ES2335269T3 - Glicopeptidos inmunogenos, cribado, preparacion y aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Glicopéptido inmunógeno de 15 a 39 aminoácidos procedentes de M. tuberculosis, con excepción del glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:1, dicho glicopéptido comprende un epítope T glicosilado de 14 a 25 aminoácidos, entre los cuales al menos un aminoácido neutro está unido a una di- o a una trimannosa y al menos el 15% de entre dichos aminoácidos son prolinas, estando una de las prolinas situada en posición -1 a -4, respecto de la posición de dicho aminoácido neutro, y dicho glicopéptido es: - presentado mediante una molécula de clase II del CMH, - reconocido específicamente por linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con la glicoproteína nativa de la cual procede, pero no es reconocido por los linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con un péptido no glicosilado de igual secuencia y - capaz de inducir una proliferación de dichos linfocitos T CD4+ por los cuales es reconocido y la secreción de citoquinas por dichos linfocitos.
Description
Glicopéptidos inmunógenos, cribado, preparación
y aplicaciones.
La presente invención se refiere a glicopéptidos
inmunógenos procedentes de Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis) útiles para la vacunación y el diagnóstico de
infecciones debidas a este microorganismo patógeno, así como a sus
procedimientos de selección y de preparación.
La infección por M. tuberculosis es una
de las infecciones más graves en medicina humana. En efecto, del 5
al 10% de las personas infectadas por M. tuberculosis que
tienen una respuesta inmunitaria normal desarrollan una enfermedad
grave (tuberculosis); esta frecuencia es aun más elevada en las
personas que tienen un déficit de su respuesta inmunitaria
(infección por el VIH, tratamiento por inmunodepresores, etc...)
Los medios aplicados para prevenir y tratar esta
infección comprenden por una parte la identificación que permite el
seguimiento y el tratamiento de la infección y por otra parte la
vacunación.
Entre las diferentes técnicas actualmente
disponibles, se pueden citar:
- -
- la obtención de cultivos puros de M. tuberculosis, que es el medio más riguroso para realizar el diagnóstico de certitud de la tuberculosis. Es una técnica medianamente sensible que permite el diagnóstico para las 2/3 de los casos de tuberculosis pulmonar. Los resultados no están disponibles más que después de un plazo mínimo de 3-4 semanas, a veces solamente después de 2 meses de cultivo. El uso de técnicas de cultivo que emplean precursores marcados permite acortar estos plazos que siguen siendo sin embargo importantes. Esta puesta en evidencia de M. tuberculosis por cultivo necesita una toma de muestra que contiene bacilos, a veces difícil de obtener incluso para la tuberculosis pulmonar donde aproximadamente el 1/3 no recibe confirmación biológica. A veces este examen necesita una intervención médica especializada (punción lumbar del líquido cefalorraquídeo o biopsia ganglionar) para formas extrapulmonares de la enfermedad.
- -
- las técnicas microbiológicas basadas en la genética molecular (PCR) se enfrentan a la misma necesidad de obtener una toma de muestra que contiene bacterias. Por otra parte, debido al hecho de la presencia en la toma de muestra de inhibidores de la reacción PCR cuyo origen es imposible controlar, estas técnicas a veces no se pueden utilizar. Su validación en la práctica corriente no se ha obtenido.
- -
- Actualmente no existe serodiagnóstico que posea una sensibilidad y una especificidad compatibles con un uso diagnóstico.
- -
- la reacción a la tuberculina muestra que un sujeto se ha sensibilizado, se ha infectado por M. tuberculosis o se ha vacunado por BCG. La tuberculina es en efecto una mezcla de antígenos de M. tuberculosis y por lo tanto es incapaz de realizar el diagnóstico entre una infección por M. tuberculosis y la vacunación por el BCG debido a reacciones cruzadas muy numerosas entre los antígenos de la vacuna y M. tuberculosis. Por otra parte, esta reacción a la tuberculina no permite distinguir una tuberculosis, enfermedad activa, de una infección por M. tuberculosis.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacunación por el BCG permite controlar la
infección primaria (multiplicación inicial de M.
tuberculosis) pero sobre todo la diseminación secundaria de
estos bacilos. Contribuye verdaderamente a reducir la incidencia de
las infecciones latentes contra las cuales ningún tratamiento eficaz
está actualmente disponible. El BCG se ha utilizado para vacunar
más de tres mil millones de individuos contra la tuberculosis, sin
efectos secundarios particulares. Con ocasión de la vacunación por
el BCG hay una multiplicación local de estos bacilos de virulencia
atenuada. Se induce una inmunidad celular. Se traduce por una
hipersensibilidad de tipo retardada (HSR) dirigida contra las
proteínas, antígenos, de micobaterias, es la reacción a la
tuberculina, y por una mayor resistencia a la infección por M.
tuberculosis. Estas dos respuestas inmunitarias (sensibilización
de tipo HSR y mayor resistencia) tienen como soportes linfocitos T
que reaccionan con antígenos de micobacterias.
El BCG protege bien contra las formas agudas de
la infección (meningitis tuberculosa del niño, por ejemplo). Su
eficacia es más variable en los adultos). La existencia de una
reactividad cruzada entre el BCG y otras micobacterias no pertenece
al complejo tuberculosis así como la ausencia, en el genoma
de BCG, de algunos antígenos inmunógenos de Mycobacterium
tuberculosis o un perfil de expresión diferente de estos
antígenos en el transcurso de la infección podría explicar la
eficacia variable del BCG.
Además, el BCG es una cepa viva de virulencia
atenuada. Posee por lo tanto un poder patógeno residual que prohíbe
el uso en los individuos inmunodeprimidos, especialmente en los
sujetos reconocidos por estar infectados por el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH).
Para combatir más eficazmente esta infección,
sería juicioso disponer de herramientas diagnósticas y de vacunas,
especialmente de una vacuna "subunidad", y por lo tanto sin
riesgo, a base de antígenos protectores del microorganismo patógeno
responsable de esta infección.
Se han hecho en este sentido un cierto número de
estudios para encontrar la o las moléculas de este microorganismo
patógeno, susceptible(s) de inducir una fuerte respuestas
inmunitaria protectora. De este modo, J. Hess et al. (C.R.
Acad. Sci. Paris, 1999, 322: 953-958) se han
centrado en las propiedades que deberían tener antígenos aptos para
ser utilizados como vacuna contra la tuberculosis. En esta revista,
subrayan la importancia de usar una combinación de antígenos
previamente seleccionados en vez de un único antígeno. Recomiendan
especialmente seleccionar estos antígenos sobre la base de
criterios tales como la presencia de zonas altamente conservadas
entre las diferentes cepas, las diferencias en el perfil de
expresión de los genes de zonas altamente conservadas entre las
diferentes cepas, las diferencias en el perfil de expresiones de los
genes de las cepas virulentas y de las cepas atenuadas, la
reactividad respecto de las células efectoras de la respuesta
inmunitaria (linfocitos B, T, CD4+, T, CD8+), la capacidad de estos
antígenos a ligarse a una mayoría de las moléculas HLA del complejo
mayor de histocompatibilidad (CMH).
Algunos de estos antígenos están presentes en
forma de antígenos secretados: MPT59 (30kDa), 85A (32 kDa), MPT64
(23 kDa), hsp71 (71 kfa), MPT51 (24 kDa), MPT63 (16kDa) y
ESAT-6 (6 kDa). (Andersen, Infect. Immun, 1994, 62,
2536-2544; Horwitz et al., PNAS, 1995, 92,
1530-1534). Estos antígenos de M.
tuberculosis ya se han propuesto como potenciales candidatos de
una composición de vacuna ya que son reconocidos preferentemente
por linfocitos T CD4+ (Andersen, et al. anteriormente citada;
Hortwitz et al. anteriormente citado).
Igualmente se ha propuesto aislar, a partir de
los antígenos de M. tuberculosis, péptidos que contienen
epítopes capaces de ser presentados por una molécula de clase II
del CMH y de ser reconocidos por los linfocitos T CD4+ específicos;
tales epítopes han sido sin embargo reseñados para dos proteínas:
ESAT-6 (Olsen et al., Eur. j. Immunol., 2000,
30, 1724-1732) y MPT-39 (Mustafa
et al., Inf. Immunol., 2000, 68,
2933-3940).
Se han hecho diversas observaciones por los
Inventores (Romains et al., Inf Immun. 1993, 61
742-750; Romain et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 1993, 90: 5322-5326):
- -
- solo las bacterias vivas son susceptibles de inducir una inmunidad protectora, induciendo también las bacterias matadas una respuesta inmunitaria, pero sin protección;
- -
- existe en el medio de cultivo proteínas liberadas por bacterias en el transcurso de su crecimiento y susceptibles de ser reconocidas por el sistema inmunitario de animales vacunados con bacterias vivas, proteínas que no son lo si o son son muy poco reconocidas después de la inmunización por bacterias matadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Gracias a este doble criterio, se han purificado
dos proteínas nuevas. Una proteína secretada por M.
tuberculosis, denominada Apa, o MPT-32 o
complejo antigénico de 45/47 kDa, es el producto del gen Rv 1860
(Laqueryrie et al. Infect. Immun. 1995, 63:
4003-4010). La segunda molécula es un péptido
interno de una serina proteasa putativa codificada por el gen
Rv1796.
Utilizando la proteína Apa nativa como antígeno,
los inventores han mostrado anteriormente que esta proteína que no
representa más que el 2% de las proteínas secretadas por los bacilos
del grupo de la tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis y
BCG) en cultivo es un antígeno inmunodominante, reconocido de manera
muy eficaz por los linfocitos T CD4+ específicos que proceden de
animales infectados por M. tuberculosis o vacunados por el
BCG (Romain et al., Inf. Immun, 1999, 67,
5567-5572: Horn et al., J. Biol. Chem., 1999,
274, 32023-32020).
En estos mismos trabajos, los inventores han
mostrado igualmente que la mannosilación de la Apa era esencial para
la actividad antigénica de esta gricoproteína:
- -
- la demannosilación de la Apa obtenida por tratamiento de la Apa nativa por la \alpha-mannosidasa o por el ácido trifluorometano sulfónico (TFMS) o bien por expresión de la Apa en una bacteria incapaz de glicolizar (E. coli) va acompañada de una pérdida de antigenicidad de un factor 100.
- -
- la Apa glicolizada, producida por Micobacterium smegmatis que tiene una composición global de mannosa ligeramente diferente de la de la Apa producida por M. tuberculosis tiene una actividad antigénica disminuida en aproximadamente un factor 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Por otra parte, se ha propuesto utilizar
polipéptidos que comprenden una fracción inmunógena de un antígeno
soluble de M. tuberculosis denominado DPEP, que corresponde a
la Apa, como vacuna o reactivo de diagnóstico para la
inmunodetección rápida y precoz de la tuberculosis (Solicitud
Internacional WO 98/29132).
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La glicosilación de la Apa se ha analizado a
partir de glicopéptidos [Apa 1-12, Apa
13-19, Apa 248-282 (correspondiente
a la secuencia SEQ ID NO : 11 en el listado de las secuencias
anexado) y Apa 269-281] obtenidos por digestión
enzimática de la Apa por la subtilísima o una mezcla de
quimiotripsina/tripsina. Este análisis ha mostrado que la
glicoproteína Apa de M. tuberculosis contiene 6 a 9 residuos
mannosa ligados por un enlace glicosídico de tipo \alpha-(1,2) de
4 residuos treonina (T_{10}, T_{18}, T_{27} y T_{277}) de la
siguiente manera: una dimannosa (T_{10} y T_{18}), una mannosa
(T_{27}), una mannosa, una dimannosa o una trimannosa (T277),
(Dobos et al., J. Bacteriol., 1996, 178,
2498-2506). Además, tales glicopéptidos
O-glicosilados que comprenden una dimannosa
(\alpha-D-Man(1\rightarrow2)-D-Man)
se pueden sintetizar a partí de aminoácidos
O-glicosilados, según el procedimiento descrito en
Franzyk et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1995, 22,
2883-2898.
Hay que subrayar que la estructura osídica de la
Apa que contiene mono-, di- o tri-mannosas ligadas a
residuos treonina se parece a la de las mannoproteínas de levadura,
en particular de Candida albicans, y es diferente de la de
las proteínas de F. meningosepticum que poseen cadenas
oligomannósicas más largas. Esta estructura osídica de la Apa de
M. tuberculosis (glicoproteína O-glicosilada)
también es diferente de la de los antígenos
O-glicosilados de células de mamífero (mucina;
Solicitud internacional PCT WO 99/34824) que comprenden un residuo
N-acetilgalactosamina (GalNAC) seguido de otros
azúcares (galactosa) ligadas a residuos de treonina, y de la de los
antígenos de N-glicosilados de los virus (complejo
gcl del citomegalovirus humano; Patente de los Estados Unidos US
5.124.440).
La pérdida de la antigenicidad de la Apa,
observada después de la desmannosilación, se podría deber a una
disminución de la fagocitosis y del apresto de este antígeno o bien
del reconocimiento del mismo por los linfocitos T CD4+. En efecto,
el receptor de mannosa de los macrofagos y de las células
dendríticas que se unen específicamente a las hexosas,
especialmente mannoproteínas de C. albicans, y mannolípidos
como el lipoarabinomannano de las micobacterias, desempeña un papel
en la fagocitosis y el apresto de los antígenos que se presentan en
la superficie de estas células en forma de un complejo
péptido-molécula de clase II del CMH. (Stahl et
al., Current Opinion in Immunology, 1998, 10,
50-55). Se ha mostrado también que un péptido
mannosilado (a nivel de residuos lisina en posición
N-terminal) era fagocitado y aprestado por las
células dendríticas, de manera mucho más eficaz que un péptido
no-glicosilado de igual secuencia (Tan. et
al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2426-2435).
En el modelo de la lisozima de la gallina, se ha
mostrado que péptidos análogos glicosilados de un péptido que
constituye un epítope T de este antígeno eran capaces de inducir
linfocitos T CD4+ que reconocen específicamente este epítope
glicosilado (Deck et al., J. Immunol., 1995, 155,
1074-1078). Sin embargo, en la medida en que tales
epítopes T glicosilados reconocidos específicamente por linfocitos T
CD4+ no se han identificado en antígenos nativos procedentes de
microorganismos patógenos (bacteria-hongo), la
importancia de la glicosilación en el reconocimiento de los
antígenos de M. tuberculosis sigue por demostrarse.
Además, y a pesar de los datos relativos a la
Apa de M. tuberculosis y los conocimientos generales sobre la
glicosilación de los antígenos, tampoco ha sido posible hasta ahora
preparar antígenos procedentes de las proteínas
O-glicosiladas de este microorganismo patógeno,
aptas para poderse utilizar efectivamente en una composición
inmunógena o de vacuna y/o en un ensayo de diagnóstico.
En efecto:
- -
- las proteínas activas que no representan más que un bajo porcentaje de las proteínas producidas por este microorganismo se purifican con rendimientos muy bajos, por procedimientos que son peligrosos, por el hecho de la manipulación de grandes cantidades de estos agentes patógenos,
- -
- las proteínas, producidas en sistemas de expresión heterólogos (células eucariotas o bacterias incapaces de glicosilar), tienen una actividad antigénica reducida,
- -
- las proteínas producidas en sistemas de expresión homóloga como M. smegmatias tienen una actividad antigénica aceptable pero se producen en cantidades insuficientes por procedimientos complejos.
\vskip1.000000\baselineskip
En consecuencia, los inventores se han marcado
como objetivo la preparación de antígenos inmunodominantes, aptos
para inducir una respuesta inmunitaria protectora humoral y/o
celular, que, por una parte, administrados solos o en combinación
con otros antígenos, podrías constituir una vacuna utilizable por
todos los individuos incluyendo los sujetos inmunodreprimidos
(desaparición del riesgo ligado al uso de una vacuna viva), por otra
parte se podrían utilizar confines diagnósticos.
Encontraron que algunos glicopéptidos
procedentes de M. tuberculosis, un microorganismo patógeno
que sintetiza glicoproteínas presentan una actividad antigénica al
menos igual si no superior a la de la proteína nativa desglicosilada
o de la proteína recombinantes producida en E. coli.
Otro objetivo de la invención es desarrollar
medios simples a aplicar para la producción de estos glicopéptidos
en grandes cantidades.
La presente invención tiene por objeto
glicopéptidos inmunógenos de 15 a 39 aminoácidos procedentes de
M. tuberculosis, dichos glicopéptidos comprenden un epítope
T glicosilado de 14 a 25 aminoácidos, entre los cuales al menos un
aminoácido neutro está unido a una di- o a una trimannosa (enlace
glicosídico) y al menos el 15% de entre dichos aminoácidos son
prolinas, estando una de las prolinas situada en posición -1 a -4,
respecto de la posición de dicho aminoácido neutro, dichos
glicopéptidos se:
- -
- presentan mediante una molécula de clase II del CMH,
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- -
- reconocidos específicamente por linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con la glicoproteína nativa de la cual proceden, pero no son reconocidos por los linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con un péptido no glicosilado de igual secuencia y
- -
- capaces de inducir una proliferación de dichos linfocitos T CD4+ por los cuales son reconocidos y la secreción de citoquinas por dichos linfocitos, con la excepción del glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:º, procedente de la Apa descrita por Dobos et al., (J. Bacteriol. 1996, 178, 2498-2506).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene también por objeto
glicopéptidos constituidos por un epítope T glicosilado de 14 a 25
aminoácidos tal como se define anteriormente.
Estos glicopéptidos constituidos esencialmente
por un epítope glicosilado son reconocidos por linfocitos T CD4+
mediante este epítope glicosilado. En efecto, después de la
inmunización con bacilos vivos del grupo de la tuberculosis, los
linfocitos T específicos de estos glicopéptidos son mucho más
numerosos que los linfocitos T específicos de los péptidos no
glicosilados de igual secuencia.
Ventajosamente, dichos glicopéptidos tienen una
actividad antigénica al menos 10 veces superior, preferiblemente al
menos 30 veces superior, a la de un péptido testigo de igual
secuencia.
Dichos glicopéptidos presentan las siguientes
ventajas:
- -
- inducción de una respuesta inmunitaria de tipo celular protectora y eventualmente de una respuesta humoral, y posible utilización como antígenos en los sujetos inmunodeprimidos.
- -
- actividad antigénica al menos igual sino superior a los antígenos clásicos (cultivo de dicho microorganismo vivo atenuado, mezclas de antígenos preparados a partir de dichos cultivos o péptidos no glicosilados) ya que son reconocidos por un número mayor de linfocitos T específicos de M. tuberculosis,
- -
- especificidad más estrecha, que permite a la vez eliminar los problemas de reactividades cruzadas con otros microorganismos, especialmente con otras micobacterias atípicas, y aumentar la eficacia de la vacunación y del diagnóstico de M. tuberculosis; en efecto, son más específicos dado que sus residuos oligosacarídicos, presentes exclusivamente en dicho microorganismo patógeno, participan de manera crucial en la definición del epítope T reconocido por los linfocitos T CD4+; constituyen de este modo antígenos específicos para la vacunación y el diagnóstico de la infección por M. tuberculosis, un organismo patógeno apto para O-glicosilar algunas de sus proteínas.
- -
- utilización en los sujetos inmunodeprimidos ya que son totalmente apatógenos,
- -
- posible producción en grandes cantidades,
- -
- mejor estadanrización de las dosis activas y de la eficacia de la vacuna,
- -
- facilidades de almacenamiento y de utilización.
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Según un modo de realización ventajosa de dichos
glicopéptidos, dicho aminoácido neutro se selecciona en el grupo
constituido por la serina y la treonina.
Según una disposición ventajosa de esta
realización de dichos glicopéptidos, contienen de 1 a 7 residuos
treonina, ligados a una di- o una trimannosa.
Según otra realización ventajosa de dichos
glicopéptidos, la di- o trimanosa comprende un enlace
\alpha-(1,2).
Según la invención, dichos glicopéptidos
proceden preferiblemente de:
- -
- la proteína Apa de M. tuberculosis (Genbank número X80268) o
- -
- la proteína Rv1796 codificada por el gen Rv 1796, en referencia a la anotación de la secuencia del genoma de M. tuberculosis de cepa H37Rv (Banco Sanger).
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Preferiblemente, dicho glicopéptido se
selecciona en el grupo constituido por:
- -
- un glicopéptido de 39 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:1) es la que se extiende de las posiciones 1 a 39 de la secuencia de la proteína Apa y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 10, 18 y 27 de la SEQ I NO:1 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico,
- -
- un glicopéptido de 26 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:2) es la que se extiende de las posiciones 261 a 2869 de la secuencia de la proteína Apa (secuencia C-terminal) y en la cual al menos el residuo treonina en posición 17 de la SEQ I NO:2 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico, y
- -
- un glicopéptido de 35 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:3) es la que se extiende de las posiciones 169 a 203 de la secuencia de la proteína Rv 1796 y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 4, 5, 7, 13, 15, 23 y 25 de la SEQ I NO:3 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de síntesis de un glicopéptido tal como se ha definido
anteriormente, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- -
- preparación, en solución, de aminoácidos neutros glicosilados, unidos a una di- o a una trimannosa por un enlace glicosídico,
- -
- síntesis, sobre soporte sólido, del glicopéptido con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de la secuencia peptídica de dicho glicopéptido y de los aminoácidos neutros glicosilados, obtenidos anteriormente, y
- -
- corte del glicopéptido del soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
Según una realización ventajosa de dicho
procedimiento, dicho aminoácido neutro se selecciona en el grupo
constituido por la serina y la treonina.
Según una disposición ventajosa de esta
realización, cuando dichos glicopéptidos presentan las siguientes
secuencias (T representa una treorina O-glicosilada,
funcionalizada por 2 o 3 residuos mannosa y Ac representa una
función acetato):
| SEQ ID NO:1: | H2N-DPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANT-CONH2 |
| SEQ ID NO:2: | AcNH-PAPAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA-COOH |
| SEQ ID NO:3: | AcNH-TIPTTETPPPPQTVTLSPVPPQTVTVIPAPPPEEG-CONH2, |
\vskip1.000000\baselineskip
dicho procedimiento comprende las siguientes
etapas:
- i)
- preparación, en solución, de treoninas O-glicosiladas funcionalizadas por 2 o 3 residuos mannosa,
- ii)
- síntesis, sobre soporte, de los péptidos que corresponden a las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 anteriormente mencionadas, con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de estas secuencias y de las treoninas O-glicosiladas obtenidas en la etapa 1),
- iii)
- corte de los péptidos del soporte sólido, y
- iv)
- introducción, por síntesis química, de una función amida a nivel del extremo C-terminal de los péptidos SEQ ID NO:1, y SEQ ID NO3:, y una función acetato a nivel del extremo N-terminal de los péptidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de los péptidos SEQ ID NO:1, SEQ ID
NO:2 y SEQ ID NO:3 corresponde por lo tanto a una síntesis peptídica
clásica en fase sólida, a lo largo de la cual se introducen
aminoácidos glicosilados. Ya conocidos en el campo de la síntesis
peptídica en fase sólida, los aminoácidos utilizados se protegen
convenientemente y, si fuese necesario, se activan antes de
incorporarse el uno tras el otro en la secuencia peptídica.
Igualmente, los hidroxilos presentes a nivel de los residuos mannosa
llevados por las treoninas deben ser convenientemente protegidos en
el transcurso de la síntesis peptídica.
\newpage
- a_{2})
- preparación de derivados de mannosa de fórmulas (I) y (II):
- en las cuales P_{1} y P_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan grupos protectores de una función hidroxilo, y X representa una función activada, tal como un átomo de bromo,
\vskip1.000000\baselineskip
- b_{2})
- reacción del derivado de fórmula (I) con el derivado de fórmula (II), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende dos residuos mannosa y que responde a la fórmula (III):
- en la cual P_{1} P_{2} y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),
\vskip1.000000\baselineskip
- c_{2})
- eventualmente, reacción del compuesto de fórmula (III) con un derivado de mannosa de fórmula (I) tal como se define en a_{2}), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende tres residuos mannosa y que responde a la fórmula (IV):
- en la cual P_{1} P_{2} y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),
\newpage
- d_{2})
- condensación del compuesto de fórmula (III) o del compuesto de fórmula (IV) con una treonina convenientemente protegida de fórmula (V):
- en la cual P_{3} representa un grupo protector de una función amina primaria y P_{4} representa un grupo protector de una función carboxilo,
- que conducen respectivamente a la obtención de una treonina glicosilada de fórmula (VI) o (VII):
- en las cuales P_{1} P_{2}, P_{3} y P_{4} son tales como se han definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos protectores P_{1} P_{2}, P_{3}
y P_{4} se pueden elegir entre los descritos en la obra
Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. GREENE y P.G.M. WUTS,
Segunda edición, 1991, J. WILEY and Sons. A título de ejemplos y de
manera no limitativa, P_{1} y P_{2} pueden representar grupos
acetilo o benzoilo, P_{3} puede representar un grupo Fmoc
(fluoreno-9-ilmetoxicarbonilo) y P4
puede representar un grupo pentafluorofenilo.
La presente invención tiene también por objeto
un procedimiento de selección y de cribado de glicopéptidos
inmunógenos a partir de la secuencia peptídica de glicoproteínas de
M. tuberculosis, que puede ventajosamente ser aplicada de
manera concomitante en el procedimiento de síntesis de los
glicopéptidos según la invención, tal como se define anteriormente,
dicho procedimiento se caracteriza porque comprende al menos las
siguientes etapas:
- a_{3})
- búsqueda y selección en la secuencia peptídica de dichas glicoproteínas de al menos una secuencia de 14 a 25 aminoácidos, que contiene al menos un aminoácido neutro unido a una di- o una trimannosa y al menos el 15% de prolina, estando una de las prolinas situada en posición -1 a -4, respecto de la posición de dicho aminoácido neutro,
- b_{3})
- preparación del/de los glicopéptido(s) seleccionado(s) en la etapa a_{3}) según el procedimiento de síntesis definido anteriormente, y
- c_{3})
- selección de los glicopéptidos cuya actividad antigénica es al menos 10 veces superior, preferiblemente al menos 30 veces superior a la de un péptido testigo de igual secuencia.
\newpage
Según una realización ventajosa de dicho
procedimiento de cribado, previamente a la etapa a_{3}), comprende
una etapa de preselección de al menos una glicoproteína
antigénica.
Según otra realización ventajosa de dicho
procedimiento de cribado, en la etapa c_{3}), la actividad
antigénica de dicho glicopéptido se evalúa por medición de la
actividad de los linfocitos T CD4+ de animales inmunizados por
Mycobacterium bovis BCG o por una fracción antigénica de
M. tuberculosis.
La activación de los linfocitos T se puede poner
de manifiesto por técnicas clásicas de inmunología tal como las
descritas en Current protocols in Immunology (John E. Cligan, 2000,
Wiley and son Inc. Biblioteca del Congreso, EE.UU). A título de
ejemplo se pueden citar los ensayos de proliferación linfocitaria,
las dosificaciones de las citoquinas (proteína o ARNm) sintetizadas
por linfocitos T CD4+ activados (inmunoensayo (ELISA) o reacción de
polimerización en cadena de tipo RT-PCR) o los
ensayos de hipersensibilidad de tipo retardado.
La presente invención engloba también los
glicopéptidos susceptibles de obtenerse por el procedimiento de
selección y de cribado tal como se ha definido anteriormente.
La presente invención también tiene por objeto
el uso de al menos un glicopéptido según la invención o de un
glicopéptido de secuencia SEQ ID NO: 11, para la preparación de una
composición inmunógena o de vacuna o de un reactivo de
diagnóstico.
La presente invención también tiene por objeto
una composición inmunógena apta para inducir una inmunidad humoral
y/o celular, caracterizada porque comprende al menos un glicopéptido
tal como se define anteriormente, asociado a al menos un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Debido a la cooperación entre los linfocitos T
CD4+ y los linfocitos T CD8+ o los linfocitos B en el
establecimiento de una respuesta humoral o celular, los
glicopéptidos de la invención se puede utilizar ventajosamente como
proteína de transporte ("portador") de cualquier otro
antígeno de vacuna para aumentar la eficacia de la inmunización
contra dicho antígeno. Esta asociación
antígeno-portador permite ventajosamente facilitar
la selección y la amplificación de los linfocitos B y T específicos
del antígeno de vacuna.
La presente invención tiene también por objeto
una composición de vacuna apta para inducir una inmunidad humoral
y/o celular, caracterizada porque comprende al menos un glicopéptido
tal como se define anteriormente, asociado a al menos un vehículo
farmacéutico aceptable, y eventualmente a al menos un
coadyuvante.
Según una realización ventajosa de dichas
composiciones inmunógenas o de vacuna, dicho glicopéptido se asocia
a una proteína o un fragmento de proteína que comprende al menos un
epítope B, un epítope T de tipo CD4+ o un epítope T de tipo
CD8+.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por epítope B, epítope T de tipo CD4+ y epítope T de tipo
CD8+ respecto de la secuencia de una proteína; el fragmento de esta
secuencia que es capaz de unirse respectivamente a un anticuerpo,
un receptor T de linfocitos CD4+ y un receptor T de linfocitos
CD8+.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por asociación del glicopéptido a una proteína tanto la
mezcla como el acoplamiento por cualquier medio físico o químico,
por ejemplo la expresión de una fusión entre la secuencia del
glicopéptido y la de la proteína o del fragmento de proteína.
Los coadyuvantes utilizados son coadyuvantes
clásicamente utilizados, se eligen ventajosamente en el grupo
constituido por hidróxido de alumina y escualeno.
Dicho glicopéptido se puede eventualmente
asociar a cualquier otro medio, en sí mismo conocido por el experto
en la técnica, que permita aumentar la inmunogenicidad de un
péptido. A título de ejemplo, se puede citar el acoplamiento a un
péptido portador que permite la obtención de un péptido
multimerizado ramificado, tal como el descrito por Wilkinson et
al., 1999, Eur. J. Immuno., 29,2788-2796.
La presente invención también tiene por objeto
anticuerpos, caracterizados porque se dirigen contra uno o varios de
los glicopéptidos según la presente invención.
Según una realización ventajosa de dichos
anticuerpos, se seleccionan entre los anticuerpos monoclonales y los
anticuerpos policlonales.
La presente invención tiene además por objeto un
reactivo de diagnóstico, caracterizado porque se selecciona en el
grupo constituido por los glicopéptidos y los anticuerpos según la
invención.
Los glicopéptidos según la invención que
detectan de manera muy específica la inmunidad celular y/o humoral
inducida por la infección por de M. tuberculosis, se pueden
utilizar ventajosamente para el diagnóstico de la tuberculosis por
cualquier técnica que permita la detección de la inmunidad humoral
y/o celular, siendo esta técnica en si misma conocida por el
experto en la técnica. A título de ejemplo, se pueden citar los
ensayos de proliferación de linfocitos T y las dosificaciones
inmunoenzimáticas de citoquinas específicas de los linfocitos T
CD4+, especialmente INF-\gamma.
La presente invención tiene también por objeto
un procedimiento de detección de la tuberculosis, caracterizado
porque comprende la detección, in vitro, de linfocitos T CD4+
que reconocen un glicopéptido tal como se ha definido anteriormente,
por cualquier técnica apropiada.
La presente invención también tiene por objeto
un procedimiento de detección de la tuberculosis, caracterizado
porque comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de
un paciente susceptible de estar por de M. tuberculosis, con
un reactivo de diagnóstico tal como se define anteriormente
(anticuerpos o glicopéptidos, según el caso) y la detección de la
formación de un complejo anticuerpos y microorganismo presente en la
muestra biológica o glicopéptido(s) y anticuerpos presentes
en la muestra.
Además de las disposiciones que anteceden, la
invención comprende también otras disposiciones, que se hará
evidentes en la siguiente descripción, la cual se refiere a ejemplos
de aplicación de la presente invención así como a los dibujos anexos
en los cuales:
- la figura 1 ilustra la medición por un ensayo
de hipersensibilidad de tipo retardad, de la actividad antigénica de
la Apa nativa purificada de M. tuberculosis, en función de la
cinética de digestión de la proteína en función del tiempo en
horas,
- la figura 2 ilustra el análisis por
espectrometría de masa de la composición en mannosa de las moléculas
de Apa, en función de la cinética de digestión de la proteína Apa
por la \alpha-mannosidasa. El número de residuos
mannosa que corresponde a cada pico de la proteína Apa se indica y
la actividad antigénica global del producto de la digestión de la
Apa se indica a los diferentes momentos estudiados.
- la figura 3 ilustra la medición por un ensayo
de hipersensibilidad de tipo retardado, de la actividad antigénica
de un glicopéptido, denominado Lip, procedente de la proteína Rv
1796 (SEQ ID NO:3). Las proteínas estándar purificadas de M.
tuberculosis (PPD) se utilizan como testigo positivo a la dosis
de 0,25 \mug en 0,1 ml. El péptido Lip se utiliza a la dosis de
0,02 \mug en 0,1 ml. Los péptidos Lip tratados por la
\alpha-mannosidasa o la subtilisina son negativos
a las mismas dosis. Los resultados se expresan por el diámetro de la
reacción de eritema.
- la figura 4 ilustra la actividad antigénica
del péptidos Lip por un ensayo in vitro de proliferación
linfocitaria. El reconocimiento por los linfocitos T del péptido Lip
glicosilado (Lip nativo) se compara con el del péptido
desglicosilado (Lip + \alpha-amnnosidasa) o del
péptido Li asociado a un anticuerpo anti-receptor
CD4+ de los linfocitos T (Lip + anti-Cd4),
- la figura 5 ilustra la medición por un ensayo
de hipersensibilidad de tipo retardado de la actividad antigénica de
la Apa nativa purificada de M. tuberculosis (Apa nativa).
o de la Apa desglicosilada producida por E.
coli (rApa E. coli), en función de la inmunización de las
cobayas. Estas se inmunizaron previamente por el BCG vivo inyectado
por vía intradérmica o por los plásmidos pAG831 o pA832, que
contienen la secuencia codificante de la Apa, puesta bajo el
control del promotor precoz del citomegalovirus. La inmunización de
las cobayas por los plásmidos conduce a una sensibilización que se
puede revelar por una reacción de hipersensibilidad de tipo
retardado. Los dos tipos de antígenos son equivalentes para generar
esta reacción, mientras que después de una inmunización por el BCG,
solamente es antigénica la Apa nativa glicosilada.
- La figura 6 representa la preparación de
unidades que cuentan con dos o tres residuos mannosa conectados por
enlaces \alpha-(1,2), y
- la figura 7 (7a y 7b) representa la
preparación de treoninas funcionalizadas por dos o tres unidades de
mannosa.
\vskip1.000000\baselineskip
50 \mug de proteína Apa purificada a partir
del sobrenadante de cultivo de M. tuberculosis, según el
protocolo descrito por Horn et al., anteriormente citado se
diluyen en un volumen de 450 \mul de tampón A (100 mM
CH3COO^{-}Na^{+}, 2 mM ZnCl_{2}).
En el momento inicial, se toman 75 \mul de la
solución de proteína Apa , se diluyen en 25 \mul de tampón A y se
congelan como testigo. 125 \mul de
\alpha-mannosidasa a 1 mg/ml (3 Ul/ml, Oxford
Glycosciences) se añaden a continuación a los 375 \mu de la
solución de Apa y el volumen de reacción de 500 \mul se incuba a
37ºC. Después de 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 16 horas y 24 horas,
se toman y congela a -20ºC 100 \mul de la reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de 100 \mul se calientan durante
2 minutos a 90ºC y a continuación se enfrían bruscamente, se secan a
vacío y se vuelven a poner en suspensión en 300 \mul de ácido
trifluoroacético al 0,1% en agua (solución B).
Los productos de digestión de la Apa se separan
de la \alpha-amminosidasa en una columna de
cromatografía en fase inversa (Ressource RPC, Pharmacia), por un
gradiente de 0 a 90% de acetonitrilo en la solución B, en 90
minutos. La Apa se eluye de la columna en el momento t = 68 minutos,
que corresponde al 51,5% \pm 0,5% de acetonitrilo. Las fracciones
correspondientes a la Apa se recogen, se liofilizan, se vuelven a
poner en suspensión en una solución de butanol al 5% en agua
(solución C), y a continuación se secan a vacío. Las muestras
purificadas se vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de
solución C.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición oligosacarídica de cada muestra
se analiza por espectrometría de masa, en las condiciones descritas
en Horn et al., anteriormente citadas.
Una medición de la absorción a 210 nm se efectúa
para evaluar la cantidad relativa de proteína presente en cada
muestra.
A continuación, las muestras se secan y su
concentración se añade a 1 mg/ml en un tampón de valoración (tampón
D : PBS, 0,9% NaCl, 0,05% Tween 80).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antigénica se mide por un ensayo de
hipersensibilidad de tipo retardado en las cobayas inmunizadas 3
meses antes por una inyección intradérmica de 2 mg de BCG vivo en 2
puntos de inyección.
Cada muestra se diluye a una concentración de 2
\mug/ml en el tampón D y 100 \mul de esta dilución (o,2 \mug)
se inyectan por vía intradérmica a lotes de 2 cobayas previamente
inmunizadas.
Los diferentes lotes de animales son los
siguientes:
- -
- lote 1 : testigo negativo que ha recibido 100 \mul de tampón D,
- -
- lote 2: Apa = t=0
- -
- lote 3: Apa t=30 minutos
- -
- lote 4: Apa t=1 hora
- -
- lote 5: Apa t=4 horas
- -
- lote 6: Apa t=16 horas
- -
- lote 7: Apa t=24 horas
- -
- lote 8: testigo positivo (0,25 \mug de proteínas estándar purificadas de Mycobacterium tuberculosis (PPD) que corresponde a 10 unidades de tuberculina (UT).
24 horas después de la inyección, la media del
diámetro de la reacción de eritema se mide para los diferentes lotes
de animales y la valoración en tuberculina de las muestras se
determina respecto del estándar PPD.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se ilustran por las figuras 1 y
2.
El análisis de la actividad antigénica de la Apa
en función de la cinética de digestión por la
\alpha-mannosidasa (figura 1) muestra que la
actividad antigénica de la Apa se pierde progresivamente a lo largo
de la digestión por la \alpha-mannosidasa: el 66%
en 1 hora, el 86% en 4 horas y del 97% al 99% para las digestiones
más largas.
\newpage
El análisis de la composición en mannosa de los
productos obtenidos en los diferentes omentos de digestión (figura
2) muestra que:
- -
- Las moléculas de Apa Nativas poseen 6 a 8 residuos mannosa, y
- -
- las moléculas de Apa en las cuales persisten 3 a 6 residuos mannosa pierden el 86% de su actividad antigénica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mostrado que la composición en
oligomannosa de la Apa es la siguiente: una dimannosa (T_{10} y
T_{18}), una mannosa (T_{27}), una mannosa, una dimannosa o una
trimannosa (T_{277}), Dobos et al. anteriormente
mencionado. Además, la \alpha-mannosidasa es una
exomannosidasa.
Por consiguiente, los resultados indican
que:
- -
- la pérdida de 1 o 2 mannosas terminales de las 4 cadenas oligomannosa de la Apa conlleva una pérdida drástica de la actividad antigénica, y
- -
- la antigenicidad de la Apa está ligada a la presencia de una di- o trimannosa sobre uno o varios de los residuos treonina glicosilados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan bacterias de la cepa de
Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) durante 20 días en un medio
sintético de Sauton (Milieux de culture, H. Cassagne, 1961, Ed.
Instituto Pasteur, tomo 2, página 242). Las moléculas secretadas en
el medio se concentran sobre una membrana de ultrafiltración (PM10,
AICON) para no retener más que las moléculas de masa molecular
superior a 10.000 Da, y a continuación se liofilizan. Se obtienen
aproximadamente 10 g de liofilizado por 600 litros de medio de
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se carga una columna preparativa con la matriz
Sup75 pregrade Pharmacia. Esta columna de 50x750 mm se equilibra
con un tampón fosfato (50 mM PO_{4}Na_{2}/K, pH 7,1; 100 mM
NaCl; 4% butanol) a un caudal de 1 ml/minuto. El material bruto
anterior se recupera en el tampón de equilibrio a una concentración
final de 10 g por 100 ml, se clarifica por centrifugación a 43.000
g, durante 4 horas y a continuación por filtración sobre filtro
0,22 \mugm. Se efectúan inyecciones de 13 ml y las diferentes
fracciones detectadas por su absorción a 280 nm se concentran sobre
la membrana PM10 y a continuación se liofilizan.
La fracción eluida entre 700 y 800 ml es muy
antigénica: se observa una hipersensibilidad de tipo retardado en
cobayas inmunizadas por BCG vivo; esta fracción es sin embargo poco
activa en cobayas inmunizados BCG inactivado por el calor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una columna preparativa Source 15Q Pharmacia (15
\mum) de 24x250 mm se equilibra con un tampón 20 mM Tris/HCl, pH
8, 4% butanol, a un caudal de 5 ml/minuto con una presión máxima de
8 bares lineal de NaCl de 0 a 150 mM en el mismo tampón se aplica
después de la inyección 500 mg de la fracción anterior disuelta en
10 ml del tampón inicial. Las fracciones se detectan por absorción
a 280 nm, concentradas sobre membrana PM 10 y a continuación se
liofilizan.
La fracción eluida, entre 40 y 75 mM de NaCl es
muy antigénica: se observa una hipersensibilidad de tipo retardado
en cobayas inmunizadas por BCG vivo; esta fracción es sin embargo
poco activa en cobayas inmunizados por BCG inactivado por el
calor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una columna RPC (Reversed Phase column) Resource
15RPC de 4,6x100 mm Pharmacia se equilibra por un tampón 20 mM
CCH3COO^{-}NH4^{+}, pH 6,5, a un caudal de 1 ml/minuto. Un
gradiente o lineal de acetonitrilo, comprendido entre el 0 y el 90%,
se aplica después de la inyección sobre la columna de 10 mg en 2 ml
de tampón de la fracción anterior. Las fracciones eluidas se
detectan a 280 nm y a continuación se concentran a vacío a 40ºC
antes de ser liofilizadas.
La fracción eluida entre las concentraciones
entre el 18 y el 22% de acetonitrilo es muy antigénica para revelar
una hipersensibilidad de tipo retardado en cobayas inmunizados por
BCG vivo y poco activo en cobayas inmunizados por BCG inactivado por
el calor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una columna microbore phase inverse C18 (Browled
lab. 1 x 250 mm) se equilibra por un tampón 20 mM
CCH3COO^{-}NH4^{+}, pH 6,5, a un caudal de 1 ml/minuto. Un
gradiente o lineal de acetonitrilo, comprendido entre el 0 y el 90%,
se aplica después de la inyección sobre la columna de la fracción
anterior.
Una fracción detectada solamente a 220 nm se
eluye por una concentración de aproximadamente el 11% de
acetonitrilo. Esta fracción (3 mg) es muy activa para revelar las
reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado en cobayas
inmunizados por bacterias vivas y poco activas en cobayas
inmunizados por BCG inactivado por el calor.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción obtenida en la etapa final de
purificación se ha secuenciado por una técnica de Edman modificada
(Applied Biosystems 473A), según las instrucciones del
fabricante.
La composición de cada muestra se analiza por
espectrometría de masa (espectrómetro MALDI-TOF), en
las condiciones descritas en Horn et al., anteriormente
mencionado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 9 \mug del glicopéptido
purificado en 65 \mug de tampón 100 mM mM CCH3COO^{-}Na^{+},
pH 5, y a se añaden continuación 3 \mul de una solución a 1 mg/ml
de \alpha-mannosidasa (Oxfor Glyco System), sea
90 mU de \alpha-mannosidasa. La reacción se incuba
24 horas a 37ºC para obtener una digestión total, y a continuación
el producto obtenido se seca a vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 690 ng del glicopéptido purificado
anteriormente en 5 \mul de tampón 100 mM carbonato de amonio, pH
8, y a continuación se añaden 1 \mul de una solución de
subtilisina a 100 \mug/ml sea aproximadamente 100 ng. La reacción
se incuba 24 h a 37ºC y a continuación el producto de la reacción se
seca a vacío y se recupera en el tampón de valoración (Tampón
D).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectan 0,02 \mug del glicopéptido
purificado anteriormente, no diferido o digerido por la
\alpha-mannosidasa o la subtilisina en lotes de
cobayas previamente inmunizadas, según el protocolo descrito en el
ejemplo 1. Los resultados se expresan por el valor del diámetro de
la reacción de eritema. El testigo está constituido por 0,25 \mug
de PPD que corresponde a 10 UT.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones del ensayo son las descritas en
Horn et al., anteriormente citado.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de masa efectuada sobre el
glicopéptido purificado indica la presencia de moléculas complejas,
verdaderamente glicosiladas por mannosas dada la presencia de
mediciones que difieren de un valor de 162 unidades de masa. Una
masa de 6951 Da corresponde a la masa del péptido tratado con
\alpha-mannosidasa se retiene como la masa mínima
de estas moléculas.
La secuencia N-terminal del
glicopéptido purificado indica la presencia de una secuencia
mayoritaria TIPTT... y de una secuencia minoritaria IPTTE...
Estos resultados son compatibles con un
glicopéptido mannosilado, denominado Lip cuya secuencia (SEQ ID NO:
3) es la de un fragmento N-terminal de un péptido
procedente de la proteína codificada por el gen Rv1796 de M.
tuberculosis que se extiende desde las posiciones 169 a 239 de
dicha proteína, en referencia a la anotación de la secuencia del
genoma de M. tuberculosis de cepa H37Rv del banco de
Sanger.
\vskip1.000000\baselineskip
El glicopéptido es muy activo para revelar las
reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado en cobayas
inmunizadas por bacterias vivas, por el contrario es poco activo en
cobayas inmunizadas por BCG inactivado por el calor.
La actividad antigénica del glicopéptido aumenta
en el transcurso de las etapas de purificación:
- -
- Etapa 1: La fracción obtenida tiene una actividad de 180.000 (UT)/mg en cobayas inmunizadas por BCG vivo y 10.000 UT/mg en cobayas inmunizadas por BCG inactivado por el calor.
- -
- Etapa 2: La fracción obtenida tiene una actividad de 900.000 (UT)/mg en cobayas inmunizadas por BCG vivo y 30.000 UT/mg en cobayas inmunizadas por BCG inactivado por el calor.
- -
- Etapa 3: La fracción obtenida tiene una actividad de 1.000.000 (UT)/mg en cobayas inmunizadas por BCG vivo y 30.000 UT/mg en cobayas inmunizadas por BCG inactivado por el calor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados ilustrados en la figura 3
muestran que
- -
- la acción de la \alpha-mannosidasa durante 24 horas a 37ºC hace perder más del 95% de la actividad antigénica: la fracción pasa de una actividad a 1.000.000 UT/mg a una actividad inferior a 30.000 UT/mg después de la desglicosilación,
- -
- la acción de la subtilisina anula la actividad antigénica, y
- -
- a cantidad equivalente de proteínas, el glicopéptido Li es al menos 10 veces más activo que las proteínas estándar purificadas de Mycobacterium tuberculosis (PPD).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados ilustrados en la figura 4
muestran que la proliferación de los linfocitos es dependiente de
la concentración de péptido. Esta proliferación es marginal cuando
los linfocitos T son tratados por un anticuerpo dirigido contra las
moléculas CD4 o cuando el glicopéptido se trata con la
\alpha-mannosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pS65T (Clontech) que contiene la
secuencia del promotor precoz del citomegalovirus se corta mediante
las enzimas de restricción NheI y BspEI, reparado por la encima de
Klenow y a continuación se liga para obtener el plásmido pAG800.
El plásmido pAG800 se corta mediante la enzima
ApaI y se liga con el oligonucleótido 12M48 (5'CA(5'
CAACGT
TGGGCC 3'; SEQ ID NO:4) hibridado sobre si mismo, para dar el plásmido pAG802.
TGGGCC 3'; SEQ ID NO:4) hibridado sobre si mismo, para dar el plásmido pAG802.
Un fragmento de 875 pares de bases que contiene
la secuencia codificante de la Apa desprovista de la secuencia señal
se amplifica por reacción de polimerización en cadena (PCT) a partir
del plásmido pLA34-2 (Laqueyrerie., 1995, Infect.
Immun., 63, 4003-4010), utilizando los
oligonucleótidos 22M42 (5'TCCCAAGCTTTTGGTAGCCG3', SEQ ID NO:5) y
33M44 (5'CTAGGATC CACCATGCCGGAGCCAGCGCCCCCG3', SEQ ID NO:6).
\newpage
El oligonucleótido 33M44 se ha sintetizado para
contener un sitio ce consenso de iniciación de la traducción de
tipo Kozak (Nucl. Acids Res., 1987, 15, 8125-8148).
El fragmento obtenido por PCR se corta por BamHI y EcoRV y se
inserto en el plásmido pAG802 cortado por BglII y SmaI, para obtener
el plásmido pAG803. En el transcurso de estas operaciones, la
secuencia de oligonucleótido 5'CAAC GTTGGGCC3' se pierde; esta
secuencia, denominada Psp1046I ISS, se considera como una secuencia
inmunoestimulante que aumenta las respuestas inmunitarias al igual
que la secuencia IL-12p40 ISS (Lipford GB et
al., 1997, Eur. J. Immunol., 27, 3420-3426).
Una secuencia Psp1046 ISS se inserta en el sitio
BamHI del plásmido pAG803 por clonación del oligonucleótido 25M45
(5'GATCCGGGGGGGAACGTTGGGGGGG3', SEQ ID NO:7) hibridado con
eloligonucleótido 25M46 (5'GATCCCCCCCCAACGTTCCCCCCCG3', SEQ ID
NO:8), para obtener el plásmido pAG831.
Una secuencia IL-12p40 ISS se
inserta en el sitio BamHI del plásmido pAG803 por clonación del
oligonucleótido 24M63 (5'AGCGCTATGACGTTCCAAGGGCCC3, SEQ ID NO:9)
hibridado con el oligonucleótido 24M64
(5'GGGCCCTTGGAACGTCATAGCGCT3'. SEQ ID NO:10), para obtener el
plásmido pAG832.
después de la transformación de Escherichia
coli de cepa XL1 Blue, los plásmidos anteriores se amplifican
en el medio de cultivo LB (Sambrook et al., Molecular cloning
: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., 1989) que contiene 25 Pg/ml de kanamycine.
Después de una etapa previa de eliminación de la endotoxina por
tratamiento de los lisados bacterianos con Triton
X-114 (1%), el ADN plasmídico se purifica sobre
columnas de filtro QIA MaxiPrep (QIAGEN) según las indicaciones del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cobayas (Hartley) que pesan entre 300 y 400
g se inmunizan por 2 inyecciones intradérmicas en los flancos con 50
Pg de ADN de los plásmidos pAG831 o pAG832, preparados y purificados
como se ha indicado anteriormente.
El testigo está constituido por un grupo de
cobayas inmunizadas por BCG vivo en las condiciones descritas en el
ejemplo 1 o en el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Un y dos meses después de la inmunización, las
reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado se miden respecto
de la proteína Apa nativa o de la proteína Apa recombinante,
producida en una cepa de Escherichia coli transformada,
purificada según el protocolo descrito en Horn et al,
anteriormente mencionado.
La Apa nativa y la Apa recombinante se inyectan
por vía intradérmica a la dosis de 0,2 \mug en 100 \mul de
tampón de valoración (tampón D). La actividad antigénica se mide
como se ha descrito en el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados ilustrados por la figura 5 son
los siguientes:
\bullet las cobayas inmunizadas con el
plásmido pAG831 o pAG832 que contienen la secuencia que codifica la
Apa bajo el control de un promotor eucariota desarrollan, en la
grandísima mayoría de los casos, una respuesta inmunitaria dirigida
contra la proteína Apa nativa (anticuerpos y una respuesta T de tipo
CD4+ medible por un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado o
por un ensayo de proliferación in vitro de los linfocitos T
cuando se ponen en presencia de los antígenos). En los animales que
responden al antígeno Apa nativo, las respuestas de los linfocitos
T CD4+ respecto del antígeno desglicosilado por vía enzimática o del
antígeno recombinante no-glicosilado procedente de
E. coli son de igual intensidad que las respuestas observadas
con e antígeno nativo glicosilado.
\bullet por el contrario, las cobayas
inmunizadas par el BCG vivo muestran una reacción de
hipersensibilidad de tipo retardado únicamente en respuesta a la
Apa nativa. Estos animales no desarrollan ninguna reacción o
desarrollan una reacción fuertemente reducida en respuesta a la Apa
recombinante no glicosilada producida en E. coli como se ha
indicado anteriormente.
Las enseñanzas de estos resultados son las
siguientes:
- 1)
- Los resultados observados en los animales inmunizados con el ADN desnudo que codifica la Apa indican que la capacidad de la proteína Apa a fagocitar y a presentar por los macrófagos o las células dendríticas es idéntica para la proteína Apa nativa o recombinante (no gicosilada).
- 2)
- La combinación de los resultados anteriores con los resultados observados en los animales inmunizados con BCG vivo indica que la ausencia de respuesta a la proteína Apa desglicosilada no se debe a una reducción de su capacidad para ser presentada por los macrófagos o las células dendríticas pero en ausencia de reconocimiento por los linfocitos T CD4+. En consecuencia, los residuos oligomannosa de las cadenas laterales de las proteínas Apa o Lip en forma nativa, tales como las producidas por M. tuberculosis o por BCG vivo, desempeñan un papel en la constitución de epítopes T reconocidos por linfocitos T CD4+.
\vskip1.000000\baselineskip
Previamente a la síntesis peptídica, se preparan
sintones glicosilados, es decir treoninas funcionalizadas por dos o
tres residuos mannosas.
La preparación de los compuestos 5 y 8 se
describe, respectivamente, por H. FRANZYK et al. en J. Chem.
Soc. Perkin Trans. 1, 1995, 2883-2898 y por R.K.
NESS et al. en J. Am. Chem. Soc. Perkin, 1950, 72,
2200-2205.
La mannosa peracetilada comercial 1 (a saber la
1,2,3,4,5-penta-O
acetil-a-D-mannopiranosa)
se broma en posición anomérica por acción del bromuro de hidrógeno
en el ácido acético, como se ha descrito par A. LEVENE et al.
en J. Biol. Chem., 1931, 90, 89-98. El intermedio 2
activado se cicliza en ortoéster 3 en una mezcla de
2,6-dimetilpiridina/metanol. La apertura
regioselectiva del ortoéster por hidrólisis ácida, a 0ºC, en una
mezcla ácido trifluoroacético 10% acuoso/acetonitrilo conduce al
1,3,4,6-tetra-O-acetil-b-D-mannopiranosa
(5). El regioisómero 4 se aísla también.
La mannosa comercial 6 se perbenzoila en 7 por
acción del cloruro de benzoilo en la piridina. Este último se activa
en 8 por acción del bromuro de hidrógeno en el ácido acético. En
este protocolo y en los que siguen, otros procedimientos de
activación por la acción del bromuro de hidrógeno podrían sin
embargo utilizarse, tales como los conocidos por el experto en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los compuestos 10 y 12 se
describe, respectivamente, por A. JANSSON et al. en J. Chem.
Soc. Perkin Trans. 1, 1992, 1699-1707 y por H.
FRANZYK et al. (ibid). Los compuestos 2 y 5 se condensan en
presencia de trifluorometanosulfonato de plata (o cualquier otro
promotor de la reacción de condensación) en el diclorometano para
conducir al disacárido peracetilado 9, que a continuación se activa
en precursor bromado 10 por acción del bromuro de hidrógeno en el
ácido acético. Según un protocolo idéntico, los compuestos 5 y 8 se
condensan para dar el compuesto 11, él mismo activado en 12.
\vskip1.000000\baselineskip
El disacárido activado 12 se condensa en el
monosacárido aceptador 5, en presencia de trifluorometanosulfonato
de plata en el diclorometano, para conducir al trisacáriddo
peracetilado 17, que a continuación se activa en precursor bromado
18 por acción del bromuro de hidrógeno en el ácido acético.
\vskip1.000000\baselineskip
Como lo ha descrito I. SCHON et al. en
Synthesis, 1986, 303-305, la función ácida primaria
es protegida por un grupo Fmoc, se bloquea en forma de éster por
acción del pentafluorofenol (pfp) en presencia de
diciclohexilcarbodiimida (DCCI) para conducir al precursor aceptador
14.
La preparación de los sintones 15 y 16 se
describe, respectivamente por A. JANSSON et al. (ibid) y por
H. FRANZYK et al. (ibid). La condensación del compuesto 14
con los disacáridos activados 10 y 12, llevada a cabo en presencia
de trifluorometanosulfonato de plata en el diclorometano, conduce a
los sintones 15 y 16, respectivamente. Según el mismo protocolo, la
condensación del compuesto 14 con el trisacárido activado 18 conduce
al sintón 19.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se sintetizan en fase sólida
utilizando la química Fmoc. La síntesis peptídica se efectúa sobre
un sintetizador automático, con la ayuda de los aminoácidos
necesarios para la obtención de las secuencias deseadas,
incorporando los sintones glicosilados, que se presentan en forma de
ésteres activados de pentafluoropfenol (sintones 15, 16 y 19).
En función de los sintones utilizados, se
obtienen bien péptidos que comprenden treoninas funcionalizadas por
dos residuos de mannosa (incorporación de los sintones 15 y/o 16 con
ocasión de la síntesis peptídica), bien péptidos que comprenden
treoninas funcionalizadas por tres residuos de mannosa y
(incorporación del sintón 19 con ocasión de la síntesis peptídica),
bien péptidos que comprenden a la vez treoninas funcionalizadas por
dos residuos de mannosa y treoninas funcionalizadas por tres
residuos de mannosa (incorporación de los sintones 19 y 15 y/o 16
con ocasión de la síntesis peptídica).
En fin de síntesis, después de escisión de los
péptidos del soporte sólido con la ayuda de ácido trifluoroacético
y desprotección de los diferentes aminoácidos u de las funciones
hidroxilas de mannosas, los péptidos se purifican por Cromatografía
de Líquido de Alto Rendimiento (HPLC) en fase inversa. Su estructura
es controlada por las técnicas conocidas por el experto en la
técnica, tales como la espectrometría de masa y el análisis en
aminoácidos.
Las funciones amidas (en posición
C-terminal des los péptidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID
NO:3) y acetatos (en posición N-terminal de los
péptidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3) se introducen a continuación por
síntesis química, mediante técnicas de química orgánica conocidas
por el experto en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Un péptido que corresponde a las posiciones 250
a 280 de la Apa se ha producido en E. coli, en forma de una
fusión con un fragmento de la ciclase de Bordetella
pertussis, según las técnicas clásicas de clonación, expresión
y purificación de proteínas recombinantes en E. coli que son
bien conocidas por el experto en la técnica (cf por ejemplo, los
protocolos descritos en Current Protocols in Molecular Biology
(Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress,
USA).
Tres grupos de 5 cobayas Hartley que pesan 300 a
400 g se han inmunizado par 2 inyecciones intradérmicas a 1 mes de
intervalo, con 20 Pg de este péptido de l Apa purificada, en 0,1 ml
de una solución de coadyuvante.
Tres grupos de 4 cobayas inmunizadas cuatro
meses antes por BCG vivo, en las condiciones descritas en el ejemplo
1 se utilizan como testigos.
Uno y dos meses después de la inmunización, las
reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado se han medido
respecto de la proteína Apa nativa, de la proteína Apa recombinante
producida en E. coli y de la proteína Apa desglicosilada
preparada como se describe en el ejemplo 1, en las condiciones
definidas en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de hipersensibilida de tipo
retardado de las cobayas inmunizadas, bien con el péptido de fusión
de la Apa, bien con el BCG vivo se han medido respecto de la
proteína Apa nativa, de la proteína Apa recombinante producida en
E. coli y de la proteína Apa desglicosilada. Los resultados
expresados por el diámetro de la reacción de eritema (mm) se
presentan en la siguiente Tabla I:
Como se indica en la Tabla I anterior, las
reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado observadas en las
cobayas inmunizadas por el BCG vivo, son importantes después de la
inyección de moléculas Apa nativa. Las reacciones son muy débiles o
ausentes después de la inyección de las moléculas desglicosiladas
por vía química o producidas en E. coli. A la inversa para
las cobayas inmunizadas por las moléculas recombinantes, fusión
entre el fragmento de la ciclasa de Bordetella pertussis y el
fragmento interno de la molécula Apa, las sensibilizaciones son
idénticas respecto de las moléculas nativas o desglicosiladas.
Estos resultados muestran que los epítopes T
glicosilados de la molécula Apa son reconocidos de manera electiva
por las cobayas inmunizadas por las bacterias vivas. Muestran
igualmente que la ausencia o el menor reconocimiento por estas
cobayas de las moléculas desglicosiladas no está unida a una menor
antigenicidad intrínseca de estas moléculas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUTO PASTEUR
\hskip1cmMarchal Gilles
\hskip1cmRomain Félix
\hskip1cmPescher Pascale
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Glicopéptidos inmunógenos, cribado,
preparación y aplicaciones
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Seq226FR86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a un di- o un
trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a una mannosa,
una dimannosa o una trimannosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacgttggg cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccaagctt ttggtagccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:linker
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaggatcca ccatgccgga gccagcgccc ccg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:linker
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccggggg ggaacgttgg ggggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:linker
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccccccc caacgttccc ccccg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:linker
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgctatga cgttccaagg gccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:linker
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcccttgg aacgtcatag cgct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlace glicosídico a una mannosa,
una dimannosa o una trimannosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
Claims (24)
1. Glicopéptido inmunógeno de 15 a 39
aminoácidos procedentes de M. tuberculosis, con excepción del
glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:1, dicho glicopéptido comprende
un epítope T glicosilado de 14 a 25 aminoácidos, entre los cuales al
menos un aminoácido neutro está unido a una di- o a una trimannosa y
al menos el 15% de entre dichos aminoácidos son prolinas, estando
una de las prolinas situada en posición -1 a -4, respecto de la
posición de dicho aminoácido neutro, y dicho glicopéptido es:
- -
- presentado mediante una molécula de clase II del CMH,
- -
- reconocido específicamente por linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con la glicoproteína nativa de la cual procede, pero no es reconocido por los linfocitos T CD4+ inducidos por inmunización con un péptido no glicosilado de igual secuencia y
- -
- capaz de inducir una proliferación de dichos linfocitos T CD4+ por los cuales es reconocido y la secreción de citoquinas por dichos linfocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Glicopéptido inmunógeno según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho aminoácido
neutro se selecciona en el grupo constituido por la serina y la
treonina.
3. Glicopéptido inmunógeno según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque
contiene de 1 a 7 residuos treonina, ligados a una di- o una
trimannosa.
4. Glicopéptido inmunógeno según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la di- o
trimanosa comprende un enlace \alpha-(1,2).
5. Glicopéptido inmunógeno según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque procede de
la proteína Apa o de la proteína Rv1796.
6. Glicopéptido inmunógeno según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se
selecciona en el grupo constituido por
- -
- un glicopéptido de 39 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:1) es la que se extiende de las posiciones 1 a 39 de la secuencia de la proteína Apa y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 10, 18 y 27 de la SEQ I NO:1 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico,
- -
- un glicopéptido de 26 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:2) es la que se extiende de las posiciones 261 a 2869 de la secuencia de la proteína Apa (secuencia C-terminal) y en la cual al menos el residuo treonina en posición 17 de la SEQ I NO:2 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico, y
- -
- un glicopéptido de 35 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:3) es la que se extiende de las posiciones 169 a 203 de la secuencia de la proteína Rv 1796 y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 4, 5, 7, 13, 15, 23 y 25 de la SEQ I NO:3 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Glicopéptido inmunógeno procedente de M.
tuberculosis, caracterizado porque está constituido por
el epítope T glicosilado de 14 a 25 aminoácidos tal como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Procedimiento de síntesis de un glicopéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque comprende las siguientes etapas:
- -
- preparación, en solución, de aminoácidos neutros glicosilados, unidos a una di- o a una trimannosa por un enlace glicosídico,
- -
- síntesis, sobre soporte sólido, del gligopéptido procedente de una glicoproteína de M. tuberculosis con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de la secuencia peptídica de dicho glicopéptido y de los aminoácidos neutros glicosilados, obtenidos anteriormente, y
- -
- corte del glicopéptido del soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho aminoácido neutro se selecciona en
el grupo constituido por la serina y la treorina.
\newpage
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque dichos glicopéptidos presentan las
siguientes secuencias (T representa una treorina
O-glicosilada, funcionalizada por 2 o 3 residuos
mannosa y Ac representa una función acetato):
SEQ ID NO:1:
H2N-DPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANT-CONH2
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:2:
AcNH-PAPAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA-COOH
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:3:
AcNH-TIPTTETPPPPQTVTLSPVPPQTVTVIPAPPPEEG-CONH2,
dicho procedimiento comprende las siguientes
etapas:
- i)
- preparación, en solución, de treoninas O-glicosiladas funcionalizadas por 2 o 3 residuos mannosa,
- ii)
- síntesis, sobre soporte, de los péptidos que corresponden a las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 anteriormente mencionadas, con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de estas secuencias y de las treoninas O-glicosiladas obtenidas en la etapa i),
- iii)
- corte de los péptidos del soporte sólido, y
- iv)
- introducción, por síntesis química, de una función amida a nivel del extremo C-terminal de los péptidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3., y de una función acetato a nivel del extremo N-terminal de los péptidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque las treoninas funcionalizadas por
residuos mannosa se preparan por las siguientes etapas:.
- a_{2})
- preparación de derivados de mannosa de fórmulas (I) y (II):
- en las cuales P_{1} y P_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan grupos protectores de una función hidroxilo, y X representa una función activada, tal como un átomo de bromo,
- b_{2})
- reacción del derivado de fórmula (I) con el derivado de fórmula (II), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende dos residuos mannosa y que responde a la fórmula (III):
- en la cual P_{1} P_{2} y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),
- c_{2})
- eventualmente, reacción del compuesto de fórmula (III) con un derivado de mannosa de fórmula (I) tal como se define en a_{2}), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende tres residuos mannosa y que responde a la fórmula (IV):
- en la cual P_{1} P_{2} y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),
- d_{2})
- condensación del compuesto de fórmula (III) o del compuesto de fórmula (IV) con una treonina convenientemente protegida de fórmula (V):
- en la cual P_{3} representa un grupo protector de una función amina primaria y P_{4 }representa un grupo protector de una función carboxilo,
- que conducen respectivamente a la obtención de una treonina glicosilada de fórmula (VI) o (VII):
- en las cuales P_{1}, P_{2}, P_{3} y P_{4} son tales como se han definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento de selección y de cribado de
glicopéptidos inmunógenos a partir de la secuencia peptídica de
glicoproteínas de M. tuberculosis, caracterizado
porque comprende al menos las siguientes etapas:
- a_{3})
- búsqueda y selección en la secuencia peptídica de dichas glicoproteínas de al menos una secuencia de 14 a 25 aminoácidos, que contiene al menos un aminoácido neutro unido a una di- o una trimannosa y al menos el 15% de prolina, estando una de las prolinas situada en posición -1 a -4, respecto de la posición de dicho aminoácido;
- b_{3})
- preparación del/de los glicopéptido(s) seleccionado(s) en la etapa a_{3}) según el procedimiento de las reivindicaciones 8 a 11, y
- c_{3})
- selección de los glicopéptidos cuya actividad antigénica es al menos 10 veces superior, preferiblemente al menos 30 veces superior a la de un péptido testigo de igual secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque previamente a la etapa a_{3}),
comprende una etapa de preselección de al menos una glicoproteína
antigénica.
14. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicho aminoácido neutro se selecciona en
el grupo constituido por la serina y la treonina.
15. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque en la etapa c_{3}), la actividad
antigénica de dicho glicopéptido se evalúa por medición de la
actividad de los linfocitos T CD4+ de animales inmunizados por
Mycobacterium bovis BCG o por una fracción antigénica de
M. tuberculosis.
16. Glicopéptido tal como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque es susceptible de obtenerse por el procedimiento de selección
y de cribado según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o el
procedimiento de síntesis según cualquiera de las reivindicaciones 8
a 11.
17. Composición inmunógena apta para inducir una
inmunidad humoral y/o celular, caracterizada porque comprende
al menos un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7 o 16 o un glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:11, asociado a al
menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Composición de vacuna apta para inducir una
inmunidad humoral y/o celular, caracterizada porque comprende
al menos un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7 o 16 o un glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:11, asociado a al
menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente a al
menos un coadyuvante
19. Composición inmunógena o de vacuna según la
reivindicación 17 o la reivindicación 18, caracterizada
porque dicho glicopéptido se asocia a una proteína o un fragmento de
proteína que comprende al menos un epítope B, un epítope T de tipo
CD4+ o un epítope T de tipo CD8+.
20. Anticuerpo, caracterizado porque se
dirige específicamente contra uno o varios de los glicopéptidos
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16.
21. Reactivo de diagnóstico,
caracterizado porque comprende un glicopéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16, un glicopéptido de
secuencia SEQ ID NO:11 o un anticuerpo según la reivindicación.
22. Procedimiento de detección de la
tuberculosis, caracterizado porque comprende la puesta en
contacto de una muestra biológica de un paciente susceptible de
estar por de Mycobacterium tuberculosis, con un reactivo de
diagnóstico, según la reivindicación 21 y la detección de la
formación de un complejo anticuerpos-microorganismo
presente en la muestra biológica o
glicopéptido(s)-anticuerpos presentes en la
muestra.
23. Procedimiento de detección de la
tuberculosis, caracterizado porque comprende la detección,
in vitro, de linfocitos T CD4+ que reconocen un glicopéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16, por cualquier
técnica apropiada.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque dicha técnica de detección se selecciona
en el grupo constituido por los ensayos de proliferación de
linfocitos T y de dosificaciones inmunoenzimáticas de citoquinas
específicas de linfocitos T CD4+.
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