ES2335473T3 - Particulas fotoemisoras para uso diaganostico y terapeutico. - Google Patents
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Abstract
Una composición emisora de luz que comprende (a) un compuesto quimioluminiscente y (b) un fotosensibilizador en la que al menos dicho compuesto quimioluminiscente está incorporado en partículas poliméricas que forman dichas partículas quimioluminiscentes, comprendiendo dichas partículas quimioluminiscentes del 0,1 al 25% en peso de un plastificante o de un fluorocarbono, en la que, tras la activación de dicho compuesto quimioluminiscente, se emite luz desde dicha composición y en la que el plastificante está seleccionado del grupo constituido por compuestos alquilaromáticos de cadena larga y alquiloxiaromáticos de cadena larga, en los que el alquilo de cadena larga es un radical de hidrocarburo monovalente saturado ramificado o sin ramificar que contiene al menos 10 átomos de carbono.
Description
Partículas fotoemisoras para uso diagnóstico y
terapéutico.
La presente invención versa acerca de partículas
para su uso en ensayos para la detección de analitos, para uso
terapéutico y para su uso como pigmentos. Las partículas tienen
propiedades ópticas y superficiales que las hacen más adecuadas
para los usos mencionados.
El campo del diagnóstico clínico ha visto una
gran expansión en años recientes, tanto en lo referente a la
variedad de materiales de interés que pueden determinarse con
facilidad y precisión, como en cuanto a los procedimientos para la
determinación. Se desean medios convenientes, fiables y no
peligrosos para detectar la presencia de bajas concentraciones de
materiales en líquidos. En la química clínica, estos materiales
pueden estar presentes en los fluidos corporales en concentraciones
por debajo de 10^{-12} molar. La dificultad de detectar
concentraciones bajas de estos materiales se complica por los
tamaños relativamente pequeños de las muestras que pueden ser
utilizados.
La necesidad de determinar muchos analitos en la
sangre y otros fluidos biológicos se ha hecho cada vez más evidente
en muchas ramas de la medicina. En la endocrinología se requiere a
menudo el conocimiento de la concentración de varias hormonas
diferentes en el suero para resolver un problema diagnóstico, o un
panel de marcadores para una diagnosis dada en el que las
proporciones pudieran asistir en la determinación del progreso de la
enfermedad. Una necesidad aún más acuciante es evidente en otras
áreas como los ensayos de alergias, la revisión de la sangre
transfundida para la detección de contaminación vírica o la
diagnosis genética.
En otros análisis, como en los ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos, existe la necesidad de detectar y
cuantificar un objetivo específico y secuencias de control positivas
en un único tubo sin separaciones y pasos de transferencia, que
llevan mucho tiempo. En principio, los controles internos eliminarán
la necesidad de una curva estándar. La amplificación y la detección
en un único tubo sin abrir el tubo también superan los problemas de
contaminación. En el análisis de mutaciones, la capacidad de medir
dos o más variantes en un solo tubo permitiría la monitorización
cuantitativa de la aparición de poblaciones mutantes.
La mayoría de los ensayos de analito múltiple
son heterogéneos, tienen una sensibilidad deficiente y un rango
dinámico bajo (se determina una diferencia en la concentración de
los analitos de 2 a 100 veces) y algunos requieren el uso de
instrumentación sofisticada. Un ensayo homogéneo que tenga una
sensibilidad mayor, mayor rango dinámico (una diferencia en
concentración de analitos de 10^{3} a 10^{4} veces) y menos
reactivos más estables aumentaría la sencillez y la fiabilidad de
los ensayos de analito múltiple.
Los compuestos luminiscentes, como los
compuestos fluorescentes y los compuestos quimioluminiscentes,
encuentran amplia aplicación en el campo de los análisis gracias a
su capacidad de emitir luz. Por esta razón, los materiales
luminiscentes vienen usándose como marcadores en análisis como los
ensayos con ácidos nucleicos y los inmunoanálisis. Por ejemplo, un
miembro de un par enlazante específico es conjugado a un material
luminiscente y se emplean protocolos diversos. El conjugado
luminiscente puede ser particionado entre una fase sólida y una fase
líquida en relación con la cantidad de analito en una muestra que
se sospecha que contiene el analito. Midiendo la luminiscencia de
cualquiera de las dos fases, puede ponerse en relación el nivel de
luminiscencia observado con una concentración del analito en la
muestra.
Se han usado partículas como liposomas y
fantasmas de eritrocitos como vehículos de materiales hidrosolubles
encapsulas. Por ejemplo, se han empleado liposomas para encapsular
material biológicamente activo para una variedad de usos, tales
como sistemas de entrega de fármacos, en los que un medicamento es
atrapado durante la preparación liposómica y luego administrado al
paciente que ha de ser tratado.
En los ensayos también se han usado partículas
como perlas de látex y liposomas. Por ejemplo, en los ensayos
homogéneos puede atraparse una enzima en la fase acuosa de un
liposoma macado con un anticuerpo o un antígeno. Se hace que los
liposomas liberen la enzima en presencia de una muestra y un
complemento. También se han utilizado liposomas marcados con
anticuerpos y antígenos dotados de tinciones solubles en lípidos
disueltos en la bicapa lipídica de un lípido para estudiar analitos
capaces de entrar en una reacción inmunoquímica con el anticuerpo o
el antígeno unido a la superficie. Se han usado detergentes para
liberar las tinciones de la fase acuosa de los liposomas.
Previamente se han usado partículas de látex
tincionadas no solo en los inmunoanálisis, sino también para otros
usos diversos, como la terapia fotodinámica y como pigmentos. Tanto
las tinciones absortivas como las tinciones que imparten
propiedades fluorescentes o quimioluminiscentes han sido
incorporadas a estas partículas. Con frecuencia, el látex es
tincionado dispersando las partículas en un disolvente que es al
menos parcialmente orgánico. El disolvente orgánico hace que las
partículas se hinchen y se cree que permite la incorporación de
concentraciones mayores de las tinciones. Aunque las propiedades
ópticas de las partículas tincionadas podría esperarse que se
potenciaran en la medida en que se incorporase más tinción a las
partículas, no ocurre necesariamente así. Hemos observado que las
concentraciones aumentadas de tinciones fluorescentes tienden a
promover el autoapagado y que las concentraciones más elevadas de
las tinciones adsortivas pueden llevar a multímeros de estado
fundamental con propiedades ópticas diferentes de las del estado
plenamente disperso. Incluso a concentraciones bajas de las
olefinas quimioluminiscentes y de los aceptores de energía,
encontramos que las tasas de desintegración de los dioxetanos
producidos en partículas de látex tras la reacción con oxígeno
singlete son no lineales. Esta observación era coherente con
estudios previamente publicados sobre la pérdida de intensidad
multifásica de estados excitados de solutos en películas de
poliestireno.
\vskip1.000000\baselineskip
La Patente U.S. Nº 5.340.716 (Ullman, et
al.) describe un procedimiento de ensayo que utiliza marcadores
quimioluminiscentes fotoactivados.
En la Patente U.S. Nº 5.709.994 (Pease, et
al.) se describen matrices quimioluminiscentes
fotoactivables.
La Patente U.S. Nº 5.194.300 (Cheung 1) presenta
procedimientos para fabricar microesferas fluorescentes.
La Patente U.S. Nº 5.132.242 (Cheung 2) presenta
microesferas fluorescentes y procedimientos para usarlas.
La Patente U.S. Nº 4.837.168 (de Jaeger) da a
conocer un inmunoanálisis que usa partículas de látex
coloreables.
La Patente U.S. Nº 4.699.826 (Schwartz, et
al.) presenta microperlas marcadas con fluorescencia.
Madison et al. describen en Brain
Research (1990) 522:90-98 un sistema de distribución
de nanoesferas de látex (LNDS), vehículos novedosos de tamaño
nanométrico de tinciones fluorescentes y agentes activos que tienen
como objetivo selectivo subpoblaciones neuronales mediante captación
y transporte retrógrado.
La Patente U.S. Nº 3.996.056 (Muller) presenta
una capa reproductiva de diazotipos formada a partir de una matriz
de pigmento de poliestireno de partículas esféricas y componentes
diazotípicos.
La Patente U.S. Nº 3.755.238 (Wiita) da a
conocer una composición para un revestimiento de alto brillo y de
perfil bajo que contiene látex de resina de vinilo plastificada y
partículas de poliolefina finamente divididas.
O'Connell et al. describen en Clin. Chem.
(1985) 31(9):1424-1426 un sistema de
inmunoanálisis sumamente sensible que involucra tubos con
revestimiento de anticuerpos y tinciones atrapadas en liposomas.
La Patente U.S. Nº 5.618.732 (Pease et
al. 1) presenta un procedimiento de calibración con matrices
quimioluminiscentes fotoactivables.
La Patente U.S. Nº 5.489.537 (Van Aken) da a
conocer ensayos de aglutinación y kits que emplean tinciones
coloidales.
La Patente U.S. Nº 5.284.752 (Sutton 1) da a
conocer procedimientos para preparar una composición polimérica de
látex y un reactivo biológico insoluble en agua.
La Patente U.S. Nº 5.234.841 (Sutton 2) da a
conocer procedimientos para preparar una composición polimérica de
látex y un reactivo biológico insoluble en agua.
La Patente U.S. Nº 5.157.084 (Lee et al.)
presenta un procedimiento para fabricar partículas poliméricas de
látex huecas.
La Patente U.S. Nº 5.053.443 (Sutton 3) da a
conocer procedimientos para preparar una composición polimérica de
látex y un reactivo biológico insoluble en agua.
La Patente U.S. Nº 4.891.324 (Pease) da a
conocer una partícula con material luminiscente para ensayos.
La Patente U.S. Nº 4.801.504 (Burdick et
al.) presenta marcadores fluorescentes que tienen una unión de
polisacáridos con partículas poliméricas.
La Patente U.S. Nº 4.784.912 (Schaeffer et
al.) presenta partículas de látex que incorporan marcadores
fluorescentes estabilizados de tierras raras.
La Patente U.S. Nº 4.650.770 (Liu et al.)
da a conocer el apagado con partículas absorbentes de energía en
ensayos de enlace de proteínas fotoemisoras competitivas.
La Patente U.S. Nº 4.483.929 (Szoka) presenta
liposomas con anticuerpos de enlace glucolipídico.
La Patente U.S. Nº 4.388.296 (Hart) da a conocer
particulados de látex emisores de energía.
La Patente U.S. Nº 4.318.707 (Litman et
al.) presenta una partícula macromolecular apagadora
fluorescente en ensayos de receptores específicos.
La Patente U.S. Nº 4.264.766 (Fischer) da a
conocer reactivos de diagnóstico inmunológico.
La Solicitud de Patente Europea 0 360 452 A2
(Warshawsky et al.) presenta partículas de látex en
reactivos, elementos y procedimientos analíticos.
La Solicitud de Patente Europea 0 369 515 A1
(Brouwer) presenta una suspensión acuosa para ensayos
diagnósticos.
La Patente U.S. Nº 5.573.909 (Singer et
al.) da a conocer marcadores fluorescentes que usan
micropartículas con desplazamiento de Stokes controlable.
Las partículas de látex hidrófilo y el uso de
las mismas es presentado por Batz et al. en la Patente U.S.
Nº 4.415.700.
El látex coloreado y los procedimientos para
fabricarlo, así como productos coloreados finamente divididos se
presentan en la Patente U.S. Nº 4.487.855 (Shih et al.).
La Patente U.S. Nº 4.419.453 (Dorman et
al.) da a conocer ensayos inmunológicos de aglutinación con
látex tincionado o coloreado y kits.
La Patente U.S. Nº 4.745.075 (Hadfield et
al.) presenta procedimientos de ensayo diagnóstico.
En la Patente U.S. Nº 4.181.636 (Fischer) se
presenta un procedimiento para producir reactivos de diagnóstico
inmunológico.
La Patente U.S. Nº 5.716.855 (Lerner et
al.) da a conocer un látex fluorescente que contiene al menos
dos fluorocromos, un procedimiento para producirlo y la aplicación
del mismo.
El documento GB-A 13 92 670 da a
conocer una matriz polimérica no halogenada que comprende una
tinción de triarilpirazolina fotoactiva luminiscente y un 10% en
peso de un plastificante de dibutilftalato.
El documento WO 97/41442 da a conocer una
composición quimioluminiscente que comprende una matriz que
incorpora un compuesto fluorescente o quimioluminiscente en la que
un catalizador capaz de catalizar la formación de oxígeno singlete
está unido a la superficie de dicha matriz. También da a conocer que
las partículas pueden contener un codisolvente que se usa a
concentraciones suficientemente bajas para evitar la disolución de
las partículas, pero a concentraciones suficientes para hinchar las
partículas.
El documento US-A 5.616.719 da a
conocer un ensayo de enlace que utiliza un precursor indicador
fotoactivo que puede reaccionar con oxígeno singlete para formar un
producto fluorescente.
Un aspecto de la presente invención es una
composición emisora de luz, tal como se define en la reivindicación
1. En las reivindicaciones 2 a 11 se definen realizaciones
preferidas.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para determinar un analito, tal como se define en la
reivindicación 12.
También está incluido dentro del ámbito de la
presente invención un kit para su uso en un ensayo, tal como
se define en la reivindicación 17.
La Figura 1 es un gráfico que muestra un trazado
gráfico de la intensidad de la señal en función del tiempo para
partículas conforme a la presente invención y para partículas de la
técnica anterior.
La Figura 2 es un trazado logarítmico del
gráfico de la Figura 1.
La Figura 3 es un gráfico que muestra un trazado
gráfico de la intensidad de la señal en función del tiempo para
partículas conforme a otra realización de la presente invención y
para partículas de la técnica anterior.
La Figura 4 es un trazado logarítmico del
gráfico de la Figura 3.
La Figura 5 es un gráfico que muestra un trazado
gráfico de la intensidad de la señal en función del tiempo en un
estudio de estabilidad térmica para partículas conforme a la
presente invención y para partículas de la técnica anterior.
La Figura 6 es un trazado logarítmico del
gráfico de la Figura 5.
La Figura 7 es un gráfico que muestra un trazado
gráfico de la intensidad de la señal en función del tiempo para
partículas conforme a otra realización de la presente invención.
La Figura 8 es un gráfico que muestra un trazado
gráfico de la intensidad de la señal en función del tiempo en un
estudio de pérdida de intensidad quimioluminiscente a dos
temperaturas diferentes para partículas conforme a la presente
invención y para partículas de la técnica anterior.
La Figura 9 es un trazado logarítmico del
gráfico de la Figura 8.
La Figura 10 es un gráfico que representa los
resultados de un ensayo para la detección del HBsAg usando
partículas conforme a la presente invención y partículas de la
técnica anterior.
La Figura 11 es un gráfico que representa los
resultados de una comparación de partículas conforme a la presente
invención y de partículas de la técnica anterior en seis muestras
problemáticas del ensayo al que pertenece la Figura 10.
La Figura 12 es un gráfico que representa los
resultados de un ensayo para la detección de TSH usando partículas
conforme a la presente invención y partículas de la técnica
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han hallados que las tinciones
incorporadas en las partículas de látex de poliestireno se comportan
más como sus soluciones en disolventes orgánicos no viscosos si
también se incorporan dopantes en las partículas. La incorporación
de los dopantes proporciona varias ventajas importantes no solo a
los inmunoanálisis, sino también a otros tipos de ensayos y a otros
usos de estas partículas. Con las partículas quimioluminiscentes,
los inventores hallaron que las tasas de pérdida de intensidad de la
emisión seguían ahora cinéticas de primer orden prácticamente
perfectas. Esto proporcionaba intensidades luminosas iniciales más
elevadas, lo que se traducía en una proporción de mayor señal fondo
y en una detectabilidad mejorada. También posibilitaba desenmarañar
entre sí las señales con diferentes tasas de pérdida de
intensidad.
Las partículas de la presente invención están
recubiertas de forma más efectiva con aminodextrano. Así, una
partícula de la invención capta un 10\pm2% de aminodextrano en
comparación con el 4\pm1% de las partículas conocidas. La mejor
cobertura superficial de las partículas con aminodextrano conduce a
superficies isotrópicas para las partículas, lo que, a su vez,
lleva a mejores resultados de los ensayos.
Las composiciones de la invención dan pie a un
comportamiento químico semejante al de las disoluciones como, por
ejemplo, en la reacción de componentes con oxígeno singlete en la
pérdida de intensidad de la quimioluminiscencia o en la pérdida de
intensidad de la fluorescencia y en los efectos de la
concentración.
La introducción de dopantes en las partículas
sensibilizantes también supuso mejoras. La velocidad de formación
de oxígeno singlete tras la irradiación de partículas
sensibilizantes no aumenta linealmente con la cantidad de
sensibilizante en las partículas. Antes bien, las velocidades
alcanzan un plató y con la adición de suficiente sensibilizante la
velocidad de formación de oxígeno singlete en realidad decae. Sin
desear limitarnos a ningún mecanismo particular, una razón de esto
puede ser el autoapagado o apilado de los sensibilizantes, como, por
ejemplo, la ftalocianina de
di-(tri-n-hexilsilil)-t-butilo
de silicio y la naftalocianina de
di-(tri-n-hexilsilil)-silicio,
en las partículas. Se cree que añadir un plastificante evita que
las tinciones se apilen o provoquen el apagamiento automático,
aumentándose así la producción de oxígeno singlete. Cuando se
incluye un dopante en las partículas, puede incorporarse más
sensibilizante en las partículas antes de que se alcance el
plató.
Una ventaja de la producción aumentada de
oxígeno singlete en los ensayos es que puede usarse una intensidad
lumínica menor para producir la misma cantidad de oxígeno singlete
y, por ende, la misma intensidad de quimioluminiscencia. Esto
reduce el fondo quimioluminiscente procedente de orígenes no
deseados, y también reduce el costo de la instrumentación.
Alternativamente, la intensidad lumínica puede permanecer
inalterada, y puede usarse la velocidad de producción de oxígeno
singlete para aumentar la sensibilidad de los ensayos.
Aumentar la eficiencia de producción de oxígeno
singlete por partícula también supone una mejora para aplicaciones
de terapia fotodinámica. Puede distribuirse más oxígeno singlete por
cada partícula que se enlaza con el tejido deseado y/o puede usarse
una potencia de láser inferior que resulte menos dañina.
Antes de ir más allá con una descripción de
realizaciones específicas de la presente invención, se definirán y
se describirán con detalle varios términos.
Componente, componente de interés: el compuesto
o la composición que se desea detectar. El componente puede ser un
analito, un compuesto de referencia, un compuesto de control, un
calibrador y similares.
Analito: el analito es una sustancia que se
quiere detectar, o cuya concentración se quiere determinar y
frecuentemente es un miembro de un par enlazante específico (pee).
Puede ser un ligando que sea monovalente (monoepitópico) o
polivalente (poliepitópico), habitualmente antigénico o hapténico, y
puede ser un único compuesto o una pluralidad de compuestos que
comparten al menos un sitio epitópico común o determinante. El
analito puede ser una parte de una célula, como una bacteria o una
célula que porte un antígeno de grupo sanguíneo como A, B, D, etc.,
o un antígeno HLA, o el analito puede ser un microorganismo, por
ejemplo, una bacteria, un hongo, un protozoo o un virus. Cuando no
es miembro de un pee, el analito puede ser una enzima, o un sustrato
enzimático, o cualquier otra sustancia, normalmente de
significación clínica, que sea susceptible de ser detectada por su
capacidad intrínseca de absorber la luz o por su capacidad de
cambiar la concentración de una sustancia dotada de la capacidad de
absorber la luz, como la creatina, el colesterol, la urea, la
fosfatasa alcalina, el potasio, los triglicéridos y similares.
Los analitos ligandos polivalentes serán
normalmente poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos y
proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y combinaciones de los
mismos. Tales combinaciones incluyen componentes de bacterias,
virus, cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos, membranas celulares
y similares.
En su mayoría, los analitos ligandos
poliepitópicos a los que puede aplicarse la presente invención
tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente 5.000, más
habitualmente de al menos aproximadamente 10.000. en la categoría
de los poli(aminoácidos), los poli(aminoácidos) de
interés tendrán por lo general un peso molecular comprendido entre
aproximadamente 5.000 y 5.000.000, más habitualmente un peso
molecular comprendido entre aproximadamente 20.000 y 1.000.000;
entre las hormonas de interés, los pesos moleculares oscilarán
habitualmente entre un peso molecular de 5.000 y uno de 60.000.
Puede considerarse una amplia variedad de
proteínas en cuanto a la familia de proteínas que tienen
características estructurales similares, las proteínas dotadas de
funciones biológicas particulares, proteínas relacionadas con
microorganismos específicos, particularmente microorganismos que
causan enfermedades, etc. Tales proteínas incluyen, por ejemplo,
inmunoglobulinas, citoquinas, enzimas, hormonas, antígenos del
cáncer, marcadores nutricionales, antígenos específicos a un
tejido, etc. Tales proteínas incluyen, a título de ilustración y no
de limitación, protaminas, histonas, albúminas, globulinas,
escleroproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas,
lipoproteínas, nucleoproteínas, glucoproteínas, receptores de
células T, proteoglucanos, HLA, proteínas no clasificadas, por
ejemplo la somatotropina, la prolactina, la insulina, la pepsina,
proteínas encontradas en el suero sanguíneo humano, factores de
coagulación sanguínea, hormonas proteínicas como, por ejemplo, la
hormona estimuladora de los folículos, la hormona luteinizante, la
luteotropina, la prolactina, la gonadotropina coriónica, las
hormonas tisulares, las citoquinas, los antígenos del cáncer como,
por ejemplo, el PSA, el CEA, la a-fetoproteína, la
fosfatasa ácida, CA19.9 y CA125, antígenos específicos a un tejido,
como, por ejemplo, la fosfatasa alcalina, la mioglobina,
CPK-MB y calcitonina, y las hormonas peptídicas.
Otros materiales poliméricos de interés son los mucopolisacáridos y
los polisacáridos.
Los analitos ligandos monoepitópicos tendrán por
lo general un peso molecular entre aproximadamente 100 y 2.000, más
habitualmente un peso molecular entre 125 y 1.000. Los analitos
incluyen fármacos, metabolitos, pesticidas, contaminantes y
similares. Incluidos entre los fármacos de interés están los
alcaloides. Entre los alcaloides están los alcaloides de la
morfina, que incluyen a la morfina, la codeína, la heroína el
dextrometorfano, sus derivados y sus metabolitos; los alcaloides de
la cocaína, que incluyen a la cocaína y la ecgonina de bencilo, sus
derivados y sus metabolitos; los alcaloides del cornezuelo del
centeno, que incluyen la dietilamida de ácido lisérgico; los
alcaloides esteroides; los alcaloides de iminazoílo; los alcaloides
de quinazolina; los alcaloides de isoquinolina; los alcaloides de
quinolina, que incluyen la quinina y la quinidina; los alcaloides
de diterpeno, sus derivados y sus
metabolitos.
metabolitos.
El siguiente grupo de fármacos incluye los
esteroides, que incluye a los estrógenos, los andrógenos, los
esteroides andreocorticales, los ácidos biliares, los glucósidos
cardiotónicos y las agliconas, que incluyen a la digoxina y la
digoxigenina, las saponinas y las sapogeninas, sus derivados y sus
metabolitos. También incluidas están las sustancias miméticas
esteroides, como el dietilestilbestrol.
El siguiente grupo de fármacos es el de las
lactamas que tienen de 5 a 6 miembros anulares, que incluyen a los
barbituratos, por ejemplo en fenobarbital y el secobarbital, la
difenilhidantoína, la primidona, la etosuximida y sus
metabolitos.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
aminoalquilbencenos, con alquilos de 2 a 3 átomos de carbono, que
incluye las anfetaminas; las catecolaminas, que incluye la efedrina,
la L-dopa, la epinefrina; la narceína; la
papaverina; y los metabolitos de los anteriores.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
benzheterocíclicos, que incluye el oxazepam, la clorpromacina, el
tegretol, sus derivados y sus metabolitos, siendo los anillos
heterocíclicos azepinas, diazepinas y fenotiazinas.
El siguiente grupo de fármacos es el de las
purinas, que incluye la teofilina, la cafeína, sus metabolitos y
sus derivados.
El siguiente grupo de fármacos incluye a los
derivados de la marihuana, que incluye al cannabinol y al
tetrahidrocannabinol.
El siguiente grupo de fármacos es el de las
hormonas como la tiroxina, el cortisol, la triyodotironina, la
testosterona, el estradiol, la estrona, la progesterona, los
polipéptidos como la angiotensina, la LHRH, y los inmunosupresores
como la ciclosporina, el FK506, el ácido micofenólico, etcétera.
El siguiente grupo de fármacos incluye a las
vitaminas como A, B, por ejemplo B12, C, D, E y K, el ácido fólico,
la tiamina.
El siguiente grupo de fármacos es el de las
prostaglandinas, que difieren por el grado y los sitios de
hidroxilación y de insaturación.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
antidepresivos tricíclicos, que incluye la imipramina, la
desmetilimipramina, la amitriptilina, la nortriptilina, la
protriptilina, la trimipramina, la clomipramina, la doxepina y la
desmetildoxepina.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
antineoplásicos, que incluye el metotrexato.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
antibióticos, que incluye la penicilina, la cloromicetina, la
actinomicetina, la tetraciclina, la terramicina, sus metabolitos y
sus derivados.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
nucleósidos y los nucleótidos, que incluyen el ATP, el NAD, el FMN,
la adenosina, la guanosina, la timidina y la citidina con sus
sustituyentes apropiados de azúcares y fosfatos.
El siguiente grupo de fármacos es el de las
drogas individuales, que incluye la metadona, el meprobamato, la
serotonina, la meperidina, la lidocaína, la procainamida, la
acetilprocainamida, el propanolol, la griseofulvina, el ácido
valproico, las butirofenonas, las antihistaminas, el cloranfenicol,
las drogas anticolinérgicas, como la atropina, sus metabolitos y
sus derivados.
Los metabolitos relacionados con estados
enfermizos incluyen la espermina, la galactosa, el ácido
fenilpirúvico y la porfirina de tipo 1.
El siguiente grupo de fármacos es el de los
aminoglucósidos, como la gentamicina, la kanamicina, la tobramicina
y la amikacina.
Entre los pesticidas de interés están los
bifeniles polihalogenados, los ésteres de fosfatos, los tiofosfatos,
los carbamatos, las sulfenamidas polihalogenadas, sus metabolitos y
sus derivados.
Para los analitos receptores, los pesos
moleculares estarán por lo general en el intervalo entre 10.000 y 2
\times 10^{8}, más habitualmente entre 10.000 y 10^{6}. Para
las inmunoglobulinas IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares
variarán por lo general entre aproximadamente 160.000 y
aproximadamente 10^{6}. Las enzimas oscilarán normalmente entre
aproximadamente 10.000 y 1.000.000 en peso molecular. Los receptores
naturales varían ampliamente, teniendo por lo general un peso
molecular de al menos 25.000 y pudiendo llegar a un peso molecular
de 10^{6} o más, incluyendo materiales como la avidina, el ADN, el
ARN, la globulina fijadora de tiroxina, la prealbúmina fijadora de
tiroxina, la transcortina, etc.
El término analito incluye además los analitos
polinucleótidos como los de los polinucleótidos definidos más
abajo. Estos incluyen el ARN-m, el
ARN-r, el ARN-t, el AND, los dúplex
ADN-ARN, etc. El término analito incluye también
los receptores que son agentes aglutinantes de polinucleótidos,
como, por ejemplo, las enzimas de restricción, los activadores, los
represores, las nucleasas, las polimerasas, las histonas, las
enzimas reparadoras, los agentes quimioterapéuticos y
similares.
El analito puede ser una molécula encontrada
directamente en una muestra como un tejido biológico, incluyendo
fluidos corporales, procedente de un huésped. La muestra puede ser
examinada directamente o ser tratada previamente para hacer que el
analito sea más fácilmente detectable. Además, el analito de interés
puede ser determinado detectando un agente probativo del analito de
interés, como un miembro de un par enlazante específico
complementario del analito de interés, cuya presencia será
detectada únicamente cuando el analito de interés esté presente en
una muestra. Así, el agente probativo del analito se convierte en el
analito que es detectado en un ensayo. El tejido biológico incluye
tejido extirpado de un órgano u otra parte del cuerpo de un huésped,
así como fluidos corporales, por ejemplo orina, sangre, plasma,
suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo,
lágrimas, moco y similares.
Reactivo marcador: un reactivo para su uso en la
realización de un ensayo para la detección de uno o más componentes.
Por lo general, el reactivo marcador también comprende un miembro
de un par enlazante específico.
Compuesto fotoactivo: un compuesto que, por sí
solo o en combinación con otro compuesto, puede ser fotoactivado
mediante la absorción de luz que tiene longitudes de onda entre 300
y 1200 nm, preferentemente entre 450 y 900 nm, frecuentemente entre
600 y 900 nm. La fotoactivación produce un cambio químico
irreversible en uno de dichos compuestos, o en ambos. Los
compuestos fotoactivos de la presente invención actúan
preferentemente en combinación con otro compuesto, en la que uno de
los compuestos absorbe la luz y el otro compuesto de la misma
experimenta un cambio químico irreversible. Tales compuestos
fotoactivos incluyen compuestos quimioluminiscentes,
fotosensibilizadores, compuestos fluorescentes fotoactivables y
similares. Los compuestos fotoactivos se incorporan en una matriz
polimérica y, por lo tanto, se escogen para que sean hidrófobos y
mucho más solubles en la matriz en agua, habitualmente al menos
10^{3} y preferentemente al menos 10^{6} más soluble en la
matriz que en el agua.
Olefinas capaces de reaccionar con oxígeno
singlete: una reacción típica de las olefinas con oxígeno singlete
es la adición 2 + 2 para formar un dioxetano. Las olefinas adecuadas
normalmente no tienen un grupo C-H saturado unido a
un carbono olefínico, con la excepción de carbonos cabeza de puente
no reactivos y preferentemente tendrán uno o más grupos donantes de
electrones unidos directamente al carbono olefínico o en conjugación
con la olefina. Los dioxetanos pueden disociarse espontáneamente o
por calentamiento, con quimioluminiscencia, o los grupos carbonilo
que se forman pueden formarse como parte de un grupo fluorescente o
ser capaces de experimentar reacciones subsiguientes que conduzcan
a una molécula fluorescente. Alternativamente, esta reacción de
disociación puede llevar a la separación de un grupo apagador a
partir de un grupo fundamentalmente fluorescente que, con ello,
recupera su propiedad fluorescente.
Otro tipo de reacción de oxígeno singlete con
olefinas es la cicloadición 4 + 2 con dienos, normalmente compuestos
aromáticos como naftalenos, antracenos, oxazoles, furanos, indoles
y similares. Tal reacción lleva inicialmente a un endoperóxido. En
algunos casos los endoperóxidos pueden redisponerse en ésteres o
anhídridos activos que son susceptibles de reacción con un grupo
situado de forma adecuada para proporcionar una lactona o una
lactama que puede ser fluorescente. Alternativamente, los
endoperóxidos pueden oxidar un precursor de un compuesto
fluorescente o quimioluminiscente. Los endoperóxidos también pueden
disociarse espontáneamente o al calentarse, con emisión
quimioluminiscente, u oxidar una leucotinción fluorescente.
Aún otro tipo de reacción de oxígeno singlete
con olefinas es la reacción "eno" que produce un
alilhidroperóxido. Las olefinas adecuadas tienen un
C-H saturado reactivo ligado a un carbono olefínico.
El producto de alilhidroperóxido puede reaccionar con un éster
activo en la misma molécula para formar una dioxetanona que puede
disociarse espontáneamente o con calor, con emisión
quimioluminiscente.
En general, las olefinas de interés son aquellas
que experimentan una reacción química tras la reacción con oxígeno
singlete para formar un producto de reacción metaestable,
normalmente un dioxetano o un endoperóxido, que sea capaz de
descomponerse con la emisión simultánea o subsiguiente de luz,
normalmente dentro del intervalo de longitudes de onda entre 250 y
1200 nm. Se prefieren las olefinas ricas en electrones que
normalmente contienen grupos donantes de electrones. Ejemplares de
tales olefinas ricas en electrones son los éteres de enol, las
enaminas, los alquilacridanos, los arilviniléteres, los
1,4-dioxenos, los 1,4-tioxenos, las
1,4-oxazinas, los arilimidazoles, los
9-alquilideno-xantanos y la
lucigenina.
La luminiscencia, ya sea la quimioluminiscencia
o la fluorescencia, producida tras la reacción de las olefinas de
interés con el oxígeno singlete se dará preferentemente a longitudes
de onda superiores a 300 nanómetros (nm), preferentemente
superiores a 500 nanómetros, y más preferentemente superiores a 550
nm. Serán de particular utilidad en la presente invención los
compuestos que observen la luz a longitudes de onda más allá de la
región en la que los componentes de la muestra contribuyen de forma
significativa a la absorción de luz. La absorbancia del suero decae
rápidamente por encima de 500 nm y llega a ser insignificante por
encima de 600 nm. La luminiscencia por encima de 550 nm es de
particular interés. Sin embargo, la luminiscencia a longitudes de
onda menores es útil cuando está ausente la interferencia por la
absorbancia de la muestra. Preferentemente, las olefinas capaces de
reaccionar con el oxígeno singlete absorberán la luz a menos de
aproximadamente 400 nm para permitir una manipulación cómoda a la
luz ambiental sin el riesgo de producir sin querer oxígeno singlete
por fotosensibilización.
Compuestos quimioluminiscentes (material
quimioluminiscente): Frecuentemente, un compuesto quimioluminiscente
fotoactivo. Ejemplos de quimioluminiscentes, a título de
ilustración y no de limitación, son, por ejemplo, las olefinas
capaces de reaccionar con oxígeno singlete o un peróxido, para
formar hidroperóxidos o dioxetanos, que pueden descomponerse en
cetonas o derivados del ácido carboxílico; los dioxetanos estables,
que pueden descomponerse por la acción de la luz; los acetilenos,
que pueden reaccionar con oxígeno singlete para formar dicetonas;
las hidrazonas o las hidrazidas, que pueden formar compuesto azo o
carbonilos azo como el luminol; los compuestos aromáticos, que
pueden formar endoperóxidos, etc. Como consecuencia de la reacción
de activación, los materiales quimioluminiscentes pueden causar
directa o indirectamente la emisión de luz.
Los dioxetanos pueden ser luminiscentes por sí
solos o en conjunción con un aceptor de energía fluorescente. Los
éteres de enol son ejemplos de tales olefinas. Con frecuencia, los
compuestos de éter de enol tendrán al menos un grupo arilo enlazado
con carbonos olefínicos en los que el anillo de arilo está
sustituido con un grupo donante de electrones en una posición que
aumenta la reactividad de la olefina con el oxígeno singlete y/o
que imparte fluorescencia al producto de la disociación del
dioxetano resultante. El grupo donante de electrones puede ser, por
ejemplo, hidroxilo, alcoxi, amino disustituido, alquil tio,
furilo, pirilo, etc. Preferentemente, los éteres de enol tienen un
grupo donante de electrones enlazado directamente a un carbono
olefínico.
Las enaminas son otro ejemplo de tales olefinas.
En general, las enaminas útiles estarán gobernadas por las reglas
presentadas más arriba para los éteres de enol.
Otra familia de quimioluminiscentes es la de los
2,4,5-trifenilimidazoles, siendo la lofina el nombre
común del producto antecedente. Los quimioluminiscentes análogos
incluyen los sustituyentes para-dimetilamino y
-metoxi.
Otras olefinas quimioluminiscentes que
satisfacen los requerimientos dados más arriba pueden encontrarse en
la Solicitud de Patente Europea Nº 0.345.776.
La composición quimioluminiscente en la presente
invención está asociada generalmente con una matriz polimérica
dentro de una partícula. Tal como se usa en el presente documento,
la expresión "asociada con" significa disolución en la matriz
polimérica.
Compuestos fluorescentes fotoactivables:
Ejemplos de compuestos fluorescentes fotoactivables, a título de
ilustración y no de limitación, son, por ejemplo, las olefinas
capaces de reaccionar con oxígeno singlete y las hidrazidas, y las
hidrazonas que reacciones con oxígeno singlete o un peróxido con
escisión simultánea o subsiguiente de un enlace para producir
compuestos fluorescentes. Ejemplos de compuestos fluorescentes
fotoactivables se dan en la Patente US 5.616.719, que es
incorporada en el presente documento por referencia. En general,
las leucotinciones fluorescentes, particularmente las tinciones de
dihidromerocianina, son útiles porque pueden ser oxidados con
facilidad por oxígeno singlete para dar compuestos
fluorescentes.
Sensibilizador: una molécula, normalmente un
compuesto, para la generación de un intermedio reactivo,
frecuentemente oxígeno singlete, o para la activación de un
compuesto fotoactivo. Preferentemente, el sensibilizador es un
fotosensibilizador. Sin embargo, hay otros sensibilizadores que
pueden ser activados químicamente (por ejemplo, las enzimas y las
sales metálicas), incluyendo, a título de ejemplo y no de
limitación, otras sustancias y composiciones que pueden producir
oxígeno singlete con o, menos preferentemente, sin activación por
una fuente de luz externa. Así, por ejemplo, se ha demostrado que
las sales de molibdato (MoO_{4}=) y la cloroperoxidasa o la
mieloperoxidasa más ion bromuro o cloruro (Kanofsky, J. Biol. Chem.
(1983) 259:5596) catalizan la conversión del peróxido de hidrógeno
a oxígeno singlete y agua. Cualquiera de estas dos composiciones
puede ser incluida, por ejemplo, en partículas a las que vaya
enlazado un miembro de un pee y ser usada en el procedimiento del
ensayo en el que esté incluido el peróxido de hidrógeno como
reactivo auxiliar, la cloroperoxidasa esté enlazada a una
superficie y el molibdato esté incorporado en la fase acuosa de un
liposoma. También incluidos dentro del alcance de la invención como
fotosensibilizadores están los compuestos que no verdaderos
sensibilizadores, pero que, al ser excitados por el calor, la luz,
la radiación ionizante o la activación química, liberan una
molécula de oxígeno singlete. Los miembros más conocidos de esta
clase de compuestos incluyen a los endoperóxidos, como el
endoperóxido de
1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno,
el
9,10-difenilantraceno-9,10-endoperóxido
y el 5,6,11,12-tetrafenil naftaleno
5,12-endoperóxido. El calentamiento o la absorción
directa de la luz por parte de estos compuestos liberan oxígeno
singlete.
Fotosensibilizador: un sensibilizador para la
activación de un compuesto fotoactivo, frecuentemente mediante la
generación de oxígeno singlete por fotoexcitación. Los
fotosensibilizadores son fotoactivables e incluyen, por ejemplo,
tinciones o compuestos aromáticos, y son normalmente compuestos que
comprenden átomos de enlace covalente, normalmente con múltiples
enlaces dobles o triples conjugados. Los compuestos deberían
absorber luz en el intervalo de longitudes de onda de
200-1.100 nm, normalmente 300-1.000
nm, preferentemente 450-950 nm, con un coeficiente
de excitación a su máximo de absorbancia mayor que 500 M^{-1}
cm^{-1}, preferentemente 5.000 M^{-1} cm^{-1}, más
preferentemente 50.000 M^{-1} cm^{-1}, a la longitud de onda de
excitación. La vida útil de un estado excitado producido siguiendo
la absorción de la luz en ausencia de oxígeno será habitualmente de
al menos 100 nanosegundos, preferentemente al menos 1 milisegundo.
En general, la vida útil tiene que ser suficientemente prolongada
como para permitir la transferencia de energía a un
quimioluminiscente o al oxígeno, que normalmente estarán presentes
a concentraciones en el intervalo de 10^{-5} a 10^{-3} M,
dependiendo del medio. El estado excitado del fotosensibilizador
normalmente tendrá un número cuántico de spin (S) diferente
del de su estado fundamental y será normalmente un triplete (S=1)
cuando el estado fundamental sea, como suele ocurrir, un singlete
(S=0). Preferentemente, el fotosensibilizador tendrá un rendimiento
de cruce intersistémico. Es decir, la fotoexcitación de un
fotosensibilizador producirá normalmente un estado de triplete con
una eficiencia de al menos el 10%, deseablemente de al menos el 40%,
preferentemente superior al 80%.
Los fotosensibilizadores serán relativamente
fotoestables y, preferentemente, no reaccionarán eficientemente con
el oxígeno singlete. En la mayoría de los fotosensibilizadores
útiles hay presentes varias características estructurales. La
mayoría de los fotosensibilizadores tiene al menos uno y
frecuentemente tres o más enlaces conjugados dobles o triples
mantenidos en una estructura rígida, frecuentemente aromática.
Frecuentemente contienen al menos un grupo que acelera del cruce
intersistémico, como un grupo carbonilo o imina o un átomo pesado
seleccionado de las filas 3-6 de la tabla periódica,
especialmente el yodo o el bromo, o tienen estructuras aromáticas
extendidas. Los fotosensibilizadores típicos incluyen la acetona, la
benzofenona, la 9-tioxantona, la eosina, el
9,10-dibromoatraceno, el azul de metileno, las
metaloporfirinas, como la hematoporfirina, las ftalocianinas, las
clorofilas, el rosa de Bengala, el buckminsterfulereno, etc., y los
derivados de estos compuestos que tienen sustituyentes de 1 a 50
átomos para hacer tales compuestos más lipófilos o más hidrófilos
y/o como grupos de unión para la unión, por ejemplo, a un miembro de
un pee. Ejemplos de otros fotosensibilizadores que pueden
utilizarse en la presente invención son aquellos que tienen las
propiedades anteriores y que son enumerados en N. F. Turro,
"Molecular Photochemistry" page 132, W. A. Benjamin Inc., Nueva
York, 1965.
Los fotosensibilizadores son, de forma
preferente, relativamente no polares para garantizar la disolución
en un miembro lipófilo cuando el fotosensibilizador se incorpora en
una partícula de látex.
Partículas de látex: partículas de látex que
tienen un diámetro medio de al menos aproximadamente 20 nm y de no
más de aproximadamente 100 micrómetros, normalmente de al menos
aproximadamente 40 nm y de menos de aproximadamente 20 micrómetros,
preferentemente de aproximada 0,10 a 2,0 micrómetros de diámetro
medio, esféricas y no esféricas, preferentemente esféricas. Las
partículas pueden tener cualquier densidad, pero preferentemente
tendrán una densidad que se aproxime a la del agua, generalmente de
aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,5 g/ml. Las partículas
pueden tener carga o no, y cuando están cargadas son preferentemente
negativas. Cuando se usan en ensayos de enlace frecuentemente serán
también adsortivas o funcionalizables, para enlazarse o unirse en
su superficie, ya sea de forma directa o indirecta, a un miembro de
un pee.
"Látex" significa un particulado de un
material polimérico insoluble en agua suspendible en agua. El látex
es frecuentemente un polietileno sustituido como el
poliestireno-butadieno, la poliacrilamida, el
poliestireno, el poliestireno con grupos amino, el ácido
poliacrílico, el ácido polimetacrílico, el
acrilonitrilo-butadieno, copolímeros de estireno,
acetato de polivinilo-acrilato, piridina de
polivinilo, copolímeros de vinilo-cloruro acrilato,
cloruro de polivinilo, polivinilnaftaleno y similares. En general,
la composición de partículas de látex es elegida para favorecer la
asociación del compuesto fotoactivo con la matriz polimérica. Por
esta razón, los polímeros serán habitualmente polímeros lineales.
Se prefieren los polímeros no reticulados de estireno y de estireno
carboxilado o estireno funcionalizado con otros grupos activos como
amino, hidroxil, halo y similares. Con frecuencia, se usarán
copolímeros de estirenos sustituidos con dienos como el
butadieno.
La asociación del compuesto fotoactivo con las
partículas de látex utilizadas en la presente invención puede
involucrar su incorporación durante la formación de las partículas
por polimerización, pero normalmente conllevará la incorporación en
partículas preformadas, normalmente por disolución no covalente en
las partículas. Por lo tanto, se escogen compuestos fotoactivos que
se disuelvan en la matriz polimérica y, por lo tanto, son
habitualmente hidrófobos, y la composición de partículas de látex se
escoge para favorecer la asociación del compuesto fotoactivo con la
matriz polimérica. Normalmente, se empleará una disolución del
compuesto fotoactivo. Los disolventes que pueden ser utilizados
incluyen alcoholes, incluidos el etanol, el etilenglicol y el
alcohol de bencilo; amidas, como la dimetil formamida, la
formamida, la acetamida y tetrametil urea y similares; sulfóxidos
como el dimetil sulfóxido y el sulfolano; y éteres como el carbitol,
el etil carbitol, el dimetoxi etano y similares, y agua. El uso de
disolventes con puntos de ebullición elevados en los que las
partículas sean insolubles permite el uso de temperaturas elevadas
para facilitar la disolución de los compuestos marcadores en las
partículas, y son particularmente adecuados. Los disolventes pueden
ser usados por sí solos o en combinación. Deberían seleccionarse
disolventes que puedan ser eliminados completamente de las
partículas o que no interfieran con la fotoactivación. Con
frecuencia, se prefieren también los disolventes hidroxílicos. Los
codisolventes aromáticos típicos, incluidos el dibutilftalato, el
benzonitrilo, el naftonitrilo, el dioctiltereftalato, el
diclorobenceno, el difeniléter, el dimetoxibenceno, etc., se usarán
en concentraciones suficientemente bajas para evitar la disolución
de las partículas, pero en concentraciones suficientes para hinchar
las
partículas.
partículas.
Por lo general, la temperatura empleada durante
el procedimiento se escogerá para maximizar la capacidad de la luz
de activar el compuesto fotoactivo, con la condición de que las
partículas no se fundan ni sufran agregación a la temperatura
seleccionada. Normalmente se emplean temperaturas elevadas. Las
temperaturas del procedimiento oscilarán por lo general entre 20ºC
y 200ºC, más habitualmente entre 50ºC y 170ºC. Se ha observado que
algunos compuestos que son casi insolubles a temperatura ambiente
son solubles en, por ejemplo, alcoholes de bajo peso molecular,
como el etanol, el etilenglicol y similares a temperaturas elevadas.
Se ha demostrado que las partículas de látex modificado carboxilado
toleran los alcoholes de bajo peso molecular a tales
temperaturas.
Un miembro de un pee puede estar físicamente
adsorbido en la superficie de la partícula de látex o puede estar
enlazado o unido de forma covalente a la partícula de forma similar
a la expuesta más arriba con respecto a otras matrices.
El enlace de los miembros de un pee a las
partículas de látex puede ser directo o indirecto, covalente o no
covalente, y puede lograrse mediante técnicas bien conocidas,
disponibles de forma generalizada en la bibliografía. Véanse, por
ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press,
Nueva York (1978), y Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059
(1970).
La superficie de las partículas de látex será
normalmente polifuncional o será capaz de ser polifuncionalizada o
será capaz de enlazarse con un miembro de un pee, o similar,
mediante interacciones covalentes o no covalentes específicas o no
específicas. Tal enlace es indirecto cuando se usan interacciones no
covalente, y es directo cuando se emplean interacciones covalentes.
Se dispone o se puede incorporar una amplia variedad de grupos
funcionales. Los grupos funcionales incluyen ácidos carboxílicos,
aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos
hidroxilo, grupos mercapto y similares. La manera de enlazar una
amplia variedad de compuestos a las superficies es bien conocida y
está ampliamente ilustrada en la bibliografía (véase más arriba). La
longitud del grupo de enlace a un oligonucleótido o miembro de un
pee puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del
compuesto objeto de enlace, del efecto de la distancia entre el
compuesto objeto de enlace y de la superficie sobre las propiedades
específicas de enlace y similares.
Los compuestos fotoactivos son incorporados en
la matriz polimérica o bien durante la preparación de la matriz
polimérica o con posterioridad a la misma. Se escogen para
disolverse en la matriz hidrófoba para reducir su capacidad de
disociarse de la matriz polimérica. Por lo general, la composición
de partículas de látex de matriz polimérica se elige para favorecer
la asociación del compuesto fotoactivo con la matriz polimérica.
La cantidad de compuesto fotoactivo incorporado
en la matriz polimérica en las composiciones de la invención
depende de varios factores como la naturaleza del compuesto
fotoactivo y la matriz polimérica, y del uso deseado para el
reactivo resultante. El compuesto fotoactivo está presente en la
matriz polimérica en una cantidad necesaria para maximizar la
eficiencia de la luz para causar la fotoactivación. En un ensayo, el
grado de fotoactivación será equivalente a la magnitud de la señal
producida conforme a la invención, es decir, de proporcionar la
relación más elevada señal-fondo en un ensayo. Por
ejemplo, en la terapia fotodinámica el grado de fotoactivación será
equivalente a la cantidad de oxígeno singlete producido.
Generalmente, la cantidad de compuesto fotoactivo se determina
empíricamente y está habitualmente en torno de 10^{-8} a 1 M,
preferentemente entre 10^{-5} y 10^{-2} M, más preferentemente
entre 10^{-3} y 10^{-1} M.
En general, el miembro de un pee estará presente
aproximadamente entre 0,5 y 100, más habitualmente entre 1 y 90,
frecuentemente entre aproximadamente 5 y 80, y preferentemente entre
aproximadamente 50 y 100 moles por ciento de las moléculas
presentes en la superficie de las partículas de látex. La cantidad
particular del miembro de un pee es dependiente también de varios
favores y lo habitual es que se determine óptimamente de manera
empírica.
Miembro de un par enlazante específico
("miembro de un pee"): una de entre dos moléculas diferentes
que tiene una zona en la superficie o en una cavidad que se enlaza
específicamente con una organización espacial y polar de la otra
molécula y que es por ello definida como complementaria de esta. Los
miembros del par enlazante específico se denominan ligando y
receptor (antiligando). Estos serán normalmente miembros de un par
inmunológico, como antígeno-anticuerpo, aunque
otros pares enlazantes específicos, como los de
biotina-avidina, hormonas-receptores
hormonales, dúplex de ácidos nucleicos,
IgG-proteína A, pares de polinucleótidos como
ADN-ADN, ADN-ARN y similares no son
pares inmunológicos, pero se incluyen en la invención y en la
definición de miembro de un
pee.
pee.
Polinucleótido: un compuesto o una composición
es un nucleótido polimérico que tiene en su estado natural entre
aproximadamente 50 y 500.000 nucleótidos o más y que tiene en su
estado aislado entre aproximadamente 15 y 50.000 nucleótidos o más,
normalmente entre aproximadamente 15 y 20.000 nucleótidos, más
frecuentemente entre 15 y 10.000 nucleótidos. El polinucleótido
incluye ácidos nucleicos de cualquier origen en forma purificada o
sin purificar, hallados de forma natural o producidos
sintéticamente, incluyendo ADN (ADNdh y ADNcs) y ARN, normalmente
ADN, y puede ser ARN-t, ARN-m,
ARN-r, ADN y RNA mitocondriales, ADN y ARN
cloroplásticos, híbridos ADN-ARN o mezclas de los
mismos, genes, cromosomas, plásmidos, los genomas de material
biológico como microorganismos, por ejemplos bacterias, levaduras,
virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, y
fragmentos de los mismos, y similares.
Ligando: cualquier compuesto orgánico para el
que exista de forma natural o pueda prepararse un receptor.
Ligando análogo: un ligando modificado, un
radical orgánico o un análogo de analito, normalmente de un peso
molecular mayor de 100, que puede competir con el ligando análogo de
un receptor, proporcionando la modificación medios para unir un
ligando análogo a otra molécula. El ligando análogo normalmente
diferirá del ligando en más que la sustitución de un hidrógeno con
un enlace que une al ligando análogo con un hub o un
marcador, pero no es preciso que así sea. El ligando análogo puede
enlazarse al receptor de manera similar al ligando. El análogo
podría ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo
de un anticuerpo al ligando.
Receptor ("antiligando"): cualquier
compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial
o polar particular de una molécula, por ejemplo, un sitio epitópico
o determinante. Receptores ilustrativos incluyen los receptores que
se dan de forma natural, por ejemplo la globulina fijadora de la
tiroxina, la globulina, los anticuerpos, las enzimas, fragmentos
Fab, lecitinas, ácidos nucleicos, proteína A, componente
complementario C1q, y similares.
Enlace específico: el reconocimiento específico
de una de dos moléculas diferentes por parte de la otra en
comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras
moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas en sus
superficies o en cavidades que dan origen al reconocimiento
específico entre las dos moléculas. Ejemplares del enlace
específico son las interacciones
anticuerpo-antígeno, las interacciones
enzima-sustrato, las interacciones de
polinucleótidos, etcétera.
Enlace no específico: el enlace no covalente
entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras
superficiales específicas. El enlace no específico puede resultar de
varios factores que incluyen las interacciones hidrófobas entre
moléculas.
Anticuerpo: una inmunoglobulina que se enlaza
específicamente con una organización espacial y polar de otra
molécula y que, por ello, es definida como complementaria de la
misma. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede
prepararse mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica,
como la inmunización de un huésped y la recogida de sueros
(policlonales) o preparando líneas celulares híbridas continuas y
recogiendo la proteína segregada (monoclonal), o clonando y
expresando secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de
los mismos que codifiquen al menos las secuencias de aminoácidos
requeridas para el enlace específico de los anticuerpos naturales.
Los anticuerpos pueden incluir clases e isótopos diversos, tales
como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los
fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv y
F(ab')_{2}, Fab' y similares. Además, pueden usarse
agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus
fragmentos cuando resulte apropiado, con la condición de que se
mantenga la afinidad de enlace con una molécula particular.
El antisuero que contiene anticuerpos
(policlonales) se obtiene mediante técnicas bien establecidas que
conllevan la inmunización de un animal, como un conejo, una cobaya,
o una cabra, con un inmunógeno apropiado y la obtención de
antisueros de la sangre del animal inmunizado después de un tiempo
de espera apropiado. Hay reseñas sobre el estado de la técnica en
Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds,
Prentice-Hall (Englewood Cliffs, Nueva Jersey, EE.
UU., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24
(1975); Broughton y Strong, Clin. Chem. 22: 726-732
(1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30:
24-31 (1974).
También pueden obtenerse anticuerpos mediante
técnicas de hibridación de células somáticas, denominándose por lo
común a tales anticuerpos anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden ser producidos conforme a las técnicas estándar
de Köhler y Milstein, Nature 265:495-497, 1975. Se
encuentran reseñas de técnicas de anticuerpos monoclonales en
Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al.
Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495
(1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of Enzymology 73 (Part
B): 3-46 (1981). Se inyectan muestras de una
preparación inmunógena apropiada en un animal como un ratón y,
después de un tiempo suficiente, el animal es sacrificado, y se
obtienen células del bazo. Alternativamente, las células del bazo
de un animal no inmunizado pueden sensibilizarse al inmunógeno in
vitro. Los cromosomas de las células del bazo que codifican las
secuencias base para las inmunoglobulinas deseadas pueden
comprimirse fusionando células del bazo, generalmente en presencia
de un detergente no iónico, por ejemplo polietilenglicol, con una
línea celular de mieloma. Se permite que las células resultantes,
que incluyen hibridomas fusionados, se desarrollen en un medio
selectivo, como un medio HAT, y las células inmortalizadas
supervivientes son cultivadas en tal medio usando condiciones
limitantes de disolución. Las células se cultivan en un recipiente
adecuado, por ejemplo pocillos de microtitración, y el sobrenadante
revisado para localizar anticuerpos monoclonales que tengan la
especificidad deseada.
Existen diversas técnicas para potenciar la
producción de anticuerpos monoclonales, como, por ejemplo, la
inyección de células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un
huésped mamífero, que acepta las células, y recoger el fluido
ascítico. Cuando se recoge una cantidad insuficiente del anticuerpo
monoclonal en el fluido ascítico, el anticuerpo se recoge de la
sangre del huésped. Alternativamente, las células que producen el
anticuerpo deseado pueden ser cultivadas en un dispositivo de
cultivo celular de fibras huecas o en un dispositivo de matraz de
agitación, siendo ambos bien conocidos en la técnica. Existen
diversas formas convencionales de aislamiento y purificación de los
anticuerpos monoclonales de otras proteínas y otros contaminantes
(véase Köhler y Milstein, supra).
En otro enfoque para la preparación de
anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de enlace del
anticuerpo puede eliminarse del ADN del cromosoma e insertarse en
un vector de clonación que pueda ser expresado en bacterias para
producir proteínas recombinantes que tienen los correspondientes
sitios de enlace del anticuerpo.
En general, los anticuerpos pueden purificarse
mediante técnicas conocidas, como la cromatografía, por ejemplo la
cromatografía DEAE, la cromatografía ABx y similares, el filtrado,
etcétera.
Sustituido: significa que un átomo de hidrógeno
de una molécula ha sido sustituido por otro átomo, que puede ser un
solo átomo, como un halógeno, etc., o parte de un grupo de átomos
que forman una funcionalidad, como que un sustituyente tenga de 1 a
50 átomos (distintos de los átomos imprescindibles de hidrógeno
necesarios para satisfacer las valencias de tales átomos), átomos
que se seleccionan independientemente del grupo constituido por el
carbono, el oxígeno, el nitrógeno, el azufre, los halógenos (cloro,
bromo, yodo, flúor) y el fósforo, y que puede estar o no unido a
uno o más átomos metálicos.
Grupo donante de electrones: un sustituyente
que, cuando va unido a una molécula, es capaz de polarizar la
molécula, de modo que el grupo donante de electrones se convierte en
deficitario en electrones y cargado positivamente con respecto a
otra porción de la molécula, es decir, tiene una densidad reducida
de electrones. Tales grupos incluyen, a título de ilustración y no
de limitación, aminas, éteres, tioéteres, fosfinas, hidroxi,
oxianiones, los mercaptanos y sus aniones, sulfuros, etc.
Un sustituyente que tenga de 1 a 50 átomos
(distintos de los átomos imprescindibles de hidrógeno necesarios
para satisfacer las valencias de tales átomos), átomos que se
seleccionan independientemente del grupo constituido por el
carbono, el oxígeno, el nitrógeno, el azufre, los halógenos y el
fósforo: un radical orgánico; el radical orgánico tiene de 1 a 50
átomos distintos del número imprescindible de átomos de hidrógeno
necesarios para satisfacer las valencias de los átomos del radical.
Generalmente, el átomo predominante es el carbono (C), pero también
puede ser oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), en
los que el O, el N, el S o el P, si está presente, están unidos al
carbono o a uno o más de los demás o al hidrógeno o a un átomo
metálico para formar diversos grupos funcionales, como, por
ejemplo, grupos carboxilo (ácidos carboxílicos), grupos hidroxilo
(alcoholes), grupos mercapto (tioles), carboxamidas, carbamatos,
ésteres de ácido carboxílico, ácidos sulfónicos, ésteres de ácido
sulfónico, ácidos fosfóricos, ésteres de ácido fosfórico, ureas,
carbamatos, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros,
tioéteres, olefinas, acetilenos, aminas, cetonas, aldehídos y
nitrilos, y alquilo, alquilideno, arilo, aralquilo y alquilo, arilo
y aralquilo sustituidos con uno o más de los grupos funcionales
anteriormente mencionados, por ejemplo fenilo, naftilo, fenantrilo,
m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi,
N-morfolino, y pueden tomarse conjuntamente para
formar un anillo, como, por ejemplo, adamantilo,
N-metiacridanilida, xantanilidina,
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno),
y similares.
Grupo de enlace: un grupo implicado en el enlace
covalente entre moléculas. El grupo de enlace variaría dependiendo
de la naturaleza de las moléculas, es decir, marcador, matriz,
miembro de un pee o molécula asociada con una partícula que está
siendo objeto de enlace, o con parte de la misma. Para el enlace de
estos materiales se emplearán grupos funcionales que están
normalmente presentes o que son introducidos en una partícula de
látex o en un miembro de un pee.
En su mayor parte, encontrarán uso las
funcionalidades del carbonilo, tanto del oxocarbonilo, por ejemplo
el aldehído, y del no oxocarbonilo (incluidos los análogos de
nitrógeno y azufre), por ejemplo carboxi, amidina, amidato,
tiocarboxi y tionocarboxi.
Las funcionalidades alternativas de oxo incluyen
halógeno, diazo, mercapto, olefina, particularmente la olefina
activada, amino, fósforo y similares. En la Patente U.S. Nº
3.817.837 puede encontrarse una descripción de los grupos de
enlace, revelación que es incorporada en el presente documento por
referencia en su integridad.
Los grupos de enlace pueden variar desde un
enlace hasta una cadena de entre 1 y 100 átomos, normal de entre 1
y 70 átomos, preferentemente de 1 a 50 átomos, más preferentemente
de 1 a 20 átomos, cada uno seleccionado de forma independiente del
grupo normalmente constituido por el carbono, el oxígeno, el azufre,
el nitrógeno, los halógenos y el fósforo. El número de heteroátomos
en los grupos de enlace oscilará normalmente entre aproximadamente
0 y 20, habitualmente entre aproximadamente 1 y 15, más
preferentemente de 2 a 6. Los átomos de la cadena pueden ser
sustituidos con átomos distintos del hidrógeno de una manera similar
a la descrita anteriormente para el sustituyente que tiene de 1 a
50 átomos. Como regla general, la longitud de un grupo de enlace
particular puede ser seleccionada arbitrariamente para permitir la
conveniencia de la síntesis y para la incorporación de cualquier
grupo deseado, como un aceptor de energía, un fluoróforo, un grupo
para el análisis de cruce intersistémico como un átomo pesado, y
similares. Los grupos de enlace pueden ser alifáticos o aromáticos,
aunque con los grupos diazo los grupos aromáticos estarán implicados
normalmente.
Cuando hay heteroátomos presentes, normalmente
habrá oxígeno presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre,
nitrógeno o fósforo; el nitrógeno estará normalmente como nitro,
nitroso o amino, normalmente enlazado con carbono, oxígeno, azufre
o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno; mientras tanto, el
fósforo estará ligado a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno,
normalmente como fosfonato y fosfato mono- o diéster.
Las funcionalidades comunes en la formación de
un enlace covalente entre el grupo de enlace y la molécula que ha
de conjugarse son alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea,
tiourea, guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato y fosfato
ésteres, amidas y tioésteres.
En general, cuando se trate de un grupo de
enlace, tendrá un grupo no oxocarbonilo que incluya análogos de
nitrógeno y de azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente
alquilante como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el análogo de
azufre, mercapto), oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o cetona), o
una olefina activa, como una sulfona de vinilo o éster
\alpha,\beta-insaturado. Estas funcionalidades
estarán ligadas a grupos aminas, grupos carboxilo, olefinas
activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando
estén ligados una amina y ácido carboxílico o su derivado
nitrogenado o ácido fosfórico, se formarán amidas, amidinas y
fosforamidas. Cuando estén ligados un mercaptano y una olefina
activada, se formarán tioéteres. Cuando estén ligados un mercaptano
y un agente alquilante, se formarán tioéteres. Cuando estén ligados
un aldehído y una amina en condiciones reductoras, se formará una
alquilamina. Cuando estén ligados un ácido carboxílico o un fosfato
ácido y un alcohol, se formarán
ésteres.
ésteres.
Un grupo o una funcionalidad que imparte
hidrofilicidad o hidrosolubilidad: es una funcionalidad hidrófila,
que aumenta la humectabilidad de los sólidos con agua y la
solubilidad en agua de los compuestos a los que va ligado. Tal
grupo funcional o tal funcionalidad puede ser un sustituyente que
tenga de 1 a 50 átomos o más, y puede incluir un grupo que tenga un
sulfonato, un sulfato, un fosfato, una amidina, un fosfonato, un
carboxilato, un hidroxilo, en particular polioles, una amina, un
éter, una amida y similares. Grupos funcionales ilustrativos son
carboxialquilo, sulfonoxialquilo, CONHOCH_{2}COOH,
CO-(glucosamina), azúcares, dextrano, ciclodextrina,
SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H, CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H,
PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, hidroxilo, carboxilo, cetona y
combinaciones de los mismos. La mayoría de las funcionalidades
anteriores pueden ser utilizadas también como grupos de unión, que
permiten la unión de un miembro de un pee o similar a una
composición particulada constituida por el marcador.
Un grupo o una funcionalidad que imparten
lipofilicidad o solubilidad en lípidos: es una funcionalidad
lipófila, que disminuye la humectabilidad de las superficies por el
agua y la hidrosolubilidad de los compuestos a los que está ligada.
Tal grupo funcional o tal funcionalidad puede contener entre 1 y 50
átomos o más, normalmente átomos de carbono sustituidos con
hidrógeno o halógeno y que pueden incluir alquilo, alquilideno,
arilo y aralquilo. El grupo lipófilo o la funcionalidad lipófila
tendrán normalmente de uno a seis grupos alifáticos de cadena recta
o ramificada de al menos 6 átomos de carbono, más habitualmente de
al menos 10 átomos de carbono, y preferentemente de al menos 12
átomos de carbono, normalmente de no más de 30 átomos de carbono. El
grupo alifático puede estar enlazado a anillos de entre 5 y 6
miembros, que puede ser alicíclicos, heterociclos o aromáticos. Los
grupos lipófilos suelen comprender plastificantes y pueden también
estar unidos a un marcador o a otra sustancia para aumentar su
solubilidad en una matriz no acuosa.
Materiales complementarios: Diversos materiales
complementarios se emplearán con frecuencia en el ensayo conforme a
la presente invención. Por ejemplo, en el medio de ensayo
normalmente estarán presentes tampones, al igual que estabilizantes
para el medio de ensayo y los componentes del ensayo.
Frecuentemente, además de estos aditivos, pueden incluirse
proteínas, como las albúminas; disolventes orgánicos, como la
formamida; sales cuaternarias de amonio; polianiones como el
sulfato de dextrano; tensioactivos, en particular tensioactivos no
iónicos; potenciadores de la aglutinación, por ejemplo
polialquilenglicoles; o similares.
De forma secuencial total o parcialmente: cuando
se combinan la muestra y diversos agentes utilizados en la presente
invención de una forma distinta a la concomitante (simultánea),
pueden combinarse uno o más con uno o más de los agentes restantes
para formar una subcombinación. Cada subcombinación puede ser
sometida a uno o más pasos del presente procedimiento. Así, cada
una de las subcombinaciones puede ser incubada bajo distintas
condiciones para lograr uno o más de los resultados deseados.
Como se ha mencionado anteriormente, un aspecto
de la presente invención es una composición emisora de luz que
comprende una matriz polimérica que tiene disuelto en su interior un
compuesto fotoactivo. La composición tiene la característica de
que, tras la activación del compuesto fotoactivo, la tasa de
disminución de intensidad de la emisión lumínica desde la matriz
polimérica en cualquier instante durante la disminución de la
intensidad en 20 veces (pérdida de intensidad exponencial) es
proporcional a la intensidad de la emisión de la luz. Esto se
consigue normalmente incorporando en la matriz una cantidad
suficiente de un dopante, como de aproximadamente el 0,1 a
aproximadamente el 25%, habitualmente de aproximadamente el 1 a
aproximadamente el 20%, más habitualmente de aproximadamente el 2 a
aproximadamente el 15% en peso de un dopante.
El dopante puede ser cualquier compuesto
orgánico que sea no polar, normalmente insoluble en agua y
relativamente flexible, con la condición de que sea suficientemente
soluble en el látex para evitar su lixiviación a una tasa
apreciable en presencia de cualquier detergente de otras sustancias
lipófilas que puedan entrar en contacto con las partículas durante
su periodo de uso o almacenamiento. Como regla general, la
distribución a favor de la matriz tiene que ser tan elevada que al
dopante sustancialmente se le impida cinéticamente escapar. Tal
distribución evita la lixiviación del dopante cuando se incluye una
sustancia hidrófoba en el medio acuoso. En general, los dopantes de
uso en la presente invención serán al menos 10^{10},
frecuentemente al menos 10^{14}, y preferentemente al menos
10^{18} veces más soluble en la matriz polimérica que en el
agua.
Los dopantes que se prefieren en las
composiciones presentes incluyen plastificantes, como los
alquilaromáticos de cadena larga y los compuestos
alquiloxiaromáticos de cadena larga y los fluorocarbonos. Con
"alquilo de cadena larga" se quiere dar a entender un radical
de hidrocarburo monovalente saturado ramificado o sin ramificar que
contiene al menos 10 átomos de carbono, normalmente de 10 a 30
átomos de carbono, más habitualmente de 15 a 25 átomos de carbono.
Ejemplos de tales radicales son decilo, undecilo, dodecilo,
tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo,
octadecilo, nonadecilo, eicosilo,
4-metil-3,3-dietil-5-isopropiloctano,
4-t-butil-4-isopropildecano
y similares. La porción aromática del plastificante está
generalmente caracterizada por ser capaz de experimentar reacciones
de sustitución. Típicamente, tales compuestos son compuestos
cíclicos que tienen uno o más enlaces dobles. Normalmente, los
compuestos contienen uno o más anillos de cinco, seis o siete
miembros. Los compuestos aromáticos pueden contener únicamente
hidrógeno y carbono, o pueden ser heterocíclicos y contener, además
de átomos de hidrógeno y de carbono, uno o más átomos como el
nitrógeno, el oxígeno, el azufre y similares. Un grupo de porciones
aromáticas comprende aquellas que contienen únicamente carbono e
hidrógeno, como, por ejemplo, benceno, naftaleno, antraceno,
fenantreno, bifenilo y similares, que pueden ser sustituidos con
uno o más sustituyentes. Otras porciones incluyen, por ejemplo,
piridilo, pirrolilo, furilo, quinolilo, fenantrolilo, acridilo y
similares. Ejemplos particulares de plastificantes, a título de
ilustración y no de limitación, son el heptadecilbenceno, el
dodeciloxinaftaleno, el bis-hexadecilnaftaleno y el
clorofeniloctadecano.
Los fluorocarbonos son compuestos constituidos
por átomos de carbono y átomos de flúor. En general, los
fluorocarbonos comprenden entre aproximadamente 1 y aproximadamente
20, normalmente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 átomos
de flúor y entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30, normalmente
entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 átomos de carbono.
Los átomos de carbono puede ser parte de un compuesto aromático. Los
compuestos particulares incluyen los aromáticos condensados, como,
por ejemplo, el decahidronaftaleno, el dodecahidrantraceno, el
tetradecahidrofenantreno, etc., el bifenilo y similares, que están
fluorados con uno o más átomos de flúor. Ejemplos particulares de
fluorocarbonos, a título de ilustración y no de limitación,
incluyen el perfluoronaftaleno (perfluorodecalina),
perfluoroantraceno, perfluorofenantreno, etcétera.
El plastificante es incorporado en las
partículas, normalmente después de que la sustancia fotoactiva haya
sido incorporada a las mismas. Alternativamente, el plastificante es
incorporado en la partícula tras la incorporación del compuesto
fotoactivo. Para incorporar el plastificante, las partículas se
calientan en un disolvente orgánico en el que las partículas sean
sustancialmente insolubles y en el que la sustancia fotoactiva tenga
una solubilidad limitada. Tales disolventes orgánicos incluyen, a
título de ejemplo y no de limitación, el etoxietanol, el etanol, el
etilenglicol y el alcohol de bencilo; amidas como la dimetil
formamida, la formamida, la acetamida, la tetrametil urea y
similares; sulfóxidos como el dimetil sulfóxido y el sulfolano; y
éteres como el carbitol, el etil carbitol, el dimetoxi etano y
similares y mezclas acuosas de los mismos entre aproximadamente el
1% y aproximadamente
el 80%.
el 80%.
En una realización menos preferida, el
plastificante puede ser incorporado durante el proceso de tinción;
sin embargo, puede producirse agregación y, por ello, no se prefiere
este enfoque, y puede usarse únicamente cuando pueda tolerarse tal
agregación. Cuando el plastificante es incorporado durante la
incorporación del compuesto fotoactivo, está incluido en la
disolución para su incorporación como se ha descrito
anteriormente.
El plastificante está incluido en el disolvente
en una cantidad tal que en las partículas resultantes esté presente
el nivel deseado de plastificante. La cantidad de plastificante en
el disolvente depende de la naturaleza del disolvente y de la
naturaleza de las partículas, al igual que en la del plastificante.
Normalmente, la concentración de plastificante es desde
aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 25%,
preferentemente desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente
el 15%, más preferentemente del 3% al 7%. El disolvente es
calentado a una temperatura comprendida entre aproximadamente 40 y
aproximadamente 180ºC, habitualmente entre aproximadamente 60 y
aproximadamente 140ºC, durante un periodo de entre aproximadamente
20 minutos y aproximadamente 10 horas, habitualmente entre
aproximadamente 1 hora y aproximadamente 6 horas.
A veces resulta deseable incluir en el
disolvente un agente, normalmente un polímero, que evite la
agregación de las partículas, particularmente cuando el disolvente
es parcialmente acuoso. El agente escogido depende de la naturaleza
del disolvente y de las partículas. Ejemplos de tales agentes, a
título de ilustración y no de limitación, son el dextrano, el
aminodextrano, la albúmina, el alcohol de polivinilo, el almidón, la
polilisina, el ácido poliacrílico y similares. La cantidad de tal
agente es la que resulte efectiva para reducir o eliminar la
agregación de las partículas. Tal cantidad está normalmente entre
aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20%, preferentemente
aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 5% en peso.
Una realización de la presente invención va
dirigida a un procedimiento para preparar partículas que comprenden
una matriz polimérica que tiene un compuesto fotoactivo disuelto en
su interior y entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el
25%, preferentemente entre aproximadamente el 2% y aproximadamente
el 10% en peso de un plastificante. Las partículas tienen un
diámetro de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 \mum.
El procedimiento comprende calentar una mezcla que comprende (i) las
partículas que comprenden el compuesto fotoactivo y (ii) el
plastificante en un medio acuoso durante un periodo de tiempo y a
una temperatura y con una concentración suficiente para que desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 20%, preferentemente
desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 15% en peso del
plastificante se disuelva en las partículas. Esta preparación
alternativa de las partículas del plastificante conlleva calentar
una mezcla de partículas tincionadas y de plastificante en un medio
acuoso, como un disolvente orgánico acuoso. De manera subsiguiente,
las partículas plastificadas se pueden hacer reaccionar con un
reactivo para proporcionar un revestimiento de dextrano sobre las
partículas. Tal reactivo incluye, por ejemplo, yodoaminodextrano y
similares en presencia de un agente de adherencia como el EDAC y
similares para producir partículas plastificantes con un
recubrimiento de aminodextrano. Este enfoque para la preparación de
partículas plastificantes permite el uso de un reactivo más
estable, como el yodoaminodextrano y similares, para formar el
recubrimiento de aminodextrano. La preparación de partículas
plastificantes ejemplificada en el Ejemplo 1 involucra combinar las
partículas tincionadas con plastificante y aminodextrano en un
medio acuoso y calentar la combinación en presencia de un agente de
adherencia como el EDAC.
Como se ha mencionado anteriormente, con las
partículas quimioluminiscentes hallamos que las tasas de pérdida de
intensidad de la emisión seguían ahora una cinética exponencial
prácticamente perfecta. Esto permitía mayores intensidades
lumínicas iniciales, lo que se traducía en una mayor proporción
sañal-fondo y en una detectabilidad mejorada.
También posibilitaba desenmarañar entre sí las señales con
diferentes tasas de pérdida de intensidad. Un experimento
comparativo que usaba partículas quimioluminiscentes de
plastificante dopado con heptadecilbenceno y sin dopar en un
inmunoanálisis de antígenos de la hepatitis B mostró un aumento
aproximado en 2,3 veces en la sensibilidad (es decir, la pendiente
de la curva de respuesta) a 1 pg/ml, lo que se traducía en un
aumento cuádruple en detectabilidad (bajar de 5 a 1 pg/ml cuando el
límite de detección se definía como una señal que estaba 2,3
desviaciones típicas por encima del negativo).
Con respecto a las partículas sensibilizantes,
cuando se incluye un dopante en las partículas, puede incorporarse
más sensibilizante en las partículas antes de que el aumento en la
tasa de oxígeno singlete alcance, con la concentración incrementada
de sensibilizante, un plató. En un experimento, la tasa de
producción de oxígeno singlete aumentó 2,2 veces cuando se
incorporó heptadecilbenceno en partículas de látex que contenían un
fotosensibilizador de ftalocianina. La producción de oxígeno
singlete se midió mediante la irradiación de una suspensión de
partículas sensibilizadoras en una solución de
9,10-bis-carboxietilantraceno y la
subsiguiente medición de la disminución resultante en la
concentración de
9,10-bis-carboxietilantraceno
eliminando las partículas y midiendo la absorbancia de la
disolución.
Como se ha mencionado más arriba, las presentes
composiciones tienen particular aplicación en el campo de los
ensayos. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para la determinación de un analito. Se proporciona
una combinación que comprende (1) un medio del que se sospecha que
contiene el analito, (2) un primer miembro de un par enlazante
específico (pee) capaz de enlazarse con el analito o con un segundo
miembro de un pee para formar un complejo relacionado con la
presencia del analito, y (3) partículas poliméricas de entre
aproximadamente 20 nm y aproximadamente \mum de diámetro que
tienen homogéneamente disperso en su interior entre aproximadamente
el 1 y aproximadamente el 20 por ciento en peso de un dopante y un
compuesto fotoactivo. El compuesto fotoactivo es activado y se
detecta el efecto de la activación en las propiedades ópticas de la
combinación. La presencia y la cantidad del efecto están
relacionadas con la presencia y la cantidad de analito en el
medio.
El ensayo se realiza normalmente en un medio
tampón acuoso con un pH moderado, generalmente aquel que proporciona
una sensibilidad óptima del ensayo. El medio acuoso puede ser
exclusivamente agua, o puede incluir del 0,01 al 80 por cito o más
en volumen de un codisolvente. El pH del medio normalmente estará en
el intervalo entre aproximadamente 4 y 13, más habitualmente en el
intervalo entre aproximadamente 5 y 10, y preferentemente en el
intervalo entre aproximadamente 6,5 y 9,5. El pH se selecciona
generalmente para lograr una sensibilidad y una especificidad
máximas del ensayo. Entre los factores que deben considerarse están
la dependencia del pH con respecto a las tasas de las reacciones
involucradas, el enlace de los miembros enlazantes y la minimización
del enlace no específico, etcétera.
Pueden usarse tampones diversos para lograr el
pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Tampones
ilustrativos incluyen los boratos, los fosfatos, los carbonatos, el
tris, el barbital y similares. El tampón particular empleado no
resulta crítico para la presente invención, pero en un ensayo
individual puede preferirse un tampón u otro.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo el ensayo, y normalmente una temperatura
constante, preferentemente la temperatura ambiente, durante el
periodo de la medición. Las temperaturas de incubación estarán
normalmente en el intervalo entre aproximadamente 5º y 99ºC,
generalmente entre 15º y 70ºC, más habitualmente entre 20º y 45ºC.
Durante las mediciones las temperaturas oscilarán generalmente entre
aproximadamente 10º y 70ºC, más habitualmente entre aproximadamente
20º y 45ºC, más habitualmente de 20º a 25ºC.
En algunos casos, dado que el producto de su
reacción relativamente estable a temperaturas ambiente, los
compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes activados pueden
requerir ser calentados hasta 100ºC para que la desintegración
produzca fluorescencia o quimioluminiscencia. Por ejemplo, pueden
formarse dioxetanos relativamente estables mediante la reacción de
oxígeno singlete con los adamantilidenos (véase, por ejemplo,
McCapra, supra), y pueden formarse endoperóxidos
relativamente estables mediante la reacción de oxígeno singlete con
naftalenos y antracenos 1,4-disustituidos (véase,
por ejemplo, N.J. Turro, Modern Molecular Photochemistry (1978)
Benjamin Cummings Publishing Co., página 594). En las dos
circunstancias anteriores, los materiales estables experimentarán
desintegración al calentarse, normalmente a una temperatura inferior
a 200ºC, preferentemente entre aproximadamente 50 y 100ºC. Tal
calentamiento causa la rápida descomposición del aducto de oxígeno
singlete/olefina y, por ende, cuando se produce
quimioluminiscencia, la emisión de luz se da en un lapso breve de
tiempo. El uso de este enfoque puede resultar deseable cuando las
señales separadas de diferentes compuestos fluorescentes o
quimioluminiscentes son difícilmente de resolver complemente por la
vida útil y la longitud de onda.
La concentración de los componentes que han de
ser detectados variaría por lo general de aproximadamente 10^{-5}
a 10^{-21} M, más habitualmente entre aproximadamente 10^{-6} a
10^{-14} M. Las consideraciones tales como si el ensayo en
cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica particular
de detección y la naturaleza y la concentración del componente de
interés determinarán normalmente las concentraciones de los
diversos reactivos.
Aunque las concentraciones de los diversos
reactivos en el medio de ensayo serán determinadas por lo general
por el intervalo de concentración de interés de los componentes que
han de ser detectados, la concentración final de cada uno de los
reactivos será determinada normalmente de forma empírica para
optimizar la sensibilidad del ensayo en el intervalo. Es decir, una
variación en la concentración de los componentes que han de ser
detectados que sea de significación debería suponer una diferencia
en la señal medible de forma precisa.
Aunque el orden de adición puede ser variado
ampliamente, habrá ciertas diferencias dependiendo de la naturaleza
del ensayo. El orden más simple de adición es añadir todos los
materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden
ser combinados de manera total o parcialmente secuencial. Puede
haber en juego uno o más pasos de incubación después de que los
reactivos se combinen, oscilando por lo general entre
aproximadamente 30 segundos y 6 horas, más habitualmente entre
aproximadamente 2 minutos y 1 hora.
La luminiscencia o la luz producidas por las
presentes composiciones que comprenden un compuesto
quimioluminiscente o fluorescente pueden ser medidas de manera
visual, fotográfica, actinométrica, espectrofotométrica o mediante
cualquier otro medio conveniente para determinar la cantidad de las
mismas que tenga relación con la cantidad de cada componente en el
medio.
El procedimiento y las composiciones de la
invención pueden estar adaptados a la mayoría de los ensayos que
involucran miembros de un pee como reacciones de
ligando-receptor, por ejemplo,
antígeno-anticuerpo, ensayos de enlace de
polinucleótidos, etcétera. Los ensayos son generalmente homogéneos o
heterogéneos, preferentemente homogéneos, incluidos los
competitivos y los sándwich. En un ensayo de enlace específico, la
muestra puede ser tratada previamente, si es necesario, para
eliminar materiales no deseados.
Como se ha mencionado previamente, el primer
miembro anterior de un pee es capaz de enlazarse con el analito o
con un segundo miembro de un pee capaz de enlazarse con el analito.
Cuando el segundo miembro de un pee es también capaz de enlazarse
con el analito, puede resultar un protocolo de ensayo sándwich. La
reacción inmunológica para un ensayo de tipo sándwich suele
involucrar un miembro de un pee, por ejemplo un anticuerpo, que es
complementario del analito, un segundo miembro de un pee, por
ejemplo un anticuerpo, que es también complementario del analito y
enlazado a la matriz particulada, y la muestra de interés.
Alternativamente, uno de los miembros de un pee
puede ser análogo al analito, en cuyo caso puede resultar un
protocolo de ensayo competitivo. La reacción inmunológica para un
protocolo competitivo suele involucrar un miembro de un pee que es
análogo al analito, y habitualmente derivado del mismo. Uno de estos
miembros de un pee estará asociado con la matriz.
En un tipo de ensayo, son combinados una muestra
de la que se sospecha que contiene un analito, que es un miembro de
un pee, y los otros componentes del ensayo con una matriz
particulada de la presente invención. Acto seguido, el medio es
irradiado y, subsiguientemente, examinado para detectar la presencia
de una emisión de luz espontánea (es decir, quimioluminiscente) o
de luz inducida (es decir, fluorescente), normalmente midiendo la
cantidad de luz emitida, que está relacionada con la cantidad de
analito de la muestra. Este enfoque es un ensayo homogéneo en el
que no se emplea un paso de separación.
A continuación se describe a título de ejemplo y
no de limitación un típico protocolo de ensayo. Se une una
composición de partículas quimioluminiscentes de la presente
invención con un reactivo de enlace (por ejemplo: un anticuerpo, un
receptor de oligonucleótidos, etc.) que es complementario del
analito. Se une una partícula sensibilizadora a un segundo reactivo
de enlace específico que es complementario del analito. En un
formato de ensayo sándwich, el analito pone en proximidad estrecha
tanto al sensibilizante como a las partículas quimioluminiscentes.
La activación de las partículas sensibilizadoras con la luz resulta
en la formación de oxígeno singlete, que es canalizado al reactivo
marcador de la partícula.
Las composiciones y los ensayos anteriores se
proporcionan a título de ilustración y no de limitación para
capacitar a una persona versada en la técnica aprecie el alcance de
la presente invención y practique la invención si experimentación
indebida. Se apreciará que la elección de componentes, por ejemplo
analitos, reactivos marcadores, partículas, otros reactivos y
condiciones de reacción se sugerirán por sí solos a las personas
expertas en la técnica en vista de la revelación en el presente
documento y en los ejemplos que siguen.
La presente invención también tiene aplicación
en áreas distintas a los ensayos. Por ejemplo, las presentes
composiciones pueden usarse en la terapia fotodinámica. Puede
encontrarse una exposición de la terapia fotodinámica en un
artículo de Levy en Semin Oncol, 21(6 Suppl
15):4-10 de diciembre de 1994. La terapia
fotodinámica (TFD) se basa en el uso de moléculas sensibles a la
luz, denominadas fotosensibilizadores. La fotoactivación provoca la
formación de oxígeno singlete, que produce reacciones peroxidativas
que puede causar lesiones y muerte celulares. El porfímero de sodio
(Photofrin, fabricado por Lederle Parenterals, Carolina, Puerto
Rico, con licencia de Quadra Logic Technologies, Inc, Vancouver,
Columbia Británica, Canadá) es el fotosensibilizador que se ha
estudiado de forma más generalizada. Los pacientes generalmente
tienen que ser hospitalizados 2 días antes del tratamiento lumínico
tras administrárseles el porfímero de sodio; lleva aproximadamente
48 horas tras la inyección alcanzar la concentración óptima en
tejido tumoral. La capacidad tumoricida de la TFD con porfímero de
sodio es determinada en parte por la profundidad máxima de
penetración de luz que tiene una longitud de onda de 630 nm. El
porfímero de sodio causa fotosensibilidad cutánea que puede durar
hasta 6 semanas. El derivado de la benzoporfirina (BPD verteporfin;
BPD-Quadra Logic Technologies, Inc, Vancouver,
Columbia Británica, Canadá), otro fotosensibilizador, se acumula más
rápidamente en el tejido tumoral, permitiendo una TFD óptima de 30
a 150 minutos siguiendo la administración intravenosa. Se elimina
rápidamente del cuerpo, y la fotosensibilidad cutánea no sobrepasa
algunos días. El mecanismo primario de acción de la TFD está
relacionado con la acumulación selectiva de fotosensibilizadores en
el tejido canceroso. La terapia fotodinámica también promete en el
tratamiento de varias afecciones no neoplásicas, incluidas las
psoriasis, la degeneración macular de la retina, la placa
aterosclerótica y la restenosis, la purga de médula ósea para el
tratamiento de leucemias con trasplante autológico de médula ósea,
la inactivación de virus en la sangre o en productos sanguíneos, y
varias afecciones autoinmunes, incluida la artritis reumatoide. Levy
también presenta las características fisiológicas compartidas por
este dispar grupo de enfermedades, así como los mecanismos mediante
los cuales pueden mediar la fotoactivación. También se expone un
sistema de distribución de nanoesferas de látex (LNDS), que incluye
portadores de tamaño nanométrico de tinciones fluorescentes y de
agentes activos que atacan selectivamente subpoblaciones neuronales
mediante captación o transporte retrógrado.
Madison, et al., Brain Res. (1990),
522(1), 90-98, dan a conocer una amplia gama
de partículas de látex capaces de llevar concentraciones elevadas
de tinciones fluorescentes, fármacos y agentes fotoactivos se manera
selectiva a subpoblaciones de neuronas in vitro e in
vivo. Bachor, et al., J Urol,
146(6):1654-8 diciembre de 1991, dan a
conocer el cloro E6 libre y conjugado en la terapia fotodinámica de
las células del carcinoma humano de la vejiga. Las propiedades
químicas, fotofísicas y fotosensibilizadores de las ftalocianinas
son descritas por van Lier, et al., Ciba Found Symp,
146:17-26; exposición 26-32 (1989).
Reddi, J Photochem Photobiol B,
37(3):189-95, de febrero de 1997, expone el
papel de los vehículos de distribución para los fotosensibilizadores
en la terapia fotodinámica de los tumores. Los vehículos de
distribución basados en lípidos, como los liposomas y las
emulsiones oleosas, permiten la administración de
fotosensibilizadores insolubles en agua. Jiang, et al., J
Natl Cancer Inst, 83(17):1218-25, del 4 de
septiembre de 1991, describen la eliminación de células del
carcinoma celular escamoso humano usando un conjugado monoclonal
anticuerpo-fotosensibilizador. Yemul, et
al., Proc Natl Acad Sci U S A,
84(1):246-50, de enero de 1987, describen la
eliminación selectiva de linfocitos T mediante liposomas
fototóxicos.
Las propiedades ventajosas de las composiciones
de la presente invención permiten una producción potenciada y más
eficiente de oxígeno singlete y, por lo tanto, son más efectivos
para distribuir el nivel necesario de oxígeno singlete al sitio que
va a ser tratado. Para cada partícula que se enlaza con el tejido
enfermo puede distribuirse más oxígeno singlete y/o puede usarse
una potencia de láser inferior menos dañina. Esto se debe a la
capacidad de introducir concentraciones más elevadas de
sensibilizadores en las partículas dopadas antes de que la tasa de
oxígeno singlete ya no aumente. Esta tasa máxima más elevada de
formación de oxígeno singlete durante la irradiación de tales
partículas es capaz de producir mayores lesiones tisulares en los
sitios en los que las partículas están localizadas que los
sensibilizadores convencionales de la terapia fotodinámica. Ello no
solo simplifica los aparatos de láser requeridos para la terapia,
sino que, más importante aún, reduce la cantidad de lesiones en el
tejido periférico que está en la trayectoria de la luz pero que no
tiene fotosensibilizador ligado al mismo. El procedimiento resulta
particularmente útil cuando las partículas hacen blanco en el tejido
de interés en virtud de alguna propiedad química de su superficie,
como la unión de un anticuerpo con un antígeno ubicado en el tejido
que se elige como blanco.
Otro aspecto de la presente invención está
relacionado con kits para su uso para llevar a cabo los
ensayos. El kit está constituido, en una combinación
envasada, por (a) reactivos para llevar a cabo un ensayo,
comprendiendo los reactivos al menos un miembro de un par enlazante
específico, y (b) partículas poliméricas de entre aproximadamente
20 nm y aproximadamente 100 \mum de diámetro que tienen
incorporado en su interior entre aproximadamente un 1 y
aproximadamente un 20 por ciento en peso de un dopante y una
sustancia fotoactiva.
Para mejorar la versatilidad de la presente
invención, los reactivos pueden proporcionarse en una combinación
envasada, en el mismo recipiente o en recipientes separados, de modo
que la proporción de reactivos permita una optimización sustancial
del procedimiento y el ensayo. Los reactivos pueden estar cada uno
en recipientes separados, o pueden combinarse diversos reactivos en
uno o más recipientes, dependiendo de la reactividad cruzada y de
la estabilidad de los reactivos.
El kit puede incluir además otros
reactivos envasados por separado para llevar a cabo un ensayo, tales
como sustratos enzimáticos, miembros adicionales de un pee,
reactivos complementarios, etcétera. Las cantidades relativas de
los diversos reactivos en los kits pueden variarse
ampliamente para dar lugar a concentraciones de los reactivos que
optimicen sustancialmente las reacciones que tienen que ocurrir
durante el presente procedimiento y para optimizar sustancialmente
también la sensibilidad del ensayo. En circunstancias apropiadas,
pueden proporcionarse uno o más de los reactivos del kit
como un polvo seco, normalmente liofilizado, con inclusión de
excipientes, que, una vez diluido, proporcione una solución reactiva
que tenga las concentraciones apropiadas para llevar a cabo un
procedimiento o un ensayo conforme a la presente invención. El
kit puede incluir además una descripción escrita de un
procedimiento conforme a la presente invención, tal como se ha
descrito anteriormente.
La invención es demostrada adicionalmente por
los siguientes ejemplos ilustrativos. Las partes y los porcentajes
enumerados en el presente documento son en peso, a no ser que se
especifique lo contrario. Las temperaturas son en grados
centígrados (ºC).
Los puntos de fusión se determinar en un aparato
capilar Hoover y están sin corregir. Los espectros ^{1}H RMN se
registraron en un espectrómetro de RMN Brucker
WP-250 MHz o Brucker WP-300 MHz. Se
informó de los desplazamientos químicos en partes por millón (0,0).
Las multiplicidades RMN se consignan mediante el uso de las
siguientes abreviaturas: s, singlete; d, doblete; t, triplete; m,
multiplete; Hz, hercio. Los espectros infrarrojos se registraron en
un espectrómetro Perkin-Elmer 2971R. La ionización
química (I.C.) por desorción y la ionización electrónica (I.E.) se
llevaron a cabo en un espectrómetro de masas de alta resolución y
doble foco Varian-MAT 311A. Se usó un Finnigan
TSQ-70 o MAT-8230 para los espectros
de masas con bombardeo de átomos rápidos (FAB/LSIMS). Los espectros
de absorción de UV/visibles se realizaron en un espectrofotómetro
HP8452A de ordenación de diodos. Las mediciones de fluorescencia y
de quimioluminiscencia se llevan a cabo en un espectrofotómetro
Fluorolog Spex o en un espectrofotómetro Perkin Elmer
650-40. Las mediciones de quimioluminiscencia
también se realizaron en un quimioluminómetro propio (caja
Oriel).
Se destiló tolueno a partir de sodio sobre
argón. A no ser que se mencione lo contrario, todos los disolventes
fueron usados sin purificación, y la mayoría de las reacciones se
llevó a cabo en atmósfera de argón. El gel de sílice usado para la
cromatografía de destellos fue el de malla 230-400
ASTM, comprado en Scientific Products, mientras que las planchas
preparatorias (1000) y las planchas analíticas fueron compradas en
Analtech.
Se prepararon tioxeno C-28,
N-fenil oxazina sustituida y tioxeno unido a
9,10-bis(feniletinil)antraceno (BPEA)
como se describe más abajo. Se compraron en Aldrich Chemical Co.
2-cloro
9,10-bis(feniletinil)antraceno
(1-CI-BPEA) y rubreno
(5,6,11,12-tetrafenil naftaceno). El rubreno fue
recristalizado a partir de cloruro de metileno y almacenado a 4ºC
en una botella marrón antes de su uso. Se preparó ftalocianina de
silicio tal como se describe más abajo, y se obtuvo tetrasulfonato
de ftalocianina en Ultra Diagnostics, Inc. Se adquirieron partículas
poliestireno modificado con carboxilato (látex) en Seradyn, Inc.
Las partículas eran de 203 nm. El área de aparcamiento del
carboxilo era de 49,5 angstroms cuadrados (0,09 miliequivalentes/g).
Los sólidos fueron el 10% (100 mg/ml).
El 2-etoxietanol era de Aldrich
Chemical Co. y fue redestilado al vacío. El hidróxido de sodio era
0,1 N. El isopropanol era de Aldrich Chemical Co.
A no ser que se indique lo contrario, los
oligonucleótidos usados en los siguientes ejemplos fueron preparados
mediante síntesis usando un sintetizador automatizado y fueron
purificados mediante electroforesis de gel o HPLC.
Las siguientes abreviaturas tienen los
significados expuestos a continuación:
- Tris HCl
- - Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (una disolución 10\times), de BioWhittaker, Walkersville, {}\hskip0,2cm Maryland.
\global\parskip0.920000\baselineskip
- DTT
- - ditiotreitol, de Sigma Chemical Company, St. Louis, Misuri.
- HPLC
- - cromatografía líquida de alta presión.
- DPP
- - 4,7-difenilfenantrolina, de Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin.
- ASB
- - albúmina de suero bovino, de Sigma Chemical Company, St. Louis, Misuri.
- ELISA
- - inmunoanálisis por absorción ligada al complejo enzima-sustrato, tal como es descrito en {}\hskip0,2cm"Enzyme-Immunoassay", Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1980).
- pb
- - pares base
- ddc
- - dideoxicitidina
- g
- - gramos
- mmol
- - milimoles
- mM
- - milimolar
- pM
- - picomolar
- DMF
- - dimetil formamida
- THF
- - tetrahidrofurano
- LSIMS
- - espectroscopia de masas por bombardeo de iones rápidos
- RMN
- - espectroscopia por resonancia magnética nuclear
- TMSCl
- - tetrametilsililcloruro
- EDAC
- - hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.
- MES
- - ácido 2-(N-morfolino)etano sulfónico.
- SPDP
- -N-succinimidil 3-(2-piridiltio)-propionato.
- Sulfo-SMCC
- - N-sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato.
- TCEP
- - tris-carboxietil fosfina.
- SATA
- - N-succinimidil S-acetiltioacetato
- TSH
- - hormona estimulante del tiroides
- HBsAg
- - antígeno de superficie de la hepatitis B
- ULR
- - unidades lumínicas relativas
\vskip1.000000\baselineskip
La N-fenil oxazina se preparó
mediante un procedimiento similar al descrito en la Patente U.S. Nº
5.578.498 (Singh, et al.) para la preparación del compuesto
16. La revelación relevante de la anterior patente se incorpora en
la presente por referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 1-bromotetradecano
(89,3 mL, 336 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (62,2
mL, 357 mmol) a una disolución de 4-bromoanilina
(30 g, 174 mmol) en DMF seca (200 mL). La solución de la reacción
fue calentada a 90ºC durante 16 horas en atmósfera de argón antes
de ser enfriada a temperatura ambiente. A esta solución de reacción
se añadieron de nuevo 1-bromotetradecano (45 mL,
184 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (31 mL, 178
mmol), y la mezcla de reacción fue calentada a 90ºC durante otras
15 horas. Tras enfriar, la solución de la reacción fue concentrada
al vacío y el residuo fue diluido en CH_{2}Cl_{2} (400 mL). La
solución de CH_{2}Cl_{2} se lavó con NaOH acuoso 1 N
(2\times), H_{2}O y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y
se concentró al vacío para dar un aceite marrón oscuro
(aproximadamente 110 g). La cromatografía preparativa de columna en
gel de sílice mediante la elusión de un sistema Waters 500 Prep LC
con hexano dio un aceite amarillo que contenía principalmente el
producto
(4-bromo-N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilina)
junto con un componente secundario,
1-bromotetradecano. Este compuesto fue eliminado de
la mezcla mediante destilación al vacío (pb
105-110ºC, 0,6 mm) para dejar 50,2 g (51%) del
producto como un aceite marrón. A una mezcla de virutas de magnesio
(9,60 g, 395 mmol) en THF seco (30 mL) en atmósfera de argón se
añadió gota a gota una disolución del anterior producto de anilina
sustituida (44,7 g, 79 mmol) en THF (250 mL). Se añadieron algunos
cristales de yodo para iniciar la formación del reactivo de
Grignard. Cuando la mezcla de reacción se puso caliente y empezó a
experimentar reflujo, se reguló la velocidad de adición para
mantener un reflujo suave. Una vez que se completó la adición, la
mezcla fue calentada a reflujo una hora más. La solución
sobrenadante enfriada fue transferida mediante cánula a un embudo
de adición y añadida gota a gota (a lo largo de 2,5 horas) a una
solución de fenilglioxal (11,7 g, 87 mmol) en THF (300 mL) a -30ºC
en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó gradualmente
hasta 0ºC a lo largo de 1 hora y se agitó durante 30 minutos
adicionales. La mezcla resultante se vertió en una mezcla agua
helada (800 mL) y acetato de etilo (250 mL). Se separó la fase
orgánica y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (3
veces). Las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con H_{2}O
(2\times) y salmuera y se secaron sobre MgSO_{4}. La
evaporación del disolvente dio 48,8 g del producto crudo como un
líquido oleoso verde oscuro. La cromatografía de columna de
destello de este líquido (elusión de gradiente con hexano, 1,5:98,5,
3:97, 5:95 de acetato de etilo:hexano), que dio 24,7 g (50%) del
producto de benzoína (LSIMS (C_{42}H_{69}NO_{2}):
[M-H]^{+} 618,6, ^{1}H RMN (250 MHz,
CDCl_{3}), fue coherente con el producto esperado de benzoína. A
una solución del producto de benzoína anterior (24,7 g, 40 mmol) en
tolueno seco (500 mL) se añadieron secuencialmente
2-mercaptoetanol (25 g, 320 mmol) y TMSCI (100 mL,
788 mmol). La solución de la reacción fue calentada a reflujo
durante 23 horas en atmósfera de argón antes de ser enfriada a
temperatura ambiente. A esto se añadió TMSCI adicional (50 mL, 394
mmol); y la solución de la reacción fue calentada a reflujo otras 3
horas. La solución resultante fue enfriada, se basificó con NaOH
acuoso 2,5N frío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3\times). Las
capas orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO_{3} acuoso
saturado (3\times) y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y
se concentraron al vacío para dar un líquido aceitoso marrón. La
cromatografía preparativa de columna en gel de sílice usando un
sistema Waters 500 Prep LC (elusion de gradiente con hexano, 1:99,
2:98 acetato de etilo:hexano) proporcionó 15,5 g (60%) del tioxeno
C-28 como un aceite
anaranjado-amarillo (LSIMS (C_{44}H_{71}NOS):
[M-H]^{+} 661,6, ^{1}H RMN (250 MHz,
CDCl_{3}) que era coherente con el producto de tioxeno
C-28 esperado,
2-(4-(N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilino)-3-fenil
tioxeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió sodio metal recién cortado (5,0 g, 208
mmol) a 300 mL de metanol anhidro en un matraz de dos litros de 3
bocas equipado con un agitador magnético, condensador de reflujo, un
tubo de secado y un borboteador de gas. Una vez que el sodio se
disolvió completamente, se añadió
4-t-butil-1,2-dicianobenceno
(38,64 g, 210 mmol, de TCI Chemicals, Portland, Oregón) usando un
embudo. La mezcla se aclaró y la temperatura se incrementó hasta
aproximadamente 50ºC. En ese momento se introdujo una corriente
continua de gas amoniaco anhidro por el borboteador de gas en la
mezcla de reacción durante 1 hora. Acto seguido, la mezcla de
reacción fue calentada bajo reflujo durante 4 horas, mientras
continuó la corriente de gas amoniaco durante el transcurso de la
reacción, mientras empezaba a precipitarse un sólido. La suspensión
resultante fue evaporada hasta quedar seca (sistema de vacío propio
del laboratorio) y el residuo se suspendió en agua (400 mL) y se
filtró. Se secó el sólido (60ºC, sistema de vacío propio del
laboratorio, P_{2}O_{5}). La producción de producto
(1,3-diiminoisoindolina, 42,2 g) fue casi
cuantitativa. Se añadieron el producto anterior (18 g, 89 mmol) y
quinolina (200 mL, Aldrich Chemical Company, St. Louis, Misuri) a
un matraz de un litro y tres bocas equipado con un condensador y un
tubo de secado. Se añadió tetracloruro de silicio (11 mL, 95 mmol,
Aldrich Chemical Company) con una jeringa a la solución agitada a
lo largo de un periodo de 10 minutos. Una vez que se completó la
adición, la mezcla de reacción se calentó a
180-185ºC en un baño de aceite durante 1 hora. Se
dejó que la reacción enfriase a temperatura ambiente y se añadió
con cuidado HCl concentrado para acidular la mezcla de reacción (pH
5-6). La mezcla de reacción marrón oscura fue
enfriada y filtrada. El sólido se lavó con 100 mL de agua y se secó
(sistema de vacío propio del laboratorio, 60ºC, P_{2}O_{5}). El
material sólido se colocó en un matraz de fondo redondo de 1 litro
y se añadió ácido sulfúrico concentrado (500 mL) con agitación. La
mezcla se agitó durante 4 horas a 60ºC y luego fue diluida
cuidadosamente con hielo desmenuzado (2000 g). La mezcla resultante
fue filtrada y el sólido fue lavado con 100 mL de agua y secado. El
sólido azul oscuro fue transferido a un matraz de fondo redondo de
1 litro, se añadió amoniaco concentrado (500 mL), y la mezcla fue
calentada y agitada bajo reflujo durante 2 horas, se enfrió a
temperatura ambiente y se filtró. El sólido fue lavado con 50 mL de
agua y se secó al vacío (sistema de vacío propio del laboratorio,
60ºC, P_{2}O_{5}) para dar 12 g de producto de
tetra-t-butil ftalocianina de
silicio como un sólido azul oscuro. Se añadieron
3-picolina (12 g, de Aldrich Chemical Company),
tri-n-butil amina (anhidra, 40 mL) y
tri-n-hexil clorosilano (11,5 g) a
12 g del producto anterior en un matraz de un litro de tres bocas,
equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo. La
mezcla se calentó bajo reflujo durante 1,5 horas y luego se enfrió a
temperatura ambiente. La picolina se extrajo por destilación bajo
vacío elevado (bomba de aceite de aproximadamente 133,32 Pa) hasta
secarse. El residuo fue disuelto en CH_{2}Cl_{2} y se purificó
usando una columna de gel de sílice (hexano) para dar 10 g de
producto puro de tetra-t-butil
ftalocianina de
di-(tri-n-hexilsilil)-silicio
como un sólido azul oscuro. (LSIMS:
[M-H]^{+} 1364,2, espectros de absorción:
metanol: 674 nm ((180.000): tolueno 678 nm, ^{1}H RMN (250 MHz,
CDCl_{3}): (2-4(m, 12H), -1,3(m,
12H), 0,2-0,9(m, 54H), 1,84(s, 36H),
8,3(d, 4H) y 9,6(m, 8H) fue coherente con el anterior
producto esperado.
Se preparó hidroxipropilaminodextrano
(1NH_{2}/ 7 glucosa) disolviendo Dextran T-500
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) (50 g) en 150 mL de H_{2}O en un
matraz de fondo redondo con 3 bocas equipado con un agitador
mecánico y embudo de grifo. A la disolución anterior se añadieron
18,8 g de Zn(SF_{4})_{2} y la temperatura se
llevó hasta los 87ºC con un baño de agua caliente. Se añadió gota a
gota epiclorohidrina (350 mL) con agitación durante aproximadamente
30 min mientras se mantenía la temperatura a
87-88ºC. La mezcla fue agitada durante 4 horas
mientras la temperatura se mantuvo entre 80ºC y 95ºC, luego la
mezcla se enfrió a temperatura ambiente. El producto de
clorodextrano se precipitó vertiendo lentamente en 3L de metanol con
agitación enérgica, se recuperó por filtración y se secó durante la
noche en un horno de vacío.
El producto de clorodextrano fue disuelto en 200
mL de agua y añadido a 2L de amoniaco acuoso concentrado (36%).
Esta disolución fue agitada durante 4 días a temperatura ambiente,
luego concentrada a aproximadamente 190 mL en un evaporador
giratorio. El concentrado fue dividido en dos tandas iguales, y cada
tanda se precipitó vertiendo lentamente en 2 L de metanol con
agitación rápida. El producto final se recuperó mediante filtración
y se secó al vacío.
El hidroxipropilaminodextrano (1NH_{2}/ 7
glucosa), preparado antes, fue disuelto en 50 mM de MOPS, pH 7,2, a
12,5 mg/mL. La disolución fue agitada durante 8 horas a temperatura
ambiente, almacenada bajo refrigeración y centrifugada durante 45
minutos 15.000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-5B
inmediatamente antes de su uso para eliminar un resto de material
sólido. A 10 mL de esta disolución se añadieron 23,1 mg de
Sulfo-SMCC en 1 mL de agua. Esta mezcla fue
incubada durante 1 hora a temperatura ambiente y usada sin
purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 4 mL de una suspensión al 20% (400
mg) de 175 nm de látex modificado con carboxilato con 3 mL de
etoxietanol en un matraz de 25 mL de fondo redondo (F.R.) con una
barra agitadora. A continuación, el matraz de F.R. se colocó en un
baño de aceite a 105ºC y se agitó durante 10 minutos. Acto seguido,
se añadieron 40 mg de tetra-t-butil
ftalocianina de silicio preparada como se ha descrito con
anterioridad; las perlas se agitaron 5 minutos más. Durante todas
las adiciones, la temperatura del baño de aceite se mantuvo a 105ºC.
Se permitió que la temperatura del baño de aceite descendiese
lentamente hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. Tras
enfriarse, la mezcla fue diluida con 20 mL de etanol y se centrifugó
(12.500 rpm, 30 minutos). Los sobrenadantes se desecharon y los
gránulos se volvieron a suspender en etanol mediante ultrasonido. Se
repitió la centrifugación, y los gránulos se resuspendieron en
agua, y se repitió la centrifugación. Los gránulos fueron
resuspendidos en 5 mL de etanol acuoso al 10% hasta un volumen final
de 40 mL.
Se ligó la estreptavidina a las anteriores
perlas usando 25 mg de estreptavidina por 100 mg de perlas. Se
disolvieron 25 mg de estreptavidina (50 mg de sólido Aaston, de
Aaston, Wellesley, Massachusetts) en 1 mL de EDTA 1 mM, pH 7,5 y a
lo anterior se añadieron 77 \muL de 2.5 mg/mL SATA en etanol. La
mezcla fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se
preparó una solución de deacetilación que contenía 1 M de
hidroxilamina-HCl, 50 mM de Na_{2}PO_{4}, 25 mM
de EDTA, pH 7,0. Se añadieron 0,1 mL de esta solución de
deacetilación a la disolución anterior y se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente. La estreptavidina tiolada resultante fue
purificada en una columna Pharmacia PD10 y fue lavada con un tampón
de columna que contenía 50 mM de MOPS, 50 mM de EDTA, pH 7,2. El
volumen de la muestra se llevó a los 2,5 mL añadiendo 1,5 mL del
anterior tampón de columna. La estreptavidina tiolada fue diluida
hasta 5 mL añadiendo 1,5 mL de 50 mM de MOPS, 50 mM de EDTA, 0,1%
de Tween-20, pH 7,2. Se añadieron 5 mL de la
solución de estreptavidina tiolada a 5 mL de perlas sensibilizadoras
maleimidadas preparadas como se ha descrito anteriormente, en
atmósfera de argón, y se mezcló bien. Las perlas fueron recubiertas
con argón durante 1 minuto, se selló el tubo y la mezcla de reacción
se incubó durante la noche a temperatura ambiente en la
oscuridad.
A las perlas anteriores se añadieron 7,5 mL de
50 mM de MOPS, 50 mM de EDTA, 0,1% de Tween-20, pH
7,2 para llevar las perlas a 1 mg/mL. Las maleimidas restantes
fueron funcionalizadas añadiendo ácido mercaptoacético a una
concentración final de 2 mM. La mezcla fue incubada en la oscuridad
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tioles restantes
fueron funcionalizados añadiendo ácido yodoacético a una
concentración final de 10 mM y la mezcla fue incubada a temperatura
ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Las perlas fueron
centrifugadas durante 30 minutos a 15.000 rpm (Sorvall
RC-5B) como anteriormente un total de tres
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Configuración del Microgon: Se montó un
Microgon tal como se describe en el manual "Minikros Lab
Systems", páginas 8-10. Se usó un módulo de 0,1
micrómetros accionado entre aproximadamente
34,47-68,95 kPa. El aparato Microgon se lavó con
etanol (200 grado alcohólico).
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se calentó un baño de aceite hasta 95ºC \pm 3ºC. Un matraz de fondo redondo (mfr) de 1 litro con tres bocas equipado de un agitador mecánico digital Cafeama desde la boca central fue sumergido en el baño de aceite.
- 2.
- Adición de partículas: se añadieron 200 ml \pm 5,0 ml de de partículas de látex al mfr por medio de un cilindro de medición, que se levaron con 2 \times 30 ml de etoxietanol (ee), y el contenido fue transferido al mfr. Al matraz se añadieron 20 \pm 5 ml de hidróxido sódico 0,1 N. Las partículas fueron agitadas a 330 rpm a 95ºC durante 20 minutos.
- 3.
- Adición de tioxeno C-28: se disolvieron 3,6 gramos de tioxeno C-28 en 85 ml de etoxietanol, y la solución resultante fue añadida a las partículas gota a gota a lo largo de 85-100 minutos a una velocidad de adición constante de aproximadamente 1,0 ml por minuto. Las partículas se agitaron durante 5 minutos y se añadieron 6,0 ml de hidróxido sódico 0,1 N y 30 ml de agua desionizada a lo largo de 10 minutos. Las partículas se agitaron durante 5 minutos.
- 4.
- Adición de 1-Cl-BPEA: se añadió 1 gramo de 1-Cl-BPEA a 155 ml de ee y se calentó gradualmente hasta 95ºC para disolver el 1-Cl-BPEA. La solución de etoxietanol de 1-Cl-BPEA fue añadida a las partículas a lo largo de 60-70 minutos. Las partículas fueron agitadas durante 5 minutos y se añadieron 6,0 ml de hidróxido sódico 0,1 N y de 12 ml de agua desionizada a las partículas durante 5 minutos. Las partículas fueron agitadas durante 10 minutos.
- 5.
- Adición de rubreno: se disolvió rubreno (recristalizado, P.F. 328ºC-329ºC, 480 mg) en 200 ml de 1,2-dimetoxietano y después de añadió con agitación a las partículas anteriores a lo largo de 70-90 minutos. La velocidad de adición fue de 3,0 ml por minuto. A continuación, se añadieron 30 ml de hidróxido sódico 0,1 N y 120 ml de agua desionizada a las partículas a lo largo de 30 minutos, y el medio fue agitado durante 10 minutos. El medio fue enfriado hasta 40ºC durante 1 hora con agitación. Las partículas fueron sometidas a filtración en un aparato Microgon usando un filtro (Tetko) de 43 micrómetros (de Tetko Inc., Briarcliff Manor, Nueva York).
Se determinó que las partículas tenían
aproximadamente un 15% en peso de tinciones incorporadas en su
interior y que la concentración de las partículas era de 37 mg/ml.
El tamaño de las partículas era de 216 nm \pm17 nm. La
concentración de tinciones era como sigue: tioxeno
C-28, aproximadamente 100 mM;
1-Cl-BPEA, aproximadamente 43 mM; y
rubreno, aproximadamente 21,5 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Configuración del Microgon: Se montó un
Microgon tal como se describe en el manual Minikros Lab Systems,
páginas 8-10. Se usó un módulo de 0,1 micrómetros
accionado entre aproximadamente 34,47-68,95 kPa. El
aparato Microgon se lavó con etanol (200 grado alcohólico).
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se calentó un baño de aceite hasta 95ºC \pm 1ºC. Un matraz de fondo redondo (mfr) de 1 litro con tres bocas equipado de un agitador mecánico digital Cafeama desde la boca central fue sumergido en el baño de aceite.
- 2.
- Adición de partículas: se añadieron 200 ml \pm 5,0 ml de partículas de látex al mfr por medio de un cilindro de medición, que se levaron con 2 \times 30 ml de etoxietanol (ee), y el contenido fue transferido al mfr. Al matraz se añadieron 20 \pm 5 ml de hidróxido sódico 0,1 N. Las partículas fueron agitadas a 330 rpm a 95ºC durante 20 minutos.
- 3.
- Adición de N-fe: se disolvió N-fe (1,93 gramos, 5,4 mmol) en 85 ml de etoxietanol, y la solución resultante fue añadida a las partículas gota a gota a lo largo de 85-100 minutos a una velocidad de adición constante de aproximadamente 1,0 ml por minuto. Las partículas se agitaron durante 5 minutos y se añadieron 6,0 ml de hidróxido sódico 0,1 N y 30 ml de agua desionizada a lo largo de 10 minutos. Las partículas se agitaron durante 5 minutos.
- 4.
- Adición de rubreno: se disolvió rubreno (480 mg, 0,9 mmol) en 200 ml de 1,2-dimetoxietano y después de añadió con agitación a las partículas anteriores a lo largo de 70-90 minutos. La velocidad de adición fue de 3,0 ml por minuto. A continuación, se añadieron 30 ml de hidróxido sódico 0,1 N y 120 ml de agua desionizada a las partículas a lo largo de 30 minutos, y el medio fue agitado durante 10 minutos. El medio fue enfriado hasta 40ºC durante 1 hora con agitación. Las partículas fueron sometidas a filtración en un aparato Microgon usando un filtro (Tetko) de 43 micrómetros (de Tetko Inc., Briarcliff Manor, Nueva York).
\vskip1.000000\baselineskip
Se montó un Microgon tal como se describe en el
manual "Minikros Lab Systems", páginas 8-10. Se
usó un módulo de 0,1 micrómetros accionado entre aproximadamente
34,47-68,95 kPa. El aparato Microgon se lavó con
etanol (200 grado alcohólico).
- 1.
- Partículas RTA preparadas como se ha descrito anteriormente
- 2.
- N-heptadecilbenceno de Pfaltz & Bauer
- 3.
- Etanol
- 4.
- Aminodextrano (una amina por cada 15,5 glucosas)
- 5.
- EDAC (Sigma)
- 6.
- Dextrano aldehído (8-9 aldehídos por azúcar)
- 7.
- Cianoborohidruro sódico
- 8.
- Tampón MES
- 9.
- Cloruro sódico
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- La reacción se llevó a cabo en un matraz cónico de 500 ml que estaba tapado y cubierto con papel de aluminio. Al matraz cónico se añadieron 0,5 ml de N-heptadecilbenceno (como dopante) y 10 ml de etanol. Se disolvió aminodextrano (1,0 g) en 20 ml de tampón MES 50 mM (pH = 6,0) (50 mg/mL) y luego se añadió al matraz cónico. A continuación, se añadieron 30 mL de tampón MES (50 mM, pH = 6,0) al matraz cónico, que fue entonces agitado o sometido a vórtice. Ochenta (80) mL del medio que contenía las partículas RTA fotoactivas (25 mg/mL) fueron añadidos al matraz cónico, que fue nuevamente agitado a sometido a vórtice. Al matraz se añadieron 60 mL de tampón MES (50 mM, pH = 6,0). El matraz fue cubierto con papel de aluminio y colocado en un agitador a 80-85ºC.
Después de aproximadamente 16 horas en el
agitador, la temperatura de las partículas se permite que descienda
a la temperatura ambiente. Se disolvió EDAC (400 mg) en 5,0 mL de
agua desionizada y se añadió al anterior matraz un mL cada vez, con
agitación, a lo largo de diez minutos. El matraz fue devuelto al
agitador durante 16 horas a temperatura ambiente. Se añadió un
volumen igual de NaCl 1,0 M en el tampón MES al matraz cónico. La
mezcla se cargó en una configuración de Microgon y las partículas se
concentraron hasta entre 25 y 50 ml. Las partículas fueron lavadas
con entre uno y dos litros de NaCl 0,5 M en el tampón MES. El tamaño
de las partículas se determinó usando un instrumento NICOMP.
Las concentraciones de tinción fueron: tioxeno
100 mM; CI-BPEA 25 mM y rubreno 35 mM; el
plastificante estaba presente a un nivel del 20% en peso. La
concentración de dextrano en las perlas se determinó que era de 10
\pm 2% mediante el procedimiento bien conocido de la antrona. Se
volvieron a suspender dos (2) g de partículas recubiertas de amino
a 20 mg/mL en tampón MES (pH = 6,0, 50 mM y NaCl 0,5 M). El volumen
total fue de 100 mL.
Se tomaron alícuotas (10 mL) de la suspensión
anterior y se sometieron a ultrasonidos durante 50 pulsos. La
suspensión de perlas sometida a ultrasonidos fue añadida gota a gota
a 240 ml de dextrano aldehído prefiltrado (60 mg/mL) en una botella
de 500 ml con agitación. Se añadieron doce (12) mL de una solución
recién preparada de 40 mg/mL de NaCNBH_{3} a las perlas, que
fueron incubadas a 37ºC durante 48 horas sobre un agitador.
Después, las partículas fueron sometidas al aparato Microgon.
Se mezclaron cincuenta (50) \mug de partículas
quimioluminiscentes (dopadas con heptadecilbenceno o sin dopar) y
50 nM de ácido tetrasulfónico de ftalocianina en 1,0 ml de tampón
Tris (pH 8,0; 50 mM). Todas las mediciones en este ejemplo y en los
expuestos a continuación se llevaron a cabo usando un lector manual
construido en las propias instalaciones. Este lector era similar a
los lectores convencionales, salvo en que tenía un mecanismo para
el cambio rápido del filtro. El lector ilumina la muestra con un
láser de 675 nm, luego lee la luz emitida con un tubo
fotomultiplicador usando obturadores y filtros apropiados. La
solución fue colocada en el lector (temperatura de 37ºC) y fue
irradiada a 680 nm durante 1 segundo y, tras una demora de 50
milisegundos en la quimioluminiscencia, se registró una lectura
durante seis segundos. En la Figura 1 se muestra un gráfico de la
intensidad de la señal con respecto al tiempo tanto para partículas
dopadas como sin dopar. En la Figura 2 se muestra un gráfico
logarítmico. Para las perlas dopadas conforme a la presente
invención, la pérdida de intensidad de la quimioluminiscencia fue
monofásica, con una vida media de 0,52 segundos a 37ºC. Para las
perlas no dopadas, la pérdida de intensidad de la
quimioluminiscencia fue multifásica.
Se prepararon cincuenta (50) \mug de
partículas quimioluminiscentes (dopadas con heptadecilbenceno o sin
dopar) recubiertas de anticuerpo (TSH) de manera similar a la
descrita en la Patente U.S. Nº 5.618.732, la revelación relevante
de la cual es incorporada en la presente por referencia. Estas
partículas fueron añadidas a 1,0 ml de tampón Tris (pH 8,0; 50 mM
con un 1% de Zwittergen (Sigma Chemical Company), y se incubaron a
37ºC durante 3 días. Se añadieron 50 nM de ácido tetrasulfónico de
ftalocianina a las soluciones incubadas de partículas. La solución
fue colocada en el instrumento lector (temperatura de 37ºC). La
solución fue irradiada a 680 nm durante 1 segundo y, tras una
demora de 50 milisegundos en la quimioluminiscencia, se registró una
lectura durante cinco segundos. En la Figura 3 se muestra un
gráfico de la intensidad de la señal con respecto al tiempo tanto
para partículas dopadas como sin dopar. En la Figura 4 se muestra un
gráfico logarítmico. Para las perlas dopadas conforme a la presente
invención, la pérdida de intensidad de la quimioluminiscencia fue
monofásica, con una vida media de 0,50 segundos a 37ºC.
Se añadieron cincuenta (50) \mug de partículas
quimioluminiscentes (dopadas con heptadecilbenceno) recubiertas de
dextrano aldehído y 200 \mug de perlas sensibilizadoras
recubiertas de hidracina a 1,0 ml de tampón Tris (pH 8,0; 50 mM) y
se incubaron a 37ºC durante 18 horas. El recubrimiento de hidracina
se llevó a cabo mediante un conocimiento bien conocido en la
técnica. Se añadieron 100 \mul de la solución incubada a 0,9 mL de
tampón B (10 mM de tampón TRIS, pH 8,3, 50 mM de KCl, 4 mM de
MgCl_{2} y 02, mg/ml de ASB acetilada). Un conjunto de tubos fue
termociclado a lo largo de 35 ciclos. (Cada ciclo = 96ºC durante 60
segundos; 74ºC durante 30 segundos y 65ºC durante 60 segundos). La
solución fue colocada en el instrumento lector mencionado
anteriormente (temperatura de 40ºC). La solución fue irradiada a
680 nm durante 1 segundo y, tras una demora de 50 milisegundos, se
registró la quimioluminiscencia durante seis segundos. En la Figura
5 se muestra un gráfico de la intensidad de la señal con respecto
al tiempo tanto para partículas dopadas como sin dopar. En la Figura
6 se muestra un gráfico logarítmico.
Se añadieron cincuenta (50) \mug de partículas
quimioluminiscentes (dopadas con perfluorodecalina) recubiertas de
anticuerpo (TSH) a 1,0 ml de tampón Tris (pH 8,0; 50 mM con 0,1% de
Tween-20) y se incubaron a 37ºC durante 2 días. Las
partículas perfluorodecalina se prepararon de forma similar a la de
las partículas que contenían heptadecilbenceno. Se añadieron 50 nM
de ácido tetrasulfónico de ftalocianina a las soluciones incubadas
de partículas. La solución fue colocada en el instrumento lector
mencionado anteriormente (temperatura de 37ºC). La solución fue
irradiada a 680 nm durante 1 segundo y, tras una demora de 50
milisegundos, se registró la quimioluminiscencia durante cinco
segundos. En la Figura 7 se muestra un gráfico de la intensidad de
la señal con respecto al tiempo para las partículas dopadas con
perfluorodecalina. La pérdida de intensidad de la
quimioluminiscencia fue monofásica, y una vida media fue de de 0,24
segundos a 37ºC. Como se ha mostrado anteriormente, la vida media
de las perlas dopadas con heptadecilbenceno fue de 0,52 segundos
bajo las mismas condiciones.
Se mezclaron cincuenta (50) \mug de partículas
quimioluminiscentes (dopadas con heptadecilbenceno o sin dopar) y
50 nM de ácido tetrasulfónico de ftalocianina en 1,0 ml of tampón
Tris (pH 8,0; 50 mM). La solución fue colocada en el instrumento
lector mencionado anteriormente (temperatura de 37ºC o 50ºC). La
solución fue irradiada a 680 nm durante 1 segundo y, tras una
demora de 50 milisegundos, se registró la quimioluminiscencia
durante cuatro segundos. En la Figura 8 se muestra un gráfico de la
intensidad de la señal con respecto al tiempo tanto para partículas
dopadas como sin dopar. En la Figura 9 se muestra un gráfico
logarítmico. La pérdida de intensidad de la quimioluminiscencia fue
monofásica para las perlas dopadas conforme a la presente
invención, y la vida media fue de de 0,48 \pm 0,5 segundos a 37ºC
y de 0,166 segundos a 50ºC.
Se añadieron estándares de HBsAg en suero
almacenado (0 a 100 pg/ml) a perlas de quimioluminiscente
recubiertas de anticuerpo anti HBsAg o bien dopadas o sin dopar (2
\mug por ensayo) y anticuerpo 2 biotinilado en 0,8 mL de tampón B
y fueron incubados durante 20 minutos. Se añadieron 20 \mug de
perlas de estreptavidina en 0,2 mL de tampón B a la mezcla del
ensayo y se incubó durante 10 minutos. Se registró la señal
irradiando la muestra con luz de 680 nm durante 1 segundo y, tras
50 milisegundos, la luz emitida fue recogida durante 1 segundo
(filtro paso de banda 550-650 nm). El procedimiento
se repitió seis veces y la señal total se diagramó en la Figura 10.
Se determinó el CV para 1500 muestras negativas de un banco de
sangre tanto para perlas dopadas como sin dopar. El CV de ambos
juegos de perlas para 1500 muestras estaba entre el
2-3%. En la Figura 11 se comparan seis muestras
problemáticas de perlas dopadas y sin dopar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron estándares de HBsAg en suero
almacenado (0 a 100 pg/ml) a perlas de quimioluminiscente sin dopar
recubiertas de anticuerpo anti HBsAg (2 \mug por ensayo) y
anticuerpo 2 biotinilado en 0,8 mL de tampón B y fueron incubados
durante 20 minutos. Se añadieron 20 \mug de perlas de
estreptavidina dopadas y sin dopar en 0,2 mL de tampón B a la
mezcla del ensayo y se incubó durante 10 minutos. Se registró la
señal irradiando la muestra con luz de 680 nm durante 1 segundo y,
tras 50 milisegundos, la luz emitida fue recogida durante 1 segundo
(filtro paso de banda 550-650 nm). El procedimiento
se repitió seis veces y la señal total (media de tres experimentos)
se tabula a continuación en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron estándares de la TSH en suero
almacenado (0 y 1 \muU/ml) a perlas de quimioluminiscente
recubiertas de anticuerpo anti TSH o bien dopadas o sin dopar (2
\mug por ensayo) y anticuerpo 2 biotinilado en 0,8 mL de tampón B
y fueron incubados durante 20 minutos. Se añadieron 20 \mug de
perlas de estreptavidina en 0,2 mL de tampón B a la mezcla del
ensayo y se incubó durante 10 minutos. Se registró la señal
irradiando la muestra con luz de 680 nm durante 1 segundo y, tras
50 milisegundos, la luz emitida fue recogida durante 1 segundo
(filtro paso de banda 550-650 nm). El procedimiento
se repitió seis veces y la señal total se tabula a continuación en
la Tabla 2 y se diagrama en la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron estándares de la TSH en suero
almacenado (0 y 1 \muU/ml) a perlas de quimioluminiscente sin
dopar recubiertas de anticuerpo anti TSH (2 \mug por ensayo) y
anticuerpo 2 biotinilado en 0,8 mL de tampón B y fueron incubados
durante 20 minutos. Se añadieron 20 \mug de perlas de
estreptavidina dopadas y sin dopar en 0,2 mL de tampón B a la
mezcla del ensayo y se incubó durante 10 minutos. Se registró la
señal irradiando la muestra con luz de 680 nm durante 1 segundo y,
tras 50 milisegundos, la luz emitida fue recogida durante 1 segundo
(filtro paso de banda 550-650 nm). El procedimiento
se repitió seis ciclos y la señal total (media de tres
experimentos) se tabula a continuación en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizó oligonucleótido en la superficie
de las partículas para su uso en los experimentos en el presente de
la siguiente manera. Se maleimidató parcialmente aminodextrano (500
mg) haciéndolo reaccionar con sulfo-SMCC (157 mg,
10 mL de H_{2}O). El sulfo-SMCC fue añadido a una
solución del aminodextrano (en 40 mL, Na_{2}HPO_{4} 0,05 M, pH
7,5) y la mezcla resultante fue incubada durante 1,5 horas. La
mezcla de reacción fue dializada a continuación contra MES/NaCl
(2\times2 L, 10 mM MES, 10 mM NaCl, pH 6,0, 4ºC). El dextrano
maleimidatado fue centrifugado a 15.000 rpm durante 15 minutos, y
el sobrenadante fue recogido. La solución sobrenadante de dextrano
(54 mL) fue tratada entonces con imidazol (7 mL of solución 1,0 M)
en tampón MES (pH 6,0) y a esta disolución agitada se añadieron
partículas manchadas (fotosensibilizadoras y quimioluminiscentes)
(10 mL de 10 mg/mL). Tras agitar durante 10 minutos, la suspensión
fue tratada con EDAC (7 mmol en MES 10 mM pH 6,0) y la suspensión
se agitó durante 30 minutos. Después de este lapso, se añadió
SurfactAmps® (Pierce Chemical Company) Tween-20
(10%, 0,780 mL) a la mezcla de reacción para lograr una
concentración final del 0,1%. Acto seguido, las partículas fueron
centrifugadas a 15.000 rpm durante 45 minutos, y el sobrenadante fue
desechado. Los gránulos fueron resuspendidos en MES/NaCl (pH 6,0,
10 mM, 100 mL) mediante ultrasonidos. La centrifugación a 15.000
rpm durante 45 minutos, seguida por la resuspensión de los gránulos
tras descartar el sobrenadante se llevó a cabo dos veces. Las
partículas de dextrano maleimidatado se almacenaron en agua como
suspensión de 10 mg/mL.
Se disolvió oligonucleótido tiolado
(oligonucleótido portador de un grupo
5'-bis(6-hidroxietildisulfuro)
(Oligos Etc.) en agua a una concentración de 0,49 mM. A 116 \muL
de esta solución se añadieron 8,3 \muL de de acetato sódico 3,5
M, pH 5,3, y 8,9 \muL de tris(carboxietil)fosfina
(20 mM). Después de 30 minutos de incubación a temperatura
ambiente, se añadieron 548 \muL de etanol, y la mezcla se mantuvo
a aproximadamente -20ºC durante 1,5 horas. El oligonucleótido
precipitado se recuperó mediante centrifugación durante 2 minutos a
15.000 rpm en una centrífuga Eppendorf, luego disuelto en 37,5
\muL de 5 mM de fosfato sódico, 2 mM de EDTA, pH 6.
Se centrifugó durante 30 minutos a
aproximadamente 37.000 g una parte alícuota de las perlas
maleimidatadas preparadas anteriormente que contenía 22 mg de
perlas, y los gránulos se resuspendieron en 96 \muL de de 0,26 M
de NaCl, 0,05% de Tween-20, 95 mM de fosfato sódico,
y 0,95 mM de EDTA, pH 7. Se añadió el oligonucleótido tiolado y la
mezcla se mantuvo a 37ºC durante 64 horas en atmósfera de argón. Se
añadió una alícuota de 10 \muL de tioglicolato sódico y la
incubación continuó durante 2 horas a 37ºC. Se añadió agua hasta un
volumen total de 1 mL, y las perlas fueron recuperadas mediante
centrifugación, luego resuspendidas en 5 mL de 0,1 M de NaCl, 0,17
M de glicina, 10 mg/mL de ASB, 1 mM de EDTA, 0,1% de
Tween-20, y 0,5 mg/mL de ADN de timo de ternera
(calidad Biología Molecular Sigma), pH 9,2. Después de tres horas,
se recuperaron las perlas y se lavaron tres veces por
centrifugación, dos veces en tampón A y una vez en tampón CRP
estándar. El producto se almacenó refrigerado en tampón CRP. El
tampón A contenía 0,1 M de base Tris (J.T. Baker Chemical Co.), 0,3
M de NaCl (Mallinckrodt), 25 mM de EDTA Na_{2} H_{2}O (Sigma
Chemical Co.), 0,1% de ASB (Sigma Chemical Co.), 0,1% de dextrano
T-500 (Pharmacia), HBR-1
(Scantibodies), 0,05% de Kathon y 0,01% de sulfato de gentamicina
(GIBCO), preparado disolviendo y ajustando el pH a 8,20 con HCl
concentrado y completando hasta 10 L con agua destilada.
El procedimiento anterior puede ser modificado
de manera similar a la descrita por Ullman, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5426-5427 en la
columna 1 de la página 5427.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó ARN del VIH diana (obtenido en
Organon Teknika, Boxtel, Holanda) mediante el procedimiento de
amplificación isotérmica NASBA. Se empleó el Kit de
Amplificación NASBA de Organon Teknika. Se agregó una sonda
específica para el tipo salvaje (TS) a las perlas RTADop. Se agregó
una sonda específica para el control interno (ELGA) a las perlas de
N-fenil oxazina (perlas quimioluminiscentes con una
vida media de la pérdida de intensidad de 30 segundos). Las perlas
sensibilizadoras tenían agregadas sondas que reconocen tanto la
secuencia TS como la secuencia ELGA. La amplificación NASBA se llevó
a cabo según se describe en la Patente U.S. Nº 5.130.238, la
revelación relevante de la cual es incorporada en la presente por
referencia. La amplificación se realizó en presencia de una sonda
de 62,5 nM (4 sondas diferentes) y de 1,25 \mug de cada tipo de
perla (2 quimioluminiscentes y 2 sensibilizadoras). La reacción de
20 \muL fue incubada durante 90 minutos a 41ºC. Se leyó la señal,
que se tabula abajo en la Tabla 4. Ciclo de lectura: irradiación de
0,1 segundos, lectura de 0,5 segundos; demora de 30 segundos y
lectura de 5 segundos.
A partir de la señal en bruto la ventana de 5
segundos presentaba quimioluminiscencia procedente únicamente de
las perlas de n-fenil oxazina. Esto solo podía
ocurrir cuando se usaban perlas RTA, dado que su pérdida de
intensidad es monofásica. Cuando se usaban perlas RTA sin dopar, la
señal se desborda a la zona de lectura de los 5 segundos. Sin
embargo, el valor ULR de 0,5 segundos tiene una combinación tanto de
perlas RTA dopadas como de perlas N-fe. La
convergencia calculada de la señal N-fe en la
ventana de RTA dopada es aproximadamente 0,57 veces su señal de 5
segundos. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla
4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se agregó una sonda específica para TS a las
perlas RTADop. Se agregó una sonda específica para control
cuantitativo a las perlas de N-fenil Oxazina
(perlas quimioluminiscentes con una vida media de la pérdida de
intensidad de 30 segundos). Las perlas sensibilizadoras tenían
agregadas sondas que reconocen tanto la secuencia TS como la
secuencia ELGA. La amplificación NASBA se llevó a cabo según se
describe anteriormente, pero en presencia de una sonda de 62,5 nM
(4 sondas diferentes) y de 1,25 \mug de cada tipo de perla (2
quimioluminiscentes y 2 sensibilizadoras). La reacción de 25 \muL
fue incubada durante 90 minutos a 41ºC. Se leyó la señal, que se
tabula abajo en la Tabla 5. Ciclo de lectura: irradiación de 0,1
segundos, lectura de 0,5 segundos; demora de 30 segundos y lectura
de 5 segundos.
A partir de la señal en bruto la ventana de 5
segundos presentaba quimioluminiscencia procedente únicamente de
las perlas de n-fenil oxazina. Esto solo podía
ocurrir cuando se usaban perlas RTA, dado que su pérdida de
intensidad es monofásica. Cuando se usaban perlas RTA sin dopar, la
señal se desborda a la zona de lectura de los 5 segundos. Sin
embargo, el valor ULR de 0,5 segundos tiene una combinación tanto de
perlas RTA dopadas como de perlas N-fe. La
convergencia calculada de la señal N-fe en la
ventana de RTA dopada es aproximadamente 0,57 veces su señal de 5
segundos. Señal de tipo salvaje (lectura de 0,5 segundos): 400
ULR/10 attomoles. Señal de control cuantitativo (AC) (lectura de 5
segundos): 20 ULR/10 attomoles.
Se amplificó ARN del VIH diana (obtenido en
Organon Teknika, Boxtel, Holanda) mediante el procedimiento de
amplificación isotérmica NASBA. Se empleó el Kit de
Amplificación NASBA de Organon Teknika. El ARN diana, al que se
alude más abajo como TS, a entrada inicial diversa (número de
moléculas por reacción) se amplificó en presencia de ARN de
referencia, con un número conocido de moléculas. Las moléculas de
ARN de referencia, a las que se alude más abajo como AC, fueron
desarrolladas (por Organon Teknika) para que fueran homólogas al
ARN diana salvo en la secuencia interna de 21 nucleótidos. Esta
secuencia en el ARN de referencia era de 63 nucleótidos desde el
extremo 3' de la misma y era complementaria a la secuencia en la
tercera sonda oligonucleótida expuesta más abajo. La
correspondiente secuencia en el ARN diana era complementaria a la
secuencia en la segunda sonda oligonucleótida expuesta más abajo.
Una secuencia tanto en el ARN diana como de referencia que tenía 29
nucleótidos desde el extremo 3' era complementaria a una secuencia
en la primera sonda oligonucleótida, o sonda
común.
común.
El anterior diseño del ARN de referencia
garantiza la amplificación del ARN de referencia y diana por los
mismos cebadores y la misma enzima con igual eficiencia de
amplificación para el ARN diana y de referencia. La secuencia del
ARN diana y de referencia fue tal como describe el fabricante en J.
Virological Methods (1993) 43:177-188.
Se usó un procedimiento de detección homogénea
de la quimioluminiscencia, tal como se ha descrito más arriba, para
generar señales para la determinación. La señal de la
quimioluminiscencia se producía cuando un par de sondas quedaban
enlazadas al analito de ARN diana, una de las cuales se enlazaba con
una partícula que producía oxígeno singlete, la partícula
sensibilizadora, y la otra de las cuales se enlazaba con una
partícula tincionada con una tinción aceptora específica. En el
presente documento estas sondas son denominadas sondas de detección
de partículas. Las sondas de detección de partículas incluían una
primera sonda oligonucleótida de detección que comprendía una
secuencia que era complementaria a una secuencia en la primera sonda
oligonucleótida indicada por el subrayado en la secuencia
posterior. Se agregó una partícula con la que estaba asociado un
sensibilizador en el extremo 3' de la primera sonda oligonucleótida
de detección. Una segunda sonda oligonucleótida de detección
comprendía una secuencia que era complementaria a una secuencia en
la segunda sonda oligonucleótida indicada por el subrayado en la
secuencia posterior. Se agregaron partículas RTADop tincionadas en
el extremo 3' de la segunda sonda oligonucleótida de detección. Una
tercera sonda oligonucleótida de detección comprendía una secuencia
que era complementaria a una secuencia en la tercera sonda
oligonucleótida indicada por el subrayado en la secuencia
posterior. Se agregaron partículas N-fe tincionadas
en el extremo 3' de la tercera sonda oligonucleótida de detección.
Las sondas de detección de partículas quedaron enlazadas con las
sondas oligonucleótidas respectas primera, segunda o tercera usadas
en este ejemplo, en el que el enlace era no covalente y estaba
basado en la hibridación de una secuencia de las sondas de
detección de partículas, ya sea en el terminal oligonucleótido 3' o
en el 5', a una secuencia complementaria en las sondas
oligonucleótidas respectivas primera, segunda o tercera. Se
detectaron específicamente las señales de quimioluminiscencia
producidas por complejos de de la partícula sensibilizadora común,
con cada una de las partículas quimioluminiscentes específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'(dT)_{20}TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA 3' | (ID SEC Nº:1) | |
| 5'(TACT)_{5}GCTGCAGAATGGGATAGA 3' | (ID SEC Nº:2) | |
| 5'GATGACAGTCGCATGCAG(CTAT)_{5} 3' | (ID SEC Nº:3) | |
Todas las sondas estaban bloqueadas con amino C7
en 3' y purificadas en gel por el fabricante. Las porciones
subrayadas de las sondas representan las secuencias de 20
nucleótidos que son complementarios a los terminales 3' o 5' de las
sondas de detección de partículas.
La amplificación de ARN del ARN de ensayo y de
referencia se llevó a cabo en mezclas que contenían todas las
sondas, todas las partículas de detección y todos los reactivos de
amplificación. Los reactivos de amplificación usados fueron
suministrados por el fabricante (Organon Teknika). El reactivo NASBA
liofilizado Accusphere® fue reconstituido según las instrucciones.
La mezcla de los reactivos incluye todos los cebadores, los NTP,
MgCl_{2} y componentes tampón. El ARN diana y de referencia, las
sondas oligonucleótidas primera, segunda y tercera y las
correspondientes sondas de detección de partículas fueron añadidos a
la mezcla de reacción reconstituida. La concentración de la primera
sonda oligonucleótida fue de 25 nM, y la concentración de las
sondas oligonucleótidas segunda y tercera fue, en su concentración
final, de 25 nM. La concentración de las sondas de detección de
partículas fue, en su concentración final, de 1 \mug de partículas
por reacción. Las moléculas de ARN diana y de referencia, con un
número conocido de moléculas, fueron añadidas (2 \muL) a los
correspondientes tubos de amplificación. El volumen total de las
mezclas iniciales de reacción, incluyendo el ARN diana y de
referencia, fue de 15 \muL. Las mezclas fueron cubiertas con 20
\muL de aceite mineral blanco ligero (Aldrich Chemical Company) y
fueron incubadas a 65ºC durante 5 minutos. Siguiendo a la incubación
a 41ºC durante 10 minutos, se añadió la mezcla de enzimas (5 \muL
de Organon Teknika). La amplificación se llevó a cabo durante un
total combinado de 70 minutos, fundamentalmente a una temperatura de
41ºC. Sin embargo, a 30 minutos de iniciado este periodo, la
temperatura cayó por inadvertencia hasta los 28ºC durante un
periodo de 8 minutos hasta que se devolvió a los 41ºC durante los 32
minutos restantes. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en un
termociclador (Termociclador Biometra Trio, Biometra). Se empleó
este termociclador debido al hecho de que es un buen dispositivo de
incubación, no por la necesidad de termociclado. Al final de la
reacción de amplificación, se leyó la señal usando un lector manual
equipado con un disco de filtro. El ciclo de lectura de la señal de
quimioluminiscencia fue como sigue: 3 ciclos de 1 segundo.
Iluminación a 680 nm, lectura de 0,5 segundos
(550-660 nm), demora de 30 segundos y lectura de 10
segundos (filtro de 650 nm de paso bajo).
Los resultados se resumen a continuación en la
Tabla 6. Las señales de quimioluminiscencia corregida para las
partículas RTADop y N-fe se denominan TS y AC,
respectivamente, y se dan en la Tabla 6. La proporción entre las
señales corregidas es proporcional, y, por lo tanto, representativa,
de la proporción entre las concentraciones del ARN de ensayo y de
referencia, tal como se muestra en la Tabla 1.
Se prepararon partículas que comprendía tioxeno
C-28 (preparadas como se ha descrito anteriormente),
1-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno
(1-Cl-BPEA) (de Aldrich Chemical
Company) y rubreno (de Aldrich Chemical Company) como se ha descrito
anteriormente. Se diluyó una parte alícuota de las partículas
anteriores (47,9 mg/1 ml de etanol acuoso al 10%, pH
10-11) en un 1 ml de etanol acuoso al 10% en un
tubo de cultivo de vidrio de 13 \times 100 mm y se colocó en una
incubadora mantenida entre aproximadamente 98 y 99ºC. Se diluyó
N-heptadecilbenceno (como dopante) (HB) (20 \mul)
(Pfaltz and Bauer) en 2 ml de etanol en un tubo similar y se colocó
en la incubadora. Se dejaron unos minutos para alcanzar el
equilibrio y luego se añadieron rápidamente las partículas a la
solución de HB por medio de una pipeta Pasteur. El contenido se
mezcló completamente mediante pipeta durante 20 minutos. Se enfrió
el contenido del tubo y se añadieron 2 ml de etanol a la mezcla
para llevar la concentración hasta el 67%. Se colocaron alícuotas
de la suspensión en tubos Eppendorf de 6 \times 1,5 ml y se
centrifugaron a 15k rpm durante 20 minutos en la centrífuga
refrigerada del banco de trabajo. Se eliminaron aproximadamente 5,5
ml de sobrenadante claro pero visiblemente amarillo de las
partículas, que fueron suspendidas en 0,5 ml de etanol al 50%
mediante ultrasonidos. Tras la centrifugación a 15k rpm durante 20
minutos, se eliminó el sobrenadante y los gránulos se suspendieron
en 2 ml de etanol al 25%.
Se colocaron una alícuota de 100 \mul de la
suspensión de partículas originales (RTA) y una alícuota de 100
\mul de la suspensión de partículas que contenía el dopante
(partículas RTADop), tal como se describe anteriormente, en tubos
de vidrio pesados con precisión y se evaporaron hasta obtener un
peso constante de 5,5 y 2,7 mg, respectivamente. Los residuos secos
fueron disueltos en 8 y 4 ml de dioxano, respectivamente. Se
compararon los espectros de absorción de estas soluciones. Una
reducción de aproximadamente el 15% en los espectros de absorción
del material RTADop sugiere que aproximadamente el 15% en peso del
peso de las partículas es debido a la presencia de HB.
Se comparó la pérdida de intensidad
quimioluminiscente de las partículas RTA y RTADop. Cada tipo de
partícula (1 mg) fue diluida en 1 ml de sensibilizador soluble,
concretamente tetrasulfonato de ftalocianina (Porphyrin Products,
Logan, Utah) (D.O. 0,56 a 678 nm) en agua. Las mezclas fueron
equilibradas a 37ºC usando los siguientes parámetros: iluminación 1
segundo, lectura 30 segundos, 200 puntos de datos por ciclo. A los 5
segundos la emisión de las partículas RTADop descendió a
aproximadamente el 0,2%, mientras que la emisión de las partículas
RTA originales decayó hasta aproximadamente el 4% en 10 segundos.
Las partículas RTADop alcanzaron el nivel del fondo, mientras que
las partículas RTA originales seguían emitiendo aproximadamente al
1,5% de su intensidad inicial.
Se comparó la distribución de tamaños de las
partículas RTA iniciales y de las partículas RTADop mediante un
aparato NICOMP para determinar el tamaño de partículas
submicroscópicas Modelo 370 (NICOMP, Particle Sizing Systems, Santa
Bárbara, California). Estaba presente cada tipo de partícula (20
\mug) en 1 ml de agua D.I. pasada por un filtro de 0,2
micrómetros. El diámetro medio de las partículas RTADop era
aproximadamente 25 nm mayor que el de las partículas RTA iniciales,
aproximadamente 220 contra 195, respectivamente.
Los espectros de emisión quimioluminiscente de
las partículas RTADop se compararon con los de la partícula inicial
diluyendo 0,5 mg de partículas en 0,5 ml de sensibilizador soluble
(D.O. 1,12 a 678 nm) y congelando en nieve carbónica. A
continuación, la suspensión congelada fue iluminada durante 60
segundos con una lámpara Dolan-Jenner dotada con un
filtro de paso largo de 650 nm. Tras la iluminación, la muestra fue
transferida inmediatamente el fluorómetro, y la emisión
quimioluminiscente fue registrada en el modo de luminiscencia
(ranura en eme 20 nm, velocidad de escaneo 1200 nm/min). En las
partículas RTADop estaba reducida una emisión de menor entidad
proveniente del tioxano (420) de las partículas iniciales. Salvo en
esa pequeña diferencia, los dos espectros eran casi idénticos, lo
que indica que la incorporación de dopante (dopado) no ha tenido
efecto alguno en los espectros de emisión de las partículas.
La anterior explicación incluye ciertas teorías
en cuanto a los mecanismos implicados en la presente invención. No
debería interpretarse que estas teorías limiten la presente
invención de modo alguno, dado que se ha demostrado que la presente
invención logra los resultados descritos.
Aunque la invención precedente se ha descrito
con algún detalle a título de ilustración y de ejemplo en aras de
la claridad y la comprensión, será obvio que pueden practicarse
ciertos cambios o modificaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (20)
1. Una composición emisora de luz que comprende
(a) un compuesto quimioluminiscente y (b) un fotosensibilizador en
la que al menos dicho compuesto quimioluminiscente está incorporado
en partículas poliméricas que forman dichas partículas
quimioluminiscentes, comprendiendo dichas partículas
quimioluminiscentes del 0,1 al 25% en peso de un plastificante o de
un fluorocarbono, en la que, tras la activación de dicho compuesto
quimioluminiscente, se emite luz desde dicha composición y en la
que el plastificante está seleccionado del grupo constituido por
compuestos alquilaromáticos de cadena larga y alquiloxiaromáticos de
cadena larga, en los que el alquilo de cadena larga es un radical
de hidrocarburo monovalente saturado ramificado o sin ramificar que
contiene al menos 10 átomos de carbono.
2. La composición de la Reivindicación 1 en la
que dichas partículas quimioluminiscentes tienen un diámetro
comprendido entre los 20 nm y los 100 \mum.
3. La composición de la Reivindicación 2 en la
que dichas partículas quimioluminiscentes están dispersas en un
medio acuoso.
4. La composición de la Reivindicación 2 en la
que dichas partículas quimioluminiscentes tienen incorporado en su
interior del 1 al 20% en peso de un plastificante.
5. La composición de la Reivindicación 2 en la
que dichas partículas quimioluminiscentes tienen incorporado en su
interior del 1 al 20% en peso de un fluorocarbono.
6. La composición de la Reivindicación 1 en la
que dichas partículas quimioluminiscentes están unidas a un primer
miembro de un par enlazante específico.
7. Una composición fotoemisora conforme a la
Reivindicación 6 en la que dicho fotosensibilizador está incorporado
en un segundo conjunto de partículas poliméricas formando
partículas fotosensibilizadoras a las que va unido un segundo
miembro específico de par enlazante, comprendiendo dichas partículas
fotosensibilizadoras una matriz polimérica que tiene disuelto en su
interior del 0,1 al 25% en peso de un plastificante o de un
fluorocarbono.
8. Una composición fotoemisora conforme a la
Reivindicación 1 en la que dichas partículas quimioluminiscentes
tienen un diámetro de 20 nm a 100 \mum, teniendo disuelto en su
interior (a) del 0,1 al 25% en peso de un fluorocarbono.
9. La composición de la Reivindicación 7 en la
que dichas partículas fotosensibilizadoras tienen un diámetro de 20
nm a 100 \mum.
10. La composición de la Reivindicación 8 en la
que dichas partículas poliméricas comprenden un polímero
seleccionado del grupo constituido por poliestirenos,
poliacrilamidas, cloruros de polivinilo, polivinilnaftalenos y
polimetacrilatos.
11. La composición de la Reivindicación 6 en la
que dicho miembro de dicho par enlazante específico es un ácido
nucleico.
12. Un procedimiento para determinar un
analito, comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- proporcionar en combinación (1) un medio del que se sospecha que contiene dicho analito, y (2) una composición conforme a la Reivindicación 6 en la que dicho miembro de par enlazante específico (pee) es capaz de enlazarse con dicho analito o con un segundo miembro de un pee para formar un complejo relacionado con la presencia de dicho analito, en la que dicho segundo miembro de un pee es capaz de enlazarse con dicho analito y está ligado a dicho fotosensibilizador y en la que dichas partículas quimioluminiscentes tienen un diámetro de 20 nm a 100 \mum,
- (b)
- activar dicho compuesto quimioluminiscente y
- (c)
- determinar el efecto de dicha activación sobre las propiedades ópticas de dicha combinación, en la que el efecto resulta de que dicho compuesto quimioluminiscente y dicho fotosensibilizador se encuentren en estrecha proximidad en virtud de la presencia de dicho analito, y estando relacionada la magnitud de dicho efecto con la cantidad de dicho analito en dicho medio.
13. El procedimiento de la Reivindicación 12 en
el que dichas partículas quimioluminiscentes tienen en su interior
un fluorocarbono disperso de forma homogénea.
14. El procedimiento de la Reivindicación 12 en
el que dicho fotosensibilizador está incorporado en un segundo
conjunto de partículas asociadas con dicho segundo miembro de un
pee.
15. El procedimiento de la Reivindicación 14 en
el que dicho segundo conjunto de partículas comprende un
plastificante o un fluorocarbono.
16. El procedimiento de la Reivindicación 12 en
el que dichas partículas poliméricas comprenden un polímero
seleccionado del grupo constituido por poliestirenos, cloruros de
polivinilo y polivinilnaftalenos.
17. Un kit adecuado para su uso en un
análisis, comprendiendo dicho kit combinados en envases
reactivos para llevar a cabo un análisis, comprendiendo dichos
reactivos una composición conforme a la Reivindicación 6 en la que
las partículas poliméricas tienen un diámetro de 20 nm a 100
\mum.
18. El kit de la Reivindicación 17 en el
que dicho fotosensibilizador está incorporado en un segundo conjunto
de partículas poliméricas.
19. El kit de la Reivindicación 17 en el
que dichas partículas poliméricas tienen un fluorocarbono
incorporado en su interior.
20. El kit de la Reivindicación 17 en el
que dichas partículas poliméricas comprenden un polímero
seleccionado del grupo constituido por poliestirenos,
poliacrilamidas, cloruros de polivinilo, polivinilnaftalenos y
polimetacrilatos.
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Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040055965A1 (en) * | 1997-06-13 | 2004-03-25 | Hubig Stephan M. | Recreational water treatment employing singlet oxygen |
| US6703248B1 (en) * | 1999-12-15 | 2004-03-09 | Dade Behring Marburg Gmbh | Particles for diagnostic and therapeutic use |
| EP1302770A4 (en) * | 2000-07-14 | 2004-09-15 | Matsushita Electric Industrial Co Ltd | PROTEINS MARKED WITH PARTICLES AND IMMUNOCHROMATOGRAPHIC APPLICATION OF THE SAME |
| US20060063219A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-23 | Chiron Corporation | Trivalent metal mediated homogeneous luminescent proximity assay |
| WO2007008472A2 (en) * | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Colorado Seminary, Which Owns And Operates The University Of Denver | Photoinduced signal amplification through externally sensitized photofragmentation in masked photosensitizers |
| US20080293153A1 (en) * | 2005-07-08 | 2008-11-27 | Kutateladze Andrei G | Photolabile System with Instantaneous Fluorescence Reporting Function |
| JP4902183B2 (ja) * | 2005-12-06 | 2012-03-21 | 日立マクセル株式会社 | 機能性赤外蛍光粒子 |
| WO2007070761A2 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Colorado Seminary, Which Owns And Operates The University Of Denver | Method for encoding and screening combinatorial libraries |
| CA2669398C (en) * | 2006-11-13 | 2016-01-05 | Perkinelmer Las, Inc. | Detecting molecular interactions comprising a target-selective binding agent and a target molecule with fluorescence resonance energy transfer (fret) |
| WO2009014787A2 (en) | 2007-04-30 | 2009-01-29 | Nanogen, Inc. | Multianalyte assay |
| WO2008106149A1 (en) * | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Children's Medical Center Corporation | Methods for predicting the onset of menarche |
| US20080305157A1 (en) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | University Of Maryland Office Of Technology Commercialization | Encapsulation and separation of charged organic solutes inside catanionic vesicles |
| WO2009026313A1 (en) * | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Colorado Seminary, Which Owns And Operates The University Of Denver | Photoinduced signal amplification through externally sensitized photofragmentation in masked photosensitizers and photoamplified fluorescence turn-off system |
| US9347947B2 (en) * | 2009-03-12 | 2016-05-24 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent |
| US20110306148A1 (en) | 2010-06-14 | 2011-12-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Composition for use as an assay reagent |
| US10088490B2 (en) | 2010-08-20 | 2018-10-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Assay for analytes using multiple receptors |
| WO2013025532A2 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Detection of sex steroids |
| ITVR20120049A1 (it) * | 2012-03-19 | 2013-09-20 | Bbs Srl | Soluzione colorata in particolare per uso in metodi chirurgici per il trattamento del corpo umano o animale |
| US9244083B2 (en) | 2012-11-30 | 2016-01-26 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Compositions and methods for detecting vitamin D |
| US20140308751A1 (en) | 2013-04-12 | 2014-10-16 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Assays for Analyte Homologs |
| EP3060917B1 (en) * | 2013-10-24 | 2019-05-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Assays for macromolecular analytes |
| US20170176419A1 (en) * | 2014-03-26 | 2017-06-22 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Luminescent oxygen channeling immunoassay utilizing three antibodies and methods of production and use thereof |
| CN106661115A (zh) | 2014-06-27 | 2017-05-10 | 西门子医疗保健诊断公司 | 对维生素d差向异构体特异性的结合配偶体 |
| ES2853525T3 (es) | 2014-06-27 | 2021-09-16 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Parejas de unión específicas para epímeros de vitamina D en ensayos de vitamina D |
| CA3045310A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor |
| WO2018112237A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor |
| WO2018112255A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunosuppressant |
| KR20190095936A (ko) | 2016-12-14 | 2019-08-16 | 프로제너티, 인크. | 인테그린 저해제로의 위장관 질환의 치료 |
| US20200315540A1 (en) | 2016-12-14 | 2020-10-08 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-1 inhibitor |
| US11134889B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-10-05 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a SMAD7 inhibitor |
| CA3046019A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tlr modulator |
| CN110072519A (zh) | 2016-12-14 | 2019-07-30 | 普罗根尼蒂公司 | 使用jak抑制剂治疗胃肠道疾病及装置 |
| CN110072551B (zh) | 2016-12-14 | 2023-05-23 | 比奥拉治疗股份有限公司 | 使用利用可摄入装置释放的il-12/il-23抑制剂治疗胃肠道疾病 |
| AU2017378393B2 (en) | 2016-12-14 | 2023-03-09 | Bt Bidco, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a TNF inhibitor |
| CA3054159A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chst15 inhibitor |
| CA3054156A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with il-10 or an il-10 agonist |
| EP3600416B1 (en) | 2017-03-30 | 2023-06-07 | Biora Therapeutics, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device |
| WO2018183932A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor |
| CA3054947A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics |
| US20200306516A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-10-01 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with glatiramer or a pharmaceutically acceptable salt thereof |
| US12582809B2 (en) | 2018-01-26 | 2026-03-24 | Bt Bidco, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a PDE4 inhibitor |
| EP3830556B1 (en) | 2018-07-30 | 2024-11-13 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Kits, microfluidics devices, and methods for performing biotin assays |
| CN113125702B (zh) * | 2019-12-31 | 2025-08-22 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种均相化学发光检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4264766A (en) | 1877-09-19 | 1981-04-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunological diagnostic reagents |
| US3755238A (en) | 1970-12-28 | 1973-08-28 | R Wiita | High gloss and low block coating composition containing plasticized vinyl resin latex and finely divided polyolefin particles |
| GB1392670A (en) * | 1973-03-20 | 1975-04-30 | Vnii Fiz Tekhn I Radiotekhnich | Visual colour indicators of ionizing radiation doses |
| US3996056A (en) | 1973-04-10 | 1976-12-07 | Andrews Paper & Chemical Co. | Diazotype reproduction layer formed from matrix of spheric particle polystyrene pigment and diazotype components |
| CA1101330A (en) | 1977-09-19 | 1981-05-19 | Ernst A. Fischer | Immunological material bonded to carboxylated latex polymer and process for making it |
| US4388296A (en) | 1978-03-27 | 1983-06-14 | Hiram Hart | Energy-emitting latex-particulates |
| US4318707A (en) | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
| US4481136A (en) * | 1979-09-07 | 1984-11-06 | Syva Company | Alkyl substituted fluorescent compounds and conjugates |
| US4265766A (en) * | 1979-11-15 | 1981-05-05 | Crossley Leonard S | Chicken marinade draining system |
| EP0054685B1 (de) | 1980-12-23 | 1986-07-09 | Roche Diagnostics GmbH | Hydrophile Latexpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| US4650770A (en) | 1981-04-27 | 1987-03-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Energy absorbing particle quenching in light emitting competitive protein binding assays |
| US4419453A (en) | 1981-09-28 | 1983-12-06 | The Dow Chemical Company | Immunological agglutination assays with dyed or colored latex and kits |
| US4483929A (en) | 1982-05-03 | 1984-11-20 | Liposome Technology Incorporated | Liposomes with glycolipid-linked antibodies |
| US4487855A (en) | 1983-02-15 | 1984-12-11 | Shih Yen Jer | Colored latexes; methods for making same and colored finely divided products |
| US4652533A (en) * | 1983-04-28 | 1987-03-24 | Pandex Laboratories, Inc. | Method of solid phase immunoassay incorporating a luminescent label |
| US4699826A (en) | 1984-04-27 | 1987-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescently labeled microbeads |
| US5145774A (en) * | 1984-08-28 | 1992-09-08 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Fluorescent dyes |
| US4745075A (en) | 1984-09-06 | 1988-05-17 | Burroughs Wellcome Co. | Diagnostic test methods |
| US4719182A (en) | 1985-03-18 | 1988-01-12 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations |
| US4735907A (en) | 1985-03-18 | 1988-04-05 | Eastman Kodak Company | Stabilized fluorescent rare earth labels and labeled physiologically reactive species |
| US4806488A (en) * | 1985-09-06 | 1989-02-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Ligand-receptor assays employing squarate dye compositions |
| CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
| US4891324A (en) | 1987-01-07 | 1990-01-02 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Particle with luminescer for assays |
| US5194300A (en) | 1987-07-15 | 1993-03-16 | Cheung Sau W | Methods of making fluorescent microspheres |
| US5132242A (en) | 1987-07-15 | 1992-07-21 | Cheung Sau W | Fluorescent microspheres and methods of using them |
| US4978625A (en) * | 1987-10-19 | 1990-12-18 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescence immunoassay using water insoluble dyes |
| US5234841A (en) | 1987-12-18 | 1993-08-10 | Eastman Kodak Company | Methods of preparing a polymeric latex composition and water-insoluble biological reagent |
| US5053443A (en) | 1987-12-18 | 1991-10-01 | Eastman Kodak Company | Methods of preparing a polymeric latex composition and water-insoluble biological reagent |
| US5284752A (en) | 1987-12-18 | 1994-02-08 | Eastman Kodak Company | Methods of preparing a polymeric latex composition and water-insoluble biological reagent |
| US6083602A (en) * | 1988-03-14 | 2000-07-04 | Nextec Applications, Inc. | Incontinent garments |
| JP2681061B2 (ja) | 1988-06-08 | 1997-11-19 | ロンドン・ダイアグノスティック・インコーポレーテッド | 検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイ |
| EP0360452A3 (en) | 1988-09-06 | 1992-01-08 | Eastman Kodak Company | Latex particles in analytical reagents, elements and methods |
| DE68924517T2 (de) | 1988-11-14 | 1996-05-15 | Akzo Nobel Nv | Wässerige Suspension für diagnostischen Test. |
| US5326692B1 (en) | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
| US5157084A (en) | 1990-10-12 | 1992-10-20 | The Dow Chemical Company | Process of making hollow polymer latex particles |
| EP0984282B1 (en) * | 1991-05-22 | 2003-07-30 | Dade Behring Marburg GmbH | Particles having an incorporated composition comprising a chemiluminescent compound |
| US5578498A (en) * | 1991-05-22 | 1996-11-26 | Behringwerke Ag | Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays |
| US5340716A (en) | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
| US5154887A (en) * | 1991-05-28 | 1992-10-13 | Eastman Kodak Company | Phenalenimine fluorescent dyes and their use in analytical compositions, elements and methods |
| CA2125769C (en) | 1991-12-13 | 1999-01-26 | Morgan Van Aken | Agglutination assays and kits employing colloidal dyes |
| JPH07509245A (ja) * | 1992-07-20 | 1995-10-12 | デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 新規化学発光化合物およびその使用方法 |
| ATE162892T1 (de) * | 1992-07-31 | 1998-02-15 | Behringwerke Ag | Photoaktivierbare chemiluminizierende matrices |
| US5518808A (en) * | 1992-12-18 | 1996-05-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Luminescent materials prepared by coating luminescent compositions onto substrate particles |
| EP0613166B1 (en) * | 1993-02-26 | 2000-04-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method of making plasma display apparatus |
| FR2707658B1 (fr) | 1993-07-12 | 1995-11-24 | Prolabo Sa | Latex fluorescent comportant au moins deux fluorochromes, procédé d'obtention et application dudit latex comme marqueur, notamment en biologie. |
| CA2170873A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | Dariush Davalian | Fluorescent oxygen channeling immunoassays |
| US6238931B1 (en) | 1993-09-24 | 2001-05-29 | Biosite Diagnostics, Inc. | Fluorescence energy transfer in particles |
| US5932309A (en) * | 1995-09-28 | 1999-08-03 | Alliedsignal Inc. | Colored articles and compositions and methods for their fabrication |
| EP0852012B1 (en) * | 1996-05-01 | 2006-07-26 | Dade Behring Marburg GmbH | Chemiluminescent compositions and their use in the detection of hydrogen peroxide |
| US5881311A (en) * | 1996-06-05 | 1999-03-09 | Fastor Technologies, Inc. | Data storage subsystem with block based data management |
| US5824413A (en) * | 1996-07-15 | 1998-10-20 | Ppg Industries, Inc. | Secondary coating for fiber strands, coated strand reinforcements, reinforced polymeric composites and a method of reinforcing a polymeric material |
| AU732936B2 (en) * | 1997-02-03 | 2001-05-03 | Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. | Fluorescent materials and their use |
| US5977241A (en) * | 1997-02-26 | 1999-11-02 | Integument Technologies, Inc. | Polymer and inorganic-organic hybrid composites and methods for making same |
| US6123923A (en) * | 1997-12-18 | 2000-09-26 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Optoacoustic contrast agents and methods for their use |
| US6255359B1 (en) * | 1997-12-23 | 2001-07-03 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Permeable compositions and methods for their preparation |
| US6309701B1 (en) * | 1998-11-10 | 2001-10-30 | Bio-Pixels Ltd. | Fluorescent nanocrystal-labeled microspheres for fluorescence analyses |
| US6197482B1 (en) * | 1999-05-14 | 2001-03-06 | Eastman Kodak Company | Polymer overcoat for imaging elements |
| US6703248B1 (en) * | 1999-12-15 | 2004-03-09 | Dade Behring Marburg Gmbh | Particles for diagnostic and therapeutic use |
-
1999
- 1999-12-15 US US09/465,065 patent/US6703248B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-27 ES ES00980822T patent/ES2335473T3/es not_active Expired - Lifetime
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