ES2336724T3

ES2336724T3 - Procedimiento para la reduccion enzimatica de derivados de alquino.

Info

Publication number: ES2336724T3
Application number: ES07803080T
Authority: ES
Inventors: Rainer Sturmer; Bernhard Hauer; Bettina Rosche; Andre Mueller
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2010-04-15
Anticipated expiration: 2027-08-30
Also published as: DE502007002297D1; CN101511996A; CN101511996B; EP2061880B1; EP1894999A1; US8227218B2; JP5205381B2; ATE451452T1; US20100009421A1; JP2010501199A; WO2008025831A1; EP2061880A1

Abstract

Procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona α,β-insaturados de la fórmula general (1) **(Ver fórmula)** en la que R1 significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un resto aromático o no aromático, carbocíclico o heterocíclico, en caso dado substituido, R2significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, mediante la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa (i) que comprende al menos una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o (ii) con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.

Description

Procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino.

La invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino.

Estado de la técnica

Hasta el presente no se conoce ningún procedimiento destinado a la reducción enzimática de derivados de alquino que no requiera trifosfato de adenosina ATP.

Los autores Takeshita, M. et al. describen en la publicación Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 5 (1998) 245-248 ensayos destinados a la biotransformación asimétrica de derivados de fenilo con 4 átomos de carbono con la fracción del hígado de rata S-9 y con levadura de panificación. Según esta publicación no se transforma significativamente la 4-fenil-3-butin-2-ona de la fracción de hígado de rata en la correspondiente buten-2-ona en comparación con los controles. De igual modo, los ensayos con células de levadura completas proporcionaban una cantidad insignificante (rendimiento 3%) de buten-2-ona. Por el contrario, se formaron como componentes principales el correspondiente S-butan-2-ol (31%), la correspondiente butan-2-ona (8%) y el correspondiente S-butin-2-ol (5%). No pudo asociarse a estas biotransformaciones ninguna actividad enzimática determinada puesto que los ensayos fueron llevados a cabo con células completas de levadura. Por otra parte los ensayos se llevaron a cabo obligatoriamente en presencia de cofactores celulares, tal como por ejemplo el ATP.

Existía la tarea de proporcionar un procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino, que no necesitase ATP.

Breve resumen de la invención

La tarea precedentemente indicada se resolvió mediante el empleo de las reductasas OYE 1, 2 y 3 y los equivalentes funcionales de las mismas para la reducción de los derivados de alquino de la fórmula general (1).

Descripción de las figuras

En las figuras adjuntas muestran

la figura 1 la biotransformación de 20 mM de 4-fenil-3-butin-2-ona con OYE 1-3 en presencia de fosfato del nucleótido de nicotinamida y de adenina reducido NADPH (izquierda) o del dinucleótido de nicotinamida NADH (derecha), el ácido etilendiaminotetraacético EDTA y el isopropanol a pH 6,8 y 30ºC al cabo de 1 hora. Los enzimas se sobreexpresaron en E. coli TG10^{+}, el propio TG10^{+} sirvió como control;

la figura 2 las secuencias de aminoácidos de los enzimas empleados OYE 1, 2 y 3;

la figura 3 el mapa del plásmido de pAgro4;

la figura 4 el mapa del plásmido de pHSG575';

la figura 5 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE1;

la figura 6 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE2; y

la figura 7 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE3.

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Descripción de la invención

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La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona \alpha,\beta-insaturados de la fórmula general (1)

1

en la que

R^{1}: significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un anillo aromático o no aromático, en caso dado substituido, carbocíclico o heterocíclico, y

R^{2}: significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono,

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por medio de la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa

(i): que comprende, al menos, una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o

(ii): con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presente, al menos, un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.

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De manera preferente, se proporciona de conformidad con la invención, de manera especial, la configuración E de los compuestos de la fórmula 2,

2

en la que

R^{1} y R^{2} tienen los significados que han sido indicados precedentemente. De manera especial, los compuestos de la fórmula 2 se presentan en más de un 50%, de manera especial en más de un 60, de un 70 o de un 80%, de manera preferente sin embargo en más de un 90%, tal como por ejemplo entre un 95 y un 99%, de manera especial aproximadamente en un 100% en la configuración E.

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Básicamente puede llevarse a cabo el procedimiento de conformidad con la invención tanto con el enzima propiamente dicho purificado o enriquecido así como también con microorganismos, que expresen este enzima de manera natural o de manera recombinante, con homogenatos celulares derivados de los mismos o, cuando el microorganismo secrete el enzima en el medio circundante, con el sobrenadante del cultivo. De manera especial, una "reacción enzimática" abarca, en el sentido de la invención, también una reacción en un medio circundante exento esencialmente de ATP, es decir de manera preferente abarca una reacción con preparados enzimáticos exentos de células, tales como enzimas puros o enriquecidos o fracciones proteicas adecuadas, que ya no contengan componentes celulares de bajo peso molecular tal como especialmente el ATP.

Cuando no se indique otra cosa, significa:

\bullet: \vtcortauna alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono especialmente metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, así como los correspondientes análogos monorramificados o polirramificados, tales como i-propilo, i-butilo, sec.-butilo, terc.-butilo, i-pentilo o neopentilo; siendo especialmente preferentes los restos alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono citados;

\bullet: \vtcortauna alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono especialmente los análogos monoinsaturados de los restos alquilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, que han sido citados precedentemente, siendo especialmente preferentes los correspondientes restos alquenilo con 2 hasta 4 átomos de carbono.

\bullet: \vtcortauna los anillos carbocíclicos o heterocíclicos, aromáticos o no aromáticos, de manera especial anillos, en caso dado condensados, con 3 hasta 12 átomos de carbono y, en caso dado, con 1 hasta 4 heteroátomos, tales como N, S y O, de manera especial N u O. A título de ejemplos pueden citarse ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, los análogos monoinsaturados o poliinsaturados de los mismos, tales como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo; fenilo y naftilo; así como los restos heterocíclicos con 5 hasta 7 miembros, saturados o no saturados, con 1 hasta 4 heteroátomos, que se eligen entre O, N y S, pudiendo estar condensado el heterociclo, en caso dado, con otro heterociclo o con otro carbociclo. De manera especial deben citarse los restos heterocíclicos derivados de pirrolidina, de tetrahidrofurano, de piperidina, de morfolina, de pirrol, de furano, de tiofeno, de pirazol, de imidazol, de oxazol, de tiazol, de piridina, de pirano, de pirimidina, de piridazina, de pirazina, de cumarona, de indol y de quinolina. En caso dado los restos cíclicos, así como también los restos alquilo y los restos alquenilo que han sido citados precedentemente, pueden estar substituidos una o varias veces, tal como por ejemplo 1 vez, 2 veces o 3 veces. A título de ejemplo de los substituyentes adecuados deben citarse: halógeno, especialmente F, Cl, Br; -OH, -SH, -NO_{2} -NH_{3}, -SO_{3}H, alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y alquenilo con 2 hasta 4 átomos de carbono, alcoxi con 1 hasta 4 átomos de carbono; e hidroxi-alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono; estando definidos los restos alquilo y los restos alquenilo como precedentemente y los restos alcoxi se derivan de los restos alquilo correspondientes que han sido definidos preceden- temente.

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El procedimiento, de conformidad con la invención, puede llevarse a cabo de manera especial con alquinos de la fórmula general (1), en los cuales R^{1} significa alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono en forma ramificada y no ramificada, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono en forma ramificada y en forma no ramificada o fenilo en caso dado substituido.

Los substratos especialmente adecuados para el procedimiento de conformidad con la invención son aquellos alquinos de la fórmula general (1), en los cuales R^{1} significa fenilo en caso dado substituido y R^{2} significa CH_{3}.

Las reductasas, empleadas de conformidad con la invención, reducen ocasionalmente en parte, además del triple enlace en la posición \alpha,\beta para dar la función carbonilo, también la función carbonilo propiamente dicha, con lo cual se forma entonces el alcohol correspondiente. De la misma manera pueden ser reducidos los alquenos en parte para dar el correspondiente alcano.

Las reductasas, adecuadas para el procedimiento de conformidad con la invención, son todos aquellos enzimas que sean capaces de reducir a la 4-fenil-3-butin-2-ona en una reacción dependiente del NAD(P)H y, de manera preferente, independiente del ATP, para dar la E-4-fenil-3-buten-2-ona. Esta reacción se denomina a continuación también reacción modelo.

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3

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Por otra parte, las reductasas, que son adecuadas para el procedimiento de conformidad con la invención (que se denominan a veces también como enoato-reductasas) tienen una secuencia de polipéptido según SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o una secuencia de polipéptido que presenta al menos un 80%, tal como por ejemplo un 90%, o al menos un 95% y, de manera especial, al menos un 97%, un 98% o un 99% de identidad secuencial con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o 9.

Se conoce un polipéptido con la SEQ ID NO:1 con la denominación de OYE1 a partir de Saccharomyces carlsbergensis (genoteca Q02899).

Se codifica un polipéptido con la SEQ ID NO:2 del gen OYE2 a partir de la levadura de panificación (Saccharomyces cerevisiae locus del gen YHR179W) (genoteca Q03558).

Se codifica un polipéptido con la SEQ ID NO:3 del gen OYE3 a partir de lavadura de panificación (Saccharomyces cerevisiae locus del gen YPL171C) (genoteca P 41816).

Las secuencias según SEQ ID NO: 5, 7 y 9 corresponden a la SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y se diferencian de las mismas únicamente por un resto de metionina adicional N-terminal.

La determinación de la identidad secuencial se llevará a cabo, para las finalidades aquí descritas, por medio del programa de ordenador "GAP" del Genetics Computer Group (GCG) de la University of Wisconsin, debiéndose emplear la versión 10.3 con utilización de los parámetros patrón recomendados por el GCG.

Las reductasas de este tipo pueden ser obtenidas a partir de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o 9 por medio de procedimientos de mutagénesis conocidos por el técnico en la materia específicos o estadísticos. Sin embargo, de manera alternativa, también pueden buscarse reductasas en microorganismos, de manera preferente en aquellos de los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia o Yokenella, cuyas reductasas catalicen la reacción modelo, que ha sido citada precedentemente, y cuya secuencia de aminoácidos presente ya la identidad secuencial necesaria con respecto a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o 9 o que sea obtenida por medio de procedimientos de mutagénesis.

La reductasa puede ser empleada en forma purificada o en forma parcialmente purificada o puede ser empleada incluso en forma del propio microorganismo. El técnico en la materia conoce ampliamente los procedimientos destinados a la obtención y a la purificación de las dehidrogenasas a partir de microorganismos.

De manera preferente se lleva a cabo la reducción enantioselectiva con la reductasa en presencia de un cofactor adecuado (denominado también cosubstrato). A título de cofactores para la reducción de la cetona sirven, de manera usual, el NADH y/o el NADPH. Al mismo tiempo pueden ser empleadas las reductasas como sistemas celulares, que contengan un cofactor inherente, o a las que se aportan alternativamente mediadores Redox (A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcohols" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).

De manera preferente, se lleva a cabo la reducción enantioselectiva con la reductasa, así mismo, en presencia de un agente reductor adecuado, que regenere el cofactor oxidado en el transcurso de la reducción. Ejemplos de agentes reductores adecuados son los azúcares, especialmente las hexosas, tales como la glucosa, la manosa, la fructosa y/o los alcoholes oxidables, especialmente el etanol, el propanol o el isopropanol, así como los formiatos, los fosfitos o el hidrógeno molecular. Para la oxidación del agente reductor y, relacionado con la misma, para la regeneración del coenzima puede ser aportada una segunda dehidrogenasa, tal como por ejemplo la glucosa-dehidrogenasa cuando se utilice la glucosa como agente reductor o la formiato-dehidrogenasa cuando se utilice el formiato como agente reductor. Éstos pueden ser empleados en forma de enzima libre o inmovilizado o en forma de células libres o inmovilizadas. Su obtención puede llevarse a cabo tanto independientemente así como, también, por medio de la coexpresión en una cepa de reductasa (recombinante).

Una forma preferente de realización del procedimiento reivindicado consiste en la regeneración de los cofactores por medio de un sistema enzimático, en el que se utiliza una segunda dehidrogenasa, de manera especialmente preferente una glucosadehidrogenasa.

Por otra parte, puede ser conveniente aportar otros aditivos que favorezcan la reducción tales como, por ejemplo, las sales metálicas o los formadores de quelatos tal como por ejemplo el EDTA.

Las reductasas, empleadas de conformidad con la invención, pueden ser empleadas en forma libre o en forma inmovilizada. Se entenderá por un enzima inmovilizado aquél enzima que esté fijado sobre un soporte inerte. Los materiales de soporte, adecuados, así como los enzimas inmovilizados sobre los mismos son conocidos por las publicaciones EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y por la publicación DE-OS 10019377 así como por las referencias bibliográficas citadas en dichas publicaciones. Se hace referencia en toda su extensión de manera correspondiente a la divulgación de estas publicaciones. A los materiales de soporte adecuados pertenecen, por ejemplo, las arcillas, los minerales arcillosos tales como la caolinita, la tierra de diatomeas, la perlita, el dióxido de silicio, el óxido de aluminio, el carbonato de sodio, el carbonato de calcio, el polvo de celulosa, los materiales intercambiadores de aniones, los polímeros sintéticos tales como el poliestireno, las resinas acrílicas, las resinas de fenolformaldehído, los poliuretanos y las poliolefinas, tales como el polietileno y el polipropileno. Los materiales de soporte son empleados de manera usual en una forma finamente dividida, en una forma de partículas para la obtención de los enzimas soportados, siendo preferentes las formas porosas. De manera usual, el tamaño de las partículas del material de soporte no es mayor que 5 mm, de manera especial no es mayor que 2 mm (curva granulométrica). De manera análoga, puede elegirse una forma libre o una forma inmovilizada cuando se utilice la dehidrogenasa como catalizador para la célula completa. Los materiales de soporte son, por ejemplo, el alginato de Ca y el Carrageenan. Así mismo pueden humectarse directamente con glutaraldehído los enzimas así como también las células (reticulación para dar CLEAs). Procedimientos de inmovilización correspondientes y otros han sido descritos por ejemplo en la publicación de los autores J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim.

La reacción puede llevarse a cabo en medios de reacción acuosos o no acuosos o en sistemas de bifásicos o en (micro)emulsiones. Los medios de reacción acuosos están constituidos de manera preferente por soluciones tampón, que presentan por regla general un valor del pH comprendido entre 4 y 8, de manera preferente comprendido entre 5 y 8. El disolvente acuoso puede contener, además de agua, también al menos un alcohol, por ejemplo el etanol o el isopropanol o el sulfóxido de dimetilo.

Se entenderán por medios de reacción no acuosos aquellos medios de reacción que contengan menos de un 1% en peso, de manera preferente menos de un 0,5% en peso de agua, referido al peso total del medio líquido de la reacción. De manera especial la reacción puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico.

Los disolventes orgánicos adecuados son, por ejemplo, los hidrocarburos alifáticos, de manera preferente con 5 hasta 8 átomos de carbono, tales como el pentano, el ciclopentano, el hexano, el ciclohexano, el heptano, el octano o el ciclooctano, los hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o con dos átomos de carbono, tales como el diclorometano, el cloroformo, el tetracloruro de carbono, el dicloroetano o el tetracloroetano, los hidrocarburos aromáticos tales como el benceno, el tolueno, los xilenos, el clorobenceno o el diclorobenceno, los éteres o alcoholes alifáticos acíclicos y cíclicos, preferentemente con 4 hasta 8 átomos de carbono tales como el etanol, el isopropanol, el dietiléter, el metil-terc.-butiléter, el etil-terc.-butiléter, el dipropiléter, el diisopropiléter, el dibutiléter, el tetrahidrofurano o los ésteres tales como el acetato de etilo o el acetato de n-butilo o las cetonas tal como la metilisobutilcetona o el dioxano o mezclas de los mismos. De manera especialmente preferente son empleados los éteres que han sido citados precedentemente, de manera especial el tetrahidrofurano.

A título de ejemplo, la reducción puede llevarse a cabo con la reductasa en un medio de reacción acuoso-orgánico, tal como por ejemplo agua/isopropanol, en una relación de mezcla arbitraria, tal como por ejemplo de 1:99 hasta 99:1 o de 10:90 hasta 90:10, o puede llevarse a cabo en un medio de reacción acuoso.

El substrato (1) es empleado en la reducción enzimática preferentemente en una concentración comprendida entre 0,1 g/l y 500 g/l, de manera especialmente preferente entre 1 g/l y 50 g/l y puede ser reajustado de manera continua o de manera discontinua.

La reducción enzimática se lleva a cabo, por regla general, a una temperatura de la reacción situada por debajo de la temperatura de desactivación de la reductasa empleada y por encima de -10ºC. De manera especialmente preferente la temperatura está situada en el intervalo comprendido entre 0 y 100ºC, de manera especial está situada en el intervalo comprendido entre 15 y 60ºC y de manera especial está situada en el intervalo comprendido entre 20 y 40ºC, por ejemplo es de aproximadamente 30ºC.

Para la realización puede disponerse inicialmente, por ejemplo, el substrato (1) con la reductasa, con el disolvente y, en caso dado, con los coenzimas, en caso dado con una segunda dehidrogenasa para la regeneración del coenzima y/o con otros agentes reductores y se remueve la mezcla, por ejemplo por medio de agitadores o de vibradores. Sin embargo es posible también efectuar la inmovilización de la reductasa en un reactor, por ejemplo en una columna, y conducir a través del reactor una mezcla que contiene al substrato y, en caso dado, al coenzima y/o al cosubstrato. Con esta finalidad, puede conducirse la mezcla en circuito cerrado a través del reactor hasta que se alcance la conversión deseada.

En este caso, se reduce el triple enlace en la posición \alpha,\beta con respecto a la función carbonilo para dar un doble enlace; ocasionalmente se verifica también una reducción de la función carbonilo propiamente dicha para dar la función alcohólica. Por regla general se conduce la reducción hasta una conversión del 70% como mínimo, de manera especialmente preferente del 85% como mínimo y, de manera especial, del 95% como mínimo, con relación al substrato contenido en la mezcla. El avance de la reacción, es decir la reducción secuencial del doble enlace puede seguirse en este caso con ayuda de los métodos usuales tales como la cromatografía gaseosa o la cromatografía líquida a alta presión.

En el ámbito de la presente invención los "equivalentes funcionales" o los análogos de los enzimas divulgados de manera concreta son sus diversos polipéptidos, que tienen todavía la actividad biológica deseada, tal como por ejemplo la especificidad con respecto al substrato. De este modo, se entiende por ejemplo bajo el concepto de "equivalentes funcionales", aquellos enzimas que catalizan la reacción modelo y que presentan al menos el 20%, de manera preferente el 50%, de manera especialmente preferente el 75%, de manera muy especialmente preferente el 90% de la actividad de un enzima y que abarcan las secuencias de aminoácidos que han sido indicadas en SEQ ID NO:1, 2 o 3. De la misma manera, los equivalentes funcionales son estables de manera preferente entre pH 4 y 10 y tienen ventajosamente un óptimo de pH comprendido entre pH 5 y 8 así como un óptimo de temperatura situado en el intervalo comprendido entre 20ºC y 80ºC.

Se entiende por el concepto de "equivalentes funcionales" de conformidad con la invención, de manera especial, también aquellos mutantes, que presenten al menos en una posición de la secuencia de las secuencias de aminoácidos que han sido citadas precedentemente un aminoácido diferente de los aminoácidos que han sido citados de manera concreta pero que, a pesar de ello, tengan una de las actividades biológicas que han sido citadas precedentemente. Por consiguiente, los "equivalentes funcionales" abarcan los mutantes que pueden ser obtenidos por medio de adiciones, substituciones, deleciones y/o inversiones de uno o de varios aminoácidos, pudiéndose presentar las modificaciones citadas en cualquier posición de la secuencia en tanto en cuanto conduzcan a un mutante con el perfil de propiedades de conformidad con la invención. Así mismo, la equivalencia funcional se da, de manera especial, cuando coincida desde el punto de vista cualitativo el modelo de reactividad entre el mutante y el polipéptido no modificado, es decir por ejemplo cuando se hagan reaccionar substratos iguales con velocidades diferentes.

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Ejemplos de substituciones de aminoácidos adecuadas pueden verse en la tabla siguiente:

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Los "equivalentes funcionales" en el sentido precedente son así mismo los "precursores" de los polipéptidos descritos así como los "derivados funcionales".

Los "precursores" son, en este caso, precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

Los "derivados funcionales" de los polipéptidos, de conformidad con la invención, pueden ser preparados igualmente sobre grupos laterales de aminoácidos funcionales o sobre sus extremos N-terminales o C-terminales con ayuda de técnicas conocidas. Tales derivados abarcan, por ejemplo, los ésteres alifáticos de los grupos de los ácidos carboxílicos, las amidas del grupo de los ácidos carboxílicos, que pueden ser obtenidas por medio de la reacción con amoniaco o con una amina primaria o secundaria; los derivados N-acilados de grupo amino libres, preparados mediante la reacción con grupos acilo; o los derivados O-acilados de los grupos hidroxi libres preparados mediante la reacción con grupos acilo.

En el caso de una posible glicosilación de la proteína, los "equivalentes funcionales" de conformidad con la invención abarcan las proteínas del tipo que ha sido indicado precedentemente en forma desglicosilada o bien en forma glicosilada así como las formas modificadas que pueden ser obtenidas mediante la modificación del modelo de glicosilación.

Naturalmente los "equivalentes funcionales" abarcan así mismo los polipéptidos que pueden ser obtenidos a partir de otros organismos, así como las variantes de origen natural. De manera ejemplificativa, pueden determinarse regiones secuenciales homólogas por medio de una comparación secuencial de las regiones y pueden ser localizados enzimas equivalentes de conformidad con las especificaciones concretas de la invención.

Los "equivalentes funcionales" abarcan así mismo fragmentos, de manera preferente dominios individuales o motivos secuenciales, de los péptidos de conformidad con la invención, que presenten por ejemplo la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son, así mismo, proteínas de fusión, que presentan una de las secuencias de polipéptido que han sido citadas precedentemente o equivalentes funcionales, derivados de las mismas, y, al menos, otra secuencia heteróloga, diferente de la secuencia funcional en enlace N-terminal o C-terminal funcional (es decir sin interferencia funcional esencial mutua entre las partes de la proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de las secuencias heterólogas de este tipo son, por ejemplo, los péptidos de señal o los enzimas.

Los homólogos de las proteínas, de conformidad con la invención, pueden ser identificados mediante rastreo de bancos combinatorios de mutantes, tales como por ejemplo mutantes de acortamiento. A título de ejemplo puede generarse un banco diversificado de variantes proteicas mediante mutagénesis combinatoria en el plano de los ácidos nucleicos, tal como por ejemplo por medio de una ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe un gran número de procedimientos que pueden ser empleados para la obtención de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótido. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede llevarse a cabo en dispositivos automáticos para la síntesis del ADN y el gen sintético puede ser ligado a continuación en un vector de expresión adecuado. El empleo de un juego de genes degenerados posibilita la preparación de todas las secuencias en una mezcla que codifiquen el juego deseado en secuencias proteicas potenciales. El técnico en la materia conoce procedimientos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado de la técnica se conocen varias técnicas para llevar a cabo el rastreo de productos génicos de bancos combinatorios, que han sido preparados mediante mutaciones puntuales o mediante acortamientos y para llevar a cabo el rastreo de bancos de ADNc en productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden ser adaptadas al rastreo rápido de las genotecas, que han sido preparadas mediante mutagénesis combinatoria de los homólogos de conformidad con la invención. Las técnicas empleadas de una manera más frecuente para el rastreo de grandes genotecas, que están sometidas a un análisis con un elevado caudal, abarcan la clonación de genotecas en vectores de expresión replicables, la transformación de las células adecuadas con el banco de vectores resultante y la expresión de los genes combinatorios bajo condiciones en las que se facilite la identificación de la actividad deseada, el aislamiento del vector, que codifica el gen, cuyo producto ha sido identificado. La mutagénesis recursiva en conjunto Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales en los bancos, puede ser empleada en combinación con los ensayos de rastreo con objeto de identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

El objeto de la invención está constituido así mismo por secuencias de ácidos nucleicos (secuencias de ADN y secuencias de ARN de una sola hebra o de doble hebra, tales como por ejemplo ADNc y ARNm), que codifican un enzima con actividad de reductasa de conformidad con la invención. Son preferentes las secuencias de los ácidos nucleicos que codifiquen por ejemplo secuencias de aminoácidos de conformidad con las SEQ ID NO:1, 2 o 3 o secuencias parciales características de las mismas.

Todas las secuencias de ácidos nucleicos, aquí citadas, pueden ser preparadas en forma en sí conocida por medio de síntesis química a partir de los componentes nucleótidos, tal como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de componentes de los ácidos nucleicos individuales complementarios, que se solapan, de la doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos puede llevarse a cabo por ejemplo en forma conocida, de acuerdo con los métodos a la fosforamidita (Voet, Voet, 2ª edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y el relleno de espacios con ayuda de fragmentos de Klenow de la ADN-polimerasa y las reacciones de ligadura así como los procedimientos generales de clonación están descritos en la publicación de Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Otras configuraciones para la realización del procedimiento enzimático de reducción de conformidad con la invención son:

Las reductasas, empleadas de conformidad con la invención, pueden ser empleadas en el procedimiento de conformidad con la invención en forma de enzima libre o de enzima inmovilizado.

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El valor del pH en el procedimiento de conformidad con la invención se mantiene de manera ventajosa entre pH 4 y 12, de manera preferente se mantiene entre pH 4,5 y 9, de manera especialmente preferente se mantiene entre pH 5 y 8.

Para el procedimiento de conformidad con la invención pueden ser empleadas células lavadas, que contengan los ácidos nucleicos, constructos de ácidos nucleicos o vectores, que codifiquen la reductasa. Así mismo pueden ser empleadas células en reposo o células digeridas. A título de ejemplo, debe entenderse por células digeridas aquellas células que se han vuelto permeables por medio de un tratamiento por ejemplo con disolventes, o aquellas células que han sido digeridas por medio de un tratamiento enzimático, por medio de un tratamiento mecánico (por ejemplo prensa French o ultrasonidos) o por medio de otro método. Los extractos en bruto, obtenidos de este modo, son adecuados ventajosamente para el procedimiento de conformidad con la invención. Así mismo, los enzimas purificados o semipurificados pueden ser empleados para el procedimiento. De la misma manera, son adecuados los microorganismos o los enzimas inmovilizados, que pueden encontrar aplicación ventajosamente en la
reacción.

El procedimiento de conformidad con la invención puede llevarse a cabo según una forma de trabajo en tandas, en semi-tandas o de manera continua.

La realización del procedimiento puede llevarse a cabo ventajosamente en biorreactores tales como por ejemplo los que han sido descritos en la publicación Biotechnology, tomo 3, 2ª edición, Rehm et al Hrsg., (1993) especialmente en el Capítulo II.

Los ejemplos siguientes ponen de manifiesto la invención sin limitarla en modo alguno. En este caso se hará referencia a las figuras adjuntas. Parte experimental

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Ejemplo 1 Obtención de los transformantes E. coli TG10^{+}, que expresan la reductasa, y correspondientes constructos de transformación

Cuando no se diga otra cosa, pueden llevarse a cabo en el ámbito de la presente invención las etapas de clonación, tales como por ejemplo las disociaciones por restricción, la electrofóresis en gel de agarosa, la purificación de los fragmentos de ADN, la transferencia de ácidos nucleicos sobre nitrocelulosa y sobre membranas de Nylon, el enlace de los fragmentos de ADN, la transformación de microorganismos, el cultivo de microorganismos, la multiplicación de fagos y el análisis secuencial del ADN recombinante, como se ha descrito en la publicación de Sambrook et al. (1989) a.a.O.

La cepa recombinante Escherichia-coli TG10^{+}(OYE) se construyó de la manera siguiente:

E. coli TG10 se ha derivado de E. coli TG1 (Stratagene). El TG10 es una cepa resistente a la tetraciclina y auxótrofa con la ramnosa. El TG10^{+} se deriva del TG10 mediante introducción de los plásmidos siguientes:

a): pAgro4 (chaperona + resistente a la estreptomicina) (véase la figura 3) y

b): pHSG575 (chaperona + resistente al cloranfenicol) (véase la figura 4).

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El pAgro4 es un descendiente de los vectores pZ con genes groELS-chaperonina de E. coli. A su vez el pZ es un derivado del plásmido pACYC. El pAgro4 está descrito, por ejemplo, en la publicación Nucleic Acids Res., 1997, 25, 1203, Mol. Microbiol., 2001, 40, 397. El pHSG575 es un descendiente del pSC101 con gen represor laclq de E. coli y que está descrito, por ejemplo, en la publicación Gene, 1987, 61, 63, Mol. Microbiol., 2001, 40, 397.

El TG10^{+}(OYE) se derivó del TG10^{+} por medio de la inserción de otro plásmido:

\quad: pDHE 1650 (promotor de ramnosa lento + resistente a la ampicilina + un gel oye).

\quad: pDHE1650 es un descendiente de pJOE2702 en el que ha sido clonado el gen para el, enzima amarillo antiguo -"old yellow enzymes"- entre los puntos de restricción NdeI y PstI o bien HindIII de pJOE2702. A su vez se preparó el pJOE2702 amplificándose la secuencia rhaB de E. coli JM109 y clonándose en los puntos de restricción SphI o bien EcoRI del descendiente de pBR322 constituido por el pBTAC1. Los puntos de enlace de los ribosomas de pET11a así como un punto de restricción NdeI se obtuvieron con oligonucleótidos sintéticos y se establecieron entre los puntos de restricción BämHI/EcoRI de pBTAC1. El plásmido ha sido descrito, por ejemplo, en la publicación Methods Enzymol., 1992, 216, 457, Mol. Microbiol., 1996, 21,1037.

Por la presente se hace referencia expresa a las citas bibliográficas anteriores.

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Se clonaron los siguientes genes del enzima amarillo antiguo (oye):

a): oye 1: Saccaromyces carlsbergensis (genoteca Q02899)

b): oye 2: Saccaromyces cerevisiae (genoteca Q03558)

c): oye 3: Saccaromyces cerevisiae (genoteca P41816).

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En este caso se obtuvieron los siguientes plásmidos:

\quad: pDHE1650 OYE1 (véase la figura 5)

\quad: pDHE1650 OYE2 (véase la figura 6)

\quad: pDHE1650 OYE3 (véase la figura 7)

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Ejemplo 2 Experimentos de biotransformación a) Producción de enzimas

Las cepas recombinantes se cultivaron en medio Luria-Broth (10 g/l de triptona, 10 g/l de NaCl y 5 g/l de extracto de levadura), que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 20 \mug/ml de cloranfenicol. La sobreexpresión de proteína se indujo con 0,1 mM de IPTG para las dos chaperonas y con 0,5 g/l de L-ramnosa para OYE. Los cultivos se sacudieron con 120 revoluciones por minuto durante 22 horas a 37ºC. Las células recolectadas se conservaron a -20ºC.

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a) Biotransformación

Las biotransformaciones se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 1 ml bajo agitación magnética a 30ºC durante un período de tiempo de 1 hora. Las concentraciones iniciales en la mezcla de la reacción eran las siguientes: 10 g de masa seca celular/litro, 10% de isopropanol [volumen/volumen], 20 mM de 4-fenil-3-butin-2-ona, 5 mM de EDTA, 2 mM de NADP^{+}, 1 U/ml de glucosadehidrogenasa procedente de Thermoplasma acidophilum, 50 mM de D-glucosa, 50 mM de tampón MES, ajustado con KOH a pH 6,8. Para las biotransformaciones con NADH se empleó el sistema de regeneración de NADPH (NADP^{+}, glucosa dehidrogenasa y glucosa) por medio de 15 mM de NADH.

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b) Evaluación de los ensayos

Las mezclas de la reacción se extrajeron con cloroformo y los extractos se detectaron mediante cromatografía gaseosa capilar (GC) con empleo de una Varian Star 3400 GC con una columna capilar Supelco BPX5 (25 m x 0,32 mm de diámetro interno con un espesor de película de la fase estacionaria de 0,5 \mum) y detección por medio de FID. La identidad de los productos se demostró por medio de co-elución de patrones de muestras y por medio de los datos GC/MS. La GC/MS se llevó a cabo en un cromatógrafo de gas Hewlett-Packard 5890, Serie II, conectado con un espectrómetro de masas Hewlett-Packard 5972 TID mediante la utilización de una columna capilar Restek RTX-5MS (30 m x 0,25 mm de diámetro interno con un espesor de la película de la fase estacionaria de 0,25 \mum). Los cromatogramas y las relaciones m/z se analizaron con ayuda del programa de ordenador MSD ChemStation de la firma Agilent Technologies. Además se exploraron bancos de datos con las muestras de fragmentación con ayuda de la Wiley6 Library para llevar a cabo la identificación de los compuestos desconocidos. Se utilizó un dispositivo Bruker 300 MHz GYRO NMR para llevar a cabo la determinación de la configuración cis y de la configuración trans del producto formado constituido por la 4-fenil-3-buten-2-ona. Se utilizó el programa de ordenador 1D-WINNMR para el análisis de los datos y los espectros obtenidos se compararon con un patrón de la trans-4-fenol-3-buten-2-ona con una pureza del 99%.

Los resultados obtenidos por medio de los ensayos, expresados mediante la productividad inicial (mM/h) están reunidos en la figura 1 adjunta. Se observa una formación sorprendentemente específica de la E-4-fenil-3-buten-2-ona.

Claims

1. Procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona \alpha,\beta-insaturados de la fórmula general (1)

6

en la que

R^{1}: significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un resto aromático o no aromático, carbocíclico o heterocíclico, en caso dado substituido,

\quad: mediante la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa

(i): que comprende al menos una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o

(ii): con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la reducción se lleva a cabo con NADPH o con NADH a título de cofactor, independientemente del ATP.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el cofactor empleado es regenerado por vía enzimática.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la regeneración del cofactor se lleva a cabo por medio de glucosa-dehidrogenasa.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reducción se lleva a cabo en un medio de reacción acuoso, acuoso-alcohólico o alcohólico.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reductasa está presente en forma inmovilizada.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el enzima se elige entre las reductasas procedentes de Saccharomyces carlsbergensis (genoteca Q02899), Saccharomyces cerevisiae (genoteca Q03558) y Saccharomyces cerevisiae (genoteca P41816).

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se hace reaccionar un compuesto de la fórmula (1), en el que R^{1} significa arilo, en caso dado substituido, y R^{2} significa alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtiene el isómero E de los compuestos de la fórmula (2).

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura situada en el intervalo comprendido entre 0 y 45ºC y/o a un valor del pH situado en el intervalo comprendido entre 6 y 8.

11. Empleo de un compuesto de la fórmula (2), preparado según un procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, como producto intermedio para la síntesis química o enzimática de principios activos.