ES2335011T3 - Procedimiento inmunocromatografico. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento inmunocromatográfico caracterizado por comprender las etapas de: (1) preparación de una muestra obtenida a partir de sangre entera mediante hemolisis de la sangre entera y un tratamiento para posibilitar el revelado cromatográfico, (2) revelado de la muestra resultante sobre una membrana de revelado para inmunocromatografía, y (3) revelado de un líquido de lavado sobre la membrana de revelado para inmunocromatografía, con el fin de separar, de esta forma, un pigmento rojo obtenido del eritrocito de la membrana de revelado para inmunocromatografía, en el que la muestra obtenida a partir de sangre entera se prepara poniendo en contacto la sangre entera con un detergente no iónico, con el fin de hemolizar la sangre entera y solubilizar un componente contenido en la sangre entera, teniendo dicho componente un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de la membrana de revelado para inmunocromatografía.
Description
Procedimiento inmunocromatográfico.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento inmunocromatográfico.
Se han desarrollado diversos productos para
inmunocromatografía, en los cuales la sangre puede usarse como una
muestra a ensayar, pero cuando la sangre entera se revela sin un
tratamiento previo sobre una tira o membrana inmunocromatográfica,
el revelado inmunocromatográfico generalmente no funciona bien. Para
evitar este problema, debería separarse un suero o plasma de la
sangre entera con el fin de separar las células de sangre o
similares. La centrifugación es un procedimiento principal de
separación de plasma/suero. Sin embargo, dado que se requiere una
centrífuga para la centrifugación, un médico de medicina general no
realiza usualmente la centrifugación en una sala de consulta. Es
conocido un procedimiento que usa un filtro, tal como un filtro de
plasma (Fuji Film), como otro procedimiento para la separación del
plasma, pero igualmente necesita tiempo y es costoso. Además, es
necesaria una gran cantidad de sangre entera, puesto que debería
ampliarse un área de filtración del filtro de plasma con el fin de
separar una cantidad suficiente de plasma sin hemolisis y
obstrucción.
Bajo estas circunstancias, se han desarrollado
algunos procedimientos en los cuales se ha situado un relleno para
una separación de plasma/suero sobre una tira inmunocromatográfica.
Más particularmente, el relleno de separación está situado sobre
una porción para recibir una muestra de sangre entera en la tira
inmunocromatográfica. Cuando se aplica la muestra de sangre entera
a la porción receptora, las células de sangre se mantienen en el
relleno de separación, de manera tal que no se mueven de la tira
inmunocromatográfica durante un tiempo corto, en tanto que en ese
tiempo solamente se revelan los componentes del suero sobre la tira
inmunocromatográfica.
Los procedimientos anteriores que tienen un
relleno de este tipo, comprenden otros diversos dispositivos para
prevenir que los eritrocitos de la sangre entera se hemolizen y se
separen los componentes del suero de las células de sangre sin
hemolisis. Más particularmente, existen muchas solicitudes de
patentes y patentes registradas, por ejemplo, la Publicación de
Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No.
2002-214236 [referencia de patente 1], que usa una
membrana de carboximetilcelulosa como una membrana para capturar
células de sangre, la Publicación de Patente No Examinada Japonesa
(Kokai) No. 2002-350428 [referencia de patente 2],
que usa propanol y/o acrilamida, o la Patente Japonesa No. 2940990
[referencia de patente 3], que usa una substancia porosa
sinterizada hidrófila. Los procedimientos divulgados en estas
referencias de patentes se caracterizan por evitar la hemolisis.
Esto es debido a que la hemolisis colorea de rojo la membrana entera
de revelado inmunocromatogrático, incluyendo una zona para
enjuiciamiento, y como un resultado de ello el enjuiciamiento se
vuelve muy difícil.
Shiff (Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.,
vol. 87, (nº. 6), págs. 646-8, (1993)), divulga la
detección inmunocromatográfica de una proteína marcadora para
Plasmodium faiciparum en la sangre de pacientes infectados. En ella,
se usa un ensayo denominado ensayo ParaSight®-F y se usa el
detergente anfolítico Zwittergent® 3-14 para
hemolizar de la sangre antes de la detección
inmunocromatográfica.
En campos distintos del procedimiento
inmunocromatográfico, son conocidos un procedimiento de medición
hemolítico [referencia de patente 4] o un reactivo para hemolizar
la sangre entera con un detergente o similar (Celltac Chemi; Nihon
Kohden Corporation). Estos sistemas de ensayo conocidos no tienen
dicho problema, dado que los pigmentos rojos no afectan la
medición.
Sin embargo, en reactivos para
inmunocromatografía, en los cuales se usan un agente de revelado o
de coloración y se realiza un juicio visual, tal como una
inmunocromatografía de coloide de oro caracterizada por el teñido
con rojo, el teñido con pigmentos rojos causados por la hemolisis es
un problema crucial. Con el fin de evitar la hemolisis o un
reventamiento de eritrocitos, las células de sangre se mantienen en
el relleno para la separación del plasma bajo condiciones suaves y,
de esta forma, transcurre algún tiempo antes de que comience el
revelado inmunocromatográfico. Además, una cantidad del plasma
revelado está afectado por la viscosidad de una muestra de sangre
entera y, en consecuencia, frecuentemente se pierde cuantitividad.
Además, frecuentemente existen cambios importantes de velocidad de
separación y elución del plasma, dependiendo de la influencia de la
matriz, tal como la viscosidad de una muestra de sangre entera. Por
esta razón, existe disponible un aparato (Roche), en el cual se
compensa una intensidad de color en base a un tiempo de revelado a
partir de la separación del plasma por el relleno para colorear la
separación del plasma (no a partir del suministro de una muestra de
sangre entera).
Además, es técnicamente difícil mantener
completamente las células de sangre sobre el relleno para la
separación del plasma durante un tiempo largo, y algunas células de
sangre alcanzan la membrana de revelado inmunocromatográfico. En un
caso, tal como una inmunocromatografía de enzima, en el cual debería
revelarse además una segunda solución de revelado, tal como una
solución de lavado o una solución de substrato de enzima, después
del revelado inmunocromatográfico de una muestra, las células de
sangre que se escapan fuera del relleno para la separación del
plasma y alcanzan la membrana de revelado inmunocromatográfico,
inhiben un revelado de la segunda solución. Como un resultado de
ello, no puede obtenerse un valor medido exacto mediante una
inmunocromatografía de este tipo.
Además, como un caso especial, se conoce un
reactivo [referencia de patente 5] para la medición de un antígeno
sobre la superficie de eritrocitos mediante inmunocromatografía. En
el ensayo, se usa una membrana de revelado inmunocromatográfico que
tiene un tamaño de poro extremadamente grande (5 a 100 \mum), y se
lleva a cabo una etapa de revelado sobre la membrana sin un
reventamiento de los eritrocitos. El ensayo se caracteriza porque
los eritrocitos no revientan, así como por los procedimientos
inmunocromatográficos convencionales anteriormente mencionados.
Las características importantes de un
procedimiento inmunocromatográfico son conveniencia, rapidez, y bajo
coste. Dichas ventajas se pierden en los procedimientos anteriores
que usan una centrífuga, los cuales precisan tiempo y esfuerzo, o
el uso de un filtro previo costoso para la separación del plasma. El
problema se supera en los procedimientos anteriores en los cuales
el relleno para la separación del plasma está localizado sobre la
tira inmunocromatográfica, pero la rapidez o reproducibilidad de la
misma debería mejorarse. Además, es difícil usar el relleno en un
caso (por ejemplo, una inmunocromatografía de enzima) en el cual
debería revelarse otro líquido después del revelado de una muestra
a ensayar.
[referencia de patente 1] Publicación de Patente
No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-214236.
[referencia de patente 2] Publicación de Patente
No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-350428.
[referencia de patente 3] Patente Japonesa No.
2940990.
[referencia de patente 4] Publicación de Patente
No Examinada Japonesa (Kokai) No. 10-221334.
[referencia de patente 5] Publicación de Patente
No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2000-111555.
Tal como se ha descrito anteriormente, en los
procedimientos inmunocromatográficos convencionales que usan sangre
(es decir, sangre entera) como una muestra, la muestra de sangre
entera se trata previamente para llevar a cabo una separación
suero/plasma, o bien existe localizado sobre la tira
inmunocromatográfica un relleno para la separación del plasma con
el fin de retardar el revelado de las células de sangre sobre la
membrana de revelado inmunocromatográfico. Ambos procedimientos se
caracterizan por no reventarse los eritrocitos en la sangre entera
y no perderse pigmentos rojos procedentes de los eritrocitos. Sin
embargo, la separación previa del suero/plasma tiene una desventaja
en coste y esfuerzos. El procedimiento que usa el relleno de
separación de plasma sobre la tira inmunocromatográfica tiene un
problema con una reproducibilidad de un tiempo de medición o
similar, debido a la viscosidad de la sangre entera, y es difícil de
usar en una inmunocromatografía en la cual debería revelarse otro
líquido después del revelado de una muestra a ensayar.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento inmunocromatográfico en el cual se
trate previamente una muestra de sangre entera mediante un
procedimiento rápido y conveniente, un enjuiciamiento que no esté
afectado por una hemolisis de la sangre entera que cause una
coloración temporal de la membrana de revelado inmunocromatográfico
con rojo, y que la muestra de sangre entera pueda analizarse de
manera rápida y conveniente, y a un bajo coste.
El problema puede resolverse mediante un
procedimiento inmunocromatográfico de la presente invención,
caracterizado por comprender las etapas siguientes:
(1) preparación de una muestra obtenida a partir
de sangre entera mediante hemolisis de la sangre entera y un
tratamiento previo para posibilitar el revelado cromatográfico
(referido aquí en adelante como una etapa para la preparación de
una muestra obtenida a partir de sangre entera o una etapa
preparativa),
(2) revelado de la muestra resultante sobre una
membrana de revelado para inmunocromatografía (referido aquí en
adelante como una etapa de revelado), y
(3) revelado de un líquido de lavado sobre la
membrana de revelado para inmunocromatografía, con el fin de
separar, de esta forma, un pigmento rojo obtenido del eritrocito de
la membrana de revelado para inmunocromatografía (referida aquí en
adelante como una etapa para la separación de un pigmento rojo o una
etapa de separación), en el que
la muestra obtenida a partir de sangre entera se
prepara poniendo en contacto la sangre entera con un detergente no
iónico, con el fin de hemolizar, de esta forma, la sangre entera y
solubilizar un componente contenido en la sangre entera y que tiene
un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de la membrana de
revelado para inmunocromatografía.
En el contexto de la presente invención, se
describe que el tratamiento para posibilitar el revelado
cromatográfico es un tratamiento para solubilizar, separar, o
cambiar a una partícula de tamaño pequeño un componente contenido
en la sangre entera y que tiene un tamaño de partícula mayor que un
tamaño de poro de la membrana de revelado para
inmunocromatografía.
Además, en el contexto de la presente invención,
se describe que la muestra obtenida a partir de sangre entera se
prepara pasando la sangre entera a través de un filtro para, de esta
forma, hemolizar la sangre entera y separar un componente contenido
en la sangre entera y que tiene un tamaño de partícula mayor que un
tamaño de poro de la membrana de revelado para
inmunocromatografía.
Además, en el contexto de la presente invención,
se describe que la muestra obtenida a partir de sangre entera se
prepara rompiendo bajo una alta presión o mediante ultrasonidos la
sangre entera para, de esta forma, hemolizar la sangre entera y
cambiar a una partícula de tamaño pequeño un componente contenido en
la sangre entera y que tiene un tamaño de partícula mayor que un
tamaño de poro de la membrana de revelado para
inmunocromatografía.
Además, en el contexto de la presente invención,
se describe que la muestra obtenida a partir de sangre entera se
prepara poniendo en contacto la sangre entera con un disolvente
orgánico para, de esta forma, hemolizar la sangre entera y
solubilizar un componente contenido en la sangre entera y que tiene
un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de la membrana
de revelado para inmunocromatografía.
La presente invención se refiere a un kit para
inmunocromatografía caracterizado porque comprende (1) una tira
para inmunocromatografía y (2) un líquido de dilución para la sangre
entera que contiene un detergente no iónico, en el que el líquido
de dilución contiene el detergente no iónico a una concentración tal
que, cuando la sangre entera se diluye con el líquido de dilución
para preparar una muestra para inmunocromatografía, se hemoliza la
sangre total.
De acuerdo con el procedimiento
inmunocromatográfico de la presente invención, no es necesario un
medio para evitar la hemolisis de la sangre entera, lo cual es
esencial en procedimientos convencionales. Además, puede medirse
inmunocromatográficamente una muestra de sangre entera a un bajo
coste mediante un tratamiento previo conveniente de la muestra
sangre entera y revelado inmunocromatográfico. Además, la muestra de
sangre entera puede medirse de manera conveniente y rápida, con
pocos efectos causados por variaciones en la viscosidad de la
sangre entera.
El problema anterior puede resolverse mediante
el procedimiento de la presente invención tal como se describe más
adelante. Es decir, la sangre entera se hemoliza, por ejemplo,
mediante solubilización o reventamiento de eritrocitos. Después de
que uno o más componentes que tienen un tamaño de partícula mayor
que un tamaño de poro de la membrana de revelado para
inmunocromatografía, los cuales están contenidos en la sangre
entera, son, por ejemplo, solubilizados, separados, o cambiados a
una partícula de tamaño pequeño, se revela la muestra obtenida de
la sangre entera. De esta forma, no ocurre la obstrucción de los
poros en la membrana de revelado inmunocromatográfico durante el
revelado. Después del revelado de la muestra obtenida de sangre
entera, se revela otro líquido sobre la membrana de revelado para
separar por lavado los componentes rojos (fundamentalmente
hemoglobina) generados por hemolisis, sobre la membrana de
revelado.
Un tamaño de poro de una membrana de revelado
comúnmente usado en inmunocromatografía es generalmente de
aproximadamente 2 a 20 \mum. Cuando las células de sangre (por
ejemplo, un eritrocito que tiene un diámetro de aproximadamente 8
\mum, un leucocito que tiene un diámetro mayor que el del
eritrocito, o una plaqueta que tiene un diámetro ligeramente menor
que el de un eritrocito) o agregados obtenidos a partir de fibrina
o fosfolípidos, se disuelven y solubilizan con un detergente no
iónico, la muestra tratada puede revelarse sobre una de dichas
membranas de revelado sin una obstrucción de los poros en la
membrana de revelado. La muestra obtenida de sangre entera causa la
coloración con rojo de la membrana de revelado inmunocromatográfico.
Los componentes rojos obtenidos de la sangre entera hemolizada
pueden separarse mediante lavado de la membrana de revelado, por
ejemplo, con un licor de lavado o un líquido que contiene un
substrato para un procedimiento de enzima. Después de lavado, puede
observase una línea de teñido para su enjuiciamiento, coloreada, por
ejemplo, por una reacción inmunológica o enzímica. La presente
invención está basada en los hallazgos anteriores.
En la etapa preparativa en el procedimiento de
la presente invención, no se limita particularmente un procedimiento
para la preparación de la muestra obtenida de sangre entera,
siempre y cuando que la sangre entera se hemolize usando un
detergente no iónico y pueda llevarse a cabo un tratamiento para
posibilitar el revelado cromatográfico.
El término "tratamiento para posibilitar el
revelado cormatográfico" tal como se usa aquí, significa un
tratamiento el cual posibilita un revelado cromatográfico sobre una
membrana de revelado inmunocromatográfico en la etapa de revelado
siguiente. Más particularmente, el tratamiento significa, pero sin
limitarse a ellos, un tratamiento para, por ejemplo, solubilizar,
separar, o cambiar a una partícula de tamaño pequeño un componente
contenido en la sangre entera y que tiene un tamaño de partícula
mayor que un tamaño de poro (preferiblemente el límite inferior de
tamaños de poros) de una membrana de revelado para
inmunocromatografía [por ejemplo, diversas células de sangre (tal
como un eritrocito, diversos leucocitos, o una plaqueta), membranas
obtenidas a partir de células de sangre hemolizada (tal como una
membrana de eritrocito, diversas membranas de leucocitos, o una
membrana de plaqueta), o agregados obtenidos a partir de fibrina o
fosfolípidos].
Como el procedimiento para la preparación de la
muestra obtenida de sangre entera tal como se describe y divulga en
el contexto de esta invención, puede mencionarse, por ejemplo, un
procedimiento que usa un detergente, un procedimiento que usa un
filtro, un procedimiento que usa la rotura bajo una alta presión o
ultrasonidos, o un procedimiento que usa un disolvente orgánico. En
la etapa preparativa, puede llevarse a cabo solamente uno
cualquiera de los procedimientos anteriores, o pueden llevarse a
cabo dos o más procedimientos como una combinación de los
mismos.
En el procedimiento que usa un detergente, la
muestra obtenida de sangre entera se prepara poniendo en contacto
la sangre entera extraída de un sujeto con un detergente para, de
esta forma, hemolizar la sangre entera y solubilizar uno o más
componentes que tienen un tamaño de partícula mayor que una membrana
de revelado inmunocromatográfico contenida en la sangre entera. En
el procedimiento que usa un detergente, los componentes que tienen
un tamaño de partícula mayor que el tamaño de poro de una membrana
de revelado inmunocromatográfico contenidos en la sangre entera son
solubilizados con el detergente. Como un resultado de ello, la
muestra obtenida de sangre entera puede revelarse en la etapa de
revelado siguiente sin obstrucción de los poros en la membrana de
revelado inmunocromatográfico.
Un detergente tiende a reunir en una intercara
entre dos substancias, y cambia las propiedades de la intercara.
Una molécula de detergente que tiene dichas propiedades está
compuesta de grupos que tienen características opuestas, es decir,
un grupo lipófilo y un grupo hidrófilo. Un detergente que puede
usarse en la presente invención no está particularmente limitado,
siempre y cuando que tenga dichas propiedades. Como el detergente,
se menciona un detergente no iónico.
Los detergentes no iónicos incluyen, por
ejemplo, polioxietileno alquiléter, polioxietileno alquilaliléter,
derivados de polioxietileno, éster de ácido graso de sorbitano,
éster de ácido graso de polioxietileno sorbitano, éster de ácido
graso de polioxietileno sorbitol, éster de ácido graso de glicerina,
polioxietileno alquilamina, y alquilalcanolamina.
En el procedimiento tal como se describe y
divulga en el contexto de la presente invención puede usarse, por
ejemplo, solamente uno cualquiera de dichos detergentes no iónicos,
pero sin limitarse a los detergentes no iónicos anteriormente
mencionados, o pueden usarse dos o más detergentes como una
combinación de los mismos. Además, el detergente(s) puede
usarse conjuntamente con un agente adicional tal como sales, urea,
y/o un disolvente orgánico, o un tratamiento adicional tal como
filtración (a través de un filtro), rotura bajo alta presión, o
ultrasonidos.
Cuando se usa el detergente no iónico, puede
seleccionarse de manera apropiada una concentración del mismo. Un
intervalo aplicable de concentración depende de cada detergente a
usar, y preferiblemente está alrededor de una concentración de
micela crítica o más que de una concentración de micela crítica. Un
líquido que contiene el detergen-
te(s) preparado ajustando una concentración de cada detergente se le denomina como un líquido detergente. Cuando una concentración de detergente en el líquido detergente es demasiado alta, la viscosidad del líquido detergente a veces llega a ser más alta que la de la sangre entera, dependiendo de las propiedades del detergente. En ese caso, es difícil mezclar la sangre entera con el líquido detergente, y como resultado de ello, la sangre entera no puede solubilizarse suficientemente. Por el contrario, cuando una concentración del detergente en el líquido detergente es demasiado baja, la solubilización de la sangre entera es a veces demasiado lenta o llega a ser imposible, y como un resultado de ello, el revelado inmunocromatográfico no puede llevarse a cabo normalmente.
te(s) preparado ajustando una concentración de cada detergente se le denomina como un líquido detergente. Cuando una concentración de detergente en el líquido detergente es demasiado alta, la viscosidad del líquido detergente a veces llega a ser más alta que la de la sangre entera, dependiendo de las propiedades del detergente. En ese caso, es difícil mezclar la sangre entera con el líquido detergente, y como resultado de ello, la sangre entera no puede solubilizarse suficientemente. Por el contrario, cuando una concentración del detergente en el líquido detergente es demasiado baja, la solubilización de la sangre entera es a veces demasiado lenta o llega a ser imposible, y como un resultado de ello, el revelado inmunocromatográfico no puede llevarse a cabo normalmente.
Más particularmente, cuando el monolaurato de
polioxietileno (Tween 20^{TM}; Sigma), un éster de ácido graso de
polioxietileno sorbitol clasificado dentro de un detergente no
iónico, se usa solo, una concentración final del mismo en la
reacción de hemolisis es preferiblemente de 2 hasta 30%, más
preferiblemente de 3 hasta 20%, lo más preferiblemente de 10 hasta
20%.
Cuando el éster
mono-para-iso-octilfenilo
de polietileno glicol (Triton X-100^{TM}; Sigma),
un polioxietileno alquiléter clasificado dentro de un detergente no
iónico, se usa solo, una concentración final del mismo en la
reacción de hemolisis es preferiblemente de 0,1 hasta 30%, más
preferiblemente de 0,3 hasta 20%, lo más preferiblemente de 0,5
hasta 10%.
Cuando el polioxietileno lauriléter (Emulgen
108^{TM}; Kao), un polioxietileno alquiléter clasificado dentro
de un detergente no iónico, se usa solo, una concentración final del
mismo en la reacción de hemolisis es preferiblemente de 0,01 hasta
20%, más preferiblemente de 1 hasta 20%, lo más preferiblemente de
2,5 hasta 10%.
Incluso si una concentración de detergente es
menor que los intervalos de concentración ejemplificados, pueden
obtenerse los mismos efectos usando diversos detergentes como una
combinación de los mismos. Por ejemplo, cuando cinco tipos
diferentes de detergentes (es decir, Emulgen 108, Triton
X-100, Tween 20, Amphitol 86B y CHAPS) se usan
independientemente solos al 0,1% como una concentración final en la
reacción de hemolisis, no puede llevarse a cabo la solubilización
de la sangre entera, el teñido inmunocromatográfico, y el revelado
inmunocromatográfico, tal como se muestra en el Ejemplo 1. Sin
embargo, cuando se usan los mismos detergentes como una combinación
de los mismos (cada concentración = 0,1%), puede llevarse a cabo la
solubilización de la sangre entera, el teñido inmunocromatográfico,
y el revelado inmunocromatográfico, tal como se muestra en el
Ejemplo 3.
Por el contrario, incluso si una concentración
de detergente es mayor que el intervalo de concentración
ejemplificado, pueden obtenerse los mismos efectos usando un
detergente comercialmente disponible diluido a una concentración
apropiada. Por ejemplo, cuando el éster
mono-para-iso-octilfenilo
de polietileno glicol (Triton X-100) se
comercializa como "Detergente X" (solución acuosa al 10%) y se
mezcla con un volumen igual de sangre entera, la concentración
final de "Detergente X" es del 50%, pero la
concentraciónsubstancial de Triton X-100 es del 5%,
y como un resultado de ello, pueden obtenerse los mismos
efectos.
Como un disolvente para la dilución del
detergente, puede usarse no solamente una solución acuosa al 100%,
sino también un líquido que contenga un disolvente orgánico para la
hemolisis y el revelado inmunocromatográfico. Por ejemplo, el PB40
es una solución al 40% de cloruro de paramitil trimetil amonio, que
contiene 20 hasta 30% de isopropanol.
Una concentración preferida varía de acuerdo,
por ejemplo, con un tratamiento previo de la sangre entera, los
procedimientos opcionales ejemplificados anteriormente, y/o las
propiedades de un ensayo inmunocromatográfico, y en consecuencia,
la concentración del detergente no está limitada a los intervalos
ejemplificados anteriores.
Una cierta relación del líquido detergente a la
sangre entera es un factor importante para un revelado
inmunocromatográfico normal. Cuando la relación del líquido
detergente (es decir, el contenido en detergente) es demasiado baja,
los componentes contenidos en la sangre entera no son a veces
suficientemente solubilizados, y como un resultado de ello, se
inhibe un revelado inmunocromatográfico normal. Además, se prefiere
un contenido incrementado del líquido detergente para un revelado
inmunocromatográfico normal y estable en un tiempo más corto. Por
el contrario, cuando la relación del líquido detergente es demasiada
alta, la relación de sangre entera disminuye relativamente, y como
un resultado de ello, se reduce a veces la sensibilidad en la
medición. Una relación aplicable del líquido detergente a la sangre
entera depende de cada detergente a usar o de una concentración del
mismo, y la relación (S/WB) del líquido detergente (S) a la sangre
entera (WB) es preferiblemente de 1/10 (v/v) o mayor.
Además de los efectos anteriores, una
concentración del líquido detergente o una relación del mismo a la
sangre entera afecta a veces una inhibición de las reacciones en
inmunocromatografía o a un incremento en el valor de fondo obtenido
a partir del teñido no específico. Por ello, se prefiere seleccionar
las condiciones óptimas (tal como un detergente a usar, una
concentración del mismo, una relación del mismo a la sangre entera,
o un tiempo de mezclado) de acuerdo, por ejemplo, con un
procedimiento de medición, un producto a medir, o un tiempo de
medición.
A veces, un cierto detergente inhibe diversas
reacciones de unión (tal como una reacción
antígeno-anticuerpo), reacciones de enzimas, o
propiedades del coloide de oro o similar sobre la
inmunocromatografía, incluso si el detergente se usa a una
concentración capaz de realizar el revelado inmunocromatográfico.
Para determinar una concentración óptima del mismo, se prefiere
examinar de manera independiente y cuidadosa las condiciones
óptimas con respecto a cada inmunocromatografía y/o cada producto a
medir.
En el procedimiento que usa un filtro, la
muestra obtenida de sangre entera se prepara pasando la sangre
entera extraída de un sujeto a través de un filtro para, de esta
forma, hemolizar la sangre entera y separar uno o más componentes
que tienen un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de una
membrana de revelado inmunocromatográfico contenidos en la sangre
entera. En el procedimiento que usa un filtro, los componentes que
tienen un tamaño de poro mayor que un tamaño de poro de una membrana
de revelado inmunocromatográfico contenidos en la sangre entera son
separados por el filtro. Como un resultado de ello, la muestra
obtenida de sangre entera puede revelarse en la etapa de revelado
siguiente sin una obstrucción de los poros en la membrana de
revelado inmunocromatográfico.
Como un filtro que puede usarse en la etapa
preparativa, puede mencionarse, por ejemplo, un filtro de
jeringuilla. Una vez que la sangre entera se ha recogido en una
jeringuilla apropiada [por ejemplo, jeringuilla de 1 ml (Terumol)]
mediante un tubo, se sujeta un filtro de jeringuilla a la parte
superior de la jeringuilla, y la sangre entera de la jeringuilla
puede filtrarse a través del filtro de jeringuilla por presión.
Mediante la presión durante la filtración, las células de sangre se
rompen, los agregados que tienen un tamaño mayor que un tamaño de
poro del filtro (por ejemplo, fragmentos de membrana obtenidos a
partir de eritrocitos rotos, o agregados obtenidos a partir de de
lípidos o similares) se separan, y solamente las partículas que
tienen un tamaño menor que un tamaño de poro del filtro se recogen
en un filtrado resultante. Un tamaño de poro del filtro es
preferiblemente menor que un tamaño de poro (más preferiblemente que
el límite inferior de los tamaños de los poros) de una membrana de
revelado para inmunocromatografía. Por ejemplo, cuando un tamaño de
poro promedio de una membrana de revelado inmunocromatográfico es
de 5 \mum, un tamaño de poro del filtro es preferiblemente menor
de 5 \mum. Cuando los tamaños de poros de una membrana de revelado
inmunocromatográfico son de 5 hasta 8 \mum, un tamaño de poro del
filtro es preferiblemente de 5 \mum o menor. En relación con
esto, el tamaño de poro de una membrana de revelado
inmunocromatográfico significa un intervalo que contiene
aproximadamente el 80% de todos los tamaños de poros, y el tamaño de
poro de un filtro significa el tamaño de poro máximo.
En el procedimiento que usa la rotura bajo una
alta presión o ultrasonidos, la muestra obtenida de sangre entera
se prepara rompiendo bajo una alta presión o ultrasonidos la sangre
entera extraída de un sujeto para, de esta forma, hemolizar la
sangre entera y cambiar a uno o más componentes de partículas de
pequeño tamaño que tienen un tamaño de partícula mayor que un
tamaño de poro de una membrana de revelado inmunocromatográfico
contenidos en la sangre entera. En el procedimiento que usa la
rotura bajo una alta presión o ultrasonidos, los componentes que
tienen un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de una
membrana de revelado inmunocromatográfico contenidos en la sangre
total, se cambian a una partícula de pequeño tamaño mediante rotura
bajo una alta presión o ultrasonidos. Como un resultado de ello, la
muestra obtenida de sangre entera puede revelarse en la etapa de
revelado siguiente sin una obstrucción de los poros en la membrana
de revelado inmunocromatográfico.
Como los ultrasonidos que pueden usarse en la
etapa preparativa, pueden mencionarse por ejemplo, un tratamiento
supersónico comúnmente usado para la rotura de células. Como la
rotura bajo una alta presión, puede mencionarse, por ejemplo, un
aparato para la presión de carga tal como una prensa Francesa. La
prensa Francesa puede cargar una alta presión a una muestra que
contiene células, y puede romper células mediante una reducción
drástica de la presión al mismo tiempo que se recoge una porción de
la muestra. En consecuencia, la prensa Francesa es útil en la
rotura y dispersión de los componentes que tienen un tamaño de
partícula mayor que un tamaño de poro de una membrana de revelado
inmunocromatográfico contenidos en la sangre entera.
El procedimiento para la preparación de la
muestra obtenida de sangre entera tal como se describe y divulga en
el contexto de la presente invención, no está particularmente
limitado, siempre y cuando que este pueda hemolizar la sangre
entera, y los componentes anteriores contenidos en la sangre entera
puedan solubilizarse, cambiarse a una partícula de tamaño pequeño,
o separarse.
Un disolvente orgánico que puede usarse en la
etapa preparativa no está particularmente limitado, siempre y
cuando este pueda hemolizar la sangre entera, y los componentes que
tienen un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de una
membrana de revelado inmunocromatográfico contenidos en la sangre
entera puedan solubilizarse. Como el disolvente orgánico, puede
mencionarse, por ejemplo, cetonas (tal como acetona), alcoholes
(tal como metanol, etanol, o 2-propanol), o
acetonitrilo. Una concentración del disolvente orgánico puede
seleccionarse de manera apropiada de acuerdo con un disolvente
orgánico a usar o las condiciones (por ejemplo, condiciones cuando
se mezcla con sangre entera, o condiciones experimentales en
inmunocromatografía o de medición), tal como se ha descrito
previamente en la sección anterior de detergentes.
La etapa de revelado en el procedimiento tal
como se describe en el contexto de la presente invención, puede
llevarse a cabo de acuerdo con una etapa de revelado en un
procedimiento inmunográfico convencional, excepto que se use la
muestra obtenida de sangre entera obtenida en la etapa preparativa.
En la muestra obtenida de sangre entera usada en la etapa de
revelado, los componentes que pueden causar la obstrucción de los
poros en la membrana de revelado inmunocromatográfico, son
previamente solubilizados, separados, o cambiados a una partícula
de pequeño tamaño. En consecuencia, el revelado inmunocromatográfico
puede llevarse a cabo sin una obstrucción de los poros en la
membrana de revelado inmunocromatográfico.
Después de la etapa de revelado, la membrana de
revelado inmunocromatográfico se colorea con pigmentos rojos
obtenidos a partir de eritrocitos rotos en la sangre entera, y por
ello, es difícil observar el teñido de una línea de enjuiciamiento
o similar. En consecuencia, después de la etapa de revelado, en la
etapa de separación en el procedimiento de la presente invención,
se revela otro líquido sobre la membrana de revelado
inmunocromatográfico para separar los pigmentos rojos de la
membrana de revelado inmunocromatográfico.
El líquido para la separación de los pigmentos
rojos (referido aquí en adelante como líquido de separación) no
está particularmente limitado, siempre y cuando este pueda separar
los pigmentos rojos mediante su revelado sobre la membrana de
revelado inmunocromatográfico. Como el líquido para la separación de
los pigmentos rojos, puede usarse un líquido de lavado para
simplemente la separación por lavado de los pigmentos rojos (por
ejemplo, agua o un tampón). En un caso (tal como una
inmunocromatografía de enzima) en el cual se revela un substrato
para la coloración enzímica después del primer revelado, puede
usarse un líquido conteniendo un líquido como el líquido de
separación para la separación por lavado de los pigmentos rojos.
El inicio del revelado del líquido de separación
no está particularmente limitado, siempre y cuando la muestra
obtenida de sangre entera esté suficientemente revelada y los
pigmentos rojos puedan separarse. Generalmente, después de que
comienza el revelado de la muestra obtenida de sangre entera, puede
pararse el revelado del líquido de separación. Además, el revelado
del líquido de separación puede pararse justamente antes del inicio
del revelado de la muestra obtenida de sangre entera, seleccionando
apropiadamente la posición de inicio de cada revelado.
El kit tal como se divulga en el contexto de la
presente invención para inmunocromatografía comprende al menos (1)
una tira para inmunocromatografía y (2) un líquido de dilución para
la sangre entera que contiene un detergente. Como el detergente,
puede usarse un detergente usado en la etapa preparativa. Una
concentración del detergente contenido en el líquido de dilución
para la sangre entera no está particularmente limitada, siempre y
cuando que cuando la sangre entera se diluya con él para preparar
una muestra para inmunocromatografía (es decir, la muestra obtenida
de sangre entera), pueda hemolizarse la sangre entera.
El líquido de dilución para la sangre entera
puede contener además una substancia (tal como un anticuerpo o un
antígeno) el cual se une específicamente a un analito en una muestra
(es decir, sangre entera) y/o un agente (tal como proteínas,
azúcares, o compuestos de alto peso molecular) para la
estabilización de reactivos.
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La presente invención se ilustrará ahora
adicionalmente, pero sin manera alguna limitarla, mediante los
Ejemplos siguientes.
En este ejemplo, la sangre entera se hemolizó y
solubilizó con diversos detergentes para preparar muestras
obtenidas de sangre entera, y las muestras obtenidas de sangre
entera resultantes se sometieron a un procedimiento
inmunocromatográfico de enzima para medir la IgE específica, de
acuerdo con los procedimientos siguientes.
Se cortó una membrana de nitrocelulosa (HF180;
tamaño de poro = 5 hasta 8 \mum; Millipore) en una pieza
rectangular (5 mm x 25 mm). Se aplicó linealmente una solución
acuosa de proteínas de alérgeno de ácaro extraídas (1 mg/ml) con
una anchura de 1 mm en la posición de 15 mm a partir de un extremo
(corriente arriba) de la membrana. En este caso, la solución acuosa
se preparó previamente diluyendo un extracto de Dermatophagoides
pteronyssinus (Glia) con 5 mmol/l de un tampón de borato (pH
8,5) y dializando la solución diluida.
La membrana se dejó reposar a temperatura
ambiente durante una hora seguida de reposo a 37ºC durante 30
minutos para inmovilizar las proteínas de ácaro extraídas sobre la
membrana. La membrana se mantuvo en un desecador de gel de sílice a
temperatura ambiente durante una noche para obtener una membrana
inmovilizada con alérgeno de ácaro.
Se digirió con pepsina un anticuerpo monoclonal
de ratón de IgE anti-humano. Después de reducir la
mezcla de reacción con 2-mercaptoetilamina, se
llevó a cabo una filtración por gel para obtener un fragmento Fab'
purificado (1 mg).
Mientras tanto, se diluyó fosfatasa alcalina
intestinal bovina (2 mg) con un tampón de fosfato hasta una
concentración de 2 mg/ml. Después de diálisis, la solución diluida
se mezcló con 100 \mul de 7,5 mmol/l de
N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato
(SPDP). Después de llevar a cabo la reacción a 4ºC durante 5 horas,
el conjunto se dializó en un tampón de fosfato para obtener
fosfatasa alcalina unida a piridiltiopropionato (PDP).
Después de mezclar el anticuerpo Fab'
anti-IgE (1 ml) con un volumen igual de la fosfatasa
alcalina unida a PDP (1 ml), se agregaron adicionalmente 40 \mul
de 1 mol/l de hidroxilamina. Después de llevar a cabo la reacción a
4ºC durante 3 días, se separaron el anticuerpo Fab'
anti-IgE y la fosfatasa alcalina unida a PDP sin
reaccionar mediante filtración por gel usando una columna de
filtración por gel (TSgel^{TM} G3000SW; Toso) para obtener una
solución de anticuerpo anti-IgE marcado con
enzima.
Después de que la solución de anticuerpo
anti-IgE marcado con enzima preparado en el Ejemplo
1(1-2) se diluyera con 5 mmol/l de tampón de
fosfato (pH 7,2) conteniendo sacarosa al 5,0%, se pulverizaron 10
\mul de la solución diluida (1 \mug de anticuerpo) en un
relleno adsorbente (5 mm x 5 mm, PREM1420; Pole). El relleno se secó
en un desecador de gel de sílice a temperatura ambiente bajo
presión reducida (no superior a 13,3 kPa) durante una noche, para
obtener un relleno de anticuerpo marcado con enzima.
Se cortó un relleno de fibra de vidrio en una
pieza rectangular (5 mm x 18 mm). La pieza se sumergió en una
solución acuosa que contenía sacarosa al 0,5%, Tween 20 al 0,2%, y
alcohol polivinílico al 0,1% (grado de polimerización =
aproximadamente 500). Después de eliminar un exceso de líquido de la
pieza, la pieza se secó al aire para obtener un relleno para la
recepción de una muestra.
Se cortó un relleno de celulosa (AP25;
Millipore) en una pieza rectangular (5 mm x 25 mm) para obtener un
relleno adsorbente.
Se cortó una lámina adhesiva de plástico
(BioDot) en una pieza rectangular (5 mm x 60 mm). A la lámina
adhesiva, se unieron el relleno para la recepción de la muestra
[preparado en el Ejemplo 1(1-4)], el
anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (AP) [preparado en el
Ejemplo 1(1-3)], la membrana inmovilizada con
alérgeno de ácaro [preparada en el Ejemplo
1(1-1)], y el relleno adsorbente [preparado
en el Ejemplo 1(1-5)], en este orden en la
dirección de corriente arriba a corriente abajo con respecto a la
dirección de revelado, para obtener una tira para
inmunocromatografía. En este caso, las piezas adyacentes unidas
sobre la lámina adhesiva se solaparon una con otra a una anchura de
aproximadamente 1 mm.
Se prepararon agua desionizada, solución salina
fisiológica (150 ml/l de cloruro sódico líquido), y 10 mmol/l de un
tampón de fosfato (pH 7,5, 150 mmol/l de cloruro sódico). Se
diluyeron independientemente Triton X-100 (Sigma),
Tween 20 (Sigma), dodecil sulfato sódico, Emulgen 108 (Kao), PB40
(NOF Corporation), Amphitol 86B (Kao), y CHAPS (Dojindo) con el
tampón de fosfato anterior hasta las concentraciones de 0,2%, 1,0%,
5,0%, y 20%.
Se mezcló sangre entera humana (100 \mul)
recogida usando un tubo que contenía anticoagulante de heparina con
un volumen igual de de cada líquido detergente (100 \mul) para
preparar cada muestra. Después de 10 minutos a partir del mezclado,
se observó visualmente la hemolisis en cada muestra. La
"hemolisis" se juzgó sobre la base de un estado transparente
causado por una solubilización de la membrana eritrocítica y elución
de los pigmentos rojos, tal como la hemoglobina procedente de
eritrocitos.
Cada parte alícuota (50 \mul) de muestras
obtenidas de sangre entera preparadas mediante hemolisis y
solubilización se dispensó dentro de cada pocillo de una
microplaca. La tira para inmunocromatografía se colocó de manera
que el relleno de recepción de la muestra se introdujera dentro del
pocillo, y se produjera un revelado cromatográfico de las muestras
mediante un fenómeno capilar. Después de 10 minutos a partir del
comienzo del revelado, se revelaron cromatográficamente 200 \mul
de una solución de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfórico
(BCIP; Boeringer Mannheim).
Al igual que con las muestras anteriores, se
usaron la muestra 1 (IgE específica de ácaro = 0 IU/ml), muestra 2
(IgE específica de ácaro = 3 IU/ml), y muestra 3 (IgE específica de
ácaro = 10 IU/ml). Las cantidades de IgE específica de ácaro se
midieron mediante un análisis cuantitativo convencional (kit de
medición de anticuerpo IgE específica AlaSTAT; obtenido de Latron y
fabricado por DPC, US) y medido en IU/ml, una unidad patrón
internacional.
Después del revelado cromatográfico, se juzgó
visualmente un grado de teñido sobre el área inmovilizada con
alérgeno (la banda que tiene una anchura de 1 mm), y los resultados
se muestran en las Tablas 1 a 8. Los símbolos "-",
"\pm", "+", y "++" en las Tablas 1 a 8 (y en las
Tablas 9 a 19 descritas más adelante) significan "no
coloreado", "ligeramente coloreado", "claramente
coloreado", y "fuertemente coloreado", respectivamente. Una
concentración de cada líquido detergente en las Tablas muestra una
concentración del mismo usada en el Ejemplo
1(2-2), y en consecuencia, la concentración
final del mismo en la reacción de hemolisis fue la mitad de la
concentración mostrada en las Tablas.
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En este ejemplo, la sangre entera se hemolizó y
solubilizó con diversos detergentes para preparar muestras
obtenidas de sangre entera, y la IgE específica se midió mediante un
procedimiento inmunocromatográfico de coloide de oro, de acuerdo
con los procedimientos siguientes.
De acuerdo con el procedimiento mostrado en el
Ejemplo 1(1-1), se preparó una membrana
inmovilizada con alérgeno de ácaro pulverizando una solución acuosa
de proteínas de alérgeno de ácaro extraídas sobre una membrana de
nitrocelulosa linealmente con una anchura de 1 mm.
Se diluyó un anticuerpo monoclonal de IgE de
ratón anti-humano (1 mg) con un tampón de fosfato (2
mmol/l, pH 7,0) hasta una concentración de 0,1 mg/ml, y la solución
diluida se dializó. Mientras se agitaban 100 ml de una suspensión
de coloide de oro (GOLD COLLOID 20; British BioCell International),
se agregaron gota a gota a la suspensión 10 ml de la solución
acuosa de anticuerpo monoclonal de IgE de ratón
anti-humano. Después de agitación a temperatura
ambiente durante 10 minutos, se agregaron además gota a gota
mientras se agitaba 10 ml de albúmina de suero bovino al 10% (BSA,
A-7888; Sigma). Después de agitación a temperatura
ambiente durante 10 minutos, se agregaron además 15 ml de una
solución acuosa que contenía sacarosa al 5% y Tween 20 al 0,2%. El
conjunto se mezcló y centrifugó a 16.000 xg durante una hora a 10ºC
para separar un sobrenadante.
El anticuerpo precipitado remanente marcado con
coloide de oro se volvió a suspender en 100 ml de un tampón de
bórax (pH 8,0) que contenía sacarosa al 0,5% y Tween 20 al 0,02%. El
conjunto se centrifugó a 16.000 xg durante una hora a 10ºC para
separar el sobrenadante. El anticuerpo precipitado marcado con
coloide de oro se volvió a suspender en 100 ml de un tampón de
bórax (pH 8,0) que contenía sacarosa al 0,5% y Tween 20 al 0,02%, y
el conjunto se centrifugó a 16.000 xg durante una hora a 10ºC para
separar el sobrenadante. El anticuerpo precipitado marcado con
coloide de oro se volvió a suspender en el tampón de bórax (pH 8,0)
que contenía sacarosa al 0,5% y Tween 20 al 0,02%, de manera tal
que la densidad de la partícula pasó a ser de aproximadamente
10^{13}/ml (absorbancia a una longitud de onda de 520 nm =
aproximadamente 14), para obtener una suspensión del anticuerpo
anti-IgE marcado con coloide de oro.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1(1-3), excepto que se usó la
suspensión preparada en el Ejemplo 2(1-2)
del anticuerpo anti-IgE marcado con coloide de oro,
para obtener un relleno que contenía el anticuerpo marcado con
coloide de oro.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1(1-6), excepto que se usó el relleno
preparado en el Ejemplo 2(1-2) que contenía
el anticuerpo marcado con coloide de oro, para obtener una tira para
inmunocromatografía de coloide de oro.
De acuerdo con el procedimiento mostrado en el
Ejemplo 1(2-1), se prepararon diversas
soluciones. De acuerdo con el procedimiento mostrado en el Ejemplo
1(2-2), se mezcló sangre entera humana (100
\mul) con un volumen igual de cada solución (100 \mul) para
preparar cada muestra, y se observó la hemolisis en cada
muestra.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1(2-3), excepto que la tira para
inmunocromatografía de enzima se reemplazó por la tira para
inmunocromatografía de coloide de oro preparada en el Ejemplo
2(1-4), y la solución de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfórico
(BCIP; Boeringer Mannheim) se reemplazó por un tampón de fosfato,
para llevar a cabo el procedimiento inmunocromatográfico de coloide
de oro.
Después del revelado cromatográfico, se juzgó
visualmente un grado de coloración sobre el área inmovilizada con
alérgeno (la banda que tiene una anchura de 1 mm), y los resultados
se muestran en las Tablas 9 a 16.
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En este ejemplo, la sangre entera se hemolizó y
solubilizó con líquidos mezclados que contenían cinco detergentes a
la misma concentración, para preparar muestras obtenidas de sangre
entera, y la IgE específica se midió mediante un procedimiento
inmunocromatográfico de enzima, de acuerdo con los procedimientos
siguientes.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1(1), para preparar una tira para inmunocromatografía
de enzima.
Se prepararon cuatro tipos de líquidos mezclados
conteniendo cada uno cinco detergentes (Triton
X-100, Tween 20, Emulgen 108, Amphitol 86B, y
CHAPS) a la misma concentración (concentración = 0,04, 0,2, 1 ó 4%),
usando 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,5, 150 mmol/l de
cloruro sódico). Las concentraciones totales de los cinco
detergentes en los cuatro líquidos mezclados fueron 0,2, 1,0, 5,0, y
20%, respectivamente. De acuerdo con el procedimiento mostrado en
el Ejemplo 1(2-2), se mezcló sangre entera
humana (100 \mul) con un volumen igual de cada líquido mezclado de
detergentes (100 \mul), para preparar cada muestra, y se observó
la hemolisis en cada muestra.
De acuerdo con el procedimiento mostrado en el
Ejemplo 1(2-3), se llevó a cabo una medición
inmunocromatográfica y un juicio visual. Los resultados se muestran
en la Tabla 17. Cada concentración mostrada en la Tabla significa
una concentración de cada detergente contenido en cada líquido
mezclado usado en el Ejemplo 3(2).
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(Comparativo)
En este ejemplo, se usó un filtro de jeringuilla
para hemolizar la sangre entera y separar los componentes
contenidos en la sangre entera que tenían un tamaño mayor que un
tamaño de poro del filtro, y la muestra obtenida de sangre entera
se usó para medir la IgE específica mediante una inmunocromatografía
de enzima.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1(1), para preparar una tira para preparar una tira
para inmunocromatografía [membrana de nitrocelulosa = HF180 (tamaño
de poro = 5 a 8 \mum)]. Se repitió el mismo procedimiento,
excepto que la HF180 se reemplazó por HF240 (tamaño de poro = 3 a 5
\mum), para preparar otra tira para inmunocromatografía. Cada
tamaño de poro significa un intervalo que contiene aproximadamente
80% de todos los tamaños de poros.
La sangre entera humana recogida usando un tubo
que contenía un anticoagulante (heparina), se filtró a través de un
filtro de jeringuilla de 5 \mum (Sartorius), un filtro de
jeringuilla de 3 \mum (Adavantec), un filtro de jeringuilla de 1,
2 \mum (Sartorius), un filtro de jeringuilla de 0,8 \mum
(Advantec), o un filtro de jeringuilla de 0,2 \mum (Advantec)
para recoger cada filtrado. En este caso, el diámetro de cada
filtro de jeringuilla fue de 26 mm. Después de la filtración, se
observó visualmente la hemolisis. El tamaño de poro de cada filtro
significa el tamaño de poro máximo.
Se usaron dos tiras de inmunocromatografía de
enzima preparadas en el Ejemplo 4(1) para revelar cada
filtrado mediante inmunocromatografía de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo
1(2-3).
Después del revelado, se revelaron
cromatográficamente 200 \mul de una solución de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfórico
(BCIP; Boeringer Mannheim), de acuerdo con el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1(2-3). En este caso,
se usaron las mismas muestras que las descritas en el Ejemplo
1(2-3).
Después del revelado cromatográfico, se juzgó
visualmente un grado de coloración sobre el área inmovilizada con
alérgeno (la banda que tiene un ancho de 1 mm), y los resultados se
muestran en las Tablas 18 y 19.
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El procedimiento inmunocromatográfico de la
presente invención puede aplicarse al análisis de una muestra de
sangre entera.
Claims (2)
1. Un procedimiento inmunocromatográfico
caracterizado por comprender las etapas de:
(1) preparación de una muestra obtenida a partir
de sangre entera mediante hemolisis de la sangre entera y un
tratamiento para posibilitar el revelado cromatográfico,
(2) revelado de la muestra resultante sobre una
membrana de revelado para inmunocromatografía, y
(3) revelado de un líquido de lavado sobre la
membrana de revelado para inmunocromatografía, con el fin de
separar, de esta forma, un pigmento rojo obtenido del eritrocito de
la membrana de revelado para inmunocromatografía,
en el que la muestra obtenida a partir de sangre
entera se prepara poniendo en contacto la sangre entera con un
detergente no iónico, con el fin de hemolizar la sangre entera y
solubilizar un componente contenido en la sangre entera, teniendo
dicho componente un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro
de la membrana de revelado para inmunocromatografía.
2. Un kit para inmunocromatografía
caracterizado porque comprende
(1) una tira para inmunocromatografía y
(2) un líquido de dilución para la sangre entera
que contiene un detergente no iónico,
en el que el líquido de dilución contiene el
detergente iónico a una concentración tal que cuando la sangre
entera se diluye con el líquido de dilución para preparar una
muestra para inmunocromatografía, se hemoliza la sangre total.
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