ES2336312T3 - Procedimiento de preparacion de derivados de bisfosfonatos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de derivados de bisfosfonato de fórmula (I) siguiente: **(Ver fórmula)** representando R1, R2 y R3, idénticos o diferentes, un átomo de hidrógeno, un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o heterociclo, en la que R1 y R2 son diferentes del átomo de hidrógeno, A representa un radical de fórmula -(CH2)n-R4, R4 representa un átomo de hidrógeno, un radical alquilo, un radical arilo, un heterociclo o un radical de fórmula -NR5R6, R5 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, n es un entero de 0 a 24 incluido, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: - la puesta en contacto al menos un halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX con al menos un fosfito de fórmula (V): P(OR1)(OR2)(OR), representando R1, R2 y R, idénticos o diferentes, un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o heterociclo, para formar un α-cetofosfonato de fórmula (III), - la puesta en contacto el α-cetofosfonato obtenido anteriormente de fórmula (III): **(Ver fórmula)** con al menos un fosfito sililado de fórmula (IV): (IV)P[OSialk3]x [OR3]3-x fórmula (IV) en la que R3 representa un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o heterociclo, siendo A tal como se definió anteriormente, X representa un átomo de halógeno, preferiblemente cloro, alk representa un radical alquilo de C1-6, x representa 2 ó 3, - una hidrólisis de los compuestos obtenidos en la etapa anterior, estando dichos radicales alquilo, arilo, heterociclo y aciloxialquilo mencionados anteriormente eventualmente sustituidos por al menos un grupo elegido de un radical arilo, un radical heterociclo, un radical heterocicloalquilo, un radical alquilo, un radical alquenilo, un radical alquinilo, un radical alquiltio, un átomo de halógeno, preferiblemente CI, F, Br, un radical hidroxilo, un grupo NO2, un radical alcoxilo, un grupo éster (-COOR), un grupo aminado -NRR'''''', una función ácido, un grupo amida (-CONHR o -NHCOR), en el que R y R'''''' representan, independientemente uno del otro, un átomo de hidrógeno, un radical alquilo, arilo, heteroarilo o aciloxialquilo.
Description
Procedimiento de preparación de derivados de
bisfosfonatos.
La presente invención se refiere a
procedimientos de preparación de derivados parcialmente
esterificados del ácido
1-hidroximetilen-1,1-bisfosfónico
(o bisfosfonato). También describe los derivados así preparados,
composiciones farmacéuticas que los comprenden, su aplicación en
terapia, especialmente para el tratamiento de tumores cancerosos y
enfermedades virales o inflamatorias hepáticas.
Los derivados de los ácidos
1-hidroximetilen-1,1-bifosfónicos
presentan propiedades anti-tumorales notables y sus
aplicaciones médicas han sido objeto de investigaciones avanzadas.
Estos derivados, que se caracterizan por un enlace
P-C-P, son análogos estables de
pirofosfato y son resistentes a la hidrólisis enzimática. En lo que
se refiere a las aplicaciones de los derivados de ácido difosfónico
en terapia, se sabe que diversos derivados tienen propiedades
útiles en el tratamiento de la inflamación, de la osteoporosis o de
ciertas metástasis óseas. En particular, se usan gracias a sus
propiedades inhibidoras de la resorción ósea para tratar numerosas
enfermedades caracterizadas por un metabolismo anómalo del calcio.
La resorción ósea aumenta de manera patológica en las metástasis de
ciertos cánceres, tales como cánceres de mama o de próstata, y de
manera acelerada en los diferentes tipos de osteoporosis entre las
cuales está la relacionada con la edad. Los pacientes que presentan
este tipo de metástasis pueden beneficiarse actualmente de
protocolos de tratamientos que incluyen bisfosfonatos (Diel et
al., 2000; Lipton, 2000; Mincey et al., 2000). Debe
destacarse que el sistema óseo es el tercer sitio común de
metástasis y que más del 80% de los pacientes fallecidos a causa de
un cáncer presentan tumores óseos en la autopsia.
Numerosos derivados de ácido difosfónico se han
descrito en la bibliografía así como sus propiedades útiles en
diversos campos de aplicación.
Así, por ejemplo, el ácido didrónico se conoce
bien desde hace años como principio activo de medicamento para el
tratamiento de enfermedades óseas tales como la osteoporosis, y más
particularmente el etidronato disódico, descrito en la patente FR
8.441 M. Una estructura derivada se describe por ejemplo en la
patente US 4.705.651 relativa al ácido alendrónico que presenta
propiedades de inhibición de la pérdida ósea, permitiendo también
su uso en el tratamiento de la osteoporosis. Otra estructura
derivada, el ácido ibandrónico que presenta propiedades
antiinflamatorias, se describe en la patente GB 2.312.165.
Derivados del ácido
alcano-1,1-difosfónico resultantes
del acoplamiento de un ácido difosfónico con un ácido aminado, y
que presentan una actividad antitumoral y de inhibición de la
resorción ósea, se han descrito en la solicitud de patente WO 97
49711. Otros derivados de ácido difosfónico, que comprenden un
sustituyente fenilo en la posición 1, se conocen por su actividad
antiinflamatoria como en la patente US 4 473 560 relativa a
derivados con actividad antiinflamatoria, especialmente
antiartrítica, o en la solicitud de patente WO 97 04785 que
describe difosfonatos sustituidos por un grupo fenólico que
presentan propiedades antineoplásicas. También se han descrito en
la patente EP 0 537 008 difosfonatos que comprenden un grupo
lipófilo útiles para la preparación de un medicamento inhibidor de
proteína prenil transferasa susceptible de bloquear la
transformación neoplásica provocada por oncogenes ras.
La acción antiosteoclástica de los bisfosfonatos
se realiza mediante inducción de la apoptosis en los osteoclastos
(Luckman et al., 1998) mediante una inhibición de la ruta del
mevalonato y de la síntesis del colesterol.
Los bisfosfonatos inhiben, in vitro, la
proliferación de células de tumor de mama (Fromigue et al.,
2000; Hiraga et al., 2001; Jagdev et al., 2001;
Senaratne et al., 2000; Yoneda et al., 2000) y de
células de tumor de próstata (Lee et al., 2001). Esta
inhibición in vitro se debe a la apoptosis de las células
tumorales y está acompañada por una reducción de la expresión del
gen bcl-2 (Senaratne et al., 2000) y
de una activación de las caspasas (Fromigue et al.,
2000).
Además de los efectos anteriores, los
bisfosfonatos pueden tener varias acciones complementarias, tales
como la inhibición de la adhesión, in vitro, de células de
tumor de mama a láminas óseas (Boissier et al., 1997; Van
der Pluijm et al., 1996), la inducción in vitro de la
apoptosis de células de mielomas (Shipman et al., 1997,
1998, 2000a) o la inhibición de la actividad (pero no de la
producción) de metaloproteasas de matriz por células de carcinomas
de mama o de próstata (Boissier et al., 2000; Ichinose et
al., 2000; Teronen et al., 1997).
Los bisfosfonatos también se han usado en el
tratamiento de leucemias linfoblásticas (Ogihara et al.,
1995; Takagi et al., 1998). Las células leucémicas inducen
una angiogénesis en la médula ósea, angiogénesis necesaria para su
proliferación. El tratamiento de las leucemias linfoblásticas
mediante bisfosfonatos está acompañado por una reducción importante
de la angiogénesis (Perez-Atayde et al.,
1997).
Datos recientes destacan la implicación muy
probable de factores angiogénicos en el desarrollo de metástasis
óseas. Así, Van der Pluijm et al. (2001), en un trabajo que
usa un modelo murino in vivo de metástasis experimentales de
células de mama (MDA MB 231), han emitido la hipótesis de que el
aumento de la expresión de los factores angiogénico (VEGF) y
osteolítico (PTH) por las células tumorales está implicado en el
osteotropismo y la osteólisis de las metástasis óseas.
Aunque actualmente está bien establecida la
actividad antiproliferativa de los bisfosfonatos sobre las células
tumorales in vitro, el hecho de que los bisfosfonatos
presenten una acción antitumoral in vivo todavía es una
cuestión abierta. Algunos datos parecen estar a favor de una acción
antiproliferativa de los bisfosfonatos, in vivo, a nivel de
los focos metastásicos óseos. Así, según Hiraga et al.
(2001), los bisfosfonatos hacen disminuir la carga tumoral de las
células metastásicas de los huesos. No obstante, que se sepa, no se
ha notificado ningún dato referente a una acción antitumoral de los
bisfosfonatos in vivo sobre los tumores primarios.
El metabolismo de los bisfosfonatos por el
organismo es débil y la fracción activa de los productos sólo
representa del 3% al 7% de la cantidad absorbida. Esta baja
biodisponibilidad de los bisfosfonatos por vía oral resulta de su
baja lipofilia (Lin, 1996) que se debe a su alta ionización a pH
fisiológico. Su absorción se reduce aún más debido a la fuerte
carga negativa y al tamaño relativamente importante de esas
moléculas (Ruifrok y Mol, 1983; Pade y Stavchanvsky, 1997). Además,
la absorción de los bisfosfonatos se reduce aún más por su fuerte
complejación con el calcio y los demás iones divalentes en el
espacio intestinal (Lin, 1996). Su administración está asociada a
menudo con trastornos gástricos y con otros efectos secundarios
(Adami y Zamberlan, 1996; Mondelo et al., 1997).
Además, la resistencia adquirida a los
medicamentos es una dificultad importante encontrada actualmente en
el tratamiento del cáncer y la mayor parte de los cánceres en el ser
humano son resistentes a los efectos de las quimioterapias.
Con el fin de mejorar sus efectos terapéuticos,
se han propuesto diferentes soluciones. La primera consiste en el
uso de un vector peptídico injertado en la cadena lateral del ácido
hidroxibisfosfónico (Ezra et al., 2000). Otros estudios
sugieren encapsular el fármaco en microesferas (Patashnik et
al., 1997) o en liposomas (Ylitalo et al., 1998).
La presente invención da a conocer derivados de
bisfosfonatos que presentan una biodisponibilidad mejorada y una
eficacia terapéutica satisfactoria.
Dos procedimientos de síntesis descritos en la
bibliografía permiten la obtención de los ácidos
1-hidroximetilen-1,1-bisfosfónicos.
El primero permite acceder a los productos
deseados en una única etapa. Consiste en calentar una mezcla de
ácido carboxílico en presencia de ácido fosforoso y de tricloruro de
fósforo a 100ºC durante varias horas.
Las condiciones de esta reacción se han
estudiado mucho. En efecto, desde 1970 se han publicado más de
cincuenta patentes y artículos. No obstante, los inconvenientes de
este método son numerosos. En efecto, las condiciones operatorias
drásticas no están adaptadas para sustratos frágiles. Además, la
extracción del bisfosfonato del medio de reacción es a menudo
delicada de poner en práctica.
El segundo procedimiento es un método indirecto
que pasa por la síntesis de ésteres
1-hidroximetilen-1,1-bisfosfónicos
seguida por una etapa de desalquilación. Los
\alpha-cetofosfonatos se preparan con frecuencia
siguiendo la reacción de Michaelis Arbuzov, a partir de un fosfito
de estructura P(OR)_{3} y de un cloruro de ácido. A
continuación, normalmente se obtiene el éster bisfosfónico mediante
una reacción del \alpha-cetofosfonato con un
dialquilfosfito
\hbox{HOP(OR) _{2} .}
La etapa de desalquilación se realiza o bien
mediante hidrólisis en medio ácido clorhídrico o bien mediante un
tratamiento con bromotrimetilsilano seguido por una metanólisis.
Desgraciadamente, estos dos procedimientos de
síntesis no permiten obtener ácidos
1-hidroximetilen-1,1-bisfosfónicos
parcialmente esterificados.
Por tanto, la presente invención tiene por
objetivo proponer procedimientos de preparación de bisfosfonatos que
permiten introducir de manera regioselectiva una o varias funciones
ésteres en los grupos de ácidos fosfónicos.
La presente invención describe derivados de
bisfosfonato de fórmula (1) siguiente:
en la
que
R_{1}, R_{2} y R_{3}, idénticos o
diferentes, representan un átomo de hidrógeno, un radical alquilo,
arilo, aciloxialquilo o heterociclo,
A representa un radical de fórmula
-(CH_{2})n-R_{4},
R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un
radical alquilo, un radical arilo, un heterociclo o un radical de
fórmula -NR_{5}R_{6},
R_{5} y R_{6}, idénticos o diferentes,
representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo,
n es un entero de 0 a 24 incluido,
excluyendo compuestos de fórmula (1) en la que
R_{1}, R_{2} y R_{3} representan simultáneamente un átomo de
hidrógeno, sus isómeros ópticos y geométricos, sus racematos, sus
sales, sus hidratos y sus mezclas.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, la invención describe compuestos que tienen
la ventaja de tener mucha biodisponibilidad, en particular que
presentan una biodisponibilidad mejorada con respecto a compuestos
descritos o disponibles como principios activos terapéuticos, tales
como especialmente etidronato (Procter & Gamble), alendronato
(Merck), pamidronato (Novartis), olpadronato (Gador), ibandronato
(Borhinger-Mannheim), el compuesto EB1053 (Leo), el
compuesto YH 529 (Aventis) o residronato (Procter & Gamble).
La presente invención también describe una
composición farmacéutica que comprende en un soporte
farmacéuticamente aceptable al menos un compuesto de fórmula (I) tal
como se describió anteriormente, eventualmente en asociación con
otro principio activo terapéutico.
También da a conocer el uso de al menos un
compuesto de fórmula (I) para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a tratar una enfermedad caracterizada por un
metabolismo del calcio anómalo, tal como cánceres o la
osteoporosis.
También da a conocer el uso de al menos un
compuesto de fórmula (I) para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a tratar una enfermedad viral o inflamatoria
hepática.
La presente invención tiene por objeto
procedimientos de preparación de los compuestos de fórmula (I) tal
como se definieron anteriormente.
Los radicales alquilo, arilo, heterociclo y
aciloxialquilo mencionados anteriormente están eventualmente
sustituidos por al menos un grupo elegido de un radical arilo, un
radical heterociclo, un radical heterocicloalquilo, un radical
alquilo, un radical alquenilo, un radical alquinilo, un radical
alquiltio, un átomo de halógeno, preferiblemente Cl, F, Br, un
radical hidroxilo, un grupo NO_{2}, un radical alcoxilo, un grupo
éster (-COOR), un grupo aminado -NRR''', una función ácido, un
grupo amida (-CONHR o -NHCOR), en el que R y R''' representan,
independientemente uno del otro, un átomo de hidrógeno, un radical
alquilo, arilo, heteroarilo o aciloxialquilo.
Según la presente invención, el término
"alquilo" designa más particularmente un radical hidrocarbonado
lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 24, preferiblemente 1
a 12, átomos de carbono tal como metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo,
neopentilo, n-hexilo. Los grupos
C1-C6 se prefieren particularmente. Los grupos
metilo y etilo se prefieren muy particularmente.
El término "alquenilo" se refiere a un
radical hidrocarbonado que presenta al menos una insaturación
etilénica y el término "alquinilo" se refiere a un radical
hidrocarbonado que presenta al menos una insaturación
acetilénica.
Los grupos "arilo" son sistemas
hidrocarbonados aromáticos mono, bi o tri-cíclicos
que tienen de 6 a 18 átomos de carbono. Pueden mencionarse
especialmente, a modo de ejemplos, un radical fenilo,
\alpha-naftilo, \beta-naftilo o
antracenilo.
Los grupos "alcoxilo" corresponden a los
grupos alquilo definidos anteriormente unidos al resto del compuesto
por medio de un enlace -O- (éter).
Los grupos "alquiltio" corresponden a los
grupos alquilo definidos anteriormente unidos al resto del compuesto
por medio de un enlace -S- (tioéter).
Los radicales "aciloxialquilo" corresponden
a los grupos aciloxilo unidos al resto del compuesto por medio de
una cadena de alquileno (C1-24), preferiblemente
C1-4. Pueden mencionarse especialmente el radical
aciloximetilo o pivaloiloximetilo.
Por "halógeno" se entiende un átomo de
flúor, cloro, bromo o yodo.
Los grupos arilalquilo (o aralquilo) son grupos
que comprenden un resto arilo tal como se definió anteriormente
unido al resto del compuesto por medio de una cadena de
alquileno.
Los grupos "heterociclos" o
"heterocicloalquilo" son grupos que comprenden de 5 a 18
miembros del ciclo que comprenden uno o varios heteroátomos
(generalmente N, O, S o P), preferiblemente de 1 a 5 heteroátomos
endocíclicos. Pueden ser mono, bi o tri-cíclicos.
Pueden ser aromáticos o no. Preferiblemente, y más particularmente
para R_{5}, se trata de heterociclos aromáticos. Ejemplos de
grupos heterocíclicos aromáticos son los grupos piridina,
piridazina, pirimidina, pirazina, furano, tiofeno, pirrol, oxazol,
tiazol, isotiazol, imidazol, pirazol, oxadiazol, triazol, tiadiazol
y triazina. Ejemplos de biciclos son especialmente los grupos
quinolina, isoquinolina y quinazolina (para dos ciclos de 6
vértices) e indol, bencimidazol, benzoxazol, benzotiazol e indazol
(para un ciclo de 6 vértices y un ciclo de 5 vértices). Heterociclos
no aromáticos son especialmente piperazina, piperidina, etc.
Entre los átomos de metal alcalino, pueden
mencionarse especialmente el sodio y el potasio. Entre los
alcalinotérreos, puede mencionarse especialmente el calcio.
Los compuestos preferiblemente preparados según
la invención presentan una fórmula (I) en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo de
C1-12, más particularmente de
C1-6.
De manera ventajosa, al menos dos de los
sustituyentes R_{1}, R_{2} y R_{3} son diferentes de un átomo
de hidrógeno.
Según un modo particularmente preferido de la
invención, los sustituyentes R_{1}, R_{2} y R_{3}, que son
diferentes de un átomo de hidrógeno, son idénticos.
Los compuestos preferiblemente preparados según
la invención presentan una fórmula (I) en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} representan el radical metilo o etilo.
Los compuestos preferiblemente preparados según
la invención presentan una fórmula (I) en la que A representa un
radical de fórmula -(CH_{2})n-R_{4}, en
la que n es un entero de 1 a 12 incluido, preferiblemente de 1 a 6
incluido, ventajosamente de 1 a 3 incluido.
Los compuestos preferiblemente preparados según
la invención presentan una fórmula (I) en la que R_{4} representa
un radical alquilo C1-C6, un radical heterociclo, un
radical fenilo o un radical de fórmula -NR_{5}R_{6}, en la que
R_{5} y R_{6}, idénticos o diferentes, representan un átomo de
hidrógeno o un radical alquilo de C1-6, en la que
ventajosamente n es un entero de 1 a 6 incluido, preferiblemente de
1 a 3 incluido.
Según un modo particular de la invención, los
compuestos preferiblemente preparados según la invención presentan
una fórmula (I) en la que A representa un radical elegido de:
\newpage
Según un aspecto particular de la invención, los
compuestos de la presente invención presentan la fórmula (I) tal
como se definió anteriormente, excluyendo los compuestos en los que
A representa
R_{1} y R_{3} representan un radical metilo
y R_{2} representa un átomo de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula (I) preparados según
la invención, presentan una biodisponibilidad ventajosa, incluso
mejorada, con respecto a ciertos productos conocidos del estado de
la técnica. Los compuestos según la invención presentan así un
efecto terapéutico muy satisfactorio. En efecto, sin querer quedar
adherido a ninguna teoría de la invención, los enlaces ésteres de
los compuestos de fórmula (I) según la invención aumentan su
lipofilia y de ese modo especialmente los compuestos parecen
atravesar mejor la barrera gastrointestinal cuando se administran
por vía oral, a continuación se someten los enlaces ésteres a lisis
para liberar el ácido bisfosfónico correspondiente.
La presente invención tiene por tanto por objeto
procedimientos de preparación de compuestos de fórmulas (I).
Estos procedimientos de preparación presentan
numerosas ventajas. Son sencillos de poner en práctica
industrialmente y permiten obtener un rendimiento elevado en
bisfosfonatos.
El procedimiento general de preparación de los
compuestos de fórmula (I) de la presente invención comprende las
etapas siguientes:
- la puesta en contacto de al menos un
halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX, o de un
\alpha-cetofosfonato de fórmula (III):
con al menos un fosfito sililado de
fórmula
(IV):
(IV)P[OSialk_{3}]x[OR_{3}]_{3-x}
en las
que
R_{1}, R_{2} y R_{3}, idénticos o
diferentes, representan un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o
heterociclo,
siendo A tal como se definió anteriormente,
X representa un átomo de halógeno,
preferiblemente el cloro,
alk representa un radical alquilo de
C1-6,
x representa 2 ó 3,
- una hidrólisis de los compuestos obtenidos en
la etapa anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
El radical alquilo de C1-6 es
tal como se definió anteriormente.
El átomo de halógeno puede ser un átomo de
cloro, de bromo, de yodo o de flúor, preferiblemente X es el átomo
de cloro.
\newpage
Cuando R_{1} y R_{2} son diferentes del
átomo de hidrógeno en los compuestos de fórmula (I), el
procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula (I)
comprende las etapas siguientes:
- la puesta en contacto de al menos un
halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX con al menos un fosfito de
fórmula (V): P(OR_{1})(OR_{2})(OR), representando
R_{1}, R_{2} y R, idénticos o diferentes, un radical alquilo,
arilo, aciloxialquilo o heterociclo, para formar un
\alpha-cetofosfonato de fórmula (III),
- la puesta en contacto del
\alpha-cetofosfonato obtenido en la etapa anterior
con al menos un fosfito sililado de fórmula (IV) tal como se definió
anteriormente,
- una hidrólisis de los compuestos obtenidos en
la etapa anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Más precisamente, cuando R_{1}, R_{2} y
R_{3} son diferentes del átomo de hidrógeno, el fosfito sililado
de fórmula (IV) puesto en práctica preferiblemente corresponde a un
compuesto de fórmula (IV) en la que x vale 2.
Más precisamente, cuando R_{1} y R_{2} son
diferentes del átomo de hidrógeno y R_{3} representa un átomo de
hidrógeno, el fosfito sililado de fórmula (IV) puesto en práctica
preferiblemente corresponde a un compuesto de fórmula (IV) en la que
x vale 3.
Cuando se desea obtener compuestos de fórmula
(I) en la que R_{1} y R_{3} son metilo y R_{2} representa un
átomo de hidrógeno, el procedimiento de preparación se pone en
práctica mediante la puesta en contacto de 1 equivalente molar de
un halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX; con dos equivalentes
molares de al menos un fosfito sililado de fórmula
P[OSiMe_{3}]_{2}[OMe].
El procedimiento de preparación de los
compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} es diferente del átomo
de hidrógeno y R_{2} y R_{3} representan un átomo de hidrógeno,
se pone en práctica con una puesta en contacto de al menos un
halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX; con al menos un fosfito
sililado de fórmula (IV) en la que x vale 2 y una puesta en
contacto del producto así obtenido con al menos un fosfito sililado
de fórmula (IV) en la que x vale 3.
La hidrólisis del procedimiento de preparación
de los compuestos de fórmula (I) se realiza generalmente en un
disolvente que puede proporcionar protones, tal como especialmente
el metanol o el etanol. Preferiblemente, el disolvente usado es el
metanol.
Los rendimientos obtenidos en compuestos de
fórmula (I) son casi cuantitativos. Además, este procedimiento
presenta la ventaja de poner en práctica in situ
sucesivamente las etapas mencionadas anteriormente, sin necesidad de
transferir productos.
De manera general, las etapas del procedimiento
según la invención pueden realizarse a temperatura ambiente
(18-30ºC) y a presión atmosférica. Evidentemente, el
experto en la técnica tiene a su alcance variar estas condiciones,
si es necesario.
En ciertos casos, las reacciones con el fosfito
sililado pueden ser exotérmicas, sin por ello presentar reacciones
secundarias. Este carácter exotérmico puede hacer necesario poner en
práctica estas reacciones a temperaturas más bajas que la ambiente,
más particularmente a temperaturas comprendidas entre -70ºC y 20ºC,
especialmente cuando se pone en práctica el cloruro de
nitrobenzoilo.
Las etapas que preceden a la etapa de hidrólisis
del procedimiento según la invención pueden ponerse en práctica en
masa o en un disolvente, tal como CHCl_{3}, THF, CH_{3}CN,
CH_{2}Cl_{2} o éter. Ventajosamente, se ponen en práctica en
masa.
La etapa de hidrólisis se realiza ventajosamente
durante de 1 hora a 4 horas, más particularmente durante
aproximadamente dos horas. Se pone en práctica preferiblemente a
temperatura ambiente, entre 18ºC y 30ºC.
Tras la etapa de hidrólisis, el procedimiento
según la invención comprende preferiblemente la purificación del
compuesto de fórmula (I) obtenido. Esta purificación se realiza
mediante cualquier medio conocido en sí mismo. Preferiblemente, se
realiza una purificación mediante al menos dos lavados sucesivos en
un disolvente apropiado, especialmente éter.
Los productos de partida del procedimiento según
la invención son productos comerciales y por tanto son fácilmente
accesibles. Con respecto a los fosfitos, el
tris-trimetilsilil-fosfito es
comercial. Los demás fosfitos pueden prepararse según el
procedimiento siguiente. Se trata el dialquilfosfito mediante una
disolución de amoniaco concentrada a 0ºC. Tras la evaporación del
agua, se trata la sal obtenida mediante hexametildisilazano durante
4 horas a reflujo. El esquema de reacción es el siguiente.
En la figura 1 se representan esquemas de
reacción del procedimiento de preparación de los compuestos de
fórmula (I) según la invención.
Según la presente invención, el ácido
fenilacético-bisfosfónico puede prepararse mediante
un procedimiento análogo al método de preparación de derivados
hidroxidifosfónicos descrito en la patente FR 2 669 348 y por Y.
Leroux et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 63, 181
(1991). El procedimiento consiste, en una primera etapa, en hacer
reaccionar un cloruro de ácido de fórmula (II) ACOX, tal como se
definió anteriormente, en una mezcla de dimetilfosfito y de
trimetilfosfito, después en una segunda etapa, en hidrolizar las
funciones ésteres formadas en la primera etapa, mediante hidrólisis
ácida, seguida si es necesario por una salificación.
Por tanto, el cloruro de ácido usado en la
primera etapa puede ser el cloruro de fenilacetilo
(C_{6}H_{5}-CH_{2}-COCl) y la
reacción se realiza preferiblemente en un disolvente tal como el
cloroformo a una temperatura inferior a 30ºC, por ejemplo a
temperatura ambiente o a una temperatura próxima a 0ºC, en atmósfera
neutra, por ejemplo en atmósfera de nitrógeno.
La hidrólisis de las funciones ésteres, en la
segunda etapa, puede realizarse mediante disolución del producto
obtenido en la primera etapa en ácido clorhídrico concentrado, en
exceso, y calentando a reflujo durante de 5 horas a 15 horas
aproximadamente.
El ácido
fenilacético-bisfosfónico así preparado se obtiene
con un excelente rendimiento, superior al 95%.
La presente invención describe cualquier
composición farmacéutica que comprende en un soporte
farmacéuticamente aceptable al menos un compuesto de fórmula (I) tal
como se describió anteriormente.
Se trata ventajosamente de una composición
farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades
caracterizadas por un metabolismo del calcio anómalo, tales como
cánceres o la osteoporosis. Para los cánceres, se trata más
particularmente de los cánceres de mama, de próstata o de
leucemias.
Los tumores malignos sólidos se reparten en
carcinomas (95%) y sarcomas (5%). El desarrollo de carcinomas y
sarcomas está correlacionado con la instauración de una
vascularización de los tumores, denominada angiogénesis. Cualquier
inhibición de esta angiogénesis tumoral permite hacer retroceder, o
al menos suspender o retardar el desarrollo de los tumores. Ahora
bien, se ha encontrado de manera sorprendente que los compuestos
según la invención no solamente tienen un efecto sobre los tumores,
sino también un efecto sobre la angiogénesis.
Las composiciones farmacéuticas pueden usarse
especialmente para el tratamiento de tumores malignos, más
precisamente el tratamiento de tumores malignos sólidos.
También pueden usarse para inhibir parcial o
totalmente la angiogénesis tumoral.
Pueden destinarse además a tratar una enfermedad
viral o inflamatoria hepática.
La invención también describe el uso de un
compuesto de fórmula (I) para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a la puesta en práctica de un método de
tratamiento o de profilaxis del cuerpo humano o animal, estando
representados los compuestos por la fórmula (I) en la que R_{1},
R_{2} y R_{3}, idénticos o diferentes, representan un átomo de
hidrógeno, un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o
heterociclo.
A representa un radical de fórmula
-(CH_{2})n-R_{4},
R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un
radical alquilo, un radical arilo, un heterociclo o un radical de
fórmula -NR_{5}R_{6},
R_{5} y R_{6}, idénticos o diferentes,
representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo,
n es un entero de 0 a 24 incluido,
sus isómeros ópticos y geométricos, sus
racematos, sus sales, sus hidratos y sus mezclas.
Los compuestos descritos en la presente
invención presentan una actividad específica, libre de efectos
secundarios y de toxicidad, incluso en el caso de un tratamiento
prolongado en el tiempo. Más particularmente, el ácido
fenilacético-bisfosfónico de fórmula (I) descrito
anteriormente presenta una interesante actividad antiangiogénica,
antiinflamatoria y antiviral hepática, y una ausencia de toxicidad.
Los estudios y ensayos farmacológicos y clínicos han demostrado que
los compuestos según la invención ejercen efectos antitumorales,
antiangiogénicos y proapoptóticos, y que son activos a la vez in
vivo e in vitro sobre la proliferación de numerosas
células tumorales. Así, por ejemplo, in vitro, se ha
constatado que el ácido fenilacético-bisfosfónico
tiene efectos de inhibición de la proliferación de dos líneas
celulares de cáncer de mama, representativas de dos tipos de cáncer
de mama (tumor hormonosensible no metastásico y tumor
hormonoindependiente metastásico) incluso a dosis baja,
interrumpiendo el ciclo celular e induciendo una apoptosis de las
células tumorales. In vivo, el ácido
fenilacético-bisfosfónico bloquea irreversiblemente
la proliferación de células MCF7-ras y el
crecimiento de tumores de mama a las cinco a las seis primeras
semanas de tratamiento, y este efecto se prolonga sin aparición de
efectos tóxicos, incluso cuando se prolonga el tratamiento durante
un periodo largo. Los resultados in vivo e in vitro
demuestran así el efecto proapoptótico y antiangiogénico de los
compuestos de fórmula (I). Estos ensayos se explican en los ejemplos
más adelante.
Además, los estudios realizados han puesto en
evidencia una acción del ácido
fenilacético-bisfosfónico sobre las lesiones
inflamatorias hepáticas inducidas por virus.
Estos resultados muestran que el ácido
fenilacético-bisfosfónico y sus sales, ésteres
parciales o derivados farmacéuticamente aceptables pueden usarse
eficazmente en el tratamiento de ciertos cánceres y más
particularmente el cáncer de mama y de próstata, así como en el
tratamiento de enfermedades inflamatorias del hígado, tales como las
hepatitis agudas o crónicas, por ejemplo las hepatitis virales o
tóxicas.
La actividad antiangiogénica también resulta ser
útil en el tratamiento de las angiogénesis patológicas, por ejemplo
de las retinopatías de la diabetes, de la poliartritis reumatoide y
de la degeneración macular relacionada con la edad.
La invención también describe un método de
tratamiento de una enfermedad caracterizada por un metabolismo del
calcio anómalo, tal como cánceres o la osteoporosis, que comprende
la administración a un sujeto, especialmente humano, de una dosis
eficaz de un compuesto o de una composición farmacéutica tal como se
definieron anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la
presente invención comprenden ventajosamente uno o varios
excipientes o vehículos, aceptables desde el punto de vista
farmacéutico. Pueden mencionarse por ejemplo soluciones salinas,
fisiológicas, isotónicas, tamponadas, etc., compatibles con un uso
farmacéutico y conocidas por el experto en la técnica. Las
composiciones pueden contener uno o varios agentes o vehículos
elegidos de los dispersantes, solubilizantes, estabilizantes,
conservantes, etc. Agentes o vehículos que pueden usarse en
formulaciones (líquidas y/o inyectables y/o sólidas) son
especialmente metilcelulosa, hidroximetilcelulosa,
carboximetilcelulosa, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa,
aceites vegetales, goma arábiga, etc. Las composiciones pueden
formularse en forma de suspensión inyectable, geles, aceites,
comprimidos, supositorios, polvos, cápsulas duras, cápsulas, etc.,
eventualmente por medio de formas galénicas o de dispositivos que
garantizan una liberación prolongada y/o retardada. Para este tipo
de formulación, se usa ventajosamente un agente tal como celulosa,
carbonatos o almidones.
Los compuestos o las composiciones descritos en
la presente invención pueden administrarse de diferentes maneras y
en diferentes formas. Así, pueden inyectarse por vía sistémica u
oral, preferiblemente sistémica, tal como por ejemplo por vía
intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intraarterial,
etc. Para las inyecciones, los compuestos se acondicionan
generalmente en forma de suspensiones líquidas, que pueden
inyectarse por medio de jeringuillas o de perfusiones, por ejemplo.
Se entiende que el experto en la técnica puede adaptar el caudal
y/o la dosis inyectada en función del paciente, de la patología, del
modo de administración, etc. Normalmente, los compuestos se
administran a dosis que pueden variar entre 0,1 \mug y 500 mg/kg
de peso corporal, más generalmente de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg,
normalmente entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg. Además, pueden realizarse
inyecciones repetidas llegado el caso. Por otra parte, las
composiciones descritas en la presente invención pueden comprender,
además, otros agentes o principios activos.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención resultarán evidentes tras la lectura de los siguientes
ejemplos, que deben considerarse como ilustrativos y no
limitativos.
Figura 1: esquemas de reacción del procedimiento
de preparación de compuestos según la invención. A tiene la misma
definición que anteriormente.
Figuras 2 y 3: inhibición de la proliferación
in vitro de las células tumorales A 431 por BP1 (figura 2) y
BP2 (figura 3) respectivamente, tras 24, 48 y 72 h de cultivo. Los
resultados representan el número de células \pm EE (barras).
*P<0,05; **P<0,01 con respecto a los controles.
Figura 4: inhibición del crecimiento in
vivo de los tumores A 431 por BP1 y BP2. Las células A431
implantadas en el ratón desnudo provocan el desarrollo de tumores
subcutáneos. Una semana tras la inyección de las células, se tratan
los tumores mediante BP1 y BP2 a dosis de 0,006, 0,06 y 0,6
mg/ratón, 2 veces por semana durante 5 semanas. Los resultados
representan el volumen tumoral \pm EE (barras). *P<0,05 con
respecto a los controles.
Figura 5: análisis inmunohistoquímico de la
angiogénesis de los tumores A 431. Las células endoteliales se
detectaron con un marcador específico (GSL 1). Los resultados
representan la superficie \pm EE (barras) de las células
endoteliales cuantificada mediante análisis de imágenes (NIH image).
*P<0,01 con respecto a los controles.
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\vskip1.000000\baselineskip
Salvo que se mencione lo contrario, los
porcentajes facilitados se expresan en peso. Rdt significa
rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla de trimetilfosfito (0,01 moles) y
de dimetilfosfito (0,01 moles) en 5 ml de cloroformo, se le añade
gota a gota una disolución de cloruro de fenilacetilo en 5 ml de
cloroformo en frío (0ºC), manteniendo la mezcla de reacción con
agitación en atmósfera de nitrógeno seco. A continuación se lleva la
mezcla a 80ºC durante aproximadamente 8 horas.
Tras el enfriamiento, se lava la mezcla y se
precipita en éter etílico. El sólido blanco recogido mediante
filtración es el éster de bisfosfonato (éster tetrametílico de
1-hidroxi-1-feniletiliden-1,1-bisfosfonato).
Rendimiento: 97%
Punto de fusión F = 120ºC
RMN de ^{31}P (CDCl_{3}): \delta = 20,53
ppm
RMN de ^{1}H (TMS, CDCl_{3}) \delta = 3,8
ppm; \delta_{t} (CH_{2}) = 3,4 ppm (^{3}J_{HCCP}: 13,5
Hz); \delta_{m(ph)}= 7,3 ppm.
Se redisuelve el éster de bisfosfonato obtenido
tal como se indicó anteriormente en un gran exceso de ácido
clorhídrico concentrado y se lleva a reflujo durante 15 horas. Se
lava con éter la disolución acuosa, después se evapora a vacío en un
rotavapor. Se obtiene así el ácido correspondiente.
\newpage
Se purifica el ácido y vuelve a precipitarse en
éter y en la mezcla de benceno/éter. Se recoge el precipitado blanco
mediante filtración para obtener el ácido
1-hidroxi-1-feniletiliden-1,1-bisfosfónico.
Rendimiento: 98%
RMN de ^{31}P (D_{2}O): \delta = 19,53
ppm
RMN de ^{1}H (D_{2}O):
\delta_{t(CH2)} = 3,4 ppm (^{3}J_{HCCP}: 13,5 Hz);
\delta_{m(ph)} = 3,4 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de cuatro bocas dotado de una
agitación mecánica, de un refrigerante, de une embudo de
introducción, de un termómetro y de una llegada de nitrógeno, se
añaden gota a gota 100 ml de una disolución de amoniaco concentrada
en 83 g de dimetilfosfonato que si es necesario se habrá destilado
previamente. Se evapora a presión reducida la disolución así
obtenida. Tras las evaporaciones conjuntas repetidas con piridina
(100 ml) y benceno (2 X 100 ml), se trata el sólido blanco obtenido
mediante 140 ml de hexametildisilazano. Se lleva la mezcla así
obtenida a reflujo durante 6 horas. A continuación se destila la
disolución para dar el compuesto esperado.
Rdt = 58% Eb 74-76 (20 mmHg)
RMN de ^{31}P {^{1}H} (CDCl_{3}):
\delta=127,6. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}): \delta=0,19 (s, 18H,
Me_{3}Si), 3,30 (d, 3H, J_{PH} = 8 Hz, MeO).
\vskip1.000000\baselineskip
Se coloca un equivalente de cloruro de ácido en
un matraz de tres bocas dotado de un imán en atmósfera inerte (Ar).
Se añaden 2 equivalentes de tris(trimetilsilil)fosfito
a temperatura ambiente con agitación. A continuación se deja la
disolución a temperatura ambiente durante algunos minutos. Se
realiza la hidrólisis en metanol a 25ºC durante 1 hora. Se evaporan
a vacío las fracciones volátiles. Se purifican los productos
mediante lavado con éter.
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rendimiento = 98%.
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=19,4. RMN de ^{1}H (D_{2}O): \delta=1,48 (t, 3H,
^{3}J= 16 Hz, CH_{3}COH).
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rendimiento = 90%.
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=19,0. RMN de ^{1}H (D_{2}O): \delta=3,31 (t, 2H,
^{3}J= 14 Hz, CH_{2}COH), 7,26-7,32 (m, 4H,
C_{6}H_{5}), 7,38 (t, 1H, ^{3}J= 7,5 Hz, C_{6}H_{5}).
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 91%.
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O): \delta=
16,0. RMN de ^{1}H (D_{2}O): \delta=7,08-7,13
(m, 4H, C_{6}H_{5}), 7,46 (t, ^{3}J= 5 Hz, 1H,
C_{6}H_{5}). RMN de ^{13}C {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=78,76 (t, ^{1}J= 145,75 Hz, COH), 128,9, 130,8, 131,2,
138,6 (C_{6}H_{5}).
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 85%.
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=15,3. RMN de ^{1}H (D_{2}O): \delta=7,89 (d, 2H,
^{3}J= 8,5 Hz, C_{6}H_{4}), 8,15 (d, 2H, ^{3}J= 8,5 Hz,
C_{6}H_{4}). RMN de ^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta=
75,28 (t, ^{1}J= 149 Hz, COH), 124,67, 128;15; 146;13, 148;35
(C_{6}H_{4}).
\newpage
En un matraz de cuatro bocas dotado de una
agitación mecánica, de un refrigerante, de un embudo de
introducción, de un termómetro y de una llegada de nitrógeno se
añade gota a gota 1 equivalente de trimetilfosfito en 1 equivalente
de cloruro de ácido a 0ºC. Tras dos horas de reacción a temperatura
ambiente, el \alpha-cetofosfonato de dimetilo se
ha formado completamente (se sigue la evolución de la reacción en
RMN de ^{31}P). A continuación se añade gota a gota 1 equivalente
de tris(trimetilsilil)fosfito. A continuación se agita
la disolución durante 15 minutos. A continuación se añade el
metanol y se agita la disolución durante dos horas a temperatura
ambiente. A continuación se evaporan el disolvente y las fracciones
volátiles. El producto obtenido se presenta en forma de polvo
blanco. A continuación se purifica mediante lavados sucesivos con
éter.
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 91%
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=23,58 (d, ^{2}J= 27 Hz); 12,92 (d, ^{2}J= 27 Hz). RMN
de ^{1}H (D_{2}O): \delta=7,73 (d, 2H, ^{3}J= 6,0 Hz,
C_{6}H_{5}); 7,46-7,43 (m, 3H'' C_{6}H_{5});
3,79 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}); 3,63 (d, 3H, ^{3}J=
10,0 Hz, OCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 91%
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=29,1 (d, ^{2}J= 27 Hz); 19,90 (d, ^{2}J= 27 Hz). RMN de
^{1}H (D_{2}O): \delta=7,73 (d, 2H, ^{3}J= 6,0 Hz,
C_{6}H_{5}); 7,46-7,43 (m, 3H'' C_{6}H_{5});
3,79 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}); 3,63 (d, 3H, ^{3}J=
10,0 Hz, OCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de cuatro bocas dotado de una
agitación mecánica, de un refrigerante, de un embudo de
introducción, de un termómetro y de una llegada de nitrógeno se
añaden gota a gota 2 equivalentes de
bis(trimetilsilil)fosfito de metilo en 1 equivalente
de cloruro. Tras 10 minutos de reacción a temperatura ambiente, se
metanoliza la disolución durante dos horas. A continuación se
evaporan el disolvente y las fracciones volátiles. El producto
obtenido se presenta en forma de polvo blanco. A continuación se
purifica mediante lavados sucesivos con éter.
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 90%
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=18,50. RMN de ^{1}H (D_{2}O):
\delta=7,43-7,41 (m, 2H, C_{6}H_{5});
7,15-7,05 (m, 3H, C_{6}H_{5}); 3,79 (d, 6H,
^{3}J= 6,0 Hz, OCH_{3})
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 90%
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=23,9. RMN de ^{1}H (D_{2}O): 2,96 (d, 6H, ^{3}J= 6,0
Hz, OCH_{3}); 1,07-0,98 (m, 3H, CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 90%
RMN de ^{31}P {^{1}H} (D_{2}O):
\delta=20,79. RMN de ^{1}H (D_{2}O):
\delta=7,26-7,11 (m, 5H, C_{6}H_{5}) 3,79 (d,
6H, ^{3}J= 6,0 Hz, OCH_{3}); 3,15 (t, 2H, ^{3}J= 10,0 Hz,
C_{6}H_{5}-CH_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de cuatro bocas dotado de una
agitación mecánica, de un refrigerante, de un embudo de
introducción, de un termómetro y de una llegada de nitrógeno se
añade gota a gota 1 equivalente de trimetilfosfito en 1 equivalente
de cloruro de ácido a 0ºC. Tras dos horas de reacción a temperatura
ambiente, el \alpha-cetofosfonato de dimetilo se
ha formado completamente (se sigue la evolución de la reacción en
RMN de ^{31}P). A continuación se añade gota a gota 1 equivalente
de bis(trimetilsilil)fosfito de metilo. A continuación
se agita la disolución durante 15 minutos. A continuación se añade
el metanol y se agita la disolución durante dos horas a temperatura
ambiente. A continuación se evaporan el disolvente y las fracciones
volátiles. El producto obtenido se presenta en forma de aceite
incoloro. A continuación se purifica mediante lavados sucesivos con
éter.
\vskip1.000000\baselineskip
Polvo blanco. Rdt = 90%.
RMN de ^{31}P {^{1}H} (CDCl_{3}):
\delta=16,74 (d, ^{2}J= 47 Hz); 14,52 (d, ^{2}J= 47 Hz). RMN
de ^{1}H (D_{2}O): \delta=8,60-8,40 (s, 2H,
OH); 7,49 (d, 2H, ^{3}J= 8,0 Hz, C_{6}H_{5});
7,04-6,97 (m, 3H'' C_{6}H_{5}); 3,47 (d, 3H,
^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}); 3,34 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz,
OCH_{3}); 3,23 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
RMN de ^{31}P {^{1}H} (CDCl_{3}):
\delta=20,46 (d, ^{2}J= 48 Hz); 18,67 (d, ^{2}J= 48 Hz). RMN
de ^{1}H (D_{2}O): \delta=8,98 (s, 2H, OH); 3,92 (d, 3H,
^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}); 3,88 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz,
OCH_{3}); 3,86 (d, 3H, ^{3}J= 10,0 Hz, OCH_{3}); 1,67 (t, 3H,
^{3}J_{H-P}=15,5 Hz).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a prueba dos bisfosfonatos
denominados BP1 y BP2 cuyas fórmulas figuran a continuación en
modelos celulares y animales. BP1 que no está parcialmente
esterificado corresponde a un ejemplo comparativo.
Se sometieron a prueba los bisfosfonatos BP1 y
BP2 en diferentes líneas celulares:
- FRCjun MRA, línea de fibrosarcoma murino tras
la transfección de células FR3T3 por el oncogén
jun-4,
- Células A 431 de tumor epidermoide humano,
estas células presentan un bucle autocrino en el VEGF (factor de
crecimiento endotelial vascular) y conllevan, una vez implantadas en
ratones inmunodeprimidos, un rápido desarrollo de tumores muy
angiogénicos,
- Células MDA MB 435 de tumor de mama
humano,
- Células
HUV-EC-C, células endoteliales de
cordón umbilical humano (HUVEC) transformadas,
- Células BBC, células endoteliales de capilares
cerebrales bovinos.
Se midió la proliferación celular en presencia
de diferentes dosis de BP1 o de BP2 mediante una prueba MTT tras 24,
48 y 72 h de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los bisfosfonatos (0,1-2 mM)
inhiben la proliferación de las células FRCjunMRA, MDA MB 435 y A
431 de manera dependiente del tiempo y de la dosis (figura 2 y 3).
A modo de ejemplo BP2 (2 mM) inhibe la proliferación de las 3
líneas celulares respectivamente un 40%, 60% y 30% tras 48 h de
cultivo. Un tiempo de tratamiento de 72 h mediante BP2 (2 mM)
conlleva una inhibición del 80% de la proliferación de las células A
431 (P<0,05) (figura 3).
Una prueba de exclusión con azul trípano muestra
que BP1 y BP2 no inducen toxicidad celular, incluso a
concentraciones superiores a 5 mM.
Además, los bisfosfonatos (0,1-2
mM) también inhiben la proliferación de las células endoteliales HUV
EC C y BBC de manera dependiente del tiempo y de la dosis.
Estos resultados se confirmaron mediante una
prueba de morfogénesis vascular in vitro, en la que
normalmente se depositan células endoteliales sobre una matriz
extracelular (Matrigel); en las condiciones control, las células
endoteliales se reúnen para formar estructuras en pseudocapilares.
El tratamiento, en el momento de la siembra, de las células
endoteliales mediante BP1 y BP2 previene la formación de las
estructuras tubulares.
Estudios mediante zimografía también han
mostrado que las células A431 secretan metaloproteinasa 2 que tiene
una acción prometastásica. El tratamiento mediante BP1 y BP2 inhibe
la actividad enzimática de la metaloproteinasa 2, los BP presentan
por tanto, además de su actividad antiangiogénica, una actividad
antimetastásica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron ratones inmunodeprimidos, sin
tumores, mediante BP1 y BP2 a diferentes concentraciones en niveles
de 0,06 mg a 6 mg por inyección y por ratón. Los ratones recibían
una inyección al día durante una semana. El peso de los animales se
midió antes, durante y tras el tratamiento.
Las dosis de BP1 inferiores a 6 mg/inyección y
todas las dosis de BP2 sometidas a prueba (0,06 - 6 mg/inyección) no
mostraron signos de toxicidad tales como pérdida de peso, diarrea,
infección o anemia en los animales tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron células A 431 por vía subcutánea
en ratones inmunodeprimidos. Los ratones desarrollaban tumores en
una semana. Se colocaron los ratones portadores de tumores de manera
arbitraria en el grupo control, y grupos tratados mediante BP1 y BP2
a diferentes concentraciones.
Los ratones recibieron por vía subcutánea cerca
del tumor dos veces por semana, 0,1 ml de PBS solo para los
controles (n=6), o PBS que contenía o bien BP1 o bien BP2 a las
siguientes dosis: 0,006 (n=6); 0,06 (n=6) o 0,6 mg/inyección (n=6).
Se midieron los tumores todas las semanas y se determinó su volumen
V mediante la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R1 es el radio 1 y R2 el
radio 2, con
R1<R2.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras sacrificar a los animales y extraer
tumores, se pesaron estos últimos de manera fijada, se incluyeron
en parafina y después se cortaron. Se visualizaron mediante técnicas
inmunohistoquímicas (GSL 1) las células endoteliales de los vasos
tumorales instaurados durante la angiogénesis tumoral. Se determinó
la angiogénesis tumoral mediante el análisis de imágenes con ayuda
de un programa NIH image.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con los bisfosfonatos inhibe el
crecimiento de los tumores A 431 y es máximo incluso a las dosis
más bajas (figura 4). Tras 5 semanas de tratamiento, BP1 y BP2 (0,6
mg/inyección/ratón) inhiben el crecimiento de los tumores A 431
respectivamente un 40% y un 56% (P<0,05).
Al contrario que los resultados obtenidos in
vitro, los resultados in vivo muestran que BP2 es más
eficaz que BP1.
\newpage
Además, la inhibición del crecimiento de los
tumores A 431 en los animales tratados se correlaciona con una
inhibición de la angiogénesis intratumoral (figura 5). Esta
inhibición, demostrada mediante una reducción significativa de la
superficie ocupada por las células endoteliales por unidad de
superficie, se observa desde los valores más bajos de BP1 y BP2.
Además, se estudió el efecto de los
bisfosfonatos mediante una prueba in vivo de angiogénesis en
Matrigel. De manera clásica, VEGF exógeno (factor proangiogénico),
depositado en el Matrigel inyectado por vía subcutánea en el ratón,
provoca la invasión de esta matriz artificial por las células
endoteliales y la formación de estructuras vasculares. El estudio
microscópico del Matrigel retirado tras 10 días de los animales
tratados muestra que BP1 y BP2 inhiben la migración de las células
endoteliales en la matriz impidiendo así la formación de estructuras
capilares.
Que se sepa, los bisfosfonatos sintetizados son
los primeros en presentar una acción antitumoral in vivo
sobre el tumor primario, correlacionándose sus efectos con una
reducción de la angiogénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio del efecto del
fenilacetato-bisfosfonato de sodio sobre el
crecimiento y la viabilidad celular se realizó de la siguiente
manera.
Se siembran células MCF7-ras a
razón de 20.000 células por pocillo, en placas de 24 pocillos. Tras
24 horas de incubación, se sustituye el medio (DMEM con un 10% de
suero de ternero fetal) por un medio igual acondicionado con
diferentes concentraciones de
fenilacetato-bisfosfonato (2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM y
10 mM). Se incuban las células durante de 1 día a 4 días a 37ºC. Se
verifica la viabilidad celular mediante la prueba de azul
trípano.
Entonces se constata que el
fenilacetato-bifosfonato es citostático durante los
tres primeros días de cultivo a concentraciones inferiores a 6 mM.
A las concentraciones más elevadas (8 y 10 mM) se observa una ligera
toxicidad (10%), que se vuelve importante (50-60%)
en el cuarto día de cultivo.
Con el fin de verificar la reversibilidad del
efecto del fenilacetato-bisfosfonato, se trataron
células MCF7-ras con concentraciones crecientes de
fenilacetato-bisfosfonato durante 10 días, cambiando
el medio cada dos días. Después se reparten las células en dos
lotes. Al primer lote se le añade el medio de cultivo DMEM
complementado con un 10% de suero de ternero fetal, y al segundo
lote se le añade el mismo medio con 10 mM de
fenilacetato-bisfosfonato, cambiando el medio todos
los días. En el día 15 se añade timidina tritiada durante 4 horas y
se determina la radioactividad de la suspensión por medio de un
contador de centelleo líquido beta (Beckman).
Entonces se observa una inhibición de la
proliferación celular parcialmente reversible a la dosis de 2 mM e
irreversible más allá de 4 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar la naturaleza de la
toxicidad del fenilacetato-bisfosfonato de sodio, se
siembran células MCF7 y MCF7-ras, después se lavan
al cabo de 24 horas y se siembran durante 3 horas en medio DMEM con
adición del 10% de suero de ternero fetal. A un lote se le añade
fenilacetato-bisfosfonato (10 mM) mientras que el
otro lote no lo contiene. Se determina la apoptosis mediante la
prueba de la anexina V conjugada con el anticuerpo FITC. Se usa el
yoduro de propidio para distinguir la apoptosis precoz (marcaje
positivo para la anexina V y negativo para el yoduro de propidio)
de la apoptosis tardía (marcaje positivo para la anexina V y el
yoduro de propidio).
Se constata que al cabo de 4 horas de
tratamiento con fenilacetato-bisfosfonato, el
porcentaje de células en apoptosis precoz es casi idéntico para los
dos tipos celulares, mientras que el de las células en apoptosis
tardía es más importante para las células MCF7-ras
(el 22% y el 53% respectivamente).
Se confirma la apoptosis de las células mediante
el método de la degradación del ADN. Para ello se siembran las
células MCF7 y MCF7-ras a razón de 5 x 10^{5}
células en frascos T25. Tras 24 horas, se lavan las células y
después se siembran en medio de DMEM con adición del 10% de suero de
ternero fetal, con fenilacetato-bisfosfonato (10 mM)
para un lote y sin fenilacetato-bisfosfonato para el
otro lote.
Tras 96 horas, se incuba el extracto celular que
contiene el ADN fragmentado con 0,5 mg/ml de ARNasa A a 37ºC
durante una hora y después con 0,5 mg/ml de proteinasa K durante una
hora a 37ºC. Tras la incubación, se precipita el ADN fragmentado
mediante isopropanol y después se disuelve en 10 mM de
Tris-HCl (pH 8), 1 ml de EDTA, el 5% de glicerol y
el 0,05% de azul de bromofenol. El ADN fragmentado separado mediante
electroforesis sobre gel de agarosa al 1% se marca mediante bromuro
de etidio y se fotografía con UV.
Entonces se observa una clara degradación del
ADN de las células MCF7 y MCF7-ras en el caso del
lote que contiene 10 mM de
fenilacetato-bisfosfonato.
\newpage
Estos resultados muestran que el ácido
fenilacetato-bisfosfonato inhibe la proliferación e
induce la apoptosis de las células MCF7 y
MCF7-ras.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto antitumoral del
fenilacetato-bisfosfonato de sodio se verifica en el
ratón.
La inoculación de 4 x 10^{6} células
MCF7-ras en ratones desnudos hembras atímicos se
realiza por vía subcutánea en un volumen de 0,1 ml de DMEM e induce
un 70% de aparición de tumores tras tres semanas.
El tratamiento mediante
fenilacetato-bisfosfonato comenzó cuando los tumores
tenían un volumen medio de 550 mm^{3}. Se reparten los animales
en dos lotes, uno con fenilacetato-bisfosfonato, el
otro sin él. Se inyecta fenilacetato-bisfosfonato
por vía subcutánea y peritumoral, dos veces por semana, durante 5
semanas, usando dos dosis de 80 mg/kg (5 casos) y 160 mg/kg (6
casos).
Al final del tratamiento, se observa una
inhibición del crecimiento de los tumores que es irreversible y
dependiente de la dosis. Tras la detención del tratamiento, el
crecimiento de los tumores se bloquea durante al menos tres semanas
para los ratones tratados con una dosis de 160 mg/kg mientras que el
crecimiento se reinicia en el caso de los ratones tratados con una
dosis de 80 mg/kg.
El examen inmunohistológico de los tumores
muestra que la disminución de la proliferación está relacionada con
la inducción de la apoptosis, con una fuerte disminución de la
angiogénesis del tumor y con la inducción de la fibrosis en el
tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el efecto proapoptótico del
fenilacetato-bisfosfonato se confirma mediante la
técnica del marcaje mediante anticuerpos. Se realiza el marcaje de
células apoptóticas mediante el anticuerpo M30 que reconoce el
sitio específico de las caspasas sobre los filamentos de
citoqueratina 18 producidos por las células epiteliales. Estos
filamentos se agregan rápidamente en las células en apoptosis
precoz, mediante hiperfosforilación de las citoqueratinas. Este
marcaje citoplásmico permite observar estructuras granulares en el
interior del citoplasma, que corresponden a las células en apoptosis
tardía.
Estas estructuras granulares se observan en los
tumores tratados con una fuerte dosis (160 mg/kg) de
fenilacetato-bisfosfonato. También se constata un
aumento del marcaje con el anticuerpo
anti-citoqueratina 18 en función de la
concentración. La apoptosis precoz puede distinguirse así de la
apoptosis tardía mediante la presencia de las estructuras granulares
en el citoplasma.
Esto confirma que el tratamiento de los tumores
mediante el fenilacetato-bisfosfonato a una dosis de
80 mg/kg provoca una apoptosis mientras que el tratamiento a la
dosis de 160 mg/kg provoca una aponecrosis, fase intermedia entre la
apoptosis y la necrosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se verificó el efecto antiangiogénico mediante
la técnica de la lectina GSL1.
Usando la lectina GSL1 se determina la
angiogénesis, identificada mediante el marcaje de las células
endoteliales en rojo con el anticuerpo anti-GSL1.
Se constata que esta angiogénesis se inhibe mediante el tratamiento
de los tumores mediante el
fenilacetato-bisfosfonato. Este efecto es parcial a
la dosis de 80 mg/kg y total a 160 mg/kg.
Estos ensayos demuestran que el ácido
fenilacetato-bisfosfonato presenta un efecto
antiangiogénico muy importante, así como un efecto antitumoral y
proapoptótico. Estos resultados confirman que el ácido
fenilacetato-bisfosfonato constituye un posible
principio activo de medicamento para el tratamiento de los tumores
cancerosos, en particular el cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza el estudio en ratones desnudos que
desarrollan una hepatitis aguda. Se reparten los ratones en dos
lotes, tratándose uno mediante
fenilacetato-bisfosfonato de sodio, el otro no. Los
ratones tratados reciben fenilacetato-bisfosfonato
a razón de 80 mg/kg ó 160 mg/kg por vía subcutánea, dos veces por
semana durante 5 semanas. Después se sacrifican los ratones y se
extrae el hígado y se analiza histológicamente según HES (método de
la coloración mediante hematoxilina eosina, o Hemalun).
\newpage
El examen con el microscopio óptico muestra que
los hígados de ratones no tratados se ven muy afectados con
respecto al hígado de ratones tratados. En particular se observan
zonas necróticas debidas a una hepatitis crónica, así como una
acumulación de líquidos en los hepatocitos (esteatosis) asociada con
una inflamación de las células linfocitarias. Esta afección
hepática provoca la "necrosis de los tejidos hepáticos,
traduciéndose en la formación de una zona fibrosa".
Por el contrario, en los ratones tratados
mediante fenilacetato-bisfosfonato, en 4 de 5 casos,
no se observa ningún signo de toxicidad hepática.
Claims (7)
1. Procedimiento de preparación de derivados de
bisfosfonato de fórmula (I) siguiente:
representando R_{1}, R_{2} y
R_{3}, idénticos o diferentes, un átomo de hidrógeno, un radical
alquilo, arilo, aciloxialquilo o heterociclo, en la que R_{1} y
R_{2} son diferentes del átomo de
hidrógeno,
A representa un radical de fórmula
-(CH_{2})n-R_{4},
R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un
radical alquilo, un radical arilo, un heterociclo o un radical de
fórmula -NR_{5}R_{6},
R_{5} y R_{6}, idénticos o diferentes,
representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo,
n es un entero de 0 a 24 incluido,
caracterizado porque comprende las etapas
siguientes:
- la puesta en contacto al menos un halogenuro
de ácido de fórmula (II): ACOX con al menos un fosfito de fórmula
(V): P(OR_{1})(OR_{2})(OR), representando R_{1},
R_{2} y R, idénticos o diferentes, un radical alquilo, arilo,
aciloxialquilo o heterociclo, para formar un
\alpha-cetofosfonato de fórmula (III),
- la puesta en contacto el
\alpha-cetofosfonato obtenido anteriormente de
fórmula (III):
con al menos un fosfito sililado de
fórmula
(IV):
(IV)P[OSialk_{3}]x
[OR_{3}]_{3-x}
fórmula (IV) en la que R_{3}
representa un radical alquilo, arilo, aciloxialquilo o
heterociclo,
siendo A tal como se definió anteriormente,
X representa un átomo de halógeno,
preferiblemente cloro,
alk representa un radical alquilo de
C1-6,
x representa 2 ó 3,
- una hidrólisis de los compuestos obtenidos en
la etapa anterior, estando dichos radicales alquilo, arilo,
heterociclo y aciloxialquilo mencionados anteriormente eventualmente
sustituidos por al menos un grupo elegido de un radical arilo, un
radical heterociclo, un radical heterocicloalquilo, un radical
alquilo, un radical alquenilo, un radical alquinilo, un radical
alquiltio, un átomo de halógeno, preferiblemente CI, F, Br, un
radical hidroxilo, un grupo NO_{2}, un radical alcoxilo, un grupo
éster (-COOR), un grupo aminado -NRR''', una función ácido, un grupo
amida (-CONHR o -NHCOR), en el que R y R''' representan,
independientemente uno del otro, un átomo de hidrógeno, un radical
alquilo, arilo, heteroarilo o aciloxialquilo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación
anterior, caracterizado porque el fosfito sililado es un
compuesto de fórmula (IV) en la que x vale 2.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el fosfito sililado es un compuesto de
fórmula (IV) en la que x vale 3.
4. Procedimiento de preparación de derivados de
bisfosfonato de fórmula (I) siguiente:
representando R_{1} y R_{3} un
radical metilo y representando R_{2} un átomo de
hidrógeno,
siendo A tal como se definió en la
reivindicación 1,
caracterizado porque comprende las etapas
siguientes:
- la puesta en contacto de un equivalente molar
de un cloruro de ácido de fórmula (II): ACOCl, siendo A tal como se
definió anteriormente, con dos equivalentes molares de un fosfito
sililado de fórmula
P[OSiMe_{3}]_{2}[OMe],
- una hidrólisis de los compuestos obtenidos en
la etapa anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento de preparación de derivados de
bisfosfonato de fórmula (I) siguiente:
representando R_{1} un radical
alquilo, arilo, aciloxialquilo o heterociclo, y representando
R_{2} y R_{3} un átomo de
hidrógeno,
siendo A y los eventuales sustituyentes de los
radicales mencionados anteriormente tal como se definieron en la
reivindicación 1,
caracterizado porque comprende las etapas
siguientes:
- la puesta en contacto de al menos un
halogenuro de ácido de fórmula (II): ACOX, tal como se definió en la
reivindicación 1, con al menos un fosfito sililado de fórmula (IV)
tal como se definió en la reivindicación 1 en la que x vale 2,
después la puesta en contacto del producto así obtenido con al menos
un fosfito sililado de fórmula (IV) tal como se definió en la
reivindicación 1 en la que x vale 3,
- una hidrólisis de los compuestos obtenidos en
la etapa anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque A
representa un radical de fórmula
-(CH_{2})n-R_{4}, en la que R_{4}
representa un radical alquilo C1-C6, un radical
heterociclo, un radical fenilo o un radical de fórmula
-NR_{5}R_{6}, en la que R_{5} y R_{6}, idénticos o
diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical alquilo
de C1-6, en la que ventajosamente n es un entero de
1 a 6 incluido, preferiblemente de 1 a 3.
\newpage
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque A
representa un radical elegido de:
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