ES2368572T3

ES2368572T3 - Compuestos y métodos para inmunoterapia y diagnosis de tuberculosis.

Info

Publication number: ES2368572T3
Application number: ES06112509T
Authority: ES
Inventors: Steven Reed; Yasir Skeiky; Davin Dillon; Antonio Campos-Neto; Raymond Houghton; Thomas Vedvick; Daniel Twardzik
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2011-11-18
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: ZA967394B

Abstract

Un polipeptido aislado que comprende: (i) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102; o (ii) una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.

Description

Compuestos y metodos para inmunoterapia y diagnosis de tuberculosis

Campo tecnico

La presente invenci6n se refiere en general la detecci6n, tratamiento y prevenci6n de la infecci6n con Mycobacterium tuberculosis. La invenci6n se refiere mas particularmente a polipeptidos que comprenden un antfgeno de Mycobacterium tuberculosis, o una porci6n de este, y el uso de tales polipeptidos para diagnosticar y vacunar contra la infecci6n de Mycobacterium tuberculosis.

Antecedentes de la invenci6n

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa cr6nica que es generalmente causada por la infecci6n con Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad importante en los pafses en desarrollo, asf como un problema creciente en areas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes por ano. Si bien la infecci6n puede ser asintomatica durante un perfodo de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta mas comunmente como una inflamaci6n aguda de los pulmones, que produce fiebre y tos no productiva. Si se deja sin tratar, normalmente se producen complicaciones serias y muerte.

Si bien la tuberculosis en general se puede controlar mediante terapia extendida con antibi6ticos, tal tratamiento no es suficiente para evitar la propagaci6n de la enfermedad. Los individuales infectados pueden ser asintomaticos, pero contagiosos, durante alguno tiempo. Ademas, si bien el cumplimiento con el regimen de tratamiento es crftico, el comportamiento del paciente es diffcil de controlar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, que puede llevar al tratamiento ineficaz y el desarrollo de resistencia a los farmacos.

La inhibici6n de la propagaci6n de la tuberculosis requiere la vacunaci6n efectiva, el diagn6stico temprano y preciso de la enfermedad. En la actualidad, la vacunaci6n con las bacterias vivas es el metodo mas eficiente para inducir la inmunidad protectora. El Mycobacterium mas comun empleado para este prop6sito es Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es una fuente de controversia y algunos pafses, tales como Estados Unidos, no vacunan el publico general. El diagn6stico se obtiene comunmente mediante una prueba cutanea, que involucra la exposici6n intradermica a tuberculina PPD (derivado purificado de protefna). Las respuestas de celulas T especfficas de antfgeno producen la induraci6n medible en el sitio de inyecci6n por 48-72 horas despues de la inyecci6n, que indica la exposici6n a los antfgenos micobacterianos. La sensibilidad y especificidad, sin embargo, ha sido un problema con esta prueba, y los individuos vacunados con BCG no se pueden distinguir de los individuos infectados.

Si bien se ha demostrado que los macr6fagos actuan como efectores principales de la inmunidad para M. tuberculosis, las celulas T son los principales inductores de tal inmunidad. El papel esencial de las celulas T en la protecci6n contra la infecci6n de M. tuberculosis esta ilustrada por la frecuente aparici6n de M. tuberculosis en pacientes con SIDA, debido a la reducci6n de celulas T CD4 asociada con la infecci6n con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV). Se han demostrado que las celulas T CD4 reactivas con Mycobacterium son productoras potentes de interfer6n gamma (IFN-y), el cual a su vez, se ha demostrado que desencadena efectos antimicobacterianos de los macr6fagos en los ratones. Si bien el papel de IFN-y en los seres humanos es menos claro, los estudios han demostrado que 1,25-dihidroxi-vitamina D3, sola o en combinaci6n con IFN-y o el factor de necrosis tumoral alfa, activa los macr6fagos humanos para inhibir la infecci6n con M. tuberculosis. Ademas, se sabe que IFN-y estimula a los macr6fagos humanos para obtener 1,25-dihidroxivitamina D3. De modo similar, se ha demostrado que IL-12 cumple un papel en la estimulaci6n de la resistencia a la infecci6n con M. tuberculosis. Para una revisi6n de la inmunologfa de la infecci6n con M. tuberculosis, ver Chan y Kaufmann en Tuberculosis: Pathogenesis. Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.

El documento WO 95/01440 describe metodos y kits para el diagn6stico de tuberculosis. El documento WO 95/01441 describe antfgenos secretados de micobacterias hallados en el filtrado del cultivo a corto plazo.

Por consiguiente, existe una necesidad en la tecnica de mejores vacunas y metodos para prevenir, tratar y detectar la tuberculosis. La presente invenci6n cumple estas necesidades y ademas proporciona otras ventajas relacionadas.

Sfntesis de la invenci6n

Como se indic6 brevemente, esta invenci6n proporciona compuestos para prevenir y diagnosticar la tuberculosis. En un aspecto, se proporcionan polipeptidos que comprenden una porci6n inmunogenica de un antfgeno de M. tuberculosis soluble, especfficamente, polipeptidos que comprenden (i) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 102; o (ii) una porci6n inmunogenica de la SEQ ID NO: 102.

En aspectos relacionados, tambien se proporcionan secuencias de ADN que codifican los polipeptidos anteriores, vectores de expresi6n que comprenden estas secuencias de ADN y celulas huesped transformadas o transfectadas con tales vectores de expresi6n.

En otro aspecto, la presente invenci6n proporciona protefnas de fusi6n que comprenden un primer y un segundo polipeptido de la invenci6n o, alternativamente, un polipeptido de la invenci6n y un antfgeno de M. tuberculosis conocido.

Dentro de otros aspectos, la presente invenci6n proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los polipeptidos anteriores, o una molecula de ADN que codifica tales polipeptidos, y un portador fisiol6gicamente aceptable. La invenci6n tambien proporciona vacunas que comprenden uno o mas de los polipeptidos descritos anteriormente y un potenciador de la respuesta inmune no especffica, junto con vacunas que comprenden una o mas secuencias de ADN que codifican tales polipeptidos y un potenciador de la respuesta inmune no especffica.

En otro aspecto mas, los metodos se describen para inducir la inmunidad protectora en un paciente, que comprende

administrar a un paciente una cantidad efectiva de uno o mas de los polipeptidos anteriores. En aspectos adicionales de esta invenci6n, se proporcionan kits diagn6sticos para detectar la tuberculosis en un paciente. Se describen metodos diagn6sticos que comprenden poner en contacto las celulas dermicas de un paciente con uno o mas de los polipeptidos anteriores y detectar una respuesta inmune en la piel del paciente. Los kits de diagn6stico comprenden uno o mas de los polipeptidos anteriores en combinaci6n con un aparato suficiente para poner en contacto el polipeptido con las celulas dermicas de un paciente.

Estos y otros aspectos de la presente invenci6n seran evidentes con referencia a la descripci6n detallada y dibujos anexos siguientes.

Breve descripci6n de los dibujos e identificadores de secuencia La Figura 1A y B ilustran la estimulaci6n de la proliferaci6n y producci6n del interfer6n-y en las celulas T derivadas de un primer y segundo dador inmunol6gico de M. tuberculosis respectivamente, por los antfgeno de 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd descritos en el Ejemplo 1.

La Figura 2 ilustra la estimulaci6n de la proliferaci6n y producci6n de interfer6n-y en las celulas T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis por los dos polipeptidos representativos TbRa3 y TbRa9. SEQ. ID NO. 1 es la secuencia de ADN de TbRa1. SEQ. ID NO. 2 es la secuencia de ADN de TbRa10. SEQ. ID NO. 3 es la secuencia de ADN de TbRa11. SEQ. ID NO. 4 es la secuencia de ADN de TbRa12. SEQ. ID NO. 5 es la secuencia de ADN de TbRa13. SEQ. ID NO. 6 es la secuencia de ADN de TbRa16. SEQ. ID NO. 7 es la secuencia de ADN de TbRa17. SEQ. ID NO. 8 es la secuencia de ADN de TbRa18. SEQ. ID NO. 9 es la secuencia de ADN de ThRa19. SEQ. ID NO. 10 es la secuencia de ADN de TbRa24. SEQ. ID NO. 11 es la secuencia de ADN de TbRa26. SEQ. ID NO. 12 es la secuencia de ADN de TbRa28. SEQ. ID NO. 13 es la secuencia de ADN de TbRa29. SEQ. ID NO. 14 es la secuencia de ADN de TbRa2A. SEQ. ID NO. 15 es la secuencia de ADN de TbRa3. SEQ. ID NO. 16 es la secuencia de ADN de TbRa32. SEQ. ID NO. 17 es la secuencia de ADN de TbRa35. SEQ. ID NO. 18 es la secuencia de ADN de TbRa36. SEQ. ID NO. 19 es la secuencia de ADN de TbRa4. SEQ. ID NO. 20 es la secuencia de ADN de TbRa9.

SEQ. ID NO. 21 es la secuencia de ADN de TbRaB. SEQ. ID NO. 22 es la secuencia de ADN de TbRaC. SEQ. ID NO. 23 es la secuencia de ADN de TbRaD. SEQ. ID NO. 24 es la secuencia de ADN de YYWCPG. SEQ. ID NO. 25 es la secuencia de ADN de AAMK. SEQ. ID NO. 26 es la secuencia de ADN de TbL-23. SEQ. ID NO. 27 es la secuencia de ADN de TbL-24. SEQ. ID NO. 28 es la secuencia de ADN de TbL-25. SEQ. ID NO. 29 es la secuencia de ADN de TbL-28. SEQ. ID NO. 30 es la secuencia de ADN de TbL-29. SEQ. ID NO. 31 es la secuencia de ADN de TbH-5. SEQ. ID NO. 32 es la secuencia de ADN de TbH-8. SEQ. ID NO. 33 es la secuencia de ADN de TbH-9. SEQ. ID NO. 34 es la secuencia de ADN de TbM-1. SEQ. ID NO. 35 es la secuencia de ADN de TbM-3. SEQ. ID NO: 36 es la secuencia de ADN de TbM-6. SEQ. ID NO. 37 es la secuencia de ADN de TbM-7. SEQ. ID NO. 38 es la secuencia de ADN de TbM-9. SEQ. ID NO. 39 es la secuencia de ADN de TbM-12. SEQ. ID NO. 40 es la secuencia de ADN de TbM-13. SEQ. ID NO. 41 es la secuencia de ADN de TbM-14. SEQ. ID NO. 42 es la secuencia de ADN de TbM-15. SEQ. ID NO. 43 es la secuencia de ADN de TbH-4. SEQ. ID NO. 44 es la secuencia de ADN de TbH-4-FWD. SEQ. ID NO. 45 es la secuencia de ADN de TbH-12. SEQ. ID NO. 46 es la secuencia de ADN de Tb38-1. SEQ. ID NO. 47 es la secuencia de ADN de Tb38-4. SEQ. ID NO. 48 es la secuencia de ADN de TbL-17. SEQ. ID NO. 49 es la secuencia de ADN de TbL-20. SEQ. ID NO. 50 es la secuencia de ADN de TbL-21. SEQ. ID NO. 51 es la secuencia de ADN de TbH-16. SEQ. ID NO. 52 es la secuencia de ADN de DPEP. SEQ. ID NO. 53 es la secuencia de aminoacidos deducida de DPEP. SEQ. ID NO. 54 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal DPV. SEQ. ID NO. 55 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal AVGS. SEQ. ID NO. 56 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal AAMK. SEQ. ID NO. 57 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal YYWC.

SEQ. ID NO. 58 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal DIGS. SEQ. ID NO. 59 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal AEES. SEQ. ID NO. 60 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal DPEP. SEQ. ID NO. 61 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal APKT. SEQ. ID NO. 62 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal DPAS. SEQ. ID NO. 63 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa1. SEQ. ID NO. 64 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa10. SEQ. ID NO. 65 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa11. SEQ. ID NO. 66 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa12. SEQ. ID NO. 67 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa13. SEQ. ID NO. 68 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa16. SEQ. ID NO. 69 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa17. SEQ. ID NO. 70 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa18. SEQ. ID NO. 71 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa19. SEQ. ID NO. 72 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa24. SEQ. ID NO. 73 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa26. SEQ. ID NO. 74 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa28. SEQ. ID NO. 75 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa29. SEQ. ID NO. 76 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa2A. SEQ. ID NO. 77 es la secuencia de aminoacidos deducida de ThRa3. SEQ. ID NO. 78 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa32. SEQ. ID NO. 79 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa35. SEQ. ID NO. 80 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa36. SEQ. ID NO. 81 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa4. SEQ. ID NO. 82 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRa9. SEQ. ID NO. 83 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRaB. SEQ. ID NO. 84 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRaC. SEQ. ID NO. 85 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbRaD. SEQ. ID NO. 86 es la secuencia de aminoacidos deducida de YYWCPG. SEQ. ID NO. 87 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbAAMK. SEQ. ID NO. 88 es la secuencia de aminoacidos deducida de Tb38-1. SEQ. ID NO. 89 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-4. SEQ. ID NO. 90 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-8. SEQ. ID NO. 91 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-9. SEQ. ID NO. 92 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-12. SEQ. ID NO. 93 es la secuencia de aminoacidos de peptido 1 Tb38-1. SEQ. ID NO. 94 es la secuencia de aminoacidos de peptido 2 Tb38-1.

SEQ. ID NO. 95 es la secuencia de aminoacidos de peptido 3 Tb38-1. SEQ. ID NO. 96 es la secuencia de aminoacidos de peptido 4 Tb38-1. SEQ. ID NO. 97 es la secuencia de aminoacidos de peptido 5 Tb38-1. SEQ. ID NO. 98 es la secuencia de aminoacidos de peptido 6 Tb38-1. SEQ. ID NO. 99 es la secuencia de ADN de DPAS. SEQ. ID NO. 100 es la secuencia de aminoacidos deducida de DPAS. SEQ. ID NO. 101 es la secuencia de ADN de DPV. SEQ. ID NO. 102 es la secuencia de aminoacidos deducida de DPV. SEQ. ID NO. 103 es la secuencia de ADN de ESAT-6. SEQ. ID NO. 104 es la secuencia de aminoacidos deducida de ESAT-6. SEQ. ID NO. 105 es la secuencia de ADN de TbH-8-2. SEQ. ID NO. 106 es la secuencia de ADN de TbH-9FL. SEQ. ID NO. 107 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-9FL. SEQ. ID NO. 108 es la secuencia de ADN de TbH-9-1. SEQ. ID NO. 109 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-9-1. SEQ. ID NO. 110 es la secuencia de ADN de TbH-9-4. SEQ. ID NO. 111 es la secuencia de aminoacidos deducida de TbH-9-4. SEQ. ID NO. 112 es la secuencia de ADN de Tb38-1F2 IN. SEQ. ID NO. 113 es la secuencia de ADN de Tb38-2F2 RP. SEQ. ID NO. 114 es la secuencia de aminoacidos deducida de Tb37-FL. SEQ. ID NO. 115 es la secuencia de aminoacidos deducida de Tb38-IN. SEQ. ID NO. 116 es la secuencia de ADN de Tb38-1F3. SEQ. ID NO. 117 es la secuencia de aminoacidos deducida de Tb38-1F3. SEQ. ID NO. 118 es la secuencia de ADN de Tb38-1F5. SEQ. ID NO. 119 es la secuencia de ADN de Tb38-1F6. SEQ. ID NO. 120 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de DPV. SEQ. ID NO. 121 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de AVGS. SEQ. ID NO. 122 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de AAMK. SEQ. ID NO. 123 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de YYWC. SEQ. ID NO. 124 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de DIGS. SEQ. ID NO. 125 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de AEES. SEQ. ID NO. 126 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de DPEP. SEQ. ID NO. 127 es la secuencia de aminoacidos N-terminal deducida de APKT. SEQ. ID NO. 128 es la secuencia de aminoacidos deducida de DPAS. SEQ. ID NO. 129 es la secuencia de protefnas de antfgeno N-terminal DPPD. SEQ ID NO. 130-133 son las secuencias de protefnas de cuatro fragmentos de bromuro de cian6geno DPPD. SEQ ID NO. 134 es la secuencia de protefnas N-terminal de antfgeno XDS.

SEQ ID NO. 135 es la secuencia de protefnas N-terminal de antfgeno AGD.

SEQ ID NO. 136 es la secuencia de protefnas N-terminal de antfgeno APE.

SEQ. ID NO. 137 es la secuencia de protefnas N-terminal de antfgeno XYI.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Como se indic6 antes, la presente invenci6n generalmente se dirige a composiciones para prevenir, tratar y diagnosticar la tuberculosis. Las composiciones de la presente invenci6n incluyen polipeptidos que comprenden al menos una porci6n inmunogenica del antfgeno de M. tuberculosis de la SEQ ID NO: 102. Como se usa en la presente, el termino "polipeptido" abarca cadenas de aminoacidos de cualquier longitud, que incluye protefnas de longitud completa (es decir, antfgenos), donde los residuos de aminoacidos se unen con enlaces peptfdicos covalentes. En consecuencia, un polipeptido que comprende una porci6n inmunogenica del antfgeno de M. tuberculosis de la SEQ ID NO: 102 puede consistir completamente en la porci6n inmunogenica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar en el antfgeno nativo de M. tuberculosis o puede ser heter6logo y tales secuencias pueden ser (pero no necesariamente) inmunogenicas.

"Inmunogenico" como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de estimular una respuesta inmune (por ejemplo, celular) en un paciente, tal como un ser humano y/o en una muestra biol6gica. En particular, los antfgenos que son inmunogenicos (y sus porciones inmunogenicas) son capaces de estimular la proliferaci6n celular, producci6n de interleuquina 12 y/o producci6n de interfer6n-y en muestras las biol6gicas que comprenden una o mas celulas seleccionadas del grupo de celulas T, celulas NK, celulas B y macr6fagos, donde las celulas derivan de un individuo inmune a M. tuberculosis. Los polipeptidos que comprenden al menos una porci6n inmunogenica de uno o mas antfgenos de M. tuberculosis se puede usar generalmente para detectar tuberculosis o inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis en un paciente.

Un polipeptido se puede conjugar a una secuencia senal (o lfder) en el extremo N-terminal de la protefna que se dirige en forma cotraduccional o postraduccional la transferencia de la protefna. El polipeptido tambien se puede conjugar a un ligador u otra secuencia para facilitar la sfntesis, purificaci6n o identificaci6n del polipeptido (por ejemplo, poli-His), o para aumentar la uni6n del polipeptido a un soporte s6lido. Por ejemplo, un polipeptido se puede conjugar con una regi6n Fc de la inmunoglobulina.

En un aspecto relacionado, se describen los polipeptidos de combinaci6n. Un "polipeptido de combinaci6n" es un polipeptido que comprende al menos uno de las porciones inmunogenicas anteriores y una o mas secuencias de M. tuberculosis inmunogenicas adicionales, que se unen por medio de una uni6n peptfdica en una cadena de aminoacidos unica. Las secuencias se pueden unir directamente (es decir, sin intervenci6n de aminoacidos) o se pueden unir por medio de una secuencia ligadora (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogenicas de los polipeptidos componentes.

En general, los antfgenos de M. tuberculosis, y las secuencias de ADN que codifican tales antfgenos, se pueden preparar usando cualquiera de una variedad de procedimientos. Por ejemplo, los antfgenos solubles se pueden aislar del filtrado del cultivo de M. tuberculosis por los procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, que incluyen cromatograffa de intercambio ani6nico y fase inversa. Los antfgenos purificados luego se evaluan en cuanto a su capacidad de inducir una respuesta inmune apropiada (por ejemplo, celular) usando, por ejemplo, los metodos representativos descritos en la presente. Los antfgenos inmunogenicos luego se pueden secuenciar parcialmente usando tecnicas tales como reacciones qufmicas de Edman. Ver Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967.

Los antfgenos inmunogenicos tambien se pueden producir de modo recombinante mediante una secuencia de ADN que codifica el antfgeno, que se ha insertado en un vector de expresi6n y expresado en un huesped apropiado. Las moleculas de ADN que codifican antfgenos solubles se pueden aislar por la selecci6n de una biblioteca de expresi6n de M. tuberculosis apropiada con antisuero (por ejemplo, conejo) originado especfficamente contra antfgenos solubles de M. tuberculosis. Las secuencias de ADN que codifican antfgenos que pueden ser o no solubles se pueden identificar por la selecci6n de una biblioteca de expresi6n gen6mica o de ADNc de M. tuberculosis apropiada con suero obtenido de pacientes infectados con M. tuberculosis. Tales pruebas generalmente se pueden realizar usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Las secuencias de ADN que codifican antfgenos solubles tambien se pueden obtener por la apropiada selecci6n de una biblioteca de ADNc o ADN gen6mico de M. tuberculosis para las secuencias de ADN que hibridan oligonucle6tidos degenerados derivados de secuencias de aminoacidos parciales de antfgenos solubles aislados. Se pueden disenar y sintetizar secuencias de oligonucle6tidos para usar en tal prueba y la prueba se puede realizar, como se describe en (por ejemplo) Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (y las referencias allf citadas). Tambien se puede emplear la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR), usando los oligonucle6tidos anteriores en los metodos bien conocidosen la tecnica, para aislar una sonda de acido nucleico de una biblioteca de ADNc o gen6mica. La prueba de la biblioteca luego se puede realizar usando la sonda aislada.

Alternativamente, las bibliotecas gen6micas o de ADNc derivadas del M. tuberculosis se pueden analizar directamente usando celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) o lfneas de celulas T o clones derivados de uno o mas individuos inmunes a M. tuberculosis. En general, los PBMC y/o las celulas T para usar en tales pruebas se pueden preparar como se describe a continuaci6n. Las pruebas de biblioteca directas se pueden realizar generalmente por el ensayo de mezclas de protefnas recombinantes expresadas para determinar la capacidad de inducir la proliferaci6n y/o producci6n de interfer6n-y en celulas T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. En forma alternativa, los antfgenos de celulas T potenciales se pueden seleccionar primero sobre la base de la reactividad del anticuerpo, como se describi6 anteriormente.

Independientemente del metodo de preparaci6n, los antfgenos (y sus porciones inmunogenicas) descritos en la presente (que pueden ser o no solubles) tienen la capacidad para inducir una respuesta inmunogenica. Mas especfficamente, los antfgenos tienen la capacidad de inducir la proliferaci6n y/o producci6n de citoquinas (es decir, producci6n de interfer6n y y/o interleuquina 12) en las celulas T, celulas NK, celulas B y/o macr6fagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis. La selecci6n del tipo celular para usar en la evaluaci6n de una respuesta inmunogenica a un antfgeno, obviamente, dependera de la respuesta deseada. Por ejemplo, la producci6n de interleuquina 12 se evalua mas facilmente usando preparaciones que contienen celulas B y/o macr6fagos. Un individuo inmune a M. tuberculosis es uno que se considera resistente al desarrollo de tuberculosis en virtud de haber desencadenado una respuesta de celulas T efectiva al M. tuberculosis (es decir, sustancialmente libre de sfntomas de enfermedad). Tales individuos se pueden identificar sobre la base de una respuesta fuertemente positiva a la prueba de cutanea intradermica (es decir, induraci6n mayor de aproximadamente 10 mm de diametro) a las protefnas de tuberculosis (PPD) y una ausencia de signos o sfntomas de la enfermedad de tuberculosis. Las celulas T, celulas NK, celulas B y macr6fagos derivados de individuos inmunes a M. tuberculosis se pueden preparar usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se puede emplear una preparaci6n de PBMC (es decir, celulas mononucleares de sangre periferica) sin separaci6n adicional de las celulas componentes. Los PBMC generalmente se pueden preparar, por ejemplo, usando centrifugaci6n por densidad a traves de Ficoll™ (Winthrop Laboratories, NY). Las celulas T para uso en los ensayos descritos en la presente tambien se pueden purificar directamente de los PMBC. En forma alternativa, se pueden emplear una lfnea celular T enriquecida reactiva contra protefnas micobacterianas, o clones de celulas T reactivos para protefnas micobacterianas individuales. Tales clones de celulas T se pueden generar, por ejemplo, por el cultivo de los PMBC de individuos inmunes a M. tuberculosis con protefnas micobacterianas durante un perfodo de 2-4 semanas. Esto permite la expansi6n de solo celulas T especfficas de protefnas micobacterianas, que producen una lfnea compuesta unicamente de tales celulas. Estas celulas luego se pueden clonar y analizar con protefnas individuales, usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica, para definir mas precisamente la especificidad de las celulas T del individuo. En general, los antfgenos que son positivos para la prueba en los ensayos para proliferaci6n y/o producci6n de citoquinas (es decir, producci6n de interfer6n-y y/o interleuquina-12) realizada usando celulas T, celulas NK, celulas B y/o macr6fagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis, se consideran inmunogenicos. Tales ensayos se pueden realizar, por ejemplo, mediante los procedimientos representativos que se describen a continuaci6n. Las porciones inmunogenicas de tales antfgenos se pueden identificar usando ensayos similares, y pueden estar presentes dentro de los polipeptidos descritos en la presente.

La capacidad de un polipeptido (por ejemplo, un antfgeno inmunogenico, o una porci6n de este) para inducir la proliferaci6n celular se evalua por el contacto de las celulas (por ejemplo, celulas T y/o celulas NK) con el polipeptido y la medici6n de la proliferaci6n de las celulas. En general, la cantidad de polipeptido que es suficiente para la evaluaci6n de aproximadamente 105 celulas varfa de aproximadamente 10 ng/mL a aproximadamente 100 ug/mL y con preferencia es aproximadamente 10 ug/mL. La incubaci6n del polipeptido con las celulas se realiza normalmente a 37 "C durante aproximadamente seis dfas. Despues de la incubaci6n con el polipeptido, las celulas se analizan para determinar una respuesta proliferativa, que se puede evaluar por los metodos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como exponer las celulas a un pulso de timidina radiomarcada y que mide la incorporaci6n de la marca en ADN celular. En general, un polipeptido que produce al menos un aumento tres veces de la proliferaci6n por encima del umbral (es decir, la proliferaci6n observada para las celulas cultivadas sin polipeptido) se considera capaz de inducir la proliferaci6n.

La capacidad de un polipeptido para estimular la producci6n de interfer6n-y y/o interleuquina-12 en las celulas se puede evaluar por el contacto de las celulas con el polipeptido y medir el nivel de interfer6n-y o interleuquina-12 producida por las celulas. En general, la cantidad de polipeptido que es suficiente para la evaluaci6n de aproximadamente 105 celulas varfa de aproximadamente 10 ng/mL a aproximadamente 100 ug/mL y con preferencia es aproximadamente 10 ug/mL. El polipeptido se puede inmovilizar, pero no necesariamente, sobre un soporte s6lido, tal como una perla o microesfera biodegradable, tal como se describe en las patentes U. S. Nros 4.897.268 y

5.075.109. La incubaci6n de polipeptido con las celulas se realiza normalmente a 37"C durante aproximadamente seis dfas. Despues de la incubaci6n con el polipeptido, las celulas se analizan para determinar interfer6n-y y/o interleuquina-12 (o una o mas subunidades de esta), que se pueden evaluar por metodos conocidos por los expertos en la tecnica, tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o, en el caso de la subunidad IL-12 P70, un bioensayos tal como un ensayo que mide la proliferaci6n de las celulas T. En general, un polipeptido que genera la producci6n de al menos 50 pg de interfer6n-y por mL de sobrenadante cultivado (que contiene 104-105 celulas T por mL) se considera capaz de estimular la producci6n de interfer6n-y. Un polipeptido que estimula la producci6n de al menos 10 pg/mL de la subunidad IL-12 P70 y/o al menos 100 pg/mL de la subunidad de IL-12 P40, por 105 macr6fagos o celulas B (o por 3 x 105 de PBMC) se considera capaz de estimular la producci6n de IL-12.

En general, los antfgenos inmunogenicos son los antfgenos que estimulan la proliferaci6n y/o producci6n de citoquinas (es decir, producci6n de interfer6n-y y/o interleuquina-12) in celulas T, celulas NK, celulas B y/o macr6fagos derivados de al menos aproximadamente 25% de individuos inmunes a M. tuberculosis. Entre estos antfgenos inmunogenicos, los polipeptidos que tienen propiedades terapeuticas superiores se pueden distinguir sobre la base de la magnitud de las respuestas de los ensayos anteriores y sobre la base del porcentaje de individuos para el cual se observa la respuesta. Ademas, los antfgenos que tienen propiedades terapeuticas superiores no estimularan la proliferaci6n y/o producci6n de citoquinas in vitro en las celulas derivadas de mas de aproximadamente 25% de individuos que no son inmunes a M. tuberculosis, de este modo se eliminan las respuestas que no se deben especfficamente a las celulas receptivas para el M. tuberculosis. Los antfgenos que inducen una respuesta en un alto de porcentaje de las preparaciones de celulas T, celulas NK, celulas B y/o macr6fagos de los individuos inmunes a M. tuberculosis (con una baja incidencia de respuestas de las preparaciones de celulas de otros individuos) tienen propiedades terapeuticas superiores.

Los antfgenos con propiedades terapeuticas superiores tambien se pueden identificar sobre la base de su capacidad de disminuir la gravedad de la infecci6n con M. tuberculosis en animales experimentales cuando se administra como una vacuna. Las preparaciones de vacuna adecuadas para usar en animales experimentales, se describe en detalle a continuaci6n. La eficacia se puede determinar sobre la capacidad del antfgeno para proporcionar al menos aproximadamente un 50% de reducci6n de cantidades de bacterias y/o al menos aproximadamente un 40% de disminuci6n de mortalidad despues de la infecci6n experimental. Los animales experimentales adecuados incluyen ratones, cobayos y primates.

Los antfgenos que tienen propiedades diagn6sticas superiores generalmente se pueden identificar sobre la base de la capacidad de inducir una respuesta en una prueba cutanea intradermica realizada en un individuo con tuberculosis activa, pero no en una prueba realizada en un individuo que no esta infectado con M. tuberculosis. Las pruebas cutaneas generalmente se pueden realizar como se describe a continuaci6n, una respuesta de al menos 5 mm de induraci6n se considera positiva.

Las porciones inmunogenicas de los antfgenos descritos en la presente se pueden preparar e identificar mediante tecnicas bien conocidas, tal como las sintetizadas en Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247 y las referencias allf citadas. Tales tecnicas incluyen analizar porciones de polipeptido del antfgeno nativo en cuanto a las propiedades inmunogenicas. Los ensayos representativos de proliferaci6n y producci6n de citoquinas descritos en la presente generalmente se pueden emplear en estas pruebas. Una porci6n inmunogenica de un polipeptido es una porci6n que, dentro de tales ensayos representativos, genera una respuesta inmune (por ejemplo, proliferaci6n, producci6n de interfer6n-y y/o producci6n de interleuquina-12) que es sustancialmente similar a la generada por el antfgeno de longitud completa. En otras palabras, una porci6n inmunogenica de un antfgeno puede generar al menos aproximadamente el 20%, y con preferencia aproximadamente el 100% de la proliferaci6n inducida por el antfgeno de longitud completa en el ensayo de proliferaci6n modelo descrito en la presente. Una porci6n inmunogenica tambien puede, o en forma alternativa, estimular la producci6n de al menos aproximadamente el 20%, y con preferencia aproximadamente el 100% del interfer6n-y y/o interleuquina-12 inducido por el antfgeno de longitud completa en el ensayo modelo descrito en la presente.

Las porciones y otras variantes de antfgenos de M. tuberculosis se pueden generar por medios sinteticos o recombinantes. Los polipeptidos sinteticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoacidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoacidos, se pueden generar usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, tales polipeptidos se pueden sintetizar usando alguna de las tecnicas de fase s6lida disponibles en el comercio, tal como el metodo de sfntesis en fase s6lida de Merrifield, donde los aminoacidos se anaden sucesivamente a una cadena de aminoacidos en crecimiento. Ver Merrifield. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipamiento para la sfntesis automatizada de polipeptidos esta disponible en el comercio de proveedores tales como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, y se puede operara de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las variantes de un antfgeno nativo se pueden preparar generalmente mediante tecnicas de mutagenesis, tales como mutagenesis especffica de sitio dirigida a oligonucle6tidos. Las secciones de la secuencia de ADN tambien se pueden eliminar usando tecnicas estandares para permitir la preparaci6n de polipeptidos truncados.

Los polipeptidos recombinantes que contienen porciones de un antfgeno nativo se pueden preparar facilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el polipeptido usando una variedad de tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas adecuados de huesped/vector que secretan la protefna recombinante en el medio de cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro disponible en el comercio. Despues de la concentraci6n, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificaci6n adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio i6nico. Finalmente, se pueden emplear una o mas etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente una protefna recombinante.

Se puede emplear alguno de una variedad de vectores de expresi6n conocidos por los expertos en la tecnica para expresar polipeptidos recombinantes de esta invenci6n. La expresi6n se puede lograr en cualquier celula huesped apropiada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresi6n que contiene una molecula de ADN que codifica un polipeptido recombinante. Las celulas huesped adecuadas incluye celulas procariotas, levaduras y eucari6ticas superiores. Con preferencia, las celulas huesped empleadas son de E. coli, levaduras o una lfnea celular tal como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antfgenos naturales, porciones de antfgenos naturales, u otras de sus variantes.

En general, independientemente del metodo de preparaci6n, los polipeptidos descritos en la presente se preparan en forma sustancialmente pura. Con preferencia, los polipeptidos son al menos aproximadamente 80% puro, con mas preferencia al menos aproximadamente 90% puro y con maxima preferencia al menos aproximadamente 99% puro. En ciertas formas de realizaciones preferidas, que se describen en detalle a continuaci6n, los polipeptidos sustancialmente puros se incorporan en las composiciones farmaceuticas o vacunas para usar en uno o de los metodos descritos en la presente.

En ciertas formas de realizaciones especfficas, la invenci6n presente proporciona polipeptidos que comprenden al menos una porci6n inmunogenica de un antfgeno soluble de M. tuberculosis que tiene la siguiente secuencia N-terminal:

(a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu; (SEQ ID No. 120)

Una secuencia de ADN que codifica el antfgeno definido como (a) anterior se proporciona en la SEQ ID No. 101; su secuencia de aminoacidos deducida se proporciona en la SEQ ID No. 102

En un aspecto relacionado, la presente invenci6n proporciona protefnas de fusi6n que comprende un primer y un segundo polipeptido de la invenci6n o, en forma alternativa, un polipeptido de la presente invenci6n y un antfgeno conocido de M. tuberculosis, tal como el antfgeno de 38 kD descrito anteriormente o ESAT-6 (SEQ ID Nos. 103 y 104), junto con variantes de tales protefnas de fusi6n. Las protefnas de fusi6n de la presente invenci6n tambien pueden incluir un peptido ligador entre el primer y segundo polipeptido.

Una secuencia de ADN que codifica una protefna de fusi6n de la presente invenci6n se construye usando tecnicas de ADN recombinantes conocidas para ensamblar secuencias de ADN separadas que codifican el primer y segundo polipeptidos en un vector de expresi6n apropiado. El extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica el primer polipeptido se liga, con o sin un ligador peptfdico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipeptido de modo que los marcos de lectura de las secuencias esten en fase para permitir la traducci6n del ARNm de las dos secuencias de ADN en una protefna de fusi6n unica que retiene la actividad biol6gica del primer y segundo polipeptidos.

Una secuencia del ligador peptfdico se puede emplear para separar el primer y el segundo polipeptidos por una distancia suficiente para garantizar que cada polipeptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Tal secuencia del ligador peptfdico se incorpora en la protefna de fusi6n usando tecnicas bien conocidas en la materia. Las secuencias del ligador peptfdico adecuadas se pueden elegir sobre la base de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformaci6n extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con los epitopos funcionales del primer y segundo polipeptidos; y (3) la carencia de residuos hidr6fobos o cargados que podrfan reaccionar con los epitopos funcionales del polipeptido. Las secuencias del ligador peptfdico preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoacidos neutros cercanos, tales como Thr y Ala tambien se pueden usar en la secuencia ligadora. Las secuencias de aminoacidos que se pueden emplear provechosamente como ligadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; patente U. S. N.o 4.935.233 y patente U. S. N.o

4.751.180. La secuencia ligadora puede tener 1 a aproximadamente 50 aminoacidos de longitud. Las secuencias peptfdicas no son necesarias cuando el primer y segundo polipeptido tienen regiones de aminoacidos N-terminal no esenciales que se puedan usar para separar los dominios funcionales e impedir la interferencia esterica.

Las secuencias de ADN ligadas se unen operativamente a elementos regulatorios de transcripci6n o traducci6n adecuados. Los elementos regulatorios responsables para la expresi6n del ADN se ubican unicamente 5' a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipeptidos. De modo similar, los codones de detenci6n se requieren para finalizar la traducci6n y las senales de terminaci6n de la transcripci6n solo estan presentes 3' a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipeptido.

En otro aspecto, la presente invenci6n describe metodos para usar uno o mas de los anteriores polipeptidos o protefnas de fusi6n (o moleculas de ADN que codifican tales polipeptidos) para inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis en un paciente. Como se usa en la presente, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, con preferencia un ser humano. Un paciente puede padecer una enfermedad, o puede estar libre de enfermedad y/o infecci6n detectable. En otras palabras, se puede inducir inmunidad protectora para prevenir o tratar la tuberculosis.

En este aspecto, el polipeptido, protefna de fusi6n o molecula de ADN esta generalmente presente dentro de una composici6n farmaceutica y/o a vacuna. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender uno o mas polipeptidos, cada uno de los cuales puede contener una o mas de las secuencias anteriores (o sus variantes), y un portador fisiol6gicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o mas de los polipeptidos anteriores y un potenciador de respuesta inmune no especffico, tal como un adyuvante o un liposoma (en el que se incorpora el polipeptido). Tales composiciones farmaceuticas y vacunas tambien pueden contener otros antfgenos de M. tuberculosis, incorporados en un polipeptido de combinaci6n o presente dentro de un polipeptido separado.

En forma alternativa, una vacuna puede contener un ADN que codifica uno o mas polipeptidos descritos anteriormente, de modo que el polipeptido se genere in situ. En tales vacunas, el ADN puede estar presente dentro de cualquier variedad de sistemas de administraci6n conocidos por los expertos en la tecnica, que incluye sistemas de expresi6n de acidos nucleicos, sistemas de expresi6n bacterianos y virales.

Los sistemas de expresi6n de acidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresi6n en el paciente (tal como un promotor y senal de terminaci6n adecuados). Los sistemas de administraci6n bacterianos involucran la administraci6n de una bacteria (tal como Bacillus-Calmelte-Guerrin) que expresa una porci6n inmunogenica del polipeptido en su superficie celular. En una forma de realizaci6n preferida, el ADN se puede introducir usando un sistema de expresi6n viral (por ejemplo, vaccinia u otros virus de viruela, retrovirus, o adenovirus), que pueden involucrar el uso de un virus competente de replicaci6n no patogenico (defectuoso). Las tecnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresi6n son bien conocidas por los expertos en la tecnica. El ADN tambien puede ser "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La captaci6n de ADN desnudo puede aumentar por el recubrimiento del ADN en perlas biodegradable, que se transportan eficientemente e las celulas.

En un aspecto relacionado, una vacuna de ADN descrita anteriormente se puede administrar simultaneamente p sucesivamente a un polipeptido de la presente invenci6n o un antfgeno de M. tuberculosis conocido, tal como el antfgeno de 38 kD descrito anteriormente. Por ejemplo, la administraci6n de ADN que codifica un polipeptido de la presente invenci6n, sea "desnudo" o en un sistema de administraci6n que se describi6 anteriormente, puede ser seguida por la administraci6n de un antfgeno a fin de aumentar el efecto inmunol6gico protector de la vacuna.

Las vfas y frecuencia de administraci6n, asf como la dosificaci6n, variaran de individuo a individuo y se pueden asemejar a las usadas actualmente en la inmunizaci6n mediante BCG. En general, las composiciones farmaceuticas y vacunas se pueden administrar por inyecci6n (por ejemplo, intracutanea, intramuscular, intravenosa o subcutanea), intranasal (por ejemplo, por aspiraci6n) o vfa oral. Entre 1 y 3 dosis se pueden administrar durante un perfodo de 1-36 semanas. Con preferencia, se administran 3 dosis, en intervalos de 3-4 meses, y se pueden administrar vacunaciones de refuerzo en forma peri6dica a partir de ese momento. Los protocolos alternados pueden ser apropiados para los pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipeptido o ADN que, cuando se administran como se describi6 antes, es capaz de originar una respuesta inmune en un paciente inmunizado suficiente para proteger el paciente de la infecci6n con M. tuberculosis durante al menos de 1-2 anos. En general, la cantidad de polipeptido presente en una dosis (o producido in situ por el ADN en una dosis) varfa de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg por kg de huesped, normalmente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, y con preferencia de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 ug. Los tamanos de dosis adecuados variaran con el tamano del paciente, pero normalmente variaran de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 5 mL.

Si bien cualquier portador adecuado conocido por los expertos en la tecnica se puede emplear en las composiciones farmaceuticas de esta invenci6n, el tipo de portador variara de acuerdo con el modo de administraci6n. Para la administraci6n parenteral, tal como inyecci6n subcutanea, el portador con preferencia comprende agua, soluci6n salina, alcohol, una grasa, una cera o un buffer. Para la administraci6n oral, tambien se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador s6lido, tal como manitol, lactosa, almid6n, estearato de magnesio, sacarina s6dica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (por ejemplo, galactido polilactico) tambien se pueden emplear como portadores para las composiciones farmaceuticas de esta invenci6n. Se describen las microesferas biodegradable adecuadas, por ejemplo, en las patentes U. S. Nros.

4.897.268 y 5.075.109.

Se pueden emplear alguno de una variedad de adyuvantes en las vacunas de esta invenci6n para aumentar no especfficamente la respuesta inmune. La mayor parte de adyuvantes contienen una sustancia disenada para proteger el antfgeno del catabolismo rapido, tal como hidr6xido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no especffico de las respuestas inmunes, tal como lfpido A, Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados estan disponibles en el comercio como, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto y adyuvante de Freund completo (Difco Laboratories) y Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lfpido A y quil A.

En otro aspecto, esta invenci6n describe metodos para usar uno o mas de los polipeptidos descritos antes para diagnosticar tuberculosis mediante una prueba cutanea. Como se usa en la presente, una "prueba cutanea" es cualquier ensayo realizado directamente en un paciente en que se mide una reacci6n de hipersensibilidad tipo retardada (DTH) (tal como edema, enrojecimiento o dermatitis) despues de la inyecci6n intradermica de uno o mas polipeptidos descritos anteriormente. Tal inyecci6n se puede lograr usando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto el polipeptido o polipeptidos con las celulas dermicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mL. Con preferencia, la reacci6n se mide al menos 48 horas despues de la inyecci6n, con mas preferencia 48-72 horas.

La reacci6n DTH es una a respuesta inmune mediada celular, que es mayor en los pacientes que se han expuesto previamente al antfgeno de ensayo (es decir, la porci6n inmunogenica del polipeptido empleado, o una variante de este). La respuesta se puede medir visualmente, usando una regla. En general, una respuesta que es mayor de aproximadamente 0,5 cm de diametro, con preferencia mayor de aproximadamente 1,0 cm de diametro, es una respuesta positiva, indicativa de infecci6n de tuberculosis, que se puede manifestar o no como una enfermedad activa.

Los polipeptidos de esta invenci6n con preferencia se formulan, para uso en una prueba cutanea, como composiciones farmaceuticas que contienen un polipeptido y un portador fisiol6gicamente aceptable, como se describi6 anteriormente. Tales composiciones normalmente contienen uno o mas de los polipeptidos anteriores en una cantidad que varfa de aproximadamente 1 ug a aproximadamente 100 ug, con preferencia de aproximadamente 10 ug a aproximadamente 50 ug en un volumen de 0,1 mL. Con preferencia, el portador empleado en tales composiciones farmaceuticas es una soluci6n salina con conservantes apropiados, tales como fenol y/o Tween 80™.

En una forma de realizaci6n preferida, un polipeptido empleado en una prueba cutanea es de tamano suficiente de modo que permanece en el sitio de inyecci6n por la duraci6n del perfodo de reacci6n. En general, un polipeptido que es al menos 9 aminoacidos de longitud es suficiente. El polipeptido con preferencia tambien es degradado por los macr6fagos dentro de horas de inyecci6n para permitir la presentaci6n a las celulas T. Tales polipeptidos pueden contener repeticiones de una o mas de las secuencias anteriores y/u otras secuencias inmunogenicas o no inmunogenicas.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustraci6n y no a modo de limitaci6n.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE POLIPEPTIDOS DEL FILTRADO DEL CULTIVO DE M. TUBERCULOSIS

Este ejemplo ilustra la preparaci6n de polipeptidos solubles de M. tuberculosis a partir del filtrado del cultivo. A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes del siguiente ejemplo son peso en volumen.

M. tuberculosis (sea H37Ra, ATCC No. 25177, o H37Rv, ATCC No. 25618) se cultiv6 en medio GAS esteril a 37 "C durante catorce dfas. El medio luego se filtr6 al vacfo (dejando la masa de las celulas) a traves de un filtro de 0,45 u en un frasco de 2,5 L esteril. El medio se filtr6 a traves de un filtro de 0,2 u en un frasco esteril de 4 L y se anadi6 NaN3 al filtrado del cultivo a una concentraci6n del 0,04%. Los frascos luego se colocaron en una sala frfa a 4"C.

El filtrado del cultivo se concentr6 por la colocaci6n del filtrado en un reservorio de 12 L que se habfa autoclavado y se incorpora el filtrado en una celula de agitaci6n de Amicon de 400 ml que se ha lavado con etanol y contenfa una membrana de MWCO de 10.000 kDa. La presi6n se mantuvo a 60 psi usando gas nitr6geno. Este procedimiento redujo el volumen de 12 L a aproximadamente 50 ml.

El filtrado del cultivo se dializ6 en 0,1% de bicarbonato de amonio usando una membrana de ester de celulosa MWCO de 8.000 kDa, con dos cambios de soluci6n de bicarbonato de amonio. Luego se determin6 la concentraci6n de protefna por ensayo de BCA disponible en el comercio (Pierce, Rockford, IL).

El filtrado del cultivo dializado luego se liofiliz6, y los polipeptidos resuspendidos en agua destilada. Los polipeptidos se dializaron contra 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano 0,01 mM, pH 7,5 (buffer de Bis-Tris propano), las condiciones iniciales para cromatograffa de intercambio ani6nico. Se realiz6 el fraccionamiento usando cromatograffa de profusi6n de gel en una columna de intercambio ani6nico POROS 146 II Q/M de 4,6 mm x 100 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) equilibrado en un buffer Bis-Tris propano 0,01 mM pH 7.5. Los polipeptidos se eluyeron con un gradiente NaCl lineal 0-0,5 M en el sistema del buffer anterior. El eluyente de la columna se control6 a una longitud de onda de 220 nm.

Las mezclas de polipeptidos que eluyen de la columna de intercambio i6nico se dializaron contra agua destilada y se liofilizaron. El material resultante se disolvi6 en 0,1% de acido trifluoroacetico (TFA) pH 1,9 en agua, y los polipeptidos se purificaron en una columna Delta-Pak C18 (Waters, Milford, MA) tamano de poro de 300 Angstrom, tamano de partfcula de 5 micrones (3,9 x 150 mm). Los polipeptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 0-60% del buffer de diluci6n (0,1% TFA en acetonitrilo). La velocidad de flujo fue 0,75 ml/minuto y el eluyente de HPLC se monitore6 a 214 nm. Se recolectaron las fracciones que contienen los polipeptidos eluidos para maximizar la pureza de las muestras individuales. Se obtuvieron aproximadamente 200 polipeptidos purificados.

Los polipeptidos purificados luego se analizaron para determinar la capacidad de inducir la proliferaci6n de celulas T en las preparaciones de PBMC. Los PBMC de los dadores conocidos por ser positivos para la prueba cutanea PPD y cuyas celulas T se mostr6 que proliferan en respuesta a PPD y las protefnas solubles brutas de MTB se cultivaron en medio que comprende RPMI 1640 suplementado con 10% de suero humano combinado y 50 ug/ml de gentamicina. Se anadieron los polipeptidos purificados por duplicado en concentraciones de 0,5 a 10 ug/mL. Despues de seis dfas de cultivo en placas de parte inferior redonda de 96 pocillos en un volumen de 200 ul, se extrajeron 50 ul del medio de cada pocillo para la determinaci6n de los niveles de IFN-y, que se describe a continuaci6n. Las placas luego se pulsaron con 1 uCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas adicionales, se recolectaron y se determin6 la captaci6n de tritio usando un contador de centelleo gaseoso. Las fracciones que produjeron proliferaci6n en ambos replicados tres veces mayor que la proliferaci6n observada en las celulas cultivadas en medio solo se consideraron positivas.

Se midi6 IFN-y usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Las placas de ELISA se recubrieron con un anticuerpo monoclonal de rat6n dirigido a IFN-y humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Los pocillos luego se bloquearon con PBS que contiene 5% (WN) de leche seca no grasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas luego se lavaron seis veces en PBS/0,2% de TWEEN-20 y las muestras diluidas 1:2 en medio de cultivo en las placas ELISA se incubaron todas la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente y se anadi6 un suero de IFN-y anti-humano de conejo policlonal diluido 1:3000 en PBS/10% de suero de cabra normal a cada pocillo. Las placas luego se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente, se lavaron y se anadi6 IgG anticonejo acoplado a peroxidasa de rabano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una diluci6n 1:2000 en PBS/5% de de leche seca no grasa, Despues de una incubaci6n adicional de dos horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se anadi6 sustrato de TMB. La reacci6n se detuvo despues de 20 min con acido sulfurico 1 N. La densidad 6ptica se determin6 a 450 nm usando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones que produjeron ambos replicados dando una DO dos veces mayor que la DO media de las celulas cultivadas en medio solo, mas 3 desvfos estandares, se consideraron positivas.

Para la secuenciaci6n, los polipeptidos se secaron en forma individual en filtros de fibra de vidrio tratado Biobrene™ (Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA). Los filtros con polipeptido se cargaron en un secuenciador de protefna Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492. Los polipeptidos se secuenciaron desde el amino terminal y usando qufmica de Edman tradicional. La secuencia de aminoacidos se determin6 para cada polipeptido por la comparaci6n del tiempo de retenci6n del derivado de aminoacidos de PTH con los estandares del derivado de PTH apropiados.

Usando el procedimiento descrito con anterioridad, se aislaron los antfgenos que tienen las siguientes secuencias N-terminales:

(a): Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu (SEQ ID No. 54);

(b): Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser (SEQ ID No. 55);

(c): Ala-Ala-Met-Lvs-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg (SEQ ID No. 56);

(d): Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro (SEQ ID No. 57);

(e): Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val (SEQ ID No. 58);

(f): Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro (SEQ ID No. 59);

(g): Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-Ala (SEQ ID No. 60) y

(h): Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly (SEQ ID No. 61),

en donde Xaa puede ser cualquier aminoacido.

Se aisl6 un antfgeno adicional que emplea una etapa de purificaci6n de HPLC microbore ademas del procedimiento descrito anteriormente. En forma especffica, se purificaron 20 ul de una fracci6n que comprende una mezcla de antfgenos proveniente de la etapa de purificaci6n cromatografica previamente descrita, en una columna de Aquapore C18 (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Foster City, CA) con un tamano de poro de 7 micrones, tamano de columna de 1 mm x 100 mm, en un Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 172 HPLC. Las fracciones se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 1% por minuto de acetonitrilo (que contiene 0,05% de TFA) en agua (0,05% TFA) con una velocidad de flujo de 80 ul/minuto. El eluyente se control6 a 250 nm. La fracci6n original se separ6 en 4 picos principales mas otros componentes menores y se obtuvo un polipeptido que se mostr6 que tiene un peso molecular de 12,054 Kd (por espectrometrfa de masa) y la siguiente secuencia N-terminal:

(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val -Ser-Phe-Ala-Asp (SEQ ID No. 62).

Se demostr6 que este polipeptido induce la proliferaci6n y producci6n de IFN-y en preparaciones de PBMC usando los ensayos descritos anteriormente.

Los antfgenos solubles adicionales se aislaron del filtrado del cultivo de M. tuberculosis de la siguiente manera. El filtrado del cultivo de M. tuberculosis se prepar6 como se describi6 anteriormente. Despues de la dialisis contra el buffer de Bis-Tris propano, a pH 5,5, se realiz6 el fraccionamiento usando cromatograffa de intercambio ani6nico en una columna Poros QE 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems) equilibrada en buffer de Bis-Tris propano pH 5,5. Los polipeptidos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-1,5 M en el sistema buffer anterior a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El eluyente de la columna se control6 a una longitud de onda de 214 nm.

Las fracciones que eluyen de la columna de intercambio i6nico se mezclaron y sometieron a cromatograffa de fase inversa usando una columna Poros R2 de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems). Los polipeptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (0,1% de TFA) a una velocidad de flujo de 5 ml/min. El eluyente se control6 a 214 nm.

Las fracciones que contienen los polipeptidos eluidos se liofilizaron y resuspendieron en 80 ul de 0,1% de TFA acuoso y tambien se sometieron a una cromatograffa de fase inversa en una columna de Vydac C4 de 4,6 x 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (0,1 % TFA) a una velocidad de flujo de 2 ml/min. El eluyente se control6 a 214 nm.

La fracci6n con actividad biol6gica se separ6 en un pico principal mas otros componentes menores. La transferencia Western de este pico en la membrana de PVDF revel6 tres bandas principales de pesos moleculares de 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd. Se determin6 que estos polipeptidos tienen las siguientes secuencias N-terminal, respectivamente:

(j): Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (SEQ ID No. 134)

(k): Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ilc-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ata-Asp; (SEQ ID No. 135) y

(l): Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEQ ID No. 136),

en donde Xaa puede ser cualquier aminoacido.

Mediante los ensayos descritos anteriormente, se demostr6 que estos polipeptidos inducen la proliferaci6n y producci6n de IFN-y en las preparaciones de PBMC. Las Fig. 1A y B muestran los resultados de tales ensayos que usan las preparaciones de PBMC provenientes de un primer y segundo dador, respectivamente.

Las secuencias de ADN que codifican los antfgenos denominados como (a), (c), (d) y (g) anteriores se obtuvieron por la selecci6n de una biblioteca gen6mica de M. tuberculosis usando oligonucle6tidos degenerados marcados en el extremo con 32P correspondientes a la secuencia N-terminal y que contiene sesgo del cod6n de M. tuberculosis. La prueba realizada mediante una sonda correspondiente al antfgeno (a) anterior identific6 un clon que tiene la secuencia provista en la SEQ ID No. 101. El polipeptido codificados por la SEQ ID No. 101 se proporciona en la SEQ ID No. 102. La prueba realizada mediante una sonda correspondiente al antfgeno (g) anterior identific6 un clon que tiene la secuencia provista en la SEQ ID No. 52. El polipeptido codificado por la SEQ ID No. 52 se proporciona en la SEQ ID No. 53. La prueba realizada mediante una sonda correspondiente al antfgeno (d) anterior identific6 un clon que tiene la secuencia provista en la SEQ ID No. 24, y la prueba realizada con una sonda correspondiente al antfgeno (c) anterior identific6 un clon que tiene la secuencia provista en la SEQ ID No: 25.

Las anteriores secuencias de aminoacidos se compararon con las secuencias de aminoacidos conocidos en el banco de genes usando el sistema ADN STAR. La base de datos buscada contiene algunas 173.000 protefnas y es una combinaci6n de las bases de datos Swiss, PIR junto con las secuencias de protefna traducidas (Versi6n 87). No se detectaron homologfas significativas con las secuencias de aminoacidos para antfgenos (a)-(h) y (1).

Se hall6 que la secuencia de aminoacidos para el antfgeno (i) es hom6loga a una secuencia de M. leprae. La secuencia de M. leprae de longitud completa se amplific6 del ADN gen6mico usando la secuencia obtenida de GENBANK. Esta secuencia se us6 luego para analizar la biblioteca de M. tuberculosis que se describe a continuaci6n en el Ejemplo 2 y se obtuvo una copia de longitud completa del hom6logo de M. tuberculosis (SEQ ID No. 99).

Se hall6 que la secuencia de aminoacidos para el antfgeno (j) es hom6loga con una protefna de M. tuberculosis conocida traducida de una secuencia de ADN. De acuerdo con el conocimiento de los inventores, no se ha demostrado previamente que esta protefna posee actividad estimuladora de las celulas T. Se hall6 que la secuencia de aminoacidos para el antfgeno (k) esta relacionada con una secuencia de M. leprae.

En la proliferaci6n y los ensayos de IFN-y descritos con anterioridad, usando tres posibles donantes positivos PPD, los resultados de los antfgenos representativos provistos con anterioridad se presentan en la Tabla 1:

TABLA 1 5

Resultados de la proliferaci6n de PBMC y ensayos de IFN-y

Secuencia: Proliferaci6n IFN-y

(a): + -

(c): +++ +++

(d): ++ ++

(g): +++ +++

(h): +++ +++

En la Tabla 1, las respuestas que dieron un fndice de estimulaci6n (SI) de entre 2 y 4 (en comparaci6n con celulas cultivadas en medio solo) se evaluaron como +, un SI de 4-8 o de 2-4 con una concentraci6n de 1 ug o menos se evalu6 como ++ y un SI de mas de 8 se evalu6 como +++. Se hall6 que el antfgeno de la secuencia (i) tenfa un alto SI (+++) para un donante y un menor SI (++ y +) para los otros dos donantes tanto en el ensayo de proliferaci6n como de IFN-y. Estos resultados indican que estos antfgenos son capaces de inducir la proliferaci6n y/o la producci6n de interfer6n-y.

EJEMPLO 2

USO DE SUEROS DE PACIENTES PARA AISLAR ANTiGENO DE M. TUBERCULOSIS

Este ejemplo ilustra el aislamiento de antfgenos de lisado de M. tuberculosis por control con suero de individuos infectados por M. tuberculosis.

Se anadi6 M. tuberculosis H37Ra desecado (Difco Laboratories) a una soluci6n al 2% de NP40, y alternativamente se homogeneiz6 y se sonic6 tres veces. La suspensi6n resultante se centrifug6 a 13.000 rpm en tubos de microfuga y el sobrenadante se coloc6 a traves de un filtro de jeringa de 0,2 micrones. El filtrado se uni6 a perlas Macro Prep DEAE (BioRad, Hercules, CA). Las perlas se lavaron extensivamente con 20 mM de Tris pH 7,5 y las protefnas unidas se eluyeron con NaCl 1 M. El eluido de NaCl 1 M se dializ6 durante la noche contra 10 mM de Tris, pH 7.5. La soluci6n dializada se trat6 con ADNasa y ARNasa a 0,05 mg/ml durante 30 min a temperatura ambiente y luego con a-D-manosidasa, 0,5 U/mg a pH 4,5 durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Despues de retornar a pH 7,5, el material se fraccion6 por medio de FPLC en una columna Bio Scale-Q-20 (BioRad). Las fracciones se combinaron en nueve grupos, se concentraron en un Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) y luego se controlaron con Western blot en cuanto a la actividad serol6gica usando un pool serico de pacientes infectados con M. tuberculosis que no era inmunorreactivo con otros antfgenos de la presente invenci6n.

La fracci6n mas reactiva se corri6 en SDS-PAGE y se transfiri6 a PVDF. Se cort6 una banda a aproximadamente 85 Kd para dar la secuencia:

en donde Xaa puede ser cualquier aminoacido.

La comparaci6n de esta secuencia con aquellas del banco de genes tal como se describi6 con anterioridad no revel6 homologfas significativas con secuencias conocidas.

EJEMPLO 3

PREPARACION DE SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN ANTiGENOS DE M. TUBERCULOSIS

Este ejemplo ilustra la preparaci6n de secuencias de ADN que codifican antfgenos de M. tuberculosis por control de una biblioteca de expresi6n de M. tuberculosis con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis, o con antisueros obtenidos contra antfgenos solubles de M. tuberculosis.

A. PREPARACION DE ANTiGENOS SOLUBLES DE M. TUBERCULOSIS USANDO ANTISUEROS DE CONEJO

Se aisl6 ADN gen6mico de la cepa de M. tuberculosis de H37Ra. El ADN se fragment6 aleatoriamente y se us6 para construir una biblioteca de expresi6n usando el sistema de expresi6n de Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Se gener6 antisuero de conejo contra las protefnas secretoras de las cepas de M. tuberculosis H37Ra, H37Rv y Erdman por la inmunizaci6n de un conejo con sobrenadante concentrado de los cultivos de M. tuberculosis. En forma especffica, el conejo se inmuniz6 primero por vfa subcutanea con 200 ug de antfgeno proteico en un volumen total de 2 ml que contiene 10 ug de dipeptido de muramilo (Calbiochem, La Jolla, CA) y 1 ml de adyuvante de Freund incompleto. Cuatro semanas mas tarde al conejo se le administr6 un refuerzo por vfa subcutanea con 100 ug de antfgeno en adyuvante de Freund incompleto. Finalmente, el conejo se inmuniz6 cuatro semanas mas tarde con 50 ug de antfgeno de protefna. Los antisueros se usaron para analizar la biblioteca de expresi6n como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,

5 1989. Las placas de bacteri6fago que expresan antfgenos inmunorreactivos se purificaron. El fagemido de las placas se rescat6 y se dedujeron las secuencias de nucle6tidos de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De estos, 25 representan secuencias que no se han identificado previamente en

M. tuberculosis humano. Los antfgenos recombinantes se expresaron y se usaron antfgenos purificados en los analisis inmunol6gicos descritos en el Ejemplo 1. Las protefnas fueron inducidas por IPTG y purificada por eluci6n

10 en gel, como se describi6 en Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995. Las secuencias representativas de las moleculas de ADN identificadas en esta prueba se proporcionan en las SEQ ID Nos: 1-25. Las correspondientes secuencias de aminoacidos predichas se muestran en las SEQ ID Nos. 63-87.

En la comparaci6n de estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes por medio de las bases de datos descritas anteriormente, se hall6 que los clones mencionados mas adelante en la presente como TbRA2A, 15 TbRA16, TbRA18, y TbRA29 (SEQ ID Nos. 76, 68, 70, 75) muestran alguna homologfa con las secuencias previamente identificadas en Mycobacterium leprae pero no en M. tuberculosis. TbRA11, TbRA26, TbRA28 y TbDPEP (SEQ ID Nos.: 65, 73, 74, 53) se han identificado previamente en M. tuberculosis. No se hallaron homologfas significativas en TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, ThRa19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 y los clones superpuestos TbRA35 y TbRA12 (SEQ ID Nos. 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78,

20 80, 79, 66). El clon TbRa24 esta superpuesto con el clon TbRa29.

Los resultados de los ensayos de proliferaci6n de PBMC y interfer6n-y realizados en antfgenos recombinantes representativos, y usando preparaciones de celulas T de varios pacientes inmunes a M. tuberculosis pacientes diferentes se presentan en las Tablas 2 y 3, respectivamente.

TABLA 2 TABLA 3

Resultados de la proliferaci6n de PBMC en antfgenos solubles representativos

Antfgeno: Paciente

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

TbRa1: - - ± ++ - - ± ± - - + ± -

TbRa3: - ± ++ - ± - - ++ ± - - - -

TbRa9: - - nt nt ++ ++ nt nt nt nt nt nt nt

TbRa10: - - ± ± ± + nt ± - + ± ± -

Thra11: ± ± + ++ ++ + nt - ++ ++ ++ ± nt

TbRa12: - - + + ± ++ + ± ± - - - -

TbRa16: nt nt nt nt - + nt nt nt nt nt nt nt

TbRa24: nt nt nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

TbRa26: - + nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

TbRa29: nt nt nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

ThRa35: ++ nt ++ ++ ++ ++ nt ++ ++ ++ ++ ++ nt

TbRaB: nt nt nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

TbRaC: nt nt nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

TbRaD: nt nt nt nt - - nt nt nt nt nt nt nt

AAMK: - - ± - - - nt - - - nt ± nt

YY: - nt - - - nt + nt

DPEP: - + - ++ - - nt ++ ± + ± ± nt

Control: - - - - - - - - - - - - -

nt = no ensayado

Resultados de la proliferaci6n de interfer6n-y de PBMC en antfgenos solubles representativos

Antfgeno: Paciente

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

TbRa1: + ++ +++ + - ± - - + ± -

TbRa3: - ± ++ - ± - - ++ ± - - - -

TbRa9: ++ + nt nt ++ - nt nt nt nt nt nt nt

TbRa10: + + ± ± ± + nt ± - + ± ± -

Tbra11: ± + ++ ++ + nt - ++ ++ ++ ± nt

TbRa12: - - + + ± +++ + ± ± - + - -

TbRa16: nt nt nt nt + + nt nt nt nt nt nt nt

TbRa24: nt nt nt nt + - nt nt nt nt nt nt nt

TbRa26: ++ ++ nt nt + + nt nt nt nt nt nt nt

TbRa29: nt nt nt nt + - nt nt nt nt nt nt nt

ThRa35: ++ nt ++ ++ +++ +++ nt ++ ++ +++ +++ ++ nt

TbRaB: nt nt nt nt ++ + nt nt nt nt nt nt nt

TbRaC: nt nt nt nt + + nt nt nt nt nt nt nt

TbRaD: nt nt nt nt + + nt nt nt nt nt nt nt

AAMK: - - ± - - - nt - - - nt ± nt

YY: - nt - - - nt + nt

DPEP: + + + +++ + - nt +++ ± + ± ± nt

Control: - - - - - - - - - - - - -

nt = no ensayado

En las Tablas 2 y 3, las respuestas que dieron un fndice de estimulaci6n (SI) de entre 1,2 y 2 (en comparaci6n con celulas cultivadas en medio solo) se evaluaron como ±, un SI de 2-4 se evalu6 como +, un SI de 4-8 o 2-4 con una concentraci6n de 1 ug o menos se evalu6 como ++ y un SI de mas de 8 se evalu6 como +++. Ademas, el efecto de

5 la concentraci6n sobre la proliferaci6n y la producci6n se interfer6n-y se muestra para dos de los antfgenos anteriores en la figura adjunta. Tanto para la proliferaci6n como la producci6n de interfer6n-y, el TbRa3 se evalu6 como ++ y TbRa9, como +.

Estos resultados indican que estos antfgenos solubles pueden inducir proliferaci6n y/o producci6n de interfer6n-y en celulas T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis.

10 B. USO DE SUEROS DE PACIENTES PARA IDENTIFICAR UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA EL ANTiGENO DE M. TUBERCULOSIS

La biblioteca de ADN gen6mico descrita anteriormente y una biblioteca de H37Rv adicional, se analizaron mediante mezclas de sueros obtenidas de los pacientes con tuberculosis activa. Para preparar la biblioteca de H37Rv, se aisl6 ADN gen6mico de la cepa de M. tuberculosis H37Rv, se someti6 a digesti6n parcial con Sau3A y se us6 para 15 construir una biblioteca de expresi6n usando el sistema de expresi6n de Lambda Zap (Stratagene, La Jolla, Ca). Tres mezclas de sueros diferentes, cada una que contiene suero obtenido de tres individuos con enfermedad pulmonar o pleural activa, se usaron en la selecci6n de expresi6n. Las mezclas se denominaron TbL, TbM y TbH, con referencia a la reactividad relativa con el lisado de H37Ra (es decir, TbL = reactividad baja, TbM = reactividad media y TbH = reactividad alta) en formato ELISA e inmunotransferencia. Tambien se emple6 una cuarta mezcla de

20 sueros de siete pacientes con tuberculosis pulmonar activa. Todos los sueros carecieron de aumento de reactividad con la protefna de uni6n a fosfato de M. tuberculosis H37Ra recombinante de 38 kD.

Todas las mezclas se pre-adsorbieron con el lisado de E. coli y se usaron para analizar las bibliotecas de expresi6n de H37Ra y H37Rv, descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Las placas de bacteri6fago que expresan antfgenos inmunorreactivos se purificaron. El fagemido de las placas se rescat6 y se dedujeron las secuencias de nucle6tidos de los clones de

M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De estos, 31 representaron secuencias que no se han identificado previamente en M. tuberculosis humano. Las secuencias representativas de las moleculas de ADN identificadas en esta prueba 5 se proporcionan en las SEQ ID Nos: 26-51 y 105. De estos, TbH-8 y TbH-8-2 (SEQ. ID NO. 105) son secuencias de ADN no contiguas del mismo clon, y TbH-4 (SEQ. ID NO. 43) y TbH-4-FWD (SEQ. ID NO. 44) son secuencias de ADN no contiguas del mismo clon. Las secuencias de aminoacidos para los antfgenos de la presente identificados como Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9, y TbH-12 se muestran en las SEQ ID Nos.: 88-92. La comparaci6n de estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes mediante las bases de datos identificadas

10 anteriormente no revelaron homologfas significativas para TbH-4, TbH-8, TbH-9 y TbM-3, si bien se hallaron homologfas mas debiles en TbH-9. Se hall6 que TbH-12 es hom6loga con una protefna antigenica de 34 kD previamente identificada en M. paratuberculosis (Ace. No. S28515). Se hall6 que Tb38-1 se ubica 34 pares de bases corriente arriba del marco de lectura abierto para el antfgeno ESAT-6 previamente identificados en M. bows (Ace. No. U34848) y en M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun 63:1710-1717, 1995).

15 Las sondas derivadas de Tb38-1 y TbH-9, ambos aislado de una biblioteca de H37Ra, se usaron para identificar clones en una biblioteca de H37Rv. Tb38-1 hibrid6 en Tb38-IF2, Tab38-IF3, Tbb38-1F5 y Tb38-1 F6 (SEQ. ID NOS. 112, 113, 116, 118 y 119). (SEQ ID NOS. 112 y 113 son secuencias no contiguas del clon Tb38-1F2). Dos marcos de lectura abierta se dedujeron en Tb38-1F2; uno corresponde a Tb37FL (SEQ. ID. NO. 114), el segundo, una secuencia parcial, puede ser el hom6logo de Tb38-1 y se denomina Tb38-IN (SEQ. ID NO. 115). La secuencia de

20 aminoacidos deducida de Tb38-1 F3 se presenta en SEQ. ID. NO. 117. Una sonda TbH-9 identific6 a tres clones en la biblioteca H37Rv. TbH-9-FL (SEQ. ID NO. 106), que puede ser el hom6logo de TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEQ. ID NO. 108), y TbH-9-4 (SEQ. ID NO. 110), los cuales son todos secuencias muy relacionadas con TbH-9. Las secuencias de aminoacidos deducidas para estos tres clones se presentan en SEQ ID NOS. 107, 109 y 111.

Los resultados de ensayos de celulas T realizados en Tb38-1, ESAT-6 y otros antfgenos recombinantes 25 representativos se presentan en las Tablas 4A, B y 5, respectivamente, mas abajo:

TABLA 4A

Resultados de la proliferaci6n de PBMC en antfgenos representativos

Antfgeno: Donante

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tb38.1: +++ + - - - ++ - + - ++ +++

ESAT-6: +++ + + + + - + + ++ +++

TbH-9: ++ ++ - ++ ± ± ++ ++ ++ ++ ++

TABLA 4B TABLA 5

Resultados de la producci6n de interfer6n-y de PBMC en antfgenos representativos

Antfgeno: Donante

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tb38.1: +++ + - + + +++ - + - +++ +++

ESAT-6: +++ + + + + + - + + +++ +++

TbH-9: ++ ++ - ++ ± ± +++ +++ ++ +++ ++

Sfntesis de las respuestas de celulas T en antfgenos representativos

Antfgeno: Proliferaci6n Interfer6n-y Total

Paciente 4: Paciente 5 Paciente 6 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6

TbH9: ++ ++ ++ +++ ++ ++ 13

TbM7: - + - ++ + - 4

TbH5: - + + ++ ++ ++ 8

TbL23: - + ± ++ ++ + 7,5

TbH4: - ++ ± ++ ++ ± 7

Control: - - - - - - 0

TABLA 6

Resultados de la proliferaci6n de PBMC en antfgenos TB38-1

Antfgeno: Paciente

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

pep1: - - - - ± - - - - ± - - +

pep2: ± - - - ± - - - ± ± - - +

pep3: - - - - - - - - ± - - - ±

pep4: ++ - - - - - + - ± ± - - +

pep5: ++ ± - - - - + - ± - - - +

pep6: - ++ - - - - ± - ± + - - +

Control: - - - - - - - - - - - - -

Estos resultados indican que tanto el antfgeno de M. tuberculosis de la invenci6n como ESAT-6 pueden inducir la

5 proliferaci6n y/o la producci6n de interfer6n-y en celulas T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. Segun el mejor de los conocimientos de los inventores, no se mostr6 previamente que ESAT-6 estimula las respuestas inmunes humanas.

Un grupo de seis peptidos superpuestos que cubre la secuencia de aminoacidos del antfgeno Tb38-1 se construy6 usando el metodo descrito en el Ejemplo 4. Las secuencias de estos peptidos, de ahora en mas mencionados como

10 pep1-6, se proveen en SEQ ID Nros. 93-98, respectivamente. Los resultados de ensayos de celulas T usando estos peptidos se muestran en las Tablas 6 y 7. Estos resultados confirman la existencia y ayudan a localizar epitopos de celulas T dentro de Tb38-1 capaz de inducir la proliferaci6n y la producci6n de interfer6n en celulas T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis.

TABLA 6 5

Resultados de la proliferaci6n de PBMC en antfgenos TB38-1

Antfgeno: Paciente

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

pep1: - - - - ± - - - - ± - - +

pep2: ± - - - ± - - - ± ± - - +

pep3: - - - - - - - - ± - - - ±

pep4: ++ - - - - - + - ± ± - - +

pep5: ++ ± - - - - + - ± - - - +

pep6: - ++ - - - - ± - ± + - - +

Control: - - - - - - - - - - - - -

35 TABLA 7

Resultados de la producci6n de interfer6n-y de PBMC en antfgenos TB38-1

Antfgeno: Paciente

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

pep1: + - - - ± - - - - ± - - +

pep2: - - - ± - - - ± ± - - +

pep3: - - - - - - - - ± - - - ±

pep4: ++ - - - - - + - ± ± - - +

pep5: ++ ± - - - - + - ± + - - +

pep6: + ++ - - - - ± - ± + - - +

Control: - - - - - - - - - - - - -

EJEMPLO 4

PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE UN POLIPEPTIDO A PARTIR DEL DERIVADO DE PROTEiNA PURIFICADO DE TUBERCULINA

Se aisl6 el polipeptido de M. tuberculosis del derivado de protefna purificada de tuberculina (PPD) de la siguiente manera.

PPD se prepar6 como se public6 con alguna modificaci6n (Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44:9-25, 1941).

La cepa de M. tuberculosis Rv se cultiv6 durante 6 semanas en medio sintetico en frascos giratorios a 37 "C. Los frascos que contienen el crecimiento bacteriano luego se calentaron a 100 "C en vapor de agua durante 3 horas. Los cultivos se filtraron esteriles mediante un filtro de 0,22 u y la fase lfquida se concentr6 20 veces usando una membrana lfmite de 3 kD. Las protefnas se precipitaron una vez con 50% de soluci6n de sulfato de amonio y ocho veces con 25% de soluci6n de sulfato de amonio. Las protefnas resultantes (PPD) se fraccionaron por cromatograffa lfquida en fase inversa (RP-HPLC) usando una columna de C18 (7,8 x 300 mM; Waters, Milford, MA) en un sistema de HPLC Biocad (Perseptive Biosystems. Framingham, MA). Las fracciones se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 0-100% de buffer (0,1% de TFA en acetonitrilo). La velocidad de flujo fue 10 ml/minuto y el eluyente se control6 a 214 nn y 280 nn.

Se recolectaron seis fracciones, se secaron, suspendieron en PBS y se analizaron individualmente en cobayos infectados con M. tuberculosis para la inducci6n de la reacci6n de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH). Se hall6 que una fracci6n induce una reacci6n DTH fuerte y se fraccion6 posteriormente por RP-HPLC en una columna microbore Vydac C18 (Cat. No. 218TP5115) en un Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLC. Las fracciones se eluyeron con un gradiente lineal de 5-100% de buffer (0,05% de TFA en acetonitrilo) con una velocidad de flujo de 80 ul/minuto. El eluyente se control6 a 215 nm. Se recolectaron ocho fracciones y se ensayaron en cuanto a la inducci6n de DTH en conejillos de Indias infectados con M. tuberculosis. Se hall6 que una fracci6n induce fuerte DTH de aproximadamente 16 mm de induraci6n. Las otras fracciones no indujeron DTH detectable. La fracci6n positiva se someti6 a electroforesis en gel SDS-PAGE y se hall6 que contenfa una banda de protefna sola de aproximadamente 12 kD de peso molecular.

Este polipeptido, de ahora en mas mencionado como DPPD, se secuenci6 de la terminal amino usando un secuenciador de protefnas Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 tal como se describi6 con anterioridad y se hall6 que tenfa la secuencia N-terminal mostrada en SEQ ID No.: 129. La comparaci6n de esta secuencia con secuencias conocidas en el banco de genes tal como se describi6 previamente no revel6 homologfas conocidas. Se aislaron cuatro fragmentos de bromuro de cian6geno de DPPD y se hall6 que tenfan las secuencias mostradas en SEQ ID Nos.: 130-133.

La capacidad del antfgeno DPPD de estimular PBMC humano para proliferar y producir IFN-y se ensay6 tal como se describe en el Ejemplo 1. Tal como se indica en la Tabla 8, se hall6 que DPPD estimula la proliferaci6n y genera la producci6n de grandes cantidades de IFN-y, mas que lo producido por PPD comercial.

TABLA 8

Resultados de los ensayos de proliferaci6n e interfer6n-y en DPPD

Donante de PBMC: Estimulador Proliferaci6n (CPM) IFN-y (DO450)

A: Medio 1,089 0,17

PPD (comercial): 8,394 1,29

DPPD: 13,451 2,21

B: Medio 450 0,09

PPD (comercial): 3929 126

DPPD: 6,184 1,49

C: Medio 541 0,11

PPD (comercial): 8,907 0,76

DPPD: 23,024 >2,70

EJEMPLO 5

SiNTESIS DE POLIPEPTIDOS SINTETICOS

Los polipeptidos se pueden sintetizar en un sintetizador de peptidos Millipore 9050 usando qufmica de FMOC con

5 activaci6n de HPTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio). Se puede unir una secuencia Gly-Cys-Gly al termino amino del peptido para proporcionar un metodo de conjugaci6n o rotulaci6n del peptido. El clivaje de los peptidos desde el soporte s6lido se puede llevar a cabo usando la siguiente mezcla de clivaje: acido trifluoroacetico:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Despues de clivar durante 2 horas, los peptidos se pueden precipitar en eter metil-t-butflico frfo. Los pellets de peptido se pueden disolver luego en agua con 0,1% de

10 acido trifluoroacetico (TFA) y liofilizar antes de la purificaci6n por HPLC en fase inversa C 18. Un gradiente del 0%-60% de acetonitrilo (con 0,1% de TFA) en agua (con 0,1% de TFA) se puede usar para eluir los peptidos. Despues de la liofilizaci6n de las fracciones puras, los peptidos se pueden caracterizar usando espectrometrfa de masa por electronebulizaci6n y por analisis de aminoacidos.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1): INFORMACION GENERAL:

(i): SOLICITANTES: Corixa Corporation

(ii): TiTULO DE LA INVENCION: COMPUESTOS Y METODOS PARA INMUNOTERAPIA Y DIAGNOSIS DE TUBERCULOSIS

(iii) CANTIDAD DE SECUENCIAS: 137

(iv): DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: SEED y BERRY LLP

(B): CALLE: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue

(C): CIUDAD: Seattle

(D): ESTADO: Washington

(E): PAiS: ESTADOS UNIDOS

(F): CODIGO POSTAL: 98104-7092

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-ODS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Patentin Release #1.0. Versi6n #1.30

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A): NUMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE PRESENTACION: 27 DE AGOSTO DE 1996

(C): CLASIFICACION:

(viii) INFORMACION DEL ABOGADO / AGENTE:

(A): NOMBRE: Maki, David J.

(B): NUMERO DE REGISTRO: 31.392

(C): NUMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 210121.411PC

(ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACION:

(A): TELEFONO: (206) 622-4900

(B): TELEFAX: (206) 682-6031

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:1:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 766 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:2:

(A): LONGITUD: 752 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:3:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 813 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 4:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 447 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:5:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 604 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal (xi)

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:6:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 633 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal (xi)

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:7:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1362 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:8:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1458 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:9:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 862 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:9:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:10:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 622 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal (xi)

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:10:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:11:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1200 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal (xi)

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:12:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1155 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:13:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1771 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:14:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1058 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:15:

(1): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 542 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:18:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1482 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:19:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 876 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:20:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1021 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:21:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 321 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:22:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 373 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:23:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 352 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:24:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 726 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:25:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 580 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:26:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 160 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:27: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 272 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 15 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:28:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 317 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:29:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 182 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:30:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 308 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:31:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 267 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:32:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 189 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:33:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 851 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:34:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 254 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:35:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 408 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:36:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 181 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:37:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 290 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:40:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 53 pares de base

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:42: 15 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 132 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 20 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:43:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 702 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:44:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 298 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

10: (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:38:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

15: (A) LONGITUD: 34 pares de base (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: monocatenario (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

GATCCAGTGG CATGGNGGGT GTCAGTGGAA GCAT: 34

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:39:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

20: (A) LONGITUD: 155 pares de base (B) TIPO: acido nucleico. (C) TIPO DE CADENA: monocatenario (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

(B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA:: single (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

5: ATGGCGTTCA CGGGGCGCCG GGGACCGGGC AGCCCGGNGG GGCCGGGGGG TGG 53

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:41:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

10: (A) LONGITUD: 132 pares de base (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: monocatenario (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:45:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1058 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:46:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 327 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:47:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 170 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:48:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 127 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:49:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 81 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TIPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID ND:49:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:50:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:: 149 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:51:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 355 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA:- monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:52:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 999 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:53:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 332 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:54:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:54:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:55:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:56:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:57: 25 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal 30 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:58:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 14 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:59: 5 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 13 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal 10 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:60:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

20 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:61:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: 25 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:62:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:63:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 187 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:64:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 148 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:65:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 230 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:66:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 132 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:67:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 100 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:68:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 163 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:69:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 344 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:70:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 485 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:71:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 267 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:72:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 97 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:73:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 364 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:74:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 309 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:75:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 580 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:76:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 233 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:77:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 66 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:78:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 69 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:79:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 355 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:80:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 205 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:81:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 286 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido 10 (C) TIPO DE CADENA: monocatenario

(D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:82:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 173 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO:82:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:83: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD; 107 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 15 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:84:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 125 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:: single

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:85:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 117 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:86:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 103 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:87:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 88 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:88:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 95 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:89:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 166 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:90:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 5 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:91:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 263 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:92:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 303 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:93:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 28 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:94:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:95: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 27 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 15 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:96:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 27 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:

25 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:97:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 27 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario 30 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:98:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 28 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:99: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 507 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 15 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:99:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:100:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 168 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:100:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:101:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 500 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:101:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:102:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 96 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:102:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:103:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 154 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:103:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:104:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 51 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:104:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:105:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 282 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:105:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ 10 NO:106:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1565 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:106:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:107:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 391 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:107:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:108:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 259 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:108:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:109:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 86 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:109:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:110: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1109 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal 15 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:110:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:111:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 341 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:111:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:112:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1256 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:112:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ 10 NO:113:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 432 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:113:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:114:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 368 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:114:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:115:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 12 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:115:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:116:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 396 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:116:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:117:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 80 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:117:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:118:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 387 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: monocatenario 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:118:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:119:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 272 pares de base

(B): TIPO: acido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: monocatenario

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:119:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:120:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:120:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID N0:121:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:121:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:122:

(1): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:122:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:123:

(1) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:123:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:124:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 14 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:124:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:125:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 13 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:125:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:126:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:126:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:127:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO:127:

15 (2) INFORMACION PARA LA SEQ 10 NO:128:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: 20 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:128:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:129:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:129:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:130:

(1): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 7 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:130:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:131:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 10 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(ix): CARACTERiSTICA:

(D) OTRA INFORMACION: /nota = "El segundo residuo puede ser Pro o Thr"

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:131:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:132:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 9 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(ix): CARACTERiSTICA:

(D) OTRA INFORMACION: /nota= "El tercer residuo puede ser Gln o Leu"

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:132:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:133:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 9 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:133:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:134:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:134:

(2): INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:135:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:135:

10 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:136:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C) TIPO DE CADENA: 15 (D) TOPOLOGiA: lineal

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:136:

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:137:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 aminoacidos

(B): TIPO: aminoacido

(C): TIPO DE CADENA:

(D): TOPOLOGiA: lineal

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:137:

Claims

REIVINDICACIONES

1.Un polipeptido aislado que comprende:

(i)

la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102; o

(ii)

una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
2. Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:
102.
3. Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 2, que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:
102.
4.Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que comprende una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
5.Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 4, que consiste en una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
6.

Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 4 6 5, en donde dicha porci6n inmunogenica tiene una secuencia N-terminal de acuerdo con la SEQ ID NO: 120.
7.

Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 6, en donde dicha porci6n inmunogenica consiste en residuos 15-96 de la SEQ ID NO: 102.
8.

Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica un polipeptido que comprende:

(i)

una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102; o

(ii)

una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
9. Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 8, que consiste en una secuencia de nucle6tidos que codifica un polipeptido que comprende:

(i)

una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102; o

(ii)

una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
10.Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 8 6 9, en donde dicho polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102.
11. Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 10, en donde dicho polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 102.
12.Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 8 6 9, en donde dicho polipeptido comprende una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
13.

Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 12, en donde dicho polipeptido consiste en una porci6n inmunogenica de SEQ ID NO: 102.
14.

Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 12 6 13, en donde dicha porci6n inmunogenica tiene una secuencia N-terminal de acuerdo con SEQ ID NO: 120.
15.

Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 14, en donde dicha porci6n inmunogenica consiste en los residuos 15-96 de la SEQ ID NO: 102.
16.

Una molecula recombinante de acido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 8, que comprende la secuencia de nucle6tidos de SEQ ID NO: 101.
17.Un vector de expresi6n que comprende una molecula de acido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16.
18.Una celula huesped aislada transformada con un vector de expresi6n de acuerdo con la reivindicaci6n 17.
19.

Un polipeptido combinado que comprende un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y una o varias secuencias adicionales de M. tuberculosis inmunogenicas, que se unen por medio de una ligaci6n peptfdica.
20.

Una composici6n farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador fisiol6gicamente aceptable.
21.

Una composici6n farmaceutica que comprende una molecula de acido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 y un portador fisiol6gicamente aceptable.
22.

Una composici6n farmaceutica que comprende un polipeptido combinado de acuerdo con la reivindicaci6n 19 y un portador fisiol6gicamente aceptable.
23.

Una vacuna que comprende un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un mejorador no especffico de respuesta inmune.
24.

Una vacuna que comprende una molecula de acido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 y un mejorador no especffico de la respuesta inmune.
25.

Una vacuna que comprende un polipeptido combinado de acuerdo con la reivindicaci6n 19 y un mejorador no especffico de la respuesta inmune.
26.

Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde el mejorador no especffico de la respuesta inmune es un adyuvante.
27.

Un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar como un medicamento.
28.

Un polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 27 para usar en el tratamiento o la prevenci6n de tuberculosis.
29.

Un polinucle6tido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 para usar como un medicamento.
30.

Un polinucle6tido de acuerdo con la reivindicaci6n 29 para usar en el tratamiento o la prevenci6n de tuberculosis.
31.

Uso de:

(i)

un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(ii)

una molecula de acido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16; o

(iii) un polipeptido combinado de acuerdo con la reivindicaci6n 19; en la fabricaci6n de una vacuna para inducir inmunidad de protecci6n en un paciente.
32.

Uso de un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricaci6n de un diagn6stico para detectar tuberculosis en un paciente.
33.

Un kit de diagn6stico que comprende:

(a)

un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(b)

aparato suficiente para poner en contacto dicho polipeptido con las celulas dermicas de un paciente.
34. Un metodo para la producci6n de un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la expresi6n recombinante de una molecula de ADN de acuerdo con la reivindicaci6n 8 a 16 en una celula huesped.