ES2335344T3 - Procedimiento para detectar un marcador de cancer de colon. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar cáncer de colon detectando COX-2 a partir de heces, que comprende los siguientes procedimientos: a) un procedimiento para homogeneizar las heces recogidas en presencia de un inhibidor de RNasa, para preparar una suspensión de las mismas; implicando dicho procedimiento ningún procedimiento para separar los componentes celulares de las heces; b) un procedimiento para extraer el ARN de la suspensión obtenida en a); c) un procedimiento para transcribir de forma inversa el ARN extraído para dar ADNc; d) un procedimiento para amplificar el ADNc obtenido; y e) un procedimiento para detectar la COX-2 a partir del ADNc amplificado.
Description
Procedimiento para detectar un marcador de
cáncer de colon.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar un marcador tumoral para diagnosticar el
cáncer de colon que comprende un procedimiento para extraer el ARN
de una muestra biológica, caracterizado porque no implica ningún
procedimiento para separar los componentes celulares de la muestra
biológica.
Las muertes por cáncer de colon están
aumentando. La cantidad de muertes por cáncer de colon es la cuarta
mayor entre las muertes de hombres, y la segunda mayor entre las
muertes de mujeres en todas las muertes por cáncer (Statistics of
Japanese cancer deaths in 1999 (Estadística de muertes por cáncer en
Japón en 1999)). De acuerdo con una estimación de los pacientes de
cáncer en 2015 en Japón, se estima que la cantidad de pacientes con
cáncer de colon será la primera tanto en hombres como en mujeres.
Por tanto se requieren medidas globales para contrarrestar el
cáncer de colon incluyendo prevención secundaria, y la exploración
en masa de cáncer puede ser uno de los procedimientos más
eficaces.
Para la exploración en masa de cáncer, es
importante que el procedimiento de detección sea fácil y no
invasivo. El único procedimiento no invasivo ahora disponible es el
procedimiento para examinar la existencia de sangre oculta en las
heces, es decir, el ensayo de sangre oculta fecal, y se usa
extensivamente como procedimiento convencional de la exploración en
masa de cáncer de colon.
Sin embargo, el ensayo de sangre oculta fecal
tiene sensibilidad y especificidad bastante baja (la sensibilidad:
del 30 al 90%, la especificidad: del 70 al 98%), porque la aparición
de hemoglobina en heces no es específica de tumor. Por lo tanto,
hay una deficiencia de que existen bastantes falsos negativos y
falsos positivos.
Además, en el diagnóstico de cáncer de colon,
después de o en paralelo con la exploración por el ensayo
inmunológico de sangre oculta fecal, se ha adoptado colonoscopia
total o una combinación de Ba-enema y
sigmoidoscopia. Por tanto hay una deficiencia de que se necesita
mucho tiempo y esfuerzo.
Como procedimientos alternativos al ensayo de
sangre oculta fecal, se ha informado de procedimientos que usan
ADN, tales como la detección de mutaciones en los genes
K-ras, p-53, o APC, o la detección
de inestabilidad de microsatélites en heces (D. Sidransky, y col.,
Science, 256, 3 de abril, 1992, 102-105; S. M. Dong,
y col., Journal of the National Cancer Institute, 93 (11), 11 de
junio, 2001, 858-865; G. Traverso, y col., The New
England Journal of Medicine, 346 (5), 31 de enero, 2002,
311-320; G. Traverso, y col., The Lancet, 359, 2 de
febrero, 2002, 403-404).
Estos procedimientos que usan ADN son no
invasivos y pueden capturar los cambios directos en las células
cancerosas, y tienen características de elevada especificidad, y
por tanto se considera que son procedimientos prometedores en el
futuro. Sin embargo, tienen el demérito de que la sensibilidad es
más baja en comparación con el ensayo de sangre oculta fecal, una
técnica anterior, y conllevan bastante tiempo y esfuerzo.
Además, como procedimiento alternativo al ensayo
de sangre oculta fecal, para detectar la expresión génica más
directamente, se ha desarrollado un procedimiento para detectar el
ARNm de la proteína quinasa C (PKC) o similares en las heces (L. A.
Davidson, y col., Carcinogenesis, 19(2), 1998,
253-257; R. J. Alexander y R. F. Raicht, Digestive
Diseases and Sciences, 43(12), 1998,
2652-2658; T. Yamao, y col., Gastroenterology,
114(6), 1998, 1198-1205).
Sin embargo, el procedimiento que hace uso del
ARN descrito anteriormente podría no tener una sensibilidad que
exceda la del procedimiento de ensayo de sangre oculta fecal, porque
era imposible extraer ARN fácilmente y de forma eficaz de una
pequeña cantidad de heces.
Se ha conocido un procedimiento para detectar
ARN de forma cualitativa y cuantitativa combinando el procedimiento
de PCR con la reacción de la transcriptasa inversa (RT). Este
procedimiento de RT-PCR es superior a la técnica de
transferencia de Northern en la elevada sensibilidad para poder
detectar moléculas traza, y es más ventajoso que la técnica de
hibridación in situ en velocidad y facilidad de
manipulación.
Sin embargo, como el ARN es más inestable en
comparación con el ADN y siempre está sometido a un peligro de
descomposición por enzimas de digestión del ARN (RNasas) que son
ubicuas en todas las muestras biológicas y muy estables, es
necesario un control estricto para evitar la contaminación de RNasas
en el procedimiento de RT-PCR, durante y después de
los procedimientos de purificación del ARN.
Por lo tanto, cuando se extrae ARN de las heces,
que es una muestra biológicamente muy rudimentaria, ha sido
necesario un procedimiento para separar la fracción celular por
adelantado, para excluir los efectos de las RNasas.
Por consiguiente, se ha considerado imposible
extraer ARN directamente de heces que contienen una enorme cantidad
de RNasas derivadas de una cantidad muy grande de microorganismos y,
se ha considerado que la separación de la fracción celular es
esencial para eliminar al menos las RNasas exógenas derivadas de los
microorganismos o similares.
Sorprendentemente, sin embargo, el inventor de
la presente invención descubrió que, en algunos casos, la
homogeneización de materiales biológicos congelados en presencia de
inhibidores de RNasa puede resolver los problemas descritos
anteriormente, y ha completado la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es proporcionar un procedimiento para detectar un marcador
tumoral, no invasivo y conveniente, para diagnosticar el cáncer de
colon, en el que dicho marcador tumoral es COX-2,
que sea superior en sensibilidad y especificidad al ensayo de sangre
oculta fecal existente.
La presente invención es un procedimiento para
detectar el cáncer de colon detectando COX-2, que
comprende el siguiente procedimiento;
a) un procedimiento para homogeneizar la muestra
biológica recogida en presencia de un inhibidor de RNasa para
preparar una suspensión de la misma;
caracterizado porque no implica ningún
procedimiento para separar los componentes celulares de la muestra
biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, dicha muestra biológica recogida está
preferiblemente congelada.
Además, la presente invención es el
procedimiento descrito anteriormente, en el que el inhibidor de
RNasa es tiocianato de guanidina.
Además, la presente invención es el
procedimiento descrito anteriormente, en el que la muestra biológica
es heces.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra un resultado de una
electroforesis del Ejemplo 2. El carril 1 muestra el ARN total
extraído de heces humanas con el procedimiento de Alexander y col.
El carril 2 muestra el ARN total extraído de heces humanas con el
procedimiento de la presente invención. El carril 3 muestra el ARN
total extraído de un tejido de cáncer de colon humano. El carril M
muestra los marcadores de peso molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
En cuanto a los inhibidores de RNasa de la
presente invención, se incluyen tiocianato de guanidina, Isogene,
Ultraspec II (una marca comercial registrada) y similares.
Las muestras biológicas de la presente invención
son heces, y más preferiblemente heces humanas.
Las muestras biológicas de la presente invención
pueden usarse como tales o, en algunos casos, después de
congelarlas.
Los procedimientos de congelación pueden ser
cualquier procedimiento convencional, y preferiblemente un
procedimiento que usa nitrógeno líquido. La temperatura de
congelación (y conservación) es de -1 a -196ºC, preferiblemente de
-20 a -196ºC, preferiblemente de -75 a -196ºC, más preferiblemente
de -110 a -196ºC, y mucho más preferiblemente de -196ºC.
La muestra congelada puede conservarse en estado
congelado. La temperatura de conservación es de -75 a -196ºC,
preferiblemente de -110 a -196ºC, y más preferiblemente de -196ºC.
El periodo de conservación es de un día a 10 años, preferiblemente
de un día a 3 años, y más preferiblemente de un día a un año.
El marcador tumoral usado en la presente
invención es COX-2, metaloproteasa de matriz (MMP),
c-met, variantes de CD44, EGF-R,
EF-1, Wnt-2, Bradeiona, SKP2,
KPC-1, KPC-2, PRL-3,
Angiogenina, Integrina, Snail, Desadherina, o similares, y es
preferiblemente COX-2.
Los procedimientos c) a e) descritos
anteriormente se denominan el procedimiento de
RT-PCR, y puede realizarse, por ejemplo, de acuerdo
con la descripción de T. Sekiya y col. eds., Forefront of PCR
method, 1997, Kyoritu Pub., 187-196.
La extracción del ARN de la suspensión puede
realizarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica, y
usando kits disponibles en el mercado, por ejemplo, el RNeasy Mini
(QIAGEN) o RNA Extraction Kit (Pharmacia Biotech).
"Transcripción inversa" en la presente
invención significa la conversión de ARN en el ADN complementario
(ADNc) usando una transcriptasa inversa. La reacción de
transcripción inversa se realiza habitualmente usando una solución
que contiene un tampón, sales tales como MgCl_{2}, KCl, y
similares, ditiotreitol (DTT), un cebador, los tipos de
desoxirribonucleótidos, inhibidores de RNasa, y una transcriptasa
inversa. Las sales descritas anteriormente pueden remplazarse
apropiadamente por otras sales después del ensayo. También pueden
añadirse proteínas tales como gelatina, albúmina o similares, o
detergentes.
Para la amplificación del ADNc realizada después
de la transcripción inversa, habitualmente se adopta la técnica de
PCR. La mezcla de reacción de PCR habitualmente contiene un tampón,
sales tales como MgCl_{2} y KCl, cebadores, los tipos de
desoxirribonucleótidos, y una polimerasa resistente al calor. Las
sales descritas anteriormente pueden remplazarse apropiadamente por
otras sales después del ensayo. También pueden añadirse proteínas
tales como gelatina, albúmina o similares, dimetilsulfóxido,
detergentes, o similares.
Para la amplificación del ADNc, puede usarse el
procedimiento LAMP (Patente japonesa Nº 3313358) o el procedimiento
ICAN (Patente japonesa abierta a inspección pública Nº
2001-136965).
Un "cebador" en la presente invención
significa un oligonucleótido que funciona como punto de inicio de la
síntesis en el caso de síntesis de ADNc o de amplificación de un
polinucleótido. El cebador es preferiblemente monocatenario, pero
también puede usarse bicatenario. Cuando el cebador es bicatenario,
es preferible hacerlo monocatenario antes de la reacción de
amplificación. El cebador puede sintetizarse de acuerdo con un
procedimiento bien conocido en la técnica, o puede aislarse de los
organismos vivos.
La transcriptasa inversa usada en la reacción de
transcripción inversa es una enzima capaz de transcribir de forma
inversa el ARN en ADNc. En cuanto a la transcriptasa inversa, hay
transcriptasas inversas derivadas de retrovirus tales como RAV
(virus asociado a Rous), AMV (virus de la mieloblastosis aviar) y
similares, y transcriptasas inversas derivadas de retrovirus de
ratón tales como MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney) y
similares, pero no está limitada a las anteriores.
Como polimerasa resistente al calor usada para
la PCR, puede nombrarse la Taq polimerasa, pero no está limitada a
esta.
Como procedimiento de detección del ADN
amplificado, puede usarse electroforesis usando gel agarosa, pero
el procedimiento puede no estar limitado a éste.
Además, el kit de acuerdo con la presente
invención puede contener instrucciones que describen los
procedimientos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención, pero no limitan la invención.
Entre los pacientes hospitalizados en el First
Department of Internal Medicine of Hamamatsu University School of
Medicine para examen detallado y terapia, se seleccionaron 30 casos
confirmados de cáncer de colon y 22 casos de alteración no tumoral
o inflamatoria en su colon (sin trastorno colónico) por colonoscopia
total como sujetos del estudio. Se han obtenido consentimientos
informados de todos los casos.
Tan pronto como fue posible después del muestreo
de heces, las heces se separaron en tubos de 5 ml de aproximadamente
1 g cada uno, se congelaron usando nitrógeno líquido, y se
almacenaron a -80ºC. Además, para comparación y referencia, se
midió la hemoglobina (Hb) humana en las heces de cada muestra por el
ensayo inmunológico de sangre oculta fecal. Se congelaron muestras
de biopsia tisular, tomadas de las partes tanto con cáncer como
normal cuando se realizó la endoscopia antes de la terapia, por
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Después, las heces se
homogeneizaron usando un homogeneizador, sal guanidina, y fenol, y
se extrajo el ARN completo usando cloroformo y etanol.
Se transcribió de forma inversa un pg del ARN
obtenido usando ReverScript II (una marca comercial registrada),
(volumen de mezcla de reacción: 20 \mul, Wako Pure Chemical
Industries) para dar ADNc. Una parte del mismo se amplificó
mediante PCR anidado usando GeneTaq (Wako). El producto de PCR
obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 4%, y se
tiñó con bromuro de etidio.
Aquí, los cebadores usados fueron: los cebadores
aleatorios en transcripción inversa, y en PCR, fueron los
presentados por Gerhard (JJCO, 1994) para CEA, y se diseñaron
originalmente para COX-2. La primera ronda de PCR
se ejecutó 20 ciclos, y la segunda ronda 25 ciclos.
A continuación se indican los cebadores
usados.
\newpage
<CEA>
\vskip1.000000\baselineskip
<COX-2>
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron las heces de 30 casos de cáncer de
colon (3 casos de cáncer temprano y 27 de cáncer avanzado) y de 22
casos del grupo de control por RT-PCR, para detectar
CEA y COX-2, y se obtuvieron los siguientes
resultados.
Se detectó CEA en todos los casos de los 30
casos de cáncer de colon, y en 21 de los 22 casos del grupo de
control. Además, resultó que podía extraerse ARN adecuado para la
amplificación por RT-PCR de ambas muestras.
Se detectó COX-2 en 27 casos de
los 30 casos de cáncer de colon (ciego: 2/2, colon ascendente: 3/5,
colon descendente: 1/1, colon sigmoide: 7/7, recto: 12/13; cáncer
temprano: 2/3, cáncer avanzado: 25/27), pero no se detectó en
ninguno de los 22 casos del grupo de control (sensibilidad: 90%,
especificidad: 100%).
En el ensayo inmunológico de sangre oculta
fecal, 23 de los 28 casos de cáncer de colon y 3 de los 22 casos de
control eran positivos (sensibilidad: 82,1%, especificidad:
86,3%).
De los tres casos de cáncer de colon negativos a
COX-2, uno era positivo en el ensayo inmunológico de
sangre oculta fecal, y 2 eran negativos.
Se detectó COX-2 en 3 de los 5
casos de cáncer de colon negativos al ensayo inmunológico de sangre
oculta fecal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon la cantidad y la distribución de
los pesos moleculares del ARN total obtenido de heces humanas de
acuerdo con el procedimiento de la presente invención con los
obtenidos de acuerdo con el procedimiento de Alexander (R. J.
Alexander y R. F. Raicht, Digestive Diseases and Sciences,
43(12), 1998, 2652-2658). Como control, se
extrajo el ARN total de los tejidos de cáncer de colon humano usando
un reactivo de extracción de ARN disponible en el mercado (ISOGEN,
Wako).
Se sometió a electroforesis la misma cantidad de
ARN total extraído de cada muestra en un gel de agarosa.
Dos bandas principales reconocidas en el carril
3 (ARN derivado de tejidos de cáncer de colon humano) muestran ARNr
28s y 18s. Las partes difuminadas sobre las mismas indican que están
contenidos diversos tipos de ARN de elevado peso molecular en el
ARN total obtenido.
Dos bandas principales reconocidas en el carril
2 (ARN derivado de heces obtenido por el procedimiento de la
presente invención) muestran ARNr 23s y 16s derivados de bacterias
entéricas. Como también se reconocían partes difuminadas sobre las
mismas de forma similar al carril 3, se considera que el ARN total
obtenido de las heces por el procedimiento de la presente invención
contiene también diversos tipos de ARN de elevado peso
molecular.
Por el contrario, no se detectó ninguna banda ni
manchas en todo el carril 1, lo que muestra que los ARN de elevado
peso molecular no estaban contenidos en el extracto de la
muestra.
\newpage
De hecho, se obtuvieron los productos deseados
de la muestra del carril 2 por la técnica de RT-PCR,
pero no se obtuvieron productos de PCR de la muestra del carril
1.
A partir de los resultados de los presentes
estudios, llega a ser obvio que el ARN extraído de las heces humanas
por el procedimiento de la presente invención puede amplificarse
mediante la técnica de RT-PCR. Además, la detección
de COX-2 a partir de las heces por la técnica de
RT-PCR tenía una sensibilidad del 90% y una
especificidad del 100%, y se demuestra que la presente invención es
superior a una técnica convencional del ensayo inmunológico de
sangre oculta fecal.
Además, como el procedimiento de la presente
invención necesita cantidades más pequeñas de heces para la
detección y tiene sensibilidad de detección más elevada en
comparación con la detección de la mutación génica de APC,
K-ras, o p-53, puede ahorrar en gran
medida el tiempo y el esfuerzo necesarios para la detección.
Mientras que la técnica convencional del ensayo
de sangre oculta fecal está dirigida a un acontecimiento general e
indirecto, la "hemorragia" desde la lesión, el procedimiento de
la presente invención está dirigido a un acontecimiento específico
y directo, la expresión de un marcador de carcinogénesis,
COX-2. Por lo tanto, los datos obtenidos por el
procedimiento de la presente invención proporcionan un diagnóstico
con mayor calidad.
Por consiguiente, el procedimiento de la
presente invención es clínicamente muy útil como nuevo procedimiento
de exploración no invasivo con elevada especificidad y elevada
sensibilidad.
<110> Shizuoka Technology Licensing
Organization
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de detección de un
marcador tumoral para el diagnóstico de cáncer de colon.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> KP-10665
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<211> 29
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\hskip-.1em\dddseqskipataggagagg ttagagaagg ct
\hfill22
Claims (2)
1. Un procedimiento para detectar cáncer de
colon detectando COX-2 a partir de heces, que
comprende los siguientes procedimientos:
a) un procedimiento para homogeneizar las heces
recogidas en presencia de un inhibidor de RNasa, para preparar una
suspensión de las mismas; implicando dicho procedimiento ningún
procedimiento para separar los componentes celulares de las
heces;
b) un procedimiento para extraer el ARN de la
suspensión obtenida en a);
c) un procedimiento para transcribir de forma
inversa el ARN extraído para dar ADNc;
d) un procedimiento para amplificar el ADNc
obtenido; y
e) un procedimiento para detectar la
COX-2 a partir del ADNc amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el inhibidor de RNasa es tiocianato de
guanidina.
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