión del ligando, y dos subunidades \beta idénticas con un dominio transmembrana y un dominio de tirosina quinasa intracelular. La interacción ligando-receptor da como resultado la fosforilación de los residuos de tirosina del dominio de tirosina quinasa, que se extiende desde el aminoácido 973 hasta el aminoácido 1229 de la subunidad \beta. Los sitios principales de fosforilación son las tirosinasa agrupadas en las posiciones 1131, 1135 y 1136 (LeRoith, D., et al., Endocr Rev, abril de 1995; 16(2), 143-63). Tras la autofosforilación, la quinasa del receptor fosforila proteínas intracelulares, como el sustrato del receptor de insulina 1 y Shc, que activan las rutas de señalización de la fosfatidilinositol-3 quinasa y de la proteína quinasa activada por mitógenos, respectivamente.
Basándose en el papel central del IGF-1R en las células malignas, se hace más y más evidente que IGF-1R es un objetivo para la terapia del cáncer (Baserga, R., et al., Endocrine Vol. 7, nº 1, 99-102, agosto de 1997). Una estrategia para interferir en la actividad de IGF-1R es inducir la inhibición selectiva de la tirosina quinasa de IGF-1R. Sin embargo, hoy en día no hay disponibles inhibidores selectivos de IGF-1R.
Los fármacos que contienen el ciclolignano notablemente tóxico podofilotoxina se han usado durante siglos, y sus propiedades antineoplásicas han atraído un interés particular. Los efectos secundarios indeseados de la podofilotoxina han evitado, sin embargo, su uso como fármaco antineoplásico. El mecanismo de la citotoxicidad de la podofilotoxina se ha atribuido a su unión a la \beta-tubulina, que conduce a la inhibición del ensamblaje de los microtúbulos y la detención de la mitosis. Se ha demostrado que es necesaria la conformación trans del anillo de lactona de la podofilotoxina para la unión a la \beta-tubulina. En contraste, su estereoisómero picropodofilotoxina, que tiene una configuración cis en el anillo de lactona, tiene un efecto inhibidor 50 veces menor sobre la polimerización de los microtúbulos, y una DL50 35 veces mayor en ratas. Debido al bajo efecto anti-microtúbulo de la picropodofilotoxina, este compuesto ha atraído poco interés. Durante las últimas décadas, el interés principal sobre los derivados de podofilotoxina ha concernido al etopósido, que es un derivado de etiliden glucósido de 4'-desmetil-epi-podofilotoxina. El etopósido, que no tiene efecto sobre los microtúbulos, es un inhibidor de la topoisomerasa II, y actualmente se usa como tal en la terapia del cáncer.
Estado de la técnica
Varios inhibidores sintéticos de tirosina quinasas, es decir, tirfostinas, han sido estudiados por Párrizas, M., et al., Endocrinology 1997, Vol. 138, Nº 4, 1427-1433. El IGF-1R es un miembro de la familia de receptores de tirosina quinasa, que también incluye los receptores de insulina, de factor de crecimiento epidérmico (EGF), de factor de crecimiento nervioso (NGF), y de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Todas las tirfostinas activas en el IGF-1R tienen una reacción cruzada con el receptor de insulina, aunque dos de ellas mostraron una preferencia moderada por IGF-1R. Por lo tanto, se propuso que podría ser posible diseñar y sintetizar moléculas pequeñas capaces de discriminar entre ellos.
Los inhibidores competitivos por el sustrato de la quinasa del receptor de IGF-1 se discuten en Blum, G., et al. en Biochemistry 2000, 39, 15705-15712. Se informa de varios compuestos ejemplares como inhibidores de la quinasa de IGF-1R aislada. La búsqueda de estos compuestos estuvo asistida por el conocimiento de la estructura tridimensional del dominio de quinasa del receptor de insulina, que es homólogo en un 84% respecto del dominio de quinasa del IGF-1R. El inhibidor más potente hallado fue tirfostina AG 538, con una CI50 de 400 nM. Sin embargo, dicho inhibidor bloqueó también la quinasa del receptor de insulina.
Kanter-Lewensohn, L., et al., Mol Cell Endocr 165 (2000), 131-137, investigaron si el efecto citotóxico de tamoxifeno (TAM) sobre las células de melanoma podría depender de la interferencia con la expresión o la función del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1. Se descubrió que, aunque TAM no tuvo un efecto intenso sobre la unión de IGF-1 y la expresión de IGF-1R en la superficie celular, TAM bloqueó de manera eficaz la fosforilación de tirosinas de la subunidad \beta de IGF-1R.
The Chemistry of Podophyllum, de J. L. Hartwell et al., Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe 15, 1958, 83-166, proporciona una visión de conjunto de la podofilotoxina y de los diferentes derivados de la misma, derivados comercialmente de dos especies de plantas, Podophyllum peltatum y Podophyllum emodi.
En general, se ha considerado que la picropodofilina es biológicamente inactiva, Ayres, D. C., y Loike, J. D., Lignans. Chemical, biological and clinical properties. Cambridge University Press, Cambridge, 1990.
Objetivos de la invención
El objetivo de la invención es hallar métodos nuevos para el tratamiento de tipos de cáncer específicos, dependientes de IGF-1R, por medio de una inhibición de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un modelo informático de un péptido de 12 aminoácidos que comprende las tirosinas 1131, 1135 y 1136 del receptor de IGF-1.
La Figura 2A muestra las fórmulas estructurales de los compuestos picropodofilina y podofilotoxina.
La Figura 3 es un diagrama que muestra el efecto de la picropodofilina sobre la fosforilación de tirosinas de diferentes receptores.
La Figura 4 es un diagrama que muestra el efecto de la picropodofilina sobre la autofosforilación de IGF-1R.
Las Figuras 5A y 5B son diagramas que muestran el efecto de respuesta a dosis de la picropodofilina sobre la viabilidad de 4 líneas celulares diferentes. La Figura 5A muestra el efecto sobre una línea de células de melanoma, FM 55, y una línea de células de sarcoma, RD-ES, respectivamente, y la Figura 5B muestra el efecto sobre dos líneas celulares manipuladas, R- y P6.
La Figura 6A es un diagrama que muestra el efecto de la picropodofilina sobre el peso tumoral en ratones.
Descripción de la invención
Se analizó la estructura tridimensional de una secuencia de 12 aminoácidos del dominio de tirosina de IGF-1R, que incluía los residuos de tirosina de las posiciones 1131, 1135 y 1136, mediante el uso de un programa informático para hallar compuestos que tuvieran la capacidad de imitar los residuos de tirosina e interferir en la fosforilación de los mismos. Así se descubrió, al usar un péptido de 12 aminoácidos, que dos de las tres tirosinas claves, es decir, 1135 y 1136, que se tienen que autofosforilar en IGF-1R para la activación, podían llegar a situarse a 0,95 nm (9,5 \ring{A}) entre sí, y que el ángulo aparente entre estos grupos era de alrededor de 60º. La configuración de dicha secuencia se muestra en la Figura 1. Esta corta distancia no se ha observado para las tirosinas correspondientes en el receptor de insulina. La Figura 1 representa también la estructura espacial de podofilotoxina y picropodofilina.
La modelización molecular demostró que una molécula inhibidora podría consistir en dos anillos de benceno separados por un solo átomo de carbono. Cuando se probó con un puente de dos carbonos, la distancia entre los sustituyentes de los anillos de benceno fue demasiado grande, alrededor de 1,3 nm (13 \ring{A}).
Los sustituyentes que correspondían a los grupos hidroxilo de las tirosinas se seleccionaron para que fueran grupos metoxi o metilendioxi, ya que son relativamente estables químicamente, es decir, no se oxidan o fosforilan. La distancia entre estos sustituyentes debería ser de alrededor de 0,95 \pm 0,10 nm (9,5 \pm 1,0 \ring{A}).
Entonces se descubrió sorprendentemente que los dos anillos de benceno sustituidos y en ángulo de los ciclolignanos podofilotoxina y picropodofilina se ajustaban casi exactamente al bolsillo entre las tirosinas 1135 y 1136, lo que indica que dichos compuestos podrían interferir con la autofosforilación de los residuos de tirosina. En contraste con el efecto sobre los microtúbulos, la inhibición de IGF-1R no se limitó a los ciclolignanos con una configuración trans en el anillo de lactona.
Para penetrar en el receptor, una molécula inhibidora tiene que ser pequeña. Cuando, por ejemplo, se conjugó podofilotoxina con un derivado de glucósido, podofilotoxina-4,6-O-benciliden-\beta-D-glucopiranósido, el efecto sobre IGF-1R desapareció completamente. Además, tras la reducción del anillo de lactona hasta una estructura diol, el tamaño de la molécula se incrementó debido a los sustituyentes reducidos que sobresalían de la molécula, lo que dio como resultado una actividad drásticamente reducida de los compuestos. El incremento del tamaño mediante la formación de derivados de metilendioxi o acetónidos de podofilotoxina-diol también dio como resultado compuestos con poca o ninguna actividad.
La molécula inhibidora también tiene que ser relativamente apolar, de forma que pueda penetrar libremente a través de las membranas celulares y en el receptor de IGF-1, pero lo suficientemente polar como para que sea razonablemente soluble en agua. La polaridad de la molécula se determina mediante el número y la naturaleza de las funciones de oxígeno. La polaridad parece ser óptima cuando la solubilidad en agua está entre la de la desoxipodofilotoxina, es decir, alrededor de 0,01 mM, y la de la podofilotoxina, alrededor de 0,1-0,2 mM. No debería haber presentes grupos cargados o muy polares en la molécula.
La invención se refiere al uso de un compuesto de la fórmula I
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1 
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en la que R_{1}, que puede ser igual o diferente, es OH o OCH_{3}, n es 0, 1 ó 2, R_{2} es OH, y R_{3} y R_{4} juntos son un éter o una lactona, y en la que los carbonos de las posiciones 9 y 9' tienen una configuración cis y los enlaces 8-9 y 8'-9' son enlaces beta, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un sarcoma de Ewing, glioblastoma, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, cáncer gástrico, carcinoma pancreático, cáncer ovárico y carcinoma endometrial.
De forma notable, los carbonos de las posiciones 9 y 9' de todos los compuestos de la fórmula I tienen una configuración cis, es decir, los enlaces 8-9 y 8'-9' están localizados en o sobre el plano del anillo de carbono (enlaces beta), tal como indican las líneas continuas de la fórmula I. Una línea ondulada, tal como entre los carbonos 1' y 7', indica que el enlace puede ser un enlace alfa o beta. Un enlace alfa, que está por debajo del plano del anillo de carbono, se ilustra mediante una línea discontinua. El anillo de benceno debería estar preferiblemente en una posición \alpha, tal como se demuestra en la picropodofilina.
La invención se refiere especialmente al uso de un compuesto de la fórmula II,
2
en la que R_{2} se define como en la fórmula I, que es picropodofilina. La estructura química de dicho compuesto se muestra en la Figura 2A.
La podofilotoxina y desoxipodofilotoxina, usadas como material de partida para la síntesis de los picro-derivados descritos, se dan de manera natural en las plantas. Para la preparación de dichas sustancias en forma pura, se extraen con disolventes orgánicos rizomas secados y finalmente triturados, p.ej., de Podophyllum emodi o Podophyllum peltatum. El extracto se filtra después y se concentra con gel de sílice. Las fracciones que contienen las sustancias se recogen y estas últimas se purifican adicionalmente mediante cromatografía con alúmina ácida y gel de sílice, etc., y finalmente se recristalizan.
Desoxipicropodofilina y picropodofilina se pueden preparar a partir de desoxipodofilotoxina y podofilotoxina, respectivamente. Se disolvió un mg de esta última en metanol acuoso del 70%. A la disolución se le añadieron 20 mg de acetato sódico y la mezcla se incubó después durante 20 h a 55ºC. Tras la evaporación del alcohol, el producto se extrajo con acetato de etilo, y después se purificó mediante cromatografía con gel de sílice, fase móvil: mezclas de hexano-acetato de etilo, y/o sílice unida a octadecilsilano, fase móvil: metanol acuoso; HPLC).
Como ejemplos adicionales de compuestos de fórmula I, se pueden mencionar epipicropodofilina y 4'-desmetilpicropodofilina.
Para diseñar un inhibidor de la tirosina quinasa de IGF-1R para fines terapéuticos, es de gran importancia que el inhibidor no tenga reactividad cruzada con la quinasa del receptor de insulina, que es sumamente homóloga al IGF-1R. La co-inhibición del receptor de insulina conducirá a una respuesta diabetógena in vivo. Esta respuesta comprende un efecto secundario muy grave, que no se puede controlar mediante el tratamiento con insulina ya que la quinasa del receptor está siendo bloqueada. Sin embargo, se ha demostrado, véase la Figura 3, que la picropodofilina, que es un inhibidor de IGF-1R mucho más potente que los compuestos basados en tirofostina, no interfiere en absoluto con la tirosina quinasa del receptor de insulina. Tampoco interfiere con la fosforilación de tirosinas de los receptores del factor de crecimiento epidérmico, del factor de crecimiento derivado de plaquetas o del factor de crecimiento de fibroblastos.
La podofilotoxina se ha implicado durante mucho tiempo en la terapia del cáncer, pero producía efectos secundarios inaceptables. El efecto antineoplásico, así como los efectos secundarios, se atribuían a la inhibición del ensamblaje de los microtúbulos y al bloqueo de la mitosis. Ahora se ha demostrado que la podofilotoxina y su isómero atóxico picropodofilina, que se habían considerado en general biológicamente inactivos, son inhibidores muy potentes y específicos de la fosforilación de tirosinas del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1, que desempeña un papel central como factor de supervivencia de las células cancerosas. Es de suma importancia que ni la picropodofilina y otros picro-derivados que tienen una configuración cis en el anillo de lactona inhiben el receptor de insulina, que es sumamente homólogo a IGF-1R. Tampoco inhiben otras quinasas de receptores de factores de crecimiento importantes. La baja citotoxicidad general de la picropodofilina en comparación con la podofilotoxina sugiere que el primer compuesto es un inhibidor muy selectivo de IGF-1R.
Los resultados de los experimentos biológicos sugieren que las concentraciones submicromolares de picropodofilina o de otros picro-derivados pueden ser suficientes para provocar la muerte de las células tumorales. Sin embargo, para el tratamiento óptimo, se cree que es importante mantener una concentración relativamente constante de los inhibidores a lo largo de períodos prolongados, para permitir que saturen continuamente todos los IGF-1Rs, y de esta manera destruir finalmente tantas células malignas como sea posible. Por lo tanto, la infusión de picropodofilina o derivados, en conexión con la monitorización de la concentración plasmática del compuesto, puede ser la estrategia de elección en vez de las administraciones repetitivas (p.ej. diariamente), que pueden conducir a reactivaciones del IGF-1R entre los tratamientos.
Los intentos previos de tratar seres humanos y animales con podofilotoxina han demostrado que es un compuesto relativamente tóxico, tanto de forma sistémica (la DL_{50} para ratas es de 14 mg/kg) como local (daño tisular). Su citotoxicidad se ha relacionado con la unión a la \beta-tubulina, pero esto debería ocurrir solamente a concentraciones mucho mayores que las necesarias para la inhibición de IGF-1R cuando se ensaya in vitro (CI_{50} de 0,5-1,0 \muM frente a CI_{50} de 0,001 \muM). Esta toxicidad impide su uso como fármaco para la administración parenteral, peroral, y
tópica.
La invención se refiere al uso de un compuesto como se ha descrito para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de los diferentes tipos de cáncer: sarcoma de Ewing; glioblastoma; carcinoma de próstata; carcinoma de mama; cáncer gástrico; carcinoma pancreático; cáncer ovárico; y carcinoma endometrial.
En el caso de tumores que no son completamente dependientes de IGF-1R, los compuestos de la invención pueden ser útiles para potenciar el efecto de otros fármacos antineoplásicos. La invención se refiere, por lo tanto, al uso de un compuesto de la fórmula I en combinación con otro citostático. Como ejemplos de citostáticos que se pueden usar junto con un ciclolignano de la invención se pueden mencionar vincristina, taxol y etopósido.
Se puede usar como medicamento una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula I en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable. La composición farmacéutica, que opcionalmente contiene aditivos convencionales, se puede administrar a un paciente mediante cualquier vía adecuada, dependiendo de la enfermedad a tratar y del estado del paciente.
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Para la administración parenteral, los compuestos se pueden administrar en forma de dosis inyectables o mediante la infusión intravenosa continua de una solución, suspensión o emulsión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable como vehículo farmacéutico, que puede ser un líquido estéril, tal como agua, alcoholes, aceites y otros disolventes orgánicos aceptables, con o sin la adición de un tensoactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos se pueden administrar también en forma de una inyección de liberación lenta o una preparación para implante, que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida del ingrediente activo.
Para la administración oral, los compuestos se pueden formular en preparaciones sólidas o líquidas tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, trociscos, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones.
Para la aplicación tópica, los compuestos se pueden administrar en forma de un ungüento, crema, pomada, loción o parche.
Un método de tratamiento de los tipos de cáncer mencionados en un mamífero comprende las etapas de administrar una composición farmacéutica, que contiene un compuesto que tiene la fórmula I en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable, mediante infusión constante a un paciente que padece un tumor, controlar el nivel plasmático del compuesto, y ajustar la velocidad de infusión para mantener el nivel plasmático en una concentración de 0,05-5,0 \muM durante un período de tiempo que sea suficiente para que el tumor se retrase o desaparezca.
Parte experimental Materiales Productos químicos
Los reactivos para los cultivos celulares, es decir los medios, el suero bovino fetal y los antibióticos se adquirieron de Gibco, Suecia. Todos los demás productos químicos, a menos que se indique de otra manera, fueron de Sigma (St. Louis. MO, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal de ratón contra fosfotirosina (PY99) y el anticuerpo policlonal contra la subunidad \alpha de IGF-1R (N20) y la subunidad \alpha del receptor de insulina, y el anticuerpo policlonal contra el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal contra la subunidad \alpha de IGF-1R (\alphaIR-3) y el anticuerpo monoclonal hacia el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos se adquirieron de Oncogene Science (Manhasset, NY, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal murino contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico se adquirió de Life Science, y el anticuerpo conjugado a agarosa Anti-IRS-1 se obtuvo de UBI (Lake Placid, NY, EE.UU.).
El IGF-1 recombinante fue una donación de Pharmacia Upjohn (Estocolmo, Suecia). La desoxipodofilotoxina y podofilotoxina (99,97% de pureza) fueron amablemente donados por Analytecon SA, Pre Jorat, Suiza, al igual que podofilotoxina-4,6-O-benciliden-\beta-D-glucopiranósido de Conpharm AB, Uppsala, Suecia. El etopósido fue de
Sigma.
Cultivos celulares
Las líneas de células de melanoma humano SK-MEL-2, SK-MEL-5 y SK-MEL-28, las líneas de células de sarcoma de Ewing RD-ES y ES-1, la línea de células de hepatoma HepG2, la línea de células de carcinoma prostático PC-3, y la línea de células de cáncer de mama MCF-7 fueron de la American Tissue Culture Collection, EE.UU. Las líneas de células de melanoma maligno BE, DWB y FM 55 se obtuvieron del Profesor R Kiessling, CCK, Hospital Karolinska, Estocolmo, Suecia. Las líneas de células R- y P6 fueron donaciones del Profesor R. Baserga, Universidad Thomas Jefferson, Filadelfia, PA, EE.UU. Las células R- son IGF-1R-negativas, mientras las células P6 sobreexpresan el IGF-1R.
Las líneas K562/S y K562/Vcr30 de leucemia mieloide crónica y las líneas HL60/0 y HL60/Nov de células de leucemia mieloide aguda se obtuvieron de la ATCC. Las K562/S y K562/Vcr30 son células de tipo natural (no resistentes), mientras las K562/Vcr30 y HL60/Nov son sublíneas resistentes a citostáticos. Todas las líneas de células de leucemia se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con un 10% de suero bovino fetal y con L-glutamina 2 mM, bencilpenicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml). Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos mantenidos en una atmósfera de 95% de aire/5% de CO_{2} a 37ºC en un incubador humidificado. Para los experimentos, las células se cultivaron en placas de plástico de 60 mm o en placas de plástico de 96
pocillos.
Todas las demás líneas celulares se cultivaron en Medio Esencial Mínimo que contenía un 10% de suero bovino fetal, glutamina, 1% de bencilpenicilina y estreptomicina. Las células se cultivaron en monocapas en matraces de cultivo de tejidos mantenidos en una atmósfera de 95% de aire/5% de CO_{2} a 37ºC en un incubador humidificado. Para los experimentos, las células se cultivaron en placas de plástico de 35 mm o de 60 mm o en placas de plástico de 96 pocillos. Los experimentos se iniciaron en condiciones de crecimiento subconfluentes.
Métodos Ensayos de tirosina quinasa in vitro
Se llevó a cabo la fosforilación de sustrato catalizada por IGF-1R de poliTyrGlu (pTG) básicamente como se describió previamente [Parrizas M., et al., ibídem, y Blum G., et al., ibídem]. El IR se inmunoprecipitó a partir de HepG2, el IGF-1R a partir de extracto de células P6 y en el sobrenadante se redujo inmunológicamente el contenido para ensayar las tirosina quinasas que no eran de IGF-1R. El sustrato polimérico fosforilado se investigó con un anticuerpo monoclonal purificado específico de fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano (HARP). El color se desarrolló con el sustrato cromógeno de HRP dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD). El color se cuantificó mediante espectrofotometría (lector de ELISA) y refleja la cantidad relativa de tirosina quinasa. El precipitado se sometió a inmunotransferencia con anticuerpos hacia IGF-1R e IR para verificar la presencia del receptor. Se usaron diluciones en serie para ensayar las condiciones óptimas con respecto a la cantidad de IGF-1R e IR. La señal fue lineal durante 30 minutos y fue una función de la concentración de IGF-1R hasta 75 ng/pocillo. Brevemente, se revistieron placas de 96 pocillos (Immunolon, Nunc) durante la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal de ratón (LabVision) hacia la subunidad \beta de IGF-1R a una concentración de 1 \mug/ml. Las placas se bloquearon con BSA en PBS (tampón de bloqueo de ELISA, Pierce), y se añadieron 80 \mug/ml del lisado de proteína total de la línea de células P6. Las placas se incubaron durante 1 h, y se lavaron con PBS-Tween. Los compuestos investigados se añadieron en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de la activación de la quinasa con IGF-1. El ensayo de quinasas se llevó a cabo mediante el uso del equipo de Sigma de fosforilación in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la espectrofotometría, se determinaron los valores de CI_{50} de los inhibidores mediante el uso de la función de regresión del programa Statistica.
Se analizó la autofosforilación de las tirosinas de IGF-1R mediante un ensayo ELISA de tipo sándwich. Brevemente, se revistieron placas de 96 pocillos (Immunolon, Nunc) durante la noche a 4ºC con 1 \mug/pocillo del anticuerpo monoclonal Ab-5 (LabVision) hacia la subunidad \beta de IGF-1R. Las placas se bloquearon con un 1% de BSA en PBS-Tween durante 1 h, y después se añadieron 80 g/pocillo del lisado de proteína total de la línea de células P6. Como control negativo se usó el lisado de proteína total de la línea de células R-. Los compuestos investigados se añadieron en tampón de tirosina quinasa sin ATP a temperatura ambiente durante 30 min, antes de la activación de la quinasa con ATP. El ensayo de quinasas se llevó a cabo mediante el uso del equipo de Sigma. Tras la espectrofotometría, se determinaron los valores de CI_{50} de los inhibidores mediante el uso de la función de regresión del programa
Statistica.
Ensayo del crecimiento y la supervivencia celular
El equipo de proliferación celular II (Roche Inc.) se basa en el cambio colorimétrico de la sal de tetrazolio XTT amarilla en colorante de formazano naranja por la cadena respiratoria de las células viables (Roehm, NW, et al., J Immunol Methods 142:257-265, 1991). Las células sembradas a una concentración de 5000/pocillo en 100 \mul de medio en una placa de 96 pocillos se trataron con diferentes fármacos a la concentración dada. Después de 24 ó 48 h, las células se incubaron según el protocolo del fabricante con mezcla de marcaje con XTT. Después de 4 h el colorante de formazano se cuantifica mediante el uso de un espectrofotómetro de barrido de placas multipocillo con un filtro de 495 nm. La absorbancia tiene correlación directa con el número de células viables. Se dibujó la curva de absorbancia patrón por medio de células sin tratar sembradas a una concentración de 1000 a 10000 células/pocillo con una proporción creciente de 1000 células/pocillo. Todos los patrones y los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Ensayo de fosforilación de tirosinas de receptores en células intactas
Las células se cultivaron hasta la subconfluencia en placas de 6 cm, y después se añadió medio nuevo que contenía un 10% de FBS y los compuestos deseados se añadieron durante 1 h. Las células se lisaron después y se sometieron a inmunoprecipitación mediante el uso de anticuerpos específicos. Los inmunoprecipitados se resolvieron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpo anti-fosfotirosina. Se usaron anticuerpos hacia actina (en el extracto celular) o hacia la subunidad \beta de IGF-1R como controles de carga. Tras la detección, se escanearon las películas para la cuantificación.
Inmunoprecipitación y determinación del contenido de proteína
Las células aisladas se lisaron después en 10 ml de PBSTDS helado que contenía inhibidores de proteasas (Carlberg, M., et al., J Biol Chem 271:17453-17462, 1996). Se añadieron 50 \mul de proteína A o G-agarosa en 1 ml de muestra y se incubaron durante 15 min a 4ºC en un agitador orbital. Tras centrifugación durante 10 min a 10.000 r/min a 4ºC, se guardó el sobrenadante. Se determinó el contenido de proteínas mediante un ensayo de unión de colorante con un reactivo adquirido de Bio-Rad. Se usó albúmina de suero bovino como patrón. Se añadieron 15 \mul de proteína G Plus-agarosa y 5 \mul de anti-IGF-1R. Después de una incubación de 3 h a 4ºC en un agitador orbital, el precipitado se recogió mediante un pulso de centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 s. El sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó 3 veces con PBSTDS.
Electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE)
Las muestras de proteína se disolvieron en un tampón de muestras 2x que contenía tampón de Laemmli y un 0,5% de metanol, y se hirvieron durante 5 min a 96ºC. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE con un gel concentrador del 4% y un gel separador del 7,5%. Se utilizaron simultáneamente marcadores de peso molecular (Bio Rad, Suecia) en todos los experimentos.
Transferencia de Western
Tras la SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron durante la noche a membranas de nitrocelulosa (Hybond, Amersham, R.U.) y después se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente en una disolución de un 4% de leche descremada en polvo y un 0,02% de Tween 20 en PBS, pH 7,5. Se llevaron a cabo incubaciones con los anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados con PBS con Tween e incubación con el segundo anticuerpo durante 1 h a temperatura ambiente. Tras otros 3 lavados, las membranas se incubaron con estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano durante 30 min y después se detectaron mediante el uso del sistema ECL de Amersham (Amersham, R.U.). Las películas se escanearon mediante Fluor-S (BioRad).
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Experimento 1
Efecto de los derivados de podofilotoxina sobre la fosforilación de IGF-1R en células de melanoma cultivadas
Se sembraron células de melanoma FM55 en placas de 6 cm, a una concentración de 10.000 células/cm^{2} en medio esencial mínimo complementado con un 10% de suero bovino fetal (FCS). Cuando las células alcanzaron una densidad de 65.000 células/cm^{2} en las placas, se trataron durante 1 h con 0,05 \muM de podofilotoxina, desoxipodofilotoxina, picropodofilina, desoxipicropodofilina, 4'-desmetil-7-(4,6-O-etiliden-\beta-D-glucopiranosil)epipodofilotoxina (etopósido) y podofilotoxina-4,6-O-benciliden-\beta-D-glucopiranósido (pf-4,6-O). También se administraron etopósido y pf-4,6-O a una concentración de 15 \muM. Las células se recogieron después para el ensayo y la cuantificación de la fosforilación de IGF-1R como se describe en el Experimento 1. Los valores mostrados en la Tabla 1 representan las medias de 3 experimentos.
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TABLA 1 Nivel de fosforilación de IGF-1R en células intactas (% de DO)
3 
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Los resultados demuestran que la podofilotoxina, desoxipodofilotoxina, picropodofilina y desoxipicropodofilina son inhibidores potentes de la fosforilación de IGF-1R, mientras el etopósido y Pf-4,6-O no lo son.
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Experimento 2
Efecto dependiente de la dosis de picropodofilina sobre la fosforilación de IGF-1R en un sistema sin células
Todos estos datos con células intactas demostraron que la picropodofilina y la podofilotoxina evitaron la fosforilación de IGF-1R, pero no revelaron si esto era un efecto directo o indirecto sobre la tirosina quinasa. Por lo tanto, se aisló el receptor y se determinó el efecto de la picropodofilina sobre la fosforilación de las tirosinas del sustrato catalizada mediante IGF-1R y la autofosforilación de IGF-1R in vitro. La picropodofilina disminuyó de manera eficaz la fosforilación del sustrato pTG (valor de CI_{50} 0,006 \muM, véase la Figura 3). En contraste, no pudo interferir en la fosforilación del sustrato de las tirosina quinasas de EGFR e IR, así como de los sustratos de otras "quinasas no IGF-1R" (Figura 3), que se obtuvieron mediante reducción inmunológica de IGF-1R. La podofilotoxina produjo resultados similares a la picropodofilina.
En el próximo grupo de experimentos sin células se demostró que PPP inhibió de manera eficaz la autofosforilación de IGF-1R (para los detalles, véanse los Métodos), con un valor de CI_{50} de alrededor de 0,001 \muM (véase la Figura 4). Se obtuvo una respuesta similar mediante PPT (datos no mostrados). Para investigar si PPP interfiere con la autofosforilación de tirosinas a nivel del ATP o a nivel del sustrato (es decir, el dominio de tirosina quinasa de la subunidad \beta de IGF-1R), se añadieron diversas concentraciones de ATP (19-300 \muM) al tampón de reacción durante el ensayo. Tal como se muestra, esto no alteró el valor de CI_{50} de PPP, que permaneció en 0,001-0,002 \muM (Figura 4). Estos resultados implican que los inhibidores de la autofosforilación de IGF-1R no actúan interfiriendo con el ATP, sino que en lugar de ello inhiben la fosforilación del sustrato por la tirosina quinasa de
IGF-1R.
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Experimento 3
Especificidad de picropodofilina y podofilotoxina en diversas tirosina quinasas de receptores en células cultivadas
Se cultivaron células de melanoma FM55 de la misma manera que se describió en el Experimento 1. Cuando se alcanzó una densidad de 65.000 células/cm^{2} en las placas, se trataron durante 1 h con 0 (control) y 0,05 \muM de picropodofilina y podofilotoxina, respectivamente. Las células se aislaron después y se sometieron a inmunoprecipitación del IGF-1R, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor de insulina (IR) y sustrato de insulina 1 (IRS-1) mediante el uso de anticuerpos hacia las moléculas respectivas. El IRS-1 es un sustrato de IGF-1R, y por lo tanto su fosforilación depende del IGF-1R fosforilado. Se llevaron a cabo las electroforesis en gel, las transferencias de Western y la cuantificación de las diferentes señales tal como se describió
anteriormente.
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TABLA 2 Nivel de fosforilación de IGF-1R en células intactas (% de DO)
4 
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Esto demuestra que la picropodofilina y la podofilotoxina son específicas de IGF-1R.
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Experimento 4
Efecto de la podofilotoxina y la picropodofilina sobre la fosforilación de IGF-1R de diversos tipos de células malignas
Se sembraron 12 líneas celulares de diferentes orígenes en placas de 6 cm, a una concentración de 10.000
células/cm^{2} en medio esencial mínimo complementado con suero bovino fetal (FCS). Cuando las células alcanzaron una concentración de 65.000 células/cm^{2}, se trataron con dosis 0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 o 1,0 \muM de podofilotoxina y picropodofilina durante 1 h. Las células se recogieron después para el ensayo y la cuantificación de la fosforilación de IGF-1R tal como se describió anteriormente. Después se calculó el valor de CE50, la concentración eficaz al 50%, es decir, la concentración necesaria para reducir la fosforilación en un 50%, para cada inhibidor y línea celular. Los valores se muestran a continuación en la Tabla 3. Los resultados se basan se basan en dos experimentos
diferentes.
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TABLA 3 CE50 para la fosforilación de IGF-1R
5 
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Esto demuestra que la podofilotoxina y la picropodofilina inhiben la fosforilación de IGF-1R en diversas células cancerosas.
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Experimento 5
Efecto de podofilotoxina y picropodofilina sobre la viabilidad de un gran número de tipos de células malignas
Se sembraron 12 tipos diferentes de líneas celulares en placas de 96 pocillos (el volumen medio en un pocillo fue 100 \mul), a una concentración de 10.000 células/cm^{2} en medio esencial mínimo complementado con suero bovino fetal. Cuando las células alcanzaron una concentración de 65.000 células/cm^{2}, se trataron con diferentes dosis de podofilotoxina y picropodofilina durante 48 h. Después se ensayó la viabilidad celular (véase anteriormente). Los valores de CE50 para cada inhibidor y línea celular, calculados como la concentración que da como resultado una disminución del 50% de la supervivencia celular, se muestran más adelante en la Tabla 4. Las curvas de respuesta a dosis para la línea de células de melanoma FM55 y la línea de células de sarcoma de Ewing RD-ES tratadas con picropodofilina se representan en la Figura 5A. La viabilidad de ambas líneas de células tumorales disminuye por la concentración de picropodofilina. La Figura 5B muestra las curvas de respuesta a dosis para una línea celular de fibroblastos murinos, desprovista (R-) o que sobreexpresa el IGF-1R humano (P6). Mientras la viabilidad de las células P6 cae con la dosis de picropodofilina, las células R- no responden. Esto implica que la picropodofilina es selectiva para el IGF-1R. Todos los resultados presentados en la Tabla 4 y en la Figura 5 se basan en 4 experimentos
diferentes.
TABLA 4 CE50 (\muM) para la viabilidad celular
7 
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La podofilotoxina y la picropodofilina son inhibidores muy potentes de la viabilidad de las células tumorales.
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Experimento 6
Inhibición del crecimiento de células malignas in vivo
Se usaron ratones atímicos (nu/nu) sin patógenos de cuatro a seis semanas de edad y se albergaron en aisladores de plástico en una instalación estéril. La línea de células de sarcoma de Ewing ES-1 y la línea de células de melanoma BE (se demostró que ambas expresaban IGF-1R) se inyectaron de forma subcutánea en una cantidad de 10^{7} células/ratón en un volumen de 0,2 ml de solución salina estéril. Se llevaron a cabo tratamientos experimentales con podofilotoxina, desoxipodofilotoxina o picropodofilina mediante inyecciones intraperitoneales diarias del compuesto en un volumen de 100 \mul de disolvente, compuesto de una mezcla de DMSO y solución salina fisiológica (8:2). Los ratones de control se trataron con el disolvente. Se trataron 3-6 animales en cada grupo. Los animales se monitorizaron tres veces por semana en busca de signos de enfermedad y crecimiento tumoral. La masa tumoral se estimó mediante el uso de la fórmula (d^{2}xD)/2, en la que d y D representan los diámetros pequeño y grande del tumor, respectivamente. Los ratones se observaron cuidadosamente en busca de la presencia de efectos secundarios, y se sacrificaron al final de los experimentos para el análisis histológico de las lesiones. Todos los experimentos se llevaron a cabo según las directrices éticas para el uso de animales de laboratorio, proporcionadas por un comité ético
institucional.
El primer grupo de experimentos se llevaron a cabo para investigar posibles efectos tóxicos locales y sistémicos de podofilotoxina, desoxipodofilotoxina y picropodofilina en los ratones atímicos. En el primer experimento, se implantaron bombas osmóticas cargadas con un disolvente exento de fármaco, podofilotoxina (0,25 mg), desoxipodofilotoxina (0,25 mg) o picropodofilina (0,25 mg) de forma subcutánea en la región del costado. Los fármacos se administran de forma subcutánea con un flujo constante de 0,6 \mul/h a lo largo de 7 días. El volumen de las bombas fue de 100 \mul. Después de 7 días, los ratones se sacrificaron, y las reacciones tisulares en la piel y el tejido subcutáneo adyacente a la salida de las bombas fueron analizadas y puntuadas por un patólogo experimentado. Hubo 3 ratones en cada grupo. El tratamiento con el disolvente (control) no proporcionó un aumento de ninguna lesión. En contraste, la podofilotoxina provocó graves reacciones tisulares con necrosis, hemorragia e inflamación (Tabla 5). Los ratones tratados con desoxipodofilotoxina tuvieron lesiones leves, mientras los animales tratados con picropodofilina no exhibieron reacciones visibles (Tabla 5).
En el siguiente experimento, se analizaron los efectos sistémicos de los fármacos inyectando de forma intraperitoneal 100 \mul de cada compuesto diariamente a lo largo de 5 días. Se inyectaron dos dosis (7 ó 28 \mug/kg/d) y se usaron 3-6 ratones para cada fármaco y dosis. Los ratones se inspeccionaron cuidadosamente todos los días en busca de signos de molestias, enfermedades y pérdida de peso. Primero se confirmó que los ratones toleraron bien el disolvente exento de fármaco. Sin embargo, los ratones tratados tanto con la dosis baja como con la dosis elevada de podofilotoxina enfermaron y, en 2 días, murieron el 67% y el 100% de los animales, respectivamente (Tabla 6). Los ratones tratados con dosis bajas de desoxipodofilotoxina exhibieron signos graves de enfermedad después de 3 días. A la dosis elevada, el experimento se paró después de 2 días debido a enfermedades graves o muerte. En contraste, los ratones tratados con ambas dosis de picropodofilina sobrevivieron durante todo el experimento de 5 días y no exhibieron ningún signo de enfermedad (Tabla 6).
Debido a la toxicidad de podofilotoxina y desoxipodofilotoxina, solamente se usó picropodofilina para analizar el efecto sobre xenoinjertos tumorales. Para este fin, se establecieron xenoinjertos de ES-1 (células de sarcoma de Ewing) y BE (células de melanoma) en ratones atímicos. Cuando los tumores de ES-1 y BE comenzaron a crecer de forma subcutánea y fueron medibles, se trató a los ratones diariamente con inyecciones intraperitoneales de picropodofilina (28 \mug/kg, que fueron necesarios para proporcionar una concentración media por encima de 0,05 \muM de picropodofilina en el plasma sanguíneo) o un 80% de DMSO en solución salina como vehículo durante 4-6 días, seguido de 4-6 días sin tratamiento. Los ratones se sacrificaron después y los tumores fueron analizados por un patólogo experimentado. La picropodofilina inhibió de manera significativa el crecimiento de ambos tipos de tumores y provocó la regresión (ES-1, véase la Figura 6A), y el análisis histológico de las muestras de tumores reveló una necrosis
masiva.
Los resultados demuestran que los animales toleran bien la picropodofilina, en contraste con la podofilotoxina y la desoxipodofilotoxina, y provoca la regresión tumoral.
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TABLA 5 Toxicidad local
8
TABLA 6 Toxicidad sistémica
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Experimento 7
Efectos interactivos de la picropodofilina sobre las células malignas tratadas con citostáticos
Se cultivaron las líneas de células de leucemia K562/S, K562/Nov, HL60/0 y HL60/Nov en placas de 96 pocillos (25.000 células/pocillo, el volumen medio por pocillo fue 100 \mul), en medio RPMI40 complementado con suero bovino fetal. Después de 24 h las células se trataron durante 72 h con diferentes concentraciones del agente antineoplásico vincristina, con y sin una co-incubación con picropodofilina 0,05 \muM. Se demostró que la picropodofilina a esta concentración no provocó una muerte celular detectable en las células tumorales. Después se ensayó la viabilidad celular. Los valores de CI_{50} para cada inhibidor y línea celular se muestran más adelante (Tabla 7). Los resultados se basan en 3 experimentos diferentes.
Tal como se muestra, la co-incubación con picropodofilina disminuyó los valores de CI_{50} para la viabilidad celular en las 4 líneas celulares.
TABLA 7 CI_{50} (nM) para la viabilidad celular
10
Los resultados demuestran que la picropodofilina sensibiliza a las células malignas hacia los agentes citostáticos convencionales.
Conclusión
Se ha demostrado que la picropodofilina, que tiene una configuración cis en el anillo de lactona, es un inhibidor sumamente específico y potente de la tirosina quinasa de IGF-1R.
La inactivación inducida por picropodofilina del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 provocó una muerte celular amplia de células malignas, mientras las células desprovistas de los receptores del factor de crecimiento similar a la insulina 1 fueron resistentes. Este mecanismo nuevo de la picropodofilina y los derivados de la misma puede ser útil en la terapia del cáncer dependiente de IGF-1R.

Claims (13)

1. El uso de un compuesto de la fórmula I
11
en la que R_{1}, que puede ser igual o diferente, es OH o OCH_{3}, n es 0, 1 ó 2, R_{2} es OH, y R_{3} y R_{4} juntos son un éter o una lactona, y en la que los carbonos de las posiciones 9 y 9' tienen una configuración cis y los enlaces 8-9 y 8'-9' son enlaces beta, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un sarcoma de Ewing, glioblastoma, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, cáncer gástrico, carcinoma pancreático, cáncer ovárico y carcinoma endometrial.
2. El uso según la reivindicación 1 de un compuesto en el que el anillo de benceno está en posición \alpha.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2 de un compuesto que tiene la fórmula II.
12
en la que R_{2} se define como en la fórmula I, que es picropodofilina.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel plasmático del compuesto se mantiene a una concentración de 0,05-5,0 \muM.
5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el compuesto se usa en combinación con un citostático.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un sarcoma de Ewing.
7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un glioblastoma.
8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un carcinoma de próstata.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un carcinoma de mama.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un cáncer gástrico.
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un carcinoma pancreático.
12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un cáncer ovárico.
13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un carcinoma endometrial.
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