ES2625491T3 - Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares - Google Patents
Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para incrementar la producción y/o extracción de fitoesteroles estableciendo cultivos de células vegetales y adicionando al medio ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo.
Description
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DESCRIPCION
Uso de las ciclodextrinas para la produccion y extraccion de fitoesteroles en cultivos celulares.
La presente invencion se encuentra dentro del campo de la biotecnologfa y la farmacia, y se refiere a un procedimiento para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles a partir de cultivos de celulas vegetales mediante la adicion al medio de cultivo de ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo.
ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
Los fitoesteroles y los fitoestanoles (formas reducidas de los fitoesteroles) son compuestos derivados del escualeno cuya caracterfstica comun es la presencia de un anillo esterol, diferenciandose en sus cadenas laterales. Su funcion principal es la de actuar como componentes estructurales, ya que son constituyentes de las membranas celulares vegetales, aunque algunos fitoesteroles presentan tambien una accion hormonal (Azcon-Bieto & Talon., 2000. Ed. McGraw-Hill).
Los fitoesteroles pertenecen a la familia de los triterpenos, son esteroles de origen vegetal, cuya estructura qufmica es muy similar a la del colesterol, que se encuentran presentes en los frutos, semillas, hojas y tallos de practicamente todos los vegetales conocidos (Ling & Jones, 2005. Life Sci. 57:195-206). Por este motivo, los incorporamos normalmente en nuestra dieta. Se estima que la ingesta promedio diaria de fitoesteroles se encuentra en un rango que va desde los 160 mg/dfa hasta los 500 mg/dfa. Los fitoesteroles qufmicamente identificados suman mas de 25 estructuras diferentes, pero son solo tres los que estan en mayor proporcion: el p-sitosterol (C29), el campesterol (C28) y el estigmasterol (C29), quienes en su conjunto constituyen el 95%-98% de los fitoesteroles identificables en extractos vegetales. Los fitoesteroles comparten con el colesterol el nucleo central de la molecula, la estructura ciclopentano perhidrofenantreno (D-5 insaturado, conservando el grupo -OH que sustituye el carbono 3 de la estructura cfclica). La diferencia estructural de los fitoesteroles con el colesterol radica en la cadena hidrocarbonada lateral. En el colesterol esta cadena esta formada por ocho carbonos y es saturada. En los fitoesteroles, la cadena lateral es mas larga (9 o 10 carbonos) y en algunos de ellos presenta un doble enlace (estigmasterol). Los fitoestanoles estan en menor proporcion que los fitoesteroles en el reino vegetal, se forman por la reduccion del doble enlace de la posicion D-5 de la estructura cfclica. Se ha propuesto que la diferencia estructural en la cadena lateral de los fitoesteroles y de los fitoestanoles con el colesterol es responsable de los particulares efectos hipocolesterolemicos.
Numerosas evidencias experimentales han demostrado que los esteroles vegetales tienen un importante efecto hipocolesterolemico, reduciendo tanto los niveles de colesterol total como los de colesterol ligado a protefnas de baja densidad (LDL) (Varady y cols., 2007. Transl Res 149: 22-30.). El efecto mas y mejor estudiado de los esteroles vegetales es la inhibicion de la absorcion intestinal de colesterol, tanto el procedente de la dieta (300 mg/dfa) como el colesterol endogeno circulante en la bilis (100 mg/dfa) que, al ser parcialmente pero extensamente reabsorbido en el intestino, constituye la principal forma de captacion. Los esteroles vegetales, al ser mas hidrofobicos que el colesterol, pueden competir con el y desplazarlo de las micelas de absorcion, habiendose demostrado, tanto en estudios in vivo como in vitro, que se produce una disminucion de la incorporacion del colesterol en las micelas lo que se traduce en una disminucion de la absorcion intestinal de colesterol. A dosis elevadas de esteroles vegetales la absorcion de colesterol disminuye un 30-50% (Ostlund & Lin, 2006. Curr Atheroscler rep 8: 487-491). Ademas, los esteroles vegetales podrfan reducir la tasa de esterificacion del colesterol en el enterocito (afectando a la actividad de las enzimas implicadas) y consecuentemente, de esta forma se reducirfa la cantidad de colesterol exportado a la sangre en forma de quilomicrones. Tambien se ha sugerido que, en presencia de esteroles vegetales, el colesterol que ya de por si es poco soluble, puede aumentar la tasa de precipitacion y por tanto desplazarse a una forma no- absorbible o menos absorbible.
Actualmente, se sabe que los fitoesteroles y fitoestanoles poseen propiedades inmunomoduladoras que podrfan ser beneficiosas para la prevencion del cancer de colon (McCann y cols., 2003. J Nutr. 133:1937-1942), cancer de mama (Awad y cols., 2000. Anticancer Res. 20(2A):821-824.), control de la hiperplasia prostatica benigna (Awad y cols., 2001. Eur J Cancer Prev 10(6):507-513) y dano tisular asociado a inflamacion (Lowe & Ku, 1996. Urology 1996; 48:12-20).
Estudios recientes sugieren que una dieta rica en fitoesteroles puede ser fuertemente protectora contra estos tipos de cancer, desencadenando respuestas como, aumento de la respuesta antitumoral, la inhibicion del crecimiento tumoral; tambien afectan al ciclo celular y promueven la apoptosis a traves de la induccion del metabolismo de esfingolfpidos y la estimulacion de la formacion de ceramidas (Awad y cols., 2000. Anticancer Res. 20(2A):821-824). Ademas, los esteroles aumentan la respuesta celular de los linfocitos T tanto in vivo como in vitro (Bouic y cols., 1996. Int J Immunopharmacol. 18:693-700) y promueven la expresion o actividad de factores endogenos inhibidores de la angiogenesis, proceso necesario para el crecimiento de tumores y desarrollo de la metastasis (Quesada y cols., 2006. Med. Res. Rev. 26:483-530). Asimismo, los fitoesteroles tambien presentan accion antimicrobiana, antifungica y antibacteriana (Ling & Jones, 1995. Life Sci. 57:195-206).
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Los fitoesteroles mas importantes, desde el punto de vista economico, son el p-sitosterol, el campesterol y el estigmasterol. En la actualidad, estos compuestos se obtienen mediante un proceso extractivo de la materia prima vegetal. Este proceso de extraccion es de bajo rendimiento ya que a partir de 1,6 kg de hoja seca de Pandanus tectorius se obtienen 26,8 mg de una mezcla de estigmasterol y el p-sitosterol en una proporcion 2:1 (Mario y cols., 2008. J Nat Med. 62:232-235). Asimismo, a partir de 5 kg de fruto de banana se obtuvieron 325, 76, y 65 mg/kg de p-sitosterol, campesterol y estigmasterol respectivamente (Oliveira y cols., 2008. J Agric Food Chem. 56(20):9520- 9524).
El cultivo in vitro constituye una alternativa a los metodos clasicos de extraccion convencional a partir de materia prima vegetal y se trata de un area emergente y de gran potencial de crecimiento para la sfntesis de compuestos bioactivos. El cultivo de celulas vegetales in vitro ha abierto nuevos caminos como fuente de obtencion de compuestos bioactivos de gran valor anadido debido a las ventajas que presenta su utilizacion ya que estos cultivos son independientes de factores geograficos, estacionales y ambientales, reconocidos como sistemas de produccion estables ya que aseguran la obtencion continua de compuestos con calidad y productividad uniformes y los requerimientos de espacio para el desarrollo de la produccion son reducidos. Ademas, el proceso de purificacion del compuesto de interes es mas facil y se optimiza cuando este se libera al medio de cultivo, la produccion del compuesto se puede realizar a gran escala y existe la posibilidad de obtener productos nuevos que no son sintetizados por las plantas de forma natural. La optimizacion de la produccion de metabolitos incluye el establecimiento de las condiciones optimas de cultivo y el ajuste de los parametros de crecimiento celular. Cuando ademas se quiere comercializar el producto a nivel industrial, es necesario realizar un escalado en sistemas que garanticen la produccion elevada del metabolito de interes (en biorreactores) para alcanzar niveles economicamente rentables. Ademas, existen otros factores que incrementan la productividad entre los que destaca la elicitacion del cultivo celular. Mientras que la planta responde a la presencia de elicitores sintetizando metabolitos de forma localizada alla donde se produce la interaccion, el cultivo celular responde globalmente, ya que el elicitor entra en contacto con toda la biomasa. Por lo tanto, la cantidad total de metabolitos sintetizados es mucho mayor que en la planta y esta en funcion de la biomasa de celulas elicitada (Bru y cols., 2006. J AgrFood Chem. 54(1):65-7l).
Lee M.-H. y cols., Plant Cell Physiol., 45 (8): 976-984, se refieren a un procedimiento para producir fitoesteroles en plantulas de ginseng por expresion transgenica de gen escaleno sintasa en las rafces. El documento EP-1.471.141- A1 describe que la adicion de ciclodextrina a las celulas vegetales en un medio de cultivo da lugar a la produccion de resveratrol.
Debido a las propiedades beneficiosas anteriormente descritas, desde 1997 se venden margarinas enriquecidas con fitoesteroles en Finlandia, y actualmente en varios pafses de Europa existen productos lacteos enriquecidos con los mismos. Ademas, desde septiembre del ano 2000, la FDA ha autorizado declarar en los envases de los alimentos ricos en fitoesteroles, el beneficio que para la salud presenta su consumo en relacion a un menor riesgo de enfermedades coronarias. Sin embargo, el coste de estos productos es elevado, y se estima que debido a la gran cantidad de materia vegetal necesaria para extraer una cantidad significativa de fitoesteroles con las fuentes naturales mundiales actuales solo se podrfa abastecer a un 10% de la poblacion occidental (Law 2000. BMJ 320:861-864)
Existe por tanto la necesidad de encontrar un metodo que mejore el rendimiento de extraccion de fitoesteroles a partir de los recursos naturales, permitiendo que un mayor porcentaje de la poblacion se beneficie de los efectos positivos que tienen dichos fitoesteroles sobre la salud.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion y extraccion de fitoesteroles con rendimientos elevados, donde el proceso se caracteriza por las etapas (a) a (d) tal como se mencionan a continuacion.
Los autores de la presente invencion han observado que estableciendo cultivos de celulas vegetales y adicionando al medio ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo, se incrementa el rendimiento de produccion y extraccion de fitoesteroles.
Por tanto, un primer aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles que comprende:
a) anadir ciclodextrinas a un medio de cultivo,
b) poner en contacto celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol con el medio de cultivo de a),
c) incubar las celulas del paso b) en el medio de cultivo del paso a),
d) separar los fitoesteroles obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
Medios de cultivo adecuados son conocidos en el estado de la tecnica. Asf, y sin limitar el alcance de la invencion, un medio de cultivo adecuado para celulas vegetales se describe para cada especie utilizada en los ejemplos de la
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invencion. A este medio se le pueden adicionar otros componentes dependiendo de la especie a la que pertenezcan las celulas vegetales. Las ciclodextrinas se incorporan en el medio de cultivo en el momento de su preparacion.
Las celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol pueden provenir de hojas, tejidos u organos que han sido establecidas previamente o no, en cultivos in vitro. Por tanto, se entiende por celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol cualquier lfnea celular capaz de producir fitoesteroles, bien de forma natural o tras modificacion genetica.
Cualquier organo, tejido o celula vegetal capaz de producir fitoesteroles puede ser empleado en la invencion. Esto incluye aquellas celulas procedentes de un organismo que, aunque no posea de forma natural la capacidad de sintetizar fitoesteroles, ha adquirido dicha capacidad mediante procesos de manipulacion genetica. En una realizacion preferida, son tejidos o celulas vegetales procedentes de plantas de los generos que se seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum, Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
El termino “planta” u “organismo” incluye partes, tejidos, celulas o protoplastos procedentes de la planta o del organismo, cultivos de celulas, cultivos de tejidos, callos, ovulos, embriones y semillas procedentes en ultima instancia de la planta o el organismo
Taxonomicamente los organismos del genero Rosa se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Rosales, familia Rosaceae, Subfamilia Rosoideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Daucus se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Apiales, familia Apiaceae, Subfamilia
Apioideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Daucus se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Apiales, familia Apiaceae, Subfamilia
Apioidea.
Taxonomicamente los organismos del genero Capsicum se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Solanales, familia Solanaceae, Subfamilia Solanoideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Lactuca se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Asterales, familia Asteraceae, Subfamilia Cichorioideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Catharanthus se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Gentianales, familia Apocynaceae, Subfamilia Rauvolfioideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Lycopersicum se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Solanales, familia Solanaceae, Subfamilia Solanoideae.
Taxonomicamente los organismos del genero Taxus se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Coniferales, familia Taxaceae.
Taxonomicamente los organismos del genero Vitis se definen como organismos celulares, que pertenece al superreino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Vitales, familia Vitaceae.
De esta manera, se establecen cultivos de celulas potencialmente productoras de fitoesteroles en medios de cultivo adecuados que han sido enriquecidos con ciclodextrinas. El termino “cultivo de celulas” en esta memoria, hace referencia a un cultivo de celulas aisladas del mismo o diferente tipo de tejido, preferiblemente de una planta, o una coleccion de tales celulas organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo, cultivos de protoplastos, callos (grupo de celulas vegetales indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y celulas vegetales que estan aisladas de plantas o partes de las plantas, tales como embriones, protoplastos, celulas meristematicas, polen, hojas, rafces, rafz inclinada, antera, pistilo, flor, semilla, vaina o vastago de la planta.
Tambien se entienden como celulas potencialmente productoras de fitoesteroles aquellas que provienen de vitroplantas, organos o tejidos de dichas vitroplantas, y especfficamente, de vitroplantas, organos o tejidos de vitroplantas de los generos que se seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum, Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
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Asf, en otra realizacion preferida de este aspecto de la invencion, las celulas potencialmente productoras de fitoesteroles proceden de vitroplantas.
Las ciclodextrinas son oligosacaridos cfclicos que se forman en algunos procesos de degradacion del almidon. A veces tambien son llamadas cicloamilosas. Presentan un exterior hidrofflico y una cavidad interior hidrofobica donde pueden atrapar moleculas organicas no polares. Para cambiar las propiedades ffsicas y qufmicas de las ciclodextrinas se han desarrollado diversos derivados. Unos de los mas utilizados son los derivados parcialmente metilados que tienen una solubilidad en agua hasta 150 veces superior a la del producto de partida.
Asf, en otra realizacion preferida, las ciclodextrinas que se anaden en el paso a) del procedimiento de la invencion se eligen del grupo que comprende ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA) o ciclodextrina hidroxipropilada (CDHA). Preferiblemente, el grado de sustitucion de los metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMa es de entre 1 y 3, y mas preferiblemente, el grado de sustitucion por metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMA es de 2.
La ciclodextrina metilada aleatoriamente puede estar dimetilada.
En otra realizacion preferida de la invencion, la ciclodextrina hidroxipropilada aleatoriamente tiene un grado de sustitucion por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9.
En otra realizacion preferida de este aspecto de la invencion la ciclodextrina es un maltooligosacarido cfclico constituido por 7 unidades de D-glucosa unidas por enlaces glucosfdicos de tipo a (1^- 4) (p-ciclodextrinas).
En otra realizacion preferida la concentracion de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) del procedimiento de la invencion es de entre 6,5 y 130 g/l de medio de cultivo. Mas preferiblemente la concentracion de ciclodextrinas es de entre 10 y 100 g/l medio de cultivo y aun mas preferiblemente es de entre 50 y 75 g/l medio de cultivo.
El jasmonato de metilo es un regulador del crecimiento, modulando multiples aspectos del desarrollo de las plantas (maduracion de frutos, viabilidad del polen, crecimiento de la rafz, curvatura de los zarcillos) y que promueve el envejecimiento foliar, produciendo senescencia. Parece actuar de forma especffica sobre la expresion de genes implicados en la defensa de las plantas a ataques de insectos y patogenos y genes que codifican para protefnas de reserva.
En otra realizacion preferida, ademas de anadir ciclodextrinas, se anade jasmonato de metilo al medio de cultivo del paso a) del procedimiento de la invencion. En otra realizacion mas preferida de la presente invencion la concentracion de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 5 y 500 micromoles por litro de medio de cultivo. Mas preferiblemente la concentracion de jasmonato de metilo es de entre 25 y 150 micromoles/l de medio de cultivo y aun mas preferiblemente de entre 75 y 125 micromoles/l de medio de cultivo.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de una composicion, de ahora en adelante composicion de la invencion, que comprende ciclodextrinas para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles en celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol. En una realizacion preferida, la composicion de la invencion comprende, ademas de ciclodextrinas, jasmonato de metilo. Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de un medio de cultivo, de ahora en adelante medio de cultivo de la invencion, que comprende ciclodextrinas para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles en celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol. En una realizacion preferida, el medio de cultivo de la invencion comprende, ademas de ciclodextrinas, jasmonato de metilo.
Tanto la densidad celular en el medio de cultivo como el fotoperiodo pueden variar en funcion de la procedencia de las celulas potencialmente productoras de fitoesteroles. El fotoperiodo se ajustara preferiblemente a un ciclo natural de entre 12-16 horas de luz y 8-12 horas de oscuridad.
A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion.
EXPOSICION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACION
A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto el efecto del uso de las ciclodextrinas y el jasmonato de metilo en la produccion de fitoesteroles a partir de suspensiones celulares de diferentes especies vegetales.
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Preparacion y mantenimiento de material vegetal > Lfnea celular: Rosa sp.
La lfnea celular de Rosa mini (Rosa sp.) se inicio a partir de hojas de plantas cultivadas en los invernaderos de Viveros Bermejo S.L. Para ello las hojas se lavaron tres veces con agua jabonosa. Posteriormente se llevo a cabo la desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuacion se sumergieron durante 15-20 minutos en una disolucion de hipoclorito sodico al 10% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las hojas se lavaron tres veces con agua destilada esteril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Una vez desinfectadas se cortaron en fragmentos de 1,5-2,0 mm y se depositaron sobre placas Petri que contenfan un medio de cultivo optimo para la induccion de callos basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (30 g/l) y 2,4-diclorofenoxiacetico (1,1 mg/l) y benciladenina (0,45 mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfrfa.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de los callos friables obtenidos, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml del medio cultivo descrito sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C bajo un fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se subcultivaron cada 14-16 dfas.
> Lfnea celular: Daucus carota
Lfnea celular: Daucus carota L. var. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 Lfnea celular: Daucus carota L. cv. Chantenay.
La lfnea celular Daucus carota L. var. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 fue obtenida de German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ; Braunschweig, Alemania).
Para la induccion de callos de Daucus carota L. cv. Chantenay se utilizaron vitroplantas que se obtuvieron por germinacion in vitro de semillas.
• Germinacion in vitro de semillas de Daucus carota variedad Chantenay.
El objetivo fundamental de la germinacion de semillas in vitro es la obtencion de plantas esteriles para su utilizacion en la induccion de lfneas celulares de los diferentes organos de la planta: rafz, tallo y hoja.
Para obtener la vitroplanta de zanahoria se utilizaron semillas suministradas por Viveros Bermejo S.L. Las semillas se sometieron a un proceso de desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuacion se sumergieron durante 15-20 minutos en una disolucion de hipoclorito calcico al 7% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada esteril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a tubos que contenfan el medio de cultivo basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) y hidrolizado de casefna (300 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (25 g/l). Este medio se ajusta a pH 5,8 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfrfa.
• Obtencion de callos y mantenimiento de suspensiones celulares de Daucus carota variedad Chantenay.
Los tallos de las vitroplantas se utilizaron como fuente de explantos. Las placas Petri con los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4,6 w/m2 a 25 °C, observandose al cabo de 2-3 semanas la aparicion de microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml del medio de cultivo anteriormente descrito suplementado con acido naftalenacetico (2 mg/l) y benciladenina (0,2 mg/l).
A partir de la lfnea celular generada bajo las condiciones descritas se origino una lfnea celular en oscuridad con el fin de comparar la produccion de fitoesteroles en luz y oscuridad.
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Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml de medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, en las mismas condiciones de luz y Ta y se subcultivaron cada 20 dfas.
> Lfnea celular: Capsicum annuum y Capsicum chinense
Para la induccion de callos de Capsicum se utilizaron vitroplantas obtenidas a partir de semillas germinadas in vitro.
■ Germinacion in vitro de semillas de Capsicum
Para obtener la vitroplanta de Capsicum se utilizaron semillas que se sometieron a un proceso de desinfeccion con etanol al 70% durante 2 minutos y a continuacion, se sumergieron durante 20 minutos en una disolucion de hipoclorito sodico al 20% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada esteril, trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a tubos que contenfan el medio de cultivo basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) e hidrolizado de casefna (300 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (25 g/l). Este medio se ajusta a pH 5,8 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfrfa. Los tubos de cultivo in vitro se mantienen en una camara de germinacion durante 15 dfas, a 25° C bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
■ Obtencion de callos y mantenimiento de suspensiones celulares de Capsicum.
Una vez crecidas las plantulas se utilizaran hipocotilos como fuente de explanto, para la obtencion de los microcallos en el medio de cultivo descrito anteriormente suplementado con acido naftalenacetico (2 mg/l) y benciladenina (0,2 mg/l). Los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4,6 w/m2 a 25 °C, observandose al cabo de 2 semanas la aparicion de estos microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml del mismo medio de cultivo.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml de medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm en las mismas condiciones de luz y Ta y se subcultivaron cada 20 dfas.
> Lfnea celular: Lactuca sativa
Para la induccion de callos de Lactuca sativa se utilizaron hojas de vitroplantas obtenidas por germinacion in vitro.
■ Germinacion in vitro de semillas de Lactuca sativa
Para obtener las vitroplantas de Lactuca sativa se utilizaron semillas suministradas por Ramiro Arnedo S.L. Las semillas se sometieron a un proceso de desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuacion se sumergieron durante 15 minutos en una disolucion de hipoclorito calcico al 7% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada esteril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a tubos que contenfan el medio de cultivo basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) e hidrolizado de casefna (300 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (25 g/l). Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfrfa.
■ Obtencion de callos y mantenimiento de suspensiones celulares de Lactuca sativa
Una vez crecidas las plantulas se utilizaron las hojas y la rafz como fuente de explantos para la obtencion de los microcallos en placa Petri. Las placas Petri con los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4,6 w/m2 a 25 °C, observandose al cabo de 2-3 semanas la aparicion de microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml del medio de cultivo anteriormente descrito suplementado con acido naftalenacetico (1 mg/l) y quinetina (1 mg/l).
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Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de porciones de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml de medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C en las condiciones descritas anteriormente y se subcultivaron cada 16 dfas.
> Lfnea celular: Catharanthus roseus
La lfnea celular de C. roseus (L.) G.Don fue obtenida de German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ; Braunschweig, Alemania, numero PC-1101).
Los callos se mantuvieron a 25°C en oscuridad, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml de un medio que contenfa medio basal LS (Linsmaier & Skoog, F. 1965 Physiol. Plant. 18, 100-127) suplementado con tiamina (0,4 mg/l) y mio-inositol (100 mg/l) y sacarosa (30 g/l) como fuente carbonada, acido alfa-naftalenacetico (0,19 mg/l) y 2,4-diclorofenoxiacetico (0,22 mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfrfa.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml del medio LS sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C en la oscuridad.
> Lfnea celular: Lycopersicon esculentum
Lfnea celular: Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom Lfnea celular: Lycopersicon esculentum variedad Durinta
Las lfneas celulares derivadas del tomate Durinta suministrado por la Wester Seed (Holanda) fueron obtenidas a partir de diferentes tejidos (epidermis y pericarpo) del fruto.
Para ello los frutos se lavaron tres veces con agua jabonosa. Posteriormente se llevo a cabo la desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto e hipoclorito calcico al 7% durante 20 minutos. Tras la desinfeccion, se enjuagaron con abundante agua destilada esteril. Una vez desinfectadas se seleccionaron explantos de 1,5-2,0 mm y se depositaron sobre placas Petri que contenfan un medio de cultivo optimo para la induccion de callos basado en el descrito por Murashige y Skoog (1962), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) e hidrolizado de casefna (250 mg/l); como fuente carbonada se utilizo sacarosa (30 g/l) y 2,4-diclorofenoxiacetico (1 mg/l) como hormona. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (7,5 g/l) cuando el medio se enfrfa.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml de medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C bajo un fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se subcultivaron cada 14-16 dfas.
Lfnea celular: Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom
Para la induccion de callos de Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom se utilizaron vitroplantas obtenidas por germinacion in vitro.
■ Germinacion in vitro de semillas de Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom
Para obtener las vitroplantas de Lycopersicon esculentum se utilizaron semillas suministradas por Ramiro Arnedo S.L. Las semillas se sometieron a un proceso de desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuacion se sumergieron durante 15 minutos en una disolucion de hipoclorito calcico al 7% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada esteril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a tubos que contenfan el medio de cultivo basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) e hidrolizado de casefna (250 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (30 g/l). Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfrfa.
■ Obtencion de callos y mantenimiento de suspensiones celulares de Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom
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Una vez crecidas las plantulas se utilizaron las yemas axilares como fuente de explanto, para la obtencion de los microcallos en el medio de cultivo descrito anteriormente suplementado con acido naftalenacetico (2 mg/l) y benciladenina (2 mg/l). Los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4,6 w/m2 a 25 °C, observandose al cabo de 2 semanas la aparicion de estos microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml del mismo medio de cultivo.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de porciones de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml del medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C en las condiciones descritas anteriormente y se subcultivaron cada 16 dfas.
> Lfnea celular: Taxus sp.
La lfnea celular de Taxus sp se inicio a partir de hojas de plantas cultivadas en los invernaderos de Viveros Bermejo S.L. Para ello las hojas se lavaron tres veces con agua jabonosa. Posteriormente se llevo a cabo la desinfeccion con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuacion se sumergieron durante 20 minutos en una disolucion de hipoclorito calcico al 8% que contenfa Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las hojas se lavaron tres veces con agua destilada esteril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Una vez desinfectadas las hojas se cortaron en fragmentos de 1,5-2,0 mm y se depositaron sobre placas Petri que contenfan un medio de cultivo optimo para la induccion de callos que contiene sales Gamborg (3,05 g/l) suplementado con pantotenato calcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), acido nicotfnico (1 mg/l) e hidrolizado de casefna (500 mg/l). Como fuente carbonada se utilizo sacarosa (30 g/l) y 2,4-diclorofenoxiacetico (2 mg/l) y quinetina (0,2 mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 5,8 y se esteriliza mediante la aplicacion de calor humedo (autoclave) durante 20 min a 1,2 atm de presion, adquiriendo la consistencia solida mediante la adicion de agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfrfa.
Las suspensiones celulares se iniciaron a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 80 ml del medio cultivo sin agar. Las celulas en medio lfquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25°C bajo un fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se subcultivaron cada 20 dfas.
> Lfnea celular: Vitis vinifera cv. Monastrell
La lfnea celular de Vitis vinifera cv. Monastrell se obtuvieron a partir de frutos inmaduros de este cultivar de vid. Para ello, los frutos inmaduros, de aproximadamente 5 mm de diametro, se esterilizaron superficialmente por inmersion en una disolucion de hipoclorito calcico al 7% durante 15 minutos. Transcurrido este tiempo, y siempre bajo condiciones esteriles, las bayas se lavaron tres veces con agua destilada esteril, se eliminaron las semillas y se dividieron en cuatro porciones. Cada una de estas porciones se depositaron en una placa Petri que contenfa un medio de cultivo basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant. 15:473-497), suplementado con vitaminas, hormonas, hidrolizado de casefna, sacarosa y agar, ajustandose el pH a 6,0.
Las placas con los explantos se mantuvieron en oscuridad a 25°C, observandose al cabo de 2-3 semanas la aparicion de microcallos, que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenfan 100 ml del medio anteriormente descrito. Los callos friables obtenidos se subcultivaron cada tres semanas.
Posteriormente, estos callos se transfirieron a medio de cultivo Gamborg B5, suplementado con quinetina (0,2 mg/l), acido naftalenacetico (0,1 mg/l), hidrolizado de casefna (250 mg/l) y sacarosa (20 g/l). Los callos se mantuvieron friables en este estado en condiciones para la obtencion de suspensiones celulares, en oscuridad a 25°C.
Las suspensiones celulares se iniciaron mediante la transferencia de porciones de callo friable en matraces de 250 ml de capacidad, que contenfan 100 ml de medio de cultivo lfquido Gamborg descrito anteriormente. Despues de varios subcultivos de las suspensiones en este volumen se procedio al escalado en matraces de 500 ml de capacidad que contenfan 200 ml de medio de cultivo. Se mantuvieron en agitacion a 105 rpm, en iguales condiciones de oscuridad y temperatura que las descritas para las anteriores y se subcultivaron cada 14-16 dfas.
Elicitacion de las celulas
En cada experiencia de elicitacion se tomaron, en condiciones de esterilidad, entre 420 y 110 gramos de peso fresco de celulas por litro, que habfan sido previamente lavadas con medio fresco y filtradas. Utilizando esta densidad celular, las celulas se repartieron en matraces de 250 ml que contenfan 100 ml de medio fresco:
• solo con una 13-ciclodextrina metilada aleatoriamente con un grado de sustitucion por metilos de entre 1,6 y 1,9 (CDMA) a una concentracion de 62,5 g/l.
• hidroxipropilada aleatoriamente con un grado de sustitucion por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9 (CDHA), a una concentracion de 62,5 g/l.
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• con una de las ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) o (CDHA) a una concentracion 62,5 g/l y con jasmonato de metilo a una concentracion 100 micromolar.
El jasmonato de metilo se esteriliza por filtracion, disuelto en etanol, y posteriormente se mezcla con el resto del medio esteril. La concentracion final de etanol en el medio de cultivo es de 0,043 moles por litro.
Los matraces se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente para su mantenimiento en medio lfquido durante 96 horas.
Muestreo y preparacion de muestras para analisis
Los cultivos celulares incubados con elicitores se recogieron a las 96 horas de tratamiento para su analisis.
En el caso de las suspensiones celulares, las celulas fueron separadas del medio por filtracion realizando un ligero vacfo, recogiendo por separado las celulas y el filtrado. El filtrado se utilizo para la extraccion de los compuestos y posterior analisis por cromatograffa de gases/masas.
Analisis de fitoesteroles en el medio extracelular
Una vez realizados los experimentos de elicitacion, la extraccion de los compuestos secretados al medio de cultivo de las diferentes lfneas celulares, se llevo a cabo mediante particion de fases entre acetato de etilo y agua que contenfa, NaHCO3 al 3% (p/v) y NaCl al 10% (p/v). La fase organica se recogio y se evaporo en un rotavapor a 40 °C a vacfo; el residuo seco se resuspendio en 1 ml de metanol y se procedio a su analisis en el cromatografo de gases/ masas.
Los ensayos se realizaron utilizando un sistema cromatografico Agilent Technologies 6890 Network GS System equipado con un detector de masas Agilent 5973. La separacion de los compuestos se llevo a cabo sobre una columna capilar Agilent 19091 S-433 HP-5MS, con un flujo de 1,0 ml/min de helio como gas portador. La temperatura del inyector se ajusto a 250 °C y el volumen de inyeccion fue de 1 pl. El programa de analisis es el siguiente: inicio a 60 °C con subida hasta 310 °C alcanzando una temperatura maxima de 350 °C. La identificacion de los diferentes compuestos se llevo a cabo mediante la combinacion del analisis del espectro de masas y los tiempos de retencion.
El tiempo de retencion de los diferentes fitoesteroles y la respuesta del detector a la concentracion de los mismos (curva de calibrado para cuantificacion) se determino usando patrones externos.
EJEMPLO 1: Elicitacion de celulas de Lycopersicon esculentum variedad Durinta obtenidas a partir de epidermis del fruto con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (260 g pf/l, 9,2 g ps/l).
Las suspensiones de Lycopersicon esculentum se trataron con:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla A.
Los cultivos elicitados solo con CDs o en combinacion con MeJA, inducen una mayor acumulacion extracelular de estigmasterol siendo el tratamiento con CDHA+MeJA el que produjo un mayor incremento de la produccion respecto al control. Asimismo el tratamiento que produjo un mayor incremento en la biosfntesis de fucosterol fue CDHA con MeJA.
Por otro lado se observo que no existfan diferencias significativas en la produccion de p-sitosterol en los cultivos tratados con MeJA, CDMA y la combinacion de ambos tras 96 horas de elicitacion. Solo los tratamientos con CDHA y la combinacion de CDHA con MeJA se tradujo en un incremento en la produccion de p-sitosterol.
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Estos resultados indican que el tratamiento que origina mayor produccion de fitoesteroles en esta linea celular es la combinacion de CDHA y MeJA.
TABLA A: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Lycopersicon esculentum tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 9,2 g ps/l.
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+Me JA
- estigmasterol
- 0 3 6 5 14 28
- P-sitosterol
- 3 3 4 3 6 11
- fucosterol
- 4 5 26 11 38 67
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 2: Elicitacion de celulas de Lycopersicon esculentum variedad Durinta obtenidas a partir del pericarpo del fruto con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (260 g pf/l, 6 g ps/l).
Las suspensiones de Lycopersicon esculentum se trataron con:
• controles sin CDMA ni MeJA
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular elevada (260 g/pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla B.
De todos los ensayos realizados la utilizacion de CDHA sola o en combinacion con MeJA resulto ser el tratamiento que indujo un mayor incremento en la acumulacion extracelular de estigmasterol, p-sitosterol y fucosterol.
En cuanto a la produccion de taraxasterol no se observaron diferencias significativas con respecto al control.
TABLA C: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Lycopersicon esculentum tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 6 g ps/l.
- Compuestos
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- estigmasterol
- 3 3 7 9 16 19
- P-sitosterol
- 0 4 6 7 12 10
- fucosterol
- 3 4 15 20 39 31
- taraxasterol
- 9 9 4 6 5 5
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Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 3: Elicitacion de celulas de Lycopersicon esculentum variedad Micro-Tom con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular baja (130 g pf/l, 7 g ps/l).
Las suspensiones de Lycopersicon esculentum se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular baja (130 g/pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla C.
Los cultivos elicitados solamente con CDs o en combinacion con MeJA originan los mayores incrementos de la produccion de fitoesteroles respecto a los controles o incluso los tratados solamente con MeJA.
En relacion a la produccion de fucosterol y taraxasterol se observo que aquellos cultivos tratados con CDMA solo o combinado con MeJA son los que producen una mayor acumulacion extracelular.
TABLA C: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Lycopersicon esculentum tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: (7 g ps/l).
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- estigmasterol
- 0 3 14 13 13 12
- P-sitosterol
- 0 3 9 9 7 8
- fucosterol
- 4 0 19 34 19 10
- taraxasterol
- 4 8 263 234 6 64
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA. CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 4: Elicitacion de celulas de Rosa sp con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (420 g pf/l, 12,6 g ps/l).
Las suspensiones de Rosa sp se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
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Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla D.
Tras analizar los resultados se observo que la induccion de la biosfntesis de fitoesteroles en cultivos celulares de Rosa sp elicitados solo con CDs resulto ser mayor que en los elicitados solo con MeJA o en combinacion con CDs, siendo el tratamiento con CDMA el que produjo un mayor incremento.
Este hecho sugiere que el verdadero inductor de la biosfntesis de p-sitosterol y fucosterol en los cultivos de Rosa sp son las CDs.
TABLA D: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Rosa sp tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 12,6 g ps/l
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- P-sitosterol
- 0 4,6 167 62,5 143 98,3
- fucosterol
- 0 5,1 123 58 150 72,8
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 5: Elicitacion de celulas de Rosa sp con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular baja (196 g pf/l, 8,4 g ps/l).
Las suspensiones de Rosa sp se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla E.
El tratamiento que produjo un mayor incremento de la produccion de fitoesteroles es CDMA al igual que los cultivos celulares de Rosa sp elicitados utilizando una alta densidad celular (Tabla D). Sin embargo, en estos ensayos la produccion de p-sitosterol y fucosterol resulto ser del orden de 2 y 3 veces menor que en los ensayos realizados utilizando una densidad celular elevada.
TABLA E: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Rosa sp tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 8,4 g ps/l
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- P-sitosterol
- 0 5,5 52,5 27 39,37 38,25
- fucosterol
- 0 9,8 62,5 37,12 42,62 31,62
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Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 6: Elicitacion de celulas de Capsicum annuum con ciclodextrinas (CDMA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (367 g pf/l, 40 g ps/l).
Las suspensiones de Capsicum annuum se trataron con:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular elevada (367 g/pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla F.
La induccion de la biosfntesis de fitoesteroles en cultivos elicitados solo con CDs resulto ser menor que en los elicitados solo con MeJA. Sin embargo, la abundancia de fitoesteroles es mayor utilizando la combinacion de CDs y MeJA que individualmente por lo se observa un efecto aditivo.
TABLA F: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Capsicum annuum tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 40 g ps/l.
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+M eJA
- campesterol
- 0 16,2 9 31
- P-sitosterol
- 0 81,5 67 163,8
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 7: Elicitacion de celulas de Capsicum chinense con ciclodextrinas (CDMA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (367 g pf/l, 40 g ps/l).
Las suspensiones de Capsicum chinense se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular elevada (367 g/pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla G.
Como se observa en la tabla G la biosfntesis de p-sitosterol se incrementa al realizar los ensayos con CDs sola o en combinacion con MeJA mientras que la elicitacion en presencia de MeJA individualmente produce niveles inferiores. No se detecto produccion de campesterol, fucosterol y estigmasterol en presencia de MeJA pero si con CDs y la combinacion de ambos.
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TABLA G: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Capsicum chinense tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 40 g ps/l.
- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDMA CDMA+MeJA
- estigmasterol
- 0 0 22 20
- P-sitosterol
- 0 8,4 137 141,1
- campesterol
- 0 0 46 33,25
- fucosterol
- 0 0 51,6 25,6
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 8: Elicitacion de celulas de Daucus carota L. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular baja (165 g pf/l, 5 g ps/l).
Las suspensiones de Daucus carota L. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 se trataron con:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular baja (11,2 g pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla H.
Tras analizar los resultados se observo que tanto estigmasterol como campesterol y p-sitosterol se identificaron en aquellos cultivos tratados solo con CDs o en combinacion con MeJA.
La induccion de la biosfntesis de fitoesteroles en cultivos elicitados con CDMA+MeJA resulto ser similar que en los realizados en presencia solo de CDMA.
TABLA H: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Daucus carota L. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 5 g ps/l
- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- estigmasterol
- 0 0 3,6 4,3 3,7 4,9
- P-sitosterol
- 0 0 3,3 3,8 3,6 2,7
- campesterol
- 0 0 3,2 3,6 3,5 3,4
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA. CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 9: Elicitacion de celulas de Daucus carota L. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (330 g pf/l, 11,2 g ps/l).
Las suspensiones se trataron :
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
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Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular baja (11,2 g pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla I.
Al igual que ocurrfa en los experimentos de elicitacion de celulas de Daucus carota L. sativus utilizando una densidad celular baja (Tabla H), estigmasterol, campesterol y p-sitosterol solamente se identificaron en aquellos cultivos tratados con CDs individualmente o en combinacion con MeJA, siendo los niveles de produccion de fitoesteroles similares en todos los tratamientos.
TABLA I: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Daucus carota L. sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 11,2 g ps/l
- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- estigmasterol
- 0 0 6,4 5,7 4,7 5,4
- P-sitosterol
- 0 0 6,1 5,0 4,7 5,0
- campesterol
- 0 0 5,5 4,4 4,5 4,7
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 10: Elicitacion de celulas de Daucus carota variedad Chantenay con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (270 g pf/l, 16,5 g ps/l).
Las suspensiones de Daucus carota variedad Chantenay se trataron:
• controles sin CDMA ni MeJA
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla J.
Estos resultados indican que la produccion de fitoesteroles en esta lfnea celular es similar en todos los tratamientos con CDs solo o en combinacion con MeJA.
TABLA J: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Daucus carota variedad Chantenay tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 16,5 g ps/l
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- estigmasterol
- 0 0 3,46 4,16 3,22 3,87
- P-sitosterol
- 0 0 3,41 3,55 3,22 3,27
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
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CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 11: Elicitacion de celulas de Vitis vinifera cv Monastrell con ciclodextrinas (CDMA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (300 g pf/l, 2,5 g ps/l).
Las suspensiones de Vitis vinifera se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular elevada (300 g/pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla K.
La biosfntesis de fitoesteroles se produjo al realizar los ensayos con CDs mientras que en los cultivos celulares tratados solo con MeJA no se produjo acumulacion extracelular.
TABLA K: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Vitis vinifera cv Monastrell tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 2,5 g ps/l.
- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDMA CDMA+MeJA
- P-sitosterol
- 0 0 37,4 31,6
- fucosterol
- 0 0 7,5 0
Control: medio de cultivo sin elicitores MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l CDMA: tratamiento con 62,5 g/l
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 12: Elicitacion de celulas de Catharanthus roseus (L.) G.Don con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (232 g pf/l, 9,2 g ps/l).
Las suspensiones de Catharanthus roseus (L.) G. Don se trataron con:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular baja (11,2 g pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla L.
Los cultivos elicitados solamente con CDs o en combinacion con MeJA originaron produccion de fitoesteroles. Los ensayos realizados en presencia de CDs originaron un aumento de la acumulacion extracelular de fitoesteroles. En todos los casos se observa una produccion baja de fitoesteroles por lo que el efecto o el agente inductor son las CDs.
TABLA L: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Catharanthus roseus (L.) G.Don tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 9,2 g ps/l
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- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDHA CDHA+MeJA
- campesterol
- 0 0 3,3 3,4
- P-sitosterol
- 0 0 2,8 0
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA. CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 13: Elicitacion de celulas de Catharanthus roseus (L.) G.Don con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular baja (110 g pf/l, 6 g ps/l).
Las suspensiones de Catharanthus roseus (L.) G.Don se trataron con:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo utilizando una densidad celular baja (110 g pf/l). Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla M.
Solamente los cultivos celulares elicitados con CDs incrementaron la produccion de campesterol y p-sitosterol respecto al resto de tratamientos. Por lo cual en Catharanthus roseus (L.) G.Don las CDs producen un aumento de la biosfntesis de fitoesteroles.
TABLA M: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol l de Catharanthus roseus (L.) G.Don tras 96 horas de incubacion. Densidad celular: 6 g ps/l
- COMPUESTO
- CONTROL MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- P-sitosterol
- 0 0 4,7 0 3,29 0
- campesterol
- 0 0 3,86 0 2,78 0
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA.
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
EJEMPLO 14: Elicitacion de celulas de Lactuca sativa obtenidas a partir de hojas con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (250 g pf/l, 3 g ps/l).
Las suspensiones de Lactuca sativa se trataron:
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla N.
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Los cultivos elicitados solo con CDs o en combinacion con MeJA, inducen una mayor acumulacion extracelular de fitoesteroles siendo el tratamiento con CDMA el que produjo un mayor incremento de la produccion respecto al control y los cultivos tratados solo con MeJA.
Por otro lado se observo que no existfan diferencias significativas en la produccion de fitoesteroles en los ensayos realizados con CDMA+MeJA, CDHA y CDHA+MeJA.
TABLA N: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Lactuca sativa tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 2,8 g ps/l
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- campesterol
- 0 0 5,36 3,18 3,17 3,11
- estigmasterol
- 0 0 6,05 3,63 4,31 4,4
- P-sitosterol
- 0 0 5,63 3,66 3,43 3,33
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
EJEMPLO 15: Elicitacion de celulas de Lactuca sativa obtenidas a partir de rafz con ciclodextrinas (CDMA y CDHA) y jasmonato de metilo (MeJA) utilizando una densidad celular elevada (250 g pf/l, 3 g ps/l).
Las suspensiones de Lactuca sativa se trataron :
• sin CDMA ni MeJA (controles)
• con MeJA (100 micromoles/l)
• con CDMA (62,5 g/l)
• con CDMA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
• con CDHA (62,5 g/l)
• con CDHA (62,5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las celulas y el medio de cada matraz por separado, las celulas se pesaron y se determino la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del experimento se muestra en la Tabla N.
Al igual que ocurrfa en los experimentos de elicitacion de celulas de Lactuca sativa obtenidas a partir de hoja (Tabla N), estigmasterol, campesterol y p-sitosterol solamente se identificaron en aquellos cultivos tratados con CDs individualmente o en combinacion con MeJA, siendo los niveles de produccion de fitoesteroles similares en todos los tratamientos.
TABLA N: Produccion de fitoesteroles expresados en mg/l de p-sitosterol de Lactuca sativa tras 96 horas de tratamiento. Densidad celular: 3 g ps/l
- Compuesto
- Control MeJA CDMA CDMA+MeJA CDHA CDHA+MeJA
- campesterol
- 0 0 5,53 4,41 4,51 2,17
- estigmasterol
- 0 0 6,45 5,70 4,72 5,13
- P-sitosterol
- 0 0 6,12 4,96 4,71 5,02
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de MeJA
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA
5 CDMA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MeJA CDHA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62,5 g/l de CDHA combinado con 100 micromoles/l de MeJA
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Claims (18)
- 51015202530354045505560REIVINDICACIONES1. Procedimiento para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles que comprende:a. anadir ciclodextrinas a un medio de cultivo,b. poner en contacto celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol con el medio de cultivo de (alc. incubar las celulas del paso b) en el medio de cultivo del paso a),d. separar los fitoesteroles obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
- 2. Procedimiento segun la reivindicacion anterior, donde las celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol del paso (a) proceden de plantas de los generos que se seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum, Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
- 3. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las celulas vegetales con el potencial de producir fitoesterol proceden de vitroplantas.
- 4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las ciclodextrinas se seleccionan del grupo que comprende ciclodextrina metilada aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada.
- 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitucion por metilos de entre 1 y 3.
- 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente es dimetilada.
- 7. Procedimiento segun la reivindicacion 4 donde la ciclodextrina hidroxipropilada aleatoriamente tiene un grado desustitucion por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9.
- 8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la ciclodextrina es una p-ciclodextrina.
- 9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la concentracion de ciclodextrinas en elmedio de cultivo del paso (a) es de entre 6,5 y 130 g/l.
- 10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la concentracion de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 10 y 100 g/l.
- 11. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la concentracion de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 50 y 75 g/l.
- 12. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde ademas de anadir ciclodextrinas al medio de cultivo del paso (a) se anade jasmonato de metilo.
- 13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, donde la concentracion de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 5 y 500 micromoles/litro.
- 14. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde la concentracion de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 25 y 150 micromoles/litro.
- 15. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde la concentracion de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 75 y 125 micromoles/ litro.
- 16. Uso de una composicion que comprende ciclodextrinas para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles en celulas con el potencial de producir fitoesterol.
- 17. Uso de un medio de cultivo que comprende ciclodextrinas para incrementar la produccion y/o extraccion de fitoesteroles en celulas con el potencial de producir fitoesterol.
- 18. Uso de una composicion segun la reivindicacion 16 o de un medio de cultivo segun la reivindicacion 17, donde la composicion o el medio de cultivo ademas comprende jasmonato de metilo.
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| WO2010049563A1 (es) | 2010-05-06 |
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