ES2336192T3 - Proceso de fermentacion para la preparacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
Proceso de fermentacion para la preparacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas. Download PDFInfo
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Abstract
Proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, en donde se llevan a cabo los pasos siguientes: a) fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA están atenuados, b) enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y c) tratamiento del L-aminoácido, o d) constituyentes del caldo de fermentación y aislamiento de la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido.
Description
Proceso de fermentación para la preparación de
L-aminoácidos utilizando cepas de la familia
enterobacteriáceas.
La presente invención se refiere a un proceso de
fermentación para la preparación de L-aminoácidos,
especialmente L-treonina, utilizando cepas de la
familia Enterobacteriáceas en las cuales al menos el gen pckA está
atenuado.
Los L-aminoácidos se utilizan en
nutrición animal, en medicina humana y en la industria
farmacéutica.
Se conoce el modo de preparar
L-aminoácidos por la fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, especialmente Escherichia coli y
Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están
realizándose continuamente intentos para mejorar los procesos de
preparación. Las mejoras de los procesos pueden referirse a medidas
que implican la tecnología de la fermentación, v.g. alimentación y
suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes,
v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o el
acabado de la forma del producto, v.g. por cromatografía de
intercambio iónico, o las características intrínsecas de
productividad del microorganismo propiamente
dicho.
dicho.
Las características de productividad de estos
micro-organismos se mejoran utilizando métodos de
mutagénesis, selección y elección de mutantes para dar cepas que son
resistentes a antimetabolitos, v.g. el análogo de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) o auxótrofos para metabolitos de importancia reguladora, y
producir L-aminoácidos, v.g.
L-treonina.
Métodos de la tecnología del DNA recombinante
han sido utilizados también desde hace algunos años para mejorar
las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia
Enterobacteriáceas por amplificación de genes de biosíntesis
individuales de aminoácidos y estudio del efecto sobre la
producción.
EP-A-1094111
proporciona un proceso para la preparación por fermentación de
L-aminoácidos, en particular
L-lisina y L-treonina, utilizando
materias corineformes que producen ya en particular
L-aminoácidos y en las cuales la o las secuencias de
nucleótidos que codifica(n) el producto del gen pck están
atenuadas.
Prost Jean-Francois et
al.: "Detection of an extended - 10 element in the prometer
región of the pckA gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase
in Escherichia Coli". Biochemie 81:
197-200 (1999), describen que la regulación de la
transcripción del gen pckA que codifica
fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa en Escherichia
coli se analizó por mutagénesis orientada de la región promotora
y medida de la iniciación de la transcripción in vitro.
Kramer R: "Genetic and physiological
approaches for the production of amino acids" Journal of
Biotechnology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, vol. 45,
no. 1, 12 de febrero (1996-02-12),
páginas 1-21, XP004036833 ISSN:
0168-1656, describe los caminos relevantes en
microorganismos biotecnológicamente relevantes productores de
aminoácidos.
Database Biosis [Online] Biosciences Information
Service, Philadelphia, PA, EE.UU.: 1990, Medina V. et al.
proporciona "Sequence of the pck - a gene of Escherichia
Coli K-12 Relevance to genetic and allosteric
regulation and Homology of Escherichia Coli
Phospho-enolpiruvate Carboxykinase with the enzymes
from Trypanosorna-Brucei and
Saccharomyces-Cerevisiae" No. de Acceso
PREVI99191038347 a la Base de Datos XP002193203.
En Database Biosis [On line] Biosciences
Information Service, Philadelphia, PA, EE.UU.; 1990, puede
encontrarse Goldie H. et al.: "Physical and Genetic Locus
from Escherichia coli K12" No. de Acceso PREV
199089092769 a la Base de Datos XP002193202.
El objeto que se propusieron a sí mismos los
inventores fue proporcionar nuevos procedimientos para mejorar la
preparación de L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, por fermentación.
La invención proporciona un proceso de
fermentación para la preparación de L-aminoácidos,
especialmente L-treonina, utilizando
microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que, en
particular, producen ya L-treonina y en los cuales
la secuencia de nucleótidos (gen pckA) que codifica la enzima
fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa
(PEP-carboxiquinasa) (EC 4.1.1.49) está
atenuada.
\vskip1.000000\baselineskip
En los casos en que se mencionan
L-aminoácidos o aminoácidos en adelante, esto
significa uno o más amino-ácidos, con inclusión de sus sales,
seleccionados del grupo constituido por
L-asparagina, L-treonina,
L-serina, L-glutamato,
L-glicina, L-alanina,
L-cisteína, L-valina,
L-metionina, L-isoleucina,
L-leucina, L-tirosina,
L-fenilalanina, L-histidina,
L-lisina, L-triptófano,
L-homoserina y L-arginina. Se
prefiere particularmente L-treonina.
En este contexto, el término "atenuación"
describe la reducción o desactivación, en un microorganismo, de la
actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) que son
codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo por utilización de un
promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima apropiada
con actividad baja, o desactivación de la enzima (proteína)
apropiada, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de atenuación, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente se reduce en general
hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
El proceso se caracteriza porque se llevan a
cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas productores del L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos está atenuado al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA;
- b)
- enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido o
- d)
- aislamiento de constituyentes del caldo de fermentación y la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido.
Los microorganismos proporcionados por la
presente invención pueden producir L-aminoácidos a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón u opcionalmente celulosa, o a partir de
glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la
familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. Las especies Escherichia coli y
Serratia marcescens pueden mencionarse en particular entre
los géneros Escherichia y Serratia respectivamente.
Ejemplos de cepas adecuadas, particularmente
cepas productoras de L-treonina, del género
Escherichia, expresamente de la especie Escherichia coli
son:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de cepas productoras de
L-treonina del género Serratia, especialmente de la
especie Serratia marcescens, son:
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen
preferiblemente, entre otras cosas, una o más características
genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales
como 6-dimetilaminopurina, necesidad de
L-metionina, necesidad opcionalmente parcial y
compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, L-lisina, resistencia
a L-metionina, resistencia a ácido glutámico,
resistencia a L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, insuficiencia de
treonina-deshidrogenasa, capacidad opcional para
utilización de sacarosa, amplificación del operón treonina,
amplificación de la
homoserina-deshidrogenasa-I-aspartato-quinasa-I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
amplificación de homoserina-quinasa, amplificación
de treonina-sintasa, amplificación de
aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma
resistente a la realimentación, amplificación de
aspartato-semialdehido-deshidrogenasa,
amplificación de
fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
amplificación de
fosfoenol-piruvato-sintasa,
amplificación de transhidrogenasa, amplificación del producto del
gen RhtB, amplificación del producto del gen RhtC, amplificación del
producto del gen YfiK, amplificación de
malato-quinona-oxidorreductasa y
amplificación de una piruvato-carboxilasa, así como
atenuación de la formación de ácido acético.
Se ha encontrado que la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, por microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas se mejora después de atenuación y, en particular,
desactivación del gen pckA que codifica
PEP-carboxiquinasa (EC 4.1.1.49).
La secuencia de nucleótidos del gen pckA de
Escherichia coli ha sido publicada por Medina et al.
(Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)) y
puede tomarse también de la secuencia del genoma de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277,
1453-1462 (1997)). La secuencia de nucleótidos del
gen pckA de Escherichia coli se representa en SEQ ID No. 1 y
la secuencia de aminoácidos del producto del gen correspondiente se
representa en SEQ ID No. 2.
Los genes pckA descritos en las referencias
bibliográficas anteriores pueden utilizarse de acuerdo con la
invención. Es posible también utilizar alelos del gen pckA que son
resultado de la degeneración del código genético o de mutaciones
sentido neutras.
La atenuación puede conseguirse por ejemplo por
reducción o desactivación de la expresión del gen pckA o de las
propiedades catalíticas de la proteína enzimática. Ambas medidas
pueden combinarse opcionalmente.
La expresión génica puede reducirse por una
técnica de cultivo apropiada, por modificación genética (mutación)
de las estructuras de señal de la expresión génica, o por medio de
tecnología del DNA antisentido. Ejemplos de estructuras de señal de
la expresión génica son genes represores, genes activadores,
operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación de ribosoma,
el codón inicial y terminadores. Los expertos en la técnica
encontrarán información relevante entre otros lugares en, v.g.
Jensen y Hammer ((Biotechnology y Bioengineering 58,
191-195 (1998)), Carrier y Keasling (Biotechnology
Progress 15, 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current
Opinión in Microbiology 3, 159-164 (2000)) y libros
de texto bien conocidos sobre genética y biología molecular, por
ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik"
("Molecular Genetics"), 6a edición, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Alemania, 1995) o el libro de texto de Winnacker ("Gene
und Klone" ("From Genes to Clones"), VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).
Mutaciones que causan un cambio o reducción en
las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas se conocen
por la técnica anterior. Ejemplos que pueden mencionarse son los
estudios de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272,
8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences EE.UU. 95,
5511-5515 (1998)) y Wente y Schachmann (Journal of
Biological Chemistry 266; 20833-20839 (1991)).
Pueden encontrarse exámenes en libros de texto bien conocidos sobre
genética y biología molecular, v.g. el libro de texto de Hagemann
("Allgemeine Genetik" ("General Genetics"), Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones a tener en consideración son
transiciones, transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo
del efecto del cambio de aminoácidos sobre la actividad enzimática,
se utiliza el término mutaciones sentido o mutaciones sin sentido.
Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen
causan mutaciones de desplazamiento de marco, cuyo resultado es que
se incorporan aminoácidos falsos o se termina prematuramente la
traducción. Las deleciones de varios codones conducen típicamente a
una pérdida completa de la actividad enzimática. Instrucciones para
la producción de tales mutaciones forman parte de la técnica
anterior y pueden encontrarse en libros de texto bien conocidos
sobre genética y biología molecular, v.g. el libro de texto de
Knippers ("Molekulare Genetik" ("Molecular Genetics"), 6ª
edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el libro
de texto de Winnacker ("Gene und Klone" ("From Genes to
Clones"), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o
el libro de texto de Hagemann ("Allgemeine Genetik" ("General
Genetics"), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Un ejemplo de un plásmido por medio del cual
puede atenuarse el gen pckA de Escherichia coli y, en
particular, desactivarse por mutagénesis específica de la posición
es el plásmido pMAK705\DeltapckA (Figura 1). El mismo contiene
solamente parte de la región 51 y parte de la región 3' del gen
pckA. Se ha omitido un segmento de 349 pb de la región codificante
(deleción). La secuencia de este DNA, que puede utilizarse para
mutagénesis del gen pckA, se representa en SEQ ID No. 3.
La mutación por deleción del gen pckA puede
incorporarse en cepas adecuadas por cambio de genes o alelos.
Un método común es el método del cambio de genes
utilizando un derivado condicionalmente replicante de pSC101,
pMAK705, como ha sido descrito por Hamilton et al. (Journal
of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)). Pueden
utilizarse también otros métodos descritos en la técnica anterior,
por ejemplo el de Martínez-Morales et al.
(Journal of Bacteriology, 7143-7148 (1999)) o el de
Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182,
842-847 (2000)).
Cuando se ha llevado a cabo el cambio, la forma
del alelo \DeltapckA representada en SEQ ID No. 4, que es un
objeto adicional de la invención, está presente en la cepa en
cuestión.
Mutaciones en el gen pckA o mutaciones que
implican la expresión del gen pckA pueden transferirse también a
cepas diferentes por conjugación o transducción.
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, puede ser ventajoso no sólo atenuar el gen
pckA, sino también amplificar una o más enzimas del camino
biosintético conocido de la treonina, o enzimas del metabolismo
anaplerótico, o enzimas para la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido.
En este contexto, el término
"amplificación" describe el aumento de la actividad
intracelular, en un micro-organismo, de una o más
enzimas o proteínas que son codificadas por el DNA apropiado, por
ejemplo por aumento del número de copias del o de los genes,
utilizando un promotor fuerte o utilizando un gen que codifica una
enzima o proteína apropiada con una actividad alta, y opcionalmente
combinación de estas medidas.
Por medidas de amplificación, en particular
sobre+expresión, la actividad o concentración de la proteína
correspondiente se aumenta en general al menos en un 10%, 25%, 50%,
75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o
2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Así, por ejemplo, uno o más genes seleccionados
del grupo que comprende:
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (DE-A-19831609),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular y General Genetics 231, 332 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Gene 31, 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB para resistencia a homoserina (EP-A-0994190), y
- \bullet
- el gen rhtC para resistencia a treonina (EP-A-1013765),
- \bullet
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Gene 27: 193-199 (1984))
pueden amplificarse simultáneamente y, en
particular, sobreexpresarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, puede ser ventajoso no sólo atenuar el
gen pckA sino también atenuar y, en particular, desactivar uno o
más genes seleccionados del grupo que comprende:
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Ravnikar y Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) (Vogel et al., Archives in Microbiology 14 9, 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA (Número de Acceso AAC 77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) y SEQ ID No. 5), y
\newpage
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP (Número de Acceso AAC 77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) y SEQ ID No. 5),
o reducir la expresión de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefiere atenuar el marco de lectura abierto
yjfA y/o el marco de lectura abierto ytfP.
Es asimismo posible, de acuerdo con la
descripción, atenuar los marcos de lectura abiertos yjfA y/o ytfP
independientemente del gen pckA, a fin de conseguir una mejora en
la producción de aminoácidos, en particular
L-treonina.
La descripción, proporciona también de acuerdo
con ello un proceso caracterizado porque se llevan a cabo los pasos
siguientes:
- d)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales al menos el marco de lectura abierto yjfA y/o ytfP está atenuado,
- e)
- enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
- f)
- aislamiento de los constituyentes de L-treonina del caldo de fermentación y la biomasa en su totalidad o porciones de los mismos que se aíslan opcionalmente como un producto sólido junto con el L-amino-ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de un plásmido por medio del cual los
marcos de lectura abiertos yjfA e ytfP de Escherichia coli
pueden atenuarse y, en particularmente, desactivarse por mutagénesis
específica de la posición es el plásmido
pMAK705\DeltayjfA (Figura 2). El mismo contiene únicamente los bordes 5' y 3' de la región ytfP-yjfA, con inclusión de residuos muy cortos de los marcos de lectura abiertos yjfA e ytfP. Una parte de 337 pb de longitud de la región ytfP-yjfA está ausente (deleción). La secuencia de este DNA, que puede utilizarse para mutagénesis de la región ytfP-yjfA, se representa en SEQ ID No. 6.
pMAK705\DeltayjfA (Figura 2). El mismo contiene únicamente los bordes 5' y 3' de la región ytfP-yjfA, con inclusión de residuos muy cortos de los marcos de lectura abiertos yjfA e ytfP. Una parte de 337 pb de longitud de la región ytfP-yjfA está ausente (deleción). La secuencia de este DNA, que puede utilizarse para mutagénesis de la región ytfP-yjfA, se representa en SEQ ID No. 6.
Un ejemplo adicional de un plásmido por medio
del cual pueden atenuarse los marcos de lectura abiertos yjfA e ytfP
de Escherichia coli y, en particular, desactivarse por
mutagénesis específica de la posición es el plásmido
pMAK705\Delta90bp (Figura 5). El mismo contiene también únicamente
los flancos 5' y 3' de la región ytfP-yjfA con
inclusión de residuos muy cortos de los marcos de lectura abiertos
yjfA e ytfP. Una parte de 90 pb de longitud de la región
ytfP-yjfA está ausente (deleción). La secuencia de
este DNA, que puede utilizarse para mutagénesis de la región
ytfP-yjfA, se representa en SEQ ID No. 7.
Esta mutación por deleción puede incorporarse en
cepas adecuadas por reemplazamiento de genes o alelos. Es asimismo
posible transferir mutaciones en los marcos de lectura abiertos yjfA
y/o ytfP o mutaciones que afectan a la expresión de estos marcos de
lectura abiertos en diversas cepas por conjugación o
transducción.
Cuando se ha llevado a cabo el reemplazamiento,
la forma del alelo \DeltaytfP y \DeltayjfA representada en SEQ
ID No. 6 o SEQ ID No. 7, que son un objeto adicional de la
descripción, está presente en la cepa en cuestión.
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, puede ser ventajoso, además de la
atenuación individual o conjunta del gen pckA o de los marcos de
lectura abiertos yjfA e/o ytfP, desactivar reaccionar secundarias
indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Acadernic Press, Londres,
Reino Unido, 1982).
Los microorganismos preparados de acuerdo con la
invención pueden cultivarse por el proceso de lotes o el proceso de
realimentación. Un sumario de métodos de cultivo conocidos se
proporciona en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfah-renstechnik (Bioprocess
Technology 1. Introduction to Bioengineering) (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and
Peripheral Equipment) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden,
1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
adecuadamente las demandas de las cepas particulares. Descripciones
de medios de cultivo para diversos microorganismos pueden
encontrarse en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington DC, EE.UU., 1981).
Fuentes de carbono que pueden utilizarse son
azúcares y carbohidratos, v.g. glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa,
aceites y grasas, v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete, y aceite de coco, ácidos grasos, v.g. ácido palmítico,
ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, v.g. glicerol y
etanol, y ácidos orgánicos, v.g. ácido acético. Estas sustancias
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
\newpage
Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son
compuestos orgánicos que contiene nitrógeno tales como peptonas,
extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de
maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos
tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son
ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales de sodio correspondientes. El medio de
cultivo debe contener también sales metálicas, v.g. sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales promotoras del
crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas pueden utilizarse
además de las sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse también
al medio de cultivo precursores adecuados. Dichos materiales de
alimentación pueden añadirse al cultivo de una vez o alimentarse
adecuadamente durante el cultivo.
El pH del cultivo se controla por el uso
apropiado de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio,
hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos
ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación
de espuma puede controlarse utilizando agentes antiespumantes tales
como poliglicol-ésteres de ácidos grasos. La estabilidad de los
plásmidos puede mantenerse por adición de sustancias adecuadas de
acción selectiva, v.g. antibióticos, al medio. Se mantienen
condiciones aerobias por introducción de oxigeno o mezclas gaseosas
que contienen oxígeno, v.g. aire, en el cultivo. La temperatura del
cultivo es normalmente 25ºC a 4 5ºC y preferiblemente 30ºC a 40ºC.
El cultivo se continúa hasta que la formación de
L-aminoácidos o L-treonina ha
alcanzado un máximo. Este objetivo se consigue normalmente dentro
de 10 horas a 160 horas.
Los L-aminoácidos pueden
analizarse por medio de cromatografía de intercambio aniónico
seguida por derivación con ninhidrina, como ha sido descrito por
Spackman et al. et al. (Analytical Chemistry 30, 1190
(1958)), o por HPLC en fase inversa, como ha sido descrito por
Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51,
1167-1174. (1979)).
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia
coli K-12 DH5\alpha/pMAK705 fue depositado en
fecha 8 de septiembre de 2 000 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Germán Collection of
Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de acuerdo
con el Tratado de Budapest como DSM 13720.
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia
coli K-12 MG442\DeltapckA fue depositado en
fecha 2 de octubre de 2000 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Germán Collection of
Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de acuerdo
con el Tratado de Budapest como DSM 13761.
Un cultivo puro de la cepa K-12
de Escherichia coli
B-3996kur\Deltatdh\DeltapckA/pVIC40 fue
depositado en fecha 9 de marzo de 2 001 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Germán Collection of
Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest como DSM 14150.
Un cultivo puro de la cepa K-12
de Escherichia coli MG442\Delta90yjfA fue depositado en
fecha 9 de mayo de 2001 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ = Germán Collection of Microorganisms and
Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de
Budapest como DSM 14289.
Es asimismo posible de acuerdo con la
descripción, atenuar individualmente los marcos de lectura abiertos
ytfP e yjfA a fin de mejorar la producción de
L-aminoácidos.
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para la preparación de L-aminoácidos, v.g.
L-treonina, L-isoleucina,
L-metionina, L-homoserina y
L-lisina, especialmente L-treonina,
por fermentación.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle a continuación con ayuda de ejemplos.
El aislamiento del DNA plasmídico de
Escherichia coli y todas las técnicas para restricción,
tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevaron
a cabo como ha sido descrito por Sambrook et al. (Molecular
Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press). A no ser que se indique otra cosa, la transformación de
Escherichia coli se llevó a cabo como ha sido descrito por
Chung et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences EE.UU. 86, 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación para la preparación
de cepas y transformantes era 37ºC. Temperaturas de 30ºC y 44ºC se
utilizaron en el proceso de intercambio génico de Hamilton et
al.
\newpage
Partes de las regiones 5' y 3' del gen pckA de
Escherichia coli K12 se amplificaron utilizando la región en
cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. La
secuencia de nucleótidos del gen pckA en E. coli K12 MG1655
(SEQ ID No. 1) se utilizó para sintetizar los iniciadores PCR
siguientes (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizado para la PCR se aisló con "Qiagen
Genomics-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de
DNA de aprox. 500 pb de la región 5' del gen pckA (designado como
pck1) y un fragmento de DNA de aprox. 600 pb de la región 3' del gen
pckA (designado como pck2) pudieron amplificarse con los iniciadores
específicos en condiciones PCR estándar (Innis et al.
(1990), PCR Protocols. A Guide to Methods y Applications, Academic
Press) utilizando DNA-polimerasa Taq
(Gibco-BRL, Eggenstein, Alemania). Los productos PCR
se ligaron cada uno con el vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit,
Invitrogen, Groningen, Países Bajos) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y se transformaron en la cepa TOP10F'
de E. coli. Se seleccionaron células portadoras del plásmido
en agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Después de
aislamiento del DNA plasmídico, se escindió el vector pCR2.1TOPOpck2
con las enzimas de restricción StuI y XbaI y, después de separación
en gel de agarosa al 0,8%, el fragmento pck2 se aisló con ayuda del
Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania).
Después de aislamiento del DNA plasmídico, se escindió el vector
pCR2.1TOPOpck1 con las enzimas EcoRV y XbaI y se ligó al fragmento
pck2 aislado. La cepa DH5\alpha de E. coli se transformó
con la mezcla de ligación y las células portadoras del plásmido se
seleccionaron en agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina.
Después de aislamiento del DNA plasmídico, se utilizó escisión de
control con las enzimas SpeI y XbaI para detectar plásmidos que
contuvieran, en forma clonada, la secuencia de DNA mutágena
representada en SEQ ID No. 3. Uno de los plásmidos se designó como
pCR2.1TOPO\DeltapckA.
Después de restricción con las enzimas SpeI y
XbaI y separación en gel de agarosa al 0,8%, el alelo pckA descrito
en el Ejemplo 1 se aisló del vector pCR2.1TOPO\DeltapckA y se ligó
al plásmido pMAK705 (Hamilton et al., Journal of Bacteriology
174, 4617-4622 (1989)) que se había digerido con la
enzima XbaI. Se transformó DH5\alpha con la mezcla de ligación y
se seleccionaron células portadoras del plásmido en agar LB que
contenía 20 \mug/ml de cloranfenicol. Después del aislamiento del
DNA plasmídico y escisión con las enzimas HpaI, KpnI, HindIII, SalI
y PstI, se detectó la clonación con éxito. El vector de intercambio
formado, pMAK705\DeltapckA (= pMAK705deltapckA), se muestra en la
Figura 1.
La cepa MG442 de E. coli productora de
L-treonina se describe en la Patente
US-A-4.278.765 y ha sido depositada
en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales
(VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628.
La cepa MG442 presenta resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
y tiene necesidad opcionalmente parcial y compensable de
L-isoleucina.
Para el intercambio del gen pckA cromosómico por
el constructo de deleción codificado por el plásmido, se transformó
MG442 con el plásmido pMAK705\Deltapck\Delta. El intercambio
génico se llevó a cabo por el método de selección descrito por
Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174,
4617-4622 (1989)) y se comprobó por métodos PCR
estándar (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, Academic Press) utilizando los iniciadores
oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designó como
MG442\DeltapckA.
Se cultivó MG442\DeltapckA en medio mínimo de
la composición siguiente: 3,5 g/l de Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O,
1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de NH_{4}Cl, 0,1 g/l de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g/l de glucosa y 20 g/l de agar. La
formación de L-treonina se comprobó en cultivos por
lotes de 10 ml contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Se
inocularon estos con 10 ml de un medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
de MgSO_{4}.7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3} y 20 g/l de glucosa, y
se incubó durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de
Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transfirieron 250 \mul de este
precultivo a 10 ml de un medio de producción (25 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,03 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,018 g/l de MgSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20
g/l de glucosa) y se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Después de
la incubación, se determinó la densidad óptica (DO) de la suspensión
de cultivo con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Berlín, Alemania) a
una longitud de onda de medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determinó luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio
de cromatografía de intercambio iónico y reacción en
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de
glutamato-deshidrogenasa de Escherichia coli
K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos para el gen gdhA en E. coli K12 MG1655
(biblioteca de genes: No. de Acceso AE000270 y No. AE000271) se
sintetizan los iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "QIAGEN Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA con un tamaño de
aproximadamente 2150 pb, que comprende la región codificante de
gdhA y aprox. 350 pb de la secuencia flanqueante 5' y aprox. 450 pb
de la secuencia flanqueante 3', puede amplificarse con los
iniciadores específicos en condiciones estándar de PCR (Innis et
al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990,
Academic Press) con la DNA-polimerasa Pfu (Promega
Corporation: Madison, EE.UU.). El producto PCR se clona en el
plásmido pCR2.1TOPO y se transforma en la cepa TOP10 de E.
coli (Invitrogen, Leek, Países Bajos, Descripción del Producto
TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500-01). La
clonación con éxito se demuestra por escisión del plásmido
pCR2.1TOPOgdhA con las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV. Para
esto, se aísla el DNA plasmídico por medio de los "QIAprep Spin
Plasmid Kits" (QIAGEN, Hilden, Alemania) y, después de la
escisión, se separa en un gel de agarosa al 0,8%.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCR2.1TOPOgdhA se escinde con la
enzima EcoRI, se separa el lote de escisión en gel de agarosa al
0,8% y el fragmento gdhA de tamaño 2,1 kpb se aísla con la ayuda del
"QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Alemania). El
plásmido pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japón) se escinde con la
enzima EcoRI y se liga con el fragmento gdhA. La cepa de E.
coli DH5\alpha se transforma con el lote de ligación y las
células portadoras de pMW218 se seleccionan por extensión en placas
sobre agar LB (Lennox, Virology 1955, 1:190), al cual se añaden 20
\mug/ml de kanamicina.
La clonación con éxito del gen gdhA puede
demostrarse después del aislamiento del DNA plasmídico y escisión
del control con EcoRI y EcoRV. El plásmido se designa pMW218gdhA
(Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442\DeltapckA obtenida en el Ejemplo
3 y la cepa MG442 se transforman con el plásmido pMW218gdhA, y los
transformantes se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. De este modo se forman las cepas
MG442\DeltapckA/pMW218gdhA y MG442/pMW218gdhA.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina por
las cepas MG442\DeltapckA/pMW218gdhA y MG442/pMW218gdhA se testa
como se describe en el Ejemplo 4. El medio mínimo y el medio de
precultivo se complementan adicionalmente con 20 \mug/ml de
kanamicina.
El resultado del experimento se resume en la
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen rhtC de Escherichia coli K12 se
amplifica utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos para el gen rhtC en E. coli K12 MG1655
(biblioteca de genes: No. de Acceso AE000458, Zakataeva et
al. (FEBS Letter 452, 228-232 (1999)), se
sintetizan los iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "QIAGEN Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de un tamaño aprox.
de 800 pb puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones PCR estándar (Innis et al.: PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con
DNA-polimerasa Pfu. (Promega Corporation, Madison,
USA).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japón)
se escinde con la enzima SamI y se liga con el fragmento
rhtC-PCR. La cepa de E. coli DH5\alpha se
transforma con el lote de ligación y las células portadoras de
pMW219 se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. La clonación con éxito puede demostrarse
después de aislamiento del DNA plasmídico y escisión del control con
KpnI, HindIII y NcoI. El plásmido pMW219rhtC se muestra en la Figura
4.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442\DeltapckA obtenida en el Ejemplo
3 y la cepa MG442 se transforman con el plásmido pMW219rhtC y los
transformantes se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. De esta manera se forman las cepas
MG442\DeltapckA/pMW219rhtC y MG442/pMW219rhtC.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina por
las cepas MG442\DeltapckA/pMW219rhtC y MG442/pMW219rhtC se testa
como se describe en el Ejemplo 4. El medio mínimo y el medio de
cultivo se complementan adicionalmente con 20 \mug/ml de
kanamicina.
El resultado del experimento se resume en la
Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli B-3996
productora de L-treonina se describe en
US-A-5.175.107 y ha sido depositada
en la Colección Nacional Rusa para Microorganismos Industriales
(VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa B-3996 tiene, entre
otras cosas, resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
tiene una treonina-deshidrogenasa atenuada, en
particular desactivada, o deficiente, tiene
homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I intensificada
en la forma resistente a la realimentación, tiene una necesidad
opcionalmente parcial y compensable de L-isoleucina
y tiene capacidad para utilizar sacarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de cultivo en medio completo exento de
antibióticos durante aproximadamente 10 generaciones, se aísla un
derivado de la cepa B-3996 que no contiene ya el
plásmido pVIC40. La cepa formada es sensible a estreptomicina y se
ha designado como B-3996kur.
Para incorporación de una deleción en el gen tdh
se utilizó el método descrito por Hamilton et al. (Journal of
Bacteriology (1989) 171: 4617-4622), que está basado
en el uso del plásmido pMAK705 con un replicón sensible a la
temperatura. El plásmido pDR121 (Ravnikar y Somerville, Journal of
Bacteriology (1987) 169: 4716-4721) contiene un
fragmento de DNA de E. coli de 3,7 kilopares de bases (kpb)
de tamaño, en el cual está codificado el gen tdh. Para generar una
deleción de la región del gen tdh, se escinde pDR121 con las enzimas
de restricción ClaI y EcoRV, y se liga el fragmento de DNA de 5 kpb
de tamaño aislado, después de tratamiento con la enzima Klenow. El
lote de ligación se transforma en la cepa de E. coli
DH5\alpha y las células portadoras del plásmido se seleccionan en
agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de ampicilina.
La deleción con éxito del gen tdh puede
demostrarse después de aislamiento del DNA plasmídico y escisión de
control con EcoRI. Se aísla el fragmento EcoRI de 1,7 kpb de tamaño,
y se liga con el plásmido pMAK705, que se digiere parcialmente con
EcoRI. El lote de ligación se transforma en DH5\alpha y las
células portadoras del plásmido se seleccionan en agar LB, al que se
añaden 20 \mug/ml de cloranfenicol. La clonación con éxito se
demuestra después de aislamiento del DNA plasmídico y escisión con
EcoRI. El derivado pMAK705 formado se designa pDM32.
Para el reemplazamiento del gen, se transforma
B-3996kur con el plásmido pDM32. El reemplazamiento
del gen cromosómico tdh con el constructo de deleción codificado por
el plásmido se lleva a cabo por el proceso de selección descrito
por Hamilton et al. y se comprueba por métodos PCR estándar
(Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and
Applications, Academic Press) con los iniciadores oligonucleotídicos
siguientes:
La cepa formada se testa en cuanto a
sensibilidad a la kanamicina y se designa
B-3996kur\Deltatdh.
Para la mutagénesis específica de posición del
gen pckA, se transforma B-3996kur\Deltatdh con el
vector de reemplazamiento pMAK705\DeltapckA descrito en el
Ejemplo 2. El reemplazamiento del gen pckA cromosómico por el
constructo de deleción codificado por el plásmido se lleva a cabo
como se describe en el Ejemplo 3. La cepa obtenida se designa
B-3996kur\Deltatdh\DeltapckA.
B-3996kur\Deltatdh y
B-3996kur\Deltatdh\DeltapckA se transforman con
el plásmido pVIC40 aislado de B-3996 y las células
portadoras del plásmido se seleccionan en agar LB con 20 \mug/ml
de estreptomicina. En cada caso, una colonia individual
seleccionada se designa B-3996kur\Deltatdh/pVIC40
y B-3996kur\Deltatdh\DeltapckA/pVIC40.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina por
las cepas B-3996kur\Deltatdh/pVIC40 y
B-3996kur\Deltatdh\DeltapckA/pVIC40 se testa
como se describe en el Ejemplo 4. El medio mínimo, el medio de
precultivo y el medio de producción se complementan adicionalmente
con 20 mg/ml de estreptomicina.
El resultado del experimento se resume en la
Tabla 4.
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La cepa de E. coli pDA1/TOC21R se
describe en la solicitud de patente
F-A-2511032 y ha sido depositada en
la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM = National
Microorganism Culture Collection, Pasteur Institute, París,
Francia) bajo el número 1-167. La cepa y el
hospedador exento de plásmido han sido descritos también por
Deuce-Le Reverend et al. (European Journal of
Applied Microbiology and Biotechnology 15: 227-231
(1982)) bajo el nombre TOC21R/pDA1.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de cultivo en el medio LB exento de
antibióticos durante aproximadamente seis generaciones, se aísla
un derivado de la cepa pDA1/TOC21R que no contiene ya el plásmido
pDA1. La cepa formada es sensible a la tetraciclina y se designa
TOC21R.
Para el reemplazamiento del gen cromosómico de
pckA por el constructo de deleción codificado por el plásmido, se
transforma TOC21R con el plásmido pMAK705\DeltapckA (Ejemplo 2).
El reemplazamiento del gen se lleva a cabo por el método de
selección descrito por Hamilton et al. (1989), Journal of
Bacteriology 174, 4617-4622) y se comprueba por
métodos PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A
guide to Methods and Applications, Academic Press) con los
iniciadores oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
TOC21R\DeltapckA.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de L-lisina con la
cepa TOC21R\DeltapckA y TOC21R se comprueba en cultivos de lotes
de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se
inoculan 10 ml de medio de precultivo de la composición siguiente:
2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 2 0 g/l de glucosa y
se incuba el lote durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una
incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transinoculan
250 \mul de este precultivo en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 25
mg/l L-isoleucina y 5 mg/l tiamina) y se incuba el
lote durante 72 horas a 37ºC. Después de la incubación, se
determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un
fotómetro LP2W del Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de
onda de medida de 660 nm.
Se determina luego la concentración de
L-lisina formada en el sobrenadante de cultivo
filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos
de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
Los resultados del experimento se muestran en la
Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa B-3996kur\Deltatdh,
que necesita L-isoleucina, obtenida en el Ejemplo
7.1 se transduce con ayuda del fago Plkc (Lennox, Virology 1,
190-206 (1955); Miller, Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) y se aíslan los
transductantes
L-isoleucina-prototróficos.
Para esto, se multiplica el fago Plkc en la cepa
MG1655 (Guyer et al., Cold Spring Harbor Symposium
Quantitative Biology 45, 135-140 (1981) y Blattner
et al., Science: 277, 1453-1462 (1997)) y se
emplea el lisado de fago para la transducción de la cepa
B-3996kur\Deltatdh. La multiplicidad de la
infección es aproximadamente 0,2. La selección para transductantes
prototróficos de L-isoleucina se lleva a cabo en
agar mínimo, que contiene 2 g/l de glucosa y 10 mg/l de
L-treonina. Se aísla un transductante prototrófico
de L-isoleucina, se extiende sobre agar LB para
purificación o aislamiento y se designa
B-3996kur\DeltatdhilvA^{+}.
El gen pckA de la cepa
B-3996kur\DeltatdhilvA^{+} se reemplaza luego,
como se describe en el Ejemplo 3, por el alelo \DeltapckA
preparado en los Ejemplos 1 y 2. La cepa obtenida se designa
B-3996kur\DeltatdhilvA^{+}\DeltapckA.
Las cepas
B-3996kur\DeltatdhilvA^{+} y
B-3996kur\DeltatdhilvA^{+}\DeltapckA se
transforman con el plásmido pVIC40 aislado de la cepa
B-3996 y las células portadoras del plásmido se
seleccionan sobre agar LB, que se complementa con 20 \mug/ml de
estreptomicina. En cada caso, una colonia individual seleccionada se
designa B-3996kur\DeltatdhilvA+\DeltapckA/pVIC40
y B-3996kur\DeltatdhilvA+/pVIC40.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-isoleucina
por las cepas B-3996kur\DeltatdhilvA^{+}/pVIC40
y B3996kur\DeltatdhilvA^{+}\DeltapckA/pVIC40 se testa en las
condiciones de test que se describen en el Ejemplo 4. El medio
mínimo, el medio de precultivo y el medio de producción se
complementan adicionalmente con 20 \mug/ml de estreptomicina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa AJ 11502 de E. coli productora de
L-valina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.391.907 y ha sido
depositada en el Centro Nacional para Investigación de Utilización
en Agricultura (Peoria, Illinois, EE.UU.) como NRRL
B-12288.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de cultivo en medio LB exento de
antibióticos durante aproximadamente 6 generaciones, se aísla un
derivado exento de plásmido de la cepa AJ 11502. La cepa formada es
sensible a ampicilina y se designa AJ 11502kur.
\newpage
Para reemplazamiento del gen cromosómico pckA
por el constructo de deleción codificado por el plásmido, se
transforma AJ 11502kur con el plásmido pMAK705\DeltapckA (véase
el Ejemplo 2). El reemplazamiento del gen se lleva a cabo por el
método de selección descrito por Hamilton et al. (1989)
Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) y se
comprueba por los métodos PCR estándar (Innis et al. (1990)
PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)
con los iniciadores oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
AJ11502kur\DeltapckA. El plásmido descrito en la memoria
descriptiva de patente
US-A-4.391.907, que lleva la
información genética con respecto a la producción de valina, se
aísla de la cepa NRRL B-12288. La cepa
AJll502kur\DeltapckA se transforma con este plásmido. Uno de los
transformantes obtenidos se designa
B-12288\DeltapckA.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de L-valina por las
cepas B-12288\DeltapckA y NRRL
B-12288 se comprueba en cultivos de lotes de 10 ml
contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se inoculan 10
ml de medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l
extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3},
20 g/l glucosa y 50 mg/l ampicilina, y el lote se incuba durante 16
horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG
(Birsfelden, Suiza). Se transinoculan 250 \mul de este precultivo
en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 5
mg/l tiamina y 50 mg/ml ampicilina) y el lote se incuba durante 72
horas a 37ºC. Después de la incubación, se determina la densidad
óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro LP2W del
Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de onda de medida de
660 nm.
La concentración de L-valina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 7.
(No forma parte de la
invención)
La región del gen ytfP-yjfA se
amplifica a partir de Escherichia coli K12 utilizando la
reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos
sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos de la región
del gen ytfP-yjfA en la cepa MG1655 de E.
coli K12 (SEQ ID No. 5), se sintetizan los iniciadores PCR
siguientes (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de un tamaño aprox.
de 1300 pb puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones PCR estándar (Innis et al., (1990) PCR Protocols.
A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
DNA-polimerasa Taq (Gibco-BRL,
Eggenstein, Alemania). El producto PCR se liga con el vector
pCR2.1TOPO (Kit de Clonación TOPO TA, Invitrogen, Groningen, Países
Bajos) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y se
transforma en la cepa TOP10F' de E. coli. La selección de las
células portadoras del plásmido tiene lugar en agar LB, al que se
añaden 50 \mug/ml de ampicilina. Después del aislamiento del DNA
plasmídico, se comprueba la clonación con éxito del producto PCR
con las enzimas de restricción EcoRI y NsiI.
Para generar una deleción de 337 pb en la región
yftP-yjfA, se escinde el vector
pCR2.1TOPOytfP-yjfA con las enzimas de restricción
NdeI y SspI, y se liga el fragmento de DNA de 4,8 kpb, después de
tratamiento con la enzima Klenow.
Para generar una deleción de 90 pb, el vector
pCR2.1TOPOytfP-yjfA se escinde con las enzimas NdeI
y SplI, y se liga el fragmento de DNA de 5 kpb de tamaño, después de
tratamiento con enzima Klenow.
La cepa DH5\alpha de E. coli se
transforma con los lotes de ligación, y las células portadoras del
plásmido se seleccionan en agar LB, al que se añaden 5 0 \mug/ml
de ampicilina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, aquellos
plásmidos en los cuales la secuencia de DNA mutágeno representada en
SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 7 se clona se detectan por escisión de
control con la enzima EcoRI. Los plásmidos se designan
pCR2.1TOPO\DeltayjfA y pCR2.1TOPO\Delta90bp.
\vskip1.000000\baselineskip
(No forma parte de la
invención)
Los alelos ytfP-yjfA descritos
en el Ejemplo 11 se aíslan de los vectores pCR2.1TOPO\DeltayjfA y
pCR2.1TOPO\Delta90bp después de restricción con las enzimas SacI y
XbaI y separación en gel de agarosa al 0,8%, y se ligan con el
plásmido pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of
Bacteriology 174, 4617-4622), que se digiere con
las enzimas SacI y XbaI. Los lotes de ligación se transforman en
DH5\alpha y las células portadoras del plásmido se seleccionan en
agar LB, al que se añaden 20 \mug/ml de cloranfenicol. La
clonación con éxito se demuestra después de aislamiento del DNA
plasmídico y escisión con las enzimas SacI y XbaI. Los vectores de
reemplazamiento formados, pMAK705\DeltayjfA
(= pMAK705deltayjfA) y pMAK705\Delta90bp (= pMAK705delta90bp) se muestran en la Figura 2 y en la Figura 5.
(= pMAK705deltayjfA) y pMAK705\Delta90bp (= pMAK705delta90bp) se muestran en la Figura 2 y en la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
(No forma parte de la
invención)
Para reemplazamiento de la región del gen
cromosómico ytfP-yjfA con el constructo de deleción
de 90 pb codificado por el plásmido, se transforma MG442 con el
plásmido pMAK705\Delta90bp. El reemplazamiento del gen se lleva a
cabo por el método de selección descrito por Hamilton et al.
(1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) y se
comprueba por métodos estándar PCR (Innis et al., (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
los iniciadores oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
MG442\Delta90yjfA.
\vskip1.000000\baselineskip
(No forma parte de la
invención)
La preparación de L-treonina por
la cepa MG442\Delta90yjfA se testa como se describe en el Ejemplo
4. El resultado del experimento se resume en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen pckA de la cepa MG442\Delta90yjfA se
reemplaza, como se describe en el Ejemplo 3, por el alelo
\DeltapckA (véanse los Ejemplos 1 y 2). La cepa obtenida se
designa MG442\Delta90yjfA\DeltapckA.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina con
la cepa MG442\Delta90yjfA\DeltapckA se lleva a cabo como se
describe en el Ejemplo 4. El resultado se muestra en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Figura 1: pMAK705\DeltapckA (=
pMAK705deltapckA)
\bullet Figura 2: pMAK705\DeltayjfA
(=pMAK705deltayjfA)
\bullet Figura 3: pMW218gdhA
\bullet Figura 4: pMW219rhtC
\bullet Figura 5: pMAK705\Delta90bp (=
pMAK705delta90bp)
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de longitud deben entenderse como
datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente:
\bullet cat: Gen de resistencia a
cloranfenicol
\bullet rep-ts: Región de
replicación sensible a la temperatura del plásmido pSC101
\bullet pck1: Parte de la región 5' del gen
pckA
\bullet pck2: Parte de la región 3' del gen
pckA
\bullet ytfP'-yjfA': Secuencia
de DNA que contiene regiones codificantes truncadas de ytfP e
yjfA
\bullet kan: Gen de resistencia a
kanamicina
\bullet gdhA: Gen de
glutamato-deshidrogenasa
\bullet rhtC: Gen que imparte resistencia a
treonina
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
\bullet BamHI: endonucleasa de restricción de
Bacillus amyloliquefaciens
\bullet BglII: endonucleasa de restricción de
Bacillus globigii
\bullet ClaI: endonucleasa de restricción de
Caryphanon latum
\bullet EcoRI: endonucleasa de restricción de
Escherichia coli
\bullet EcoRV: endonucleasa de restricción de
Escherichia coli
\bullet HindIII: endonucleasa de restricción
de Haemophilus influenzae
\bullet KpnI: endonucleasa de restricción de
Klebsiella pneumoniae
\bullet PstI: endonucleasa de restricción de
Providencia stuartii
\bullet PvuI: endonucleasa de restricción de
Proteus vulgaris
\bullet SacI: endonucleasa de restricción de
Streptomyces achromogenes
\bullet SalI: endonucleasa de restricción de
Streptomyces albus
\bullet SmaI: endonucleasa de restricción de
Serratia marcescens
\bullet XbaI: endonucleasa de restricción de
Xanthomonas badrii
\bullet XhoI: endonucleasa de restricción de
Xanthomonas holcicola
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación por
fermentación de L-aminoácidos utilizando cepas de la
familia Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000425 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1620)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1156)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA mutagénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
del polienlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)..(522)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región 5 (pck1) del gen
pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (523)..(542)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
del polienlazador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (543)..(1105)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región 3 (pck1) del gen
pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1106)..(1156)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
del polienlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón inicial del alelo delta
pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(598)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 5' del alelo delta pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (599)..(618)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
del polienlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (619)..(1291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 3' del alelo delta pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1292)..(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de parada del alelo delta
pckA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(714)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF ytfP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento ((461)..(727))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF yjfA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 911
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(911)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región ytfP-yjfA
portadora de deleción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(383)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Flanco 5' de la región
ytfP-yjfA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (384)..(911)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Flanco 3' de la región
ytfP-yjfA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(318)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón ATG del ORF ytfP truncado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento ((388)..(390))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón ATG del ORF yjfA truncado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región ytfP-yjfA
portadora de deleción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(630)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Flanco 5' de la región
ytfP-yjfA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (631)..(1158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Flanco 3'de la región
ytfP-yjfA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(378)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón ATG del ORF ytfP truncado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento ((635)..(637))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón ATG del ORF yjfA truncado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador pckA '5'-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador pckA '5'-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador pckA '3'-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador pckA '3'-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador Gdh1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador Gdh2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador RhtC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador RhtC2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador Tdh1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador Tdh2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador ytfP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador ytfP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
Claims (28)
1. Proceso de fermentación para la preparación
de L-aminoácidos, en donde se llevan a cabo los
pasos siguientes:
- a)
- fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA están atenuados,
- b)
- enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y
- c)
- tratamiento del L-aminoácido, o d) constituyentes del caldo de fermentación y aislamiento de la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde se utilizan microorganismos en los cuales otros genes del
camino biosintético del L-aminoácido deseado se
amplifican adicionalmente.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde se utilizan microorganismos en los cuales los caminos
metabólicos que reducen la formación del
L-aminoácido deseado se desactivan al menos
parcialmente.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la expresión del o de los polinucleótidos que codifican el
producto del gen pckA está desactivada.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde las propiedades reguladoras y/o catalíticas del polipéptido
(proteína enzimática) codificado por el polinucleótido pckA están
reducidas.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde microorganismos de la familia Enterobacteriáceas se
fermentan, en los cuales uno o más genes seleccionados del grupo
que comprende:
- 6.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 6.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 6.3
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
- 6.4
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
- 6.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 6.6
- el gen rhtB para resistencia a homoserina, y
- 6.7
- el gen rhtC para resistencia a treonina,
- 6.8
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa se amplifican simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde se fermentan microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del
grupo que comprende:
- 7.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 7.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 7.3
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA, y
- 7.4
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP,
- se atenúan, o se reduce la expresión de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde se prepara L-isoleucina,
L-valina, L-lisina o
L-treonina.
9. El plásmido pMAK705\DeltapckA, que contiene
partes de las regiones 5' y 3' del gen pckA, correspondientes a SEQ
ID No. 3.
\newpage
10. Polinucleótido aislado de microorganismos de
la familia Enterobacteriáceas que contienen una secuencia de
polinucleótidos que codifica las regiones 5' y 3' del gen pckA,
representadas en SEQ ID No. 4, que es particularmente adecuado como
constituyente de plásmidos para la mutagénesis específica de
posición del gen pckA.
11. Cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas que
contienen una mutación de deleción en el gen pckA, correspondiente a
SEQ ID No. 4.
12. Cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de
acuerdo con la reivindicación 11, que contienen adicionalmente una
mutación de deleción en el marco de lectura abierto ytfP,
correspondiente a SEQ ID No. 6 ó 7.
13. Cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de
acuerdo con la reivindicación 11, que contienen adicionalmente una
mutación de deleción en el marco de lectura abierto yjfA,
correspondiente a SEQ ID No. 6 ó 7.
14. Cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de
acuerdo con la reivindicación 11, en donde las mismas tienen una o
más características seleccionadas del grupo que comprende:
resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I amplificada
en la forma resistente a la realimentación, necesidad parcial
opcionalmente compensable de L-isoleucina,
treonina-deshidrogenasa atenuada y capacidad para
utilizar sacarosa.
15. La cepa MG442\DeltapckA de Escherichia
coli K-12, depositada bajo el número DSM 13761
en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células).
16. La cepa B3996kur\DeltatdhpckA/pVIC40 de
Escherichia coli K12, depositada bajo el número DSM 14150 en
la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células).
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