ES2337017T3

ES2337017T3 - Procedimiento para obtener respuestas inmunitarias celulares de proteinas.

Info

Publication number: ES2337017T3
Application number: ES00968937T
Authority: ES
Inventors: Derek O'hagan; Manmohan Singh
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-10-13
Filing date: 2000-10-10
Publication date: 2010-04-20
Anticipated expiration: 2020-10-10
Also published as: AU7877900A; WO2001026681A2; US7604802B2; US6534064B1; CA2388676A1; PT1221968E; EP1221968A2; WO2001026681A3; JP2003511420A; DE60043708D1; ATE454901T1; US20030104067A1; EP1221968B1; JP2011116796A

Abstract

Una composición inmunógena que comprende un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que dicho primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína que es diferente estructuralmente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimeinto que comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución acuosa de una proteína; (b) añadir un agente de precipitación a la solución acuosa de la proteína y agitar la mezcla resultante para formar la partícula de proteína; (c) estabilizar dicha partícula de proteína mediante un tratamiento de estabilización; y (d) recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa.

Description

Procedimiento para obtener respuestas inmunitarias celulares de proteínas.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a agentes inmunógenos y a agentes que mejoran la respuesta inmunitaria a un antígeno seleccionado. En particular, la invención se refiere al uso de proteínas como antígenos para obtener respuestas inmunitarias celulares.

Antecedentes

Se han desarrollado numerosas formulaciones de vacunas que incluyen patógenos atenuados o antígenos de subunidades proteicas. Las composiciones de vacuna convencionales a menudo incluyen adyuvantes inmunológicos para mejorar las respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales. Por ejemplo, frecuentemente se utilizan adyuvantes de depósito que adsorben y/o precipitan los antígenos administrados y que pueden retener el antígeno en el sitio de inyección. Entre los adyuvantes de depósito típicos se incluyen los compuestos de aluminio y las emulsiones de agua en aceite. Sin embargo, los adyuvantes de depósito, aunque aumentan la antigenicidad, frecuentemente provocan reacciones locales persistentes y severas, como granulomas, abscesos y cicatrices, al ser inyectados subcutánea o intramuscularmente. Otros adyuvantes, como los lipopolisacáridos, pueden provocar respuestas pirógenas al ser inyectados y/o síntomas de Reiter (síntomas similares a la gripe, molestia generalizada en las articulaciones y, en ocasiones, uveítis anterior, artritis y uretritis). Se han utilizado también saponinas, como Quillaja saponaria, como adyuvantes inmunológicos en composiciones de vacuna contra una variedad de enfermedades.

Más en particular, el adyuvante completo de Freund (ACF) es un potente agente inmunoestimulante que ha sido utilizado con éxito con muchos antígenos en base experimental. El ACF incluye tres componentes: un aceite mineral, un agente emulsionante y micobacterias inactivadas, como Mycobacteríum tuberculosis. Aunque efectivo como adyuvante, el ACF presenta severos efectos secundarias principalmente debido a la presencia del componente micobacteriano, incluidos dolor, formación de abscesos y fiebre. Por lo tanto, no se utiliza el ACF en vacunas humanas y veterinarias.

El adyuvante incompleto de Freund (AIF) es similar al ACF pero no incluye el componente bacteriano. El AIF, aunque no está aprobado para uso en los Estados Unidos, ha sido utilizado en otras partes en vacunas humanas contra la gripe y la polio, y en vacunas veterinarias contra la rabia, el moquillo y la fiebre aftosa. Sin embargo, hay pruebas de que tanto el aceite como el emulsionante utilizados en el IFA pueden causar tumores en los ratones.

A pesar de la presencia de dichos adyuvantes, las vacunas convencionales muchas veces no consiguen proporcionar la protección adecuada contra el patógeno diana. A este respecto, hay un cúmulo de indicios que sugieren que la vacunación contra patógenos intracelulares, como una serie de virus, debería dirigirse tanto al brazo celular como humoral del sistema inmunitario. Más en particular, los linfocitos T citotóxicos (LTC) tienen un papel importante en la defensa inmunitaria mediada por célula contra patógenos intracelulares como virus y antígenos específicos tumorales producidos por células malignas. Los LCT median la citotoxicidad de las células infectadas viralmente mediante el reconocimiento de determinantes virales en conjunción con moléculas de CPH de clase I que se observan en las células infectadas. La expresión citoplásmica de proteínas es un prerrequisito para el procesamiento del CPH de clase I y la presentación de péptidos antigénicos a los CTC. Sin embargo, la inmunización con virus inactivados o atenuados frecuentemente no consigue producir los LCT necesarios para frenar la infección intracelular. Además, las técnicas de vacunación convencionales contra virus que exhiben una marcada heterogeneidad genética y/o tasas de mutación rápidas que facilitan la selección de variantes de escape inmunitario, como VIH o gripe, son problemáticas. Por consiguiente, se han desarrollado técnicas de vacunación alternativas.

Se han utilizado portadores particulados con antígenos adsorbidos o inmovilizados en un intento por sortear estos problemas y obtener las respuestas inmunitarias adecuadas. Dichos portadores presentan múltiples copias de un antígeno seleccionado al sistema inmunitario y promueven la inmovilización y la retención de antígenos en los ganglios linfáticos. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y pueden aumentar la presentación de antígenos por medio de la liberación de citocinas. Los ejemplos de portadores particulados incluyen los derivados de polímeros de metacrilato de polimetilo, así como también partículas de polímero derivadas de poli(láctidas) y poli(lactida-co-glicólidos), conocidos como PLG. Aunque ofrecen ventajas significativas con relación a otros sistemas más tóxicos, las partículas de PLG que contienen antígeno presentan algunos inconvenientes. Por ejemplo, la producción a gran escala y la fabricación de portadores particulados pueden resultar problemáticas debido al alto costo de los polímeros utilizados en la fabricación de los portadores particulados.

Se han empleado también liposomas en un intento por superar estos problemas. Los liposomas son vesículas microscópicas formadas a partir de constituyentes lípidos como fosfolípidos que se utilizan para inmovilizar agentes farmacéuticos. Aunque el uso de liposomas como un sistema de administración de fármacos mitiga algunos de los problemas, según se describe anteriormente, los liposomas exhiben una baja estabilidad durante el uso y el almacenamiento, y su producción y fabricación a gran escala resulta problemática.

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La publicación internacional N.º WO 98/50071 describe el uso de partículas similares a virus (PSV) como adyuvantes para mejorar las respuestas inmunitarias de los antígenos administrados con las PSV. St. Clair et al. describe el uso de los cristales de proteínas para mejorar las respuestas celulares y humorales. (St. Clair, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:9469-9474, 1999). Diminsky et al. (Vaccine, 15:637-647, 1997) se refiere a las partículas de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) derivadas del mamífero o de levadura, y a su uso en ratones.

Wade-Evans et al. (J. Gen. Virol., 78: 1611-1616, 1997) describe cristales de la proteína nuclear externa mayor (VP7) del virus de la peste equina (VPE), que se cristaliza espontáneamente en el curso de la purificación viral, y su uso como vacuna en ratones.

Raz et al. (Vaccine, 14:207-211, 1996) trata la vacunación de niños con una dosis reducida de una formulación de vacuna contra la hepatitis B recombinante derivada de células de mamíferos (Bio-Hep-B). La vacuna contenía partículas que albergaban proteínas de superficie del VHB.

El documento US 5,955,342 se refiere a composiciones inmunógenas adecuadas para uso como vacunas, que comprenden partículas similares a retrovirus no infecciosos.

El documento EP-A-0339668 se refiere al antígeno del virus de la hepatitis A (VHA) eficaz para la preparación de vacunas compuestas por partículas inmaduras vacías libres del ARN de virus.

Raychaudhuri et al. (Nature Biotechnology, 16: 1025-1031, 1998) examina los sistemas de administración de vacunas y menciona que las preparaciones de proteínas particuladas (como PSV) son capaces de promover los linfocitos T citotóxicos (LTC).

Speidel et al. (Eur. J. Immunol. 27:2391-1399, 1997) se refieren a la promoción de respuestas de los LTC in vivo por medio del uso de antígenos de proteínas agregadas mediante calor.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto que sorprendentemente las partículas de proteína son agentes inmunógenos autónomos que producen respuestas inmunitarias celulares. En particular, el ingrediente activo es también el sistema de administración, es decir, las partículas de proteína actúan como el antígeno y el sistema de administración. Además, los inventores han descubierto que las partículas de proteína presentan varias ventajas (i) son fáciles de fabricar, (ii) su fabricación es más rentable que la de los agentes existentes, (iii) proporcionan respuestas inmunitarias superiores, y (iv) presentan una toxicidad reducida y eliminan los efectos colaterales indeseados observados con otras formulaciones de vacuna. Por consiguiente, la invención se dirige principalmente al uso de dichas partículas de proteína como antígenos.

La invención proporciona una composición inmunógena que comprende un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que dicho primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína estructuralmente diferente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(b): añadir un agente de precipitación a la solución acuosa de proteína y agitar la mezcla resultante para formar la partícula de proteína;

(c): estabilizar dicha partícula de proteína mediante un tratamiento de estabilización; y

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa.

La invención proporciona también la composición inmunógena de la invención para uso en la producción de una respuesta de los linfocitos T citotóxicos (LTC) en un individuo vertebrado. La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunógena que comprende proporcionar un primer antígeno seleccionado y combinar dicho primer antígeno con un excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo dicho primer antígeno una partícula de proteína estructuralmente diferente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa, y donde dicha partícula de proteína es capaz de producir una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC).

La invención también proporciona el uso de un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que dicho primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína que es estructuralmente diferente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(b): añadir un agente de precipitación a la solución acuosa de la proteína y agitar la mezcla resultante para formar la partícula de proteína;

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa, para la fabricación de un medicamento para uso en la producción de una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC) en un individuo vertebrado.

Se presentan otros aspectos de la invención en las reivindicaciones anexas.

Sumario de la exposición

En un aspecto, la exposición se dirige a una composición inmunógena que comprende un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína y además en la que el antígeno de la partícula de proteína es capaz de producir una respuesta inmunitaria celular. En aspectos preferidos, la partícula de proteína se forma a partir de una proteína seleccionada del grupo compuesto por una proteína viral, fúngica, bacteriana, aviar o mamífera. En aspectos más preferidos, la proteína es una glicoproteína B2 del virus herpes simple (gB2 de VHS), una proteína del virus de la hepatitis C (VHC) o del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

En otro aspecto, la composición inmunógena comprende además un adyuvante, en la que el adyuvante se encuentra encapsulado dentro de la partícula de proteína, adsorbido en ésta, o conjugado o mezclado con ésta.

En un aspecto adicional, la composición inmunógena comprende además un segundo antígeno, siendo el segundo antígeno distinto del primer antígeno, es decir la partícula de proteína. El segundo antígeno puede ser un antígeno soluble o neutralizante, puede estar conjugados en la partícula de proteína o puede estar asociado con un portador (por ejemplo, el segundo antígeno puede estar encapsulado dentro del portador, adsorbido en éste o conjugado con éste). En ciertos aspectos preferidos, los portadores incluyen, sin limitación, proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (como gotitas de aceite o liposomas), portadores particulados poliméricos y partículas de virus inactivos. En aspectos más preferidos, los portadores comprenden una partícula polimérica, comprendiendo la partícula polimérica un polímero seleccionado del grupo compuesto por a poli(\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido.

En un aspecto alternativo, la exposición se dirige a una composición inmunógena que comprende un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína, y además en la que la partícula de proteína se produce mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(c): estabilizar dicha partícula de proteína mediante un tratamiento de estabilización y

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa.

En un aspecto alternativo, la solución acuosa en la etapa (a) comprende además un ácido, siendo el ácido ácido acético, ácido glicólico, ácido hidroxibutírico, ácido clorhídrico o ácido láctico. En aspectos preferidos, el agente de precipitación comprende aceites, hidrocarburos o agentes de coacervación. En realizaciones preferidas adicionales, el tratamiento de estabilización comprende tratamiento con calor o tratamiento con un agente químico de reticulación.

En un aspecto preferido, la partícula de proteína es capaz de producir una respuesta inmunitaria celular; y se forma a partir de una proteína seleccionada del grupo compuesto por un proteína viral, fúngica, bacteriana, aviaria o mamífera. En un aspecto más preferido, la proteína es la glicoproteína B2 del virus herpes simple (gB2 de VHS), el virus de la hepatitis C (VHC) o el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En ciertos aspectos preferidos, la respuesta inmunitaria celular puede ser una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC). En otro aspecto, la composición inmunógena o de vacuna comprende además un adyuvante y/o un segundo antígeno, según se describe anteriormente, donde la partícula de proteína es capaz de actuar como un antígeno y/o un adyuvante.

En otro aspecto, la exposición de referencia se dirige a un procedimiento para la producción de un respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC) en un individuo vertebrado que comprende administrar al sujeto vertebrado una composición inmunógena o de vacuna que comprende la partícula de proteína, según se describe anteriormente. La partícula de proteína se administra en una cantidad eficaz para provocar una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC) en el individuo vertebrado. Las partículas de proteína pueden coadministrarse al sujeto antes, después o en forma concomitante a un adyuvante y/o un segundo antígeno.

En otro aspecto, la exposición se dirige a un procedimiento de inmunización que comprende administrar a un individuo vertebrado una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición inmunógena o de vacuna que comprende la partícula de proteína, según lo expuesto anteriormente.

Los entendidos en la técnica podrán fácilmente determinar éstos y otros aspectos de la presente invención a la luz de la presente exposición.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra el efecto de la ovalbúmina (OVA), partículas de proteína OVA y partículas de proteína PLG/OVA sobre la lisis específica porcentual de dianas.

La figura 2 ilustra la actividad de LCT de la formulación de la proteína gB2, partículas de proteína gB2 y las partículas de proteína PLG/gB2.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de virología, química, bioquímica, tecnología recombinante, inmunología y farmacología, dentro de la pericia de la técnica. La explicación de dichas técnicas se encuentra en la bibliografía existente. Véase, por ejemplo, Virology, 3.ª Edición, vol. I & II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds., 1996); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.ª Edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Procedures in Enzymology S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.ª Edición, 1989); y DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.).

Según se las utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/a" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, que se definen como se indica a continuación.

Según se lo utiliza en la presente, el término "partícula de proteína" se refiere a una partícula hecha de una proteína, donde el término "proteína" se refiere a péptidos, polipéptidos, metaloproteínas, glicoproteínas y lipoproteínas. En realizaciones preferidas, las proteínas a partir de las cuales se forman las partículas de proteína incluyen, sin limitación, proteínas virales, proteínas fúngicas, proteínas bacterianas, proteínas aviarias, proteínas mamíferas y proteínas eucarióticas como, sin limitación, albúmina, gelatina, zeína, caseína, colágeno y fibrinógeno. En realizaciones más preferidas, las proteínas a partir de las cuales se forman las partículas de proteína incluyen, sin limitación, proteínas de la familia del virus herpes, incluidas las proteínas derivadas del virus herpes simple (VHS) de tipo 1 y 2, como las glicoproteínas gB de VHS-1 y VHS-2, gD y gH; proteínas derivadas del citomegalovirus (CMV) incluidas las gB y gH de CMV; proteínas derivadas de la familia del virus de la hepatitis), incluido el virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis delta (VHD), virus de la hepatitis E (VHE) y virus de la hepatitis G (VHG); proteínas, incluidas las proteínas de envoltura gp120, gp160, gyp41, p24gag y p55gag derivadas de VIH, incluidos miembros de varios subtipos genéticos de aislados de VIH, VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH_{LAV}, VIH_{LAI}, VIH_{MN}, VIH-1_{CM235}, VIH_{US4}, VIH-2; proteínas derivadas de virus de inmunodeficiencia símica (VIS); proteínas derivadas de Neisseria meningitidis (A, B, C, Y), Hemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter pylori; albúmina de suero humano y ovalbúmina. Se conocen en la técnica los procedimientos para la producción de partículas de proteína particulares y se exponen más detalladamente a continuación.

Las partículas de proteína tienen las siguientes características físicas. Las partículas de proteína son de aproximadamente alrededor de 150 nm a alrededor de 10 \mum, preferentemente de alrededor de 200 nm a alrededor de 4 \mum, más preferentemente de alrededor de 250 nm a alrededor de 3 \mum. Las partículas de proteína son generalmente de forma esférica y poseen un diámetro entre alrededor de 200 nm y alrededor de 10 \mum, preferentemente entre alrededor de 500 nm y alrededor de 5 \mum, más preferentemente entre alrededor de 1 \mum y alrededor de 3 \mum. En general, se obtienen partículas de proteína mediante la desnaturalización y la reticulación de la proteína, seguido de la estabilización de la proteína reticulada. Los procedimientos para la producción de partículas de proteína particulares se exponen más detalladamente a continuación.

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Pueden emplearse varias técnicas de detección para confirmar que las proteínas hayan tomado la conformación de partículas de proteína. Dichas técnicas incluyen microscopía de electrones, cristalografía de rayos X y técnicas afines. Véase, por ejemplo, Baker et al., Biophys. J. (1991) 60:1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68:4503-4505. Por ejemplo, la criomicroscopía de electrones puede desarrollarse en muestras acuosas vitrificadas de la preparación de partículas de proteína en cuestión y las imágenes registradas tomadas en condiciones de exposición adecuadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a polímeros de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima del producto. Así, se incluyen los péptidos, los oligopéptidos, los dímeros, los multímeros y similares dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de estas quedan comprendidos dentro de la definición. Los términos incluyen también modificaciones, como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras por naturaleza) en la secuencia nativa, siempre que la proteína sea capaz de actuar como un antígeno y provocar una respuesta del CTC.

Las sustituciones preferidas son aquéllas conservadoras por naturaleza, es decir, las sustituciones que se desarrollan dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácida-aspartato y glutamato; (2) básica-lisina, arginina, histidina; (3) no polar-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargada-glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina treonina, tirosina. A veces se clasifica la fenilalanina, el triptofano y la tirosina como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, puede predecirse razonablemente que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un impacto significativo en la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad de la proteína, quedan por tanto comprendidas dentro de la definición del polipéptido de referencia.

Una partícula de proteína (es decir, un primer antígeno seleccionado) es "distinta de" un segundo antígeno seleccionado cuando el segundo antígeno no está inmovilizado dentro las partículas de proteína y/o el segundo antígeno y las partículas de proteína no se expresan conjuntamente como una proteína de fusión. Sin embargo, se considera que una partícula de proteína es "distinta de" un segundo antígeno seleccionado aun si hay una asociación física laxa entre el segundo antígeno y las partículas de proteína, siempre que el segundo antígeno no esté unido covalentemente a la superficie de la partícula de proteína, o esté inmovilizado o adsorbido en ésta.

Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (ya sea lineales, conformacionales o ambos) que suscitan una respuesta inmunológica, según se define a continuación. El término se utiliza de forma intercambiable con el término "inmunógeno". Normalmente, un epítopo de célula B incluye al menos alrededor de 5 aminoácidos pero puede comprender de 3 a 4 aminoácidos. Un epítopo de linfocito T, como un epítopo de LCT, incluirá al menos alrededor de 7 a 9 aminoácidos y un epítopo de linfocito T auxiliar de al menos de alrededor de 12 a 20 aminoácidos. El término "antígeno" denota tanto antígenos subunitarios, es decir, antígenos que están separados y se diferencian de un organismo completo al que se asocia antígeno en su estado natural, así como también bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios inactivos, atenuados o inactivados. Quedan comprendidos también dentro de la definición de antígeno los anticuerpos, como anticuerpos antiidiotipo, o fragmentos de estos, y mimótopos de péptido sintético que pueden imitar a un antígeno o determinante antigénico, según se establece en la presente. De forma similar, se incluye también, en la presente definición de antígeno, un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o determinante antigénico in vivo, como en la terapia génica y aplicaciones de inmunización de ADN.

Para los fines de la presente invención, los antígenos pueden derivarse de varios de los muchos virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, según se describe más en detalle a continuación. El término denota también cualesquiera de los varios antígenos tumorales. Además, para los fines de la presente invención, un "antígeno" se refiere a un polinucleótido y una proteína que incluye modificaciones, como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras por naturaleza), a la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la capacidad de promover una respuesta inmunológica, según se define en la presente. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida a sitio, o pueden ser accidentales, como a través de mutaciones de huéspedes que producen antígenos.

Por "un lisado de H. pylori" se entiende un extracto o lisado derivado de una bacteria completa de H. pylori de tipo I o tipo II que incluye uno o más antígenos de H. pylori. Así, el término denota extractos brutos que contienen varios antígenos de H. pylori, así como también composiciones relativamente purificadas derivadas de dichos lisados brutos que incluyen únicamente uno o varios de dichos antígenos. Dichos lisados se preparan utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Los antígenos representativos que pueden encontrarse presentes en dichos lisados, ya sea solos o en combinación, incluyen uno o más antígenos derivados de las adhesiones de H. pylori como, sin limitación, una hemaglutinina fibrilar que se une a \alpha-acetil-neuraminil-lactosa de 20 kDa (HpaA), una proteína de 63 kDa que se une a una estructura similar a pilus fimbrial conservada. Véase, por ejemplo, Telford et al., Trends in Biotech. (1994) 12:420-426 para una descripción de estos antígenos. Otros antígenos que pueden encontrarse presentes en el lisado incluyen epítopos derivadas de cualquiera de las distintas flagelinas como la flagelina mayor, FlaA, y la flagelina menor, FlaB. A este respecto, las flagelas de H. pylori están compuestas por FlaA y FlaB, cada una con un peso molecular de aproximadamente 53 kDa. Otro antígeno representativo incluye la ureasa de H. pylori que se asocia con la membrana externa y el espacio periplásmico de las bacterias. La holoenzima es un gran complejo compuesto por dos subunidades de 26,5 kDa (UreA) y 61 kDa (UreB), respectivamente. Pueden encontrarse presentes los epítopos derivados de la holoenzima, ya sea de las subunidades, o de una combinación de los tres, y se incluyen dentro de la definición de "ureasa" en la presente. Otro antígeno representativo que puede encontrarse presente en el lisado o utilizarse en una forma adicionalmente purificada incluye una proteína de choque térmico de H. pylori conocida como "pct60." Se conocen el ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente a la pct60. Véase, por ejemplo, la publicación internacional N.º WO 93/18150, publicada el 16 de septiembre de 1993. El antígeno de la pct60 de longitud completa mostrado tiene alrededor de 546 aminoácidos y un peso molecular de alrededor de 58 kDa. Los antígenos de VacA y CagA pueden encontrarse también presentes en dichos lisados. Se entenderá que el lisado puede incluir también otros antígenos no específicamente descritos en la presente.

Por "antígeno de VacA" se entiende un antígeno según se lo define anteriormente que se deriva del antígeno conocido como la citotoxina de tipo I de H. pylori. La proteína de VacA induce la vacuolización en células epiteliales en el cultivo de tejidos y provoca daños tisulares importantes y ulceración cuando se la administra a ratones. Se conoce el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes para VacA y se presentan en, por ejemplo, la publicación internacional N.º WO 93/18150, publicada el 16 de septiembre de 1993. El gen para el antígeno de VacA codifica un precursor de alrededor de 140 kDa que se procesa para una molécula activa de alrededor de 90-100 kDa. Esta molécula, a su vez, se escinde proteolíticamente de forma lenta para generar dos fragmentos que se copurifican con la molécula intacta de 90 kDa. Véase, Telford et al., Trends in Biotech. (1994) 12:420-426. Así, la definición de "antígeno de VacA", según se lo utiliza en la presente, incluye la proteína precursora, así como también la molécula activa procesada, los fragmentos proteolíticos de la misma o porciones o muteínas de la misma, que retienen la reactividad específica con anticuerpos presentes en una muestra biológica de un individuo con una infección de H. pylori
de tipo I.

Por "antígeno de CagA" se entiende un antígeno, según se lo define anteriormente, que deriva del antígeno inmunodominante asociado con la citotoxina de tipo I de H. pylori. CagA se expresa en la superficie bacteriana. Se conoce el ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente para CagA. Véase, por ejemplo, la publicación internacional N.º WO 93/18150, publicada el 16 de septiembre de 1993. El antígeno de CagA de longitud completa descrito allí incluye alrededor de 1147 aminoácidos con un peso molecular predecido de alrededor de 128 kDa. La proteína nativa muestra variabilidad de tamaño inter-cepas debido a la presencia de una cantidad variable de repeticiones de un segmento de ADN de 102 bp que codifica repeticiones de un secuencia de aminoácidos rica en prolina. Véase, Covacci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5791-5795. Por consiguiente, el peso molecular presentado de CagA oscila entre alrededor de 120 y alrededor de 135 kDa. Por lo tanto, la definición de "antígeno de CagA", según se lo utiliza en la presente, incluye cualesquiera de las varias variantes de CagA, sus fragmentos y muteínas, que retienen la capacidad de reaccionar con anticuerpos en una muestra biológica de un individuo con infección de H. pylori de tipo I. Por ejemplo, el polipéptido de CagA descrito en la Figura 3 es una proteína truncada de 268 aminoácidos e incluye Glu-748 a Glu-1015, inclusive, de la molécula de longitud completa. Además, la definición de "antígeno de CagA", según se lo utiliza en la presente, incluye la proteína Nap del antígeno de H. pylori. Véase, por ejemplo, PCT IB99/00695 (WO99/53310) por una descripción de la proteína Nap de H. pylori y los procedimientos para
purificarla.

Una proteína o polipéptido "purificado" es una proteína que se produce recombinante o sintéticamente, o que se aísla de su huésped natural, de modo que la cantidad de proteína presente en una composición es sustancialmente superior que la presente en una preparación bruta. En general, una proteína purificada será homogénea en al menos alrededor del 50% y más preferentemente homogénea en al menos alrededor del 80% al 90%.

Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o composición es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmunitaria celular y/o humoral al antígeno presente en la composición de interés. Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmunitaria humoral" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por moléculas de anticuerpos, mientras que una "respuesta inmunitaria celular" es una mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos. Un aspecto importante de la inmunidad celular involucra una respuesta específica a antígeno por parte de linfocitos T citolíticos (LTC). Los LCT presentan especificidad para antígenos peptídicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y se expresan en las superficies de las células. Las LCT auxilian en la inducción y promoción de la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular involucra una respuesta específica a antígeno por parte de los linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T auxiliares actúan como auxilio en la estimulación de la función y se centran en la actividad de las células efectoras no específicas frente a las células que exhiben antígenos peptídicos en asociación con moléculas de CPH en su superficie. Una "respuesta inmunitaria celular" se refiere también a la producción de citocinas, quimiocinas y otras de tales moléculas producidas por linfocitos T activados y/u otros glóbulos blancos, incluidas las derivadas de los linfocitos T de CD4+ y CD8+.

Una composición inmunógena o vacuna que suscita una respuesta inmunitaria celular puede servir para sensibilizar a un individuo vertebrado mediante la presentación de un antígeno en asociación con moléculas del CPH en la superficie celular. La respuesta inmunitaria mediada por célula está dirigida a las células que presentan antígeno en su superficie o en sus cercanías. Además, pueden generarse linfocitos T específicos de antígenos para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.

Puede determinarse la capacidad de un antígeno particular de estimular una respuesta inmunológica mediada por célula a través de distintos ensayos, como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos celulares citotóxicos de LCT, o sometiendo a ensayo linfocitos T específicos para el antígeno en un individuo sensibilizado. Estos ensayos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376.

Por consiguiente, una respuesta inmunológica, según se la utiliza en la presente, puede ser una que estimule la producción de LCT y/o la producción o activación de linfocitos T auxiliares. El antígeno de interés puede promover también una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo. Por lo tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: producción de anticuerpos mediante, por ejemplo, sin limitación, linfocitos B y/o activación de linfocitos T supresores y/o linfocitos T y \delta dirigidas específicamente a un antígeno, o antígenos presentes en la composición o la vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la patogenicidad, y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) o complementaria a anticuerpos para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Pueden determinarse dichas respuestas por medio de la utilización de inmunoensayos y ensayos de neutralización conocidos en la técnica.

Una composición inmunógena o de vacuna que contiene una partícula de proteína de antígeno de la presente invención, o una composición inmunógena o de vacuna que comprende un adyuvante y/o un segundo antígeno que es coadministrado con la partícula de proteína de antígeno de referencia, exhibe "inmunogenicidad mejorada" cuando posee una mayor capacidad para promover una respuesta inmunitaria que la respuesta inmunitaria suscitada por una cantidad equivalente de antígeno administrada utilizando un sistema de administración diferente, por ejemplo, donde el antígeno se administra como una proteína soluble, o como un antígeno que contiene portador particulado (por ejemplo, el antígeno es adsorbido o encapsulado en una partícula de PLG). Por consiguiente, una composición inmunógena o de vacuna puede exhibir una "inmunogenicidad mejorada" porque el antígeno es más fuertemente inmunogénico o porque es necesaria una dosis inferior o menos dosis de antígeno para lograr una respuesta inmunitaria en el individuo al que se le administra el antígeno. Dicha inmunogenicidad mejorada puede determinarse administrando una composición de partículas de proteína y controles de antígeno a animales y comparando las titulaciones de anticuerpos y/o inmunidad mediada por células frente a ambos utilizando los ensayos estándar descritos anteriormente.

Para los fines de la presente invención, una "cantidad eficaz" de una partícula de proteína de antígeno será la cantidad que, al ser administrada, promueva una respuesta inmunológica o mejore la respuesta inmunológica de un antígeno coadministrado.

Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro de la subphylum chordata, con inclusión, sin limitación, de humanos y otros primates, incluidos los primates no humanos como chimpancés y otros simios y especies de monos, animales de granja como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; animales domésticos como perros y gatos; animales de laboratorio, incluidos roedores como ratones, ratas y cobayos; aves, incluidas aves domésticas, silvestres y de caza como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y otros. El término no denota una edad particular. Por consiguiente, se pretende incluir tanto a individuos adultos como a recién nacidos. El sistema descrito anteriormente está destinado a uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores ya que el sistema inmunitario de todos estos vertebrados funciona de forma similar.

Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otra forma, es decir, que se puede administrar el material a un individuo junto con la formulación de partículas de proteína sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición que lo contiene.

Por "pH fisiológico" o "pH en el intervalo fisiológico" se entiende un pH en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 inclusive, más típicamente en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.

Según se lo utiliza en la presente, "tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción o eliminación de síntomas y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno en cuestión. El tratamiento puede efectuarse profilácticamente (previo a la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

B. Procedimientos generales

Un aspecto fundamental de la presente invención es el descubrimiento sorpresivo de que las partículas de proteína pueden servir como antígenos para mejorar las respuestas inmunitarias humorales y/o mediadas por células en un individuo vertebrado, cuando se administran las partículas de proteína. La partícula de proteína es autónoma, es decir, la partícula de proteína es el antígeno así como también el sistema de administración para el ingrediente activo. Por consiguiente, la presente invención no requiere el uso de portadores, como polímeros, incluido el PLG y similares, ya que el antígeno de interés, en forma de una partícula de proteína, no necesita ser adsorbido o inmovilizado en una partícula de portador para promover una respuesta inmunitaria celular. Además, el tamaño del antígeno no es limitado porque el sistema no depende de la encapsulación del antígeno. Por consiguiente, el presente sistema es útil con una amplia variedad de antígenos y proporciona una potente herramienta para prevenir y/o tratar un gran número de infecciones.

Pueden formarse partículas de proteína para uso como antígenos a partir de casi cualquier proteína, o combinación de proteínas o fragmentos de estas, que tenga la capacidad de formar partículas en condiciones adecuadas. En particular, las partículas de proteína de la presente invención pueden formarse tanto por precipitación química de una proteína purificada, por medio de la utilización de agentes químicos reticulados, como por estabilización térmica, como se describe en detalle a continuación. Además, las partículas de proteína de la invención son estructuralmente diferentes de las PSV. Las partículas de proteína tienen las siguientes características físicas: las partículas de proteína son de aproximadamente alrededor de 150 nm a alrededor de 10 \mum, preferentemente de alrededor de 200 nm a alrededor de 4 \mum, más preferentemente de alrededor de 250 nm a alrededor de 3 \mum. Las partículas de proteína tienen generalmente forma esférica y poseen un diámetro de alrededor de 200 nm a alrededor de 10 \mum, preferentemente de alrededor de 500 nm a alrededor de 5 \mum, más preferentemente de alrededor de 1 \mum a alrededor de 3 \mum.

Por contraposición, las partículas similares a virus (PSV) pueden formarse espontáneamente mediante la expresión recombinante de la proteína en un sistema de expresión inadecuado. Generalmente, las PSV se forman dentro de una matriz homogénea, como una membrana, y pueden ser segregadas del sistema de expresión. Por otra parte, las PSV son de aproximadamente alrededor de 50 nm, son de forma esférica y poseen un diámetro de alrededor de 40 nm a alrededor de 100 nm. Sin embargo, muy pocas proteínas forman espontáneamente PSV.

Una ventaja particular de la presente invención es la capacidad de las partículas de proteína para mejorar la inmunogenicidad, como mediante la generación de respuestas inmunitarias mediadas por células en un individuo vertebrado. La capacidad de las partículas de proteína de la presente invención de promover una respuesta inmunitaria mediada por células proporciona una potente herramienta contra infecciones provenientes de una amplia gama de patógenos. Por consiguiente, las partículas de proteína de la presente invención pueden incorporarse a las composiciones de vacuna.

Una ventaja adicional de la presente invención es el descubrimiento de que las partículas de proteína son más rentables a la hora de su fabricación, promueven respuestas inmunitarias superiores y presentan una toxicidad reducida, así como menos efectos colaterales indeseables en comparación con las partículas poliméricas, como las micropartículas de PLG. Por consiguiente, el presente sistema es útil con una amplia gama de antígenos y proporciona una potente herramienta para prevenir y/o tratar una gran cantidad de infecciones.

Las partículas de proteína para uso como antígenos pueden formarse a partir de proteínas, como péptidos, polipéptidos, metaloproteínas, glicoproteínas y lipoproteínas. En realizaciones preferidas, las proteínas a partir de las cuales se forman las partículas de proteína incluyen, sin limitación, proteínas virales, proteínas fúngicas, proteínas bacterianas, proteínas aviarias, proteínas mamíferas y proteínas eucarióticas. En realizaciones más preferidas, las proteínas a partir de las cuales se forman las partículas de proteína incluyen, sin limitación, proteínas de la familia del virus herpes, incluidas las proteínas derivadas del virus herpes simples (VHS) de tipo 1 y 2, como las glicoproteínas de gB, gD y gH VHS-1 y VHS-2; proteínas derivadas del citomegalovirus (CMV) incluidas la gB y la gH de CMV; proteínas derivadas de la familia del virus de la hepatitis, incluido el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis delta (VHD), el virus de la hepatitis E (VHE) y el virus de la hepatitis G (VHG); proteínas, incluidas las proteínas de envoltura gp120, gp160, gp41, p24gag y p55gag derivadas de VIH como, incluidos los miembros de los distintos subtipos genéticos de VIH, los aislados de VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH_{LAV}, VIH_{LAI}, VIH_{MN}, VIH-1_{CM235}, VIH-1_{US4}, VIH-2; las proteínas derivadas de los virus de inmunodeficiencia símica (VIS); las proteínas derivadas de Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Hemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter pylori; albúmina de suero humano y ovalbúmina, según se trata más en detalle más adelante. En una realización alternativa, las partículas de proteína pueden formarse a partir de una combinación de una o más proteínas, o la combinación de una proteína y un segundo antígeno, donde el segundo antígeno se diferencia de la proteína.

Los antígenos, por tanto, pueden derivar de una amplia gama de virus, bacteria, hongos, plantas, protozoarios y otros parásitos. Por ejemplo, la presente invención será útil para estimular una respuesta inmunitaria contra una amplia gama de proteínas de la familia del virus herpes, incluidas las proteínas derivadas del virus herpes simple (VHS) de tipo 1 y 2, como de gB, gD, gH, VP16 y VP22VHS-1 y VHS-2; antígenos derivados del virus de varicela zoster (VVZ), virus de Epstein-Barr (VEB) y citomegalovirus (CMV) incluidas las gB y gH de CMV; y antígenos derivadas de otros virus de herpes humano como HHV6 y HHV7. Véase, por ejemplo, Chee et al., Citomegalovirus (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169, para una reseña del contenido codificante de la proteína del citomegalovirus; McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574, para una piscusión de las distintas proteínas codificadas por VHS-1; la patente de Estados Unidos N.º 5.171.568 para una discusión de las proteínas gB y gD de VHS-1 y VHS-2 y los genes que codifican para éstas; Baer et al., Nature (1984) 310: 207-211, para la identificación de las secuencias de codificación de proteínas en un genoma VEB; y Davison y Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para una reseña de VVZ.)

Además, las respuestas inmunitarias a los antígenos de la familia del virus de la hepatitis, incluido el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis delta (VHD), el virus de la hepatitis E (VHE) y el virus de la hepatitis G, pueden mejorarse también de manera conveniente utilizando partículas de proteína. A modo de ejemplo, el genoma VHC codifica varias proteínas virales, incluida la E1 (conocida también como E) y E2 (conocida también como E2/NSI), NS3, NS4, NS5, y similares, que serán de utilidad con la presente invención (véase, Houghton et al. Hepatology (1991) 14:381-388, para una presentación de proteínas del VHC, incluida la E1 y la E2). Puede utilizarse también el \delta-antígeno del VHD con el presente sistema de partículas de proteína (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.º 5,389,528, para una descripción del \delta-antígeno).

De forma similar, el virus de la gripe es otro ejemplo de un virus para el cual la presente invención resultará particularmente útil. Específicamente, las glicoproteínas de envoltura HA y NA de la gripe A son de particular interés para generar una respuesta inmunitaria. Se han identificado diversos subtipos HA de gripe A (Kawaoka et al., Virology (1990) 179:759-767; Webster et al. "Antigenic variation among type A influenza viruses" pp. 127-168. En P. Palese y D.W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York). Por consiguiente, estos antígenos pueden promover una respuesta inmunitaria cuando se los administra como partículas de proteína. Alternativamente, puede mejorarse la respuesta inmunitaria a cualquiera de estos antígenos cuando se los coadministra con la partícula de proteína de los antígenos de referencia.

Otros antígenos de particular interés que se utilizan en las composiciones de partículas de proteína de referencia incluyen antígenos y polipéptidos derivados de éstas del papilovirus humano (PVH), como una o más de las diversas proteínas tempranas incluidas la E6 y la E7, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el VIH-1 (conocido también como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR. etc.), incluidos, sin limitación, los antígenos de los aislados VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH_{LAV}, VIH_{LAI}, VIH_{MN}) como gp120, gp41, gp160, gag y pol (véase, por ejemplo, Myers et al. Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers et al., Human Retrovirus and Aids, 1990, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory; y Modrow et al., J. Virol. (1987) 61:570-578, para una comparación de las secuencias de los genes de envoltura de una variedad de aislados de VIH).

Los antígenos virales particularmente preferidos derivan de otros virus como, sin limitación, proteínas de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, el virus de la polio, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, el virus de la rubéola, el virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Bimaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, el virus de la rabia, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, el virus de la parotiditis, el virus del sarampión, el virus sincitial respiratorio, etc.); Orthomyxoviridae (por ejemplo, el virus de la gripe de tipo A, B y C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae, por ejemplo, HTLV-I; HTLV-II; VIH-1; VIH-2; el virus de inmunodeficiencia símica (VIS) entre otros. Véase, por ejemplo, Virology, 3.ª Edición (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2.ª Edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. 1991) para una descripción de estos y otros virus.

Los antígenos bacterianos particularmente preferidos derivan de organismos que causan difteria, tétano, tos ferina, meningitis y otros estados patógenos, con inclusión, sin limitación, de antígenos derivados de Corynebacterium difteriae, Clostridium tetani, Bordetella pertusis, Neisseria meningitidis, incluidos los serotipos de Meningococcus A, B, C, Y y WI35 (MenA, B, C, Y y WI35), Haemophilus influenza tipo B (Hib), y Helicobacter pylori. Los ejemplos de antígenos parasitarios incluyen los derivados de organismos que provocan la malaria y la enfermedad de Lyme.

En realizaciones más preferidas, los antígenos bacterianos derivan de H. pylori. Las bacterias de H. pylori se dividen en dos grupos, Tipo I y Tipo II, en base a la presencia o ausencia de proteínas específicas. Por ejemplo, las bacterias de Tipo I y Tipo II producen ureasas y una serie de adhesinas. Por otra parte, sólo las cepas de H. pylori de Tipo I producen VacA y CagA. (Publicación internacional N.º WO 93/18150 publicada el 16 de septiembre de 1993). Por consiguiente, las composiciones de la presente invención pueden incluir uno o más VacA, CagA, ureasa de H. pylori, un lisado de H. pylori, según se los describe anteriormente, la proteína de choque térmico de H. pylori pct60 y similares. Por ejemplo, una vacuna de amplio espectro puede contener antígenos específicos de H. pylori de tipo I, como VacA y CagA, así como también antígenos comunes a H. pylori de tipo I y II, como la ureasa. (Para una exposición más detallada de los antígenos de H. pylori para uso en la presente, véase la publicación internacional N.º. WO 93/18150, publicada el 16 de septiembre de 1993, y la WO 98/27432, publicada el 25 de junio de 1998).

En realizaciones alternativas, los antígenos bacterianos preferidos derivan de Neisseria meningitidis. Los meningococos de dividen en grupos serológicos basados en las características inmunológicas de los antígenos capsulares y de la pared celular. Los serogrupos reconocidos en la actualidad incluyen A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E. Se han desarrollado vacunas basadas en polisacáridos capsulares contra la enfermedad meningocócica causada por los serogrupos A (MenA), B (MenB), C (Men C), Y (Men Y) y W 135 (Men W135). (Para una presentación más detallada de los antígenos de MenB para uso en la presente, véase la publicación internacional N.º WO 98/08543, publicada el 5 de marzo de 1998; la WO 98/08874, publicada el 5 de marzo de 1998, la WO 99/10372, publicada el 4 de marzo de 1999; el documento US99/09346 (WO 99/57280) IB98/01665 (WO 99/24578) y el documento IB99/00103 (WO 99/36544).

Pueden utilizarse convenientemente las combinaciones de antígenos derivadas de los organismos anteriores para promover la inmunidad de múltiples patógenos en una sola vacuna. Por ejemplo, una combinación particularmente preferida es una combinación de oligosacáridos de superficie bacteriana derivados de MenC y Hib conjugados con un portador mutante no tóxico derivado de una toxina bacteriana, como un mutante no tóxico de las toxinas de la difteria conocidas como CRM_{197}. Este conjugado es útil para prevenir la meningitis bacteriana y se describe en la publicación internacional N.º WO 96/14086, publicada el 17 de mayo de 1996. Además, los procedimientos descritos en la presente proporcionan medios para tratar una serie de cánceres malignos. Por ejemplo, el sistema de la presente invención puede utilizarse para mejorar las respuestas inmunitarias humorales y las mediadas por células de proteínas específicas particulares para un cáncer en cuestión, como un oncogén activado, un antígeno fetal o un marcador de activación. Dichos antígenos tumorales incluyen cualesquiera de los varios MAGE (melanoma asociado al antígeno E), incluidos MAGE 1, 2, 3, 4, etc. (Boon, T. Scientific American (March 1993):82-89); cualesquiera de las varias tirosinasas; MART 1 (antígeno de melanoma reconocido por linfocitos T), ras mutante; p53 mutante; antígeno de melanoma p97; ACE (antígeno carcigenoembrionario), entre otros.

Es evidente que la invención de referencia puede utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria a una amplia gama de antígenos, y por lo tanto para tratar o prevenir una gran cantidad de enfermedades.

Se conocen en la técnica los procedimientos y condiciones adecuadas para la formación de partículas de una amplia gama de proteínas. Por ejemplo, en el proceso de reticulación de la suspensión, se añade una solución de una proteína a un líquido inmiscible o una fase oleosa. La proteína se disuelve en un disolvente adecuado, como un alcohol (metanol, etanol, isopropanol y similares), una cetona (metil etil cetona, acetona y similares), un glicol (etilenglicol, propilenglicol y similares) o un disolvente de amida (por ejemplo, acetamida), que contiene entre un 5% y alrededor de un 90% de agua. Se añade un agente de precipitación a una solución de proteínas para formar una partícula de proteína. Los aceites como aceite mineral, aceite de silicona o aceite vegetal; los hidrocarburos, como hexano, heptano, dodecano y éter de petróleo de punto ebullición alto; y los agentes de coacervación como acetona, etanol, isopropanol y similares son útiles como agentes de precipitación. Las partículas de proteína se dispersan mediante agitación a alta velocidad y se estabilizan utilizando el tratamiento de estabilización, como tratamiento térmico o mediante tratamiento con un agente químico de reticulación. En particular, la estabilización se alcanza mediante el calentamiento de la suspensión a una temperatura de alrededor de 30ºC a alrededor de 150ºC, preferentemente de alrededor de 35ºC a alrededor de 120ºC, más preferentemente de alrededor de 40ºC a alrededor de 100ºC. Alternativamente, las partículas de proteína se estabilizan mediante tratamiento con un agente químico de reticulación, como gluteraldehído, butadiona y similares. Véase, por ejemplo, WO 96/10992; Polymers in Controlled Drug Delivery, Eds. Illum, L. y Davis, S.S. (Wright, 1987), capítulo 3, p. 25; Torrado, J.J. et al., International Journal of Pharmaceutics, (1989) 51: 85-93; Chen, G.Q et al., Journal of Microencapsulation, (1994) 11 (4):395-407.

En particular, se trata una solución acuosa de una proteína, preferentemente una solución de proteína de alrededor de un 0,1 a alrededor de un 20%, más preferentemente de alrededor de un 0,5 a alrededor de un 10%, y aún más preferentemente una solución de proteína de alrededor de un 1 a alrededor de un 5% con un ácido, hasta que el pH es de alrededor de 1 a alrededor de 6, preferentemente de alrededor de 1,5 a alrededor de 5, más preferentemente de alrededor de 2 a alrededor de 4, donde el ácido incluye, sin limitación, ácido acético, ácido glicólico, ácido hidroxibutírico, ácido clorhídrico, ácido láctico y similares. La solución se agita a alta velocidad, preferentemente entre alrededor de 1.000 y alrededor de 25.000 rpm, más preferentemente entre alrededor de 2.000 y alrededor de 15.000, aún más preferentemente entre alrededor de 5.000 y alrededor de 10.000 rpm durante entre alrededor de 1 minuto y alrededor de 60 minutos, preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 45 minutos, más preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 30 minutos. Se añade un agente de coacervación a la solución agitada para formar las partículas de proteína y la mezcla se agita entre alrededor de 1 minuto y alrededor de 60 minutos, preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 45 minutos, más preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 30 minutos. Los agentes de coacervación incluyen, sin limitación acetona, etanol, isopropanol y similares. Opcionalmente, el agente de coacervación se evapora y las partículas de proteína se estabilizan mediante el calentamiento de la mezcla entre alrededor de 30 y alrededor de 70ºC, preferentemente entre alrededor de 35 y alrededor de 65ºC, más preferentemente entre alrededor de 40 y alrededor de 60ºC, entre alrededor de 1 minuto y alrededor de 60 minutos, preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 45 minutos, más preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 30 minutos, con agitación entre alrededor de 1.000 y alrededor de 25.000 rpm, más preferentemente entre alrededor de 2.000 y alrededor de 15.000, aún más preferentemente entre alrededor de 5.000 y alrededor de 10.000 rpm. Las partículas de proteína se dimensionan, por ejemplo en un dimensionador Malvern Master.

En un procedimiento alternativo, se añade una solución acuosa de la proteína, según se la describe anteriormente, a un agente de precipitación, como un aceite mineral, aceite de silicona o aceite vegetal; y/o hidrocarburos, como hexano, heptano, dodecano y éter de petróleo de alto punto de ebullición. La emulsión se agita a alta velocidad, preferentemente entre alrededor de 1.000 y alrededor de 25.000 rpm, más preferentemente entre alrededor de 2.000 y alrededor de 15.000, aún más preferentemente entre alrededor de 5.000 y alrededor de 10.000 rpm durante alrededor de 1 minuto y alrededor de 60 minutos, preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 45 minutos, más preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 30 minutos. La mezcla se calienta entre alrededor de 30 y alrededor de 70ºC, preferentemente entre alrededor de 35 y alrededor de 65ºC, más preferentemente entre alrededor de 40 y alrededor de 60ºC, durante alrededor de 1 minuto y alrededor de 60 minutos, preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 45 minutos, más preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 30 minutos, con agitación entre alrededor de 1.000 y alrededor de 25.000 rpm, más preferentemente entre alrededor de 2.000 y alrededor de 15.000, aún más preferentemente entre alrededor de 5.000 y alrededor de 10.000 rpm para estabilizar las partículas de proteína. La mezcla se centrifuga y se recogen las partículas de proteína. Se dimensionan las partículas de proteína, por ejemplo en un dimensionador Malvern Master.

Una vez obtenida, la partícula de proteína de la presente invención puede incorporarse a las composiciones inmunógenas o de vacuna que comprenden opcionalmente un adyuvante y/o un segundo antígeno seleccionado. El adyuvante y/o el segundo antígeno puede administrarse separadamente, en forma simultánea, o justo antes o después de la administración de la partícula de una composición de proteína. Las composiciones de vacuna pueden utilizarse para el tratamiento y/o la prevención de infecciones. Además, pueden utilizarse las formulaciones de la invención que comprenden las partículas de proteína para mejorar la actividad de los segundos antígenos seleccionados producidos in vivo, es decir, en conjunción con inmunización con ADN.

El antígeno de la partícula de proteínas puede utilizarse en composiciones para inmunizar un individuo vertebrado contra uno o más patógenos seleccionados o contra antígenos subunitarios derivados de éstos, o para promover una respuesta inmunitaria en uno o varios antígenos. Los antígenos pueden administrarse como un segundo antígeno con el antígeno de la partícula de proteínas, incluidas proteínas, polipéptidos, fragmentos de proteína antigénica, oligosacáridos, polisacáridos y similares. De forma similar, puede administrarse un oligonucleótido o polinucleótido, que codifica un antígeno deseado, con el antígeno de la partícula de proteínas para la expresión in vivo.

Como se explica anteriormente, las formulaciones de partículas de proteína pueden o no contener un segundo antígeno de interés. Por ejemplo, las partículas de proteína pueden formarse a partir de una combinación de una proteína apropiada y un antígeno, o los antígenos pueden administrarse separadamente de la composiciones de partículas de proteína en el mismo o distintos sitios. En cualquier caso, se administrarán uno o más antígenos seleccionados en una "cantidad terapéuticamente eficaz" de modo que pueda generarse una respuesta inmunitaria en el individuo al que se le administra. La cantidad exacta necesaria variará en función del individuo sometido a tratamiento, la edad y el estado general del individuo sometido a tratamiento, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y/o provocar una respuesta inmunitaria mediada por células; el grado de protección deseado; la gravedad de la afección que se esté tratando; el antígeno particular seleccionado y su modo de administración, entre otros factores. El entendido en la técnica podrá determinar con facilidad la cantidad terapéuticamente eficaz adecuada. Por consiguiente, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es lo suficientemente amplia por lo que se determinará a través de pruebas de rutina. En general, una cantidad "terapéuticamente eficaz" de antígeno será una cantidad en el orden de alrededor de 0,1 \mug a alrededor de 1000 \mug, más preferentemente de alrededor de 1 \mug a alrededor de 100 \mug.

De forma similar, el antígeno de la partícula de proteínas se encontrará presente en una cantidad tal que el segundo antígeno exhiba una "inmunogenicidad mejorada," según se define anteriormente. El entendido en la técnica podrá determinar fácilmente las cantidades que son eficaces para provocar una respuesta inmunitaria mejorada.

Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más "excipientes o vehículo farmacéuticamente aceptables" como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, podrán encontrarse presentes sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, tampones biológicos y similares en dichos vehículo. Un tampón biológico puede ser virtualmente cualquier solución que sea farmacológicamente aceptable y que proporcione la formulación de adyuvantes con el pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiológico. Los ejemplos de soluciones tamponadoras incluyen una solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con tris, solución salina tamponada con Hank, medio de cultivo como Medio Esencial Mínimo de Eagle ("MEM"), y similares.

El segundo antígeno se asocia opcionalmente con un portador (por ejemplo, el antígeno puede estar encapsulado dentro del portador o adsorbido en éste), siendo el portador una molécula que no induce por sí misma la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas de gran tamaño, de metabolización lenta, como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (como gotitas de aceite o liposomas), portadores particulados poliméricos, partículas de virus inactivos y similares. Además, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes adicionales. Además, el antígeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, como un toixode de difteria, tétano, cólera, etc. Los ejemplos de portadores particulados poliméricos incluyen portadores particulados formados a partir de materiales que son esterilizables, no tóxicos y biodegradables. Dichos materiales incluyen, sin limitación, poli(ácido \alpha-hidroxi), poli ácido hidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster y polianhídrido. Preferentemente, las micropartículas para uso con la presente invención derivan de un poli(ácido \alpha-hidroxi), en particular, de una poli(lactida) ("PLA") o un copolímero de D,L-lactida y glicólido o ácido glicólico, como un poli(D,L-lactida-co-glicólido) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Las micropartículas pueden derivar de cualquiera de los varios materiales de partida poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros como PLG, una variedad de proporciones láctida:glicólido, la determinación de lo cual dependerá en gran medida de la elección y, parcialmente, del segundo antígeno coadministrado (por una presentación más detallada de portadores particulados para uso en la presente, véase la solicitud de patente de Estados Unidos N.º 09/124,533 (US 6,884,435), de propiedad conjunta, presentada el 29 de julio de 1998).

El adyuvante/segundo antígeno puede conjugarse en la superficie de la partícula de proteína mediante cualquiera de los varios procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, Greg. T. Hermanson Ed., Academic Press, New York. 1996). Por ejemplo, la conjugación proteína-proteína (es decir, partícula de proteína-segundo antígeno) podría llevarse a cabo a través de la utilización de enlazantes sulfo-SMCC (ésteres de sulfosuccinimidilo) para conjugación a través de protocolos estándar.

Pueden utilizarse también adyuvantes para mejorar la eficacia de las composiciones farmacéuticas. Dichos adyuvantes incluyen, sin limitación: (1) sales de aluminio (alum), como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsiones de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, como péptidos de muramilo (véase más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), como por ejemplo (a) MF59 (publicación internacional N.º WO 90/14837) que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5% (que opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE (véase más adelante) aunque no es necesario) formulados en partículas submicrométricas a través de un microfluidizador como el modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA); (b) SAF que contiene escualano al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 plurónico-bloqueado al 5%, y thr-MDP (véase más adelante) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula superior; y (c) un sistema de adyuvantes Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Inmunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo compuesto por monofosforilípido A (MFL), dimicolato de trehalosa (DMT), y esqueleto de la pared celular (EPC), preferentemente MFL + EPC (Detox^{TM}) (por una presentación más detallada sobre emulsiones de aceite-en-agua submicrométricas adecuadas para uso en la presente, véase la publicación internacional N.º WO 99/30739, publicada el 24 de junio de 1999); (3) pueden utilizarse adyuvantes de saponina, como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de éstos, como ISCOM (por sus siglas en inglés, complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvantes Completos de Freund (ACF) y Adyuvantes Incompletos de Freund (AIF); (5) citocinas, como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), factor estimulante de colonia de macrófagos (FEC-M), factor de necrosis tumoral (FNT), etc.; (6) mutantes destoxificados de una toxina ADP-ribosilante bacteriana como una toxina del cólera (TC), una toxina de la tos ferina (TTF), o una toxina lábil al calor de E. coli (TL), particularmente TL-K63 (en la que el aminoácido natural en la posición 63 está sustituido por lisina) TL-R72 (en la que el aminoácido natural en la posición está sustituido por arginina), TC-S109 (en la que el aminoácido natiral en la posición 109 está sustituido), adyuvantes derivados de la familia CpG de moléculas, dinucleótidos CpG y oligonucleótidos sintéticos que comprenden motivos CpG (véase, por ejemplo, Krieg et al., Nature, 374:546 (1995) y Davis et al., J. Inmunol., 160:870-876 (1998)) y PT-K9/G129 (en la que el aminoácido natural en la posición 9 está sustituido por lisina y en la posición 129 por glicina) (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales Nº. WO93/13202 y WO92/19265); y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición.

Los péptidos de muramilo incluyen, sin limitación, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isogluatme (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse parenteralmente, por ejemplo, mediante inyección. Las composiciones pueden inyectarse subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, los supositorios, las aplicaciones mucosales y transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede efectuarse en una dosis única o en un régimen de dosis múltiples. Un régimen de dosis múltiples es uno en que un régimen de vacunación primario puede consistir en de 1 a 10 dosis separadas, seguido de otras dosis suministradas a intervalos subsiguientes, que se selecciona para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo de 1 a 4 meses para una segunda dosis y, de ser necesario, dosis subsiguientes después de varios meses. El régimen de dosificación quedará determinado también, al menos en parte, por la necesidad del individuo y quedará a criterio del profesional responsable. Además, si se desea prevenir una enfermedad, las vacunas se administran generalmente previo a la infección primaria con el patógeno de interés. Si se desea el tratamiento, por ejemplo, para reducir síntomas o empujes, las vacunas se administran generalmente contra la infección primaria.

C. Sección experimental

Se presentan más adelante ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos únicamente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en forma alguna.

Se ha hecho un esfuerzo por asegurar la precisión de las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se contempla algún grado de error experimental y desviación.

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Ejemplo 1 Preparación de partículas pequeñas de proteína de ovoalbúmina (OVA)

Se disolvió ovalbúmina (OVA, 200 mg) en agua destilada (10 ml) para formar una solución de proteína al 2%. Se añadió ácido láctico (100 \mul) a la solución de OVA hasta que se redujo el pH a alrededor de 4,5-5,0. Se agitó la solución en un agitador magnético a 1500 rpm durante 10 minutos. Se añadió acetona (25 ml) a la solución agitada y la mezcla se dejó en agitación durante 10 minutos. La mezcla se calentó a 70ºC durante 30 minutos con agitación a 5000 rpm para estabilizar las partículas de proteína. Las partículas de proteína se dimensionaron entonces en un dimensionador Malvern Master para uso posterior (las partículas de proteína eran de alrededor de 250 nm).

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Ejemplo 2 Preparación de partículas de gran tamaño de proteína de ovalbúmina (OVA)

Se disolvió ovalbúmina (OVA, 200 mg) en agua destilada (10 ml) para formar una solución de proteínas al 2%. Se añadió ácido láctico (100 \mul) a la solución de OVA hasta que se redujo el pH a alrededor de 4,5-5,0. Se agitó la solución en un agitador magnético a 500 rpm durante 10 minutos. Se añadió acetona (25 ml) a la solución agitada y la mezcla se dejó en agitación durante 10 minutos. La mezcla se calentó a 70ºC y se agitó a 500 rpm durante 30 minutos para estabilizar las partículas de proteína. Las partículas de proteína se liofilizaron y luego se dimensionaron en un dimensionador Malvern Master y se almacenaron en un desecador para uso posterior (las partículas de proteína eran de alrededor de 2,5 \mum).

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Ejemplo 3 Preparación de partículas pequeñas de proteína gB2

Se disolvió antígeno de gB2 del VHS (4,2 mg) en agua destilada (2 ml) y se agitó la solución en un agitador magnético a 1500 rpm. Se añadió acetona (2,5 ml) a la solución agitada y la mezcla se dejó en agitación durante 20 minutos. La mezcla se calentó entonces a 70ºC y se dejó en agitación durante 25 minutos para estabilizar las partículas de proteína. La mezcla se centrifugó a 30.000 x g y se recogieron las partículas de proteína. Las partículas de proteína se liofilizaron y luego se dimensionaron en un dimensionador Malvern Master para uso posterior (las partículas de proteína eran de alrededor de 350 nm).

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Ejemplo 4 Preparación de partículas de proteína gB2 de gran tamaño

Se disolvió antígeno de gB2 de VHS (4,2 mg) en agua destilada (2 ml) y se agitó la solución en un agitador magnético a 750 rpm. Se añadió acetona (2,5 ml) a la solución agitada y la mezcla se dejó en agitación durante 20 minutos. La mezcla se calentó entonces a 70ºC y se mantuvo en agitación durante 25 minutos para estabilizar las partículas de proteína. La mezcla se centrifugó a 30.000 x g y se recogieron las partículas de proteína. Las partículas de proteína se liofilizaron y luego se dimensionaron en un dimensionador Malvern Master para uso posterior (las partículas de proteína eran de alrededor de 5 \mum).

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Ejemplo 5 Preparación de partículas de proteína PLG

Se fabricaron partículas de proteína PLG (poli(láctida-co-glicólidos)) utilizando polivinil alcohol (PVA) de la siguiente manera:

Soluciones utilizadas:

(1): RG 503 PLG al 6% (Boehringer Ingelheim) en diclorometano.

(2): polivinil alcohol (PVA) (ICN) al 8% en agua.

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En particular, se fabricaron las partículas de proteína combinando 10 ml de solución de polímeros con 40 ml de la solución de PVA y homogeneizando durante 3 minutos utilizando un homogeneizador de mesa Omni con una sonda de 10 mm a 10K rpm. La emulsión se dejó en agitación durante la noche para que se evaporara el disolvente. Las partículas de proteína formadas se lavaron con agua por centrifugación 4 veces y se liofilizaron. Las partículas de proteína se dimensionaron entonces en un dimensionador Malvern Master para uso futuro.

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Ejemplo 6 Preparación de partículas de proteína inmovilizadas en PLG-OVA a través de una técnica de evaporación de disolventes

En un tubo de ensayo de vidrio de 15 ml, se colocó 1 ml de OVA 10 mg/ml y 20 ml de PLG (poli D,L-láctida-co-glicólido) al 5% p.p. en diclorometano, proporción láctida a glicólido de 50:50 mol, PM medio = 70-100 kDa, (Medisorb Technologies International). La solución se homogeneizó durante 2 minutos a altas rpm utilizando un homogeneizador portátil. Se añadió el homogeneizado a 80 ml de polivinil alcohol (PVA) al 10% (12-23 kDa) en un vaso de precipitaición de vidrio de 100 ml. Esto se homogeneizó durante dos minutos a 10.000 rpm utilizando un homogeneizador de laboratorio equipado con un generador con un diámetro de 20 mm. Se agitó la solución a temperatura ambiente a una velocidad moderada utilizando una barra de agitación magnética hasta que los disolventes se evaporaron. Se resuspendieron las partículas de proteína en agua, se lavaron varias veces con agua, y se utilizó centrifugación para granular las partículas de proteína entre lavados. Las partículas de proteína se secaron en presencia de desecante (CaSO_{4} de Dririte) al vacío. Se determinó que el volumen medio era 0,9 \mum a través de medición por difracción láser. Se determinó que el contenido proteico de las partículas de proteína era 0,8% p:p mediante análisis composicional de aminoácidos.

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Ejemplo 7 Inmunogenicidad de las partículas de proteína de ovalbúmina (OVA)

Se administró ovalbúmina, partículas de proteína PLG/OVA, pequeñas partículas de proteína OVA (250 nm) y partículas de proteína OVA de gran tamaño (2500 nm), producidas según se describe anteriormente, en forma subcutánea a ratones (dosis = 10 \mul). Se reforzaron los animales a 1M y 28 días. Se recogió el suero a las dos semanas de la última inmunización y se ensayó la actividad de LCT según se describe en Doe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:8578-8583.

Los cultivos de linfocitos se prepararon de la siguiente manera: Se cultivaron células de bazo (cb) de ratones inmunizados en placas de 24 pocillos a razón de 5x10^{6} células por pocillo. De esas células, se sensibilizaron 1x10^{6} con péptidos epitópicos sintéticos de EG7 (EL4 transfectado con ovalbúmina) y proteínas EL4 a una concentración de 10 \muM durante 1 hora a 37ºC, se lavaron y se cocultivaron con las 4x10^{6} cb no tratadas remanentes en 2 ml de medio de cultivo [RPMI 1640 al 50% y alfa-MEM (GIBCO) al 50%] complementado con suero bovino fetal activado por calor, 2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M, antibióticos e interleucina 2 al 5% (Rat T-Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). En los días 3 y 5, las células se alimentaron con 1 ml de medio de cultivo fresco y el día 6 se ensayó la citotoxicidad.

Se condujo el ensayo celular citotóxico de la siguiente manera: las células diana EG7 (EL4 transfectada con ovalbúmina) y EL4 utilizadas en los ensayos de liberación de ^{51}Cr expresaban la clase I pero no la clase II de moléculas del CMH. Se incubaron aproximadamente 1x10^{6 }células diana en 200 \mul de medio que contenía 50 \muCi (1 Ci = 37 Gbq) de ^{51}Cr y péptidos sintéticos de ovalbúmina (1 \mum) durante 60 min y se lavaron tres veces. Se cultivaron células efectoras (E) con linfocitos T diana 5x10^{3} en varias proporciones E/T en 200 \mul de medio de cultivo, en placas para cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo durante 4 horas. Se utilizaron las cpm medias de los pocillos en duplicado para calcular la liberación específica porcentual de ^{51}Cr.

Como se muestra en la Figura 1, las partículas de OVA pequeñas y de gran tamaño promueven una respuesta de las LCT y las pequeñas partículas de proteína OVA exhibieron una actividad comparable con la de las partículas de proteína OVA de gran tamaño. Ambos tipos de partículas de proteína OVA fueron más activas que las formulaciones de partículas de proteína PLG/OVA y ovalbúmina solas.

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Ejemplo 8 Preparación de partículas de proteína inmovilizadas en gB2 PLG utilizando una técnica de evaporación de disolventes

En un tubo de ensayo de vidrio de 15 ml, se colocaron 0,5 ml de gB2 5 mg/ml y 5 ml de PLG (poli D,L-láctida-coglicólido) al 6% p/p en diclorometano, proporción de láctida a glicólido 50:50, PM medio = 70-100 kDa, (Medisorb Technologies International). La solución se homogeneizó durante 2 minutos a rpm alta utilizando un homogeneizador portátil. Se añadió el homogeneizado a 20 ml de polivinil alcohol (PVA) al 8% (12-23 kDa) en un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml. La mezcla se homogeneizó durante dos minutos a 10.000 rpm utilizando un homogeneizador de laboratorio equipado con un generador con un diámetro de 20 mm. Se agitó la solución a temperatura ambiente a una velocidad moderada utilizando una barra de agitación magnética hasta que se evaporaron los disolventes. Las partículas de proteína se resuspendieron en agua y se lavaron varias veces con agua y se utilizó centrifugación para granular las partículas de proteína entre lavados. Las partículas de proteína se secaron en presencia de un desecante (CaSO_{4} de Dririte) al vacío. Se determinó que el volumen medio era 0,9 \mum mediante medición por difracción láser. Se determinó que el contenido de proteínas de la partícula de proteína era el 0,5% p:p mediante análisis composicional de aminoácidos.

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Ejemplo 9 Inmunogenicidad de las partículas de proteína gB2

Se administraron subcutáneamente a ratones partículas de proteína gB2, partículas de proteína inmovilizadas en gB2 PLG, producidas según se describe anteriormente, así como también gB2 sola, sin partículas de proteína asociadas (como control negativo) y controles gag-pol de virus vacunal (como control positivo) (dosis = 5 \mug). Los días 7 y 14, se reforzaron los animales. Se recogió el suero a las dos semanas de la última inmunización y se ensayó la actividad de las LCT, según se describe en Doe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:8578-8583.

Los cultivos de linfocitos se prepararon de la siguiente manera. Se cultivaron células de bazo (cb) de ratones inmunizados en placas de 24 pocillos a 5x10^{6} células por pocillo. De estas células, se sintetizaron 1x10^{6} con péptidos epitópicos sintéticos de las proteínas del VIH-1_{SF2} a una concentración de 10 \muM durante 1 hora a 37ºC, se lavaron y se cocultivaron con las 4x10^{6 }cb remanentes sin tratar en 2 ml de medio de cultivo [RPMI 1640 al 50% y alfa-MEM al 50% (G113CO)] complementados con suero bovino fetal inactivado con calor, 5x10^{-5} M 2-mercaptoetanol, antibióticos e interleuquina 2 al 5% (Rat T-Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Se alimentaron las células con 1 ml de medio de cultivo fresco los días 3 y 5, y el día 6 se ensayó la citotoxicidad.

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El ensayo celular citotóxico se condujo de la siguiente manera. Las células diana SvBALB (H-2^{d}) (SvB) y MC57 (H-2^{b}) utilizadas en los ensayos de liberación de ^{51}Cr expresaban la clase I pero no la clase II de las moléculas del CPH. Se incubaron aproximadamente 1x10^{6} células diana en 200Pl de medio que contenía 50 PCi (1 Ci = 37 Gbq) de ^{51}Cr y péptidos VIH-1 sintéticos (1 mM) durante 60 min y se lavaron tres veces. Las células efectoras (E) se cultivaron con 5x10^{3} células diana (T) en diferentes ratios E/T, en 200 \mul de medio de cultivo, en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo durante 4 horas. Se utilizaron las cpm medias de los pocillos en duplicado para calcular la liberación específica de ^{51}Cr.

Como se muestra en la Figura 2, las partículas de proteína gB2 eran menos activas con el control de vacunación y eran más activas que las partículas de proteína PLG/gB2 y la formulación de la proteína gB2.

Por consiguiente, se dan a conocer composiciones de partículas de proteína de antígeno y procedimientos novedosos para utilizarlas y fabricarlas. Aunque se han descrito las realizaciones preferidas de la invención de referencia en algún detalle, se entenderá que se pueden realizar variaciones obvias sin que éstas queden fuera del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

1. Una composición inmunógena que comprende un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que dicho primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína que es diferente estructuralmente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimeinto que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa.

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2. La composición inmunógena de la reivindicación 1 en la que la solución acuosa en la etapa (a) comprende además un ácido.

3. La composición inmunógena de la reivindicación 2 en la que el ácido es ácido acético, ácido glicólico, ácido hidroxibutírico, ácido clorhídrico o ácido láctico.

4. La composición inmunógena de la reivindicación 1 en la que el agente de precipitación comprende un aceite, un hidrocarburo o un agente de coacervación.

5. La composición inmunógena de la reivindicación 1 en la que el tratamiento de estabilización comprende tratamiento térmico o tratamiento con un agente químico de reticulación.

6. La composición inmunógena de la reivindicación 5 en la que el tratamiento de estabilización es tratamiento térmico.

7. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que la partícula de proteína es capaz de producir una respuesta inmunitaria celular.

8. La composición inmunógena de la reivindicación 7 en la que la respuesta inmunitaria celular es un respuesta a linfocitos T citotóxicos.

9. La composición inmunógena de la reivindicación 7 en la que la partícula de proteína se forma a partir de una proteína seleccionada del grupo constituído por una proteína viral, fúngica, bacteriana, aviaria y mamífera.

10. La composición inmunógena de la reivindicación 9 en la que la proteína es la glicoproteína B del virus herpes simple de tipo 2 (gB2 de VHS), una proteína del virus de la hepatitis C (VHC) o una proteína del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

11. La composición inmunógena de la reivindicación 10, en la que la proteína del VHC es la proteína nuclear del VHC, E1, E2, NS3, NS4 ó NS5.

12. La composición inmunógena de la reivindicación 10 en la que la proteína del VIH es gp120, gp160, gp41, p24gag o p55gag.

13. La composición inmunógena de la reivindicación 7 que comprende también un adyuvante.

14. La composición inmunógena de la reivindicación 13 en la que dicho adyuvante comprende MF59, LT-K63 o LT-R72.

15. La composición inmunógena de la reivindicación 13 en la que el adyuvante se encuentra encapsulado dentro de la partícula de proteína.

16. La composición inmunógena de la reivindicación 13 en la que el adyuvante es adsorbido o conjugado en la partícula de proteína.

17. La composición inmunógena de la reivindicación 7 que comprende además un segundo antígeno, siendo dicho segundo antígeno distinto de dicha partícula de proteína.

18. La composición inmunógena de la reivindicación 17 en la que dicho segundo antígeno está adsorbido en un portador o encapsulado en éste, estando seleccionadoe dicho portador del grupo compuesto por proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos, partículas poliméricas y partículas de virus inactivos.

19. La composición inmunógena de la reivindicación 19 en la que dicha partícula polimérica comprende un polímero seleccionado del grupo compuesto pot un poli(\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido.

20. La composición inmunógena de la reivindicación 18 en la que dicho segundo antígeno está conjugado en dicha partícula de proteína.

21. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que la partícula de proteína es de: (i) entre alrededor de 150 nm y alrededor de 10 \mum, (ii) entre alrededor de 200 nm y alrededor de 4 \mum o (iii) entre alrededor de 250 nm y alrededor de 3 \mum.

22. La composición inmunógena de la reivindicación 1 en la que la partícula de proteína tiene un diámetro: (i) de alrededor de 200 nm a alrededor de 10 \mum, (ii) de alrededor de 500 nm a alrededor de 5 \mum o (iii) de alrededor de 1 \mum a alrededor de 3 \mum.

23. La composición inmunógena de cualquier reivindicación precedente para uso en la producción de una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC) en un individuo vertebrado.

24. Un procedimiento para preparar una composición inmunógena que comprende proporcionar un primer antígeno seleccionado y combinar dicho primer antígeno con un excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo dicho primer antígeno una partícula de proteína que es estructuralmente diferente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, producida mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(c): estabilizar dicha partícula de proteína mediante un tratamiento de estabilización, y

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa y dicha partícula de proteína es capaz de producir una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC).

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25. El procedimiento de la reivindicación 24, que comprende además combinar dicha composición inmunógena con un segundo antígeno, siendo dicho antígeno distinto de dicha partícula de proteína.

26. El uso de un primer antígeno seleccionado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que dicho primer antígeno seleccionado es una partícula de proteína que es diferente estructuralmente de una partícula similar a virus y generalmente de forma esférica, y producida mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una solución acuosa de una proteína;

(d): recuperar las partículas de proteína de la solución acuosa para la fabricación de un medicamento para uso en la producción de una respuesta a linfocitos T citotóxicos (LTC) en un individuo vertebrado.

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27. El uso de la reivindicación 26, en el que el medicamento presenta las características de la composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 22.

28. El uso de la reivindicación 26, en el que dicho medicamento puede administrarse con un adyuvante.

29. El uso de la reivindicación 26, en el que dicho medicamento puede administrarse con un segundo antígeno, siendo dicho segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que dicho medicamento puede administrarse a dicho sujeto vertebrado antes de dicho segundo antígeno.

31. El uso de la reivindicación 29, en el que dicho medicamento puede administrarse a dicho sujeto vertebrado después de dicho segundo antígeno.

32. El uso de la reivindicación 29, en el que dicha partícula de proteína se administra a dicho sujeto vertebrado en forma concurrente con la administración de dicho segundo antígeno.