ES2336977T3 - Secuencia de acido nucleico para una malato permeasa de s.pompe y sus usos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CONTIENE UNA SECUENCIA QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE MEDIA EN LA CAPTACION DE L ACIDO NUCLEICO. LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO SE UTILIZAN PARA TRANSFORMAR CELULAS PARA SU UTILIZACION EN LA MEDIACION DE LA CAPTACION DE MALATO, DE ACIDO SUCCINICO O DE MALONATO, EN PARTICULAR DE LA CAPTACION DE MALATO DURANTE LA FERMENTACION DE VINOS.

Description

Secuencia de ácido nucleico para una malato permeasa de S. pombe y sus usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento y a una secuencia de nucleótidos para la transformación de microorganismos. Más particularmente, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante, a un gen, a un polipéptido, a una cepa de levadura transformada, a un procedimiento de transformación de una cepa de levadura, a un procedimiento de producción de un polipéptido deseado, y a un procedimiento de fermentación.

Antecedentes de la invención

El transporte de ácido L-málico a través de la membrana plasmática y su degradación en microorganismos es de interés considerable en muchos campos, particularmente aquellos que implican la fermentación por levaduras. El ácido L-málico puede ser usado como única fuente de carbono y energía por las levaduras Candida sphaerica (Corte-Real y col-, 1989), Hansenula anomala (Corte-Real y Leao, 1990) y Candida utilis (Cassio y Leao, 1993). La forma disociada del malato es transportada a través de la membrana plasmática por simportes protónicos que son inducibles y están sometidos a la represión de la glucosa. No obstante, en Zygosaccharaomyces bailii (Rodríguez y Thornton, 1990) y Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) (Sousa y col., 1992), el ácido L-málico sólo se puede metabolizar en presencia de una fuente de carbono asimilable (Osothsilp y Subden, 1986). El ácido málico es transportado de manera activa en la forma disociada mientras que el ácido no disociado entra en la célula por difusión simple (Baranowski y Radler, 1984; Osothsilp y Subden, 1986; Sousa y col., 1992). La inhibición competitiva de las velocidades de captación inicial del ácido L-málico por el ácido succinico, el ácido D-málico, ácido fumárico, ácido oxaloacético, ácido \alpha-cetoglutárico, ácido maleico y ácido malónico sugiere fuertemente que estos ácidos son transportados por el mismo transportador en S. pombe (Sousa y col., 1992).

La degradación del ácido mélico es de interés particular para las bodegas. Las cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) del vino no pueden metabolizar eficazmente el malato en el mosto de la uva y los cambios en la acidez total del vino durante la vinificación son, por tanto, insignificantes (Gao, 1995). La producción de vinos equilibrados requiere la reducción controlada del ácido málico en exceso, particularmente en las regiones viticultoras del mundo más frías.

Se ha usado la desacidificación química para reducir la acidez total del vino. La desacidificación química normalmente se lleva a cabo mediante (a) mejora - que esencialmente es la dilución del ácido málico con agua azucarada; (b) precipitación - la adición de calcio, potasio u otros cationes para producir una sal insoluble; o (c) enmascaramiento - la adición de zumo de uva o sacarosa al vino finalizado para enmascarar el sabor agrio del ácido málico. Todos estos procedimientos dan como resultado malato residual que puede ayudar a la fermentación maloláctica por bacterias contaminantes, a menos que se trate con dosis elevadas de sulfitos.

Los procedimientos de fermentación maloláctica para la degradación del ácido málico dependen de la conversión del ácido L-málico en ácido L-láctico y CO_{2} por bacterias malolácticas, por ejemplo, especies de Leuconostoc, Lactobacillus, y Pediococcus. Las bacterias malolácticas pueden encontrarse sobre las uvas que se convierten en parte de la microflora del lagar, o se pueden introducir en el vino cultivos congelados o crio-desecados disponibles comercialmente de las bacterias. Los procedimientos de fermentación malolácticos presentan una serie de desventajas; por ejemplo, las bacterias malolácticas fermentan los terpenos que cambian el carácter del vino. El control de las fermentaciones malolácticas a menudo es difícil, que da como resultado una fermentación maloláctica incompleta y fermentaciones posteriores en botella. Normalmente el crecimiento bacteriano también está acompañado por la producción de dióxido de carbono que puede dar como resultado un vino "gaseoso".

También se han usado cepas de levadura que pueden degradar el ácido L-málico en fermentaciones del vino. Se han intentado fermentaciones que usan la levadura de fisión S. pombe que degrada completamente el malato en etanol mediante una fermentación malo-etanólica. Thornton (patente de EE.UU. Nº 4.830.968) describe un procedimiento que supone la inoculación de zumo de uva con una cepa de Saccharomyces malidevorans que es capaz de degradar parcialmente el ácido L-málico en condiciones de elaboración del vino. No obstante, estas cepas de levaduras (es decir, Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces malidevorans) no son deseables en la preparación del vino, puesto que se producen sabores desagradables. También se han usado suspensiones celulares de alta densidad de diversas levaduras, incluyendo S. cerevisiae, para intentar incrementar la velocidad a la que se degrada el L-malato durante la fermentación (Gao, 1995).

Se han llevado a cabo intentos para hibridar levaduras del vino con cepas de levaduras que metabolizan el malato. La fusión de protoplastos (Carrau y col., 1982; Svoboda, 1980, patente de EE.UU. Nº 5.330.774 de Carrau y col.), la transformación (Lautensach y Subden, 1984; Williams y col., 1984), y otros medios (Fernandez, 1967; Goto y col., 1978; Kuczynski y Radler, 1982) no han tenido éxito.

Se ha explorado el tratamiento por ingeniería metabólica de cepas de S. cerevisiae para llevar a cabo simultáneamente la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica o malo-etanólica. El gen maloláctico (mleS) de Lactobacillus delbrueckii (Williams y col., 1984) y Lactococcus lactis (Ansanay y col., 1993, Denayrolles y col., 1994) ha sido clonado, caracterizado y se han realizado varios intentos para introducir y expresar este gen en S. cerevisiae. No obstante, las cepas recombinantes de S. cerevisiae que expresan el gen mleS eran incapaces de degradar eficazmente el malato a L-lactato (Williams y col., 1984; Ansanay y col., 1993, Denayrolles y col., 1995).

J.C. van Slooten y col. describen en MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS 1992, 5, 179-186 una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida de un gen dctA de una especie de Rhizobium. Se considera que el gen dctA codifica un gen de la proteína transportadora dctA que está involucrada en el sistema de transporte del dicarboxilato; resultó ser un análogo u homólogo de una malato permeasa eucariota.

C. Buser-Suter y col. describen en PLANT PHYSIOL: (1982) 69, 456-459 la presencia de una ácido málico permeasa en vacuolas de plantas aisladas de Bryophyllum daigremonitianum.

MJ Sousa y col. examinan en YEAST 1992, 8, 1025-1031 el transporte de ácido málico en S. pombe y describen la evidencia de un simporte protón-dicarboxilato.

Viljoen M. y col. describen en YEAST 1994, 10, 613-624 un análisis molecular del gen de la enzima málica (mae2) de S. pombe.

Osothsilp C. y col. describen en JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1986, 168, 1439-1443 el transporte de malato en S. pombe.

Roson CW y col. describen en JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1984, 160, 903-909 la clonación molecular y la organización genética de genes transportadores dct de Rhizobium.

Ortiz y col. enseñan en EMBO JOURNAL 1992, 11, 3491-34 99 que la tolerancia a metales pesados en levaduras de fisión requiere un transportador de membrana vacuolar de tipo cassette de unión a ATP y describen la complementación de la clonación de un transportador de membrana vacuolar procedente de S. pombe.

Así, era un objeto proporcionar una molécula de ácidos nucleicos que codificase una proteína que medie en la captación de L-malato, succinato, y malonato en eucariotas.

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Resumen de la invención

Los presentes inventores han identificado un gen en S. pombe, designado gen mae1 o gen de la malato permeasa, que codifica una permeasa de un ácido dicarboxílico (denominada en el presente documento como "malato permeasa" o "Mae1"). Esta es la primera caracterización molecular de una permeasa de un ácido dicarboxílico en una célula eucariota. El gen mae1 de S. pombe codifica un único ARNm de 1,5 kb. El gen se expresa constitutivamente y no está sometido a represión catabólica como se ha informado previamente para el gen de la malato permeasa de C. utilis (Cassio y Leas, 1993) y H. anomala (Corte-Real y Leao, 1990). El gen mae1 fue mapeado a 2842 pb en 5' del gen MFm1 sobre el cromosoma I.

Los ensayos de transporte revelaron que el gen mae1 codifica una malato permeasa involucrada en el transporte de L-malato, succinato, y malonato. La malato permeasa de S. pombe tiene 435 residuos aminoácidos con un peso molecular de 49 kDa aproximadamente.

La Mae1 de S. pombe contiene una serie de regiones bien caracterizadas que incluyen dos sitios de fosforilación de la proteína quinasa C, una región PEST, una región de cremallera de leucinas, dos regiones enlazadoras hidrófílas, y diez hélices que se extienden a través de la membrana. En particular, se encontró una región PEST bien conservada (aminoácidos 421-434 en la Figura 3, SEQ ID NO: 2) en el extremo C-terminal, que consta de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S), treonina (T) y en un menor grado ácido aspártico. Un motivo de cremallera de leucinas (aminoácidos 214 a 235 en la Figura 3, SEQ ID NO: 2), que consta de cuatro residuos de leucina espaciados por 6 aminoácidos, está localizado entre los dominios seis y siete que se extienden a través de la membrana. Se encontraron sitios de fosforilación de la proteína quinasa C en la posición 28: phvplSqrlkh y en la posición 94: ikypsTikdsw. La Mae1 de S. pombe también contiene tres sitios potenciales de glicosilación unidos a N localizados en los aminoácidos 193, 277 y 336 (Figura 3, SEQ ID NO: 2).

Los presentes inventores han introducido una ruta eficiente para la degradación de malato en S. cerevisiae clonando y expresando los genes de la malato permeasa (mae1) y de la enzima málica (mae2) de S. pombe en esta levadura. Las cepas recombinantes degradaron eficazmente 8 g/l de malato en 7 días. Una cepa recombinante de S. cerevisiae que contiene tanto los genes mae1 de S. pombe como mleS de L. lactis también demostró degradar eficaz y rápidamente el L-malato a L-lactato en mosto de uva en un periodo de tiempo significativamente corto. Los presentes inventores han demostrado la eficacia de estas cepas recombinantes (mae1, mae2, y mae1mleS) para la fermentación maloetanólica, y la fermentación maloláctica, respectivamente.

Por tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato. La molécula de ácidos nucleicos puede comprender el gen de la malato permeasa (mae1) de S. pombe. En particular, la molécula de ácidos nucleicos se caracteriza por la codificación de una proteína que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato y tiene una región PEST, y un motivo de cremallera de leucinas.

En una forma de realización de la invención, la molécula de ácidos nucleicos aislada comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a (i); y

(iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i).

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Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos aislada comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos como la mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3, en la que T también puede ser U;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a {i), preferentemente complementarias a la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3;

(iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i); y

(iv) una molécula de ácidos nucleicos que difiere de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) en las secuencias de los codones debido a la degeneración del código genético.

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La invención también contempla una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica un truncamiento de Mae1, un análogo, o un homólogo de Mae1, o uno de sus truncamientos. (Mae1 y los truncamientos, análogos y homólogos de Mae1 también se denominan colectivamente en el presente documento "proteína Mae1" o "proteínas Mae1").

La invención también proporciona una molécula nucleica que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína Mae1 y una proteína o péptido heterólogo, preferentemente un marcador seleccionable, o una proteína involucrada en el metabolismo del L-malato, succinato, o malonato, tal como la enzima málica o la enzima maloláctica.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Por consiguiente, se pueden construir vectores de expresión adaptados para la transformación de una célula hospedadora que comprende una molécula de ácidos nucleicos de la invención y uno o más elementos de transcripción y traducción unidos de manera operativa a la molécula de ácidos nucleicos.

El vector de expresión se puede usar para preparar células hospedadoras transformadas que expresan una proteína Mae1. Por tanto, la invención proporciona adicionalmente células hospedadoras que contienen un vector de expresión de la invención.

De acuerdo con una forma de realización de la invención, se proporciona una cepa de levadura que incorpora un material de ADN que comprende:

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido funcional o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que proporcionarán actividad malato permeasa para una aplicación en la que la malato permeasa esté prevista para su uso,

un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la malato permeasa, y

un terminador para la terminación de la transcripción de la secuencia de nucleótidos.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para la preparación de una proteína Mae1 utilizando las moléculas de ácidos nucleicos aisladas y purificadas de la invención. En una forma de realización se proporciona un procedimiento para la preparación de una proteína Mae1 que comprende (a) la transferencia de un vector de expresión recombinante de la invención a una célula hospedadora; (b) la selección de las células hospedadoras transformadas entre células hospedadoras no transformadas; (c) el cultivo de una célula hospedadora transformada seleccionada en condiciones que permitan la expresión de la proteína Mae1; y (d) el aislamiento de la proteína Mae1.

Según una forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de producción de malato permeasa, que incluye el cultivo de una cepa de levaduras transformadas mediante material de ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una malato permeasa funcional o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que proporcionarán actividad malato permeasa para una aplicación en la que la malato permeasa esté prevista para su uso, y que adicionalmente codifica un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la malato permeasa, y un terminador para la terminación de la transcripción de la secuencia de nucleótidos.

Además, la invención contempla de manera general una proteína Mae1 aislada que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato. En una forma de realización, la proteína se caracteriza porque tiene parte o toda la conformación estructural primaria (es decir, secuencia continua de residuos aminoácidos) y la actividad enzimática de Mae1 procedente de S. pombe. En particular, se proporciona una proteína Mae1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3. La invención también incluye truncamientos de la proteína y análogos, homólogos, e isoformas de la proteína y sus truncamientos (es decir, proteínas Mae1).

Las proteínas Mae1 de la invención se pueden conjugar con otras moléculas, tales como péptidos o proteínas, para preparar proteínas de fusión. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante la síntesis de proteínas de fusión N-terminales o C-terminales.

La invención contempla adicionalmente anticuerpos que tengan especificidad contra un epítopo de una proteína Mae1 de la invención. Los anticuerpos se pueden marcar con una sustancia detectable y se pueden usar para detectar proteínas Mae1.

La invención también permite la construcción de sondas de nucleótidos que sean únicas para las moléculas de ácidos nucleicos de la invención y, por consiguiente, para las proteínas Mae1. Por tanto, la invención también se refiere a una sonda que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1. La sonda puede estar marcada, por ejemplo, con una sustancia detectable y se puede usar para seleccionar, entre una mezcla de secuencias de nucleótidos, una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que presenta una o más de las propiedades de la Mae1.

La identificación y secuenciación de un gen responsable del transporte activo del L-malato, succinato, y malonato permite a alguien experto en la materia mediar en la captación en células de malato, succinato y malonato en diversas aplicaciones tecnológicas.

Se puede usar una proteína Mae1 de la invención para identificar sustancias que afectan a la actividad de la proteína, y así pueden ser útiles en la mediación del transporte de L-malato, succinato, o malonato en una célula, preferentemente un microorganismo o la célula de una planta. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para la identificación de una sustancia que media en el transporte de L-malato, succinato o malonato que comprende la incubación de una proteína Mae1 de la invención con un sustrato de la proteína Mae1, y una sustancia de prueba que se sospecha que afecta a la actividad de la proteína Mae1, y la determinación del efecto de la sustancia comparándola con un control.

La invención también se refiere a un procedimiento para dotar a una célula, preferentemente un microorganismo o la célula de una planta, de la capacidad de transportar malato que comprende la transformación de la célula con un fragmento de ADN o una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que media en la captación de malato. Preferentemente, la célula se transforma con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína Mae1 de la invención. Según una forma de realización específica de la invención, se proporciona un procedimiento para dotar a una cepa de levaduras de la capacidad de transportar eficazmente el malato, dicho procedimiento que comprende la transformación de la cepa de levaduras con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido funcional o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que mediarán en la captación del malato. La transformación de las células puede dotar a las células con la capacidad de degradar eficazmente el malato, succinato, o malonato.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para mediar en la captación de malato en cepas de levaduras en muchas aplicaciones industriales tales como la elaboración de vino. Por tanto, los procedimientos de la invención se pueden usar para transformar una levadura o levadura del vino del género Saccharomyces, preferentemente Saccharomyces cerevisiae o S. bayanus, para transportar el malato y permitir así que la levadura degrade eficazmente el malato. Más particularmente, la transformación de S. cerevisiae se puede llevar a cabo clonando el gen de la malato permeasa (mae1) procedente de la levadura S. pombe en la cepa de la levadura S. cerevisiae.

La invención proporciona adicionalmente, en general, un procedimiento de degradación del malato que incluye el cultivo, en presencia de una fuente de malato, de un microorganismo que ha sido transformado con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que media en la captación de malato.

Más específicamente, según la invención, adicionalmente se proporciona un procedimiento de degradación del malato que incluye el cultivo, en presencia de una fuente de malato, de una cepa de levadura que ha sido transformada introduciendo en la cepa de levadura una molécula de ácidos nucleicos que tiene una secuencia que codifica la malato permeasa o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que mediarán en la captación del malato, y que incluye un promotor y un terminador para la promoción y la terminación de la transcripción, y por tanto de la expresión del gen de la malato permeasa.

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La invención se extiende, incluso, a un procedimiento de degradación del malato durante la fermentación del vino, cuyo procedimiento incluye, el cultivo, en mostos de uva que contienen una fuente de malato, de una cepa de levadura transformada mediante material de ADN recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una malato permeasa funcional o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que proporcionarán actividad malato permeasa, y que adicionalmente codifica un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos, y un terminador para terminar la transcripción de la secuencia de nucleótidos que da como resultado una permeasa para transportar el malato al interior de las células de levadura.

Así, según la invención se proporciona un procedimiento de fermentación del vino, que incluye el cultivo, en un medio de fermentación del vino que incluye mosto de uva que contiene una fuente de malato, de una cepa de levadura transformada mediante material de ADN recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una malato permeasa funcional o uno de sus intermedios, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que proporcionarán actividad malato permeasa, y que adicionalmente codifica un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos, y un terminador para terminar la transcripción de la secuencia de nucleótidos, que da como resultado una permeasa para transportar el malato al interior de las células de levaduras.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. No obstante, se debe entender que aunque la descripción detallada y los ejemplos específicos indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan sólo a modo de ilustración, puesto que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y del alcance de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

Descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor con referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra la transferencia cromosómica del gen mae1 en el que los cromosomas de S. pombe se separaron sobre un gel CHEF (izquierda) y se probaron con una sonda con un fragmento Nsi1/Xho1 interno marcado de mae1 (derecha);

la Figura 2 muestra un mapa de restricción y la estrategia de secuenciación del ADN para la región codificante y la región 3' del gen mae1 y del gen MFm1;

la Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen mae1, los nucleótidos que están numerados a la izquierda y los aminoácidos, designados por el código estándar de una sola letra, que están numerados a la derecha;

la Figura 4 muestra una gráfica de hidropatía de la proteína mae1 predicha;

la Figura 5 es un modelo sugerido que muestra la distribución propuesta de los dominios de la membrana hidrófoba que están numerados del 1 al 10;

la Figura 6 muestra una transferencia de Northern del ARN total de S. pombe de tipo silvestre, probada con una sonda con el fragmento Nsi1/Xho1 de 695 pb de mae1;

la Figura 7 muestra la captación de (a) [^{14}C] ácido L-málico y (b) [^{l4}C] ácido succínico por el tipo silvestre (\Delta), el mutante mae1 (\medcirc) y el mutante complementado (\Box);

la Figura 8 muestra una descripción general de la permeabilidad y el transporte y degradación del malato por (A) S. cerevisiae y (B) S. pombe;

la Figura 9 muestra la captación de ^{14}C L-malato por cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen el gen mae1 de S. pombe bajo la regulación de (A) el promotor de PGK1 y (B) el promotor de ADH1;

la Figura 10 muestra la degradación del malato por las cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen los genes mae1 y/o mae2 de S. pombe que contienen 8-9 g/l de L-malato en medio glicerol-etanol al 2%;

la Figura 11 muestra la degradación del malato por las cepas recombinantes de S. cerevisiae que contiene los genes mae1 y/o mae2 de S. pombe que contienen 8-9 g/l de L-malato en medio glucosa al 2%;

la Figura 12 muestra la degradación del L-malato en mosto de uva Cabernet Sauvignon por cepas recombinantes de S. cerevisiae, incluyendo las cepas control;

la Figura 13 muestra la degradación del L-malato en mosto de uva Chardonnay por cepas recombinantes de S. cerevisiae, incluyendo las cepas control;

la Figura 14 son transferencias que muestran la fermentación maloláctica por las cepas de levadura recombinante de S. cerevisiae en vinos Cabernet Sauvignon (A) y Chardonnay (B) después de la fermentación; y

la Figura 15 muestra una representación esquemática de la subclonación del ORF de mae1 de S. pombe bajo el control del promotor de PGK1 y las secuencias terminadoras en pHVX2, un derivado de Yeplac181.

Descripción detallada de la invención I. Moléculas de ácidos nucleicos de la invención

Como se ha mencionado anteriormente, la invención proporciona una molécula de ácidos nucleicos aislada que tiene una secuencia que codifica una proteína que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato. El término "aislado" se refiere a un ácido nucleico sustancialmente exento de material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o reactivos químicos, u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico "aislado" también está exento de secuencias que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' de la molécula de ácidos nucleicos) de las cuales deriva el ácido nucleico. El término "ácido nucleico" está previsto que incluya ADN y ARN y puede ser de doble cadena o de cadena sencilla. En una forma de realización preferida, la molécula de ácidos nucleicos codifica Mae1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3. En otra forma de realización, la molécula de ácidos nucleicos es un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y en la Figura 3.

La invención incluye secuencias de ácidos nucleicos complementarias al ácido nucleico que codifica Mae1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y en la Figura 3, y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y en la Figura 3; preferentemente, las secuencias de ácidos nucleicos complementarías a la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 y en la Figura 3.

La invención también incluye moléculas de ácidos nucleicos que tienen una identidad u homología de secuencia sustancial con la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y en la Figura 3, o que codifican proteínas Mae1 que tienen una homología sustancial con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y en la Figura 3. La homología se refiere a la similitud de secuencia entre secuencias y se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se pueden alinear con el fin de comparar. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base del nucleótido o aminoácido, entonces las moléculas son coincidentes o tienen posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

La invención también incluye una molécula de ácidos nucleicos, y fragmentos de la molécula de ácidos nucleicos que tiene al menos 15 bases, que se hibrida con las moléculas de ácidos nucleicos de la invención en condiciones de hibridación, preferentemente condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN son conocidas por aquellos expertos en la materia, o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, se puede emplear lo siguiente: 6,0* cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a 45ºC aproximadamente, seguido por un lavado de 2,0 x SSC a 50ºC. La rigurosidad se puede seleccionar en base a las condiciones usadas en la etapa de lavado. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado se puede seleccionar a partir de una rigurosidad elevada de 0,2 x SSC a 50ºC aproximadamente. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede estar en condiciones de rigurosidad elevada, a 65ºC aproximadamente.

Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas y purificadas que tienen secuencias que difieren de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3, debido a la degeneración del código genético también están dentro del alcance de la invención.

Una molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención que comprende ADN se puede aislar preparando una sonda de ácidos nucleicos marcada basada en todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en la Figura 3 o en la SEQ ID NO: 1, y usando esta sonda de ácidos nucleicos marcada para seleccionar una librería de \DeltaDN apropiada (por ejemplo, un ADNc o una librería de ADN genómico). Por ejemplo, se puede usar una librería genómica completa aislada de un microorganismo para aislar un ADN que codifica una proteína Mae1 de la invención seleccionando la librería con la sonda marcada usando técnicas habituales. Los ácidos nucleicos aislados mediante selección de un ADNc o una librería de ADN genómico se pueden secuenciar mediante técnicas habituales.

Una molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención que es ADN también se puede aislar amplificando selectivamente un ácido nucleico que codifica una proteína Mae1 de la invención usando procedimientos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ADNc o ADN genómico. Es posible diseñar cebadores de oligonucleótidos sintéticos a partir de las moléculas de ácidos nucleicos mostradas en la Figura 3 o en la SEQ ID NO: 1, para su uso en PCR. Un ácido nucleico se puede amplificar a partir de ADNc o ADN genómico usando estos cebadores de oligonucleótidos y técnicas de amplificación por PCR habituales. El ácido nucleico amplificado de esta forma se puede clonar en un vector apropiado y se puede caracterizar mediante análisis de la secuencia de ADN. El ADNc se puede preparar a partir de ARNm, aislando el ARNm celular total mediante una variedad de técnicas, por ejemplo, usando el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin y col., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). A continuación el ADNc se sintetiza a partir del ARNm usando la transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa Moloney MLV disponible en Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa AMV disponible en Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).

Una molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención que sea ARN se puede aislar clonando un ADNc que codifica una nueva proteína Mae1 de la invención en un vector apropiado que permita la transcripción del ADNc para producir una molécula de ARN que codifica una nueva proteína de la invención.

Una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína que media en la captación de L-malato, ácido succínico o malonato también se puede identificar usando una aproximación funcional. Por ejemplo, el gen mae1 en S. pombe se puede interrumpir empleando técnicas de ADN recombinante habituales y las secuencias de ADN del gen mae1 como se ha descrito en el presente documento, o alternativamente, una cepa de S. pombe que contiene un gen mae1 se puede someter a un tratamiento mutágeno, incluyendo radiación o tratamientos químicos. En particular, una cepa de S. pombe se puede tratar con etilmetanosulfonato (EMS), ácido nitroso (NA), o hidroxilamina (HA), que producen mutantes con sustituciones de pares de bases. Los mutantes deficientes en la utilización de malato, ácido succínico, o malonato se pueden seleccionar, por ejemplo, cultivando en placa una dilución apropiada sobre placas de agar diferenciales en las que las colonias mutantes son de un color distinguible. Se puede usar la complementación de estos mutantes con librerías genómicas procedentes de otros organismos para identificar clones que contienen genes que codifican proteínas que median en la captación de L-malato, ácido succínico y malonato (véase Ejemplo 1).

Una molécula de ácidos nucleicos de la invención también se puede sintetizar químicamente usando técnicas habituales. Se conocen diversos procedimientos de síntesis química de polidesoxinucleótidos, incluyendo síntesis en fase sólida que, al igual que la síntesis peptídica, ha sido completamente automatizada en sintetizadores de ADN disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, Itakura y col. patente de EE.UU. Nº 4.598.049; Caruthers y col. patente de EE.UU. Nº 4.458.066; e Itakura patentes de EE.UU. Nº 4.401.796 y 4.373.071).

La determinación de si una molécula de ácidos nucleicos particular codifica una proteína Mae1 de la invención se puede conseguir expresando el ADNc en una célula hospedadora apropiada mediante técnicas habituales, y probando la actividad de la proteína usando los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la actividad de una proteína Mae1 putativa se puede someter a prueba mezclándola con un sustrato apropiado y sometiéndola a ensayo para la actividad malato permeasa. Alguien con conocimientos en la materia también puede comparar la estructura tridimensional de la proteína, analizada, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN bidimensional, con la estructura tridimensional para la malato permeasa de S. pombe. Un ADNc que tiene la actividad, o la estructura tridimensional de una nueva proteína de la invención aislado de esta forma se puede secuenciar mediante técnicas habituales, tales como la terminación de la cadena con didesoxinucleótidos o secuenciación química de Maxan-Gilbert, para determinar la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína codificada.

El codón de iniciación y las secuencias sin traducir de una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína Mae1 se pueden determinar usando software de ordenador disponible actualmente diseñado para este propósito, tal como PC/Gene (IntelliGenetics Inc., CA). Los elementos reguladores se pueden identificar usando técnicas convencionales. La función de los elementos se puede confirmar usando estos elementos para expresar un gen informador que está unido de manera operable a los elementos. Estas construcciones se pueden introducir en células en cultivo usando procedimientos habituales. Además, para identificar elementos reguladores en el ADN, esas construcciones también se pueden usar para identificar proteínas que interaccionan con los elementos, usando técnicas conocidas en la materia.

La secuencia de una molécula de ácidos nucleicos de la invención también se puede invertir en relación a su presentación normal para su transcripción para producir una molécula de ácidos nucleicos antisentido. Preferentemente, una secuencia antisentido se construye invirtiendo una región que precede al codón de iniciación o a una región sin conservar. En particular, las secuencias de ácidos nucleicos contenidas en las moléculas de ácidos nucleicos de la invención o uno de sus fragmentos, preferentemente la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en el Listado de secuencias como SEQ ID NO: 1 y en la Figura 3 se pueden invertir en relación a su presentación normal para su transcripción para producir moléculas de ácidos nucleicos antisentido. Las secuencias antisentido se pueden usar para modular la expresión del gen mae1 reduciendo o inhibiendo de esta forma la captación del L-malato, ácido succínico, o malonato.

La invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden una proteína Mae1 de la invención y una proteína o péptido heterólogo, o una proteína marcadora seleccionable (véase a continuación). La construcción de una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de un péptido o una proteína seleccionada y una secuencia de ácidos nucleicos de una proteína Mae1, emplea técnicas de ingeniería genética convencionales [véase, Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Por ejemplo, la secuencia que codifica una proteína seleccionada se puede fusionar a una secuencia de una de diversas regiones identificables que, cuando la proteína está unida a membrana, se encuentran sobre la superficie de la célula. Además, la proteína seleccionada se puede fusionar al extremo amino de la molécula Mae1. Alternativamente, la secuencia de la proteína seleccionada se puede fusionar al extremo carboxilo de la molécula Mae1. En cualquiera de los dos extremos amino o carboxilo, el péptido o la proteína deseada está fusionada de manera que la fusión no desestabiliza la estructura nativa de ninguna de las proteínas.

Una molécula de ácidos nucleicos de la invención puede contener múltiples copias de una secuencia que codifica una proteína Mae1, con la secuencia que codifica una proteína o un péptido heterólogo fusionada a sólo una de las secuencias Mae1, o con la proteína o el péptido heterólogo fusionado a todas las copias de la secuencia Mae1.

Una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1 y una secuencia que codifica una secuencia de una proteína o péptido heterólogo opcionalmente pueden contener un péptido enlazador insertado entre la secuencia Mae1 y la secuencia del péptido o proteína heteróloga seleccionada. Esta secuencia enlazadora puede codificar, si se desea, un polipéptido que sea escindible o digerible de manera seleccionable mediante procedimientos químicos o enzimáticos convencionales. Por ejemplo, el sitio de escisión seleccionado puede ser un sitio de escisión enzimático. La secuencia enlazadora opcional puede servir para un fin distinto a la provisión de un sitio de escisión. El enlazador también puede ser una secuencia de aminoácidos simple de una longitud suficiente para evitar cualquier impedimento estérico entre la molécula Mae1 y el péptido o proteína heteróloga seleccionada.

Una amplia variedad de genes heterólogos o fragmentos génicos son útiles en la formación de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. Los genes heterólogos que se pueden incorporar a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen los siguientes:

(a) genes del ácido maloláctico, que codifican una enzima maloláctica que convierte el L-malato en L-lactato, y truncamientos, análogos y sus homólogos que tienen la actividad de una enzima maloláctica. Ejemplos de genes que codifican una enzima maloláctica son los genes mleS y EML de Lactobacillus lactis (V. Ansanay, y col., FEBS 332:74-80; SEQ ID NOS: 3 y 5) y L. delbrueckii (Williams y col., 1984), y el gen maloláctico descrito por Lautensach, y Subden (Microbios, 1984);

(b) los genes del ácido málico que codifican una enzima del ácido málico que cataliza la descarboxilación oxidativa del malato en piruvato y dióxido de carbono seguido por la descarboxilación y reducción sucesiva de acetaldehído para dar etanol, y truncamientos, análogos y sus homólogos que tienen la actividad de una enzima del ácido málico. Los ejemplos de genes del ácido málico incluyen el gen mae2 de S. pombe (Viljoen y col., 1994, SEQ ID NO: 7); y los genes que codifican las enzimas del ácido málico de ratón (Bagchi, S., y col., J. Biol. Chem. 262, 1558-1565, 1987), rata (Mangnuson, Ma. A. y col., J. Biol. Chem. 261, 1183-1186, 1986), Zea maize (Rothermel, B. A. y Nelson, T. J. Biol. Chem. 264, 19587-19592, 1989), P. vulgaris, (Walter y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5546-5550), Populus deltoides (Van Doorsselaere y col. 1991, Plant Physiol. 96:1385-1386); F. linearis (Rajeevan y col., 1991, Plant Mol. Biol. 17:371-383); B. stearo (Kobayshi y col., 1989, J. Biol. Chem. 264: 3200-3205), E. coli (Mahajan, S. K. y col., Genetics 125, 261-273, 1990), Flaveria trinervia (Boersch, D., y Westhoff, P., FEBS Lett.), humano (Loeber, G., y col., J. Biol. Chem. 266, 3016-3021, 1991), Ascaris suum (base de datos Swiss-Prot, número de acceso P27443) y Mesembryanthemum crystallinum (Cushman, 1992, Eur. J. Biochem. 208, 259-266); y

(c) genes que codifican enzimas involucradas en el metabolismo del malato en plantas, y truncamientos, análogos y sus homólogos que tienen la actividad de las enzimas. Ejemplos de enzimas involucradas en el metabolismo del malato en plantas incluyen la malato deshidrogenase, enzima málica, malato sintasa, fumarasa, y PEP carboxilasa (Martinoia, E. y D. Rentsch, Acta. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994, 45:447-67 y las referencias allí presentadas).

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II. Proteínas Mae de la invención

Como se ha mencionado en el presente documento, la invención contempla una proteína Mae1 aislada que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato. En una forma de realización, la proteína se caracteriza porque tiene parte o toda la conformación estructural primaria (es decir, la secuencia continua de residuos aminoácidos) y la actividad enzimática de Mae1 de S. pombe.

En particular, se proporciona una proteína Mae1 purificada que tiene la secuencia de aminoácidos de Mae1 de S. pombe como se muestra en la SEQ ID NO: 2 y en la Figura 3. El gen mae1 de S. pombe codifica una proteína de 435 residuos aminoácidos con un peso molecular de 49 kDa aproximadamente. El perfil de hidropatía de la secuencia de aminoácidos deducida (Figura 4) reveló una proteína con N- y C-términos hidrófilos y diez hélices putativas que se extienden a través de la membrana, típicas de proteínas de transporte de membrana. Los 36 aminoácidos N-terminales y los 65 aminoácidos C-terminales son altamente hidrófilos.

Se construyó un modelo estructural para la malato permeasa mediante análisis por ordenador (Figura 5). Dos enlazadores hidrófilos prominentes, de 20 y 25 aminoácidos de largo, están localizados entre los dominios hidrófobos que se extienden a través de la membrana dos y tres, y siete y ocho, respectivamente. La longitud de los otros enlazadores hidrófilos abarca entre 7 y 12 aminoácidos.

La Mae1 de S. pombe contiene una serie de regiones bien caracterizadas que incluyen dos sitios de fosforilación de la proteína quinasa C, una región PEST, una región de cremallera de leucinas, dos regiones enlazadoras hidrófilas, y diez hélices que se extienden a través de la membrana. En particular, en el extremo C-terminal se encuentra una región PEST bien conservada (aminoácidos 421-434), que consta de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S), treonina (T) y en un menor grado ácido aspártico. Un motivo de cremallera de leucinas (aminoácidos 214 a 235), que consta de cuatro residuos de leucina espaciados por 6 aminoácidos, está localizado entre los dominios que se extienden a través de la membrana seis y siete. Los sitios de fosforilación de la proteína quinasa C se encontraron en la posición 28: phvplSqrlkh y en la posición 94: ikypsTikdsw. La Mae1 de S. pombe también contiene tres sitios potenciales de glicosilación unidos a N localizados en los aminoácidos 193, 277 y 336.

La estructura tridimensional de la malato permeasa de S. pombe representada en la Figura 5 muestra que la malato permeasa contiene varias regiones accesibles identificables que, cuando la proteína está unida a membrana, se encuentran sobre la superficie de la célula, y no están involucradas en ninguna de las interacciones con el resto de la proteína que contribuyen a la estabilidad estructural general. Estas regiones son, por tanto, buenos candidatos como sitios para fusiones o modificaciones (inserciones, deleciones, etc.) como se ha descrito en el presente documento. Por tanto, tanto el extremo amino como el extremo carboxilo de la malato permeasa de S. pombe están fácilmente accesibles para fusiones o modificaciones.

Las proteínas Mae1 de la invención se caracterizan adicionalmente por su capacidad para transportar L-malato, succinato y malonato desde un medio extracelular a la matriz intracelular. El transporte de malato, succinato, y malonato se puede someter a ensayo usando los ensayos de transporte descritos en el presente documento. Por ejemplo, células de levadura transformadas con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína Mae1 de la invención se pueden crecer en presencia de L-malato o ácido L-succínico marcado y se puede medir la cantidad de L-malato o ácido L-succínico marcado unido a las células de levadura.

Dentro del contexto de la presente invención, una proteína de la invención puede incluir diversas formas estructurales de la proteína primaria que retienen la actividad malato permeasa. Por ejemplo, una proteína de la invención puede estar en forma de sales ácidas o básicas o en forma neutra. Además, los residuos aminoácidos individuales se pueden modificar por oxidación o reducción.

Además de la secuencia de aminoácidos de Mae1 de longitud completa (SEQ ID NO: 2 o Figura 3), las proteínas de la presente invención incluyen truncamientos de Mae1, y análogos, y homólogos de Mae1, y sus truncamientos como se describe en el presente documento. Las proteínas truncadas pueden comprender péptidos de entre 3 y 4 00 residuos aminoácidos, que tienen un tamaño que abarca desde un tripéptido a un polipéptido 400-mero. Por ejemplo, una proteína truncada puede comprender la región PEST (aminoácidos 421-434) o el motivo de cremallera de leucinas (aminoácidos 214 a 235).

Las proteínas de la invención también pueden incluir análogos de Mae1 como se muestra en la Figura 3 o en la SEQ ID NO: 2, y/o sus truncamientos como se describe en el presente documento, que pueden incluir, pero no están limitados a Mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 2), que contiene una o más sustituciones, inserciones, y/o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de naturaleza conservativa o no conservativa. Las sustituciones de aminoácidos conservados suponen la sustitución de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Mae1 con aminoácidos de características de carga, tamaño, y/o hidrofobicidad similares. Cuando sólo se realizan sustituciones conservadas, el análogo resultante debe ser funcionalmente equivalente a la Mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 2). Las sustituciones no conservadas suponen el reemplazo de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Mae1 con uno o más aminoácidos que poseen características de carga, tamaño, y/o hidrofobicidad distintas.

Se puede introducir una o más inserciones de aminoácidos en Mae1 de S. pombe (SEQ ID NO: 2). Las inserciones de aminoácidos pueden constar de residuos aminoácidos únicos o aminoácidos secuenciales que abarcan una longitud de entre 2 y 15 aminoácidos.

Las deleciones pueden consistir en la eliminación de uno o más residuos aminoácidos, o porciones discretas (por ejemplo, una o más de la región PEST, del motivo de cremallera de leucinas) de la secuencia de Mae1 (SEQ ID NO: 2). Los aminoácidos delecionados pueden ser contiguos, o no. La longitud límite inferior del análogo resultante con una mutación de deleción es de 10 aminoácidos aproximadamente, preferentemente de 100 aminoácidos.

Se anticipa que si se sustituyen, insertan o eliminan aminoácidos en secuencias fuera de las regiones bien caracterizadas tales como la región PEST y el motivo de cremallera de leucinas, etc., la proteína Mae1 resultante podría tener actividad malato permeasa. Preferentemente, las modificaciones se realizan en regiones accesibles e identificables, que se encuentran sobre la superficie de la célula (véase Figura 5).

Las proteínas de la invención también incluyen homólogos de Mae1 (SEQ ID NO: 2) y/o sus truncamientos como se describe en el presente documento. Esos homólogos de Mae1 incluyen proteínas cuyas secuencias de aminoácidos están compuestas de las secuencias de aminoácidos de las regiones Mae1 de otras especies en las que la secuencia de nucleótidos que codifica la región Mae1 se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas (véase descripción de las condiciones de hibridación rigurosas en el presente documento) con una sonda usada para obtener la Mae1.

La invención también contempla isoformas de la proteína de la invención. Una isoforma contiene el mismo número y tipo de aminoácidos que la proteína de la invención, pero la isoforma tiene una estructura molecular diferente. Las isoformas contempladas por la presente invención son aquellas que tienen las mismas propiedades que la proteína de la invención como se describe en el presente documento.

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La presente invención también incluye proteínas Mae1 conjugadas con una proteína marcadora seleccionable o un péptido o una proteína heteróloga para producir proteínas de fusión. Los ejemplos de proteínas marcadoras seleccionables son G418, \beta-cloranfenicol, fleomicina, e higromicina que confieren resistencia a ciertos fármacos; proteínas que confieren resistencia a herbicidas (por ejemplo, sulfometuron-metilo) y a cobre; \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. Ejemplos de proteínas heterólogas incluyen la enzima maloláctica de L. lactis y L. delbrueckii [SEQ. ID. NOS: 3 a 6], las enzimas málicas de S. pombe [SEQ. ID. NOS: 7 y 8], ratón, rata, humano, maíz, P. vulgaris, P. deltoides, F. linearis, B. stearo, E. coli, Flaveria trinervia, Ascaris suum y Mesembryanthemum, y las enzimas involucradas en el metabolismo del malato en plantas como se describe en el presente documento.

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III. Vectores de expresión, células hospedadoras, y expresión de mae1

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que tienen una secuencia que codifica una proteína Mae1 de la invención se pueden incorporar de manera conocida a un vector de expresión apropiado que asegura una buena expresión de la proteína. Los posibles vectores de expresión incluyen, pero no están limitados a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus asociados a adenovirus defectivos en la replicación), mientras que el vector sea compatible con la célula hospedadora usada. Por ejemplo, el vector puede ser un vector lanzadera tal como pRS315, o un vector tal como pHVX2, YEplac181, o un plásmido basado en CEN.

Los vectores se pueden seleccionar basándose en el número de copias de la molécula de ácidos nucleicos a introducir en la célula hospedadora, que a su vez está determinado por la elección del origen de replicación. Por consiguiente, se pueden seleccionar los siguientes vectores: (a) un vector replicativo (YEp) a un número de copias elevado que tenga un origen de replicación en levaduras (por ejemplo, YEplac181); (b) un vector replicativo (YRp) a un número de copias elevado que tenga una secuencia ARS cromosómica como origen de replicación; (c) un vector replicativo lineal (YLp) a un número de copias elevado que tenga una secuencia telomérica como origen de replicación; y (d) un vector replicativo (YCp) a un bajo número de copias que tenga ARS cromosómico y secuencias centroméricas.

Una molécula de ácidos nucleicos de la invención se puede integrar en el genoma de una célula hospedadora, preferentemente en el genoma de una célula de levadura, bien para sustituir o duplicar una secuencia nativa. En este caso, se puede seleccionar un vector de integración (YIp) que no posea un origen en las células hospedadoras.

Por tanto, la invención contempla un vector de expresión que contenga una o más moléculas de ácidos nucleicos de la invención, y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia(s) de proteínas insertada. En particular, el vector de expresión puede incluir secuencias promotoras y terminadoras para promover y terminar la transcripción del gen en la célula hospedadora transformada y la expresión del gen de la malato permeasa. Secuencias reguladoras adecuadas se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, víricos, de mamíferos, o de insectos (por ejemplo, véanse las secuencias reguladoras descritas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). La selección de secuencias reguladoras apropiadas depende de la célula hospedadora seleccionada, y se puede llevar a cabo fácilmente por alguien con conocimientos ordinarios en la materia. Ejemplos de secuencias reguladoras que se pueden usar en una molécula de ácidos nucleicos de la invención incluyen los promotores y terminadores de genes para la alcohol deshidrogenase I (ADHI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), y 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), u otros promotores que son funcionales en S. cerevisiae.

Las secuencias reguladoras necesarias pueden ser suministradas por la mae1 nativa y/o sus regiones flanqueantes. No obstante, en células hospedadoras en las que un promotor nativo sea inactivo (por ejemplo, el promotor mae1 de S. pombe en cepas de S. cerevisiae), el promotor se puede seleccionar entre promotores adecuados de la célula hospedadora, por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa I (ADHI), y la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK) y las secuencias terminadoras apropiadas se pueden usar con S. cerevisiae.

Se apreciará que el nivel de expresión de una molécula de ácidos nucleicos de la invención se puede modular ajustando el número de copias de la molécula de ácidos nucleicos introducida en la célula hospedadora y/o la naturaleza de los elementos reguladores contenidos en la molécula de ácidos nucleicos.

Los vectores de expresión de la invención también pueden contener un gen marcador seleccionable que facilite la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Ejemplos de genes marcadores seleccionables son genes que codifican una proteína marcadora seleccionable tal como G418, \beta-cloranfenicol, fleomicina, e higromicina que confieren resistencia a ciertos fármacos; una proteína que confiera resistencia a herbicidas (por ejemplo, sulfometuron-metilo) y a cobre; \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. Los marcadores seleccionables se pueden introducir en un vector separado de la molécula de ácidos nucleicos de interés.

Los vectores de expresión también pueden contener genes que codifican un resto que proporciona una expresión incrementada de la proteína recombinante; ayudan en la purificación de la proteína recombinante diana actuando como ligando en la purificación de afinidad; y dirige la proteína recombinante a la membrana plasmática. Por ejemplo, se puede añadir un sitio de escisión proteolítico a la proteína recombinante diana para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión, o se puede usar un péptido señal para dirigir la malato permeasa a la membrana plasmática de la cepa de levadura.

Los vectores de expresión se pueden introducir en células hospedadoras para producir una célula hospedadora transformante. "Células hospedadoras transformantes" incluyen células hospedadoras que han sido transformadas o transfectadas con un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "transformado con", "transfectado con", "transformación" y "transfección" engloban la introducción de ácidos nucleicos (por ejemplo, un vector) en una célula hospedadora mediante cualquiera de numerosas técnicas habituales. Las células procariotas se pueden transformar con ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, electroporación o transformación mediada por cloruro de calcio. El ácido nucleico se puede introducir en células de mamífero mediante técnicas convencionales tales como coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofectina, electroporación o microinyección. Procedimientos adecuados para la transformación y transfección de células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio. Las técnicas de transformación más habituales que se pueden usar para cepas de levadura incluyen técnicas con protoplastos, la técnica de permeabilización a sales de litio, y electroporación. Un vector de expresión de la invención también se puede integrar en el genoma de una célula hospedadora usando procedimientos convencionales tales como el procedimiento de hibridación de colonias como se describe por Rose y col. (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbour Press, 1990).

Para producir una proteína de fusión de esta invención, la célula hospedadora se transforma con, o se ha integrado en su genoma, una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia Mae1 fusionada a la secuencia de un péptido o proteína heteróloga seleccionada, o una proteína marcadora seleccionable, de manera deseable bajo el control de secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión de una proteína de fusión. A continuación la célula hospedadora se cultiva en condiciones conocidas adecuadas para la producción de proteínas de fusión.

Se pueden usar una amplia variedad de células hospedadoras procariotas y eucariotas como células hospedadoras para la expresión de la proteína Mae1 o la proteína de fusión de la invención. Por ejemplo, las proteínas de la invención se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando baculovirus), células de levadura, células de plantas, o células de mamífero. Otras células hospedadoras adecuadas se pueden encontrar en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

De manera más particular, la célula hospedadora es una cepa de levadura, preferentemente una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae, una cepa de levadura de S. bayanus, o una cepa de levadura de Schizosaccharomyces. Las células hospedadoras transformadas para su uso en la elaboración de vino preferentemente son cepas de levaduras del vino de Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces, por ejemplo "Prise de Mousse" {Lallemande EC 1118), Vin13, Vin7, N96, y WE352.

Por tanto, la presente invención incluye células eucariotas o procariotas transformadas, caracterizadas porque contienen al menos una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína Mae1, o que codifica una proteína de fusión de una proteína Mae1 y una proteína o péptido heterólogo. Un ejemplo de dicha célula hospedadora transformada es una cepa de levadura que tiene una secuencia de nucleótidos del gen mae1 como se muestra en la Figura 3 o en la SEQ ID NO: 1, y un polipéptido funcional, que es una malato permeasa. En una forma de realización, la cepa de levadura puede ser Saccharomyces, transformada con un gen de la malato permeasa, en particular, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína Mae1. En otra forma de realización, la cepa de levadura transformada puede ser Saccharomyces, transformada con un gen mae1 de S. pombe. En otra forma de realización, la cepa de levadura transformada puede ser Saccharomyces cerevisiae, y el gen mae1 se puede clonar procedente de S. pombe. Preferentemente, la cepa de levadura es S. cerevisiae que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende la secuencia mostrada en la Figura 3 o en la SEQ ID NO: 1.

La presente invención también incluye células eucariotas o procariotas transformadas, caracterizadas por que contienen al menos una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión de una proteína Mae1 y una proteína o péptido heterólogo. En una forma de realización de la invención, se proporciona una cepa de levadura que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1 y una secuencia que codifica una enzima maloláctica, preferentemente que comprende el gen mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 1) y el gen mleS de L. lactis (SEQ ID NO: 5). En otra forma de realización de la invención, la cepa de levadura es una cepa de levadura del vino que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1, y una secuencia que codifica una enzima mélica, lo más preferentemente la secuencia comprende el gen mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 1) y el gen mae2 de S. pombe (SEQ. ID. NOS: 7 y 8).

En una forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una proteína Mae1 que comprende las etapas de: construcción de un vector que comprende una molécula de ADN recombinante que tiene la secuencia de nucleótidos definida anteriormente para transformar una célula de levaduras y permitir la síntesis de un polipéptido que transporta malato. Así, el procedimiento puede incluir el aislamiento del gen mae1 de S. pombe o cualquier otro organismo; insertando el gen mae1 en un vector de clonación, tal como un plásmido de expresión en levaduras o un plásmido basado en CEN, y la introducción del gen mae1 en una cepa de levadura de S. cerevisiae, transformando así la S. cerevisiae en un microorganismo que transporta malato. El plásmido puede servir como base para una caracterización y manipulación posterior del gen mae1. La expresión del gen mae1 en S. cerevisiae se puede llevar a cabo sustituyendo el promotor nativo de S. pombe por las secuencias promotoras y terminadoras de S. cerevisiae. La construcción del gen se puede subclonar, si se desea, en un vector adecuado antes de ser transformado en la cepa de levadura, o alternativamente, el gen se puede integrar en el ADN cromosómico de S. cerevisiae.

Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para producir y aislar una proteína Mae1. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una proteína Mae1 que comprende (a) la transferencia de un vector de expresión de la invención a una célula hospedadora; (b) la selección de células hospedadoras transformadas entre células hospedadoras no transformadas; (c) el cultivo de una célula hospedadora transformada seleccionada en condiciones que permiten la expresión de la proteína Mae1; y (d) el aislamiento de la proteína Mae1.

Las proteínas Mae1 de la invención también se pueden preparar mediante síntesis química usando técnicas muy conocidas en la química de proteínas tales como síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154) o síntesis en disolución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart).

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IV. Aplicaciones Sondas de nucleótidos

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención permiten a aquellos expertos en la materia construir sondas de nucleótidos para su uso en la detección de secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas Mae1. Las sondas adecuadas incluyen moléculas de ácidos nucleicos basadas en secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos 6 aminoácidos secuenciales de las regiones de la proteína Mae1 como se muestra en la SEQ ID NO: 1, o en la Figura 3. Una sonda de nucleótidos se puede marcar con una sustancia detectable tal como un marcador radiactivo que proporcione una señal adecuada y tenga una semivida suficiente tal como ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C o similares. Otras sustancias detectables que se pueden usar incluyen antígenos que son reconocidos por un anticuerpo marcado específico, compuestos fluorescentes, enzimas, anticuerpos específicos para un antígeno marcado, y compuestos luminiscentes. Un marcador apropiado se puede seleccionar teniendo en cuenta la velocidad de hibridación y la unión de la sonda al nucleótido a detectar y la cantidad de nucleótido disponible para la hibridación. Las sondas marcadas se pueden hibridar a ácidos nucleicos sobre soportes sólidos tales como filtros de nitrocelulosa o membranas de nailon tal y como se describe de manera general en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.). Las sondas de ácidos nucleicos se pueden usar para detectar genes, preferentemente en células de levadura, que codifiquen proteínas Mae1.

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Anticuerpos

Las proteínas Mae1 de la invención se pueden usar para preparar anticuerpos específicos para las proteínas. Se pueden preparar anticuerpos que se unan a un epítopo distinto en una región sin conservar de la proteína. Una región sin conservar de la proteína es aquella que no tiene una homología de secuencia sustancial con otras proteínas, por ejemplo, las regiones fuera de las PEST conservadas o los motivos de cremallera de leucinas como se describe en el presente documento. Se puede usar una región procedente de uno de los dominios bien caracterizados (por ejemplo, regiones PEST) para preparar un anticuerpo para una región conservada de una proteína Mae1. También se pueden generar anticuerpos que tengan especificidad para una proteína Mae1 a partir de proteínas de fusión creadas mediante la expresión de proteínas de fusión en bacterias como se describe en el presente documento.

Se pueden usar procedimientos convencionales para preparar los anticuerpos. Por ejemplo, usando un péptido de una proteína Mae1, se puede preparar antisuero policlonal o anticuerpos monoclonales usando procedimientos habituales [por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)) así como otras técnicas tales como la selección de librerías combinatorias de anticuerpos (Huse y col., Science 246, 1275 (1989)]. El término "anticuerpos" incluye fragmentos de anticuerpos que también reaccionen específicamente con una proteína, o péptido que tenga la actividad de una proteína Mae1.

Se pueden usar anticuerpos específicamente reactivos con una proteína Mae1, o derivados, tales como conjugados enzimáticos o derivados marcados, para detectar Mae1 en diversas muestras, por ejemplo, levaduras o plantas, por ejemplo, se pueden usar en cualquier inmunoensayo conocido que dependa de la interacción de unión entre un determinante antigénico de una proteína Mae1 y los anticuerpos. Ejemplos de esos ensayos son radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos (por ejemplo, ELISA), inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, aglutinación con látex, y hemaglutinación.

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Procedimientos de mediación de la captación de malato, ácido succínico y malonato

Una proteína Mae1 de la invención se puede usar para identificar sustancias que afecten a la actividad de la proteína, y así pueden ser útiles en la mediación del transporte del L-malato, succinato, o malonato en una célula, preferentemente un microorganismo (por ejemplo, una levadura) o la célula de una planta. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para identificar una secuencia que medie en el transporte de L-malato, succinato o malonato que comprende la incubación de una proteína Mae1 de la invención con un sustrato de la proteína Mae1, y una sustancia de prueba que sea sospechosa de afectar a la actividad de la proteína Mae1, y la determinación del efecto de la sustancia comparándola con un control. La sustancia puede ser una sustancia natural o sintética.

En particular, la invención proporciona un procedimiento para identificar una sustancia que medie en el transporte de L-malato, succinato, o malonato en un microorganismo (por ejemplo, una levadura) que comprende el cultivo en presencia de malato, succinato o malonato y una sustancia de prueba que sea sospechosa de afectar a la actividad de una proteína Mae1, de un microorganismo que ha sido transformado con una molécula de ácidos nucleicos de la invención que contiene una secuencia que codifica una proteína Mae1, y expresa una proteína Mae1, el ensayo para la captación de malato, succinato, o malonato, y la determinación del efecto de la sustancia comparándola con un control en el que el microorganismo se cultiva sin la sustancia de prueba. El malato, succinato o malonato se pueden marcar con una sustancia detectable como se describe en el presente documento.

Las sustancias identificadas usando los procedimientos de la invención así como moléculas de ácidos nucleicos antisentido, y anticuerpos, pueden reducir la expresión o la actividad de la proteína Mae1 en una célula, preferentemente un microorganismo o la célula de una planta, afectando así a la captación de malato, ácido succínico y malonato por la célula. Los inhibidores de una proteína Mae1 pueden ser particularmente útiles en la elaboración de vino cuando la cepa de levadura del vino usada sea muy eficiente en la degradación de malato. Las sustancias inhibidoras pueden ser particularmente útiles en regiones cálidas, en las que normalmente hay insuficiente ácido en el vino y el ácido se debe añadir para convertir vinos planos e insípidos en vinos agradables.

Las sustancias identificadas usando el procedimiento de la invención que estimulan la actividad de una proteína Mae1 de la invención pueden ser particularmente útiles en la mejora de la fermentación maloláctica o maloetanólica. Las sustancias estimuladoras pueden ser útiles en el incremento de la captación de malato y pueden tener una aplicación particular en la elaboración de vino usando cepas de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) que no eliminan eficazmente el malato.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para transformar una célula, preferentemente un microorganismo o la célula de una planta, para así mediar en la captación y el metabolismo del L-malato, ácido succínico, o malonato por la célula. En particular, la molécula de ácidos nucleicos pueden hacer que una célula, preferente un microorganismo, sea capaz de degradar eficazmente el malato. En una forma de realización de la invención se proporciona un ADN recombinante que se usa para transformar un microorganismo para así dotarlo de la capacidad de degradar eficazmente el malato, el ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que media en la captación de malato, y que permite la síntesis del polipéptido por el microorganismo transformado.

Más particularmente, según la invención se proporciona una molécula de ADN recombinante para su uso en la transformación de una cepa de levadura para así dotarla de la capacidad de degradar eficazmente el malato, dicho ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la malato permeasa o un intermedio de la misma, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que mediará en la captación de malato, y permite la expresión de malato permeasa en la levadura transformada.

Se pueden usar células hospedadoras (por ejemplo, microorganismos y células de planta) de la invención que contienen una molécula de ácidos nucleicos de la invención para mediar en la captación y el metabolismo del L-malato, ácido succínico, o malonato. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento de mediación en la captación y el metabolismo del L-malato, ácido succínico, o malonato que comprende el crecimiento en presencia de una fuente de L-malato, ácido succínico, o malonato, de una célula transformada con una molécula de ácidos nucleicos de la invención. En una forma de realización de la invención, se contempla un procedimiento de degradación del malato que incluye el cultivo, en presencia de una fuente de malato, de un microorganismo que ha sido transformado con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que media en la captación de malato. Preferentemente, el microorganismo se transforma con una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1, lo más preferentemente de la secuencia comprende el gen mae1 de S. pombe {Figura 3 o
SEQ ID NO: 1).

Más específicamente, según la invención se proporciona un procedimiento de degradación del malato que incluye el cultivo en presencia de una fuente de malato, de una cepa de levadura que ha sido transformada introduciendo en la cepa de levadura, una secuencia de nucleótidos que codifica la malato permeasa o un intermedio de la misma, o codifica al menos en gran parte su secuencia de aminoácidos que mediará en la captación de malato, y que incluye un promotor y un terminador para la promoción y terminación la transcripción, y la expresión del gen de la malato permeasa. Preferentemente la cepa de levadura es S. cerevisiae que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1, lo más preferentemente la secuencia comprende el gen mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 1).

El procedimiento de la invención para la degradación de malato usando células hospedadoras transformadas de la invención es particularmente útil en la elaboración del vino, y proporciona un medio simple y menos caro de degradar eficazmente el malato durante, o después de la etapa de fermentación alcohólica. Por tanto, la invención también contempla un procedimiento de degradación del malato durante la fermentación del vino, cuyo procedimiento incluye, el cultivo, en mostos de uva que contienen una fuente de malato, de una cepa de levadura transformada por una molécula de ácidos nucleicos de la invención. En una forma de realización de la invención la cepa de levadura es transformada mediante material de ADN recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una malato permeasa funcional o un intermedio de la misma, o codifica al menos en gran parte su secuencia de nucleótidos que proporcionará actividad malato permeasa, y que adicionalmente codifica un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos, y un terminador para terminar la transcripción de la secuencia de nucleótidos que da como resultado una permeasa para transportar el malato a las células de levadura.

Según la invención también se proporciona un procedimiento de fermentación del vino, que incluye el cultivo, en un medio de fermentación del vino que incluye mosto de uva que contiene una fuente de malato, de una cepa de levadura transformada por una molécula de ácidos nucleicos de la invención. En una forma de realización de la invención la cepa de levadura es transformada con un material de ADN recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una malato permeasa funcional o un intermedio de la misma, o codifica al menos en gran parte su secuencia de nucleótidos que proporcionará actividad malato permeasa, y que adicionalmente codifica un promotor para la promoción de la transcripción de la secuencia de nucleótidos y la conducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos, y un terminador para terminar la transcripción de la secuencia de nucleótidos, que da como resultado una permeasa para transportar el malato a las células de levadura.

La cepa de levadura usada en los procedimientos de la invención para la fermentación del vino puede ser una cepa de levadura del vino que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1, lo más preferentemente la secuencia que comprende el gen mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 1). En una forma de realización preferida de la invención, la cepa de levadura contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1 y una secuencia que codifica una enzima maloláctica, preferentemente que comprende el gen mae1 de S. pombe {Figura 3 o SEQ ID NO: 1) y el gen mleS de L. lactis (SEQ ID NO: 5). En otra forma de realización preferida de la invención, la cepa de levadura es una cepa de levadura del vino que contiene una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica una proteína Mae1, y una secuencia que codifica una enzima málica, lo más preferentemente la secuencia comprende el gen mae1 de S. pombe (Figura 3 o SEQ ID NO: 1) y el gen mae2 de S. pombe [SEQ. ID. NO: 7]. Los presentes inventores han demostrado que cepas de S. cerevisiae recombinante que contienen los genes mae1 y mae2 de S. pombe bajo el control de señales promotoras y terminadoras de S. cerevisiae degradan 8-9 g/1 de malato.

Ejemplos de cepas de levadura del vino que se pueden usar en los procedimientos de la invención son cepas del vino de S. cerevisiae y S. bayanus incluyendo las cepas de levadura del vino industriales Bourgovin RC 212, ICV 0-47, 71B-1122, KIV-1116 (Lallemande) "Prise de Mousse" (Lallemande EC 1118), Vin 7, Vin 13, N96, y WE352 {Dept. of Microbiology, University of Stellenbosch).

Las cepas de levadura de la presente invención que contienen una molécula de ácidos nucleicos que codifica una enzima maloláctica (por ejemplo, mies) serán útiles en la degradación de malato a L-lactato y CO_{2} durante la fermentación alcohólica (es decir, la fermentación maloláctica), mientras que las cepas de levadura que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima málica (por ejemplo, mae2) serán útiles en la degradación de malato a etanol y CO_{2} después de la fermentación alcohólica (fermentación maloetanólica). Las cepas de levadura que contienen una molécula de ácidos nucleicos que codifica una enzima maloláctica también pueden ser cepas sensibles al etanol. Estas cepas sensibles al etanol se pueden usar como co-cultivos junto con cepas de levadura del vino industriales.

Las cepas de levadura de la invención que son particularmente útiles en la fermentación del vino se pueden seleccionar basándose en su eficacia de fermentación usando una versión automatizada de un mini-fermentómetro como se describe por Reed y Chen (Am J Enol Vitic 29:165, 1978). Las cepas seleccionadas basadas en las pruebas de eficacia de la fermentación se pueden escalar para producciones de lotes y se pueden evaluar para parámetros tales como la eficacia de conversión, la tolerancia al frió, fase de adaptación a corto, tolerancia al etanol, tolerancia al SO_{2}, baja actividad espumante, degradación del malato, floculación al final de la fermentación, y resistencia a zimotoxinas asesinas. Los ensayos organolépticos también se pueden realizar usando procedimientos convencionales. Un vinatero puede seleccionar cepas para la fermentación maloetanólica o la fermentación maloláctica basándose en la composición del mosto y el estilo del vino.

Se apreciará que las moléculas de ácidos nucleicos, las células hospedadoras, y los procedimientos de la invención se pueden usar para mediar en la captación de malato, ácido succínico, o malonato en campos tecnológicos diferentes a la elaboración del vino. Por ejemplo, el incremento de la captación de malato y el metabolismo del malato usando moléculas de ácidos nucleicos de la invención para así incrementar la producción de etanol, puede ser útil en fermentaciones de vino y de zumo de frutas para la producción de licores alcohólicos tales como el brandy.

En plantas, el malato desempeña una función fundamental en la mayoría de orgánulos. El malato lleva a cabo las siguientes funciones importantes en plantas: (i) el malato es un intermedio en el ciclo del ácido tricarboxílico, y la acumulación de malato puede servir como energía respiratoria durante la noche; (ii) el malato es el almacén tanto para el CO_{2} como para los equivalentes de reducción en el CAM; (iii) una lanzadera de oxaloacetato-malato media en el transporte de los equivalentes de reducción al citosol o los peroxisomas, y puede actuar en la generación de NADH apoplástico que se usa en una reacción compleja para generar H_{2}O_{2} apoplástica; (iv) el malato se puede usar como sustancia osmótica; (v) la síntesis y degradación del ácido málico son componentes del mecanismo del estado del pH; (vi) la síntesis de malato equilibra la captación desigual de cationes o aniones por parte de las raíces; (vii) el malato es un componente importante del exudado de algunas raíces de plantas que incrementa la disponibilidad de fosfato en el suelo; y (viii) el malato modula la dependencia del voltaje del canal de aniones estomatal y puede ser parte del mecanismo sensor del CO_{2} (E. Martinoia y D. Rentsch, Acta. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 1994, 45: 447-67).

Las moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas Mae1, o equivalentes funcionales de proteínas Mae1, y opcionalmente genes que codifican enzimas involucradas en el metabolismo del malato en plantas como se describe en el presente documento), las células hospedadoras que contienen las moléculas de ácidos nucleicos, y las sustancias de la presente invención pueden ser útiles en la modulación del metabolismo del malato en plantas afectando de esa forma a una o más funciones como se ha descrito anteriormente. En particular, las moléculas de ácidos nucleicos, células hospedadoras, y sustancias de la presente invención pueden ser útiles en la modificación del transporte del malato en orgánulos de plantas tales como cloroplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas, y simbiosomas para afectar de esa forma al metabolismo del malato en los orgánulos. Las moléculas de ácidos nucleicos, células hospedadoras, y sustancias de la presente invención pueden ser útiles en la modulación de la eficiencia mediante la cual algunas plantas convierten el CO_{2} en carbohidratos. Además, el ácido málico desempeña un papel muy importante como reservorio energético en el ciclo diurno del metabolismo de plantas superiores. Por tanto, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden ser usadas en plástidos, cloroplastos, mitocondrias, y otros orgánulos de plantas superiores para controlar el metabolismo del malato que da lugar a la construcción de plantas de mayor eficiencia energética de interés agrícola u otro interés comercial.

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La invención se entenderá con mayor profundidad por referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, se pretende que los ejemplos sean meramente ilustrativos de formas de realización de la invención y no se deben interpretar como una limitación del alcance de la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y caracterización de la Mae1

Cepas y condiciones de crecimiento: Se usó la cepa de Escherichia coli HB101 (hsd20 leuB supE44 ara-14 galK2 lacYl proA2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 recA13 mcrB). Los procedimientos para la manipulación de las células y el ADN de Escherichia coli se basan en los de Sambrook y col. (1989). Además, también se usó en este estudio una cepa haploide de Schizosaccharomyces pombe 912 leu 1-32 h- (tipo silvestre), y un mutante mae1- haploide de S. pombe leu 1-32 T-h mae1- (Osothsilp y Subden, 1986b). Las células de levadura se crecieron en YE (2% de glucosa, 0,5% de extracto de levadura), MM (Alfa y col., 1993) más leucina y medio YEPD (1% de extracto de levadura, 2% de Bactopeptona, 2% de glucosa), suplementado con el 0,8% de ácido L-málico (Sigma, St. Louis, MO) si fuera necesario. Los transformantes se seleccionaron en YNB (0,17% de base nitrogenada de levaduras sin aminoácidos y (NH_{4}) SO_{4}, [Difco Laboratories, Detroit, MI], 0,5% de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2% de glucosa, 1,7% de bacto-agar [Difco Laboratories, Detroit, MI] y agar indicador de malato-glucosa (MGIA), descrito previamente por Osothsilp y Subden (1986b).

Transformación de levaduras: Las células de S. pombe se transformaron por electroporación (Prentice, 1992).

Electroforesis en gel de campo pulsado y transferencia de Southern: La transferencia cromosómica se realizó como se describe por Viljoen y col. (1994). En la transferencia de Southern se usaron procedimientos habituales (Sambrook y col., 1989). Se usó una membrana de nailon Hybond-N de 0,45 \mum (Amersham International, Buckinghamshire, RU). Se usó el kit de mareaje de ADN cebado aleatoriamente {Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) para el radiomarcaje de la sonda mae1.

Transferencia de Northern: El aislamiento del ARN se realizó según Viljoen y col. (1994). El ARN total se separó en un gel desnaturalizante al 0,8% de agarosa/formaldehido 2,2 M y se transfirió a una membrana de nailon Hybond-N de 0,45 \mum (Amersham International, Buckinghamshire, Rü) como se describe por Sambrook y col. (1989).

Clonación del gen mae1 : Se usó una librería genómica HindIII de S. pombe preparada en un vector lanzadera WH5 por Paul Young (Queen's University, Kingston, Ontario) para transformar la cepa de S. pombe leu1-32 mae1, h- según el procedimiento de Beach y col. (1982). Los transformantes se transfirieron a 100 \mul de medio indicador liquido MG1 (Osothsilp y Subden, 1986b). La complementación se determinó colorimétricamente y a continuación se confirmó mediante ensayos de la actividad transportadora (Osothsilp y Subden, 1986b).

Un subclon EcoR1 de 5,4 kb y un subclon Sma1 de 3,4 kb en pRS315 (Sikorski y Hieter, 1989) se transformaron en el mutante mae1 para determinar qué fragmento contenía el gen mae1.

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Análisis de la secuencia de ADN de mae1

Para secuenciar el fragmento clonado, se realizaron digestiones unidireccionales con la exonucleasa III (Sambrook y col., 1989). Los derivados de deleción se transformaron en E. coli (Tschumper y Carbón, 1980).

El plásmido de ADN se aisló a partir de los transformantes usando el método de lisis alcalina de Lee y Rasheed (1990) y se digirió con PvulI para determinar los tamaños de los fragmentos obtenidos. Los fragmentos solapados se seleccionaron por análisis de la secuencia de ADN {Tabor y Richardson, 1987) y el fragmento de ADN que contiene el gen mae1 se secuenció en ambas direcciones usando Sequenase v2.0 (US Biochemical Corp., Cleveland, OH). La secuencia de nucleótidos se analizó con el paquete de programas del Genetics Computer Group. Se realizaron búsquedas en la base de datos del Genbank usando los programas FASTA y TFASTA y usando BLAST sobre el servicio de archivos NCB1 (Altschul y col., 1990). Los segmentos transmembrana de la proteína mae1 se predijeron mediante los métodos de Eisenberg y col. (1984) y Rao y Argos (1986).

Ensayos del transporte para los ácidos L-málico y succinico: Se recogieron células de levadura en la fase de crecimiento logarítmica (DO de 1,2 a A_{595}) y se lavaron tres veces con KCl 0,1 M (pH 3,5). Las células se suspendieron en 4 mi de KC1 0,1 M (pH 3,5) y se almacenaron a 4ºC. Los ensayos del transporte se completaron en 3 h. Las suspensiones celulares se pre-incubaron durante 5 minutos en un baño de agua agitador a 30ºC a 100 rpm. Los ensayos se iniciaron añadiendo 25 \mul de L-malato marcado con ^{14}C (45 \muCi/\mumol) (Amersham), 100 \mul de ácido succínico (42 \muCi/\mumol) (ICN), 100 \mul de ácido malónico (56,7 \muCi/\mumol) (Du Pont) o 100 \mul de \alpha-cetoglutarato (51,8 \muCi/\mumol) (Du Pont). Se retiró una muestra de 0,5 ml a intervalos de 10, 20, 40, 60, y 120 segundos, se filtró rápidamente a través de membranas de 0,45 \mum (Millipore Corporation, Bedford, MA), y se lavó inmediatamente tres veces con cantidades de 5 mi de KC1 0,1 M enfriado en hielo (pH 3,5). Los filtros que contiene las células se secaron al horno a 50ºC y se pusieron en viales de centelleo que contienen 5 mi de mezcla de reacción de centelleo (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Se usaron células llevadas previamente a ebullición (5 min) para determinar la unión no específica del [^{14}C] malato, succinato, malonato y \alpha-cetoglutarato a las células de levadura.

Clonación y subclonación del gen mae1 : El gen mae1 se clonó a partir de una librería genómica HindIII de S. pombe por complementación de un mutante transportador. Osothsilp y Subden (1986b) generaron diversos mutantes de S. pombe que eran incapaces de utilizar el malato. Un subclon Sma1 de 3,4 kb fue el fragmento más pequeño capaz de restaurar completamente del transporte del L-malato en el mutante.

Localización cromosómica del gen mae1 : El análisis de Southern de geles CHEF (Figura 1) confirmó la localización del gen mae1 sobre el cromosoma 1 (Osothsilp, 1987). El análisis de la secuencia reveló que el gen mae1 está localizado 2842 pb en 5' al gen MFm1 (Davey, 1992) (Figura 2).

Secuencia de nucleótidos del gen mae1 : La secuencia del gen mae1 de S. pombe se ha enviado al GenBank con el número de acceso U21002 pero no está disponible al público o a cualquier otra persona distinta del solicitante sin la autorización del solicitante. En la Figura 2 se muestra un mapa de restricción del gen mae1. La secuencia de nucleótidos del gen mae1 de la invención se da en la Figura 3. El análisis de la secuencia de ADN reveló un marco de lectura abierto de 1314 pb. Las búsquedas de homología de la base de datos del GenBank v72.0 llevada a cabo para la secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de la proteína, no reveló ninguna similitud significativa con otras secuencias de ADN o proteínas. Una secuencia TATAT prominente repetida (cuatro veces) estaba localizada de -153 a -175 pb aguas arriba del codón ATG. Se encontró una repetición directa de 10 pb TCATTTTTTA separada por 9 pb en las posiciones -258 a -267 y -277 a -286.

Características de la proteína mae1 : Se ha predicho que el gen mae1 codifica una proteína de 435 residuos aminoácidos (aa) con un peso molecular predicho de 49 kDa aproximadamente. El perfil de hidropatía de la secuencia de aa deducida (Figura 4) reveló una proteína con N y C-términos hidrófilos y diez hélices putativas que se extienden a través de la membrana, típicas de proteínas de transporte de membrana. Los 36 aa N-terminales y los 65 aa C-terminales son altamente hidrófilos. No se encontró péptido señal en el N-término pero no se debe descartar la presencia de un péptido señal interno. Varias proteínas de membrana sin una secuencia señal en el N-término, por ejemplo, la arginina permeasa codificada por CAN 1 (Hoffmann, 1985) y la proteína GAL2 (Tschopp y col., 1986) de S. cerevisiae no contienen secuencia señal.

Los segmentos transmembrana de la proteína mae1 se predijeron mediante los métodos de Eisenberg y col. (1984) y Rao y Argos (1986).

Se construyó un modelo estructural para la malato permeasa mediante análisis por ordenador (Figura 5). Dos enlazadores hidrófilos prominentes, de 20 y 25 aa de largo, están localizados entre los dominios hidrófobos que se extienden a través de la membrana dos y tres, y siete y ocho, respectivamente. La longitud de los otros enlazadores hidrófilos abarca entre 7 y 12 aa.

Varios motivos conservados fueron reconocidos en la proteína mae1. En el extremo C-terminal se encuentra una región PEST (aa 421-434) bien conservada. Muchas proteínas con semi-vidas intracelulares inferiores a 2 h contienen una o más regiones PEST, que constan de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S), treonina (T) y en un menor grado ácido aspártico (Rogers y col., 1986).

Un motivo de cremallera de leucinas (aa 214 a 235), que consta de cuatro residuos leucina espaciados por 6 aa, está localizado entre los dominios que se extienden a través de la membrana seis y siete. La periodicidad de una leucina o isoleucina cada siete residuos (Landschulz y col., 1988) se ha observado en varias proteínas transportadoras (Bisson y col., 1993). En transportadores de la glucosa en mamíferos y en muchos de los transportadores fúngicos se encuentra un motivo de cremallera conservada en o cerca del segundo dominio transmembrana putativo (White y Weber, 1989). Se ha demostrado que estos motivos median en las interacciones proteína-proteína en diversos sistemas por medio de una estructura helicoidal enrollada. No se sabe si este motivo tiene alguna función en los transportadores. No obstante, en general existe un elevado grado de conservación de este motivo entre transportadores eucariotas (Bisson y col., 1993).

La proteína mae1 contiene tres sitios potenciales de glicosilación unidos a N localizados en los aa 193, 277 y 336. Los posibles sitios de fosforilación de la proteína quinasa C se encuentran en la posición 28: phvplSqrlkh y en la posición 94: ikypsTikdsw.

Expresión del gen mae1 : El análisis de Northern reveló que el gen mae1 codifica un único transcrito de 1,5 kb aproximadamente. La expresión del gen mae1 en presencia de glucosa, rafinosa o fructosa (Figura 6) reveló que el gen mae1 de S. pombe no estaba sujeto a la represión catabólica como se ha informado previamente para los genes de la malato permeasa de C. utilis (Cassio y Leao, 1993) y H. anomala (Corte-Real y Leao, 1990).

Transporte del ácido málico y ácido succinico mediante la permeasa mae1 de S. pombe : Los ensayos de transporte del ácido málico, succínico, malónico y \alpha-cetoglutárico se realizaron usando una cepa de tipo silvestre de S. pombe, un mutante mae1- y el mutante mae1- complementado con el gen mae1. El fragmento Sma1 de 3,4 kb que contiene el gen mae1 clonado en pRS315 restauró completamente el transporte de los ácidos L-málico (Figura 7 (a)), succínico (Figura 7(b)) y malónico en el mutante mae1-. El \alpha-cetoglutarato no fue transportado por ninguna de las cepas de S. pombe usadas en los ensayos de transporte.

Sousa y col. (1992) afirmaron que la inhibición competitiva de las velocidades de captación inicial del ácido L-málico por el ácido succínico, ácido D-málico, ácido fumárico, ácido oxaloacético, ácido \alpha-cetoglutárico, ácido maleico y ácido malónico sugiere que estos ácidos son transportados por el mismo transportador. Los resultados muestran que el gen mae1 de S. pombe codifica una permeasa general para el L-malato, succinato y malonato.

Estos datos muestran una permeasa de ácidos dicarboxílicos C_{4} en eucariotas.

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Ejemplo 2 Expresión funcional de los genes mae1 y mae2 de S. pombe en S. cerevisiae

S. cerevisiae no puede degradar eficazmente el malato debido a la ausencia de un transportador de malato, y una enzima málica con una baja afinidad por el sustrato. En contraste, S. pombe degrada el malato activamente puesto que la levadura contiene una permeasa para el malato y una enzima málica con una elevada afinidad por el sustrato (Figura 8). Las fusiones de lacZ demostraron que los promotores de los genes mae1 (SEQ ID NO: 1) y mae2 (SEQ ID NO: 3) de S. pombe no son funcionales en S. cerevisiae. Para expresar estos genes en S. cerevisiae, los marcos de lectura abiertos (ORFs) de mae1 y mae2 de S. pombe se subclonaron en cassettes de expresión que contienen las secuencias promotoras y terminadoras de la alcohol deshidrogenase (ADH1) y la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK1) de S. cerevisiae. Las diferentes construcciones empleadas en este estudio se listan en la Tabla 1.

Todos los plásmidos listados en la Tabla 1 se transformaron en la cepa de laboratorio YPH259 de S. cerevisiae (Sikorski, 1989). Las cepas de S. cerevisiae recombinantes que contienen el gen mae1 eran capaces de transportar activamente el L-malato (Figura 9), demostrando así la síntesis, la modificación post-traduccional correcta y la inserción de la proteína Mae1 de S. pombe Mae1 en la membrana plasmática de S. cerevisiae. Se investigó la capacidad de las cepas de S. cerevisiae recombinante, que contienen los genes mae1 y mae2 de S. pombe bajo el control de las señales promotoras y terminadoras de S. cerevisiae, para degradar 8-9 g/l de L-malato en medio basado en glicerol-etanol al 2% (condiciones respiratorias) y basado en glucosa al 2% (condiciones fermentativas) (Figs. 10 y 11).

Las cepas de levadura control YADH y YPGK sólo degradaron cantidades insignificantes de L-malato después de 22 días. Las cepas recombinantes YADH-mae1 y YPGK-mae1 que sólo contienen permeasa, mostraron una capacidad incrementada para degradar L-malato {Figs. 10 y 11) que probablemente se consiguió con la enzima málica nativa de S. cerevisiae. La degradación del L-malato mediante cepas recombinantes que contienen solamente la enzima málica de S. pombe, no fue significativamente diferente de la de las levaduras control. No obstante, cuando se introdujeron tanto el gen de la malato permeasa (mae1) como el gen mae2 de S. pombe, se produjo la degradación completa del
L-malato.

En medio glicerol-etanol al 2% y glucosa al 2%, la cepa recombinante MAL2 fue capaz de degradar completamente el L-malato el 7 y 19 días, respectivamente (Figs. 10 y 11). Comparada con MAL2, la cepa recombinante MAL1 degradó el malato menos eficazmente en ambos medios de glicerol-etanol y glucosa. Este fenómeno posiblemente se puede explicar por el hecho de que el gen mae2, bajo el control del promotor de ADH1 (MAL2), se expresa más intensamente que el gen mae2 bajo el control del promotor de PGK1 (MAL1). También es posible que la sobreexpresión de la proteína Mae1 pueda tener un efecto disruptor sobre la membrana celular de la levadura. Este efecto habría sido más severo en la construcción en la que el gen mae1 está bajo el control del promotor de ADH1 más fuerte.

La capacidad de las cepas MAL1 y MAL2 para metabolizar el L-malato difería considerablemente en el medio de glicerol-etanol y el medio de glucosa. Ambas cepas recombinantes se comportaron mucho más eficazmente en glicerol-etanol que en el medio de glucosa. En glicerol-etanol, el 92% (7 g/1) del L-malato fue degradado rápidamente en 4 días por la cepa MAL2 (Figura 10), mientras que en el medio de glucosa (Figura 11) esta cepa degradó el L-malato mucho más despacio; después de 4 días sólo el 27% del malato había sido degradado. La degradación completa del L-malato en medio de glucosa ocurrió sólo después de 18-19 días. Ni el promotor de PGK1 ni el promotor de ADH1 usados estaban sometidos a la regulación de la glucosa; la expresión de los genes mae1 y mae2 en el medio de glucosa se confirmó mediante análisis de transferencia de Northern y Western.

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Este estudio ha demostrado que S. cerevisiae requiere una permeasa para degradar eficazmente el malato. En contraste a numerosos intentos infructuosos en otras partes, se diseñó una cepa de S. cerevisiae por ingeniería genética que degrada hasta 8 g/l de L-malato en 7 días en condiciones aeróbicas.

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Ejemplo 9 Fermentación maloláctica en mostos de Cuba mediante una cepa modificada por ingeniería genética de S. cerevisiae

En el estudio resumido en este ejemplo se usaron los siguientes materiales y procedimientos:

Cepas y plásmidos: Las diferentes cepas y plásmidos empleados se listan en la Tabla 2.

Subclonación de los genes mae1 y mleS : Las manipulaciones del ADN se realizaron en el vector lanzadera de la levadura E. coli YEplacl81 (Gietz y Sugino, 1988). Se obtuvo el vector de expresión pHVX2 (Tabla 2) por subclonación de un fragmento HindIII a partir del plásmido pJC (Crous y col., 1995), que contiene las secuencias promotoras y terminadoras de PGK1 en el sitio HindIII de Yeplac181 (Figura 15). El ORF de mae1 se aisló como fragmento BalI-NdeI a partir del plásmido pJG1 (Grobler y col., 1996) y se subclonó en YEplac181 que contiene un sitio de clonación múltiple con los sitios de restricción EcoRI, BalI, NdeI y BglII. El ORF de mae1 se volvió a aislar en forma de fragmento EcoRI-BglII y se subclonó en el sitio EcoRIlBglII de pHvX2 para dar el plásmido pHV3 (Figura 15). La clonación y expresión del gen mleS de L. lactis en S. cerevisiae ha sido descrita previamente (Denayrolles y col., 1994).

Condiciones de cultivo: E. coli JM10 9 (Tabla 2) se creció en caldo Terrific {1,2% de triptona, 2,4% extracto de levadura, 0,4% de glicerol y 10% (v/v) de disolución tampón de KH_{2}PO_{4} 0,17 M y K_{2}HPO_{4} 0,72 M) a 37ºC. Los transformantes de E. coli se seleccionaron en medio LB (0,5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, 1% de triptona) suplementado con ampicilina.

Las células de levadura se cultivaron en medio YPD liquido (1% de extracto de levadura, 2% de bactopeptona, 2% de glucosa) a 30ºC. S. cerevisiae se transformó con los plásmidos pHV3 y pMDMALO juntos, así como con pHVX2, pHV3 o pMDMALO independientemente (Tabla 2). Los transformantes se aislaron sobre placas de agar YNB selectivas (0,17% de base nitrogenada de levadura (YNB) sin aminoácidos (aa) y sulfato de amonio [Difco Laboratories, Detroit, MI], 0,5% de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2% de glucosa y 1,7% de agar, suplementado con el 0,002% (p/v) de adenina, histidina y el 0,003% (p/v) de licina con o sin uracilo y leucina, o ambos. Los transformantes se cultivaron a una elevada densidad celular en medio líquido YNB maloláctico 10 a 30ºC, se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en zumo de uva estéril antes de la inoculación en mosto de uva.

Fermentación maloláctica en mostos de uva: Las cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen los diferentes plásmidos se inocularon a una concentración final de 2 \times 10^{6} células/ml en 200 ml de mosto (precalentado a 15-20ºC) en contenedores de vidrio de 250 mi. Los mostos de Cabernet Sauvignon (2,8 g/1 de L-malato) y Shiraz (3,2 g/1 de L-malato) se fermentaron a 20ºC y el mosto de Chardonnay (3,4 g/1 de L-malato) a 15ºC, sin agitación. Ambos mostos de uva roja y uva blanca se suplementaron con el 0,07 5% de fosfato de diamonio antes de la inoculación.

La concentración de malato durante la fermentación se midió enzimáticamente usando el kit de prueba L-Malic Acid Test Kit (Boehringer Mannheim, Alemania). La conversión de malato en lactato se visualizó por cromatografía en papel según procedimientos habituales. Se usó el recuento en placa sobre placas de agar YPD para determinar el número de células viables y el crecimiento de las cepas malolácticas de S. cerevisiae.

En este estudio se construyó una cepa recombinante de S. cerevisiae, que contiene tanto el gen mae1 de S. pombe (SEQ ID NO: 1) como al gen mleS de L. lactis (SEQ ID NO: 2). Se investigó la capacidad de la cepa recombinante para llevar a cabo la fermentación maloláctica en mostos de uva Cabernet Sauvignon, Shiraz y Chardonnay. La cepa de levadura recombinante (MLF1), que contiene tanto el gen mae1 de S. pombe como el gen mleS de L. lactis, degradó eficaz y rápidamente el L-malato a L-lactato en el mosto de uva en un periodo de tiempo significativamente corto (Figs. 12 y 13). Las cepas de levadura control, que sólo contienen el cassette de expresión de PGK1 (pHVX2), o el gen mleS (pMDMALO) o el gen mae1 (pHV3) bajo el control del promotor de PGK1, eran incapaces de degradar el L-malato en L-lactato y CO_{2}.

El metabolismo rápido y completo de 2,8 g/1 de L-malato en mosto de Cabernet Sauvignon se obtuvo en 3 días (Figura 12). En mosto de Chardonnay, 3,4 g/1 de L-malato se degradaron a lactato en 7 días a 15ºC. (Figs. 13 y 14). También se consiguió una fermentación maloláctica rápida (2 días) con la cepa recombinante en el mosto de la uva Shiraz.

La integración de los genes mae1 y mleS en los genomas de las cepas de levadura del vino debe producir cepas que sean capaces de degradar el malato en lactato y CO_{2} durante la fermentación alcohólica. Una aproximación alternativa es construir cepas malolácticas de S. cerevisiae sensibles al etanol que se pueden usar como co-cultivos junto con cepas de levadura del vino industriales. El uso de cepas malolácticas de S. cerevisiae sensibles al etanol durante la vinificación debe dar como resultado una degradación rápida y completa del malato en lactato. No obstante, se evitará la expansión de levaduras malolácticas en una bodega puesto que estas células de levadura morirán durante las últimas fases de la fermentación debido a la toxicidad del etanol. El completamiento temprano de la fermentación maloláctica en el vino es de gran importancia para los vinateros, puesto que las operaciones en la bodega pueden comenzar inmediatamente para evitar la oxidación y el deterioro del vino. La aplicación de cepas malolácticas de S. cerevisiae puede evitar retrasos con el embotellamiento temprano y almacenamiento del vino, inmediatamente después de la fermentación alcohólica.

Habiendo ilustrado y descrito los principios de la invención en una forma de realización preferida, aquellos expertos en la materia deben apreciar que la invención se puede modificar en el orden y los detalles sin apartarse de esos principios. Nosotros reivindicamos todas las modificaciones que entren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad en el mismo grado que si se indicase específica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorporase por referencia en su totalidad.

A continuación se exponen citas completas para algunas de las referencias mencionadas en la memoria descriptiva, y se proporcionan leyendas detalladas para algunas de las Figuras.

La solicitud contiene el listado de secuencias que forman parte de la solicitud.

TABLA 1 Construcciones usadas para diseñar por ingeniería genética una vía de degradación del malato en S. cerevisiae YPH259 (19)

1

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TABLA 2 Diferentes cepas y plásmidos empleados en la construcción genética de cepas malolácticas de S. cerevisiae

2

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Citas completas para las referencias mencionadas en la memoria descriptiva Referencias

(Estas referencias se incorporan en el presente documento por referencia a ellas).

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Leyendas de las Figuras detalladas para las Figs. 1 a 15

Figura 1. Transferencia cromosómica del gen mae1. Los cromosomas de S. pombe se separaron sobre un gel de CHEF (izquierda) y se probaron con una sonda con el fragmento Nsi1/Xho1 interno marcado de mae1 (derecha).

Figura 2. Mapa de restricción y estrategia de secuenciación del ADN para la región codificante y 3' del gen mae1 y del gen MFm1. Solamente se muestran los sitios de restricción únicos que se producen dentro del gen mae1. Los fragmentos de la exonucleasa solapados se generaron para la secuenciación como se indica por las flechas. Ambas hebras del gen mae1 se secuenciaron completamente mientras que sólo se secuenció una hebra del gen MFm1.

Figura 3. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida del gen mae1. Los nucleótidos están numerados a la izquierda, y los aminoácidos, designados por el código estándar de una sola letra, están numerados a la derecha. Las flechas que conectan los residuos 421 y 434 encierran una secuencia PEST; la serina y la treonina marcadas con un circulo son los sitios de fosforilación potenciales de la secuencia PEST. Los segmentos putativos que se extienden a través de la membrana se muestran en forma de cajas sólidas. Las asparaginas (N) marcadas con un circulo son posibles sitios de glicosilación. Las estrellas indican una cremallera de leucinas putativa. En el extremo 5' la caja "TATA" putativa está subrayada.

Figura 4. Diagrama de hidropatía de la proteína mae1 predicha. El perfil se determinó mediante el algoritmo de Kyte y Doolittle (1982) usando una ventana de 10 aa.

Figura 5. Modelo que muestra la distribución propuesta de los dominios de membrana hidrófobos que están numerados del 1 al 10. Los sitios de N-glicosilación (Y), el patrón de cremallera de leucinas (que conecta los dominios 6 y 7) y la región PEST (cilindro abierto próximo al extremo -COOH) están indicados sobre un modelo. El modelo se construyó a partir del análisis de la proteína mae1 usando los métodos de Eisenburg y col. (1984) y Rao y Argos (1986).

Figura 6. Transferencia de Northern del ARN total de S. pombe de tipo silvestre, probada con una sonda con el fragmento Ns1/Xho1 de mae1 de 695 pb. Las células se crecieron en glucosa (1), fructosa (2), fructosa tamponada con succinato 10 mM a pH 6,0 (3) o rafinosa (4) como única fuente de carbono.

Figura 7. Captación de [^{14}C] ácido L-málico (a) y [^{14}C] ácido succinico (b) por el tipo silvestre (\Delta), el mutante mae1- (\medcirc) y el mutante complementado (\Box). El transporte del ácido L-málico y el ácido succinico por el mutante fue completamente restaurado mediante la transformación de las células con el gen mae1. Se obtuvieron resultados similares cuando se usó [^{14}C] ácido malónico (datos no mostrados).

Figura 8. (A) S. cerevisiae no puede degradar eficazmente el malato debido a la ausencia de un transportador de malato y una enzima málica con una baja afinidad por el sustrato (K_{m} = 50 mM). (B) En contraste, S. pombe degrada el malato activamente puesto que esta levadura contiene una permeasa para el malato y otros ácidos dicarboxílicos C_{4}. Además, la afinidad por el sustrato de la enzima málica de S. pombe es considerablemente superior que la de la enzima de S. cerevisiae.

Figura 9. Captación de ^{14}C L-malato por cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen el gen mae1 de S. pombe bajo la regulación (A) del promotor de PGK1 y (B) el promotor de ADH1, según Grobler y col. (14). Las células se cultivaron hasta una DO_{600} = 0,6 en un medio de glucosa al 2%, que contiene el 0,17% de base nitrogenada de levadura [sin aminoácidos y (NH_{4})_{2}SO_{4}] y el 0,5% de (NH_{4})2S04, el 0,002% de adenina, uracilo e histidina y el 0,003% de lisina.

Figura 10. Degradación del malato por las cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen los genes mae1 y/o mae2 de S. pombe en medio glicerol-etanol al 2% que contiene 8-9 g/l de L-malato. El medio de glicerol/etanol y el medio de glucosa se suplementaron como se indica en la Figura 9. La concentración de malato durante la fermentación se midió enzimáticamente con el kit de prueba 1-malic Acid Test Kit de Boehringer Mannheim. La degradación del malato se consideró completa cuando la concentración alcanzó los 0,3 g/l de L-malato (en este punto durante la vinificación se consideró que la fermentación maloláctica se había completado).

Figura 11. Degradación del malato mediante las cepas recombinantes de S. cerevisiae que contienen los genes mae1 y/o mae2 de S. pombe en medio glucosa al 2% que contiene 8-9 g/l de L-malato. El medio de glicerol/etanol y el medio de glucosa se suplementaron como se indica en la Figura 9. La concentración de malato durante la fermentación se midió enzimáticamente con el kit de prueba 1-malic Acid Test Kit de Boehringer Mannheim. La degradación del malato se consideró completa cuando la concentración alcanzó los 0,3 g/1 de L-malato (en este punto durante la vinificación se consideró que la fermentación maloláctica se había completado).

Figura 12. Degradación del L-malato en mosto de uva Cabernet Sauvignon mediante cepas recombinantes de S. cerevisiae. La degradación del malato se consideró completa cuando la concentración alcanzó los 0,3 g/1 de L-malato (Martineau y col., 1995). La cepa MLF1 de S. cerevisiae que contiene el gen de la malato permeasa (mae1) de S. pombe y el gen maloláctico (mleS) de L. lactis degradó completamente el L-malato en el mosto de uva Cabernet Sauvignon. El malato no fue degradado por las levaduras control que contienen el cassette de expresión de PGK1 (pHVX2) o el gen mleS (pMDMALO) o el gen mae1 (pHV3) individualmente.

Figura 13. Degradación del L-malato en mosto de uva Chardonnay mediante cepas recombinantes de S. cerevisiae. La degradación del malato se consideró completa cuando la concentración alcanzó los 0,3 g/l de L-malato (Martineau y col., 1995). La cepa MLF1 de S. cerevisiae que contiene el gen de la malato permeasa (mae1) de S. pombe y el gen maloláctico (mleS) de L. lactis degradó completamente el L-malato tanto en el mosto de uva Cabernet Sauvignon como Chardonnay. El malato no fue degradado por las levaduras control que contienen el cassette de expresión de PGK1 (pHVX2) o el gen mleS (pMDMALO) o el gen mae1 (pHV3) individualmente.

Figura 14. La fermentación maloláctica mediante las cepas de levadura recombinantes de S. cerevisiae en vinos Cabernet Sauvignon (A) y Chardonnay (B) después de la fermentación. Los carriles A3 y B3 corresponden al mosto fermentado con MLF1. Los carriles uno y dos (A y B) corresponden a la levadura control que contiene sólo el cassette de expresión de PGK1 (pHVX2) o el gen mleS (pMDMALO), respectivamente.

Figura 15. Subclonación del ORF de mae1 de S. pombe bajo el control de las secuencias promotoras y terminadoras de PGK1 en pHVX2, un derivado de Yeplac181 (Sikorski y Hieter, 1989).

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Universidad de Stellenbosch

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Victoria Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Stellenbosch 7600

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: República de Sudáfrica

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

Nº DE TELÉFONO

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

Nº DE FAX

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CIUDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

Nº DE TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

Nº DE FAX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento y secuencia de nucleótidos para la transformación de microorganismos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX:

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2460 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Schizosaccharomyces pombe

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mae1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 439 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1927 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactococcus lactis

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: EML

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 522 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2686 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactococcus lactis

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: mleS

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

13

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 541 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

LONGITUD: 2422 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Schizosaccharomyces pombe

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: mae2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍ STICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARECTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LONGITUD: 566 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

Claims (35)

1. Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a (i);

(iii) secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i),

que codifica una malato permeasa eucariota de S. pombe que media en la captación de L-malato, succinato, y malonato.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una molécula de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1 en la que la proteína contiene una región PEST, y un motivo de cremallera de leucinas.

3. Una molécula de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1 que comprende

(i) una secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO: 1 o la Figura 3, en la que la T también puede ser U;

(ii) secuencias de ácidos nucleicos complementarias a (i), preferentemente complementarias a la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3;

(iii) una secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico de (i), o

(iv) una secuencia de ácidos nucleicos que difiere de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) en las secuencias del codón debido a la degeneración del código genético.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Una sonda de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 1, que codifica al menos 6 ácidos nucleicos secuenciales a partir de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la Figura 3.

5. Un procedimiento de aislamiento de un ácido nucleico según la reivindicación 1 que comprende la puesta en contacto de un ácido nucleico que contiene la muestra con una sonda según la reivindicación 4 en condiciones que permiten la hibridación de la sonda con una molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, si está presente en la muestra, y el aislamiento de la molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión recombinante adaptado para la transformación de una célula hospedadora que comprende una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una célula hospedadora eucariota transformada con un vector de expresión recombinante según la reivindicación 6.

8. Una célula hospedadora eucariota según la reivindicación 7, dicha célula que tiene integrado en su genoma dicha molécula de ácidos nucleicos.

9. Una célula hospedadora eucariota que tiene integrado en su genoma una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima maloláctica.

10. Una célula hospedadora eucariota que tiene integrado en su genoma una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima málica.

11. Una célula eucariota transformada con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima maloláctica.

12. Una célula eucariota transformada con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende la malato permeasa codificada por la molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una enzima málica.

13. Una célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en la que la célula degrada el L-malato durante la fermentación alcohólica.

14. Una célula de Saccharomyces según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en la que la célula degrada el L-malato durante la fermentación alcohólica del vino.

15. Una célula de levadura según la reivindicación 9 u 11, en la que la célula es útil en la degradación del L-malato a L-lactato y CO_{2} durante la fermentación alcohólica.

16. Una célula de levadura según la reivindicación 10 ó 12, en la que la célula es útil en la degradación del L-malato a etanol y CO_{2} durante la fermentación alcohólica.

17. Una célula eucariota según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 que es una célula de levadura.

18. Una célula eucariota según una cualquiera de las reivindicaciones 7 al 17 que es Saccharomyces.

19. Una célula eucariota según la reivindicación 18 que es S. cerevisiae o S. bayanus.

20. Un procedimiento de incremento de la captación de L-malato, ácido succinico o malonato en una célula que comprende la transformación de la célula con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

21. Un procedimiento para dotar a un microorganismo de la capacidad de degradar el malato que comprende la transformación del microorganismo con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

22. Un procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que el microorganismo es una cepa de levadura.

23. Un procedimiento de degradación del malato, que comprende el cultivo, en presencia de malato, de un microorganismo que ha sido transformado con una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

24. Un procedimiento de degradación del malato que comprende el cultivo, en presencia de malato, de una célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 7 al 19.

25. Un procedimiento de degradación del malato durante la fermentación del vino, cuyo procedimiento comprende el cultivo, en mostos de uva que contienen malato, de una cepa de levadura según la reivindicación 17, 18
ó 19.

26. Un procedimiento de fermentación del vino, que incluye el cultivo, en un medio de fermentación del vino que incluye un mosto de uva que contiene malato, de una cepa de levadura según la reivindicación 17, 18 ó
19.

27. Un procedimiento según la reivindicación 22, 25 ó 26, en el que la cepa de levadura es una cepa de Saccharomyces.

28. Un procedimiento para la preparación de una proteína que media en la captación de L-malato, succinato y malonato, que comprende (a) la transferencia de un vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 a una célula hospedadora; (b) la selección de las células hospedadoras transformadas entre las células hospedadoras no transformadas; (c) el cultivo de una célula hospedadora transformada seleccionada en condiciones que permiten la expresión de la proteína; y (d) el aislamiento de la proteína.

29. Una proteína aislada caracterizada porque está codificada por una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

30. Una proteína aislada según la reivindicación 29, caracterizada porque tiene parte o toda la conformación estructural primaria y la actividad enzimática de la malato permeasa de S. pombe.

31. Una proteína aislada según la reivindicación 30, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o en la Figura 3.

32. Una proteína aislada según la reivindicación 29, 30 ó 31, que es un truncamiento de la proteína o una isoforma de la proteína y sus truncamientos, que tiene actividad malato permeasa.

33. Anticuerpos que tienen actividad específica contra un epítopo de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. Un procedimiento para la detección de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, que comprende la puesta en contacto de una muestra con un anticuerpo según la reivindicación 33.

\newpage

35. Un procedimiento para la identificación de una sustancia que media en el transporte del L-malato, succinato o malonato que comprende la incubación de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 con un sustrato de la proteína, y una sustancia de prueba que se sospecha que afecta a la actividad de la proteína, y la determinación del efecto de la sustancia comparándola con un control.