ES2854724T3 - Ciclación enzimática de ácido homofarnesílico - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de 3a,6,6,9a-tetrametil-dodecahidronafto[2,1-b]furano (ambróxido), en el que a) ácido homofarnesílico de fórmula Ia **(Ver fórmula)** se convierte en esclareolida de fórmula IIa, **(Ver fórmula)** en el que el ácido homofarnesílico de fórmula Ia se pone en contacto con una escualeno-hopeno ciclasa (SHC), que es capaz de ciclar un ácido carboxílico poliinsaturado, en particular ácido homofarnesílico; en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli LU 15568 transgénica que sobreexpresa SHC; b) esclareolida de la fórmula IIa del paso a) se reduce químicamente a ambroxidol y c) ambroxidol del paso b) se cicla químicamente dando ambróxido.

Description

DESCRIPCIÓN

Cidación enzimática de ácido homofamesílico

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de esclareolida mediante ciclación biocatalítica de ácido homofarnesílico y así como a un procedimiento para la producción de ambróxido a través de la ciclación biocatalítica de ácido homofarnesílico para dar esclareolida.

Antecedentes de la invención

Los compuestos con la estructura principal del dodecahidronafto[2,1-b]furano son de gran interés económico como productos químicos aromáticos. En este caso se menciona el Compuesto (-)-2, el (3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9atetrametildodecahidronafto-[2 ,1-b]-furano conocido como el estereoisómero levógiro del ambroxano.

Originalmente obtenido a partir del ámbar del cachalote, actualmente existen principalmente dos rutas que permiten el acceso a ambroxán. Esclareol (3), un ingrediente de la esclárea (Salvia sclarea) sirve a este respecto con frecuencia como material de partida adecuado para material semisintético, debido a que contiene ya información óptica para el compuesto ((-)-2). A este respecto, la degradación oxidativa se puede llevar a cabo con ácido crómico, permanganato, H2O2 u ozono [Stoll et a l Helv Chim Acta (1950), 33: 1251]. La esclareolida (4) obtenida se convierte mediante una reducción posterior (por ejemplo con LiAlH4 o NaBH4) en el ambrox-1,4-diol (5) [Mookherjee et al.; Perfumer and Flavourist (1990), 15: 27]. La preparación de compuesto (4) a partir de esclareol (3) puede tener lugar también mediante una biotransformación con Hyphozyma roseoniger [documento EP 204009]

( - ) - A m b r o x Esclareol 3 Ambroxidol 5 W-2 Ambrox-1,4-diol (5) puede ciclarse por último con una serie de procedimientos químicos para dar el compuesto ((-)-2). Al racemato de ambroxán (rac-2) se han elaborado accesos, entre otros, a través de ácido homofarnesílico [documento US 513.270; Lucius et al. ; Chem Ber (1960), 93: 2663] y 4-(2,6,6-trimetil-ciclohex-1-enil)-butan-2-ona [Büchi et al. ; Helv Chim Acta (1989), 72: 996].

El volumen de mercado de ambroxán en 2002 era en promedio de 20 toneladas al año. Para ello es necesaria una base de partida de aproximadamente 33 toneladas de esclareol al año. Para la producción de una tonelada de ambroxán se necesitan 207 toneladas de distintas sustancias individuales, que a su vez requieren la acumulación de 206 toneladas de desecho. Las sustancias que se acumulan presentan efectos diferentes, pero en general, relativamente potentes sobre la salud y el medio ambiente [Deutsche Bundesstiftung Umwelt]. Por lo tanto, esta síntesis es de muy alto consumo energético y requiere el uso de productos químicos contaminantes.

La síntesis biocatalítica de compuesto ((-)-2) se describe en la bibliografía [Neumann et al.; Biol Chem Hoppe Seyler (1986), 367: 723]. A este respecto, la molécula se obtiene a partir de homofarnesol (compuesto (1a), (3Z,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11 -trien-1 -ol). Como catalizador se usó la escualeno-hopeno ciclasa (SHC) de Alicyclobacillus acidocaldarius (anteriormente Bacillus acidocaldarius). Otras enzima que catalizan la ciclación de homofarnesol en ambroxán se describen en documentos de patente (por ejemplo documento WO 2012/066059) y en la bibliografía [Neumann et al, loc. cit.].

Seitz, M. et al describen en ChemBioChem 2013, 14, 436-439 un procedimiento enzimático para la producción de esclareolida a partir de ácido homofarnesílico con el uso de la escualeno-hopeno ciclasa de Zymomonas mobilis (Zm SHCl). Los rendimientos de producto alcanzados a este respecto se encuentran sin embargo solo en aproximadamente el 7,7 al 22,9 %. A este respecto se trata de un procedimiento para la preparación de esclareolida de fórmula IIa, en el que se convierte el ácido homofarnesílico de fórmula Ia en esclareolida de fórmula IIa,

en el que ácido homofarnesílico de fórmula Ia se pone en contacto con una escualeno-hopeno ciclasa (SHC), que es capaz de ciclar un ácido carboxílico poliinsaturado, en particular ácido homofarnesílico, en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli BL21 (DE3) transgénica que sobreexpresa SHC.

Era objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento mejorado para la producción de precursores de ambróxido, en particular de esclareolida y compuestos relacionados, que pueda llevarse a cabo de manera técnicamente más sencilla y más económico que los procedimientos químicos convencionales (por ejemplo, reducción del número de pasos de reacción necesarios, y/o materiales de partida más baratos). Otro objetivo era reducir los gastos generados adicionalmente por el uso de materias primas fácilmente accesibles así como una disminución del número de reacciones químicas (o pasos). En particular, se proporcionará un procedimiento biocatalítico mejorado para la producción de esclareolida.

Sumario de la invención

Los objetivos anteriores se consiguieron mediante la provisión de un procedimiento para la producción de precursores de ambróxido, preferentemente esclareolida, de fórmula general (4) o (IIa), caracterizado porque el ácido homofarnesílico de fórmula general (1 b) o (Ia) se cicla biocatalíticamente, tal como se explica con más detalle a continuación.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el espectro (A) de cromatografía de gases (CG) de un producto de ciclación de ácido homofarnesílico preparado de acuerdo con la invención en comparación con (B) la CG de un preparado de esclareolida comercial.

Descripción detallada de la invención

A. Definiciones generales

"Ácido homofarnesílico" (compuesto (1b) o (Ia)) es sinónimo de, "ácido (3E,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trienoico" "esclareolida "(compuesto (4) o (IIa)) es sinónimo de "(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-tetrametil-1,4,5,5a,7,8,9,9boctahidrobenzo[e]benzofuran-2-ona".

La esclareolida levógira (o compuesto (-)-4) tiene la siguiente fórmula

"ambrox", "ambroxán" y "ambróxido" se usan como sinónimos en el presente documento. Abarcan todas las formas estereoisoméricas, tal como en particular (+)-ambrox, 3a-epi-(-)ambrox, 9b-epi-(-)ambrox y en particular (-)ambrox.

Las "ciclasas" en el sentido de la presente invención son en general enzimas o mutantes de enzimas, que en particular muestran la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa. Como enzimas con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, son adecuadas transferasas intramoleculares de la subclase de las isomerasas; es decir, proteínas con el número EC EC 5.4. (código de enzima de acuerdo con Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650) En particular, se trata de representantes de EC 5.4.99.17. Como enzimas con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa son en particular adecuadas aquellas ciclasas que también provocan la ciclación de ácido homofarnesílico en esclareolida y/o de escualeno en hopeno (para ello también ocasionalmente el nombre de "SHC" escualeno hopeno ciclasa) y que se describen en detalle en la solicitud internacional PCT/EP2010/057696. Mutantes de las mismas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2012/066059.

Debido a la reversibilidad de las reacciones enzimáticas, la presente invención se refiere a las conversiones enzimáticas descritas en el presente documento en ambas direcciones de conversión.

"Mutantes funcionales" de una "ciclasa" abarcan los "equivalentes funcionales" de tales enzimas definidos a continuación.

La expresión "procedimiento biocatalítico" se refiere a cualquier procedimiento llevado a cabo en presencia de actividad catalítica de una "ciclasa" de acuerdo con la invención o de una enzima con "actividad ciclasa", es decir, procedimientos en presencia de enzima bruta o purificada, disuelta, dispersada o inmovilizada, o en presencia de células microbianas completas, que presentan o expresan actividad enzimática de este tipo. Por lo tanto, los procedimientos biocatalíticos abarcan procedimientos enzimáticos y microbianos.

El término "estereoisómeros" abarca isómeros conformacionales y, en particular, isómeros configuracionales, tales como enantiómeros y diastereoisómeros.

En general están abarcados de acuerdo con la invención todas las formas estereoisoméricas de los compuestos descritos en el presente documento, tales como isómeros constitucionales y en particular estereoisómeros y mezclas de los mismos, tales como, por ejemplo, isómeros ópticos o isómeros geométricos, tales como isómeros E y Z, así como combinaciones de los mismos. Si están presentes varios centros de asimetría en una molécula, entonces, la invención abarca todas las combinaciones de diferentes conformaciones de estos centros de asimetría, tales como, por ejemplo, pares de enantiómeros.

El término "estereoespecífico" significa que uno de varios posibles estereoisómeros de un compuesto preparado de acuerdo con la invención con al menos un centro de asimetría se produce por la acción de una enzima de acuerdo con la invención en alto "exceso enantiomérico" o alta "pureza enantiomérica", tal como, por ejemplo, al menos 90 % de ee, en particular al menos 95 % de ee, o al menos 98 % de ee, o al menos 99 % de ee. El valor de % de ee se calcula según la siguiente fórmula:

% de ee = [X^a-X^b]/[X^a+X^b]*100,

en la que X^a y X^b representan la fracción molar de los enantiómeros A o B.

Con una "actividad ciclasa", que se determinó con un "sustrato de referencia en condiciones estándar", se describe, por ejemplo, una actividad enzimática que describe la formación de un producto cíclico a partir de un sustrato no cíclico. Condiciones estándar son, por ejemplo, concentraciones de sustrato de 10 mM a 0,2 M, en particular de 15 a 100 mM, tal como, por ejemplo, aproximadamente de 20 a 25 mM; a pH 4 a 8, y a temperaturas de, por ejemplo, 15 a 30 o 20 a 25 °C. La determinación puede tener lugar a este respecto con células recombinantes que expresan ciclasa, células digeridas que expresan ciclasa, fracciones de las mismas o enzima ciclasa enriquecida o purificada. En particular, el sustrato de referencia es un ácido homofarnesílico de fórmula (Ia); las condiciones estándar son en particular aproximadamente ácido homofarnesílico 20 a 25 mM de fórmula (Ia), a de 20 a 25 °C y pH 4 - 6, tal como, por ejemplo 4,5; tal como se describe con más detalle en los ejemplos.

El "rendimiento" y/o la "conversión" de una reacción de acuerdo con la invención se determina durante un periodo de tiempo definido de, por ejemplo, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 o 48 horas, en el que la conversión de ácido homofarnesílico en esclareolida tiene lugar por medio de las ciclasas de acuerdo con la invención. En particular, la reacción se lleva a cabo en condiciones definidas con precisión, de por ejemplo 25, 30, 40, 50 o 60 °C. En particular, tiene lugar la determinación del rendimiento y/o de la conversión llevándose a cabo la reacción para la conversión de ácido homofarnesílico en esclareolida por medio de las ciclasas de acuerdo con la invención a 30 °C durante 16 horas.

Para la determinación del rendimiento y/o de la conversión, se hace reaccionar en particular una solución de ácido homofarnesílico 10 mM con una solución de ciclasa, encontrándose la enzima como extracto de proteína de membrana de células que expresan ciclasa (aisladas, por ejemplo, de acuerdo con [Ochs D.et al.; J Bacteriol (1992), 174: 298]) en una concentración de contenido de proteína del 0,08 por ciento en peso.

Una ciclasa de acuerdo con la invención también se puede caracterizar porque, en la reacción de ácido homofarnesílico en esclareolida en las mismas condiciones, muestra un rendimiento y/o conversión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 500, 1000 veces o más en comparación con la escualeno-hopeno ciclasa (SHC) Alicydobacillus acidocaldarius (antes Bacillus acidocaldarius) El término "condiciones" se refiere en este caso a condiciones de reacción tales como concentración de sustrato, concentración de enzima, periodo de tiempo de reacción y/o temperatura.

La expresión "ácido carboxílico" abarca tanto el ácido libre como la forma de sal del mismo, tal como, por ejemplo, sus sales de metal alcalino o alcalinotérreo. Esto se aplica correspondientemente a todos los ácidos carboxílicos mencionados en el presente documento, tal como, por ejemplo, el ácido homofarnesílico

El término "aproximadamente" designa un cambio potencial de ± 25 % de un valor indicado, en particular ± 15 %, ± 10%, preferentemente ± 5 %, ± 2 % o ± 1 %.

El término "esencialmente" delimita un intervalo de valores de aproximadamente el 80 al 100 % inclusive, tal como, por ejemplo, el 85-99,9 %, en particular del 90 al 99,9 %, preferentemente del 95 al 99,9 % o del 98 al 99,9 %, principalmente del 99 al 99,9 %.

A menos que se indiquen datos distintos, en el presente documento se aplican las siguientes definiciones químicas generales:

"alquilo" representa restos hidrocarburo saturados, de cadena lineal o ramificados, en particular de cadena lineal con 1 a 6, en particular 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo metilo, etilo, propilo, 1 -metiletilo, butilo, 1 -metilpropilo, 2-metilpropilo, y 1,1-dimetiletilo como representantes a modo de ejemplo de alquilo C1-C4; así como pentilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1 -metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1 -etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1 -etil-1-metilpropilo y 1-etil-2-metilpropilo; en particular metilo, etilo, n-propilo y n-butilo.

B. Configuraciones especiales de la invención

La presente invención se refiere en particular a las siguientes formas de realización especiales:

Procedimiento para la producción de 3a,6,6,9a-tetrametil-dodecahidronafto[2,1-b]furano (ambróxido),

en el que

a) se convierte ácido homofarnesílico de fórmula Ia en esclareolida de fórmula IIa,

en el que ácido homofarnesílico de fórmula Ia se pone en contacto con una escualeno-hopeno ciclasa (SHC), que es capaz de ciclar un ácido carboxílico poliinsaturado, en particular ácido homofarnesílico, en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli LU 15568 transgénica que sobreexpresa SHC,

b) esclareolida de la fórmula IIa del paso a) se reduce químicamente a ambroxidol y

c) ambroxidol del paso b) se cicla químicamente dando ambróxido.

Dicho procedimiento, en el que ácido homofarnesílico se emplea en forma esencialmente estereoisoméricamente pura como reactante, preferentemente en un porcentaje del ácido (3E,7E)-homofarnesílico de al menos el 85 % en moles, lo más preferentemente del 90, 95 o 99 o 99,9 % en moles, con respecto a la cantidad total de isómeros de ácido homofarnesílico contenidos. A este respecto, "esencialmente" significa un intervalo de valores del 80 al 100 %.

Dicho procedimiento, en el que se obtiene esclareolida de fórmula IIa en forma estereoisoméricamente pura o como mezcla de estereoisómeros.

Dicho procedimiento, en el que la SHC se selecciona de entre

a) proteínas que comprenden un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 b) por deleción, inserción, sustitución, adición, inversión o una combinación de proteínas de derivadas de proteínas de acuerdo con a), que comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos el 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, en particular al menos el 75 % o el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, tal como, por ejemplo, al menos el 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con respecto a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2; y

c) proteínas funcionalmente equivalentes a a) o b) que catalizan la ciclación de ácido homofarnesílico en esclareolida y se seleccionan de SEQ ID NO: 3-326.

Dicho procedimiento, en donde la actividad enzimática de la SHC se encuentra en una forma seleccionada de:

a) una ciclasa libre, producida de manera recombinante, dado el caso parcial o totalmente purificada, b) ciclasa de acuerdo con a) en forma inmovilizada;

c) células completas, que contienen al menos una ciclasa;

d) lisados celulares u homogeneizados celulares de células de acuerdo con c).

Dicho procedimiento, en el que la reacción tiene lugar en sistemas acuosos monofásicos o en sistemas acuososorgánicos o sólidos-líquidos de dos fases.

Dicho procedimiento, en el que la SHC se codifica por un gen que se aísla a partir de un microorganismo seleccionado entre Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec., Streptomyces coelicolor y en particular Zymomonas mobilis.

Dicho procedimiento, en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli LU 15568 transgénica que sobreexpresa SHC, producido mediante transformación de la cepa de E. coli TG10 pAfro4 pHSG575 con el plásmido pDHE-Zm-SHC-1.

Dicho procedimiento, en el que la reacción tiene lugar en un modo de proceder discontinuo, de alimentación discontinua o continuo.

Dicho procedimiento, en el que la conversión biocatalítica se lleva a cabo en al menos una de las siguientes condiciones:

a) a un valor de pH del medio de reacción en el intervalo de aproximadamente 4 a 5,8 o de 4,5 a 5,8, en particular de 4,5 a 5,5 o de 5 a 5,5;

b) a una concentración de sustrato de al menos 15 mM, tal como, por ejemplo, hasta 100 mM, en particular hasta 50 mM, en particular de 15 a 30 mM, principalmente de 15 a 25 mM;

c) a una concentración de enzima de al menos 5 mg/ml; en particular de 5 a 100, preferentemente de 10 a 50 o de 15 a 40 o de 15 a 30 mg/ml

d) a una temperatura de reacción en el intervalo de 32 a 40 °C, en particular de 35 a 38 °C;

e) en tampón de citrato de sodio, que contiene MgCh de 1 a 20 mM o de 5 a 10 mM

f) a una concentración de tampón de aproximadamente 10 a 100, en particular de 20 a 50 mM.

Los procedimientos de acuerdo con la invención se llevan a cabo preferentemente con implementación simultánea de las condiciones anteriores a) a b) o a) a c) o a) a d) o a) a e) o a) a f). A este respecto, cualquier combinación de intervalos de parámetros es parte de la presente divulgación, independientemente del grado respectivo de preferencia de intervalos individuales.

Preferentemente, la reacción tiene lugar a una temperatura de aproximadamente 37 °C y un valor de pH en el intervalo de 5 a 5,2.

Dicho procedimiento, en el que ambróxido es (-)-ambróxido ((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-tetrametildodecahidronafto[2,1-b]furano [CAS 6790-58-5]).

C. Configuraciones adicionales de la invención

1. Secuencias de ciclasa especialmente adecuadas

Las ciclasas que pueden usarse de acuerdo con la invención son las SHC cuya SEQ ID NO para la correspondiente secuencia de tipo natural, organismo fuente y número de referencia del banco de genes, están resumidas en la siguiente tabla.

continuación

s543 seq_ID 75 Blastopirellula marina EAQ78122.1 continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la ciclasa que en el presente documento se denomina también Zm-SHC-1.

2. Otras proteínas/mutantes de enzimas

El procedimiento de acuerdo con la invención no está limitado a las proteínas con actividad ciclasa descritas concretamente en el presente documento, sino que, más bien se extiende también a equivalentes funcionales de las mismas.

"Equivalentes funcionales" o análogos de las enzimas divulgadas concretamente, en particular de SEQ ID NO: 2 a 6, son en el contexto de la presente invención, polipéptidos distintos de los mismos, que tienen además la actividad biológica deseada, tal como en particular actividad ciclasa.

De este modo, por ejemplo por "equivalentes funcionales" se entienden enzimas y mutantes que en una prueba usada para la "actividad ciclasa" en el sentido de la invención (es decir, con un sustrato de referencia en condiciones estándar) presentan una actividad al menos el 1 %, en particular al menos aproximadamente del 5 al 10 %, tal como, por ejemplo, al menos el 10 % o al menos el 20 %, tal como, por ejemplo, al menos el 50 % o el 75 % o el 90 % mayor o menor de una enzima, que comprende una secuencia de aminoácidos definida concretamente en el presente documento (en particular SEQ ID NO: 2 a 6).

Los datos de actividad para equivalentes funcionales se refieren en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, a determinaciones de actividad, llevadas a cabo por medio de un sustrato de referencia en condiciones estándar, tal como se define en el presente documento.

La "actividad ciclasa" en el sentido de la invención puede detectarse con ayuda de distintas pruebas conocidas. Sin estar limitado a esto, se menciona una prueba con el uso de un sustrato de referencia, tal como, por ejemplo, ácido homofarnesílico, en condiciones estándar, tal como se describe anteriormente y se explica en la parte experimental.

Equivalentes funcionales son además estables por ejemplo entre pH 4 y 11 y tienen ventajosamente un valor óptimo de pH en un intervalo de pH 5 a 10, tal como en particular de 6,5 a 9,5 o de 7 a 8 o aproximadamente a 7,5, así como un valor óptimo de temperatura en el intervalo de 15 °C a 80 °C o de 20 °C a 70 °C, tal como, por ejemplo, aproximadamente de 30 a 60 °C o aproximadamente de 35 a 45 °C, tal como aproximadamente a 40 °C.

Por "equivalentes funcionales" se entienden en particular también "mutantes", que se derivan de SEQ ID NO: 2 a 326, en particular de SEQ ID NO: 2 a 6, y en al menos una posición de secuencia de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente presentan un aminoácido distinto del aminoácido mencionado en concreto pero, a pesar de ello, tienen una de las actividades biológicas mencionadas anteriormente.

"Equivalentes funcionales" comprenden los mutantes que pueden obtenerse mediante una o varias, tal como, por ejemplo, de 1 a 50, de 2 a 30, de 2 a 15, de 4 a 12 o de 5 a 10 mutaciones, tal como adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos, pudiendo aparecer los cambios mencionados en cualquier posición de secuencia, siempre que lleven a un mutante con el perfil de propiedades de acuerdo con la invención. Equivalencia funcional se da en particular también entonces cuando los patrones de reactividad entre mutante y polipéptido no modificado coinciden cualitativamente, es decir, por ejemplo se hacen reaccionar sustratos iguales con diferente velocidad.

Ejemplos no limitativos de sustituciones de aminoácidos adecuadas están resumidos en la siguiente tabla:

Resto original Ejemplos de sustitución

AIa Ser

Arg Lys

Asn Gln; His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn; Gln

Ile Leu; Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

"Equivalentes funcionales" en el sentido anterior son también "precursores" de los polipéptidos descritos así como "derivados funcionales" y "sales" de los polipéptidos.

"Precursores" son a este respecto etapas previas naturales o sintéticas de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

Por el término "sales" se entiende tanto sales de grupos carboxilo como sales de adición de ácido de grupos amino de las moléculas de proteína. Sales de grupos carboxilo se pueden preparar de manera en sí conocida y comprenden sales inorgánicas, tales como, por ejemplo, sales de sodio, de calcio, de amonio, de hierro y de zinc, así como sales con bases orgánicas, tales como, por ejemplo, aminas, tales como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Sales de adición de ácido, tales como, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos, tales como ácido acético y ácido oxálico también se abarcan.

"Derivados funcionales" de los polipéptidos pueden prepararse asimismo en grupos laterales de aminoácido funcionales o en sus extremos N o C terminales con ayuda de técnicas conocidas. Los derivados de este tipo comprenden por ejemplo ésteres alifáticos de grupos ácido carboxílico, amidas de grupos ácido carboxílico, que pueden obtenerse mediante reacción con amoniaco o con una amina primaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos amino libres, preparados mediante reacción con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos hidroxi libres, preparados mediante reacción con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" abarcan naturalmente también polipéptidos a los que puede accederse a partir de otros organismos, así como variantes que existen naturalmente. Por ejemplo, mediante comparación de secuencias pueden establecerse zonas de regiones de secuencia homólogas y siguiendo las especificaciones de la invención pueden averiguarse enzimas equivalentes.

Los "equivalentes funcionales" abarcan asimismo fragmentos, preferentemente dominios o motivos de secuencia individuales, polipéptidos, que presentan por ejemplo la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son además proteínas de fusión que presentan una de las secuencias de polipéptido mencionadas anteriormente o equivalentes funcionales derivados de las mismas y al menos una secuencia heteróloga adicional, funcionalmente distinta de la misma, en enlace funcional N o C terminal (es decir, sin perjuicio funcional esencial mutuo de las partes de proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de secuencias heterólogas de este tipo son por ejemplo péptidos señal, anclas de histidina o enzimas.

Los "equivalentes funcionales" abarcados conjuntamente son homólogos de las proteínas divulgadas concretamente. Estos tienen al menos el 60 %, preferentemente al menos el 75 %, en particular al menos el 85 %, tal como, por ejemplo, el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, de homología (o identidad) con una de las secuencias de aminoácidos divulgadas concretamente, calculada según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (Estados Unidos) 85(8), 1988, 2444-2448. Una homología o identidad porcentual de un polipéptido homólogo de acuerdo con la invención significa, en particular, identidad porcentual de los restos de aminoácido con respecto a la longitud total de una de las secuencias de aminoácidos descritas concretamente en el presente documento.

Los valores de identidad porcentual también pueden determinarse por medio de BLAST Alignments, Algorithmus blastp (BLAST de proteína-proteína), o aplicando los ajustes de Clustal indicados a continuación.

En el caso de una posible glicosilación de proteína, los "equivalentes funcionales" abarcan proteínas del tipo designado anteriormente en forma desglicosilada o glicosilada así como formas diferentes que pueden obtenerse mediante modificación del patrón de glicosilación.

Homólogos de las proteínas o polipéptidos se pueden generar mediante mutagénesis, por ejemplo, mediante mutación puntual, extensión o truncación de la proteína.

Homólogos de las proteínas se pueden identificar mediante selección de bancos combinatorios de mutantes, tal como, por ejemplo, mutantes truncadas. Por ejemplo puede generarse un banco variado de variantes de proteína mediante mutagénesis combinatoria en el plano de ácido nucleico, tal como por ejemplo mediante ligación enzimática de una mezcla de oligonucleóticos sintéticos. Existen múltiples procedimientos que pueden usarse para la preparación de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica generada puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético puede ligarse entonces en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto de genes degenerado permite la provisión de todas las secuencias en una mezcla, que codifican el conjunto deseado de secuencias de proteína potenciales. Procedimientos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos por el experto en la materia (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado de la técnica, varias técnicas para seleccionar productos génicos de bancos combinatorios, que han sido preparados por mutaciones puntuales o truncación, y para seleccionar bibliotecas de ADNc en busca de productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden adaptarse a la selección rápida de los bancos de genes, que se han generado mediante mutagénesis combinatoria de homólogos de acuerdo con la invención. Las técnicas usadas con la mayor frecuencia para la selección de grandes bancos de genes, que están sujetas a un análisis con alto rendimiento, comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células adecuadas con el banco de vectores resultante y expresión de los genes recombinantes en condiciones en las que la detección de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen, cuyo producto se detectó. La Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM) (mutagénesis de conjunto recursiva), una técnica que amplía la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede usarse en combinación con las pruebas de selección para identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

3. Ácidos nucleicos y constructos

3.1 Ácidos nucleicos

Se divulgan también secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima con actividad ciclasa tal como se describe anteriormente.

Se divulgan también ácidos nucleicos con un determinado grado de identidad con las secuencias concretas descritas en el presente documento.

Por "identidad" entre dos ácidos nucleicos se entiende la identidad de los nucleótidos a lo largo de la longitud de ácido nucleico completa en cada caso, en particular la identidad que se calcula mediante comparación con ayuda del software Vector NTI Suite 7.1 de la empresa Informax (EE. UU.) empleando el procedimiento Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Alineaciones de secuencias múltiples rápidas y sensibles en un microordenador. Comput Appl. Biosci. abril de 1989; 5(2): 151-1) se calcula con el ajuste de los parámetros:

parámetros de alineación múltiples:

penalización de abertura de huecos 10

penalización de extensión de huecos 10

intervalo de penalización de separación de huecos 8

penalización de separación de huecos apagado

% de identidad para retardo de alineación 40

(continuación)

huecos específicos de residuos apagado

hueco de residuo hidrófilo apagado

ponderación de transición 0

parámetro de alineación por pares:

algoritmo FAST encendido tamaño de K-tuplas 1

penalización por hueco 3

tamaño de ventana 5

número de mejores diagonales 5

Como alternativa, la identidad también puede determinarse según Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, de acuerdo con la dirección de Internet: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# y con los siguientes parámetros:

penalización de abertura por hueco de ADN 15,0

penalización de extensión de hueco de ADN 6,66

matriz de ADN identidad

penalización de abertura por hueco de proteína 10,0

penalización de extensión por hueco de proteína 0,2

matriz de proteína Gonnet

Todas las secuencias de ácido nucleico mencionadas en el presente documento (secuencias de ADN y ARN monocatenarias y bicatenarias, tales como, por ejemplo, ADNc y ARNm) mediante síntesis química a partir de los elementos constructivos de nucleótido, tales como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de elementos constructivos de ácido nucleico complementarios, solapantes, individuales, de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede tener lugar por ejemplo, de manera conocida, según el procedimiento de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y la compleción de huecos con ayuda del fragmento de la ADN polimerasa y reacciones de ligación así como procedimientos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Se divulgan también secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN mono- y bicatenarios, tales como por ejemplo ADNc y ARNm), que codifican uno de los polipéptidos anteriores y sus equivalentes funcionales, a los que puede accederse, por ejemplo, con el uso de análogos de nucleótido artificiales.

Se divulgan tanto moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican los polipéptidos o proteínas o secciones biológicamente activas de los mismos, como fragmentos de ácido nucleico, que se pueden usar, por ejemplo, para su uso como sondas de hibridación o cebadores para la identificación o amplificación de ácidos nucleicos codificantes.

Las moléculas de ácido nucleico también pueden contener secuencias no traducidas del extremo 3' y/o 5' de la región de gen codificante.

Se desvelan además las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias de nucleótidos descritas concretamente o una sección de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos permiten la generación de sondas y cebadores que pueden usarse para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de células y organismos. Tales sondas o cebadores comprenden habitualmente una región de secuencia de nucleótidos que en condiciones "rigurosas" (véase más abajo) hibrida al menos aproximadamente 12, preferentemente al menos aproximadamente 25, tal como, por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de una secuencia de ácido nucleico o de una cadena antisentido correspondiente.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y, además, puede estar esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o estar libre de precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico puede aislarse por medio de técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia proporcionada. Por ejemplo, puede aislarse ADNc de un banco de ADNc adecuado, usándose una de las secuencias completas descritas específicamente o una sección de la misma como sonda de hibridación y técnicas de hibridación convencionales (tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, EF y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico, que comprende una de las secuencias desveladas o una sección de la misma, puede aislarse mediante reacción en cadena de la polimerasa, usándose los cebadores de oligonucleótidos que se crearon basándose en esta secuencia. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse mediante análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos se pueden preparar también mediante procedimientos de síntesis estándar, por ejemplo, con un sintetizador automático de a Dn .

Secuencias de ácido nucleico o derivados de las mismas, homólogos o partes de estas secuencias, se puede aislar, por ejemplo, con procedimientos de hibridación habituales o la técnica de PCR a partir de otras bacterias, por ejemplo, a través de bancos genómicos o de ADNc. Estas secuencias de ADN se hibridan con las secuencias en condiciones estándar.

Por "hibridar" significa la capacidad de un poli u oligonucleótido para unirse a una secuencia casi complementaria en condiciones estándar, mientras que en estas condiciones no se producen uniones inespecíficas entre componentes no complementarios. Para ello, las secuencias pueden ser complementarias en un 90-100 %. La propiedad de las secuencias complementarias de poder unirse específicamente entre sí, se utiliza, por ejemplo, en la técnica de transferencia de tipo Northern o Southern o en la unión de cebadores en PCR o RT-PCr .

Para la hibridación se usan ventajosamente oligonucleótidos cortos de las zonas conservadas. En cambio, también pueden usarse para la hibridación fragmentos más largos de los ácidos nucleicos o las secuencias completas. En función del ácido nucleico (oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa) usado o en función de qué tipo de ácido nucleico ADN o ARN que se usa para la hibridación, varían estas condiciones estándar. De este modo, por ejemplo las temperaturas de fusión para ADN:híbridos de ADN es aproximadamente 10 °C menor que la de ADN:híbridos de ARN de igual longitud.

En condiciones estándar, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico, se entienden temperaturas entre 42 y 58 °C en una solución tampón acuosa con una concentración entre 0,1 y 5 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de formamida al 50 %, tal como, por ejemplo, 42 °C en 5 x SSC, formamida al 50 %. Ventajosamente, las condiciones de hibridación para ADN:híbridos de ADN son 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20 °C y 45 °C, preferentemente entre aproximadamente 30 °C y 45 °C. Para ADN:híbridos de ARN, las condiciones de hibridación son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 °C y 55 °C, preferentemente entre aproximadamente 45 °C y 55 °C. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son valores de temperatura de fusión calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido en G C del 50 % en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN se describen en los libros de texto pertinentes sobre Genética, tal como, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse según fórmulas conocidas por el experto en la materia, por ejemplo en función de la longitud de los ácidos nucleicos, el tipo de híbridos o el contenido de G C. El experto puede extraer informaciones adicionales para la hibridación de los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

La "hibridación" puede tener lugar en particular en condiciones rigurosas. Tales condiciones de hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Por condiciones de hibridación "rigurosas" se entiende en particular: la incubación a 42 °C durante la noche en una solución que se compone del 50 % de formamida, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 g/ml ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado, seguido de una etapa de lavado de los filtros con 0,1x SSC a 65 °C.

Se desvelan también derivados de las secuencias de ácido nucleico desveladas o derivables concretamente.

Otras secuencias de ácido nucleico que codifican mutantes de ciclasa, por ejemplo de SEQ ID NO: 1 o de las secuencias codificantes a SEQ ID NO: 2 a 326, en particular SEQ ID NO: 2 a 6, se pueden derivar de una mutación análoga F486 o F486 y se diferencian de la misma por adición, sustitución, inserción o deleción de nucleótidos individuales o varios nucleótidos, pero codifican además polipéptidos con el perfil de propiedades deseado.

Están comprendidas también aquellas secuencias de ácido nucleico que comprenden las denominadas mutaciones silenciosas o, correspondientemente al uso de codón de un organismo de origen u organismo hospedador especial, están modificadas con respecto a una secuencia mencionada en concreto, al igual que variantes naturales, tales como, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas, de las mismas.

Se desvelan asimismo secuencias que pueden obtenerse mediante sustituciones de nucleótidos conservadoras (es decir, el aminoácido en cuestión se sustituye por un aminoácido de la misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

Se desvelan también las moléculas derivadas de los ácidos nucleicos desvelados concretamente mediante polimorfismos de secuencia. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural. Estas variaciones naturales provocan habitualmente una varianza del 1 al 5 % en la secuencia de nucleótidos de un gen.

Por derivados de las secuencias de ácido nucleico que codifican ciclasas derivadas de la secuencia SEQ ID NO: 1 o de una de las secuencias codificantes para SEQ ID NO: 2 a 326, en particular SEQ ID NO: 2 a 6, se entienden, por ejemplo, variantes alélicas que presentan al menos el 60 % de homología a nivel de aminoácidos derivados, preferentemente al menos el 80 % de homología, de manera muy especialmente preferente al menos el 90 % de homología a lo largo de toda la región de secuencia (con respecto a la homología a nivel de aminoácidos, se remite a las declaraciones anteriores sobre los polipéptidos). A lo largo de zonas parciales de las secuencias, las homologías pueden ser ventajosamente más altas.

Además, por derivados también se entienden homólogos de las secuencias de ácido nucleico, por ejemplo homólogos de hongos o bacterias, secuencias acortadas, ADN monocatenario o ARN de la secuencia de ADN codificante y no codificante.

Además, por derivados se entienden, por ejemplo, fusiones con promotores. Los promotores que preceden a las secuencias de nucleótidos indicadas, pueden estar modificados por al menos un intercambio de nucleótidos, al menos una inserción, inversión y/o deleción, sin que en cambio se deteriore la funcionalidad o eficacia de los promotores. Además, puede aumentarse la eficacia de los promotores mediante modificación de su secuencia, o se pueden reemplazar completamente por promotores más eficaces de organismos de diferentes especies.

3.2 Generación de mutantes funcionales

El experto en la materia conoce también procedimientos para generar mutantes funcionales de las enzimas.

En función de la técnica usada, el experto en la materia puede introducir mutaciones completamente aleatorias o también más dirigidas en genes o regiones de ácido nucleico no codificantes (que son importantes por ejemplo para la regulación de la expresión) y a continuación crear bancos de genes. Los procedimientos de biología molecular necesarios para ello son conocidos por el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, Molecular Cloning. 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Los expertos en la técnica conocen desde hace mucho tiempo procedimientos para la modificación de genes y, por lo tanto, para la modificación de las proteínas codificadas por los mismos, tal como, por ejemplo,

- mutagénesis específica de sitio, en la que se intercambian de manera dirigida nucleótidos individuales o varios nucleótidos de un gen (Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), - mutagénesis de saturación, en la que en cualquier sitio de un gen se puede intercambiar o agregar un codón para aminoácido cualquiera (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcárel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1), - la reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (PCR propensa a errores), en la que las secuencias de nucleótidos se mutan por a Dn polimerasas que funcionan incorrectamente (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- el procedimiento SeSaM (Sequence Saturation Method), en el que se evitan intercambios preferidos por la polimerasa. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279

- el paso de genes en cepas mutantes, en las que, por ejemplo, debido a mecanismos de reparación del ADN defectuosos, se produce una tasa de mutación elevada de secuencias de nucleótidos (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. En: Trower MK (ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), o

- barajado de ADN, en el que se forma y digiere un conjunto de genes estrechamente relacionados y los fragmentos se usan como moldes para una reacción en cadena de la polimerasa, en la que, a través de la separación y aproximación de cadenas repetidas, se generan finalmente genes mosaico de longitud completa (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747).

Con el uso de la denominada evolución dirigida ("directed evolution"; descrita, entre otros en Reetz MT y Jaeger KE (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, En: Demain AL, Davies JE (ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology), el experto en la materia también puede generar mutantes funcionales de forma dirigida y también a gran escala. A este respecto, en una primera etapa se generan en primer lugar bancos de genes de las proteínas respectivas, pudiendo emplearse por ejemplo los procedimientos indicados anteriormente. Los bancos de genes se expresan de manera adecuada, por ejemplo, por bacterias o por sistemas de presentación de fagos.

Los genes en cuestión de organismos hospedadores, que expresan mutantes funcionales con propiedades que corresponden en gran medida a las propiedades deseadas, pueden estar sujetos a otra ronda de mutación. Las etapas de mutación y selección o cribado pueden repetirse iterativamente hasta que los mutantes funcionales presentes presenten las propiedades deseadas en una medida suficiente. Mediante este modo de trabajo iterativo puede efectuarse un número limitado de mutaciones, tal como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones, y evaluarse y seleccionarse su influencia sobre la propiedad enzimática en cuestión. El mutante seleccionado puede entonces someterse a una etapa de mutación adicional de la misma manera. Esto permite que se reduzca significativamente el número de mutantes individuales que van a examinarse.

Los resultados también proporcionan información importante con respecto a la estructura y secuencia de las enzimas en cuestión, que son necesarias para generar de manera dirigida enzimas adicionales con propiedades modificadas deseadas. En particular, se pueden definir los denominados "hot spots", es decir, secciones de secuencia que son potencialmente adecuadas para modificar una propiedad enzimática mediante la introducción de mutaciones dirigidas.

Igualmente se puede obtener información con respecto a las posiciones de secuencia de aminoácidos, en cuya zona se pueden llevar a cabo mutaciones que probablemente tendrán poco impacto en la actividad enzimática, y pueden denominarse como posibles "mutaciones silenciosas".

3.3 Constructos

Se desvelan además constructos de expresión, en particular recombinantes, que contienen, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido; así como, vectores, en particular recombinantes, que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión.

Por una "unidad de expresión" se entiende un ácido nucleico con actividad de expresión, que comprende un promotor tal como se define en el presente documento, y después de un enlace funcional con un ácido nucleico que va a expresarse o un gen, regula la expresión, es decir, la transcripción y la traducción de este ácido nucleico o de este gen. Por lo tanto, también se habla en este contexto de una "secuencia de ácido nucleico reguladora". Además del promotor, pueden estar contenidos otros elementos reguladores, tales como, por ejemplo, potenciadores.

Por un "casete de expresión" o "constructo de expresión" se entiende una unidad de expresión que está funcionalmente enlazada con el ácido nucleico que se va a expresar o al gen que se va a expresar. A diferencia de una unidad de expresión, un casete de expresión no solo comprende por lo tanto secuencias de ácido nucleico que regulan la transcripción y la traducción, sino también las secuencias de ácido nucleico que se expresarán como proteína como consecuencia de la transcripción y traducción.

En el contexto de la invención, los términos "expresión" o "sobreexpresión" describen la producción o el aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que se codifican por el ADN correspondiente. Para ello puede introducirse, por ejemplo, un gen en un organismo, reemplazarse un gen existente por otro gen, aumentarse el número de copias del gen o de los genes, usarse un promotor fuerte o usarse un gen que codifica una enzima correspondiente con una alta actividad y combinarse dado el caso estas medidas.

Preferentemente, tales constructos, en el sentido 5' de la secuencia codificante respectiva comprenden un promotor y en el sentido 3' una secuencia de terminación así como, dado el caso, otros elementos reguladores habituales, en concreto, en cada caso operativamente enlazados con la secuencia codificante.

Por un "promotor", un "ácido nucleico con actividad promotora" o una "secuencia promotora" se entiende un ácido nucleico que, en enlace funcional con un ácido nucleico que va a transcribirse, regula la transcripción de este ácido nucleico.

En este contexto, por enlace "funcional" u "operativo" se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de uno de los ácidos nucleicos con actividad promotora y una secuencia de ácido nucleico que va a transcribirse y dado el caso otros elementos reguladores, tales como, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, que garantizan la transcripción de ácidos nucleicos, así como por ejemplo un terminador, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función en la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Para ello no es realmente necesario un enlace directo en el sentido químico. Secuencias de control genético, tales como, por ejemplo, secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función sobre la secuencia diana desde posiciones más alejadas o incluso de otras moléculas de a Dn . Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir se sitúa por detrás (es decir, en el extremo 3') de la secuencia promotora, de modo que ambas secuencias estén unidas covalentemente entre sí. A este respecto, la distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar transgénicamente puede ser inferior a 200 pares de bases, o inferior a 100 pares de bases o inferior a 50 pares de bases.

Además de los promotores y terminador, como ejemplos de otros elementos reguladores se mencionan secuencias de selección como diana, potenciador, señales de poliadenilación, marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de la replicación y similares. Secuencias reguladoras adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, c A (1990).

Las constructos de ácido nucleico desvelados comprenden en particular una secuencia que codifica una ciclasa, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o que codifica una ciclasa de acuerdo con SEQ ID NO: 2 a 326 o derivados y homólogos de la misma, así como las secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse de las mismas, que se enlazaron operativa o funcionalmente con una o varias señales de regulación ventajosamente para el control, por ejemplo, el aumento, de la expresión génica.

Además de estas secuencias de regulación, la regulación natural de estas secuencias todavía puede estar presente antes de los genes estructurales reales y dado el caso pueden haber sido modificadas genéticamente, de modo que se desactivó la regulación natural y se aumentó la expresión de los genes. El constructo de ácido nucleico también puede tener una estructura más sencilla, es decir, no se insertaron señales de regulación adicionales delante de la secuencia codificante y no se eliminó el promotor natural con su regulación. En cambio, la secuencia de regulación natural se muta de modo que ya no tiene lugar una regulación y se aumenta la expresión génica.

Un constructo de ácido nucleico preferido contiene ventajosamente también una o varias de las secuencias "potenciadoras" ya mencionadas, funcionalmente enlazadas con el promotor, que permiten una expresión elevada de la secuencia de ácido nucleico. También en el extremo 3' de las secuencias de ADN se pueden insertar secuencias ventajosas adicionales, tal como otros elementos reguladores o terminadores. Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en una o varias copias en el constructo. En el constructo pueden estar contenidos aún otros marcadores, tales como gentes que complementan resistencias a antibióticos o auxotrofias, dado el caso para la selección en el constructo.

Ejemplos de secuencias de regulación adecuadas están contenidas en promotores tales como promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAü)SP6, lambda-PR o en el promotor lambda-PL, que se emplean ventajosamente en bacterias Gram negativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores Gram positivos amy y SPO2, en los promotores de levaduras u hongos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Pueden usarse también promotores artificiales para la regulación.

Para la expresión en un organismo hospedador, el constructo de ácido nucleico se inserta ventajosamente en un vector, tal como por ejemplo en un plásmido o un fago, que permite la expresión óptima de los genes en el hospedador. Por vectores se entiende, además de plásmidos y fagos, también todos los demás vectores conocidos por el experto en la materia, es decir, por ejemplo, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo hospedador o replicarse cromosómicamente. Estos vectores representan una configuración adicional de la invención.

Plásmidos adecuados son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Agt11 o pBdCl, en Streptomyces plJ101, plJ364, pJ702 o plJ361, en Bacillus pUB110, p c l94 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAj667, en hongos pALSI, plL2 o pBB116, en levaduras 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Los expertos en la materia conocen bien otros plásmidos y pueden encontrarse, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018).

En una forma de configuración adicional del vector, el vector que contiene el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico también puede introducirse ventajosamente en los microorganismos en forma de ADN lineal e integrarse en el genoma del organismo hospedador a través de recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal puede consistir en un vector linealizado como un plásmido o solo en el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico.

Para una expresión óptima de genes heterólogos en organismos, es ventajoso modificar las secuencias de ácido nucleico correspondientemente al "uso de codones" específico usado en el organismo. El "uso de codones" se puede determinar por medio de evaluaciones informáticas de otros genes conocidos del organismo en cuestión.

La producción de un casete de expresión tiene lugar mediante fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótidos codificante adecuada así como una señal de terminación o de poliadenilación. Para ello se usan técnicas de recombinación y clonación comunes, tales como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, n Y (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

El constructo de ácido nucleico recombinante o el constructo de gen se inserta ventajosamente en un vector específico del hospedador para su expresión en un organismo hospedador adecuado, que permite la expresión óptima de los genes en el hospedador. Los vectores son bien conocidos por el experto en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, en "Cloning vectors" (Pouwels PH et al., ed., Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985).

4. Microorganismos

En función del contexto, por el término "microorganismo" se puede entender el microorganismo de tipo natural o un microorganismo recombinante genéticamente modificado o ambos.

Con la ayuda de los vectores se pueden producir microorganismos recombinantes que están transformados, por ejemplo, con al menos un vector y se pueden utilizar para la producción de los polipéptidos. Ventajosamente, los constructos recombinantes descritos anteriormente se introducen en un sistema hospedador adecuado y se expresan.

A este respecto se usan preferentemente procedimientos de clonación y transfección habituales conocidos por el experto en la materia, tal como, por ejemplo, la coprecipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y similares, para llevar los ácidos nucleicos mencionados a expresión en el sistema de expresión respectivo. Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, Nueva York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En principio, todos los organismos procariotas o eucariotas se tienen en cuenta como organismos hospedadores recombinantes para el ácido nucleico o el constructo de ácido nucleico. Ventajosamente, como organismos hospedadores se usan microorganismos tales como bacterias, hongos o levaduras. Ventajosamente se usan bacterias Gram positivas o Gram negativas, preferentemente bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, bacterias especialmente preferidas de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium o Rhodococcus. Se prefiere muy especialmente el género y la especie Escherichia coli. Otras bacterias ventajosas se encuentran además en el grupo de las alfa-proteobacterias, beta-proteobacterias o gamma-proteobacterias

El organismo hospedador o los organismos hospedadores contienen a este respecto preferentemente al menos una de las secuencias de ácido nucleico descritas, constructos de ácido nucleico o vectores, que codifican una enzima con actividad feniletanol deshidrogenasa de acuerdo con la definición anterior.

Los organismos usados en el procedimiento de acuerdo con la invención se cultivan o reproducen de una manera conocida por el experto en la materia en función del organismo hospedador. Los microorganismos se cultivan por regla general en un medio líquido, que contiene una fuente de carbono generalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno generalmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato de amonio, oligoelementos tales como sales de hierro, de manganeso, de magnesio y dado el caso vitaminas, a temperaturas entre 0 °C y 100 °C, preferentemente entre 10 °C y 60 °C con gasificación de oxígeno. A este respecto el valor de pH del líquido nutritivo se puede mantener en un valor fijo, es decir, regularse o no durante el cultivo. El cultivo puede tener lugar de manera "discontinua", "semicontinua" o de manera continua. Los nutrientes pueden disponerse al comienzo de la fermentación o alimentarse posteriormente de manera semicontinua o continua.

5. Producción recombinante de enzimas

Se desvelan además procedimientos para la producción recombinante de polipéptidos o de fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos, en los que se cultiva un microorganismo productor de polipéptidos, dado el caso, se induce la expresión de los polipéptidos y los aísla del cultivo. Los polipéptidos también se pueden producir a escala industrial, si así se desea.

Los microorganismos producidos pueden cultivarse de manera continua o discontinua en el procedimiento discontinuo (cultivo por lotes) o en el lote de alimentación (procedimiento de alimentación) o en el procedimiento discontinuo de alimentación repetida (procedimiento de alimentación repetitiva). Se puede encontrar un resumen de los procedimientos de cultivo conocidos en el libro de texto de Chmiel (BioprozelJtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que va a usarse tiene que satisfacer de manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de distintos microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington DC, EE. UU., 1981).

Estos medios utilizables comprenden habitualmente una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/u oligoelementos.

Fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di- o polisacáridos. Fuentes de carbono muy buenas son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. También pueden añadirse a los medios azúcares a través de compuestos complejos, tal como melaza, u otros productos secundarios de la refinación de azúcares. También puede ser ventajoso agregar mezclas de distintas fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol o etanol y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido láctico.

Las fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que contienen estos compuestos. Fuentes de nitrógeno a modo de ejemplo comprenden gas amoniaco o sales de amonio, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas, tales como agua del remojo del maíz, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como mezcla.

Compuestos de sal inorgánicos, que pueden estar contenidos en los medios, comprenden las sales de cloruro, de fósforo o de sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro.

Como fuente de azufre se pueden usar compuestos inorgánicos que contienen azufre tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros pero también compuestos de azufre orgánicos, tales como mercaptanos y tioles.

Como fuente de fósforo se pueden usar ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes.

Se pueden añadir agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en disolución. Agentes quelantes especialmente adecuados comprenden dihidroxifenoles, tales como catecol o protocatecuato, o ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico.

Los medios de fermentación empleados contienen habitualmente también otros factores de crecimiento, tales como vitaminas o promotores del crecimiento, a los que pertenecen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales proceden con frecuencia de componentes de medios complejos, tales como extracto de levadura, melaza, agua del remojo del maíz y similares. Además, al medio de cultivo se pueden añadir precursores adecuados. La composición exacta de los compuestos de los medios depende en gran medida del experimento respectivo y se decide individualmente para cada caso específico. La información sobre la optimización de medios se encuentra disponible en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) págs. 53-73, iSBn 0 19 963577 3). Los medios de crecimiento también se pueden obtener de proveedores comerciales, tales como el Estándar 1 (Merck) o BHI (infusión cerebro-corazón, DIFCO) y similares.

Todos los componentes de medio se esterilizan, o bien mediante calor (20 min a 1,5 bar y 121 °C) o bien mediante filtración estéril. Los componentes se pueden esterilizar o bien juntos o bien, si es necesario, por separado. Todos los componentes de medio pueden estar presentes al comienzo del cultivo u opcionalmente se pueden agregar de manera continua o por lotes.

La temperatura del cultivo se encuentra normalmente entre 15 °C y 45 °C, preferentemente de 25 °C a 40 °C y puede mantenerse constante o variarse durante el experimento. El valor de pH del medio se encontrará en el intervalo de 5 a 8,5, preferentemente alrededor de 7,0. El valor de pH para el cultivo se puede controlar durante el cultivo añadiendo compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control de la formación de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes, tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácido graso. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, pueden agregarse al medio sustancias de acción selectiva adecuadas, tales como, por ejemplo, antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como, por ejemplo, aire ambiente. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 20 °C a 45 °C. El cultivo continúa hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Este fin se consigue normalmente en el plazo de 10 a 160 horas.

El caldo de fermentación se procesa adicionalmente a continuación. En función del requisito, la biomasa puede retirarse del caldo de fermentación total o parcialmente mediante procedimientos de separación, tales como, por ejemplo centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos o dejarse en el mismo.

Las células también pueden digerirse en caso de que los polipéptidos no se secretan al medio de cultivo, y el producto puede obtenerse a partir del lisado según procedimientos de aislamiento de proteínas conocidos. Las células se pueden digerir opcionalmente mediante ultrasonido de alta frecuencia, mediante alta presión, tal como, por ejemplo, en una celda de presión francesa, mediante osmólisis, mediante acción de detergentes, enzimas líticas o disolventes orgánicos, mediante homogeneizadores o mediante combinación de varios de los procedimientos expuestos.

Una purificación de los polipéptidos puede conseguirse con procedimientos cromatográficos conocidos, tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), tales como cromatografía de Q-Sepharose, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, así como con otros procedimientos habituales tales como ultrafiltración, cristalización, precipitación con sales, diálisis y electroforesis en gel nativo. Procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Editorial Walter de Gruyter, Berlín, Nueva York o en Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, Nueva York, Heidelberg, Berlín.

Puede ser ventajoso, para aislar la proteína recombinante, usar sistemas de vector u oligonucleótidos que extienden el ADNc determinadas secuencias de nucleótidos y, con ello, codifican polipéptidos modificados o proteínas de fusión que, por ejemplo, sirven para simplificar la purificación. Modificaciones adecuadas de este tipo son, por ejemplo, las denominadas "etiquetas" que actúan como anclas, tales como, por ejemplo, la modificación o conocida como ancla de hexa-histidina o epítopos que pueden ser reconocidos como antígenos por anticuerpos (descritos por ejemplo en Harlow, E. y Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Estas anclas pueden servir para fijar las proteínas a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una matriz de polímero, que se puede cargar, por ejemplo, en una columna de cromatografía, o se puede usar en una placa de microtitulación o en otro soporte.

Al mismo tiempo, estas anclas se pueden usar también para reconocer las proteínas. Para el reconocimiento de las proteínas pueden usarse además marcadores habituales, tales como colorantes fluorescentes, marcadores de enzimas, que forman un producto de reacción detectable después de la reacción con un sustrato, o marcadores radiactivos, solos o en combinación con las anclas para derivatizar las proteínas.

Para la expresión de los mutantes, se puede recurrir a la descripción de la expresión de la enzima de tipo natural EbN1 y los sistemas de expresión que se pueden usar para ello en los documentos WO2005/108590 y WO2006/094945.

6. Inmovilización de enzimas

Las enzimas se pueden emplear libres o inmovilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento. Por una enzima inmovilizada se entiende una enzima que está fijada a un soporte inerte. Materiales de soporte adecuados así como las enzimas inmovilizadas en los mismos se conocen por los documentos EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y DE-OS 100193773 así como por las referencias bibliográficas citadas en los mismos. A los materiales de soporte adecuados pertenecen por ejemplo arcillas, minerales de arcilla, tales como caolinita, tierras de diatomeas, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, polvos de celulosa, materiales de intercambio aniónico, polímeros sintéticos, tales como poliestireno, resinas acrílicas, resinas de fenol-formaldehído, poliuretanos y poliolefinas, tales como polietileno y polipropileno. Los materiales de soporte se emplean para la producción de las enzimas soportadas en una forma particulada, finamente dividida, prefiriéndose formas porosas. El tamaño de partícula del material de soporte asciende habitualmente a no más de 5 mm, en particular no más de 2 mm (curva granulométrica). De manera análoga, en el caso del uso de la deshidrogenasa como catalizador de célula completa, puede seleccionarse una forma libre o inmovilizada. Materiales de soporte son por ejemplo alginato de Ca, y carragenano. Enzimas como también células pueden reticularse también directamente con glutaraldehído (reticulación para dar CLEA). Procedimientos de inmovilización correspondientes y adicionales se describen, por ejemplo, en J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. Información adicional sobre biotransformaciones y biorreactores para llevar a cabo procedimientos de acuerdo con la invención se encuentra, por ejemplo, en Rehm et al (Ed) Biotechology, 2a ed., vol. 3, capítulo 17, VCH, Weinheim.

7. Ciclación enzimática de ácidos carboxílicos poliinsaturados

7.1 Parte general

En particular, el procedimiento de ciclación de acuerdo con la invención se lleva a cabo en presencia de una enzima, codificándose la enzima por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de la misma, siendo la secuencia de ácido nucleico parte componente de un constructo de gen o vector. Los constructos de gen o vectores se describen en detalle en la solicitud internacional WO 2010/139719 en las páginas 16 a 20.

La célula hospedadora, que contiene un constructo de gen o un vector, en el que está contenida la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima con la actividad deseada, se denomina también organismo transgénico. La producción de tales organismos transgénicos se conoce en principio y se analiza, por ejemplo, en la página 20 de la solicitud internacional PCT/EP2010/057696.

Como organismos transgénicos se seleccionan, por ejemplo, células del grupo que compuesto por bacterias, cianobacterias, hongos y levaduras. Por ejemplo, la célula se selecciona de hongos del género Pichia o bacterias de los géneros Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus o Lactococcus. Por ejemplo, la célula se selecciona de bacterias de las especies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor o Zymomonas mobilis.

Preferentemente, un procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque la enzima con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa se codifica por un gen que ha sido aislado a partir de un microorganismo seleccionado entre Zymomonas mobilis, Methylococcus capsulatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec, Streptomyces coelicolor así como Acetobacter pasteurianus. Debe hacerse una mención particular de los genes en cuestión aislados de Zymomonas mobilis, Streptomyces coelicolor, Bradyrhizobium japonicum y Acetobacter pasteurianus.

Configuraciones adicionales para llevar a cabo el procedimiento de ciclación biocatalítica de acuerdo con la invención.

El procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque la enzima se encuentra en al menos una de las siguientes formas:

a) polipéptido libre, dado el caso purificado o parcialmente purificado;

b) polipéptido inmovilizado;

c) polipéptido aislado a partir de células de acuerdo con a) o b);

d) célula completa, dado el caso células en reposo o en crecimiento, que contienen al menos un polipéptido de este tipo;

e) lisado u homogeneizado de las células de acuerdo con d).

Otra forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque las células microorganismos transgénicos que expresan al menos una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido con actividad ciclasa.

En el procedimiento de acuerdo con la invención, el sustrato se pone en contacto con la enzima que tiene la actividad de una ciclasa, en un medio y/o se incuba de modo que tiene lugar una conversión del sustrato, tal como, por ejemplo, de ácido homofarnesílico, en esclareolida en presencia de la enzima. Preferentemente, en el caso del medio se trata de un medio de reacción acuoso.

El valor de pH del medio de reacción acuoso, en el que se lleva a cabo preferentemente el procedimiento de acuerdo con la invención, se mantiene a este respecto ventajosamente entre pH 4 y 12, preferentemente entre 4,5 y 9, de manera especialmente preferente entre pH 5 y 8.

En el caso de los medios de reacción acuosos se trata preferentemente de soluciones tamponadas, que por regla general presentan un valor de pH de preferentemente de 5 a 8. Como tampón puede usarse un tampón de citrato, fosfato, TRIS (tris(hidroximetil)-aminometano) o MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). Asimismo el medio de reacción puede contener también aditivos adicionales, tales como por ejemplo detergentes (por ejemplo taurodesoxicolato).

El sustrato, tal como, por ejemplo, ácido homofarnesílico, se emplea preferentemente en una concentración de 2 - 200 mM, de manera especialmente preferente de 5 - 25 mM en la reacción enzimática y puede seguirse de manera continua o discontinua.

La ciclación enzimática tiene lugar por regla general a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la enzima empleada y por encima de -10 °C. Preferentemente, el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo a una temperatura entre 0 °C y 95 °C, de manera especialmente preferente a una temperatura entre 15 °C y 60 °C, en particular entre 20 y 40 °C, por ejemplo a aproximadamente 25 a 30 °C.

Se prefiere especialmente un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que la reacción de ácido homofarnesílico para dar esclareolida tiene lugar a una temperatura en el intervalo de 20 a 40 °C y/o un valor de pH en el intervalo de 4 a 8.

Junto a estos sistemas acuosos de una sola fase, en otra variante de la invención se emplean también sistemas de dos fases. A este respecto, además de una fase acuosa como segunda fase, se usan medios de reacción orgánicos, no miscibles con agua. De esta manera los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, el producto en la fase orgánica puede separarse fácilmente de la fase acuosa que contiene el biocatalizador.

Preferentemente, un procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque la reacción de ácido homofarnesílico tiene lugar en sistemas acuosos de una sola fase o en sistemas de dos fases, o la reacción de sales de ácido homofarnesílico tiene lugar en sistemas acuosos/sólidos de dos fases.

El producto de reacción puede extraerse con disolventes orgánicos y, dado el caso, destilarse para su purificación.

Disolventes orgánicos adecuados son por ejemplo hidrocarburos alifáticos, preferentemente con 5 a 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o dos átomos de carbono, tales como diclorometano, cloroformo, tetraclorocarbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres alifáticos acíclicos y cíclicos o alcoholes, preferentemente con 4 a 8 átomos de carbono, tales como etanol, isopropanol, dietil éter, metil-ferc-butil éter, etil-ferc-butil éter, dipropil éter, diisopropil éter, dibutil éter, tetrahidrofurano o ésteres tales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metilisobutil cetona o dioxano o mezclas de los mismos. De manera especialmente preferente se usan los mencionados anteriormente heptano, metil-ferc-butil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, acetato de etilo.

Las ciclasas empleadas de acuerdo con la invención pueden usarse en el procedimiento de acuerdo con la invención como enzima libre o inmovilizada, tal como ya se describió anteriormente.

Para el procedimiento de acuerdo con la invención, pueden usarse células en reposo o en crecimiento, libres o inmovilizadas, que contienen ácidos nucleicos que codifican la ciclasa, constructos de ácido nucleico o vectores. También pueden usarse células digeridas, tales como lisados celulares u homogeneizados celulares. Por células disgregadas se entienden por ejemplo células que se han hecho permeables a través de un tratamiento por ejemplo con disolventes, o células que se han roto a través de un tratamiento enzimático, a través de un tratamiento mecánico (por ejemplo prensa francesa o ultrasonidos) o a través de otro procedimiento. Los extractos brutos así obtenidos son adecuados de manera ventajosa para el procedimiento de acuerdo con la invención. También pueden usarse para el procedimiento enzimas purificadas o parcialmente purificadas.

Si se usan organismos libres o enzimas para el procedimiento de acuerdo con la invención, entonces estos se separan convenientemente antes de la extracción, por ejemplo, a través de una filtración o centrifugación.

El procedimiento de acuerdo con la invención se puede hacer funcionar de manera discontinua, semicontinua o continua.

7.2 Reacción preferida de ácido homofarnesílico para dar esclareolida

La invención se refiere en particular a un procedimiento para la preparación de esclareolida, en el que

a) se pone en contacto ácido homofarnesílico con la homofarnesol-ambroxán ciclasa y/o se incuba, y b) se aísla esclareolida.

En una realización de la invención, se pone en contacto ácido homofarnesílico con la ciclasa en un medio y/o se incuba de modo que tiene lugar una reacción de ácido homofarnesílico para dar esclareolida en presencia de la ciclasa. Preferentemente, en el caso del medio se trata de un medio de reacción acuoso. En el caso de los medios de reacción acuosos se trata preferentemente de soluciones tamponadas, que por regla general presentan un valor de pH de preferentemente de 5 a 8. Como tampón puede usarse un tampón de citrato, fosfato, TRIS (tris(hidroximetilaminometano), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). Asimismo el medio de reacción puede contener también aditivos adicionales, tales como por ejemplo detergentes (por ejemplo taurodesoxicolato).

El sustrato se emplea preferentemente en una concentración de 5 -100 mM, de manera especialmente preferente de 15 - 25 mM en la reacción enzimática y puede seguirse de manera continua o discontinua.

La ciclación enzimática tiene lugar por regla general a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la ciclasa empleada y por encima de -10 °C. De manera especialmente preferente se encuentra en el intervalo de 0 a 100 °C, en particular de 15 a 60 °C y en especial de 20 a 40 °C, por ejemplo a aproximadamente 30 °C.

El producto de reacción esclareolida se puede extraer con disolventes orgánicos, seleccionados del grupo de los mencionados a continuación y, dado el caso, se destilan para su purificación.

Junto a estos sistemas acuosos de una sola fase, en otra variante de la invención se emplean también sistemas de dos fases. A este respecto se usan líquidos iónicos como segunda fase, pero preferentemente medios de reacción orgánicos inmiscibles con agua como segunda fase. De esta manera los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, ambroxán en la fase orgánica puede separarse fácilmente de la fase acuosa que contiene el biocatalizador.

Por medios de reacción no acuosos se entienden medios de reacción que contienen menos del 1 % en peso, preferentemente menos del 0,5 % en peso de agua, con respecto al peso total del medio de reacción líquido. En particular, la reacción puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico.

Disolventes orgánicos adecuados son por ejemplo hidrocarburos alifáticos, preferentemente con 5 a 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o dos átomos de carbono, tales como diclorometano, cloroformo, tetraclorocarbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres alifáticos acíclicos y cíclicos o alcoholes, preferentemente con 4 a 8 átomos de carbono, tales como etanol, isopropanol, dietil éter, metil-ferc-butil éter, etil-ferc-butil éter, dipropil éter, diisopropil éter, dibutil éter, tetrahidrofurano o ésteres tales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metilisobutil cetona o dioxano o mezclas de los mismos. De manera especialmente preferente se usan los mencionados anteriormente heptano, metil-ferc-butil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, acetato de etilo.

La conversión de ácido homofarnesílico en esclareolida puede tener lugar no solo en sistemas acuosos de una sola fase sino también en sistemas de dos fases. En el caso de los sistemas de dos fases se emplean los mencionados anteriormente. Preferentemente se usan los disolventes orgánicos, no miscibles con agua mencionados anteriormente, como segunda fase. De esta manera los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, ambroxán en la fase orgánica puede separarse fácilmente de la fase acuosa que contiene el biocatalizador.

Se desvela además un procedimiento para la producción biocatalítica de esclareolida, caracterizado por que la enzima es un polipéptido, que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la en SEQ ID NO 2;

b) molécula de ácido nucleico que comprende al menos un polinucleótido de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1;

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia presenta una identidad de al menos el 45 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2;

d) molécula de ácido nucleico según (a) a (c), que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente o un fragmento de la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 2;

e) molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, que se obtiene amplificándose una molécula de ácido nucleico de un banco de ADNc o de un ADN genómico por medio de los cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 327 y 328, o sintetizándose químicamente la molécula de ácido nucleico mediante síntesis de novo;

f) molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, que en condiciones rigurosas hibrida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c);

g) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, que puede aislarse a partir de un banco de ADN con el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c) o sus fragmentos parciales de al menos 15 nt, preferentemente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt como sonda en condiciones de hibridación rigurosas; y

h) molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, presentando la secuencia del polipéptido una identidad de al menos el 30 % con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2;

i) molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, seleccionándose el polipéptido mediante una molécula de ácido nucleico del grupo de a) a h)

j) molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una ácido homofarnesílico ciclasa, presentando el polipéptido un sitio de unión análogo o similar, tal como un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de los descritos en a) a h).

Un sitio de unión análogo o similar en el sentido de la invención es un motivo o dominio conservado de la secuencia de aminoácidos con una homología del 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o 100 %, que garantiza la unión del mismo sustrato, en particular ácido homofarnesílico.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico c) presenta una identidad con la SEQ ID NO: 1 de 15 al menos el 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

Igualmente, un polipéptido funcionalmente equivalente presenta identidad con la SEQ ID NO: 2 de al menos el 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. En lugar del término "identidad" puede usarse con el mismo significado también el término "homólogo" u "homología".

La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos.

Parte experimental

A menos que se proporcionen datos especiales en los siguientes ejemplos, se aplican los siguientes datos generales.

A. Datos generales

Todos los materiales y microorganismos utilizados son productos comercialmente disponibles.

A menos que se indique lo contrario, la clonación y expresión de proteínas recombinantes tiene lugar según métodos convencionales, tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, EF y Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

B. Ejemplos

Ejemplo 1 Clonación de Zm-SHC y expresión en E. coli

Con los oligonucleótidos Zm-SHC_fW y Zm-SHC_rev puede amplificarse el gen de la ciclasa a partir de Zymomonas mobilis.

Se mezclaron de manera equimolar respectivamente 100 ng de los cebadores Zm-SHC_fW y Zm-SHC_rev. La PCR con ADN genómico de Z. mobilis (ATCC31821) se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante con Pwo-Polymerase (Roche Applied Science) y el siguiente programa de gradiente de temperatura: 95 °C durante 3 min; 30 ciclos con 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s, y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 10 min.; 4 °C hasta su uso. El producto de PCR (~2,2 kB) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa (1,2 % de E-gel, Invitrogen) y cromatografía en columna (kit de GFX, Amersham Pharmacia) y a continuación se secuenció (cebador de secuenciación: Zm-SHC_fW y Zm-SHC_rev). La secuencia obtenida corresponde a la secuencia publicada.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la producción de 3a,6,6,9a-tetrametil-dodecahidronafto[2,1-b]furano (ambróxido), en el que

a) ácido homofarnesílico de fórmula Ia

se convierte en esclareolida de fórmula IIa,

en el que el ácido homofarnesílico de fórmula Ia se pone en contacto con una escualeno-hopeno ciclasa (SHC), que es capaz de ciclar un ácido carboxílico poliinsaturado, en particular ácido homofarnesílico; en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli LU 15568 transgénica que sobreexpresa SHC;

b) esclareolida de la fórmula IIa del paso a) se reduce químicamente a ambroxidol y

c) ambroxidol del paso b) se cicla químicamente dando ambróxido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que ácido homofarnesílico se emplea en forma esencialmente estereoisoméricamente pura como reactante, en donde se define esencialmente un intervalo de valores del 80 al 100 % inclusive.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la esclareolida se obtiene en forma estereoisoméricamente pura o como mezcla de estereoisómeros.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la SHC se selecciona de entre

a) proteínas que comprenden un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 b) por deleción, inserción, sustitución, adición, inversión o una combinación de proteínas de derivadas de proteínas de acuerdo con a), que comprenden un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos el 45 % con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; y

c) proteínas funcionalmente equivalentes a a) o b) que catalizan la ciclación de ácido homofarnesílico en esclareolida y se seleccionan de las SEQ ID NO: 3-326.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la conversión biocatalítica

a) se lleva a cabo a un valor de pH del medio de reacción en el intervalo de aproximadamente 4 a 5,8, en particular de 4,5 a 5,5; y en al menos una de las siguientes condiciones adicionales:

b) a una concentración de sustrato de al menos 15 mM, en particular de 15 a 30 mM;

c) a una concentración de enzima de al menos 5 mg/ml;

d) a una temperatura de reacción en el intervalo de 32 a 40 °C, en particular de 35 a 38 °C;

e) en un tampón de citrato de sodio que contiene de 1 a 20 mM de MgCh; y/o

f) a una concentración de tampón de aproximadamente 10 a 100 mM.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la SHC se encuentra en una forma seleccionada de:

a) una ciclasa libre, producida de manera recombinante, dado el caso parcial o totalmente purificada, b) ciclasa de acuerdo con a) en forma inmovilizada;

c) células completas, que contienen al menos una ciclasa;

d) lisados celulares u homogeneizados celulares de células de acuerdo con c).

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción tiene lugar en sistemas acuosos monofásicos o en sistemas acuosos-orgánicos o sólidos-líquidos de dos fases.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, teniendo lugar la reacción a una temperatura de aproximadamente 37 °C y un valor de pH en el intervalo de 5 a 5,2.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la SHC se codifica por un gen que se aísla de un microorganismo seleccionado de entre Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec., Streptomyces coelicolor y en particular Zymomonas mobilis.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la SHC se produce a partir de la cepa de E. coli LU 15568 transgénica que sobreexpresa SHC, producida mediante transformación de la cepa de E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 con el plásmido pDHE-Zm-SHC-1.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que ambróxido es (-)-ambróxido ((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-tetrametil-dodecahidronafto[2,1-b]furano [CAS 6790-58-5]).