ES2336086T3

ES2336086T3 - Metodo para el ensamblaje de un polinucleotido de cadena doble.

Info

Publication number: ES2336086T3
Application number: ES02807744T
Authority: ES
Inventors: Glen A. Evans
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2001-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: DE60234716D1; US20030087238A1; EP1470252B1; ATE451473T1; US6670127B2; CY1109845T1; DK1470252T3; US20060134628A1; EP1470252A4; HK1066570A1; AU2002368136A1; PT1470252E; JP2005519641A; WO2004033619A3; CA2454561A1; EP1470252A2; WO2004033619A2

Abstract

Un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble que comprende: a) seleccionar un oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble, en el que dicho oligonucleótido de iniciación comprende al menos un saliente; b) poner en contacto dicho oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble con un siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal, en el que dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es contiguo al oligonucleótido de iniciación y comprende al menos un saliente, y en el que al menos un saliente de dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es complementario a al menos un saliente de dicho oligonucleótido de iniciación; c) repetir (b) para añadir secuencialmente el siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal al oligonucleótido de iniciación extendido, con lo que se sintetiza dicho polinucleótido de cadena doble, en el que dicho oligonucleótido de iniciación en la etapa a) tiene un saliente 3'' y uno 5'', y/o en el que dicho siguiente oligonucleótido más terminal tiene un saliente 3'' y uno 5''.

Description

Método para el ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere, de modo general, al área de la bioinformática y más específicamente a métodos para el ensamblaje de polinucleótidos dirigido por ordenador.

Las enzimas, anticuerpos, receptores y ligandos son polipéptidos que han evolucionado mediante presión selectiva para realizar funciones biológicas muy específicas dentro de un organismo vivo. El uso de un polipéptido para aplicaciones tecnológicas específicas puede requerir que el polipéptido funcione en entornos o sobre sustratos para los que no se seleccionó evolutivamente. Los polipéptidos aislados de microorganismos que crecen en entornos extremos proporcionan abundantes pruebas de que estas moléculas son, en general, maleables con respecto a estructura y función. Sin embargo, el proceso para aislar un polipéptido de su entorno nativo es costoso y requiere tiempo. Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos para desarrollar de forma sintética material genético que codifique un polipéptido que posea una actividad deseada.

Existen dos maneras de obtener material genético para manipulaciones de ingeniería genética: (1) aislamiento y purificación de un polinucleótido en forma de ADN o ARN a partir de fuentes naturales o (2) la síntesis de un polinucleótido usando diversos enfoques químicos-enzimáticos. El primer enfoque se limita a secuencias de origen natural que no se prestan fácilmente a la modificación específica. El último enfoque es mucho más complicado y requiere un trabajo más intenso. Sin embargo, el enfoque químico-enzimático tiene muchas características atractivas incluyendo la posibilidad de preparar, sin ninguna limitación significativa, cualquier secuencia de polinucleótidos deseable.

Actualmente existen dos métodos generales para el ensamblaje sintético de oligonucleótidos en largos fragmentos de polinucleótidos. En primer lugar, se permite que los oligonucleótidos que abarcan toda la secuencia a sintetizar hibriden, y a continuación se reparan las mellas con ligasa. A continuación, se clona el fragmento directamente, o se clona después de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El polinucleótido se usa posteriormente para ensamblaje in vitro en secuencias más largas. El segundo método general para la síntesis de genes utiliza polimerasa para rellenar huecos de cadena sencilla en los pares hibridados de oligonucleótidos. Después de la reacción de la polimerasa, las regiones de cadena sencilla de los oligonucleótidos se vuelven de cadena doble, y después de la digestión con endonucleasa de restricción, pueden clonarse directamente o usarse para ensamblaje adicional de secuencias más largas ligando fragmentos de cadena doble diferentes. Típicamente, posteriormente a la reacción de la polimerasa, cada segmento debe clonarse lo que retrasa significativamente la síntesis de fragmentos largos de ADN y reduce enormemente la eficacia de este enfoque. Itakura et al., Science vol. 198, p 1056-1063, (1978) describe un método en el cual se forman y se ligan dos oligonucleótidos de cadena parcialmente doble con salientes.

La creación de polinucleótidos totalmente nuevos, o la modificación sustancial de polinucleótidos existentes, requiere mucho tiempo, es cara, requiere múltiples y complejas etapas, y en algunos casos en imposible. Por lo tanto, existe una gran necesidad de un medio eficaz para ensamblar polinucleótidos sintéticos de cualquier secuencia deseada. Dicho método podría aplicarse de forma universal. Por ejemplo, el método podría usarse para preparar eficazmente una selección de polinucleótidos que tienen sustituciones específicas en una secuencia conocida que se expresa y se criba en busca de una función mejorada. La presente invención satisface estas necesidades proporcionando métodos eficaces y potentes para la síntesis de un polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para el ensamblaje sintético de polinucleótidos y algoritmos relacionados. En particular, la presente invención proporciona métodos rápidos y eficaces para generar cualquier secuencia de ácido nucleico, incluyendo genes completos, segmentos cromosómicos, cromosomas y genomas. Puesto que este enfoque se basa en un enfoque completamente sintético, no existen limitaciones, tales como la disponibilidad de ácidos nucleicos existentes, para impedir la construcción de incluso segmentos muy grandes de ácido nucleico.

Breve descripción de los dibujos

Símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.

La Figura 1 representa placas de 96 pocillos para la síntesis de oligonucleótidos F (es decir, "directos" o de "cadena más"), síntesis de oligonucleótidos R (es decir, "inversos" o de "cadena menos"), y una placa T (es decir, "temperatura") para la hibridación de oligonucleótidos F y T.

La Figura 2 representa el plan de mezclado de oligonucleótidos en el que oligonucleótidos F y oligonucleótidos R hibridan para formar un polinucleótido contiguo.

La Figura 3 representa el esquema de ensamblaje de una secuencia de polinucleótido diana que define un gen, genoma, conjunto de genes o secuencia polipeptídica. La secuencia se diseña por ordenador y se usa para generar un conjunto de fragmentos de oligonucleótidos analizados que abarcan la cadena + y - de una secuencia de polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana.

La Figura 4 representa un esquema de los módulos de síntesis de polinucleótidos. Un cabezal de nanodispensado con una pluralidad de válvulas depositará productos químicos de síntesis en recipientes de ensamblaje. La distribución de productos químicos desde el depósito de reactivos puede controlarse usando una bomba de jeringa. Por debajo de las cámaras de reacción hay un conjunto de recipientes de ensamblaje unidos a microcanales que mueven los fluidos mediante microfluídica.

La Figura 5 representa que la síntesis de oligonucleótidos, el ensamblaje de oligonucleótidos mediante mezclado e hibridación, y el ligamiento pueden realizarse usando el mezclado microfluídico.

La Figura 6 representa el mezclado secuencial de oligonucleótidos sintetizados en matrices.

La Figura 7 representa la fase de mezclado de los componentes de oligonucleótido a través de los colectores de ensamblaje que da como resultado el completo ensamblaje de todos los oligonucleótidos a partir de la matriz.

La Figura 8 representa un ejemplo de un módulo de ensamblaje que comprende un conjunto completo de colectores de mezclado producidos usando microfabricación en una única unidad. Diversas configuraciones del colector de mezclado permitirán el ensamblaje de mayores números de matrices de pocillos de oligonucleótidos componentes analizados.

La Figura 9 representa la configuración para el ensamblaje de oligonucleótidos sintetizados en una matriz predefinida. El paso a través del dispositivo de ensamblaje en presencia de ADN ligasa y otro tampón apropiado y componentes químicos facilitará el ensamblaje de polinucleótidos de cadena doble.

La Figura 10 representa un ejemplo del diseño del dispositivo de mezclado. Microsurcos o canales microfluídicos se graban en la superficie del dispositivo de mezclado. El dispositivo proporciona un recipiente de micro-reacción en la unión de dos canales para 1) mezclar los dos chorros, 2) mantenimiento controlado o ciclado de la temperatura en el punto de la unión y 3) expulsión de la mezcla ligada desde el canal de salida al siguiente conjunto de cámaras de mezclado y ligamiento.

La Figura 11 representa el diseño de una plataforma de síntesis de polinucleótidos que comprende placas de micropocillos a las que se dirigen una pluralidad de canales para el microdispensado.

La Figura 12 representa un ejemplo de una plataforma de síntesis de polinucleótidos de alta capacidad usando microplacas de micropocillos de alta densidad capaces de sintetizar más de 1536 oligonucleótidos componentes por placa.

La Figura 13 representa un formado de ensamblaje de polinucleótidos que usa síntesis de oligonucleótidos unidos a una superficie en lugar de síntesis soluble. En esta configuración, los oligonucleótidos se sintetizan con un enlazador que permite la unión a un soporte sólido.

La Figura 14 representa un diagrama de ensamblaje de polinucleótido sistemático sobre un soporte sólido. Un conjunto de oligonucleótidos componentes analizados se disponen en una matriz con un oligonucleótido estabilizante unido. Un conjunto de oligonucleótidos de sustrato de ligamiento se coloca en la solución y se realiza el ensamblaje sistemático en la fase sólida mediante hibridación, ligamiento y fusión secuenciales.

La Figura 15 representa el ensamblaje de polinucleótidos usando oligonucleótidos componentes unidos a un conjunto de electrodos metálicos en un chip microelectrónico. Cada electrodo puede estar controlado independientemente con respecto a la corriente y al voltaje.

La Figura 16 representa de modo general un método de ensamblaje por extensión del cebador.

La Figura 17 proporciona un diagrama del sistema.

La Figura 18 representa una vista en perspectiva de un instrumento.

La Figura 19 representa dos diagramas de flujo que muestran la generación de matrices de oligonucleótidos auto-ensamblantes.

Descripción detallada de la invención

El esclarecimiento de la secuencia completa de genomas completos, incluyendo el genoma humano, permite enfoques funcionales a gran escala para la genética. La presente invención se basa en un nuevo enfoque para utilizar los resultados de la información de la secuencia genómica mediante ensamblaje de polinucleótidos dirigido por ordenador en base a la información disponible en bases de datos tales como la base de datos del genoma humano. Específicamente, la presente invención puede usarse para sintetizar, ensamblar y seleccionar una nueva secuencia de polinucleótido diana sintética que codifica un polipéptido diana. El polinucleótido diana puede codificar un polipéptido diana que muestra una actividad biológica mejorada o alterada en comparación con un polipéptido modelo codificado por una secuencia de polinucleótido natural (de tipo silvestre) o modelo. Posteriormente, pueden usarse ensayos convencionales para examinar la actividad de un polipéptido diana expresado. Por ejemplo, el polipéptido diana expresado puede ensayarse para determinar su capacidad para realizar la función del polipéptido modelo correspondiente o para determinar si se ha producido un polipéptido diana que muestra una nueva función. Por lo tanto, la presente invención proporciona un medio para dirigir la evolución sintética de un polipéptido modelo mediante síntesis dirigida por ordenador de un polinucleótido que codifica un polipéptido diana obtenido de un polipéptido modelo.

En una realización, la invención proporciona un método para sintetizar un polinucleótido diana proporcionando una secuencia de polinucleótido diana e identificando al menos un oligonucleótido iniciador presente en el polinucleótido diana que incluye al menos un oligonucleótido de cadena más, hibridado con al menos un oligonucleótido de cadena menos, dando como resultado un polinucleótido de cadena parcialmente doble constituido por un saliente 5' y un saliente 3'. Posteriormente, puede añadirse un siguiente oligonucleótido más terminal en un proceso que se repite sistemáticamente para ensamblar secuencialmente un polinucleótido de cadena doble. En las diversas realizaciones proporcionadas por los métodos de ensamblaje de la invención, un siguiente oligonucleótido más terminal, que puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, puede añadirse para extender el oligonucleótido de iniciación de manera alterna bidireccional, de manera unidireccional, o cualquier combinación de las mismas.

Como se usa en este documento, una "secuencia de polinucleótido diana" incluye cualquier secuencia de ácido nucleico adecuada para codificar un polipéptido diana que puede sintetizarse mediante un método de la invención. Puede usarse una secuencia de polinucleótido diana para generar un polinucleótido diana usando un aparato capaz de ensamblar secuencias nucleicas. De modo general, una secuencia de polinucleótido diana es un segmento lineal de ADN que tiene una región de cadena doble; el segmento puede ser de cualquier longitud lo suficientemente larga para ser creado mediante la hibridación de al menos dos oligonucleótidos que tienen regiones complementarias. Se contempla que un polinucleótido diana pueda tener 100, 200, 300, 400, 800, 1000, 1500, 2000, 4000, 8000, 10000, 12000, 18.000, 20.000, 40.000, 80.000 o más pares de bases de longitud. Los métodos de la presente invención pueden utilizarse para crear genomas artificiales completos de longitudes comparables a genomas bacterianos, de levadura, virales, de mamífero, de anfibio, de reptil, o de ave conocidos. En realizaciones más particulares, el polinucleótido diana es un gen que codifica un polipéptido de interés. El polinucleótido diana puede incluir además elementos no codificantes tales como orígenes de replicación, telómeros, promotores, potenciadores, señales de inicio y de terminación de la transcripción y la traducción, intrones, puntos de corte y empalme de exones, componentes del armazón de cromatina y otras secuencias reguladoras. El polinucleótido diana puede comprender múltiples genes, segmentos cromosómicos, cromosomas e incluso genomas completos. Un polinucleótido puede obtenerse de secuencias procariotas o eucariotas incluyendo bacterianas, de levadura, virales, de mamífero, de anfibio, de reptil, de ave, de plantas, de arqueobacterias y otros organismos vivos que contienen ADN.

Un "oligonucleótido", como se usa en este documento, se define como una molécula constituida por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Los oligonucleótidos son pequeños segmentos de ADN, de cadena sencilla o de cadena doble, constituidos por las bases de los nucleótidos unidas mediante enlaces fosfato. El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores, tales como la temperatura de reacción, la concentración de sales, la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, y el grado de complementariedad con la secuencia con la que se pretende que hibride el oligonucleótido.

Los nucleótidos están presentes en ADN o ARN y abarcan adenina, citosina, guanina y timina o uracilo, respectivamente, como base y un resto de azúcar que es desoxirribosa o ribosa, respectivamente. Se entenderá, sin embargo, que pueden usarse otras bases modificadas capaces de formar un emparejamiento de bases con una de las bases convencionales, adenina, citosina, guanina, timina y uracilo, en un oligonucleótido empleado en la presente invención. Dichas bases modificadas incluyen, por ejemplo, 8-azaguanina e hipoxantina. Si se desea, los nucleótidos pueden llevar una etiqueta o marcador de modo que al incorporarse a un producto de extensión del cebador, aumentan la señal asociada con el producto de extensión del cebador, por ejemplo para su captura en fase sólida.

Un oligonucleótido de cadena más, por convención, incluye un segmento de ADN de cadena sencilla corto que comienza con el extremo 5' a la izquierda según se lee la secuencia. Un oligonucleótido de cadena menos incluye un segmento de ADN de cadena sencilla corto que comienza con el extremo 3' a la izquierda según se lee la secuencia. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos se encuentran en, por ejemplo, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gate, ed., IRL Press, Oxford (1984). Se han proporcionado técnicas de síntesis en fase sólida para la síntesis de varias secuencias peptídicas en, por ejemplo, varias clavijas ("pins") (Véase por ejemplo, Geysen et al., J. Immun. Meth. (1987) 102: 259-274).

Se han concebido métodos adicionales de formación de grandes matrices de oligonucleótidos y otras secuencias de polímeros en un corto periodo de tiempo. Deben observarse particularmente, Pirrungetal., Patente de Estados unidos Nº 5.143.854 (véase también la Solicitud PCT Nº WO 90/15070), Fodor et al., Publicación PCT Nº WO 92/10092 y Winkler et al., Patente de Estados unidos Nº 6.136.269, que describen métodos de formación de grandes matrices de secuencias de polímeros usando, por ejemplo, técnicas de síntesis dirigida por luz. Véase también, Fodor et al., Science (1991) 251: 767-777. Se han realizado algunos trabajos para automatizar la síntesis de matrices de polímeros. Por ejemplo, Southern, Solicitud PCT Nº WO 89/10977, describe el uso de un trazador gráfico convencional para depositar tres monómeros diferentes en doce ubicaciones diferentes sobre un sustrato.

Una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido "de iniciación", como se usa en este documento, es una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido que sirve como la primera secuencia o secuencia de partida que se extiende secuencialmente mediante adición sistemática de un siguiente oligonucleótido más terminal o un siguiente polinucleótido componente más terminal. Una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido de iniciación puede tener un saliente 5', un saliente 3', o un saliente 5' y 3' de cualquier cadena. Una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido de iniciación puede prolongarse de manera alterna bidireccional, de manera unidireccional o cualquier combinación de las mismas. Una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido de iniciación puede estar contenida en una secuencia de polinucleótido diana e identificarse mediante un algoritmo de la invención. A este respecto, una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido de iniciación contenida en una secuencia de polinucleótido diana puede ser el oligonucleótido 5' más terminal, el oligonucleótido 3' más terminal, o ni el nucleótido 3' ni el 5' más terminal de la secuencia del polinucleótido diana, dependiendo de si el polinucleótido diana se ensambla partiendo del centro frente a partiendo de uno de los dos extremos. Si una secuencia de oligonucleótido o polinucleótido de iniciación contenida en una secuencia de polinucleótido diana representa el oligonucleótido 5' más terminal o el oligonucleótido 3' más terminal del polinucleótido diana, ésta puede abarcar un saliente.

Para el ensamblaje por ligamiento de un polinucleótido diana, un oligonucleótido de iniciación comienza el ensamblaje proporcionando un ancla para hibridación de posteriores oligonucleótidos contiguos al oligonucleótido de iniciación. Por lo tanto, para el ensamblaje por ligamiento, un oligonucleótido de iniciación es un ácido nucleico de cadena parcialmente doble, proporcionando de este modo un(os) saliente(s) de cadena sencilla para la hibridación de una molécula de ácido nucleico contigua de cadena doble. Para ensamblaje por extensión del cebador de un polinucleótido diana, un oligonucleótido de iniciación comienza el ensamblaje proporcionando una plantilla para la hibridación de posteriores oligonucleótidos contiguos al oligonucleótido de iniciación. Por lo tanto, para el ensamblaje por extensión del cebador, un oligonucleótido de iniciación puede ser de cadena parcialmente doble o de cadena completamente doble.

Como se usa en este documento, la expresión "siguiente oligonucleótido más terminal" se refiere a un oligonucleótido que se añade a un oligonucleótido de iniciación extendido en el extremo 5' o en el 3'. Un siguiente oligonucleótido más terminal puede ser de cadena sencilla, de cadena parcialmente doble o de cadena completamente doble. En los métodos secuenciales de la invención se utilizan ciclos de adición secuencial del siguiente oligonucleótido más terminal al oligonucleótido de cadena doble que se está extendiendo; el siguiente oligonucleótido más terminal tiene al menos un saliente que es complementario a una secuencia saliente 3' o 5' que pertenece a la cadena más o menos del oligonucleótido de cadena doble que se está extendiendo.

Como se usa en este documento, las expresiones "más terminal 5'" y "más terminal 3'" se refieren a un oligonucleótido o polinucleótido de cadena sencilla o de cadena doble que abarca el comienzo o el final físico de una secuencia de polinucleótido diana. Como se ha descrito anteriormente, un oligonucleótido o polinucleótido de iniciación usado en los métodos de ensamblaje secuencial de la invención puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido más terminal 5' o uno más terminal 3'.

Como se usa en este documento, la expresión "síntesis enzimática" se refiere al ensamblaje de polinucleótidos que utiliza una o más enzimas para funciones que incluyen, por ejemplo, polimerización, extensión del cebador, ligamiento o reparación de emparejamientos erróneos.

La presente invención proporciona métodos rápidos y eficaces para el ensamblaje de un polinucleótido, incluyendo genes completos, segmentos o fragmentos cromosómicos, cromosomas y genomas. Puesto que los métodos de la invención se basan en un enfoque completamente sintético, no existen limitaciones, tales como la disponibilidad de ácidos nucleicos existentes o las complejidades de mutagénesis específica, que impidan la construcción de incluso segmentos muy grandes de ácido nucleico. En particular, los métodos conocidos en la técnica para el ensamblaje sintético de oligonucleótidos en largos fragmentos de ADN utilizan generalmente polimerasa para rellenar huecos de cadena sencilla en pares de oligonucleótidos hibridados. Sin embargo, después de la reacción de la polimerasa, cada segmento debe clonarse, una etapa que retrasa significativamente la síntesis de largos fragmentos de polinucleótidos y reduce enormemente la eficacia del enfoque. Adicionalmente, el enfoque solamente puede usarse para pequeños fragmentos de ADN.

Otros métodos conocidos en la técnica de síntesis de polinucleótidos incluyen técnicas basadas en PCR que implican el ensamblaje de oligonucleótidos solapantes realizados mediante una ADN polimerasa termoestable durante ciclos repetidos mediante fusión, hibridación y polimerización. Una desventaja clave de los métodos mediados por PCR es que los complejos sucesos de cebado erróneo afectan negativamente a la corrección de un polinucleótido ensamblado resultante. Además, la baja fidelidad de la ADN polimerasa termoestable influye en la fiabilidad de esta tecnología con un mayor número de etapas de PCR. Otros métodos conocidos para la síntesis de polinucleótidos implican el ligamiento de dos o más cadenas de polinucleótidos sin el uso de una plantilla y tienen la desventaja de ser capaces solamente de sintetizar genes cortos de aproximadamente 200 pares de bases.

En una realización, la invención proporciona un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble que comprende a) seleccionar un oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble, en el que el oligonucleótido de iniciación comprende al menos un saliente; b) poner en contacto el oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble con un siguiente oligonucleótido más terminal, en el que el siguiente oligonucleótido más terminal es contiguo al oligonucleótido de iniciación y comprende al menos un saliente, y en el que el al menos un saliente del siguiente oligonucleótido más terminal es complementario a al menos un saliente del oligonucleótido de iniciación; y c) repetir (b) para añadir secuencialmente el siguiente oligonucleótido más terminal al oligonucleótido de iniciación extendido, con lo que se sintetiza el polinucleótido de cadena doble.

La invención proporciona además un método de ensamblaje de un polinucleótido diana que comprende: a) proporcionar una secuencia de polinucleótido diana; b) identificar al menos un oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble presente en el polinucleótido diana, en el que el oligonucleótido de iniciación comprende un saliente 5' y un saliente 3'; c) identificar un siguiente oligonucleótido más terminal presente en el polinucleótido diana, en el que el siguiente oligonucleótido más terminal es contiguo al oligonucleótido de iniciación y comprende un saliente 5' y un saliente 3', en el que al menos un saliente del siguiente oligonucleótido más terminal es complementario a al menos un saliente del oligonucleótido de iniciación; d) poner en contacto el oligonucleótido de iniciación con el siguiente oligonucleótido más terminal en condiciones y durante un periodo adecuados para hibridación, en el que se extiende la secuencia de iniciación; y e) repetir de (a) a (d) para añadir secuencialmente el siguiente oligonucleótido más terminal al oligonucleótido de iniciación extendido, con lo que se sintetiza un polinucleótido diana.

Además de los métodos de ensamblaje secuencial descritos anteriormente, la invención también proporciona métodos de ensamblaje de conjuntos, en los que se sintetizan y posteriormente se hibridan dos conjuntos de oligonucleótidos. A este respecto, la invención también proporciona un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble como se define en la reivindicación 17, que comprende: (a) sintetizar químicamente un primer conjunto de oligonucleótidos de al menos 25 bases que comprende una primera cadena de un polinucleótido de cadena doble; (b) sintetizar químicamente un segundo conjunto de oligonucleótidos de al menos 25 bases que comprende una segunda cadena complementaria del polinucleótido de cadena doble, cada uno de los oligonucleótidos en el segundo conjunto de los oligonucleótidos solapándose con al menos un oligonucleótido en el primer conjunto de los oligonucleótidos, y (c) hibridar el primer y segundo conjuntos de oligonucleótidos para producir un polinucleótido de cadena doble en ausencia de síntesis enzimática.

Un polinucleótido de cadena doble producido mediante los métodos de ensamblaje de la invención puede tener, por ejemplo, aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1 x 10^{3}, 5 x 10^{3}, 1 x 10^{4}, 5 x 10^{4}, 1 x 10^{5}, 5 x 10^{5}, 1 x 10^{6}, 5 x 10^{6}, 1 x 10^{7}, 5 x 10^{7}, 1 x 10^{8}, 5 x 10^{8}, 1 x 10^{9}, 5 x 10^{9} o más pares de bases de longitud. Como se ha descrito anteriormente, en una realización de la invención, pueden generarse dos conjuntos de oligonucleótidos de modo que estén representadas las cadenas más y menos completas del gen. Los conjuntos de oligonucleótidos pueden estar constituidos por oligonucleótidos de entre aproximadamente 15 y 150 bases, entre aproximadamente 20 y 100 bases, entre aproximadamente 25 y 75 bases, entre aproximadamente 30 y 50 bases. Las longitudes específicas incluyen, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64. 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 150 o más bases.

Dependiendo del tamaño, el solapamiento entre los oligonucleótidos de los dos conjuntos puede diseñarse para ser de aproximadamente el 50 por ciento de la longitud del oligonucleótido o entre aproximadamente 5 y 75 bases por par de oligonucleótidos, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64. 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 90, 100 o más bases. Los conjuntos pueden diseñarse de modo que el emparejamiento complementario con el primer y segundo conjuntos da como resultado el solapamiento de secuencias emparejadas, ya que cada oligonucleótido del primer conjunto es complementario a regiones de dos oligonucleótidos del segundo conjunto, con la posible excepción de los oligonucleótidos terminales.

Los métodos de ensamblaje de conjuntos de la invención pueden combinarse además con los métodos de ensamblaje secuencial para ensamblar un polinucleótido de cadena doble. Como se usa en este documento, la expresión "polinucleótido componente" cuando se usa en referencia a un método de ensamblaje que combina los métodos de ensamblaje de conjuntos y secuencial proporcionados por la invención, se refiere a un polinucleótido que se prepara sintetizando e hibridando dos conjuntos diferentes de oligonucleótidos. Un polinucleótido componente se incorpora posteriormente a un polinucleótido más grande mediante los métodos de ensamblaje secuencial proporcionados por la invención.

Por lo tanto, la invención proporciona un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble que comprende: a) sintetizar químicamente un primer conjunto de oligonucleótidos que comprende una primera cadena de un polinucleótido de cadena doble; b) sintetizar químicamente un segundo conjunto de oligonucleótidos que comprende una segunda cadena complementaria del polinucleótido de cadena doble, cada uno de los oligonucleótidos en el segundo conjunto de los oligonucleótidos solapándose con al menos un oligonucleótido en el primer conjunto de los oligonucleótidos; y c) hibridar el primer y segundo conjuntos de oligonucleótidos para producir un polinucleótido componente de cadena parcialmente doble; d) repetir las etapas (a) a (c) para preparar una serie de polinucleótidos componentes de cadena parcialmente doble; e) seleccionar al menos un polinucleótido componente de cadena parcialmente doble presente en el polinucleótido diana para servir como el polinucleótido de iniciación, en el que el polinucleótido de iniciación comprende un saliente 5' y un saliente 3'; f) añadir el siguiente polinucleótido componente más terminal, en el que el siguiente polinucleótido componente más terminal comprende al menos un saliente que es complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación; g) poner en contacto el polinucleótido de iniciación con el siguiente polinucleótido componente más terminal en condiciones y durante un periodo adecuados para hibridación, en el que se extiende la secuencia de iniciación; y h) repetir opcionalmente de (e) a (g) para añadir secuencialmente los siguientes polinucleótidos componentes más terminales al polinucleótido de iniciación extendido, con lo que se ensambla un polinucleótido diana en ausencia de síntesis enzimática.

Los métodos de ensamblaje de la invención pueden abarcar una etapa inicial de proporcionar o seleccionar un polinucleótido diana a ensamblar o pueden realizarse sin una diana predeterminada para ensamblar un polinucleótido de secuencia aleatoria, por ejemplo, para general una biblioteca aleatoria. Como alternativa, los métodos de ensamblaje de la invención pueden utilizarse para ensamblar un polinucleótido que abarca una secuencia diana, pero que también contiene una secuencia aleatoria, por ejemplo, para generar una biblioteca sesgada. La invención puede emplear un programa informático, almacenado en un medio legible por ordenador, para generar una secuencia de polinucleótido diana obtenida de una secuencia modelo, comprendiendo el programa informático instrucciones para hacer que un sistema informático: a) identifique una secuencia de polinucleótido de iniciación contenida en la secuencia del polinucleótido diana; b) analice la secuencia del polinucleótido diana en múltiples oligonucleótidos distintos, parcialmente complementarios; c) controle el ensamblaje de la secuencia del polinucleótido diana controlando la extensión bidireccional de la secuencia del polinucleótido de iniciación mediante la adición secuencial de oligonucleótidos parcialmente complementarios, dando como resultado un polinucleótido de cadena doble contiguo.

Se describe además un método para la síntesis automatizada de una secuencia de polinucleótido diana, que incluye: a) proporcionar al usuario una oportunidad de comunicar una secuencia de polinucleótido diana deseada; b) permitir al usuario transmitir la secuencia de polinucleótido diana deseada a un servidor; c) proporcionar al usuario una designación única; d) obtener la secuencia de polinucleótido diana transmitida proporcionada por el usuario.

Se describe además un método para la síntesis automatizada de una secuencia de polinucleótido, que incluye: a) proporcionar al usuario un mecanismo para comunicar una secuencia de polinucleótido modelo; b) opcionalmente proporcionar al usuario una oportunidad de comunicar al menos una modificación deseada a la secuencia modelo, si se desea; c) permitir al usuario transmitir la secuencia modelo y la modificación deseada a un servidor; d) proporcionar al usuario una única designación; e) obtener la secuencia modelo transmitida y la modificación deseada opcional proporcionadas por el usuario; f) introducir en un ordenador programado, a través de un dispositivo de entrada, datos que incluyen al menos una porción de la secuencia de polinucleótido modelo; g) determinar, usando el procesador, la secuencia de la secuencia de polinucleótido modelo que contiene la modificación deseada; h) determinar además, usando el procesador, al menos una secuencia de polinucleótido de iniciación presente en la secuencia de polinucleótido modelo; i) seleccionar, usando el procesador, un modelo para sintetizar la secuencia de polinucleótido modelo modificada en base a la posición de la secuencia de iniciación en la secuencia de polinucleótido modelo; y j) extraer, al dispositivo de salida, los resultados de la al menos una determinación.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. Por ejemplo, las abreviaturas de una letra y de tres letras para aminoácidos y las abreviaturas de una letra para nucleótidos se entienden de la forma habitual. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la puesta en práctica o en el ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los métodos descritos anteriormente se denominan colectivamente como los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención. Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención pueden realizarse en combinación con o en ausencia de métodos de síntesis enzimática. Los métodos de síntesis enzimática incluyen, por ejemplo, polimerización enzimática, ligamiento enzimático, reparación enzimática de emparejamientos erróneos y otras funciones enzimáticas que pueden utilizarse en los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención. Como se ha descrito anteriormente, en los métodos de la invención de ensamblaje de polinucleótidos, el polinucleótido extendido puede ponerse en contacto con un siguiente oligonucleótido más terminal en condiciones y durante un periodo adecuados para la hibridación, dando la puesta en contacto como resultado un polinucleótido de cadena doble contiguo, en el que se extiende la secuencia de iniciación. Posteriores siguientes oligonucleótidos más terminales pueden añadirse secuencialmente al polinucleótido de iniciación extendido mediante ciclos repetidos de hibridación y ligamiento, con lo que se ensambla un polinucleótido diana.

Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención pueden incluir la adición de MutS durante el ensamblaje de polinucleótidos. MutS es una proteína bacteriana implicada en la reparación de emparejamiento erróneo de ADN que reconoce y repara muchos errores, incluyendo emparejamientos erróneos de bases, bases sin emparejar, y pequeños bucles de inserción o deleción. MutS funciona uniendo los pares de bases emparejados erróneamente en polinucleótidos de cadena doble y puede utilizarse en los métodos de la invención para impedir la incorporación de oligonucleótidos emparejados erróneamente en el polinucleótido de cadena doble que se está extendiendo. En particular, si hibridan dos oligonucleótidos que tienen un emparejamiento erróneo de una única base, MutS se une al oligonucleótido hibridado y la posición del emparejamiento erróneo, impidiendo físicamente de este modo que la enzima ligasa se una a y se ligue a oligonucleótidos adyacentes. Como consecuencia de la unión de MutS, los oligonucleótidos que contienen una base emparejada erróneamente no se incorporarán al polinucleótido de cadena doble que se está extendiendo. Por lo tanto, los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención, que incluyen los métodos de ensamblaje secuencial descritos en este documento, pueden abarcar la adición a la mezcla de reacción de MutS durante, por ejemplo, las etapas de mezclado o ligamiento. En los métodos de ensamblaje de polinucleótidos que abarcan dos conjuntos de oligonucleótidos proporcionados por la invención, se hibrida en presencia de proteína MutS el primer y segundo conjuntos de oligonucleótidos para ensamblar un polinucleótido de cadena doble. En general, en los métodos de ensamblaje secuencial o de conjuntos descritos en este documento, puede añadirse MutS a la mezcla de reacción primaria o mezcla y estará presente en todas las posteriores etapas de ensamblaje.

Homólogos de proteína MutS de Escherichia coli se encuentran en casi cualquier organismo. En procariotas, las proteínas MutS se originan a partir de un único gen, mientras que los eucariotas contienen múltiples genes homólogos de mutS (msh). La MutS termoestable se obtiene de la bacteria termófila Thermus aquaticus y tiene el 63% de identidad con la proteína MutS de E. coli y el 55% de identidad con la proteína humana homóloga MSH2. La MutS termoestable puede unirse a oligonucleótidos emparejados erróneamente a hasta 70ºC y es particularmente útil para poner en práctica los métodos reivindicados. La MutS termoestable esta disponible en el mercado de diversas fuentes, por ejemplo, Epicentre Technologies, Ecogen S.R.L., Madrid, España, y puede usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, por ejemplo, añadiendo 0,1 \mug por 50 \mul de mezcla de reacción.

Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención proporcionan varias ventajas sobre métodos conocidos en la técnica anterior de síntesis de polinucleótidos. Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos permiten el ensamblaje de grandes nucleótidos de cadena doble y eliminan el requisito de posterior clonación y ligamiento en un vector que otorga competencia de replicación. En su lugar, los métodos de ensamblaje de polinucleótidos de la invención permiten el ensamblaje eficaz de polinucleótidos de un tamaño suficiente para abarcar regiones reguladoras así como elementos distantes que actúan en posición cis y trans necesarios para la replicación. Por lo tanto, los polinucleótidos ensamblados mediante los métodos de la invención pueden contener, por ejemplo, una región codificante de proteínas, promotor, señal de traducción, origen de replicación, elementos reguladores y señal de poliadenilación. Al proporcionar la capacidad de ensamblar oligonucleótidos competentes para replicación debido a la viabilidad de ensamblaje de grandes moléculas, los métodos de la invención permiten el ensamblaje de polinucleótidos que pueden transferirse directamente a una célula huésped, por ejemplo, mediante transformación de un huésped bacteriano, sin etapas de clonación intermedias.

Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos secuencial de la invención reducen además la tasa de error observada con métodos que requieren etapas de hibridación de mezclas de gran número de oligonucleótidos. Además, los métodos de ensamblaje de polinucleótidos secuencial de la invención pueden realizarse con grandes oligonucleótidos que tienen un saliente de aproximadamente el 50 por ciento de su longitud, para dar como resultado un solapamiento de aproximadamente el 50 por ciento después de la hibridación con el saliente complementario correspondiente del oligonucleótido de iniciación extendido. Los métodos de ensamblaje de polinucleótidos secuencial de la invención eliminan la necesidad de purificación y permiten el ensamblaje sistemático de oligonucleótidos de cadena doble de idéntico tamaño. Los métodos de ensamblaje de la invención también pueden realizarse con oligonucleótidos de cadena doble de tamaños no idénticos. Además, los métodos de ensamblaje de polinucleótidos secuencial de la invención evitan problemas de emparejamiento erróneo asociados con pequeñas secuencias repetidas y complementarias que se encuentran en métodos de mezclado tradicionales.

En una realización, un polinucleótido de iniciación puede unirse a un soporte sólido para una eficacia mejorada. La fase sólida permite la separación eficaz del polinucleótido diana ensamblado a partir de otros elementos de la reacción. Pueden aplicarse diferentes soportes en el método. Por ejemplo, los soportes pueden ser perlas magnéticas de látex o perlas magnéticas de vidrio de poro controlado que permiten que el producto deseado se separe magnéticamente de la mezcla de reacción. La unión del polinucleótido de iniciación a dichas perlas puede realizarse mediante diversos métodos conocidos, por ejemplo tratamiento con carbodiimida (Gilham, Biochemistry 7: 2809-2813 (1968); Mizutani y Tachbana, J. Chromatography 356: 202-205 (1986); Wolf et al., Nucleic Acids Res. 15: 2911-2926 (1987); Musso, Nucleic Acids Res. 15: 5353-5372 (1987); Lund et al, Nucleic Acids Res. 16: 10861-10880 (1988)).

El polinucleótido de iniciación unido a la fase sólida puede actuar como ancla para la síntesis continuada del polinucleótido diana. El ensamblaje puede realizarse mediante adición de polinucleótidos contiguos junto con ligasa para el ensamblaje por ligamiento o mediante adición de oligonucleótidos junto con polimerasa para el ensamblaje por extensión del cebador. Después del periodo de incubación apropiado, los componentes no unidos del método pueden eliminarse por lavado y la reacción puede repetirse de nuevo para mejorar la eficacia de la utilización de plantillas. Como alternativa, puede añadirse otro conjunto de polinucleótidos u oligonucleótidos para continuar el ensamblaje.

La fase sólida, para usarla eficazmente para la síntesis, puede contener poros con espacio suficiente para la síntesis de las largas moléculas de ácido nucleico. La fase sólida puede estar constituida por material que no puede unirse de forma no específica a cualquier componente no deseado de la reacción. Una manera de resolver el problema es usar perlas de vidrio de poro controlado apropiadas para largas moléculas de ADN. El polinucleótido de iniciación puede unirse a las perlas a través de un conector largo. El papel del conector es situar al polinucleótido de iniciación a una distancia deseable de la superficie del soporte sólido.

El método de la invención incluye además identificar un siguiente oligonucleótido más terminal presente en el polinucleótido diana, que es contiguo al polinucleótido de iniciación. Un siguiente oligonucleótido más terminal puede incluir al menos un oligonucleótido de cadena más, hibridado a al menos un oligonucleótido de cadena menos, dando como resultado un polinucleótido de cadena parcialmente doble que comprende un saliente 5', un saliente 3', o un saliente 5' y un saliente 3', donde al menos un saliente del siguiente oligonucleótido más terminal es complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación extendido. Dos o más oligonucleótidos que tienen regiones complementarias, donde estén permitidas, "hibridarán" (es decir, se emparejarán sus bases) en las condiciones apropiadas, produciendo de este modo una región de cadena doble. Para emparejarse (es decir, hibridar), los oligonucleótidos deben ser al menos parcialmente complementarios. La expresión "complementario a" se usa en este documento en relación con nucleótidos para significar un nucleótido que emparejará sus bases con otro nucleótido específico. De este modo, adenosín trifosfato es complementario a uridín trifosfato o timidín trifosfato y guanosín trifosfato es complementario a cistidín trifosfato.

Como se usa en este documento, un "saliente" 5' o 3' significa una región de cadena sencilla en el extremo 5' o 3', o 5' y 3', de un polinucleótido de cadena doble o de cadena sencilla o de un oligonucleótido de cadena doble o de cadena sencilla que proporciona un medio para la posterior hibridación de un polinucleótido u oligonucleótido contiguo que contiene un saliente que es complementario al saliente del polinucleótido u oligonucleótido contiguo. Dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de hibridación.

Para aplicaciones que requieren alta selectividad, se deseará típicamente emplear condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones de sal relativamente baja y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas mediante NaCI de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran pocos, si es que toleran alguno, emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido y la plantilla o cadena diana. Se aprecia, de modo general, que las condiciones pueden hacerse más rigurosas mediante la adición de cantidades en aumento de formamida.

Para algunas aplicaciones, por ejemplo, por analogía a la sustitución de nucleótidos mediante mutagénesis dirigida, se aprecia que pueden usarse condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones, puede producirse la hibridación incluso aunque las secuencias de sonda y cadena diana no son perfectamente complementarias, sino que se emparejan erróneamente en una o más posiciones. Las condiciones pueden hacerse menos rigurosas aumentando la concentración de sales y disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, una condición de rigurosidad media podría proporcionarse mediante NaCI de aproximadamente 0,1 a 0,25 M a temperaturas de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC, mientras que una condición de baja rigurosidad podría proporcionarse mediante sal de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, a temperaturas que varían entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 55ºC. Por lo tanto, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente dependiendo de los resultados deseados.

Puede ser ventajoso determinar la hibridación de oligonucleótidos empleando una etiqueta. Una amplia variedad de etiquetas apropiadas se conocen en la técnica, incluyendo fluorescentes, radioactivas, enzimáticas u otros ligandos, tales como avidina/biotina, que pueden ser detectadas. Puede desearse emplear una etiqueta fluorescente o una marca enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radioactivos u otros perjudiciales para el medioambiente. En el caso de marcas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden emplearse para proporcionar un medio para una detección visible al ojo humano o mediante espectrofotometría para identificar si se ha producido la hibridación específica con un oligonucleótido complementario.

Al menos un oligonucleótido de un polinucleótido de iniciación puede adsorberse o fijarse de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido de cadena sencilla fijado se somete a continuación a hibridación con los oligonucleótidos complementarios en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas también dependerán de las circunstancias particulares en base a los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, el tipo de ácido nucleico diana, la fuente de ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc.). Después del lavado de la superficie hibridada para eliminar oligonucleótidos no unidos específicamente, la hibridación puede detectarse, o incluso cuantificarse, por medio de la etiqueta.

En una realización, el método de la invención incluye además identificar una segunda secuencia de polinucleótido presente en el polinucleótido diana que es contigua al polinucleótido de iniciación e incluye al menos un oligonucleótido de cadena más, hibridado con al menos un oligonucleótido de cadena menos, dando como resultado un polinucleótido de cadena parcialmente doble constituido por un saliente 5', un saliente 3', o un saliente 5' y un saliente 3', donde al menos un saliente del segundo polinucleótido es complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación. En esta realización, la invención proporciona además un tercer polinucleótido presente en el polinucleótido diana que es contiguo a la secuencia de iniciación y proporciona un saliente 5', un saliente 3', o un saliente 5' y un saliente 3', donde al menos un saliente del tercer polinucleótido es complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación que no es complementario a un saliente del segundo polinucleótido. Posteriores polinucleótidos se añaden en extremos alternos para extender el polinucleótido de iniciación de manera alterna bidireccional.

El método proporciona además la puesta en contacto del polinucleótido de iniciación con el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido en condiciones y durante un periodo adecuados para la hibridación, dando la puesta en contacto como resultado un polinucleótido de cadena doble contiguo, que da como resultado la extensión del polinucleótido de iniciación. Los polinucleótidos hibridados se ponen en contacto opcionalmente con una ligasa en condiciones adecuadas para el ligamiento. El método descrito anteriormente se repite opcionalmente para añadir secuencialmente polinucleótidos de cadena doble al polinucleótido de iniciación extendido mediante ciclos repetidos de hibridación y ligamiento.

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Como se describe en este documento, en los métodos de la invención el polinucleótido de iniciación puede extenderse mediante extensión unidireccional o bidireccional así como mediante extensión mixta unidireccional y bidireccional. Como se ha descrito anteriormente, en una extensión bidireccional alterna, se añade un siguiente oligonucleótido o polinucleótido más terminal que tiene al menos un saliente complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación extendido que no es complementario a un saliente del oligonucleótido o polinucleótido que se añadió inmediatamente antes, dando como resultado de este modo un patrón alterno bidireccional de adición de posteriores siguientes oligonucleótidos más terminales. En otras realizaciones, un siguiente oligonucleótido más terminal puede ser cualquier siguiente polinucleótido más terminal independientemente de si su adición al polinucleótido de cadena doble que se está extendiendo dará como resultado extensión bidireccional o unidireccional. En dichas realizaciones, el siguiente oligonucleótido o polinucleótido más terminal tiene un saliente que puede ser complementario a cualquier saliente del polinucleótido de cadena doble que se está extendiendo.

De acuerdo con los métodos de la invención un polinucleótido puede ensamblarse aleatoriamente o puede abarcar una secuencia de polinucleótido diana, que puede diseñarse de novo u obtenerse de una secuencia de polinucleótido modelo predeterminada. Un polinucleótido diana puede ser de cualquier tamaño o complejidad determinada y puede incluir cualquier cosa desde polinucleótidos que codifican genomas completos o rutas para secuencias parciales, segmentos o fragmentos de un oligonucleótido o polinucleótido. Una secuencia de polinucleótido modelo incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que está predeterminada antes del ensamblaje y, por ejemplo, puede codificar una secuencia de polipéptido modelo. Una secuencia de polipéptido modelo puede proporcionar una base para diseñar un polinucleótido modificado de modo que se sintetiza un polinucleótido diana que incorpora la modificación deseada.

La presente invención también proporciona métodos que pueden usarse para sintetizar, de novo, polinucleótidos que codifican conjuntos de genes, genes de origen natural expresados a partir de construcciones promotoras naturales o artificiales o genes artificiales obtenidos de secuencias de ADN sintéticas, que codifican elementos de sistemas biológicos que realizan una función o atribución especificada de un organismo artificial así como genomas completos. En la producción de dichos sistemas y genomas, la presente invención proporciona la síntesis de un polinucleótido de cadena doble, competente en replicación, en la que el polinucleótido tiene un origen de replicación, una primera región codificante y una primera región reguladora que dirige la expresión de la primera región codificante.

Como se usa en este documento, la expresión "competente en replicación", se refiere a un polinucleótido que es capaz de dirigir su propia replicación. Un polinucleótido competente en replicación abarca una región reguladora que tiene las señales y elementos reguladores que actúan en posición cis requeridos para dirigir la expresión de la región codificante. El polinucleótido competente en replicación obvia la necesidad de métodos recombinantes tales como clonación de una región codificante sintetizada, en un vector tal como un plásmido o un virus, para otorgar competencia en replicación.

Una secuencia de polinucleótido que define en gen, genoma, conjunto de genes o secuencia de proteína puede diseñarse de manera asistida por ordenador (descrita a continuación) y usarse para generar un conjunto de oligonucleótidos analizados que abarcan la cadena más (+) y menos (-) de la secuencia. Como se usa en este documento, una "analizada" significa una secuencia de polinucleótido diana que se ha delineado de manera asistida por ordenador de modo que se identifiquen una serie de secuencias de oligonucleótido contiguas. Las secuencias de oligonucleótido se sintetizan individualmente y se usan en un método de la invención para generar un polinucleótido diana. La longitud de un oligonucleótido es bastante variable. Preferiblemente, los oligonucleótidos usados en los métodos de la invención tienen entre aproximadamente 15 y 100 bases y más preferiblemente entre aproximadamente 20 y 50 bases. Las longitudes específicas incluyen, aunque sin limitación 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64. 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100 bases. Dependiendo del tamaño, el solapamiento entre los oligonucleótidos que tienen complementariedad parcial puede diseñarse para que tenga entre 5 y 75 bases por par de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos se tratan preferiblemente con polinucleótido quinasa, por ejemplo, T4 polinucleótido quinasa. La fosforilación puede realizarse antes o después de la mezcla del conjunto de oligonucleótidos, o después pero antes de la hibridación. Después de la hibridación, los oligonucleótidos se tratan con una enzima que tiene una función de ligamiento. Por ejemplo, una ADN ligasa se empleará típicamente para esta función. Sin embargo, la topoisomerasa, que no requiere fosforilación en 5', es rápida y funciona a temperatura ambiente, y puede usarse en lugar de ligasa. Por ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleótidos de 50 pares de bases que se solapan en 25 bases mediante un sintetizador de matrices de oligonucleótidos (OAS). Un conjunto de oligonucleótidos de cadena (+) 5' se sintetiza en una placa de 96 pocillos y el segundo conjunto 3' o cadena (-) se sintetiza en una segunda placa de microvaloración de 96 pocillos. La síntesis puede realizarse usando química de fosforamidita modificada para reducir el tamaño de la reacción y generar pequeños volúmenes de reacción y rendimientos en el intervalo de 2 a 5 nmoles. La síntesis se realiza en perlas de vidrio de poro controlado (CPG), a continuación los oligonucleótidos completados se desbloquean, se desprotegen y se retiran de las perlas. Los oligonucleótidos se liofilizan, se resuspenden en agua y se fosforilan en 5' usando polinucleótido quinasa y ATP para permitir el ligamiento.

El conjunto de secuencias de oligonucleótido dispuestas en matriz en la placa puede ensamblarse usando una estrategia de mezclado mixta. Por ejemplo, el mezclado sistemático de oligonucleótidos componentes puede realizarse usando un robot de pipeteo automatizado Beckman Biomek modificado, u otra estación de trabajo de laboratorio automatizada. Los fragmentos pueden combinarse con tampón y enzima (Taq I ADN ligasa o Egea Assemblase^{TM}, por ejemplo). El mezclado puede realizarse en placas de micropocillos. Después de cada etapa de mezclado, la temperatura se eleva para permitir el ligamiento y la hibridación, y después se realiza mezclado adicional.

En los métodos de ensamblaje de la invención, puede realizarse hibridación lenta mediante generalmente no más de 1,5ºC por minuto a 37ºC o menos para maximizar la eficacia de hibridación. La hibridación lenta puede conseguirse mediante diversos métodos, por ejemplo, con un termociclador programable. La velocidad de enfriamiento puede ser lineal o no lineal y puede ser, por ejemplo, de 0,1ºC, 0,2ºC, 0,3ºC, 0,4ºC, 0,5ºC, 0,6ºC, 0,7ºC, 0,8ºC, 0,9ºC, 1,0ºC, 1,1ºC, 1,2ºC, 1,3ºC, 1,4ºC, 1,5ºC, 1,6ºC, 1,7ºC, 1,8ºC, 1,9ºC o 2,0ºC. La velocidad de enfriamiento puede ajustarse al alza o a la baja para maximizar la eficacia y la precisión.

El ensamblaje del polinucleótido diana implica la formación de un conjunto de intermedios. Un conjunto de intermedios puede incluir un oligonucleótido de cadena más, hibridado con un oligonucleótido de cadena menos, como se ha descrito anteriormente. El intermedio hibridado puede formarse proporcionando un único oligonucleótido de cadena más, hibridado con un único oligonucleótido de cadena menos.

Como alternativa, dos o más oligonucleótidos pueden comprender la cadena más o la cadena menos. Por ejemplo, para construir un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido de iniciación) que puede usarse para ensamblar un polinucleótido diana de la invención, pueden hibridarse tres o más oligonucleótidos. Por lo tanto, un primer oligonucleótido de cadena más, un segundo oligonucleótido de cadena más, contiguo al primer oligonucleótido de cadena más, y un oligonucleótido de cadena menos que tiene una primera secuencia contigua que es al menos parcialmente complementaria al primer oligonucleótido de cadena más y una segunda secuencia contigua que es al menos parcialmente complementaria al segundo oligonucleótido de cadena más, puede hibridarse para formar un polinucleótido de cadena parcialmente doble. El polinucleótido puede incluir un saliente 5', un saliente 3', o un saliente 5' y un saliente 3'. El primer oligonucleótido de cadena más y el segundo oligonucleótido de cadena más son secuencias contiguas de modo que pueden ligarse. El oligonucleótido de cadena menos es parcialmente complementario a ambos oligonucleótidos de cadena más y actúa como una secuencia "puente" o "estabilizante" hibridando con ambos oligonucleótidos. Posteriores polinucleótidos constituidos por más de dos oligonucleótidos hibridados como se ha descrito anteriormente, pueden usarse para ensamblar un polinucleótido diana de manera que de cómo resultado un polinucleótido de cadena doble contiguo.

Un ejemplo del uso de dos o más oligonucleótidos de cadena más, para ensamblar un polinucleótido se muestra en la figura 3. Una estructura triple de tres oligonucleótidos de aproximadamente 50 pb cada uno, que se solapa en aproximadamente 25 pb forma un intermedio "fragmentado". Dos de estos oligonucleótidos proporcionan un sustrato de ligamiento unido mediante ligasa y el tercer oligonucleótido es un estabilizante que une a dos secuencias específicas mediante hibridación dando como resultado la formación de una parte de la construcción de polinucleótido final. Este intermedio proporciona un sustrato para ADN ligasa que, mediante su actividad de sellado de fragmentos, une los dos oligonucleótidos de 50 pares de bases en un único polinucleótido de cadena sencilla de 100 bases.

Después del mezclado y la formación iniciales de productos hibridados, los productos se ensamblan en polinucleótidos cada vez más grandes. Por ejemplo, después de la formación de la estructura triple de oligonucleótidos, conjuntos de estructuras triples se unen, ligan y ensamblan sistemáticamente. Cada etapa puede estar mediada por mezclado, ligamiento y termociclado robotizado para conseguir la hibridación y la desnaturalización. La etapa final une piezas ensambladas en una secuencia completa que representa todos los fragmentos en la matriz. Puesto que la eficacia de rendimiento en cada etapa es menor del 100%, la cantidad en masa de producto completado en la mezcla final puede ser muy pequeña. Opcionalmente, cebadores de oligonucleótidos específicos adicionales, habitualmente de 15 a 20 bases y complementarios a los extremos finales del ensamblaje, pueden hibridarse y puede realizarse la amplificación por PCR, amplificando y purificando de este modo el producto final de longitud completa.

Los métodos de la invención proporcionan varias mejoras respecto a la tecnología existente de síntesis de polinucleótidos. Por ejemplo, la síntesis puede utilizar microdispensado piezioeléctrico o nanodispensadores microsolenoides que permiten una síntesis muy rápida, volúmenes de reacción mucho más pequeños y placas de mayor densidad como recipientes de síntesis. El instrumento usará placas de hasta 1536 pocillos proporcionando una capacidad muy alta. Adicionalmente, el mezclado controlado puede realizarse mediante un colector microfluídico que moverá oligonucleótidos individuales a través de microcanales y los mezclará/ligará de manera controlada. Esto obviará la necesidad de pipeteo robotizado y aumenta la velocidad y la eficacia. Por lo tanto, un aparato que realiza un método de la invención tendrá una mayor capacidad para reacciones simultáneas dando una mayor capacidad global para la longitud génica.

Una vez que se han sintetizado polinucleótidos diana usando un método de la presente invención, puede ser necesario cribar las secuencias para el análisis de la función. La presente invención contempla específicamente tecnologías basadas en chips de ADN. En resumen, estas técnicas implican métodos cuantitativos para analizar gran número de genes de forma rápida y precisa. Al marcar genes con oligonucleótidos o usando matrices fijadas a sondas, puede emplearse tecnología de chip para segregar moléculas diana como matrices de alta densidad y cribar estas moléculas en base a la hibridación.

El uso de síntesis combinatoria y ensayos de cribado de alto rendimiento en bien conocido por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.807.754; 5.807.683; 5.804.563; 5.789.162; 5.783.384; 5.770.358; 5.759.779; 5.747.334; 5.686.242; 5.198.346; 5.738.996; 5.733.743; 5.714.320; y 5.663.046 describen sistemas de cribado útiles para determinar la actividad de un polipéptido diana. Estas patentes enseñan diversos aspectos de los métodos y composiciones implicados en el ensamblaje y los análisis de actividad de matrices de alta densidad de diferentes polisubunidades (polinucleótidos o polipéptidos). Como tal, se contempla que los métodos y composiciones descritas en las patentes mencionadas anteriormente puedan ser útiles para ensayar los perfiles de actividad de los polipéptidos diana de la presente invención.

Se describe además un método para la expresión y el aislamiento de un polipéptido diana codificado por un polinucleótido diana. El método incluye incorporar un polinucleótido diana sintetizado mediante un método de la invención en un vector de expresión; introducir el vector de expresión en una célula huésped adecuada; cultivar la célula huésped en condiciones y durante un periodo adecuado para promover la expresión del polipéptido diana codificado por el polinucleótido diana; y aislar el polipéptido diana.

La invención puede usarse para modificar algunas características funcionales, estructurales, o filogenéticas de un polinucleótido modelo que codifica un polipéptido modelo dando como resultado un polipéptido diana alterado. Una secuencia de polinucleótido de entrada o modelo que codifica un polipéptido modelo puede manipularse electrónicamente para determinar un potencial para un efecto de un cambio (o variación) de aminoácidos en un punto particular o en múltiples puntos en el polipéptido modelo. Una vez identificada, una nueva secuencia de polinucleótido diana se ensambla mediante un método de la invención, de modo que el polinucleótido diana codifica un polipéptido diana que posee una característica diferente de la del polipéptido modelo.

Los métodos de la invención pueden depender del uso de bases de datos públicas de secuencia y estructura. Estas bases de datos se vuelven más robustas a medida que se añaden más secuencias y estructuras. La información respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido diana y la estructura terciaria del polipéptido puede usarse para sintetizar oligonucleótidos que pueden ensamblarse en un polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana. Un polipéptido modelo debe tener suficiente información estructural para analizar los aminoácidos implicados en la función del polipéptido. La información estructural puede obtenerse de cristalografía de rayos X, RMN, o alguna otra técnica para determinar la estructura de una proteína a nivel de aminoácidos o atómico. Una vez seleccionada, la información de secuencia y estructural obtenida del polipéptido modelo puede usarse para generar una pluralidad de polinucleótidos que codifican una pluralidad de variantes de secuencias de aminoácidos que comprenden un polipéptido diana. Por lo tanto, puede seleccionarse un polipéptido modelo en base a la similitud de secuencia global con la proteína diana o en base a la presencia de una porción que tiene similitud de secuencia con una porción del polipéptido diana.

Un "polipéptido", como se usa en este documento, es un polímero en el que los monómeros son alfa aminoácidos y se unen conjuntamente a través de enlaces amida. Los aminoácidos pueden ser el isómero óptico L o el isómero óptico D. Los polipéptidos tienen dos o más monómeros de aminoácido de largo y a menudo tienen más de 20 monómeros de aminoácido de largo. Se usan las abreviaturas convencionales para los aminoácidos (por ejemplo, P para prolina). Estas abreviaturas se incluyen en Stryer, Biochemistry, Tercera Ed., 1988. Con respecto a los polipéptidos, "aislado" se refiere a un polipéptido que constituye el componente principal en una mezcla de componentes, por ejemplo, el 50% o más, el 60% o más, el 70% o más, el 80% o más, el 90% o más, o el 95% o más en peso. Los polipéptidos aislados se obtienen típicamente mediante purificación a partir de un organismo en el que se ha producido el polipéptido, aunque la síntesis química también es posible. El método de purificación del polipéptido incluye, por ejemplo, técnicas de cromatografía o inmunoafinidad. Los polipéptidos de la invención pueden detectarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico (SDS)-poli-acrilamida seguida por tinción con Azul de Coomassie o análisis mediante transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales o policlonales que tienen afinidad de unión por el polipéptido a detectar.

Un "polipéptido quimérico," como se usa en este documento, es un polipéptido que contiene porciones de secuencia de aminoácidos obtenidas de dos o más proteínas diferentes, o dos o más regiones de la misma proteína que normalmente no son contiguas.

Un "ligando", como se usa en este documento, es una molécula que es reconocida por un receptor. Los ejemplos de ligandos que pueden ser investigados por esta invención incluyen, aunque sin limitación, agonistas y antagonistas para receptores de la membrana celular, toxinas y venenos, epítopos virales, hormonas, opiáceos, esteroides, péptidos, sustratos enzimáticos, cofactores, fármacos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos y proteínas.

Un "receptor", como se usa en este documento, es una molécula que tiene una afinidad por un ligando. Los receptores pueden ser de origen natural o moléculas fabricadas por el hombre. Pueden emplearse en su estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden estar unidos, covalentemente o no covalentemente, a un miembro de unión, directamente o mediante una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores que pueden ser empleados por esta invención incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos, receptores de la membrana celular, anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos, virus, células, fármacos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, péptidos, cofactores, lectinas, azúcares, polisacáridos, membranas celulares, y orgánulos. Un "par ligando receptor" se forma cuando dos moléculas se han combinado a través de reconocimiento molecular para formar un complejo.

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Los ejemplos específicos de polipéptidos que pueden sintetizarse mediante esta invención incluyen, aunque sin limitación:

a): Receptores de microorganismos: La determinación de ligandos que se unen a receptores de microorganismos tales como proteínas o enzimas de transporte específicas esenciales para la supervivencia de microorganismos sería una herramienta útil para descubrir nuevas clases de antibióticos. Serían de valor particular antibióticos contra hongos, protozoos y bacterias oportunistas resistentes a antibióticos actualmente en uso.

b): Enzimas: Por ejemplo, un receptor puede comprender un punto de unión de una enzima tal como una enzima responsable de la escisión de un neurotransmisor; la determinación de ligandos para este tipo de receptor para modular la acción de una enzima que escinde un neurotransmisor es útil en el desarrollo de fármacos que puedan usarse en el tratamiento de trastornos de neurotransmisión.

c): Anticuerpos: Por ejemplo, la invención puede ser útil en la investigación de un receptor que comprende un punto de unión a ligando en una molécula de anticuerpo que combina con un epítopo de un antígeno de interés; la determinación de una secuencia que imita un epítopo antigénico puede conducir al desarrollo de vacunas en las que el inmunógeno se basa en una o más de dichas secuencias o conducir al desarrollo de agentes de diagnóstico relacionados o compuestos útiles en tratamientos terapéuticos tales como para enfermedades autoinmunes (por ejemplo, bloqueando la unión de los anticuerpos "autoinmunes").

d): Polinucleótidos: Pueden sintetizarse secuencias de polinucleótidos para establecer secuencias de unión a ADN o ARN que actúan como receptores para la secuencia sintetizada.

e): Polipéptidos Catalíticos: Polímeros, preferiblemente anticuerpos, que son capaces de promover una reacción química que implica la conversión de uno o más reactivos en uno o más productos. Dichos polipéptidos incluyen generalmente un punto de unión específico para al menos un reactivo o intermedio de reacción y una funcionalidad activa próxima al sitio de unión, funcionalidad que es capaz de modificar químicamente el reactivo de unión. Los polipéptidos catalíticos y otros se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT Nº WO 90/05746, WO 90/05749 y WO 90/05785.

f): Receptores hormonales: La identificación de los ligandos que se unen con alta afinidad a un receptor tal como los receptores para insulina y hormona del crecimiento es útil en el desarrollo de, por ejemplo, una sustitución oral de las inyecciones diarias que los diabéticos deben recibir para aliviar los síntomas de la diabetes o una sustitución para la hormona del crecimiento. Otros ejemplos de receptores hormonales incluyen los receptores de la hormona vasoconstrictora; La determinación de ligandos para estos receptores puede conducir al desarrollo de fármacos para controlar la presión sanguínea.

g): Receptores de opiáceos: La determinación de ligandos que se unen a los receptores de opiáceos en el cerebro es útil en el desarrollo de sustituciones menos adictivas para morfina y fármacos relacionados.

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En el contexto de un polipéptido, el término "estructura" se refiere a: la disposición tridimensional de átomos en la proteína. "Función" se refiere a cualquier propiedad medible de una proteína. Los ejemplos de función proteica incluyen, aunque sin limitación, catálisis, unión a otras proteínas, unión a moléculas no proteicas (por ejemplo, fármacos), e isomerización entre dos o más formas estructurales. "Proteína biológicamente relevante" se refiere a cualquier proteína que desempeña un papel en la vida de un organismo.

Para identificar motivos estructurales significativos, la secuencia del polipéptido modelo se examina en busca de coincidencias con las entradas en una o más bases de datos de dominios reconocidos, por ejemplo, los dominios de la base de datos PROSITE (Bairoch, Nucl. Acids. Res. 24: 217, 1997) o la base de datos pfam HMM (Bateman et al., (2000) Nucl. Acids. Res. 28: 263). La base de datos PROSITE es una compilación de dos tipos de firmas-perfiles de secuencia, que representan típicamente dominios proteicos completos, y patrones que representan típicamente solamente los aspectos funcionales o estructurales más altamente conservados de dominios proteicos.

Los métodos pueden usarse para generar polipéptidos que contienen polimorfismos que tienen un efecto sobre una actividad catalítica de un polipéptido diana o una actividad no catalítica del polipéptido diana (por ejemplo, estructura, estabilidad, unión a una segunda proteína o cadena polipeptídica, unión a una molécula de ácido nucleico, unión a una molécula pequeña, y unión a una macromolécula que no es una proteína ni un ácido nucleico). Por ejemplo, la invención proporciona un medio para ensamblar cualquier secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido diana de modo que el polipéptido codificado pueda expresarse y cribarse para una actividad particular. Alterando aminoácidos particulares en puntos específicos en el polipéptido diana, la temperatura de operación, el pH de operación, o cualquier otra característica de un polipéptido puede manipularse, dando como resultado un polipéptido con una actividad única. Por lo tanto, los métodos de la invención pueden usarse para identificar sustituciones de aminoácidos que pueden hacerse para manipular la estructura o función de un polipéptido de interés (por ejemplo, para aumentar o disminuir una actividad seleccionada o para añadir o eliminar una actividad seleccionada).

Además, los métodos de la invención pueden usarse en la identificación y análisis de polimorfismos candidatos para la dirección específica de polimorfismo mediante agentes farmacéuticos o de diagnóstico, para la identificación o análisis de polimorfismos candidatos para aplicaciones farmacogenómicas, y para análisis bioquímico experimental y estructural de dianas farmacéuticas que muestran polimorfismo de aminoácidos.

Una biblioteca de polinucleótidos diana que codifican una pluralidad de polipéptidos diana puede prepararse mediante la presente invención. Las células huésped se transforman mediante introducción artificial de los vectores que contienen el polinucleótido diana mediante inoculación en condiciones que conducen a dicha transformación. Las bibliotecas resultantes de clones transformados se criban a continuación en busca de clones que muestren actividad para el polipéptido de interés en un ensayo fenotípico para actividad.

Un polinucleótido diana puede incorporarse (es decir, clonarse) en un vector apropiado. Para fines de expresión, las secuencias diana que codifican un polipéptido diana pueden insertarse en un vector de expresión recombinante. La expresión "vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus, u otro vehículo conocido en la técnica que ha sido manipulado mediante inserción o incorporación de la secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido diana. El vector de expresión típicamente contiene un origen de replicación, un promotor, así como genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. Los vectores adecuados para su uso incluyen, aunque sin limitación, el vector de expresión basado en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg et al., Gene, 56: 125, 1987), el vector de expresión pMSXND para su expresión en células de mamífero (Lee y Nathans, J. Biol. Chem., 263: 3521, 1988), vectores obtenidos de baculovirus para su expresión en células de insecto, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV.

Dependiendo del vector utilizado, cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., puede usarse en el vector de expresión (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology, 153: 516-544, 1987). Estos elementos son bien conocidos por un especialista en la técnica.

La expresión "unido/a de forma operativa" o "asociado/a de forma operativa" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia reguladora y la secuencia de polinucleótido regulada por la secuencia reguladora. La secuencia reguladora unida de forma operativa controla la expresión del producto expresado por la secuencia de polinucleótido. Como alternativa, el enlace funcional también incluye un elemento potenciador.

"Promotor" significa una secuencia reguladora de ácido nucleico suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer a la expresión de secuencia de polinucleótido dependiente de promotor controlable por señales o agentes específicas de tipo celular, específicas de tejido, o inducible por señales o agentes externos; dichos elementos pueden ubicarse en las regiones 5' o 3' del gen nativo, o en los intrones.

"Expresión génica" o "expresión de la secuencia de polinucleótido" significan el proceso mediante el cual una secuencia de nucleótido experimenta transcripción y traducción con éxito, de modo que se expresen niveles detectables de la secuencia de nucleótido administrada en una cantidad y durante un periodo de tiempo, de modo que se consiga un efecto biológico funcional.

En levaduras, puede usarse un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Cap. 13, 1988; Grant et al., "Expression and Secretion Vectors for Yeast," en Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, págs. 516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Cap. 3, 1986; "Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast," Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, págs. 673-684, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vol. 1 y 11, 1982). Puede usarse un promotor de levadura constitutivo, tal como ADH o LEU2, o un promotor inducible, tal como GAL ("Cloning in Yeast," Cap. 3, R. Rothstein en: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Como alternativa, pueden usarse vectores que promueven la integración de secuencias de ADN en el cromosoma de levadura.

En algunas realizaciones, puede ser deseable incluir regiones especializadas conocidas como telómeros en el extremo de una secuencia de polinucleótido diana. Los telómeros son secuencias repetidas descubiertas en los extremos del cromosoma y se sabe desde hace tiempo que los cromosomas con los extremos truncados son inestables, tienden a fusionarse con otros cromosomas y, en caso contrario, se pierden durante la división celular.

Algunos datos sugieren que los telómeros interactúan con el complejo de nucleoproteína y la matriz nuclear. Un supuesto papel para los telómeros incluye estabilizar cromosomas y proteger a los extremos frente a enzimas degradativas.

Otro posible papel para los telómeros es en la replicación. De acuerdo con la presente doctrina, la replicación de ADN requiere inicios a partir de cebadores de ARN cortos hibridados al extremo T de la plantilla. El resultado de este mecanismo es un "problema de replicación en el extremo" en el que la región correspondiente al cebador de ARN no se replica. A lo largo de muchas divisiones celulares, esto dará como resultado el truncamiento progresivo del cromosoma. Se piensa que los telómeros pueden proporcionar una amortiguación contra este efecto, al menos hasta que ellos mismos son eliminados por este efecto. Una estructura adicional que puede incluirse en el polinucleótido diana es un centrómero.

Se describe la administración de un ácido nucleico en una célula que puede identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en la construcción de expresión. El marcador podría dar como resultado un cambio identificable por la célula transfectada que permite la fácil identificación de la expresión.

Un vector de expresión puede usarse para transformar una célula diana. Por "transformación" se entiende un cambio genético inducido en una célula después de la incorporación de nuevo ADN (es decir, ADN exógeno a la célula). Cuando la célula es una célula de mamífero, el cambio genético se consigue generalmente mediante la introducción del ADN en el genoma de la célula. Por "célula transformada" se entiende una célula en la que (o en una ancestro de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinantes. La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede realizarse mediante técnicas convencionales como conocen bien los especialistas en la técnica. Cuando el huésped es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse células competentes que son capaces de captar ADN a partir de células recogidas después de una fase de crecimiento exponencial y posteriormente tratadas mediante el método de CaCl_{2} mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse MgCl_{2} o RbCl. La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasto de la célula huésped o mediante electroporación.

Un polipéptido diana puede producirse en procariotas mediante la expresión de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Estos incluyen, aunque sin limitación, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido, o ADN de cósmido que codifican un polipéptido. Las construcciones pueden expresarse en E. coli a gran escala para ensayos in vitro. La purificación a partir de bacterias se simplifica cuando las secuencias incluyen marcas para purificación de una etapa mediante cromatografía de níquel- quelado. La construcción también puede contener una marca para simplificar el aislamiento del polipéptido. Por ejemplo, una marca de polihistidina de, por ejemplo, seis restos de histidina, puede incorporarse en el extremo amino terminal, o en el extremo carboxilo terminal, de la proteína. La marca de polihistidina permite el conveniente aislamiento de la proteína en una única etapa mediante cromatografía de níquel-quelado. El polipéptido diana también puede manipularse para contener un punto de escisión para ayudar en la recuperación de proteínas. Como alternativa, los polipéptidos pueden expresarse directamente en una célula huésped deseada para ensayos in situ.

Cuando el huésped es un eucariota, pueden usarse métodos de transfección de ADN tales como co-precipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales, tales como microinyección, electroporación o técnicas biolísticas, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores virales. Las células eucariotas también pueden cotransfectarse con secuencias de ADN que codifican un polipéptido, y una segunda molécula de ADN extraña que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de timidina quinasa de herpes simplex. Otro método es usar un vector viral eucariota, tal como virus de simio 40 (SV40) o virus del papiloma bovino, para infectar o transformar transitoriamente células eucariotas y expresar la proteína. (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Preferiblemente, se utiliza un huésped eucariota como célula huésped, como se describe en este documento. Los sistemas eucariotas, y preferiblemente sistemas de expresión de mamífero, permiten que se produzcan las modificaciones post-traduccionales apropiadas de proteínas de mamífero expresadas. Las células eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del transcrito primario, glicosilación, fosforilación y ventajosamente secreción del producto génico, deben usarse como células huésped para la expresión del polipéptido. Dichas líneas de célula huésped pueden incluir, aunque sin limitación, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293 y WI38.

Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con el ADNc que codifica un polipéptido diana controlado mediante elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, puntos de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante otorga resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Por ejemplo, después de la introducción de ADN extraño, puede dejarse crecer a las células manipuladas durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de timidina quinasa de virus herpes simplex (Wigler et al., Cell, 11: 223,1977), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026, 1962), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell, 22: 817, 1980) que pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse resistencia antimetabolito como la base de selección para dhfr, que otorga resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527, 1981); gpt, que otorga resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072,1981; neo, que otorga resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1, 1981); e hygro, que otorga resistencia a genes de higromicina (Santerre et al., Gene, 30: 147, 1984). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8047, 1988); y ODC (ornitina descarboxilasa), que otorga resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO
(McConlogue L, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987).

Las técnicas para el aislamiento y purificación de polipéptidos expresados por microbios o por eucariotas pueden ser cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones por cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas, tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales o antígeno.

Un polinucleótido diana, o construcción de expresión que contiene un polinucleótido diana, puede atraparse en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso y se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan auto-redisposición antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas. El liposoma puede complejarse con un virus hemoaglutinante (HVJ). Esto ha demostrado facilitar la fusión con la membrana celular y promover la entrada en la célula de ADN encapsulado en liposomas. El liposoma puede complejarse o emplearse junto con proteínas cromosómicas nucleares no histona (HMG-1). Además, el liposoma puede complejarse o emplearse junto con HVJ y Hug-1. Puesto que dichas construcciones de expresión se han empleado con éxito en la transferencia y expresión de ácidos nucleicos in vitro e in vivo, entonces son aplicables. Cuando se emplea un promotor bacteriano en la construcción de ADN, también será deseable incluir en el liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.

La presente invención describe métodos para permitir la creación de un polinucleótido diana en base solamente a información, es decir sin el requisito de genes, moléculas de ADN o genomas existentes. Generalmente, usando software informático, es posible construir un polinucleótido virtual en el ordenador. Este polinucleótido consta de una sucesión de bases de ADN, G, A, T o C, comprendiendo por ejemplo una secuencia de polinucleótido completa artificial en una sucesión lineal. Después de la construcción de una secuencia, se usa a continuación software informático para analizar la secuencia diana dividiéndola en un conjunto de oligonucleótidos solapantes de longitud especificada. Etapas opcionales en el ensamblaje de secuencias incluyen identificar y eliminar secuencias que pueden dar origen a horquillas, repeticiones u otras secuencias que son indeseables. Por lo tanto, el éxito en la construcción de un gen grande puede mejorarse sustancialmente mediante el pre-cribado de secuencias para regiones o áreas difíciles. En pocas palabras, se usa una secuencia de aminoácidos para generar una secuencia génica sintética usando codones de E. coli de clase II. Antes del análisis de la secuencia, varias subrutinas se aplican a la secuencia para identificar tipos específicos de disposiciones de secuencia que podrían provocar la terminación temprana de la síntesis de oligonucleótidos, dificultad o baja eficacia de ligamiento o síntesis, estructuras secundarias inusuales o atípicas. Se usan programas para analizar la secuencia e identificar:

Cualquier región de más de 25 pares de bases con un contenido de GC de más del 70%

Cualquier secuencia 3' o 5' terminal que podría formar un híbrido de "horquilla" de más de 7 pares de bases, permitiendo un bucle de hasta 4 pares de bases.

Cualquier secuencia de 8 o más pares de bases que tiene una repetición invertida perfecta en un intervalo de 50 pb, de modo que pueda formarse una horquilla interna.

Después de la identificación, la secuencia se ajusta manualmente de la siguiente manera. Se cambiarán terceras bases de codones para eliminar horquillas o reducir el número de bases emparejadas en la horquilla a menos de cinco bases contiguas.

Cuando sea posible, se cambiarán terceras bases de codones, dejando la secuencia de aminoácidos sin cambios, para reducir el contenido de GC de una región a menos del 65% a lo largo de 20 bases.

Cuando sea posible, se realizarán cambios de tercera base, manteniendo igual a la secuencia de aminoácidos, para eliminar híbridos internos o reducir el número de bases coincidentes a menos de 7.

La secuencia de ADN sintética resultante seguirá codificando la misma proteína pero el uso del codón se ajustará para eliminar estructuras de secuencia que podrían causar errores de ensamblaje, podrían rebajar la eficacia de ensamblaje o causar otro tipo de problemas en el procedimiento técnico de la síntesis y el ensamblaje de genes.

El posterior análisis de la secuencia diana da como resultado un conjunto de secuencias de ADN más cortas que se solapan para abarcar toda la longitud del polinucleótido diana en conjuntos solapantes.

Típicamente, un gen de 1000 pares de bases se dividiría en 20 100- meros donde 10 de estos comprenden una cadena y 10 de estos comprenden la otra cadena. Estos se seleccionarían para solaparse en cada cadena en de 25 a 50 pares de bases.

La degeneración del código genético permite una libertad sustancial en la elección de codones para cualquier secuencia de aminoácidos particular. Los organismos transgénicos tales como plantas frecuentemente prefieren codones particulares que, aunque codifican la misma proteína, pueden diferir de los codones en los organismos de los que se obtuvo el gen. Por ejemplo, la Patente de Estados unidos Nº 5.380.831 de Adang et al., describe la creación de plantas transgénicas resistentes a insectos que expresan el gen de la toxina de Bacillus thuringiensis (Bt). La proteína cristalina de Bt, una toxina para insectos, es codificada por un gen de longitud completa que se expresa mal en plantas transgénicas. Para mejorar la expresión en plantas, un gen sintético que codifica la proteína que contiene codones preferidos en plantas se sustituyó con la secuencia natural. La invención descrita en ese documento comprendía un gen sintetizado químicamente que codifica una proteína intersticial que frecuentemente es equivalente a una proteína intersticial nativa de Bt. El gen sintético se diseñó para expresarse en plantas a un nivel superior a un gen de Bt nativo.

Al diseñar un polinucleótido diana que codifica un polipéptido particular, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos al otorgar función biológica interactiva en una proteína se entiende de modo general en la técnica. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga, estos son: Isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (47); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (45).

En la técnica se sabe que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y siguen dando como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, seguir obteniendo una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1, y se prefieren aún más aquellos dentro de \pm0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente en base a la hidrofilicidad. La Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101 afirma que la mayor hidrofilicidad local media de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (44); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (45); histidina (-0.5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (1.5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse con otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y seguir obteniendo un polipéptido biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En dichas cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de +0,5.

Como se ha resumido anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones ejemplares que tienen en cuenta diversas de las anteriores características son bien conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Puede usarse la implementación en hardware o software, o una combinación de ambos. Sin embargo, preferiblemente, los algoritmos y procesos se implementan en uno o más programas informáticos que se ejecutan en ordenadores programables comprendiendo cada uno al menos un procesador, al menos un sistema de almacenamiento de datos (incluyendo memoria volátil y no volátil y/o elementos de almacenamiento), al menos un dispositivo de entrada, y al menos un dispositivo de salida. Se aplica el código del programa a los datos de entrada para realizar las funciones descritas en este documento y generar información de salida. La información de salida se aplica a uno o más dispositivos de salida, de manera conocida.

Cada programa puede implementarse en cualquier lenguaje informático (incluyendo lenguajes de programación máquina, de ensamblaje, de alto nivel, u orientado a un objeto) para comunicar con un sistema informático. En cualquier caso, el lenguaje puede ser un lenguaje compilado o interpretado.

Cada uno de dichos programas informáticos se almacena preferiblemente en un medio o dispositivo de almacenamiento (por ejemplo, ROM, CD-ROM, cinta, o disco magnético) legible por un ordenador programable de uso general o específico, para configurar y manejar el ordenador cuando el medio o dispositivo de almacenamiento es leído por el ordenador para realizar los procedimientos descritos en este documento. El sistema también puede considerarse para implementarlo como un medio de almacenamiento legible por ordenador, configurado con un programa informático, donde el medio de almacenamiento configurado de este modo hace que un ordenador funcione de una manera específica y predefinida para realizar las funciones descritas en este documento.

Por lo tanto, se describe un programa informático, almacenado en un medio legible por ordenador, para generar una secuencia de polinucleótido diana. El programa informático incluye instrucciones para hacer que un sistema informático: 1) identifique una secuencia de polinucleótido de iniciación contenida en la secuencia del polinucleótido diana; 2) analice la secuencia del polinucleótido diana en múltiples oligonucleótidos distintos, parcialmente complementarios; y 3) controle el ensamblaje de la secuencia del polinucleótido diana controlando la extensión bidireccional de la secuencia del polinucleótido de iniciación mediante la adición secuencial de oligonucleótidos parcialmente complementarios, dando como resultado un polinucleótido de cadena doble contiguo. El programa informático contendrá un algoritmo para analizar la secuencia del polinucleótido diana generando un conjunto de oligonucleótidos correspondiente a una secuencia polipeptídica. El algoritmo utiliza una secuencia polipeptídica para generar una secuencia de ADN usando una tabla de codones especificada. El algoritmo genera a continuación un conjunto de oligonucleótidos analizados correspondientes a las cadenas (+) y (-) de la secuencia de ADN de la siguiente manera:

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1. La secuencia de ADN GENE[ ], una matriz de bases, se genera a partir de la secuencia de proteína AA[ ], una matriz de aminoácidos, usando una tabla de codones especificada. Un ejemplo de la tabla de codones para codones de E. coli de tipo II, se enumera a continuación.

a. Parámetros

i.: N Longitud de la proteína en restos de aminoácidos

ii.: L = 3N Longitud del gen en bases de ADN

iii.: Q Longitud de cada oligonucleótido componente

iv.: X = Q/2 Longitud de solapamiento entre oligonucleótidos

v.: W = 3N/Q Número de oligonucleótidos en el conjunto F

vi.: Z = 3N/Q + 1 Número de oligonucleótidos en el conjunto R

vii.: F [1 : W] conjunto de oligonucleótidos de cadena (+)

viii.: R [L : Z] conjunto de oligonucleótidos de cadena (-)

ix.: AA [1 : N] matriz de restos de aminoácidos

x.: GENE [1 : L] matriz de bases que comprende el gen

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b. Obtener o diseñar una secuencia de proteína AA[ ] constituida por una lista de restos de aminoácidos.

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c. Generar la secuencia de ADN, GENE[ ], a partir de la secuencia de proteína, AA[ ]

i.: Para I = 1 a N

ii.: Traducir AA [J] a partir de la tabla de codones que general GENE [I: I + 2]

iii.: I = I + 3

iv.: J = J + 1

v.: Ir a ii

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2. Dos conjuntos de oligonucleótidos solapantes se generan a partir de GENE[ ]; F [ ] abarca la cadena (+) y R[ ] es un conjunto complementario, parcialmente solapante que abarca la cadena (-).

a. Generar el conjunto F[] de oligonucleótidos

i.: Para I = 1 a W

ii.: F[I] = GENE[I : I + Q - 1]

iii.: I = I + Q

iv.: Ir a ii

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b. Generar el conjunto R de oligonucleótidos

i.: J = W

ii.: Para I = 1 a W

iii.: R[I] = GENE [W : W - Q]

iv.: J = J - Q

v.: Ir a iii

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c. El resultado es dos conjuntos de oligonucleótidos F[] y R [] de longitud Q

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d. Generar los dos oligonucleótidos finales

i.: S [1] = GENE [Q/2 : 1]

ii.: S [2] = GENE [L - Q/2 : L]

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Posteriormente, si se desea, el ensamblaje del conjunto de oligonucleótidos puede establecerse mediante el siguiente algoritmo: Dos conjuntos de oligonucleótidos F[1 : W] R[1 : Z] S[1 : 2]

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3. Etapa 1

a. Para I = 1 a W

b. Hibridar F[I], F[I + 1], R[I]; colocar en T [I]

c. Hibridar F[I + 2], R[I + 1], R[I + 2] T[I + 1]

d. I = I + 3

e. Ir a b

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4. Etapa 2

a. Realizar lo siguiente hasta que sólo quede una única reacción

i.: Para I = 1 a W/3

ii.: Ligar T [I], T [I + 1]

iii.: I = I + 2

iv.: Ir a ii

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA DE CODONES (uso preferido de E. coli de Clase 11)

1

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Los algoritmos útiles para el ensamblaje de un polinucleótido diana pueden describirse además como la sucesión "Perl script" como se muestra a continuación. El ALGORITMO 1 proporciona un método para convertir una secuencia de proteína en una secuencia de polinucleótido usando codones de E. coli:

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100

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La siguiente lista proporciona la preferencia de codones de clase II en Perl para E. coli

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2

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El ALGORITMO 2 proporciona un método para analizar una secuencia de polinucleótido en oligonucleótidos componentes directos e inversos que pueden ensamblarse de nuevo en un polinucleótido diana completo que codifica un polipéptido diana:

101

102

103

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También se describe un método asistido por ordenador para sintetizar un polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana obtenido de una secuencia modelo usando un ordenador programado que incluye un procesador, un dispositivo de entrada y un dispositivo de salida, introduciendo en el ordenador programado, a través del dispositivo de entrada, datos que incluyen al menos una porción de la secuencia del polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana. Posteriormente, la secuencia de al menos un polinucleótido de iniciación presente en la secuencia del polinucleótido diana se determina y se obtiene un modelo para sintetizar la secuencia del polinucleótido diana. El modelo se basa en la posición de la secuencia de iniciación en la secuencia del polinucleótido diana usando parámetros de secuencia globales necesarios para la expresión del polipéptido diana en un sistema biológico. La información se extrae a un dispositivo de salida que proporciona los medios para sintetizar y ensamblar un polinucleótido
diana.

Se entiende que cualquier aparato adecuado para la síntesis de polinucleótidos puede usarse en la presente invención. Diversos ejemplos no limitantes de aparatos, componentes, ensamblajes y métodos se describen a continuación. Por ejemplo, en una realización, se contempla que pueda usarse un cabezal de nanodispensado con hasta 16 válvulas para depositar productos químicos de síntesis en recipientes de ensamblaje (Figura 4). Los productos químicos pueden controlarse usando una bomba de jeringa desde el depósito de reactivos. Debido a la velocidad y capacidad del sistema de dispensado por chorro de tinta, la síntesis puede hacerse muy pequeña y muy rápida. Por debajo de las cámaras de reacción hay un conjunto de recipientes de ensamblaje unidos a microcanales que moverán fluidos mediante microfluídica. La configuración de los canales mezclará pares y estructuras triples de oligonucleótidos sistemáticamente usando, por ejemplo, un dispositivo robotizado. Sin embargo, el mezclado puede realizarse usando fluídica y sin partes móviles.

Como se muestra en la figura 5, síntesis de oligonucleótidos, el ensamblaje de oligonucleótidos mediante mezclado e hibridación, y ligamiento puede realizarse usando mezclado por microfluídica, dando como resultado el mismo conjunto de intermedios críticos de estructura triple que sirve como sustrato para hibridación, ligamiento y unión de oligonucleótidos. La ADN ligasa y otros componentes pueden colocarse en el fluido tampón que se mueve a través de las microcámaras del instrumento. Por lo tanto, la síntesis y el ensamblaje pueden realizarse de manera muy controlada en el mismo instrumento.

Como se muestra en la figura 6, el colector de mezclado puede producirse de plástico no poroso y diseñarse para controlar el mezclado secuencial de oligonucleótidos sintetizados en matrices. El análisis de oligonucleótidos a partir de una secuencia génica diseñada en el ordenador puede programarse para síntesis en la que las cadenas (+) y (-) se colocan en pocillos alternos de la matriz. Después de la síntesis en este formato, las secuencias de 12 filas del gen se dirigen al colector de mezclado que mezcla sistemáticamente tres pocillos en recipientes de reacción formando la estructura crítica triple. Después del ciclado de temperatura para hibridación y ligamiento, se mezclan cuatro conjuntos de estructura triple en 2 conjuntos de 6 productos de oligonucleótido, a continuación 1 conjunto de 12 productos de oligonucleótidos. Cada fila de la matriz sintética se asocia con un colector similar dando como resultado la primera fase de ensamblaje de 8 conjuntos de oligonucleótidos ensamblados que representan 12 oligonucleótidos cada uno. Como se muestra en la figura 7, la segunda fase de mezclado en colector está controlada mediante un único colector que mezcla los ensamblajes de 8 filas en un único ensamblaje completo. El paso de los componentes de oligonucleótidos a través de los dos colectores de ensamblajes (el primero de 8 y el segundo único) da como resultado el ensamblaje completo de los 96 oligonucleótidos de la matriz. El módulo de ensamblaje (Figura 8) de Genewriter^{TM} puede incluir un conjunto completo de 7 colectores de mezclado producido usando microfabricación en un único bloque de plástico que se asienta por debajo de los recipientes de síntesis. Diversas configuraciones del colector de mezclado permitirán el ensamblaje de matrices de 96, 384 ó 1536 pocillos de oligonucleótidos componentes ana-
lizados.

La configuración inicial está diseñada para el ensamblaje de 96 oligonucleótidos sintetizados en una matriz predefinida, constituida por 48 pares de 50-meros solapantes. El paso a través del dispositivo de ensamblaje en presencia de ADN ligasa y otros componentes químicos tamponantes apropiados, y con controles de temperatura apropiados en el dispositivo, los ensamblará en un único ensamblaje génico de cadena doble de 2400 bases (Figura 9). El diseño básico de dispositivo de mezclado puede estar hecho de Plexiglas^{TM} u otro tipo de copolímero con microsurcos o canales de microfluídica grabados en la superficie y con un elemento de control de la temperatura tal como un circuito Peltier por debajo de la unión de los canales. Esto da como resultado un recipiente de micro-reacción en la unión de dos canales para 1) mezclado de los dos chorros, 2) mantenimiento a temperatura controlada o ciclado en el punto de la unión y 3) expulsión de la mezcla ligada desde el canal de salida al siguiente conjunto de cámaras de mezclado y
ligamiento.

Como se muestra en la figura 11, el diseño de la plataforma de ensamblaje puede constar de 8 placas de micropocillos de síntesis en una configuración de 96 pocillos, a las que se dirigen 16 canales de microdispensado. Por debajo de cada placa hay: 1) un colector de evacuación para retirar componentes de síntesis; y 2) un colector de ensamblaje basado en el esquema de la figura 9 para ensamblar oligonucleótidos componentes de cada matriz de 96 pocillos. La figura 12 muestra un formato de ensamblaje de mayor capacidad que usa microplacas de 1536 pocillos y capaz de la síntesis de 1536 oligonucleótidos componentes por placa. Debajo de cada placa hay: 1) un colector de evacuación para retirar componentes de síntesis; y 2) un colector de ensamblaje para ensamblar 1536 oligonucleótidos componentes de cada placa de 1536 pocillos. Las estrategias de mezclado y ensamblaje pueden basarse en los conceptos usados para placas de 96 pocillos.

Un formato de ensamblaje alternativo incluye el uso de síntesis de oligonucleótidos unidos a la superficie en lugar de síntesis soluble en perlas de vidrio CPG (Figura 13). En esta configuración, los oligonucleótidos se sintetizan con un enlazador de hidrocarburo que permite la unión a un soporte sólido. Después del análisis de secuencias componentes y la síntesis, los oligonucleótidos sintetizados se unen covalentemente a un soporte sólido de modo que el estabilizante se une y los dos sustratos de ligamiento se añaden a la solución de revestimiento. El ligamiento se produce según media el ADN en la solución y el aumento de la temperatura por encima de la Tm retira los oligonucleótidos enlazados mediante fusión térmica. Como se muestra en la figura 14 el ensamblaje sistemático sobre un soporte sólido de un conjunto de oligonucleótidos componentes analizados puede disponerse en una matriz con el conjunto de oligonucleótidos estabilizantes unidos. El conjunto de oligonucleótidos de sustrato de ligamiento se colocan en la solución y el ensamblaje sistemático se realiza en la fase sólida mediante hibridación, ligamiento y fusión secuencial que mueve las moléculas de ADN en desarrollo a través de la superficie de membrana.

La figura 15 muestra un medio alternativo adicional para el ensamblaje de oligonucleótidos, uniendo los oligonucleótidos componentes a un conjunto de electrodos metálicos en un chip microelectrónico, donde cada electrodo puede controlarse independientemente con respecto a la corriente y al voltaje. La matriz contiene el conjunto de oligonucleótidos de cadena menos. La colocación de una carga positiva en el electrodo moverá mediante electroforesis el oligonucleótido sustrato de ligasa componente sobre la superficie en la que tiene lugar la hibridación. La presencia de ADN ligasa media en la unión o ligamiento covalente de los componentes. A continuación se apaga el electrodo o se aplica una carga negativa y la molécula de ADN es expulsada del electrodo. El siguiente elemento de la matriz que contiene el siguiente oligonucleótido estabilizante del conjunto analizado se enciende con una carga positiva y se realiza una segunda hibridación, unión y ligamiento con el siguiente oligonucleótido en el conjunto. La aplicación sistemática y repetitiva de control de voltaje, hibridación, ligamiento y desnaturalización dará como resultado el movimiento de la cadena en desarrollo a través de la superficie así como el ensamblaje de los componentes en una molécula de ADN completa.

Se describen además métodos para la síntesis automatizada de polinucleótidos diana. Por ejemplo, una secuencia deseada puede ordenarse mediante cualquier medio de comunicación disponible para un usuario que desea ordenar dicha secuencia. Un "usuario", como se usa en este documento, es una entidad capaz de comunicar una secuencia de polinucleótido deseada a un servidor. La secuencia puede transmitirse mediante cualquier medio de comunicación disponible para el usuario y que pueda ser recibido por un servidor. Al usuario se le puede proporcionar una única designación de modo que el usuario pueda obtener información respecto a la síntesis del polinucleótido durante la síntesis. Una vez obtenida, la secuencia de polinucleótido diana transmitida puede sintetizarse mediante cualquier método mostrado en la presente invención.

Se describe aún más un método para la síntesis automatizada de un polinucleótido, proporcionando al usuario un mecanismo para comunicar una secuencia de polinucleótido modelo y opcionalmente proporcionando al usuario una oportunidad de comunicar al menos una modificación deseada a la secuencia modelo. La invención prevé un usuario que proporciona una secuencia modelo y una modificación deseada a esa secuencia que da como resultado la alteración de la secuencia modelo. Cualquier modificación que altera la expresión, función o actividad de un polinucleótido diana o polipéptido diana codificado puede ser comunicada por el usuario de modo que se sintetiza un polinucleótido o polipéptido modificado de acuerdo con un método de la invención. Por ejemplo, un polinucleótido modelo que codifica un polipéptido que se expresa normalmente en un sistema eucariota puede alterarse de modo que los codones del polinucleótido diana resultante conducen a la expresión del polipéptido en un sistema procariota. Además, el usuario puede indicar una actividad modificada deseada de un polipéptido codificado por un polinucleótido modelo. Una vez proporcionados, los métodos de la presente invención pueden usarse para sintetizar un polinucleótido diana que codifica un polipéptido diana que se cree que tiene la actividad modificada deseada. Los métodos pueden utilizarse además para expresar el polipéptido diana y para cribar en busca de la actividad deseada. Se entiende que los métodos proporcionan un medio para la evolución sintética, con lo que cualquier parámetro de la expresión de polinucleótidos y/o actividad de polipéptidos puede alterarse según se desee.

Una vez que la secuencia modelo transmitida y la modificación deseada son proporcionadas por el usuario, los datos que incluyen al menos una porción de la secuencia de polinucleótido modelo se introducen en un ordenador programado, a través de un dispositivo de entrada. Una vez introducidos, los algoritmos de la invención se usan para determinar la secuencia de la secuencia de polinucleótido modelo que contiene la modificación deseada y que da como resultado un polinucleótido diana que contiene la modificación. Posteriormente, el procesador y los algoritmos se usan para identificar al menos una secuencia de polinucleótido de iniciación presente en la secuencia de polinucleótido. Se identifica y se sintetiza un polinucleótido diana (es decir, un polinucleótido modelo modificado).

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Ejemplos Protocolo de Diseño de Síntesis de Ácido Nucleico

Con el fin de ensamblar una secuencia de ácido nucleico sintética que codifica un polipéptido diana, una secuencia de polipéptido modelo o secuencia de ácido nucleico se obtiene y se analiza usando un paquete de análisis de ADN adecuado, tal como, por ejemplo, MacVector o DNA Star. Si la proteína diana se va a expresar en un sistema bacteriano, por ejemplo, la secuencia modelo puede convertirse en una secuencia que codifica un polipéptido que utiliza codones preferidos de E. coli (es decir, preferencia por codones de Tipo I, Tipo II o Tipo II). Se describen los programas de conversión Codon I, Codon II o Codon III. Sin embargo, puede diseñarse una secuencia de ácido nucleico para alojar cualquier preferencia de codones de cualquier organismo procariota o eucariota.

Además de las anteriores preferencias de codones, pueden incluirse secuencias promotoras, potenciadoras, de replicación o de resistencia a fármacos específicas en una secuencia de ácido nucleico sintética. La longitud de la construcción puede ajustarse mediante rellenado para dar un número redondo de bases en base a la síntesis de aproximadamente 25 a 100 pb. La síntesis de secuencias de aproximadamente 25 a 100 pb de longitud puede fabricarse y ensamblarse usando el sistema sintetizador de matrices y puede ser útil sin purificación adicional. Por ejemplo, dos placas de 96 pocillos que contienen 100-meros podrían dar una construcción de 9600 pb de una secuencia
diana.

Posteriormente al diseño de los oligonucleótidos necesarios para el ensamblaje de la secuencia diana, los oligonucleótidos se analizan usando ParseOligo^{TM}, un programa informático de marca registrada que optimiza el ensamblaje de secuencias de ácido nucleico. Las etapas opcionales en el ensamblaje de secuencias incluyen identificar y eliminar secuencias que pueden dar origen a horquillas, repeticiones u otras secuencias difíciles. La lista de oligonucleótidos analizados se transfiere al software controlador del sintetizador. Los oligonucleótidos individuales se analizan en los pocillos y se realiza la síntesis de oligonucleótidos.

El programa ParseOligo lee una secuencia de ADN de un archivo y la analiza en dos conjuntos de oligonucleótidos, un conjunto directo y uno inverso, para el ensamblaje de genes sintéticos.

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El formato del archivo de entrada en el siguiente:

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104

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Ensamblaje de Oligonucleótidos Analizados Usando una Reacción de PCR de dos Etapas

Obtener conjuntos en matrices de oligonucleótidos solapantes analizados, de 50 bases cada uno, con un solapamiento de aproximadamente 25 pares de bases (pb). La concentración de oligonucleótidos es de 250 nM (250 \muM/ml). Los oligonucleótidos de 50 bases dan T_{m}S de 75 a 85 grados C, de 6 a 10 do_{260}, de 11 a 15 nanomoles, de 150 a 300 \mug. Se resuspenden en de 50 a 100 \mul de H_{2}O para preparar 250 nM/ml. Combinar cantidades iguales de cada oligonucleótido a una concentración final de 250 \muM (250 nM/ml). Añadir 1 \mul de cada para dar 192 \mul. Añadir 8 \mul de dH_{2}O (agua desionizada) para llegar hasta 200 \mul. La concentración final es de 250 \muM de oligonucleótidos mezclados. Diluir 250 veces tomando 10 \mul de oligonucleótidos mezclados y añadir a 1 ml de agua. (1/100; 2.5 mM) a continuación tomar 1 \mul de esto y añadir a 24 \mul de mezcla de PCR 1x. La reacción de PCR incluye:

TRIS-HCl 10 mM, pH 9,0

MgCl_{2},2 mM

KCI 50 mM

dNTP 0,2 mM cada

Triton X-100 al 0,1%

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Una U Taq1 polimerasa se añade a la reacción. La reacción se termocicla en las siguientes condiciones

a. Ensamblaje

i.: 55 ciclos de

1.: 94 grados 30 s

2.: 52 grados 30 s

3.: 72 grados 30 s

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Después de la amplificación de ensamblaje, tomar 2,5 \mul de esta mezcla de ensamblaje y añadir a 100 \mul de mezcla de PCR. (dilución 40x). Preparar cebadores externos tomando 1 \mul de F1 (cebador directo) y 1 \mul de R96 (cebador inverso) a 250 \muM (250 nm/ml-250 nmoles/\mul) y añadir a los 100 \mul de reacción de PCR. Esto da una concentración final de 2,5 \muM cada oligonucleótido. Añadir 1 U Taq1 polimerasa y termociclar en las siguientes condiciones:

3

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Extraer con fenol/cloroformo. Precipitar con etanol. Resuspender en 10 \mul de dH_{2}O y analizar en un gel de agarosa.

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Ensamblaje de Oligonucleótidos Analizados Usando Ligamiento con Taq1

Se obtienen conjuntos en matriz de oligonucleótidos solapantes analizados de aproximadamente 25 a 150 bases de longitud cada uno, con un solapamiento de aproximadamente 12 a 75 pares de bases (pb). La concentración de oligonucleótidos es de 250 nM (250 pM/ml). Por ejemplo, los oligonucleótidos de 50 bases dan T_{m}s de 75 a 85 grados C, 6 a 10 de do_{260}, de 11 a 15 nanomoles, de 150 a 300 \mug. Resuspender en de 50 a 100 ml de H_{2}O para preparar
250 nM/ml.

Usando una estación de trabajo robotizada, se combinan por parejas cantidades iguales de oligonucleótidos directos e inversos. Tomar 10 \mul de oligonucleótido directo y 10 \mul de inverso y mezclar en una nueva placa de 96 pocillos de fondo en v. Esto da una matriz con conjuntos de oligonucleótidos de estructura doble a 250 \muM, de acuerdo con la Etapa 1 del esquema de mezclado en la Tabla 1. Preparar una placa de ensamblaje tomando 2 \mul de cada par de oligómeros y añadir a una nueva placa que contiene 100 \mul de mezcla de ligamiento en cada pocillo. Esto da una concentración efectiva de 2,5 \muM o 2,5 nM/ml. Transferir 20 \mul de cada pocillo a una nueva placa de micropocillos y añadir 1 \mul de T4 polinucleótido quinasa y 1 \mul de ATP 1 mM a cada pocillo. Cada reacción tendrá 50 pmoles de oligonucleótido y 1 nmol de ATP. Incubar a 37 grados C durante 30 minutos.

Iniciar el ensamblaje de acuerdo con las Etapas 2-7 de la Tabla 1. Realizar la Etapa 2 de mezclado mezclando cada pocillo sucesivo con el siguiente. Añadir 1 \mul de Taq1 ligasa a cada pocillo mezclado. Ciclar una vez a 94 grados durante 30 segundos; 52 grados durante 30 s; a continuación 72 grados durante 10 minutos.

Realizar la etapa 3 (Tabla 1) del esquema de mezclado y ciclar de acuerdo con el esquema de temperatura anterior. Realizar las etapas 4 y 5 del esquema de mezclado y ciclar de acuerdo con el esquema de temperatura anterior. Realizar la etapa 6 del esquema de mezclado y tomar 10 \mul de cada mezcla a un nuevo micropocillo. Realizar la etapa 7 del esquema de mezclado mezclando los tres pocillos restantes. Los volúmenes de reacción serán:

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A continuación se realizó una amplificación final por PCR tomando 2 \mul de mezcla de ligamiento final y añadir a 20 \mul de mezcla de PCR que contiene TRIS-HCl 10 mM, pH 9,0, MgCl_{2} 2,2 mM, KCl 50 mM, dNTP 0,2 mM cada y Triton X-100 al 0,1%.

Preparar cebadores externos tomando 1 \mul de F1 (cebador directo) y 1 \mul de R96 (cebador inverso) a 250 \muM (250 nm/ml-250 nmoles/\mul) y añadir a los 100 \mul de reacción de PCR dando una concentración final de 2,5 \muM cada oligonucleótido. Añadir 1 U Taq1 polimerasa y ciclar durante 35 ciclos en las siguientes condiciones: 94 grados durante 30 s; 50 grados durante 30 s; y 72 grados durante 60 s. Extraer la mezcla con fenol/cloroformo. Precipitar con etanol. Resuspender en 10 \mul de dH_{2}O y analizar en un gel de agarosa.

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TABLA 1 Esquema de mezclado para ensamblaje por ligamiento

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Ensamblaje de Oligonucleótidos Analizados Usando Síntesis y Ensamblaje con Taq1

Se obtienen conjuntos en matriz de oligonucleótidos solapantes analizados de aproximadamente 25 a 150 bases de longitud cada uno, con un solapamiento de aproximadamente 12 a 75 pares de bases (pb). La concentración de oligonucleótidos es desde 250 nM (250 \muM/ml). Los oligonucleótidos de 50 bases dan T_{m}s de 75 a 85 grados C, de 6 a 10 do_{260}, de 11 a 15 nanomoles, de 150 a 300 \mug. Resuspender en de 50 a 100 ml de H_{2}O para preparar
250 nM/ml.

La invención prevé el uso de una estación de trabajo robotizada para realizar el ensamblaje de ácido nucleico. En el presente ejemplo, se preparan dos placas de trabajo que contienen oligonucleótidos directos e inversos en una mezcla de PCR a 2,5 mM y 1 \mul de cada oligonucleótido se añade a 100 \mul de mezcla de PCR en un nuevo micropocillo proporcionando una placa de oligonucleótido directo y una de inverso en una matriz. A continuación se inicia el ensamblaje por ciclado de la siguiente manera de acuerdo con el esquema de mezclado descrito en la Tabla 1. En el presente ejemplo, pueden realizarse 96 ciclos de ensamblaje de acuerdo con este esquema.

Retirar 2 \mul del pocillo F-E1 y transferir a un nuevo pocillo; retirar 2 \mul de R-E1 y transferir a un nuevo pocillo; añadir 18 \mul de mezcla de PCR 1x; añadir 1 U de Taq1 polimerasa;

Ciclar una vez:: 94 grados 30 s

\quad: 52 grados 30 s

\quad: 72 grados 30 s

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Posteriormente, retirar 2 \mul del pocillo F-E2 y transferir al recipiente de reacción; retirar 2 \mul del pocillo R-D12 y transferir al recipiente de reacción. Ciclar una vez de acuerdo con las temperaturas anteriores. Repetir el mezclado y el ciclado de acuerdo con el esquema descrito en la Tabla 1 durante aproximadamente 96 ciclos.

A continuación se realiza una amplificación por PCR tomando 2 \mul de mezcla de reacción final y añadiéndolos a 20 \mul de una mezcla de PCR que comprende:

TRIS-HCl 10 mM, pH 9,0

MgCl2 2,2 mM

KCI 50 mM

dNTP 0,2 mM cada

Triton X-100 al 0,1%

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Se preparan cebadores externos tomando 1 \mul de F1 y 1 ml de R96 a 250 mM (250 nm/ml-250 nmoles/ml) y añadir a los 100 \mul de reacción de PCR. Esto da una concentración final de 2,5 \muM cada oligonucleótido. Posteriormente se añade 1 U Taq1 polimerasa y la reacción se cicla durante aproximadamente 23 a 35 ciclos en las siguientes condiciones:

94 grados 30 s

50 grados 30 s

72 grados 60 s

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La reacción se extrae posteriormente con fenol/cloroformo, se precipita con etanol y se resuspende en 10 ml de dH2O para análisis en un gel de agarosa.

Se añaden cantidades iguales de oligonucleótidos directo e inverso por parejas tomando 10 \mul de oligonucleótido directo y 10 \mul de inverso y se mezclan en una nueva placa de 96 pocillos de fondo en v. Esto proporciona una matriz con conjuntos de oligonucleótidos de cadena doble a 250 mM, de acuerdo con la Etapa 1 del esquema de mezclado en la Tabla 1. Se preparó una placa de ensamblaje tomando 2 \mul de cada par de oligómeros y añadiéndolos a la placa que contiene 100 \mul de mezcla de ligamiento en cada pocillo. Esto da una concentración efectiva de 2,5 \muM o 2,5 nM/ml. Aproximadamente 20 \mul de cada pocillo se transfieren a una nueva placa de micropocillos además de 1 \mul de T4 polinucleótido quinasa y 1 \mul de ATP 1 mM. Cada reacción tendrá 50 pmoles de oligonucleótido y 1 nmol de ATP. Incubar a 37 grados durante 30 minutos. El ensamblaje del ácido nucleico se inició de acuerdo con las Etapas 2-7 de la Tabla 1. El mezclado de la Etapa 2 se realiza mezclando cada pocillo con el siguiente pocillo en sucesión. Se añade 1 \mul de Taq1 ligasa a cada pocillo mezclado y se cicla una vez de la siguiente manera:

94 grados 30 segundos

52 grados 30 s

72 grados 10 minutos

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La Etapa 3 del esquema de mezclado se realiza y se cicla de acuerdo con el esquema de temperatura anterior. Las Etapas 4 y 5 del esquema de mezclado se realizan y se ciclan de acuerdo con el esquema de temperatura anterior. Realizar la etapa 6 del esquema de mezclado y tomar 10 \mul de cada mezcla y transferir a un nuevo micropocillo. La Etapa 7 del esquema de mezclado se realiza mezclando los tres pocillos restantes. Los volúmenes de reacción serán (la placa inicial tiene 20 \mul por pocillo):

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Se realiza una amplificación final por PCR tomando 2 \mul de la mezcla final de ligamiento y añadiéndolos a 20 \mul de mezcla de PCR que comprende:

TRIS-HCl 10 mM, pH 9,0

MgCl2 2,2 mM

KCl 50 mM

dNTP 0,2 mM cada

Triton X-100 al 0,1%

Se preparan cebadores externos tomando 1 \mul de F1 y 1 \mul de R96 a 250 mM (250 nm/ml-250 nmoles/ml) y añadiéndolos a los 100 \mul de reacción de PCR dando una concentración final de 2,5 \muM para cada oligonucleótido. Posteriormente, se añade 1 U de Taq1 polimerasa y se cicla durante aproximadamente 23 a 35 ciclos en las siguientes condiciones:

94 grados 30 s

50 grados 30 s

72 grados 60 s

El producto se extrae con fenol/cloroformo, se precipita con etanol, se resuspende en 10 \mul de dH2O y se analiza en un gel de agarosa.

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TABLA 2 Esquema de mezclado para el ensamblaje usando Taq1 polimerasa (también topoisomerasa II)

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TABLA 3 Esquema de mezclado alternativo (que inicia el ensamblaje desde el extremo 5' o 3')

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Ensamblaje de Moléculas de Ácido Nucleico

Las moléculas de ácido nucleico que se enumeran en la Tabla 4 se produjeron usando los métodos descritos en este documento. Los elementos y características de cada molécula de ácido nucleico también se describen en la Tabla 4.

Como se describe en la Tabla 4, se ensambló un plásmido sintético de 4800 pb de longitud. El plásmido comprende 192 oligonucleótidos (dos conjuntos de 96 50-meros solapantes; 25 pb de solapamiento). El plásmido es esencialmente pUC que contiene resistencia a kanamicina en lugar de resistencia a ampicilina. El plásmido sintético también contiene genes lux A y B a partir del gen de luciferasa bacteriana de Vibrio fisheri. El plásmido SynPuc19 tiene 2700 pb de longitud comprendiendo una secuencia esencialmente idéntica a pUC19 acortada solamente hasta exactamente 2700 pb. Se usaron dos conjuntos de 96 50-meros para ensamblar el Synlux4. El plásmido pUC19 se acortó y se añadió el gen luxA. Se usaron 54 oligonucleótidos 100-meros que comprenden dos conjuntos de 27 oligonucleótidos para ensamblar el plásmido. El plásmido miniQE10 que comprende 2400 pb se ensambló usando 48 oligonucleótidos 50-meros. MiniQE10 es un plásmido de expresión que contiene una marca His 6x y un promotor bacteriano para expresión de polipéptidos de alto nivel. MiniQE10 se ensambló y se sintetizó usando el método de amplificación con Taq1 polimerasa. El plásmido microQE es un plásmido mínimo que contiene solamente un gen de ampicilina, un origen de replicación y un enlazador de plásmidos pQE. MicroQE se ensambló usando ligamiento combinatorio con 24 50-meros o con un tubo de aplicación por PCR. Las secuencias de ácido nucleico de SynFibI, SynFibB y SynFibG son fibrinógenos huma-
nos sintéticos fabricados usando codones de E. coli para optimizar la expresión en un sistema de expresión procariota.

TABLA 4 Moléculas de ácido nucleico sintéticas producidas usando los métodos de la invención

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Debe entenderse que, aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la anterior descripción pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define mediante el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble que comprende:

a): seleccionar un oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble, en el que dicho oligonucleótido de iniciación comprende al menos un saliente;

b): poner en contacto dicho oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble con un siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal, en el que dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es contiguo al oligonucleótido de iniciación y comprende al menos un saliente, y en el que al menos un saliente de dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es complementario a al menos un saliente de dicho oligonucleótido de iniciación;

c): repetir (b) para añadir secuencialmente el siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal al oligonucleótido de iniciación extendido, con lo que se sintetiza dicho polinucleótido de cadena doble,

en el que dicho oligonucleótido de iniciación en la etapa a) tiene un saliente 3' y uno 5', y/o

en el que dicho siguiente oligonucleótido más terminal tiene un saliente 3' y uno 5'.

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2. Un método de ensamblaje de un polinucleótido diana que comprende:

a): proporcionar una secuencia de polinucleótido diana;

b): identificar al menos un oligonucleótido de iniciación de cadena parcialmente doble presente en dicho polinucleótido diana; en el que dicho oligonucleótido de iniciación comprende un saliente 5' y un saliente 3';

c): identificar un siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal presente en dicho polinucleótido diana, en el que dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es contiguo al oligonucleótido de iniciación y comprende un saliente 5' y un saliente 3', en el que al menos un saliente de dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal es complementario a al menos un saliente de dicho oligonucleótido de iniciación;

d): poner en contacto dicho oligonucleótido de iniciación con dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal en condiciones y durante un periodo adecuados para la hibridación, en el que dicha secuencia de iniciación se extiende; y

e): repetir (a) a (d) para añadir secuencialmente el siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal al oligonucleótido de iniciación extendido, con lo que se sintetiza un polinucleótido diana.

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3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido de iniciación se extiende de manera bidireccional.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido de iniciación se extiende de manera unidireccional.

5. El método de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido de iniciación es el oligonucleótido 5' más terminal de dicho polipéptido diana.

6. El método de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido de iniciación es el oligonucleótido 3' más terminal de dicho polipéptido diana.

7. El método de la reivindicación 2, en el que el polinucleótido diana comprende una secuencia que codifica un polipéptido diana.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido diana es una proteína.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha proteína es una enzima.

10. El método de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido de iniciación comprende una secuencia identificada por un programa informático.

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho programa informático comprende un algoritmo que comprende las siguientes etapas:

a): analizar una secuencia de proteína codón por codón;

b): proporciona una secuencia génica sintética usando codones de E. coli de Tipo II;

c): analizar la secuencia de la etapa b) oligómero Q por oligómero Q en oligonucleótidos de longitud Q con solapamiento X para conjunto directo;

d): analizar la secuencia en oligonucleótido de longitud Q a partir de la cadena inversa que se solapa en X nucleótidos;

e): determinar la secuencia de fragmentos "suffer" de longitud Q/2 en el extremo de la secuencia INVERSA; y

f): sintetizar la secuencia usando sintetizadores de matriz.

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12. El método de la reivindicación 2, en el que dicho saliente complementario de dicho siguiente oligonucleótido de cadena doble más terminal comprende aproximadamente el cincuenta por ciento de la longitud de la cadena que tiene dicho saliente complementario.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicha cadena que tiene dicho saliente complementario tiene aproximadamente de 15 a 1000 nucleótidos de longitud.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha cadena que tiene dicho saliente complementario tiene aproximadamente de 20 a 500 nucleótidos de longitud.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicha cadena que tiene dicho saliente complementario tiene aproximadamente de 25 a 100 nucleótidos de longitud.

16. El método de la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido de iniciación está unido a un soporte sólido.

17. Un método de ensamblaje de un polinucleótido de cadena doble que comprende:

a): sintetizar químicamente un primer conjunto de oligonucleótidos que comprende una primera cadena de un polinucleótido de cadena doble;

b): sintetizar químicamente un segundo conjunto de oligonucleótidos que comprende una segunda cadena complementaria de dicho polinucleótido de cadena doble, cada uno de dichos oligonucleótidos en dicho segundo conjunto de oligonucleótidos solapándose con al menos un oligonucleótido en dicho primer conjunto de dichos oligonucleótidos y

c): hibridar dichos primer y segundo conjuntos de oligonucleótidos para producir un polinucleótido componente de cadena parcialmente doble;

d): repetir las etapas (a) a (c) para preparar una serie de polinucleótidos componentes de cadena parcialmente doble;

e): seleccionar al menos un polinucleótido componente de cadena parcialmente doble presente en dicho polinucleótido diana para que sirva como el polinucleótido de iniciación, en el que dicho polinucleótido de iniciación comprende un saliente 5' y un saliente 3';

f): añadir el siguiente polinucleótido componente más terminal, en el que dicho siguiente polinucleótido componente más terminal comprende al menos un saliente que es complementario a al menos un saliente del polinucleótido de iniciación;

g): poner en contacto dicho polinucleótido de iniciación con dicho siguiente polinucleótido componente más terminal en condiciones y durante un periodo adecuados para la hibridación; y

h): repetir (e) a (g) para añadir secuencialmente dicho siguiente polinucleótido componente más terminal al polinucleótido de iniciación extendido, con lo que se ensambla un polinucleótido diana en ausencia de polimerización enzimática.