ES2336302T3

ES2336302T3 - Produccion de celulas ttcr gamma delta.

Info

Publication number: ES2336302T3
Application number: ES01921047T
Authority: ES
Inventors: David N. Bell; Danna L. Skea
Original assignee: Therapure Biopharma Inc
Current assignee: Therapure Biopharma Inc
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2010-04-12
Anticipated expiration: 2021-04-03
Also published as: EP1268746A2; ATE449162T1; WO2001075072A3; AU4816201A; NZ522337A; CA2405050A1; EP1268746B1; JP2003529363A; JP4982645B2; AU2001248162B2; DE60140526D1; WO2001075072A2; CA2405050C

Abstract

Procedimiento para expandir las células T TcRγδ+ en una muestra de partida, que comprende: (1)cultivar las células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T, interleuquina-2 e interleuquina-7, y (2)cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende interleuquina-2 e interleuquina-7 para expandir las células T TcRγδ+.

Description

Producción de células T TcR\gamma\delta.

La presente invención se refiere a procedimientos nuevos y mejorados para la expansión ex vivo de células T TcR\gamma\delta^{+}.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} son un subconjunto pequeño de linfocitos T circulantes que son diferentes de las células T TcR\alpha\beta^{+} convencionales, que reconocen, con una especificidad fina, los péptidos antígenos foráneos en el contexto de los elementos de restricción del complejo clásico de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I o II. En contraste, las células T TcR\gamma\delta^{+} pueden reconocer antígenos tanto peptídicos como no peptídicos que pueden derivarse a partir de microorganismos foráneos o de productos celulares endógenos inducidos por estrés, tal como una infección o transformación vírica. Además, al contrario que el reconocimiento de antígeno por parte de las células TcR\alpha\beta^{+}, el reconocimiento de antígeno por parte de las células T TcR\gamma\delta^{+} no se encuentra restringido al MHC.

Los receptores de células T de las células TcR\alpha\beta^{+} y TcR\gamma\delta^{+} se diferencian a partir de los diferentes elementos genéticos que los codifican. La mayoría de células T TcR\gamma\delta^{+} se clasifican en dos subconjuntos principales: V\delta1^{+} y V\delta2^{+} basándose en los genes que codifican su cadena \delta. El subconjunto mayor de las células T TcR\gamma\delta^{+} en la sangre periférica humana expresa V\delta2 en combinación con V\gamma9, mientras que la mayor parte del resto expresa V\delta1 en combinación con V\gamma2, V\gamma3, V\gamma4, V\gamma5 o V\gamma8 (Salerno A. y Dieli F., 1998).

Debido a que las células T TcR\gamma\delta^{+} no presentan las características de especificidad fina de las células T TcR\alpha\beta^{+}, se ha propuesto que representan un mecanismo inmunológico más primitivo que proporciona una función de vigilancia de primera línea contra la infección y los tumores (Boismenu R. et al., 1997). Varios estudios han documentado la respuesta de las células T TcR\gamma\delta^{+} frente a diversos virus, bacterias y parásitos (Bukowski J.F. et al., 1994; Wallace M. et al., 1994; Lang F. et al. 1995; Elloso M.M. et al., 1996), así como su capacidad de mediar en la lisis de células tumorales de diversos orígenes (Zocchi M.R. et al., 1990; Kitayama J. et al., 1993; Choudhary A. et al., 1995). Los tumores hematopoyéticos podrían ser particularmente susceptibles a los efectos líticos de las células T TcR\gamma\delta^{+} debido a que los ratones transgénicos que expresan el transgén V\gamma1.1 muestran una resistencia espontánea a leucemias de células T inyectadas y los hibridomas de células T TcR\gamma\delta^{+} derivados de estos ratones responden preferentemente a células malignas hematopoyéticas y no a células tumorales no hematopoyéticas (Penninger J. et al., 1995). Además, los clones humanos de células T TcR\gamma\delta^{+} derivadas de sangre periférica y de médula ósea del paciente se ha demostrado que lisan células leucémicas autólogas en la leucemia linfoblástica aguda y en la leucemia mieloide aguda, respectivamente (Bensussan A. et al., 1989; Jahn B. et al., 1995). Además, se ha demostrado la asociación entre una mayor supervivencia libre de enfermedad en pacientes de leucemia tras el trasplante de médula ósea alogénica y un incremento del número y porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+} en sangre periférica (Lamb L.S. et al., 1996). Conjuntamente, estos resultados sugieren que las células T TcR\gamma\delta^{+} podrían presentar un potencial terapéutico en el tratamiento del cáncer y de las enfermedades infecciosas.

Muchos de los procedimientos publicados que describen la expansión ex vivo de las células T TcR\gamma\delta^{+} requieren la presencia de antígeno. Las células o líneas celulares infectadas o transformadas por virus, las bacterias y los parásitos se ha demostrado que estimulan la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} ex vivo, al igual que las líneas celulares tumorales establecidas. Por ejemplo, se utilizaron células infectadas por virus herpes simplex (HSV) para estimular la expansión de las células V\delta2^{+} (Bukowski J.F. et al., 1994), mientras que las líneas celulares B-linfoblastoides transformadas por virus de Epstein Barr (EBV) se utilizaron para estimular la expansión de las células V\delta1^{+} (Orsini D.L.M. et al., 1993). Se ha demostrado que los extractos de Mycobacterium tuberculosis y antígenos palúdicos de Plasmodium falciparum en estadio sanguíneo estimulan la proliferación de las células T TcR\gamma\delta^{+} (Constant P. et al., 1994; Elloso M.M. et al., 1996). Daudi, una línea celular humana inmortalizada de linfoma de Burkitt, también puede estimular la proliferación de las células T TcR\gamma\delta^{+} (Kaur I. et al., 1993). Además, se ha demostrado que algunos antígenos no peptidilo de la familia del fosfato de prenilo bien caracterizados, por ejemplo el pirofosfato de isopentenilo, estimulan la expansión ex vivo de las células T TcR\gamma\delta^{+} (García V.E. et al., 1998). En algunos de estos sistemas, los cultivos de células T TcR\gamma\delta^{+} estimulados por antígenos se suplementaron con citoquinas.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} también han sido expandidos ex vivo a partir de poblaciones de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) mediante cultivo con IL-2 (Zocchi M.R. et al., 1990) o con IL-2 en combinación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado (Kitayama J. et al., 1993) o anticuerpo anti-TcR\gamma\delta^{+} (Yu S. et al., 1999). En estos sistemas, la estimulación selectiva de las células T TcR\gamma\delta^{+} por los antígenos tumorales se supone que se ha producido in vivo previamente al aislamiento de las células T del tejido canceroso.

En otro sistema, se expandieron células T TcR\gamma\delta^{+} procedentes de sangre periférica de pacientes de glioblastoma utilizando un anticuerpo anti-CD3 inmovilizado en fase sólida, en combinación con IL-2, seguido de cultivo en IL-2 solo (Yamaguchi T. et al., 1997). Estos autores informaron de que las células T TcR\gamma\delta^{+} posteriormente purificadas no proliferaban durante más de una semana en presencia de IL-2 solo y, por lo tanto concluyeron que este procedimiento resultaría aplicable únicamente a estudios de corto plazo. Además mostraron que el procedimiento producía en la expansión y el enriquecimiento de células T tanto TcR\gamma\delta^{+} como TcR\alpha\beta^{+}, consiguiendo purezas de las células T TcR\gamma\delta^{+} del orden de 28%. En un informe posterior, los mismos autores demostraron que dicho procedimiento expandía selectivamente el subconjunto V\delta2^{+} (Suzuki Y. et al., 1999). En otro informe, dicho grupo mostró que las células T TcR\gamma\delta^{+} expandidas en cultivo utilizando anti-CD3 e IL-2 seguido de IL-2 solo y que se purificaron posteriormente a partir de la población expandida proliferaron mejor al añadir IL-15, según un ensayo de incorporación de ^{3}H-timidina (Yamaguchi et al., 1998).

De esta manera, existen limitaciones a la proliferación celular y/o requisitos para la estimulación antigénica en los procedimientos existentes para el cultivo ex vivo y la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+}. A partir de lo expuesto anteriormente, existe una necesidad en la técnica de un procedimiento para cultivar selectivamente in vitro grandes cantidades de células TcR\gamma\delta^{+} esencialmente puras.

La presente invención proporciona nuevos procedimientos para expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo en ausencia de antígeno exógeno. En particular, los inventores han demostrado que las células T TcR\gamma\delta^{+} pueden expandirse mediante el cultivo de las células en un primer medio que contiene un mitógeno de células T, interleuquina-2 e interleuquina-7, y después subcultivando las células en un segundo medio de cultivo que contiene interleuquina-2 e interleuquina-7 en ausencia del mitógeno. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la presente invención proporciona un procedimiento para expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en una muestra de partida, que comprende:

(1): cultivar células en una muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T, interleuquina-2 e interleuquina-7, y

(2): cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende interleuquina-2 e interleuquina-7 para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+}.

La expresión "factor de crecimiento que presenta actividad similar a interleuquina-2" se refiere a cualquier compuesto que presenta la misma actividad que IL-2 con respecto a su capacidad de expandir las células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo, e incluye, de manera no limitativa, IL-2 y miméticos de IL-2, o cualquier equivalente funcional de IL-2.

La expresión "factor de crecimiento que presenta actividad similar a interleuquina-7" se refiere a cualquier compuesto que presenta la misma actividad que IL-7 con respecto a su capacidad de expandir las células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo, e incluye, de manera no limitativa, IL-7, miméticos de IL-7 o cualquier equivalente funcional de IL-7.

Los procedimientos de la invención resultan en poblaciones celulares expandidas de células T TcR\gamma\delta^{+}. El término "expandido" se refiere a que el número de células del tipo celular diana o deseado (es decir las células T TcR\gamma\delta^{+}) en la preparación final es más alto que el número en la población celular inicial o de partida.

En una forma de realización preferida, antes de cultivar las células en el primer medio de cultivo, el cultivo carece de células no TcR\gamma\delta^{+}. Los primer y segundo medios de cultivo también pueden contener otros factores de crecimiento (además de IL-2 e IL-7) que pueden incrementar la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+}. Entre los ejemplos de dichos factores de crecimiento se incluyen IL-4 e IL-15.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas mediante el procedimiento de la invención pueden utilizarse en una diversidad de aplicaciones experimentales, terapéuticas y comerciales.

Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente. Sin embargo, debe apreciarse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque hacen referencia a las formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a título ilustrativo, debido a que resultarán evidentes diversos cambios y modificaciones para el experto en la materia a partir de la presente descripción detallada.

A continuación, se describe la invención haciendo referencia a los dibujos, en los que:

La figura 1 es un gráfico que representa el número total de células viables frente al tiempo bajo diversas condiciones de cultivo,

La figura 2 es un gráfico que representa el número total de células viables frente al tiempo bajo diversas condiciones de cultivo,

La figura 3 es un gráfico que representa el número total de células viables frente al tiempo bajo diversas condiciones de cultivo,

La figura 4 es un gráfico que representa el número total de células viables frente al tiempo bajo diversas condiciones de cultivo,

La figura 5 es un gráfico que representa el número total de células viables frente al tiempo bajo diversas condiciones de cultivo.

La presente invención proporciona nuevos procedimientos para expandir selectivamente células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo. Los procedimientos pueden utilizar muestras de partida no fraccionadas o muestras de partida que han sido enriquecidas en células T. Ventajosamente, los procedimientos de la invención no requieren la utilización de estimulación antigénica, que resulta necesaria en la mayoría de los demás procedimientos.

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De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la presente invención proporciona un procedimiento para expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en una muestra de partida, que comprende:

(1): cultivar las células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T y por lo menos dos factores de crecimiento, y

(2): cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende por lo menos dos factores de crecimiento para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+},

en el que los dos factores de crecimiento son factores de crecimientos cualesquiera que pueden expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo, es decir, IL-2 e IL-7.

En el contexto de la presente invención se describe un procedimiento para expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en una muestra de partida, que comprende:

(1): cultivar células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende: (a) un mitógeno de células T, (b) un factor de crecimiento que presenta actividad similar a interleuquina-2 y (c) un factor de crecimiento que presenta actividad similar a interleuquina-7, y

(2): cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende: (i) un factor de crecimiento que presenta actividad similar a la de interleuquina-2, e (ii) un factor de crecimiento que presenta actividad similar a la de interleuquina-7 para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+}.

La expresión "factor de crecimiento que presenta actividad similar a interleuquina-7" se refiere a cualquier compuesto que presenta la misma actividad que IL-7 con respecto a su capacidad de expandir las células T TcR\gamma\delta^{+} en cultivo, e incluye, aunque sin limitación, IL-7, miméticos de IL-7 o cualquier equivalente funcional de IL-7.

La muestra de partida puede ser cualquier muestra que contenga células T TcR\gamma\delta^{+} o precursores de las mismas, incluyendo, aunque sin limitación, sangre, médula ósea, tejido linfoide, epitelio, timo, hígado, bazo, tejidos cancerosos, tejido de nódulo linfático, tejido infectado, tejido fetal y fracciones o partes enriquecidas de los mismos. La muestra de partida es preferentemente sangre, incluyendo sangre periférica o sangre de cordón umbilical o fracciones de las mismas, incluyendo células de la capa leucocitaria, células mononucleares y células mononucleares de baja densidad (LDMNC). Las células pueden obtenerse a partir de una muestra de partida de sangre utilizando técnicas conocidas de la técnica, tales como la centrifugación en gradiente de densidad. Por ejemplo, puede añadirse una capa de sangre completa sobre un volumen igual de Ficoll-Hypaque^{TM}, seguido de centrifugación a 400xg durante 30 minutos a temperatura ambiente. El material del interfaz contendrá las células mononucleares de baja densidad, que pueden recogerse y lavarse en medio de cultivo y centrifugarse a 100xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Antes del cultivo para células TcR\gamma\delta^{+}, las células pueden mantenerse en cualquier medio de cultivo adecuado de mamífero, tal como AIM-V^{TM}, RPMI 1640 o IMDM.

Antes de cultivar la muestra de partida o fracción de la misma (tal como LDMNC) en el primer medio de cultivo, la muestra o fracción de la misma puede enriquecerse para determinados tipos celulares y/o empobrecerse para otros tipos celulares. En particular, la muestra de partida o fracción de la misma puede enriquecerse para células T conjuntamente con el empobrecimiento en células T TcR\alpha\delta^{+}. La muestra puede enriquecerse o empobrecerse en determinados tipos celulares utilizando técnicas conocidas en la materia. En una forma de realización, el cultivo puede empobrecerse en células de un fenotipo particular mediante el cultivo de la muestra de partida o fracción de la misma con un cóctel de anticuerpos que contiene anticuerpos específicos para marcadores en las células en las que debe empobrecerse. Preferentemente los anticuerpos en el cóctel son complejos de anticuerpos tetraméricos tal como se describe en la patente US nº 4.868.109 de Landsdorp.

Tras fraccionar y enriquecer las células en la muestra de partida, si se desea, las células se cultivan en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T y por lo menos dos factores de crecimiento: interleuquina-2 e interleuquina-7. Preferentemente el mitógeno de células T se encuentra presente en una cantidad de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 \mug/ml; la interleuquina-2 se encuentra presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1.000 ng/ml; la interleuquina-7 se encuentra presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1.000 ng/ml. Más preferentemente, el mitógeno de células T se encuentra presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 \mug/ml; la interleuquina-2 se encuentra presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 ng/ml; la interleuquina-7 se encuentra presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 ng/ml. Más preferentemente, el medio comprende 1 \mug/ml de un mitógeno de células T; 10 ng/ml de interleuquina-2 y 10 ng/ml de interleuquina-7.

Las células se cultivan preferentemente en el primer medio de cultivo durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 21 días. Más preferentemente, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 14 días.

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El mitógeno de células T puede ser cualquier agente que pueda estimular las células T, incluyendo, aunque sin limitación, lectinas de origen vegetal y no vegetal, anticuerpos que activan las células T y otros mitógenos no lectina/no de anticuerpo. Una lectina vegetal preferida es la concanavalina A (ConA), aunque pueden utilizare otras lectinas vegetales tales como la fitohemaglutinina (PHA). Entre los anticuerpos preferidos se incluyen un anticuerpo anti-CD3 tal como OKT3, un anticuerpo anti-CD2 tal como OKT11 o un anticuerpo anti-CD28. Dentro del contexto de la presente invención, se entiende que entre los anticuerpos se incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab y F(ab^{1})^{2}), anticuerpos monocatenarios, fragmentos variables de cadena única (CcFv) y parejas de unión producidas recombinantemente. Entre otros mitógenos se incluyen 12-miristato-13-acetato de forbol (TPA) y sus compuestos relacionados, tales como mezereína, o compuestos bacterianos tales como la enterotoxina A estafilocócica (SEA) y la proteína A estreptocócica. El mitógeno de células T puede ser soluble o inmovilizarse, y puede utilizarse más de un mitógeno de células T en el procedimiento de la
invención.

Tras el cultivo en el primer medio de cultivo, las células se lavan mediante centrifugación y se subcultivan en un segundo medio de cultivo que comprende por lo menos dos factores de crecimiento, incluyendo por lo menos interleuquina-2 e interleuquina-7. En el caso de que las células se subcultiven con IL-2 solo, la proliferación continúa durante unos cuantos días aunque posteriormente se reduce rápidamente. De esta manera, para conseguir una proliferación celular continua tras la eliminación del mitógeno, se requiere tanto IL-2 como IL-7 en el segundo medio de
cultivo.

La etapa de subcultivo (es decir, la eliminación del mitógeno de células T) es importante para la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} mediante el procedimiento de la presente invención, particularmente en el caso de que la muestra de partida o las LDMNC no se fraccionen antes del cultivo en el primer medio de cultivo. En el caso de que las LDMNC se fraccionen, la etapa de subcultivo puede ser opcional. A la inversa, en el caso de que el mitógeno no se incluya en el primer medio de cultivo, se produce poca o ninguna expansión celular. La eliminación del mitógeno mediante subcultivo presenta la ventaja adicional de que las células T TcR\gamma\delta^{+} resultan más adecuadas para la utilización terapéutica, debido a que la administración de mitógeno residual en un paciente no resulta deseable. La eliminación del mitógeno de células T en la etapa de subcultivo puede no resultar necesaria en el caso de que las células T TcR\gamma\delta^{+} sean para usos experimentales, diagnósticos u otros usos no terapéuticos.

Preferentemente, en el segundo medio de cultivo, los dos factores de crecimiento, IL-2 e IL-7, se encuentran presentes a las mismas concentraciones que las indicadas anteriormente para el primer medio de cultivo.

Las células se cultivan preferentemente en el segundo medio de cultivo durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 21 días. Más preferentemente, entre aproximadamente 9 días y aproximadamente 13 días.

Los primer y segundo medios de cultivo pueden incluir además otros ingredientes que pueden ayudar al crecimiento y expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+}. Entre los ejemplos de otros ingredientes que pueden añadirse se incluyen, de manera no limitativa, plasma o suero, factores de crecimiento adicionales, incluyendo citoquinas tales como IL-4 e IL-5, factores de necrosis tumoral (TNFs) e interferones (IFNS), proteínas purificadas tales como albúmina, una fuente de lípidos, tal como lipoproteína de baja densidad (LDL), vitaminas, aminoácidos, esteroides y cualquier otro suplemento que proporcione soporte o estimule el crecimiento y/o la supervivencia.

En una forma de realización preferida, los primer y segundo medios de cultivo incluyen adicionalmente otros factores de crecimiento, tales como IL-4 o IL-5 o un mimético o equivalente funcional de los mismos. En el contexto de la presente invención se ha descubierto que la adición de un tercer factor de crecimiento a los primer y segundo medios incrementa la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} en comparación con la expansión conseguida utilizando dos factores de crecimiento.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en el contexto de la presente invención se describe además un procedimiento para expandir células T TcR\gamma\delta^{+} en una muestra de partida, que comprende:

(1): cultivar células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T y por lo menos tres factores de crecimiento, y

(2): cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende por lo menos tres factores de crecimiento para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+}.

En una forma de realización preferida, los tres factores de crecimiento se seleccionan de entre combinaciones de IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Entre los ejemplos de combinaciones se incluyen IL-2, IL-4 e IL-15; IL-2, IL-4 e IL-7, e IL-2, IL-7 e IL-15. El tercer factor de crecimiento puede encontrarse presente en una cantidad similar a la de los dos factores de crecimiento indicados anteriormente.

En el contexto de la presente invención se ha descubierto asimismo que la adición de un cuarto factor de crecimiento a los primer y segundo medios incrementa la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} en comparación con la expansión obtenida utilizando dos o tres factores de crecimiento.

(1): cultivar las células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T y por lo menos cuatro factores de crecimiento, y

(2): cultivar las células obtenidas en la etapa (1) en un segundo medio de cultivo que comprende por lo menos cuatro factores de crecimiento para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+}.

En formas de realización preferidas, los cuatro factores de crecimiento son IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15.

Preferentemente, tanto el primer como el segundo medios de cultivo se suplementan con suero o plasma (P). La cantidad de P en los primer y segundo medios de cultivo preferentemente se encuentra comprendida entre aproximadamente 1% y aproximadamente 25%. Más preferentemente, la cantidad de P en los primer y segundo medios de cultivo se encuentra comprendida entre aproximadamente 2% y aproximadamente 20%. Todavía más preferentemente, la cantidad de P en los primer y segundo medios de cultivos se encuentra comprendida entre aproximadamente 2,5% y aproximadamente 10%. Más preferentemente, la cantidad de P en los primer y segundo medios de cultivos es de 5%. El suero o plasma (P) puede obtenerse a partir de cualquier fuente, incluyendo, aunque sin limitación, sangre periférica humana, sangre de cordón umbilical, o sangre derivada de otra especie de mamífero. El plasma puede obtenerse de un único donante o puede agruparse de varios donantes. En el caso de que deban utilizarse clínicamente células T TcR\gamma\delta^{+} autólogas, es decir reinfusionadas en el mismo paciente del que se ha obtenido la muestra de partida original, resulta preferido utilizar también P autólogo (es decir, del mismo paciente), para evitar la introducción de productos extraños (por ejemplo virus) en dicho paciente. En el caso de que las células T TcR\gamma\delta^{+} deban utilizarse alogénicamente (es decir, infusionarse en una persona diferente de la que se ha obtenido la muestra de partida original), resulta preferido utilizar plasma de uno o del otro para minimizar la introducción de productos extraños en el paciente; por lo menos, el plasma debe derivarse de un ser humano para evitar la administración de productos animales en el paciente.

Los procedimientos de la invención resultan en poblaciones celulares expandidas de células T TcR\gamma\delta^{+}. El término "expandido" se refiere a que el número de células del tipo celular diana o deseado (es decir, de células T TcR\gamma\delta^{+}) en la preparación final es superior al número en la población celular de partida o inicial.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas según los procedimientos de la invención pueden separarse de otras células que pueden encontrarse presentes en el cultivo final utilizando técnicas conocidas de la técnica, incluyendo la separación celular activada por fluorescencia, la separación inmunomagnética, la cromatografía de columna de afinidad, la centrifugación en gradiente de densidad y el cribado celular en fase sólida.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas según los procedimientos de la invención también resultan de utilidad. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en el contexto de la presente invención se describe una preparación celular de células T TcR\gamma\delta^{+}. Preferentemente, las células T TcR\gamma\delta^{+} constituyen más de 60%, más preferentemente más de 80% y todavía más preferentemente más de 90%, del total de células en la población enriquecida.

Las células TcR\gamma\delta^{+} obtenidas mediante el procedimiento de la invención pueden utilizarse en cualquiera y en todas las aplicaciones. Se cree que las células T TcR\gamma\delta^{+} forman una primera línea de defensa frente a patógenos infecciosos. Además, las células T TcR\gamma\delta^{+} presentan actividad citolítica intrínseca contra células transformadas de diversos orígenes, incluyendo linfomas de células B, sarcomas y carcinomas. En consecuencia, las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas y cultivas ex vivo según el procedimiento de la invención pueden trasfundirse en un paciente para el tratamiento o la prevención de infecciones, cáncer o enfermedades resultantes de la inmunosupresión. Ventajosamente, las células T TcR\gamma\delta^{+} de la invención no contienen mitógenos o suero fetal bovino, con lo que resultan útiles para aplicaciones terapéuticas en el ser humano. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en el contexto de la presente invención se describe un procedimiento para modular una respuesta inmunológica, que comprende administrar una cantidad efectiva de células T TcR\gamma\delta^{+} preparadas según un procedimiento de al invención en un animal que necesita las mismas.

La expresión "cantidad efectiva" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios para conseguir los resultados deseados.

El término "animal" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todos los miembros del reino animal. Preferentemente, el animal es un mamífero, más preferentemente es un ser humano.

En el contexto de la presente invención se describe un procedimiento para tratar una infección, que comprende administrar una cantidad efectiva de células T TcR\gamma\delta^{+} preparadas según el procedimiento de la invención en un animal que las necesita.

Entre los ejemplos de infecciones que pueden tratarse se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, infecciones bacterianas tales como aquéllas causadas por Mycobacteria (por ejemplo la tuberculosis), infecciones víricas tales como las causadas por el virus del herpes simplex (HSV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o los virus de la hepatitis, e infecciones parasitarias tales como aquéllas causadas por Plasmodium (por ejemplo la malaria).

En el contexto de la presente invención se describe asimismo un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de células T TcR\gamma\delta^{+} preparadas según el procedimiento de la invención en un animal que las necesita.

Entre los ejemplos de cáncer que pueden tratarse están comprendidas de manera no limitativa, leucemias, incluyendo la leucemia mielógena crónica, la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfoblástica aguda y las leucemias de células T y células B, linfomas (de Hodgkin y no de Hodgkin), trastornos linfoproliferativos, plasmacitomas, histiocitomas, melanomas, adenomas, sarcomas, carcinomas de tejidos sólidos, tumores hipóxicos, carcinomas de células escamosas, cánceres genitourinarios tales como el cáncer cervical y de vejiga, cánceres hematopoyéticos, cánceres de cabeza y cuello, y cánceres del sistema nervioso.

En el contexto de la presente invención se describe además un procedimiento procedimiento para tratar la leucemia mielógena crónica, que comprende administrar una cantidad efectiva de células T TcR\gamma\delta^{+} preparadas según el procedimiento de la invención en un animal que las necesita. En esta forma de realización, las LDMNC pueden obtenerse de un paciente que presenta leucemia mielógena crónica (CML). Tras cultivar y expandir las células T TcR\gamma\delta^{+}, las células expandidas no contendrán células CML cancerosas, con lo que resultarán muy adecuadas para la reinfusión en el paciente.

En el contexto de la presente invención se describe además la utilización de células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas mediante los procedimientos de la invención para la modulación de una respuesta inmunológica, para tratar una infección o para tratar cáncer tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. La invención incluye además la utilización de células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas según los procedimientos de la invención, para la preparación de un medicamento o composición farmacéutica para modular una respuesta inmunológica, para tratar una infección o para tratar cáncer, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas según la presente invención también pueden utilizarse en modelos experimentales, pro ejemplo para estudiar adicionalmente y elucidar la función de las células. Además, estas células pueden utilizarse para estudios dirigidos a la identificación de los antígenos/epítopos reconocidos por las células T TcR\gamma\delta^{+} y para el diseño y el desarrollo de vacunas.

Las células T TcR\gamma\delta^{+} obtenidas, según la invención pueden utilizarse inmediatamente en las aplicaciones terapéuticas, experimentales o comerciales mencionadas anteriormente, o las células pueden conservarse criogénicamente para la utilización posterior.

Los ejemplos no limitativos siguientes son ilustrativos de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Se aislaron células mononucleares de baja densidad (LDMNC) a partir de sangre periférica adulta mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Hypaque^{TM} (densidad=1,077 g/ml). Se añadió una capa de 100 ml de volumen de sangre completa en alícuotas de 10 a 15 ml sobre un volumen igual de Ficoll-Hypaque^{TM} en probetas cónicas de cultivo de tejido de 50 ml que se centrifugaron a continuación a 400xg durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recogió el material de la interfase que contenía las células mononucleares y las células se lavaron dos veces en medio de cultivo (AIM-V^{TM} que contenía 20 unidades/ml de heparina y 2-mercaptoetanol 50 \muM; HCBM-2) mediante centrifugación a 100xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se diluyeron en HCBM-2 que contenía 10% de plasma autólogo y se incubaron en matraces de poliestireno de cultivo de tejidos durante la noche a 37ºC y con 5% de CO_{2}. La mañana siguiente, las células se lavaron dos veces mediante centrifugación y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 2% de plasma autólogo. Se diluyó 1:20 una muestra de la suspensión celular con ácido acético al 2% y se determinó el número total de células nucleadas utilizando un hemocitómetro.

Se enriqueció el cultivo de LDMNC en células T TcR\gamma\delta^{+} mediante selección negativa utilizando un cóctel de anticuerpos específicos de linaje y cromatografía de afinidad inmunomagnética (StemSep^{TM}, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). Se resuspendió un total de 8,2x10^{7} LDMNC en 1,25 ml de PBS que contenía 2% de plasma autólogo y se añadió un cóctel específico de linaje de anticuerpos monoclonales. El cóctel contenía anticuerpos específicos para CD14 (monocitos), CD16 (células NK), CD19 (células B), CD33 (células progenitoras mieloides), CD56 (células NK), glicoforina A (células eritroides) y TcR\alpha\beta (células T TcR\alpha\beta^{+}). Dichos anticuerpos eran anticuerpos biespecíficos con una especificidad antigénica para el marcador específico de linaje y la otra especificidad antigénica para el dextrano. Las LDMNC se incubaron con los anticuerpos biespecíficos sobre hielo durante 30 minutos, añadiendo a continuación coloide de dextrano de hierro y se continuó la incubación durante 30 minutos adicionales. A continuación, la suspensión se sometió a cromatografía inmunomagnética, un procedimiento que elimina las células que han sido entrecruzadas por los anticuerpos biespecíficos a las partículas de dextrano de hierro. De esta manera, las células recuperadas eran una población enriquecida de células TcR\gamma\delta^{+} que no se habían unido ni a anticuerpo ni al dextrano de hierro. En rendimiento de células T TcR\gamma\delta^{+} obtenido fue de 2,65x10^{5} células.

Se sembró un cultivo de tejido con las células T TcR\gamma\delta^{+} enriquecidas, bajo diversas condiciones (indicadas a continuación) a una densidad de 1x10^{5} células/ml en HCMB-2 que contenía 5% de plasma autólogo (P) y los cultivos se incubaron a 37ºC y con 5% de CO_{2}. En diversos puntos del tiempo se realizó un seguimiento de la expansión celular mediante recuento de las células en una muestra pequeña de cada cultivo utilizando un hemocitómetro. Las muestras se diluyeron con un volumen igual de azul tripán al 0,4% previamente al recuento, de manera que las células viables (no teñidas) pudiesen distinguirse de las células no viables (teñidas de azul).

Inicialmente, las células se cultivaron bajo dos condiciones diferentes (condición 1 y condición 6) y después las células bajo la condición 1 se subcultivaron bajo cinco condiciones diferentes (condiciones 1 a 5). Inicialmente, bajo la condición 1, se añadió una combinación de mitógeno y citoquinas a un cultivo enriquecido de 1,3x10^{5} células T TcR\gamma\delta^{+}, de la manera siguiente: 1 \mug/ml de concanavalina A (ConA), 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4. Las células se cultivaron bajo esta condición durante 7 días, después de lo cual se habían expandido aproximadamente en 3,5 veces hasta un total de 4,5x10^{5} células viables. En este punto, se añadió al cultivo medio de cultivo fresco que contenía 5% de plasma autólogo, para diluir las células hasta una densidad de 1x10^{5} células/ml (volumen total=4,5 ml) y se añadió 1 \mug/ml de concanavalina A, 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4. Se continuó el cultivo durante 2 días más, después de lo cual las células se habían expandido hasta un total de 2,0x10^{6} células viables. En este punto, las células se subcultivaron de la manera siguiente: las células se peletizaron mediante centrifugación a 100xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez con HCBM-2 y se resuspendieron a una densidad de 1,0x10^{5} células/ml en HCMB-2 que contenía 2% de plasma autólogo. Las células resuspendidas se dividieron en 5 partes iguales de 4,0x10^{5} células cada una y se cultivaron bajo las condiciones siguientes:

1.: 1 \mug/ml de ConA + 10 ng/ml de IL-2 + 10 ng/ml de IL-4 + 2% de P

2.: 10 ng/ml de IL-2 + 10 ng/ml de IL-4 + 2% de P

3.: 10 ng/ml de IL-2 + 2% de P

4.: 10 ng/ml de IL-4 + 2% de P

5.: 2% de P.

El día 12, se realizó un recuento de las células en cada cultivo y se añadió medio de cultivo fresco que contenía 2% de plasma autólogo a cada uno para diluir las células hasta 1x10^{5} células/ml. Se añadió mitógeno fresco y citoquinas para mantener las condiciones proporcionadas anteriormente. Se continuaron los cultivos durante 4 días más (hasta el día 16), momento en el que se realizó un recuento de las células bajo cada condición y se analizaron los cultivos mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+}.

En una sexta condición de cultivo, se sembraron células T TcR\gamma\delta^{+} en un cultivo tal como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que, en esta condición, las células no se estimularon con mitógeno y se mantuvieron en todo momento en presencia de 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4 en HCBM-2 con plasma autólogo.

Sumario de las condiciones

Condición de cultivo - -> Condición de subcultivo

1.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> ConA + IL-2 + IL-4 + P

2.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P

3.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + P

4.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-4 + P

5.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> P

6.: IL-2 + IL-4 + P.

Los resultados de este experimento están representados en la figura 1, en la que el número total de células viables en cada condición de cultivo se proporciona en un gráfico como función del tiempo. La flecha en la figura indica el punto del tiempo en el que se subcultivaron las células. Los recuentos celulares numéricos se proporcionan en la tabla adjunta al gráfico, conjuntamente con el porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+} en las poblaciones expandidas al final del periodo de cultivo.

Estos datos demuestran que se consigue la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} mediante el procedimiento de la presente invención, es decir:

Mitógeno (por ejemplo ConA) + IL-2 + IL-4 - -> IL-2 + IL-4.

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Los datos también demuestran que la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} es mayor en el caso de que se utilice IL-4 que en el caso de que no se utilice, es decir, la expansión total fue mayor bajo la condición 2 que bajo la condición
3.

Los datos demuestran además que el mitógeno resulta necesario al inicio del cultivo para que se produzca una expansión significativa de las células T TcR\gamma\delta^{+}, es decir, la expansión total fue mucho mayor bajo la condición 2 que bajo la condición 6.

Los datos demuestran además que la etapa de subcultivo (es decir, la eliminación del mitógeno del cultivo) resulta en una mejor expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+}, es decir, la expansión total fue mayor bajo la condición 2 que bajo la condición 1.

Los datos también demuestran que se obtiene una alta pureza de células T TcR\gamma\delta^{+} (99%) mediante el procedimiento de la presente invención sin necesidad de una purificación adicional de la población celular expandida.

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Ejemplo 2

Se enriqueció un cultivo en células T TcR\gamma\delta^{+} a partir de LDMNC de sangre periférica adulta tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células T TcR\gamma\delta^{+} enriquecidas se sembraron en un cultivo de tejidos y se expandieron de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, condición 2. Específicamente, se iniciaron cultivos con: (1) 1 \mug/ml de concanavalina A y 10 ng/ml de IL-2, o (2) 1 \mug/ml de concanavalina A y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4, o (3) 1 \mug/ml de concanavalina A y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7. El día 10, se subcultivaron las células en cada condición, es decir, se eliminó el mitógeno, y las células se expandieron adicionalmente en: (1) IL-2, o (2) IL-2 e IL-4, o (3) IL-2 e IL-7. El día 17, se terminaron los cultivos, se determinaron los recuentos celulares finales y se evaluó la pureza de células T TcR\gamma\delta^{+} mediante citometría de flujo.

Sumario de las condiciones

Condición de cultivo - -> Condición de subcultivo

1.: ConA + IL-2 + P - -> IL-2 + P

2.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P

3.: ConA + IL-2 + IL-7 + P - -> IL-2 + IL-7 + P.

Los resultados de este experimento están representados en la figura 2, en la que se proporciona un gráfico como función del tiempo del número total de células viables bajo cada condición de cultivo. La flecha en la figura indica el punto del tiempo en el que se subcultivaron las células (es decir, en que se eliminó el mitógeno). Los recuentos celulares numéricos se proporcionan en la tabla adjunta al gráfico, conjuntamente con el porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+} en las poblaciones expandidas al final del periodo de cultivo.

Estos datos demuestran que se ha conseguido la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} mediante el procedimiento de la presente invención, es decir:

Mitógeno (por ejemplo ConA) + IL-2 + IL-4 o IL-7 - -> IL-2 + IL-4 o IL-7.

Los datos demuestran además que la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} es mayor en el caso de que se utilice
IL-4 o IL-7 que en el caso de que no se utilicen, es decir, la expansión total fue mayor bajo las condiciones 2 y 3 que bajo la condición 1.

Los datos también demuestran que se obtiene una pureza muy alta de células T TcR\gamma\delta^{+} (>95%) mediante el procedimiento de la presente invención sin purificación adicional de la población celular expandida.

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Ejemplo 3

Se enriqueció un cultivo en células T TcR\gamma\delta^{+} a partir de LDMNC de sangre periférica adulta tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células T TcR\gamma\delta^{+} enriquecidas se sembraron en un cultivo de tejidos y se expandieron de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, condición 2, con la excepción de que el mitógeno utilizado era un anticuerpo monoclonal inmovilizado en lugar de concanavalina A. Se recubrieron pocillos de una placa de cultivo de tejidos con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3, a una concentración de 10 \mug/ml en PBS durante la noche a 4ºC. Se vaciaron los pocillos y se lavaron cinco veces con PBS previamente a la utilización. A modo de control negativo, de manera similar se utilizó una inmunoglobulina de isotipo correspondiente (IgG2a) de especificidad antigénica irrelevante. Se iniciaron cultivos con: (1) OKT3 inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2, (2) OKT3 inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4, o (3) IgG2a inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4. El día 8, se subcultivaron las células bajo cada condición, es decir, se eliminó el mitógeno. Lo expuesto anteriormente se llevó a cabo mediante resuspensión de las células, eliminación de la suspensión celular de los pocillos recubiertos, peletización y lavado de las células mediante centrifugación y reintroduciendo las células en pocillos de cultivo de tejidos no recubiertos. Los cultivos se expandieron adicionalmente en: (1) IL-2, (2) IL-2 e IL-4, (3) IL-2 e IL-4. El día 20, se terminaron los cultivos, se determinaron los recuentos celulares finales y se evaluó la pureza de células T TcR\gamma\delta^{+} mediante citometría de flujo.

Sumario de las condiciones

Condición de cultivo - -> Condición de subcultivo

1.: OKT3 + IL-2 + P - -> IL-2 + P

2.: OKT3 + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P

3.: IgG2a + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P.

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 3, en la que se proporciona un gráfico como función del tiempo del número total de células viables bajo cada condición de cultivo. La flecha en la figura indica el punto del tiempo en el que se subcultivaron las células. Los recuentos celulares numéricos se proporcionan en la tabla adjunta al gráfico, conjuntamente con el porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+} en la población expandida al final del periodo de cultivo.

Mitógeno (por ejemplo OKT3) + IL-2 + IL-4 - -> IL-2 + IL-4.

Los datos demuestran que la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} es mayor en el caso de que se utilice IL-4 que en el caso de que no se utilice, es decir, la expansión total fue mayor bajo la condición 2 que bajo la condición 1.

Los datos demuestran que el mitógeno puede ser un anticuerpo monoclonal, y que la especificidad del anticuerpo monoclonal es importante, debido a que la expansión total fue mucho más alta bajo la condición 2 que bajo la condición 3.

Los datos también demuestran que se obtienen una pureza muy alta de células T TcR\gamma\delta^{+} (94%) mediante el procedimiento de la presente invención sin purificación adicional de la población celular expandida. Además, la pureza en células T TcR\gamma\delta^{+} es más alta en el caso de que se utilice IL-4 (94%) que en el caso de que no se utilice
(73%).

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Ejemplo 4

Se enriqueció un cultivo en células T TcR\gamma\delta^{+} a partir de LDMNC de sangre periférica adulta tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se sembró un cultivo de tejidos con células T TcR\gamma\delta^{+} enriquecidas y se expandieron de manera similar a la descrita en el Ejemplo 3. Los cultivos se iniciaron con: (1) OKT3 inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2, (2) OKT3 inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-4, o (3) OKT3 inmovilizado y 10 ng/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7. El día 6, se subcultivaron las células bajo cada condición, es decir se eliminó el mitógeno. Los cultivos se expandieron adicionalmente en: (1) IL-2, (2) IL-2 e IL-4, o (3) IL-2 e IL-7. El día 21, se finalizaron los cultivos y se determinaron los recuentos celulares finales.

Sumario de las condiciones

Condición de cultivo - -> Condición de subcultivo

1.: OKT3 + IL-2 + P - -> IL-2 + P

2.: OKT3 + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P

3.: OKT3 + IL-2 + IL-7 + P - -> IL-2 + IL-7 + P.

Los resultados de este experimento están representados en la figura 4, en la que se proporciona un gráfico como función del tiempo del número total de células viables bajo cada condición de cultivo. La flecha indica el punto del tiempo en que se subcultivaron las células. Los recuentos celulares numéricos se proporcionan en la tabla adjunta al gráfico, conjuntamente con el porcentaje de células T TcR\gamma\delta^{+} en las poblaciones expandidas al final del periodo de cultivo.

Mitógeno (por ejemplo OKT3) + IL-2 + IL-4 o IL-7 - -> IL-2 + IL-4 o IL-7.

Los datos demuestran además que la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} es mayor en el caso de que se utilice
IL-4 o IL-7 que en el caso de que no se utilicen, es decir, la expansión total es más alta bajo las condiciones 2 y 3 que bajo la condición 1.

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Ejemplo 5

Se enriqueció un cultivo en células T TcR\gamma\delta^{+} a partir de LDMNC de sangre periférica adulta tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se sembró en una placa de cultivo de tejidos un cultivo enriquecido de células T TcR\gamma\delta^{+} y se expandió de manera similar a la descrita en el Ejemplo 2. Específicamente, se iniciaron cultivos con 1 \mug/ml de concanavalina A y una combinación de citoquinas (ver posteriormente), cada una de las cuales se utilizó a una concentración de 10 \mug/ml. El día 8, se subcultivaron las células en cada condición, es decir, se eliminó el mitógeno, y las células se expandieron adicionalmente utilizando únicamente la combinación respectiva de citoquinas.

Sumario de las condiciones

Condición de cultivo - -> Condición de subcultivo

1.: ConA + IL-2 + P - -> IL-2 + P

2.: ConA + IL-2 + IL-4 + P - -> IL-2 + IL-4 + P

3.: ConA + IL-2 + IL-4 + IL-7 + P - -> IL-2 + IL-4 + IL- 7 + P

4.: ConA + IL-2 + IL-4 + IL-15 + P - -> IL-2 + IL-4 + IL-15 + P

5.: ConA + IL-2 + IL-7 + IL-15 + P - -> IL-2 + IL-7 + IL-15 + P

6.: ConA + IL-2 + IL-4 + IL-7 + IL-15 + P - -> IL-2 + IL-4 + IL-7 + IL-15 + P.

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 5, en la que se proporciona un gráfico como función del tiempo del número total de células viables bajo cada condición de cultivo. La flecha en la figura indica el punto del tiempo en el que se subcultivaron las células (es decir, en que se eliminó el mitógeno). Se proporcionan los recuentos celulares numéricos en la tabla adjunta al gráfico.

Estos datos demuestran que la adición de un tercer factor de crecimiento incrementa la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} en comparación con la expansión obtenida utilizando uno o dos factores de crecimiento, es decir, la expansión fue más alta bajo las condiciones 3, 4 y 5 que bajo las condiciones 1 y 2.

Estos datos demuestran además que la adición de un cuarto factor de crecimiento incrementa la expansión de las células T TcR\gamma\delta^{+} en comparación con la expansión obtenida utilizando uno, dos o tres factores de crecimiento, es decir, la expansión fue mayor bajo la condición 6 que bajo las condiciones 1 a 5.

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Citas completas para las referencias mencionadas en la memoria

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Claims

1. Procedimiento para expandir las células T TcR\gamma\delta^{+} en una muestra de partida, que comprende:

(1): cultivar las células en la muestra de partida en un primer medio de cultivo que comprende un mitógeno de células T, interleuquina-2 e interleuquina-7, y

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además enriquecer las células en la muestra de partida en células T previamente a la etapa (1).

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además enriquecer las células en la muestra de partida en células T TcR\gamma\delta^{+} previamente a la etapa (1).

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además empobrecer las células en la muestra de partida de células CD14^{+}, CD16^{+}, CD19^{+}, CD33^{+}, CD56^{+} y glicoforina-A^{+} previamente a la etapa
(1).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además empobrecer las células en la muestra de partida de células T TcR\alpha\beta^{+} previamente a la etapa (1).

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además empobrecer las células en la muestra de partida de células T no TcR\gamma\delta^{+} previamente a la etapa (1).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de partida es sangre o tejido o fracciones de los mismos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la muestra de partida se selecciona de entre sangre periférica, sangre de cordón umbilical, médula ósea, tejido linfoide, epitelio, timo, hígado, bazo, tejido canceroso, tejido infectado, tejido de nódulo linfático o fracciones de los mismos.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que la muestra de partida es sangre periférica humana o una fracción de la misma.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de partida es de células mononucleares de baja densidad.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en el primer medio de cultivo el mitógeno de células T se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 \mug/ml y en el que en los primer y segundo medios de cultivo la interleuquina-2 se encuentra presente en una cantidad comprendida de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1.000 ng/ml, y la interleuquina-7 se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1.000 ng/ml.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en el primer medio de cultivo el mitógeno de células T se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 \mug/ml y en el que en los primer y segundo medios de cultivo la interleuquina-2 se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ng/ml y la interleuquina-7 se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ng/ml.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en el primer medio de cultivo el mitógeno de células T se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 \mug/ml y en el que en los primer y segundo medios de cultivo la interleuquina-2 se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 ng/ml y la interleuquina-7 se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 ng/ml.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el primer medio de cultivo comprende 1 \mug/ml de un mitógeno de células T y en el que en los primer y segundo medios de cultivo 10 ng/ml de interleuquina-2 y 10 ng/ml de interleuquina-7.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dichos primer y segundo medios de cultivo comprenden además un factor de crecimiento adicional.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho factor de crecimiento adicional es IL-4 o IL-15, o un mimético o equivalente funcional de los mismos.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dichos primer y segundo medios de cultivo comprenden además dos factores de crecimiento adicionales.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dichos dos factores de crecimiento adicionales son IL-4 e IL-15, o un mimético o equivalente funcional de los mismos.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el mitógeno de células T es una lectina vegetal.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la lectina vegetal es la concanavalina A.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el mitógeno de células T es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo se une a CD3 o a un fragmento del mismo.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los primer y segundo medios de cultivo contienen además suero o plasma.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el suero o el plasma se encuentran presentes en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 25% en volumen.

25. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el suero o el plasma se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 20% en volumen.

26. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el suero o el plasma se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 10% en volumen.

27. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el suero o el plasma se encuentra presente en una cantidad de aproximadamente 5% en volumen.