ES2336992A1 - Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la produccion de alcaloides indolicos. - Google Patents
Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la produccion de alcaloides indolicos. Download PDFInfo
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Abstract
Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la producción de alcaloides indólicos. Composición que comprende ciclodextrinas y jasmonato de metilo, y método para incrementar la producción de alcaloides indólicos en cultivos de células vegetales, tejidos de plantas, vitroplantas y plantas que son capaces de sintetizar estos compuestos, excretarlos y acumularlos en el medio de cultivo.
Description
Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de
metilo para incrementar la producción de alcaloides indólicos.
La presente invención se encuentra dentro de la
biología y de la biotecnología, y se refiere al empleo de una
composición que comprende ciclodextrinas y jasmonato de metilo para
incrementar la producción de alcaloides indólicos en cultivos de
células vegetales, tejidos de plantas, vitroplantas y plantas que
son capaces de sintetizar estos compuestos, excretarlos y
acumularlos en el medio de cultivo.
Los alcaloides son uno de los grupos más
diversos de metabolitos secundarios encontrados en los organismos
vivos, aislándose tradicionalmente de las plantas, de las cuales
alrededor del 20% los contienen, pero encontrándose también en
animales, insectos, invertebrados marinos y microorganismos. De los
aproximadamente 12000 alcaloides conocidos, una gran cantidad han
sido empleados en la medicina, y muchos de ellos aún son prominentes
fármacos hoy en día. De acuerdo con su origen biogenético se
clasifican en cuatro grupos:
- 1)
- alcaloides derivados de aminoácidos tales como ornitina/arginina, lisina, histidina, fenilalanina/tirosina, triptofano, y del ácido antranílico y el ácido nicotínico;
- 2)
- alcaloides purínicos;
- 3)
- terpenos aminados, y
- 4)
- alcaloides policétidos.
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Dentro del grupo de los alcaloides derivados del
triptofano se encuentran los indólicos (que se pueden agrupar, a su
vez, en monoterpernos o indol terpenos (iridoides)) y los
quinoleínicos. La mayor parte proceden de la triptamina, producto de
la descarboxilación del triptofano, que se une en casi todos los
casos a otras unidades como son las unidades acetato, mevalonato,
secologanósido (aldehído monoterpénico) y otras. Podemos por tanto
hablar de varios subgrupos dentro de los alcaloides indólicos. Así,
desde un punto de vista químico se pueden reconocer 8 subgrupos:
corinante, aspidosperma, iboga, estricnano, plumerano, eburnano,
valesiacontamano y aparicino. Otra posible clasificación sería:
- a)
- Alcaloides simples, derivados normalmente de la triptamina.
- b)
- Alcaloides derivados de la \beta-carbolina, biogenéticamente formados por condensación de un aldehído o cetoácido con la triptamina.
- c)
- Alcaloides procedentes de la ciclación de la triptamina, como la eserina o fisostigmina del Haba del Calabar (Physostigma venenosum).
- d)
- Alcaloides derivados de la ergolina, su estructura química corresponde a la unión de un indol con una quinoleína hidrogenada, aquí se encuentran los alcaloides del cornezuelo de centeno (Claviceps purpurea).
- e)
- Alcaloides indolmonoterpénicos, proceden de la unión de la triptamina con el secologanósido.
- f)
- Alcaloides quinoleínicos, biogenéticamente incluidos en el subgrupo anterior ya que su biosíntesis se realiza a partir del triptófano por unión al secologanósido vía estrictosidina pero químicamente su estructura deriva de la quinoleína.
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Los alcaloides indolmonoterpénicos ó monoterpén
indólicos (AMIs) conforman una familia de más de 3.000 miembros,
encontrándose en varias familias vegetales, pero principalmente en
las Apocynaceae, Loganiaceae, Nissaceae y Rubiaceae,
todas del orden Gentianales. Los AMI's se forman a partir del
triptofano y de la secologanina, un derivado del isopentenil
pirofosfato. El interés en ellos se debe a que algunos,
específicamente la catarantina y la vindolina, pueden formar dímeros
citotóxicos que se utilizan en los tratamientos contra diferentes
tipos de cánceres.
Catharanthus roseus (L.) G. Don es una
planta perenne de la familia de las Apocinaceas de distribución
pantropical originaria de Madagascar, capaz de biosintetizar más de
130 metabolitos secundarios de naturaleza alcaloide, usada en la
medicina tradicional como agente hipoglucémico, siendo además una
fuente importante de agentes quimioterapéuticos con actividad
anticancerígena, y que produce una gran variedad de AMIs, la mayoría
de los cuales poseen actividad farmacológica, se cultiva para
obtener industrialmente, a partir de sus hojas, los alcaloides
anticancerígenos vincristina, vinblastina y anhidrovinblastina
mientras que sus raíces se utilizan como materia prima para la
extracción de los alcaloides serpentina y ajmalicina, prescritos
para los tratamientos de hipertensión y desordenes circulatorios
(Karthikeyan et al., 2007. Journal of Zhejiang University
- Science B 8(7): 453-457) Jaleel &
Panneerselvam, 2007. Chin J Pharm Tox 21, 6,
487-494). Estos metabolitos se extraen de los
diferentes tejidos de esta planta y las rutas biosintéticas que
conducen a su obtención se conocen y están bien descritas en la
bibliografía (El-Sayed M & Verpoorte R, 2007.
Photochem. Photobiol 6(2-3):
277-305). La principal demanda de hojas la realiza
Estados Unidos y Reino Unido que movilizan más de 100 toneladas
anuales mientras que Alemania se interesa por la compra de las
raíces (Acosta y Rodríguez, 2002, Instructivo técnico para el
cultivo de Catharanthus roseus (L.) G. Don. Rev.
Cubana Plant. Med. 7, 96-99).
Entre los alcaloides más importantes producidos
por C. roseus están los del tipo
bis-indólico que incluyen a la vinblastina,
utilizada en el tratamiento del mal de Hodgkin, y a la vincristina
empleada en el tratamiento de la leucemia; esta planta también
produce los agentes antihipertensivos ajmalicina y serpentina
utilizados contra las arritmias cardiacas y el mejoramiento de la
circulación cerebral.
Los alcaloides más importantes desde el punto de
vista económico son la vinblastina y la vincristina. En la
actualidad, estos compuestos se obtienen mediante un proceso
extractivo de la materia prima vegetal ya que no existen preparados
sintéticos que puedan reemplazar la potente acción antineoplásica
que exhiben la vincristina y la vinblastina. Este proceso de
extracción es de baja productividad (rendimiento) ya que a partir de
2 toneladas de hojas se recoge 1 gramo de alcaloide activo, cantidad
requerida para el tratamiento de un niño con leucemia o linfosarcoma
durante seis semanas (Cuellar et al., 1975. Rev. Cubana
Farm. 9, 183-199). El precio de la vinblastina
en el mercado es de aproximadamente un millón de dólares por
kilogramo, calculándose que existe una producción anual de 12 Kg.
Por otra parte, la vincristina alcanza un precio de 3.5 millones de
dólares por kilogramo y su producción anual es de aproximadamente 1
kilogramo. El alto costo de estos alcaloides se debe a que
encuentran en concentraciones muy bajas en la planta (alrededor de
0.0005% en peso seco) y su extracción se lleva a cabo en presencia
de otros 200 alcaloides con propiedades químicas y físicas similares
(De Luca & Laflamme, 2001. Curr. Opi. Plant Biol. 2001,
3, 225-233). La complejidad de los procesos
genéticos, catalíticos y de transporte de la biosíntesis de los
alcaloides monoterpénicos indólicos hace difícil la obtención de
estos compuestos.
Otro método para la obtención de estos
compuestos y que ha resultado tener cierto éxito es el de
semi-síntesis mediante el acoplamiento de los
precursores vindolina (muy abundante en las plantas de C.
roseus) y catarantina (que puede alcanzar niveles altos en
cultivos celulares de C. roseus) dando lugar a la
vinblastina. Pero para sintetizarlos de novo hace falta la
intervención de más de 50 pasos metabólicos, habiéndose
caracterizado hasta el momento solamente unas 20 enzimas de las 50
requeridas para su biosíntesis.
La biosíntesis de los alcaloides
bis-indólicos se inicia con la condensación de la
catarantina y la vindolina, para formar la
3',4'-anhidrovinblastina, el precursor de la
vinblastina, la vincristina, la leurosina y la Catarina. Esta
reacción, al igual que la oxidación posterior, parece ser llevada a
cabo por peroxidasas inespecíficas, lo que parece indicar que la
limitante de la biosíntesis de este tipo de alcaloides resulta ser
la disponibilidad de los precursores monoméricos.
Recientemente se ha purificado una enzima que
cataliza específicamente dicho paso y ha sido denominada
\alpha-3', 4'-anhidrovinblastina
sintasa (AVLBS). Esta enzima, dependiente de H_{2}O_{2}, que ha
sido purificada a homogeneidad aparente (192 veces) a partir de
hojas de C. roseus, tiene una masa molecular de 45.4 kDa y un
pH óptimo de 6.5, si bien también presenta una actividad sustancial
en el rango de pH de 4 - 5, el cual es el rango de pH comúnmente
determinado en las vacuolas. Además de su actividad de AVLBS la
enzima pura tiene actividad de peroxidasa. Su espectro visible de
absorbancia muestra máximos de absorción a 404, 501 y 633 nm
sugiriendo que se trata de una proteína con hierro en un grupo hemo
y que pertenece a la familia de las peroxidasas (Sottomayor et
al., 1998. FEBS Lett. 428: 299-303).
Encontrar los aspectos que intervienen en la
regulación de su biosíntesis a nivel celular y molecular, o
encontrar un método que incremente la producción de sus metabolitos
intermediarios, resulta de especial interés tanto desde el punto de
vista económico como farmacéutico.
Los cultivos in vitro de raíces y
suspensiones celulares constituyen una alternativa a los métodos
clásicos de extracción convencional a partir de materia prima
vegetal, aunque hasta el momento actual se han realizado con escaso
éxito comercial ya que el principal cuello de botella en la
obtención de estos alcaloides por cultivo in vitro se
encuentra en su producción dependiente de tejidos específicos de la
planta (Verpoorte & Memelink., 2002. Curr. Opi. Biotech.
13:181-187). Así, en la bibliografía se describen
los cultivos de brotes de C. roseus como aquellos capaces de
acumular catarantina, vindolina y otros alcaloides en cantidades
similares a los que se extraen de materia prima vegetal. Otra
alternativa biotecnológica para la producción de estos compuestos
consiste en el empleo de cultivos celulares sometidos a extracción.
Así, mediante la adición de ciertos agentes extractores abióticos
como una fuente nitrogenada produce un aumento de la síntesis de
alcaloides (Sreevalli Y et al., 2004. Ind. Crops Prod.
19: 191-195), la exposición a la luz UV incrementa
la producción de catarantina y vindolina en suspensiones celulares
(Ramani S & Chelliah, J, 2008. BMC Plant Biology 7:61), y
los factores bióticos como la adición de jasmonato de metilo (MeJA)
a suspensiones celulares de C. roseus, suplementadas con los
precursores de la ruta de biosíntesis adecuados, aumentan la
expresión de los genes implicados en la biosíntesis de indol
alcaloides y por lo tanto su producción (Vasconsuelo & Boland,
2007. Plant Science 172:861-875).
En la bibliografía se recogen diferentes
procedimientos en los que se pretende incrementar la producción de
metabolitos secundarios utilizando cultivos celulares. Así, se ha
descrito el empleo de ácido alkanoico (ácido propiónico o butírico)
o una sal metálica de estos ácidos, ejemplificado en cultivos
celulares del género Taxus (WO
2005064002-A1), el tratamiento de la suspensión
celular con un adsorbente y uno o más agentes extractores adecuados
que incrementen la producción (WO 2005012507-A1), la
adición de agentes extractores al final de la fase exponencial del
crecimiento, añadiendo compuestos que estabilizan la viabilidad
celular y el aporte de nutrientes a las suspensiones celulares
(poliaminas, prolina, ergosterol, sacarosa, calcio, nitrato
potásico, etc...) (EP378921-A).
En el caso concreto de cultivos celulares de
C. roseus, la solicitud de patente internacional
W08800968-A describe la inducción de metabolitos
(alcaloides, hormonas esteroideas y glicósidos cardiacos) mediante
la adición al cultivo celular de un compuesto osmóticamente activo
como una sal o un azúcar. Además se describe un nuevo proceso para
el aislamiento de alcaloides a gran escala a partir de hojas
liofilizadas de C. roseus. Con este procedimiento que parte
de 1 kilogramo de hojas secas se obtienen 0.4 gramos de catarantina,
0.4 de leurosina y 0.8 de vindolina por lo que el rendimiento del
proceso es considerado ventajoso frente a los descritos en otras
patentes debido al alto valor añadido que poseen estos compuestos.
En la patente US 5037977 se describe una mejora de un método por el
que se incrementa la productividad de las drogas antineoplásicas
vinblastina, leurosideno y 3',4'-anhidrovinblastina.
Concretamente el procedimiento para mejorar la producción de
vinblastina se caracteriza por una reacción de catarantina con
vindolina en presencia de sales de hierro III, luego
eliminar/inactivar el hierro permitiendo que un agente reductor
reaccione con el compuesto resultante y otra serie de reacciones
concretas que llevan a la síntesis de estas moléculas. De manera
similar se describen procedimientos para incrementar la producción
de leurosideno y 3',4'-anhidrovinblastina. En todos
ellos se trata de reacciones químicas en las que se parte de
compuestos químicos catarantina y vindolina no obtenidos por cultivo
in vitro ni de plantas, ya que se trata de las sales de
sulfato de catarantina y de una solución hidroclorada de
vindolina.
En Xu & Dong, 2005. (Enzyme Microb.
Technol. 36: 280-284) suspensiones de células
vegetales de C. roseus son extraídas con paredes celulares de
Aspergillus niger para inducir la activación de una enzima
responsable de la biosíntesis de fenilalanina (PAL) y la síntesis de
catarantina en las células, sugiriendo que en esta última la ruta de
señalización implica especies reactivas de oxígeno. Es también
destacable las experiencias de producción de catarantina, serpentina
y ajmalicina publicadas por Zhao et al., 2001 (Enzyme
Microb. Technol. 28:673-681), en las que
utilizando una combinación de agentes extractores observa un efecto
sinérgico en la acumulación de alcaloides indólicos tanto en las
células cultivadas en suspensión como en los medios de extracción.
Así, describen los valores de producción más elevados de catarantina
cuando extraen las suspensiones celulares en presencia de malato (40
mg/l) y alginato sódico (1.5% p/v) tanto en células (0.57 mg/g peso
seco) como en el medio de cultivo (25.2 mg/l). En estas condiciones
también se recogen valores elevados de serpentina y ajmalicina en
células (0.28 y 0.84 mg/g peso seco) y en el medio de cultivo (4.4 y
35 mg/l).
Tenido en cuenta el papel beneficioso de los
alcaloides indólicos sobre la salud humana es importante poder
disponer de una fuente biológica adecuada y de un procedimiento que
permita la obtención de estos compuestos en cantidades suficientes
para satisfacer la demanda.
Los autores de la presente invención han
desarrollado un método que incrementa la producción de alcaloides
indólicos en cultivos de células vegetales que son capaces de
sintetizar estos compuestos, excretarlos y acumularlos en el medio
de cultivo, mediante el tratamiento combinado de ciclodextrinas con
jasmonato de metilo.
El tratamiento combinado con ambos agentes
extractores tiene un efecto sinérgico en la producción de alcaloides
indólicos, originando una mayor producción de catarantina en C.
roseus que el tratamiento con dichos agentes extractores por
separado. Así, mediante el tratamiento de C. roseus cv. First
Kiss Apricot con ciclodextrina metilada al azar (CDMA)+MeJA se
alcanzaron valores de 5056 \mug/g peso seco de catarantina, lo que
incrementa hasta 5.5 veces más la producción que si se utilizan
separadamente MeJA (912 \mug/g peso seco) o CDMA (965 \mug/g
peso seco). En cuanto a la producción de ajmalicina también se
observó un mayor incremento con respecto a C. roseus (L.) G.
Don, alcanzándose valores de 3368 \mug/g peso seco cuando se
extrae con el tratamiento combinado CDMA y MeJA.
El incremento de la síntesis de alcaloides
indólicos se ejemplifica en varios cultivares de C. roseus
(L.) G. Don, una de las especies productoras de indolalcaloides más
importantes, por su capacidad de sintetizar más de 130 compuestos de
naturaleza alcaloide, y por la especial relevancia de estos
alcaloides en la salud humana.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención es el método de obtención de alcaloides indólicos, que
comprende:
a) la adición de ciclodextrinas y jasmonato de
metilo a un medio de cultivo,
b) la adición de células potencialmente
productoras de alcaloides indólicos al medio de cultivo de a),
c) la incubación de las células del paso b) en
el medio de cultivo del paso a),
d) la separación de los alcaloides indólicos
obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
Las células potencialmente productoras de
alcaloides indólicos pueden provenir de hojas, tejidos u órganos que
han sido establecidas previamente ,o no, en cultivo in vitro.
Por tanto, se entiende por células potencialmente productoras de
alcaloides indólicos, cualquier línea celular capaz de producir
indolalcaloides, bien de forma natural o tras modificación
genética.
Cualquier órgano, tejido o célula vegetal capaz
de producir indolalcaloides puede ser empleado en la invención. Esto
incluye aquellas células procedentes de un organismo que, aunque no
posean de forma natural la capacidad de sintetizar alcaloides
indólicos, ha adquirido dicha capacidad mediante procesos de
manipulación genética. En una realización preferida, son tejidos o
células vegetales procedentes de plantas de especies del orden
Gentianales. En otra realización más preferida pertenecen a
las familias Apocynaceae, Loganiaceae, Nissaceae y
Rubiaceae. En otra realización aún más preferida, pertenecen
al género Catharanthus, y en otra realización particular de
la invención, pertenecen a la especie C. roseus (L.) G.
Don.
El término "planta" u "organismo"
incluye partes, tejidos, células o protoplastos procedentes de la
planta o del organismo, cultivos de células, cultivos de tejidos,
callos, óvulos, embriones y semillas procedentes en última instancia
de la planta o el organismo.
Taxonómicamente C. roseus (L.) G. Don. se
define como un organismo celular, que pertenece al supereino
Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta,
orden Gentianales, familia Apocynaceae, Subfamilia
Rauvolfioideae, tribu Vinceae, género
Catharanthus.
El término "cultivo de células" en esta
memoria, hace referencia a un cultivo de células aisladas del mismo
o diferente tipo de tejido, o una colección de tales células
organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos
tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo,
cultivos de protoplastos, callos (grupo de células vegetales
indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y células
vegetales que están aisladas de plantas o partes de las plantas,
tales como embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen,
hojas, raíces, raíz inclina, antera, pistilo, flor, semilla, vaina o
vástago de la planta.
También se entienden como células productoras de
indolalcaloides aquellas que provienen de vitroplantas, órganos o
tejidos de dichas vitroplantas, y específicamente, de vitroplantas,
órganos o tejidos de vitroplantas de C. roseus. Ensayos que
han realizado los inventores demuestran que la extracción, en el
medio de cultivo que comprende ciclodextrinas y jasmonato de metilo,
de hojas de vitroplantas de C. roseus da lugar a una mayor
producción de metabolitos secundarios que cuando se extraen hojas
procedentes de plantas de invernadero. Por tanto, en una realización
preferida, las células potencialmente productoras de alcaloides
indólicos proceden de vitroplantas, y más preferiblemente, de
vitroplantas del orden Gentianales, y más preferiblemente, de
vitroplantas que se seleccionan de las familias Apocynaceae,
Loganiaceae, Nissaceae y/o Rubiaceae, más
preferiblemente, de vitroplantas procedentes de plantas del género
Catharanthus, y más preferiblemente vitroplantas
procedentes de plantas de C. roseus. Aún más preferiblemente,
proceden de las hojas de dichas vitroplantas.
El jasmonato de metilo es un regulador del
crecimiento, modulando múltiples aspectos del desarrollo de las
plantas (maduración de frutos, viabilidad del polen, crecimiento de
la raíz, curvatura de los zarcillos) y que promueve el
envejecimiento foliar, produciendo senescencia. Parece actuar de
forma específica sobre la expresión de genes implicados en la
defensa de las plantas a ataques de insectos y patógenos y genes que
codifican para proteínas de reserva.
En otra realización preferida de la presente
invención la concentración de jasmonato de metilo es de entre 5 y
500 micromoles/por litro de medio de cultivo. Más preferiblemente la
concentración de jasmonato de metilo es de entre 25 y 150
micromoles/L medio de cultivo y aun más preferiblemente de entre 75
y 125 micromoles/L medio de
cultivo.
cultivo.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos
que se forman en algunos procesos de degradación del almidón. A
veces también son llamadas cicloamilosas. Presentan un exterior
hidrofílico y una cavidad interior hidrofóbica donde pueden atrapar
moléculas orgánicas no polares. Para cambiar las propiedades físicas
y químicas de las ciclodextrinas se han desarrollado diversos
derivados. Unos de los más utilizados son los derivados parcialmente
metilados que tienen una solubilidad en agua hasta 150 veces
superior a la del producto de partida.
Así, en otra realización preferida de la
invención las ciclodextrinas se eligen del grupo que comprende
cliclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) o ciclodextrina
hidroxipropilada (CDHA).
Preferiblemente, el grado de sustitución por
metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMA es de entre 1 y
3. En particular, el grado de sustitución por metilos por unidad de
glucosa (anhidra) de la CDMA es de 2. En otra realización preferida
de este aspecto de la invención un maltooligosacárido cíclico
constituido por 7 unidades de D-glucosa unidas por
enlaces glucosídicos de tipo \alpha (1 \rightarrow 4)
(\beta-ciclodextrinas).
En otra realización preferida de este aspecto de
la invención la concentración de ciclodextrinas es de entre 6.5 y
130 g/L medio de cultivo. Más preferiblemente la concentración de
ciclodextrinas es de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo y aún más
preferiblemente es de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo.
En otra realización preferida de la invención,
la concentración celular es de entre 10 g de peso fresco/litro, 1 g
de peso seco/litro y 400 g de peso fresco/litro, 20 gramos de peso
seco/litro. Más preferiblemente, la concentración celular es de
entre 75 g de peso fresco/litro, 4 g de peso seco/litro y 300 g peso
fresco/litro, 15 g de peso seco/litro, y aún más preferiblemente es
de entre 100 peso fresco/litro, 5 g de peso seco/litro y 250 g de
peso fresco/litro, 12 g de peso seco/litro.
La irradación de las suspensiones celulares que
comprenden jasmonato de metilo y ciclodextrina, con luz UV a 254 nm,
en agitación continua para evitar, en la medida de lo posible, que
las células sedimentaran y la exposición al tratamiento con luz UV
fuera real, dio lugar a un incremento de la producción de
alcaloides. Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto
de la invención, el medio de cultivo del método de la invención, que
contiene las suspensiones de células potencialmente productoras de
alcaloides indólicos y la combinación de ciclodextrinas y jasmonato
de metilo, se somete a luz UV. Los ensayos se realizaron con
irradiaciones cortas de 15 minutos, y también con tiempos largos de
120 minutos. Los mejores resultados se obtuvieron con tiempos de
irradiación cortos, por lo que preferiblemente, se somete a luz UV
durante tiempos cortos de entre 5 y 30 minutos.
Tanto durante la irradiación de 15 minutos como
en la de 120 minutos horas las suspensiones deben permanecer en
agitación continua para evitar, en la medida de lo posible, que las
células sedimenten y no reciban la exposición al tratamiento con luz
UV.
Tal y como se observa en los ejemplos, el
oxígeno parece ser un factor limitante en la producción de
indolalcaloides a partir de suspensiones celulares, pues existe un
aumento de acumulación extracelular de ajmalicina, serpentina y
catarantina en matraces de capacidad 1000 ml respecto a los de 250
ml. Se ha visto que la mayor producción tiene lugar a valores
cercanos a la saturación, siendo necesario en el caso de la
catarantina, valores de concentración de oxígeno en el medio
superiores al 40% para que sea excretada al medio. Así, otra
realización preferida de este aspecto de la invención, la
concentración de oxígeno en el medio es de entre un 40% y un
100%.
En otro aspecto de la invención se proporciona
una composición que comprende MeJA y ciclodextrinas. Otro aspecto de
la invención se refiere al uso de la composición que comprende MeJA
y ciclodextrinas para promover la producción de alcaloides indólicos
en células productoras de los mismos. Un último aspecto de la
invención se refiere al uso combinado de jasmonato de metilo y
ciclodextrinas para promover la producción de alcaloides indólicos
en células productoras de los mismos.
Fig. 1. Estudio de la producción de
indolalcaloides mediante análisis cromatográfico
(HPLC/UV-VIS) de medios de cultivo de C.
roseus (L.) G. Don tras 96 horas de incubación utilizando una
densidad celular elevada (230 g de peso fresco/litro, 9.2 g de peso
seco/litro). Se muestra un experimento representativo de 3 réplicas
biológicas.
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Producción de serpentina excretada al
medio de cultivo por suspensiones celulares de C. roseus en
respuesta a los diferentes agentes extractores bajo las condiciones
descritas en la Fig. 1, tras 96 h de incubación utilizando una
densidad celular elevada (230 g de peso fresco/litro, 9.2 g de peso
seco/litro).
Fig. 3. Efecto de la combinación de CDMA y MeJA
utilizando una densidad celular elevada (225 g de peso fresco/litro,
12 g de peso seco/litro) sobre la cinética de acumulación
extracelular de indolalcaloides en la línea C. roseus (L.) G.
Don.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Efecto de la adición de MeJA combinado
con CDMA sobre la cinética de acumulación extracelular de
catarantina y serpentina utilizando una densidad celular elevada
bajo las condiciones descritas en la Fig. 3.
Fig. 5. Análisis cromatográfico
(HPLC-UV) de caldos de C. roseus (L.) G. Don
tras 96 horas de incubación utilizando una densidad celular baja
(110 g de peso fresco/litro), en respuesta a los diferentes agentes
extractores. Se muestra un experimento representativo de 3 réplicas
biológicas.
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 6: Producción de serpentina y catarantina
por suspensiones celulares de C. roseus (L.) G. Don en
respuesta a diferentes agentes extractores bajo las condiciones
descritas en la figura 5.
Fig. 7. Efecto de CDMA combinado con MeJA
utilizando una densidad celular baja (95 g de peso fresco/litro)
sobre la cinética de acumulación extracelular de indolalcaloides en
la línea C. roseus (L.) G. Don.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 8. Efecto de la adición de MeJA combinado
con CDMA sobre la cinética de acumulación extracelular de
catarantina y serpentina bajo las condiciones descritas en la figura
7.
Fig. 9. Efecto de la disponibilidad de oxígeno
sobre la acumulación extracelular de indolalcaloides a partir de
suspensiones celulales de C. roseus (L.) G. Don. extraídas
con CDMA y MeJA utilizando una densidad celular elevada (200 g peso
fresco/litro, 9.2 g de peso seseo/litro).
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 10. Efecto de la disponibilidad de oxígeno
sobre la acumulación en el medio de cultivo de catarantina y
serpentina bajo las condiciones descritas en la figura 9.
Fig. 11. Producción de ajmalicina y catarantina
por suspensiones celulares de C. roseus en respuesta a los
diferentes agentes extractores tras 96 h de incubación utilizando
una densidad celular elevada (218 g de peso fresco/litro, 6.4 g peso
seco/litro) de medios de cultivo de C. roseus cv. First Kiss
Apricot.
Se muestra un experimento representativo de 3
réplicas biológicas.
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 12. Efecto de la combinación de CDMA con
MeJA utilizando una densidad celular elevada (232 g de peso
fresco/litro, 6.8 g de peso seco/litro), sobre la cinética de
acumulación extracelular de indolalcaloides en la línea C.
roseus cv. First Kiss Apricot.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 13. Efecto de la adición de MeJA combinado
con CDMA sobre la cinética de acumulación extracelular de ajmalicina
bajo las condiciones descritas en la figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto el efecto en el uso conjunto de jasmonato de metilo y
ciclodextrinas en la producción de indolalcaloides mediante la
utilización de suspensiones celulares de C. roseus.
\vskip1.000000\baselineskip
Linea celular: C. roseus (L.) G. Don
Linea celular: C. roseus cultivares First
Kiss Apricot, Victory Red Blue Berry y Victory Bright.
La línea celular de C. roseus (L.) G. Don
fue obtenida de Germán Collection of Microorganisms and Cell
Cultures (DSMZ; Braunschweig, Alemania).
Para la inducción de callos de C. roseus
de los demás cultivares se recolectaron hojas jóvenes de
0.5-2.0 cm de longitud, de tres variedades: First
Kiss Apricot, Victory Red Blue Berry y Victory Bright. A
continuación se lavaron tres veces con agua jabonosa. Posteriormente
se llevó a cabo la desinfección con etanol al 70% durante 1 minuto e
hipoclorito cálcico al 2% durante 15 minutos. Tras la desinfección,
se enjuagaron con abundante agua destilada estéril. Una vez
desinfectadas se cortaron en fragmentos de 1.5-2.0
mm que se depositaron sobre placas con distintos medios de cultivo.
De entre todos los medios que se probaron, el que dio los mejores
resultados fue el medio LS. Por ello, los callos se mantuvieron a
25ºC en oscuridad, en matraces de 250 mi de capacidad que contenían
100 ml del medio LS, consistente en medio basal LS (Linsmaier,E.M.
& Skoog, F. 1965 Physiol. Plant. 18,
100-127) suplementado con Tiamina (0,4 mg/l) y
Mio-inositol (100 mg/l, sacarosa (30 g/l) como
fuente carbonada y ácido alfa-naftalenacético (0.186
mg/l) y 2.4-diclorofenoxiacético (0.22 mg/l) como
hormonas. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la
aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de
presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de
agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables obtenidos, en matraces de 250 ml de
capacidad que contenían 80 ml de medio LS sin agar. Las células en
medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a
25ºC en la oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada experiencia de extracción se tomaron, en
condiciones de esterilidad, entre 90 y 240 g de peso fresco de
células por litro que habían sido previamente lavadas con medio
fresco y filtradas. Utilizando esta densidad celular, las células se
repartieron en matraces de 250, 500, 1000 ml que contenían 100 ml de
medio fresco.
- \bullet
- sólo con una \beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente con un grado de sustitución por metilos de entre 1,6 y 1,9 (CDMA) a una concentración de 62,4 g/l.
- \bullet
- hidroxipropilada aleatoriamente con un grado de sustitución por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9 (CDHA), a una concentración de 62,4 g/l.
- \bullet
- con una de las ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) o (CDHA) a una concentración 62,4 g/l y con jasmonato de metilo a una concentración 100 micromolar.
El jasmonato de metilo se esteriliza aparte del
medio por filtración, disuelto en etanol, y posteriormente se mezcla
con el resto del medio estéril. La concentración final de etanol en
el medio de cultivo es de 0.2% en volumen.
Los matraces se incubaron en las mismas
condiciones descritas anteriormente para su mantenimiento en medio
líquido durante periodos de tiempo comprendidos entre 24 y 192
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la obtención de vitroplantas de
Catharanthus se utilizaron brotes de plantas jóvenes crecidas
en invernadero. Los brotes se lavaron con agua jabonosa. A
continuación se procedió a su desinfección con etanol al 70% durante
1 minuto e hipoclorito cálcico al 2 % durante 15 minutos. Tras la
desinfección, se lavaron con abundante agua destilada estéril. Una
vez desinfectados y trabajando en cabina de flujo laminar, los
brotes se cultivaron en recipientes que contenían 50 ml de medio de
cultivo optimizado consistente en medio basal MS (Murasighe and
Skoog, 1962) suplementado con vitaminas de Morel,
6-bencílaminopurina (0, 680 mg/l), ácido
alfa-naftalenacético (0,180 mg/l), sacarosa (20
g/l), carbón activo (1.2 g/l). El pH del medio de cultivo se ajustó
a 5,8 y se esterilizó mediante la aplicación de calor húmedo
(autoclave) durante 20 min a 1.2 atm y se solidifica mediante la
adición de agar (8 g/l). Otras vitroplantas se mantuvieron en un
medio de cultivo constituido por una doble capa, consistente en una
capa de medio de cultivo sólido y otra de medio de cultivo líquido
de idéntica composición pero sin agar.
Los brotes se mantuvieron en cámara de cultivo a
25 \pm 1ºC y un fotoperiodo de 16 horas luz / 8 horas
oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la estimulación de la producción de
alcaloides indólicos, se añadieron al medio de cultivo de las
vitroplantas los siguientes agentes extractores:
- \bullet
- Jasmonato de metilo a una concentración 100 micromolar.
- \bullet
- Jasmonato de metilo a una concentración 100 micromolar y \beta-ciclodextrina hidroxipropilada con un grado de sustitución por metilos de entre 0.6 y 0,9 (CDHA) a una concentración de 62,4 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
El jasmonato de metilo se esteriliza aparte del
medio por filtración, disuelto en etanol al 2%, y posteriormente se
mezcla con el resto del medio estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos incubados con agentes extractores
se recogieron diariamente o cada cierto tiempo para su análisis. En
el caso de las vitroplantas, una vez transcurrido el tiempo de
extracción, se recolectaron las hojas para la extracción y análisis
de indolalcaloides por HPLC con detector de fotodiodo array.
En el caso de las suspensiones celulares, las
células fueron separadas del medio por filtración realizando un
ligero vacío, recogiendo por separado las células y el filtrado. El
filtrado se utilizó para la extracción de los compuestos y posterior
análisis por HPLC con detector de fotodiodo array.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizados los experimentos de
extracción, la extracción de los compuestos secretados al medio de
cultivo de C. roseus, se realizó basificando el medio
extracelular con amoniaco hasta alcanzar un pH de 9.5. A
continuación se realizó una primera extracción con acetato de etilo
(v:v) durante un periodo de tres horas. Transcurrido ese tiempo se
recogió la fase orgánica (acetato de etilo) y se evaporó en un
rotavapor a 40ºC a vacío; el residuo seco se resuspendió en metanol
y se procedió a su análisis cromatógrafo.
Las muestras fueron analizadas utilizando un
sistema cromatográfico Waters LC 600 acoplado a un detector de
selección fotodiodo en batería Waters 996. La estación de control y
procesado de datos se realizó mediante el software Millenium.
La separación en fase reversa HPLC se llevó a
cabo sobre una columna Spherisorb ODS2 C18. El volumen de inyección
fue de 20 \mul y la velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1
ml/minuto, utilizando como disolvente: metanol, acetonitrilo,
trietilamina, acetato de amonio en proporción 15:1:45:40
(vol:vol:vol:vol) (Morforte-Gonzáles et al.,
(1992) Phytochem Anal 3:117-121).
El tiempo de retención de los diferentes
indolalcaloides y la respuesta del detector a la concentración de
los mismos (curva de calibrado para cuantificación) se determinó
usando patrones externos. La extracción de los cromatogramas
correspondientes a los indolalcaloides se realizó a 254 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizados los experimentos de
extracción y recolectadas las hojas, la extracción de los compuestos
se realizó macerando las hojas en un mortero con metanol (1:2 p/v).
A continuación, el triturado se filtra utilizando una tela de Nylon
y el filtrado se centrifuga a 120 g durante 6 minutos a temperatura
ambiente. Tras la centrifugación, se recoge el sobrenadante y se
lleva a sequedad aplicando N_{2}. El residuo seco obtenido se
resuspende en 2 ml de H_{2}SO_{4} al 2% y se deja reposar
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo,
se añaden 7 ml de acetato de etilo y se centrifuga a 20000 g durante
1 minuto a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, se elimina
el acetato de etilo y la fase acuosa restante se basifica añadiendo
amonio hasta alcanzar un pH de 9.5. A continuación se añaden 40 ml
de acetato de etilo durante un periodo de tres horas. Transcurrido
ese tiempo se recoge la fase orgánica (acetato de etilo) y se
evapora en un rotavapor a 40ºC a vacío; el residuo seco se
resuspendió en metanol y se procedió a su análisis
cromatográfico.
Las muestras fueron analizadas utilizando un
sistema cromatográfico Waters LC 600 acoplado a un detector de
selección fotodiodo en batería Waters 996. La estación de control y
procesado de datos se realizó mediante el software Millenium.
La separación en fase reversa HPLC se llevó a
cabo sobre una columna Spherisorb ODS2 C18. El volumen de inyección
fue de 20 \mul y la velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1
ml/minuto, utilizando como disolvente: metanol, acetonitrilo,
trietilamina, acetato de amonio en proporción 15:1:45:40
(vol:vol:vol:vol) (Morforte-Gonzáles et al.,
(1992) Phytochem Anal 3:117-121).
El tiempo de retención de los diferentes
indolalcaloides y la respuesta del detector a la concentración de
los mismos (curva de calibrado para cuantificación) se determinó
usando patrones externos. La extracción de los cromatogramas
correspondientes a los indolalcaloides se realizó a 254 nm.
Las suspensiones de C. roseus (L.) G. Don
se trataron con:
- \bullet
- controles sin CDMA ni MeJA
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo. Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de ajmalicina y serpentina en el medio extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la Tabla A y Fig. 1 y
2.
Cuando el cultivo se extrajo solo con CDMA o
CDHA, se observó una acumulación extracelular de ajmalicina por
unidad de biomasa ligeramente superior que en los controles y a los
obtenidos sólo con MeJA.
Sólo la combinación de CDHA con MeJA se tradujo
en un incremento en la producción de ajmalicina.
Por otro lado se observó que no existían
diferencias significativas con los distintos tratamientos tras 96
horas de extracción en la producción de serpentina.
Densidad celular: 9.2 g de peso seco/litro
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones celulares de C. roseus
(L.) G. Don se trataron con:
- \bullet
- beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l y jasmonato de metilo (MeJA) a concentración de 100 micromoles/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Periódicamente se extrajeron muestras y se
recogieron las células y el medio por separado. A continuación, se
cuantificó la cantidad de indolalcaloides en el medio extracelular
como se describe en los modos de realización. Los resultados se
muestran en la tabla B y Figuras 3 y 4.
En presencia de CDMA y MeJA la catarantina se
acumula durante las primeras 72 horas, desapareciendo su producción
a las 96 horas hasta el final del tiempo de extracción. En relación
a la ajmalicina se observó un aumento desde las 24 horas después de
la extracción y un pico de máxima producción a las 96 horas. A
partir de ese momento hay una disminución progresiva de la cantidad
de ajmalicina detectada en el medio extracelular disminución que
probablemente este relacionada con el aumento de serpentina a partir
de 120 horas, ya que la ajmalicina es el precursor inmediato de la
serpentina.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA;
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de C. roseus se trataron
con:
- \bullet
- controles sin CDMA ni MeJA
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l).
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de cultivo
utilizando una densidad celular baja (110 g/peso fresco/litro). Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de ajmalicina y serpentina en el medio extracelular.
El resultado del experimento se muestra en la Tabla C y Fig. 5 y
6.
Cuando el cultivo se extrajo sólo con CDMA o
CDHA, no se observaron diferencias significativas con respecto al
control de acumulación extracelular de alcaloides, aunque el
tratamiento sólo con MeJA presentó una disminución en la producción
de ajmalicina y un aumento de serpentina respecto a los controles.
Asimismo, la combinación de CDHA y CDHA con MeJA, se tradujo en un
incremento en la producción de ajmalicina y serpentina.
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones celulares de C. roseus
(L.) G. Don se trataron con:
- \bullet
- beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l y jasmonato de metilo (MeJA) a concentración de 100 micromoles/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Periódicamente se extrajeron muestras y se
recogieron las células y el medio por separado. A continuación, se
cuantificó la cantidad de alcaloides en el medio extracelular como
se describe en los modos de realización. Los resultados se muestran
en la tabla D y Fig. 7 y 8.
En presencia de CDMA y MeJA la catarantina se
acumula a partir de las 48 horas, manteniendo su valor constante
hasta las 96 horas y desapareciendo desde 120h hasta el final del
tiempo de incubación. En cuanto a la ajmalicina se observó un pico
de máxima producción a las 48 horas, a partir de 120 horas no se
detecta ajmalicina en el medio extracelular, y sin embargo, se
comienza a observar un aumento de serpentina.
\vskip1.000000\baselineskip
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA;
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones celulares de C. roseus
(L.) G. Don se trataron con:
- \bullet
- beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l y jasmonato de metilo MeJA a concentración de 100 micromoles/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml, 500 mi y 1000 ml conteniendo cada
uno de ellos 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se
recolectaron las células y el medio de cada matraz por separado, las
células se pesaron y se determinó la cantidad total de
indolalcaloides en el medio de cultivo. El resultado del experimento
se muestra en la Tabla E y Figuras 9 y 10.
En presencia de CDMA y MeJA se observa un
aumento de acumulación extracelular de ajmalicina, serpentina y
catarantina en matraces de capacidad 1000 ml respecto a los de 250
ml por lo que hay un claro indicio de la actuación del oxígeno como
factor limitante en la producción de indolalcaloides a partir de
suspensiones celulares de C. roseus. Se observa como en
concentraciones de oxígeno próximas a la saturación se obtiene mayor
producción de alcaloides, y en el caso concreto de la catarantina se
requiere más del 40 % para que se excrete al medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Densidad celular: 9.2 g de peso seco/litro.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de C. roseus cv. First
Kiss Apricot de densidad alta (218 g peso fresco/litro) se trataron
con:
- \bullet
- controles sin CDMA ni MeJA
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l).
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de ajmalicina y serpentina en el medio
extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla F
y la Fig. 11.
Tras analizar los resultados obtenidos en el
ejemplo 2 (Tabla B) y ejemplo 6 (Tabla F) se observó que la línea
celular de C. roseus cv. First Kiss Apricot es más productora
que la línea celular de C. roseus (L.) G. Don, por lo que la
producción de indolalcaloides depende del cultivar de C.
roseus que se utilice.
El tratamiento que originó una mayor producción
de catarantina en C. roseus cv. First Kiss Apricot fue
CDMA+MeJA alcanzando valores de 5056 \mug/g peso seco (Tabla F).
Por lo cual el uso de combinado de ambos agentes extractores
incrementa hasta 5.5 veces más la producción que si se utilizan
separadamente MeJA (912 \mug/g peso seco) o CDMA (965 \mug/g
peso seco).
En cuanto a la producción de ajmalicina también
se observó un mayor incremento con respecto a C. roseus (L.)
G. Don (Tabla B), alcanzándose valores de 3368 \mug/g peso seco
cuando se extrae con el tratamiento combinado CDMA y MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin agentes
extractores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones celulares de C. roseus
cv First Kiss Apricot se trataron con:
- \bullet
- beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) a concentración de 62.5 g/l y jasmonato de metilo (MeJA) a concentración de 100 micromoles/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Periódicamente se extrajeron muestras y se
recogieron las células y el medio de cultivo por separado. A
continuación, se cuantificó la cantidad de alcaloides en el medio de
cultivo. Los resultados se muestran en la tabla G y Fig. 12 y
13.
En presencia de CDMA y MeJA la catarantina se
acumula durante las primeras 96 horas alcanzando un plateau.
En cuanto a la ajmalicina se observó un aumento máximo mantenido
desde las 72 horas hasta 120 horas mientras que la máxima producción
de serpentina comienza a las 96 horas y se mantiene hasta el final
del experimento.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA;
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de hojas de plantas crecidas
en invernadero y vitroplantas sin ningún tratamiento. A
continuación, se cuantificó la cantidad de indolalcaloides como se
describe en los modos de realización.
Los resultados se muestran en la tabla H.
Tras analizar los resultados obtenidos, se
observa la presencia de vindolina, no detectada en los cultivos
celulares. Asimismo, observamos que las hojas derivadas de cultivo
in vitro, muestran mayor producción de vindolina, catarantina
y ajmalicina que las hojas de plantas de invernadero.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Al cabo de 96 horas de tratamiento, se
recolectaron las hojas de las vitroplantas, se pesaron y se
determinó la cantidad total de indol alcaloides producidos. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla I.
El tratamiento CDHA+MeJA originó una mayor
producción de vindolina y catarantina (Tabla I) hasta 1.6 y 10 veces
respectivamente, en comparación con los datos de las vitroplantas
extraídas sólo con MeJA.
En cuanto a la ajmalicina y serpentina se
observó que aquellas vitroplantas que fueron extraídas sólo con MeJA
presentaban mayor producción que que las vitroplantas tratadas con
ambos agentes extractores.
\vskip1.000000\baselineskip
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA;
CDHA: tratamiento con 62.4 g/l de CDMA.
Claims (26)
1. Método de obtención de alcaloides indólicos,
que comprende:
- a.
- la adición de ciclodextrinas y jasmonato de metilo a un medio de cultivo,
- b.
- la adición de células potencialmente productoras de alcaloides indólicos al medio de cultivo de a),
- c.
- la incubación de las células del paso b) en el medio de cultivo del paso a),
- d.
- la separación de los alcaloides indólicos obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación anterior,
donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos
son células vegetales procedentes de plantas del orden
Gentianales.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde las células
potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células
vegetales procedentes de plantas que se seleccionan de las
siguientes familias: Apocynaceae, Loganiaceae, Nissaceae y/o
Rubiaceae.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde las células
potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células
vegetales procedentes de plantas del género Catharanthus.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde las células
potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células
vegetales procedentes de C. roseus.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde las células
potencialmente productoras de alcaloides indólicos proceden de
vitroplantas.
7. Método según la reivindicación anterior,
donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos
proceden de las hojas de las vitroplantas.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde la concentración de
jasmonato de metilo es de entre 5 y 500 micromoles/ litro de medio
de cultivo.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, donde la concentración de
jasmonato de metilo es de entre 25 y 150 micromoles/ litro de medio
de cultivo.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde la concentración de
jasmonato de metilo es de entre 75 y 125 micromoles/ litro de medio
de cultivo.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, donde las ciclodextrinas se
seleccionan del grupo que comprende cliclodextrina metilada
aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada.
12. Método según la reivindicación 11 donde la
ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución
por metilos de entre 1 y 3.
13. Método según la reivindicación 11 donde la
ciclodextrina metilada aleatoriamente es dimetilada.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 donde la ciclodextrina es una
\beta-ciclodextrina.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 donde la concentración de ciclodextrinas es
de entre 6.5 y 130 g/L medio de cultivo a).
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 donde la concentración de ciclodextrinas es
de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo a).
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 donde la concentración de ciclodextrinas es
de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo a).
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 donde la concentración de células de b) en
el medio a) es de entre 10 g de peso fresco/litro, 1 g de peso
seco/litro y 400 g de peso fresco/litro, 20 g de peso
seco/litro.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18 donde la concentración de células de b) en
el medio a) es de entre 75 g de peso fresco/litro, 4 g de peso
seco/litro y 300 g de peso fresco/litro, 15 g de peso
seco/litro.
\newpage
20. Método según la reivindicación 19 donde la
concentración de células de b) en el medio a) es de entre 100 g de
peso fresco/litro, 5 g de peso seco/litro y 250 g de peso
fresco/litro, 10 g de peso seco/litro.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, donde el medio de cultivo que comprende las
ciclodextrinas, el jasmonato de metilo y las células potencialmente
productoras de alcaloides indólicos se someten a radiación UV.
22. Método según la reivindicación anterior,
donde los donde el medio de cultivo que comprende las
ciclodextrinas, el jasmonato de metilo y las células potencialmente
productoras de alcaloides indólicos se someten a radiación UV
durante tiempos cortos de entre 5 y 30 minutos.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22 donde el porcentaje de saturación de oxígeno
en el medio de cultivo es de entre 40% y un 100%.
24. Composición que comprende jasmonato de
metilo y ciclodextrinas.
25. Uso de la composición de la reivindicación
24 para promover la producción de alcaloides indólicos en células
productoras de los mismos.
26. Uso combinado de
metil-jasmonato y ciclodextrinas para promover la
producción de alcaloides indólicos en células productoras de los
mismos.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802437A ES2336992B1 (es) | 2008-08-14 | 2008-08-14 | Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la produccion de alcaloides indolicos. |
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| ES200802437A ES2336992B1 (es) | 2008-08-14 | 2008-08-14 | Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la produccion de alcaloides indolicos. |
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- 2008-08-14 ES ES200802437A patent/ES2336992B1/es active Active
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