ES2455544T5 - Vectores de lentivirus pseudotipificados con una glucoproteína de envoltura de virus sindbis - Google Patents

Description

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6K/E1 presentan secuencias reconocidas y escindidas por endopeptidasas. La secuencia de poliproteínas E3/E2 se presenta como SEC ID Nº: 20. Normalmente, la unión E3/E2 se escinde por furina o una serina endopeptidasa tipo furina entre los restos 65 y 66 de la poliproteína E3/E2. La furina presenta especificidad para restos arginina apareados que están separados por dos aminoácidos. Para mantener Escisión E3/E2 por furina, los restos 62-66

5 (RSKRS; SEC ID Nº: 26) deberían mantener los dos restos arginina con separación de dos aminoácidos y el resto serina.

En una realización de la invención, la poliproteína comprende una secuencia E3 que corresponde a los restos 1-65 de la SEC ID Nº: 20 o una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia para los restos 1-65 de la SEC ID Nº: 20, en la que los

10 restos 62-65 son RSKR (SEC ID Nº: 27) y la variante es capaz de incorporarse a una envoltura vírica pseudotipificada. Preferiblemente, la parte E2 de la poliproteína es cualquiera de las realizaciones como se definió en la presente memoria anteriormente.

Alternativamente, se puede usar una secuencia de escisión diferente en vez de la secuencia de escisión de furina E3/E2 o cualquiera de las otras secuencias de escisión. Los sitios de reconocimiento y escisión se pueden

15 incorporar para endopeptidasas, incluyendo, sin limitación, endopeptidasas aspárticas (por ej., catepsina D, quimosina, proteasa VIH), cisteína endopeptidasas (bromelaínas, papaína, calpaína), metaloendopeptidasas, (por ej., colagenasa, termolisina), serina endopeptidasas (por ej., quimotripsina, factor IXa, factor X, trombina, tripsina), estreptocinasas. Las secuencias del sitio de reconocimiento y escisión para estas enzimas son conocidas.

En el caso de que se use dicho sitio de escisión, se puede introducir en una poliproteína E3 que comprende al

20 menos los restos 1-60, tales como los restos 1-61 ó 1-62 de la SEC ID Nº: 20 o una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia al correspondiente número de restos de la SEC ID Nº: 20, fusionados directamente en el C-terminal a dicha secuencia de escisión, que a su vez se fusiona a la parte E2 de la poliproteína. Preferiblemente, la parte E2 de la poliproteína es cualquiera de las realizaciones como se definió en la presente memoria anteriormente.

25 Las secuencias de proteína E2 de la invención incluyen las variantes de la SEC ID Nº: 1 en que la 160X es como se definió en la siguiente Tabla y la proteína es como se presenta en la SEC ID Nº: 1 aparte de los siguientes restos 70, 76 y 159 y 160, que son como sigue:

SEC ID Nº:

70 76 159 160X

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de heparán comparado con la HR de la cepa de referencia. Esto normalmente implica al menos un cambio de aminoácidos comparado con la secuencia de glucoproteínas E2 de HR.

Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que la unión de la partícula vírica a una superficie celular induce endocitosis, llevando el virus a un endosoma, provocando la fusión de la membrana y permitiendo que el núcleo del virus entre en el citosol. Para ciertas realizaciones, que utilizan la integración de partículas del vector lentivírico, después de transcripción inversa y migración del producto al núcleo, el genoma del virus se integra en el genoma de la célula diana, incorporando la secuencia o las secuencias de interés en el genoma de la célula diana. Para reducir la posibilidad de mutagénesis por inserción y activar la expresión transitoria de un antígeno o antígenos diseñados, sin embargo, otras realizaciones utilizan partículas no integrantes del vector lentivírico, que no se integran en el genoma de la célula diana, pero en su lugar expresan la secuencia o las secuencias de interés de un episoma. De cualquier modo, la CD infectada expresa entonces la secuencia o las secuencias de interés, por ej., un antígeno, una molécula estimuladora. El antígeno puede ser tratado después por las células dendríticas y presentado a células T y B, generando una respuesta inmunitaria específica del antígeno. No se requiere la ruta específica descrita anteriormente siempre que la célula dendrítica sea capaz de estimular una respuesta inmunitaria específica del antígeno.

Las partículas víricas se pueden administrar a un individuo para proporcionar un efecto profiláctico o terapéutico. El producto de la secuencia de interés es típicamente un antígeno de un agente causante de enfermedad o una célula enferma (por ej., célula tumoral). Después de la infección de las células dendríticas y expresión del producto, se genera una respuesta inmunitaria al producto. La respuesta inmunitaria puede ser humoral o celular o ambas.

A. Envoltura del vector vírico

Los virus transmitidos por los artrópodos (Arbovirus) son virus que son transmitidos a un huésped, tales como seres humanos, caballos o pájaros por un vector de artrópodo infectado tal como un mosquito. Los arbovirus se dividen además en subfamilias de virus incluyendo alfavirus y flavivirus, que tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva y una envoltura que contiene glucoproteína. Por ejemplo, el virus de la fiebre del dengue, el virus de la fiebre amarilla y el virus del Nilo Occidental pertenecen a la familia del flavivirus y virus Sindbis, el virus del bosque Semiliki y el virus de la Encefalitis Equina Venezolana, son miembros de la familia alfavirus (Wang et al. J. Virol. 66, 4.992 (1.992)). La envoltura de virus Sindbis incluye dos glucoproteínas transmembrana (Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2.005)): E1, se cree que es responsable de la fusión y E2, se cree que es responsable de la unión celular. Las glucoproteínas de envoltura del virus Sindbis son conocidas para pseudotipificar otros retrovirus, incluyendo oncoretrovirus y lentivirus.

Como se discutió anteriormente, se puede usar una glucoproteína de envoltura de arbovirus para pseudotipificar un genoma de vector con base lentivírica. Un lentivirus "pseudotipificado" es una partícula lentivírica que tiene una o más glucoproteínas de envoltura que están codificadas por un virus que es distinto del genoma lentivírico. La glucoproteína de envoltura se puede modificar, mutar o lograr como se describe en la presente memoria.

La envoltura de virus Sindbis y otros alfavirus se incorpora a la bicapa lipídica de la membrana de la partícula vírica y típicamente incluye múltiples copias de dos glucoproteínas, E1 y E2. Cada glucoproteína tiene regiones de expansión de membrana; E2 tiene un dominio citoplasmático de aproximadamente 33 restos mientras la cola citoplasmática de E1 es muy corta (aproximadamente 2 restos). Tanto E1 como E2 tienen ácidos palmíticos unidos a, o cerca de, las regiones de expansión de membrana. E2 se sintetiza inicialmente como una proteína precursora que se escinde por furina u otra Serina proteinasa dependiente de Ca2+ en E2 y una glucoproteína pequeña denominada E3. Situada entre las secuencias que codifican E2 y E1 hay una secuencia que codifica una proteína denominada 6K. E3 y 6K son secuencias de señal que sirven para traslocar las glucoproteínas E2 y E1, respectivamente, en la membrana. En el genoma del virus Sindbis, la región codificadora para proteínas de envoltura de Sindbis incluye secuencia que codifica E3, E2, 6K y E1. Como se usa en la presente memoria, la "envoltura" de un virus arbovirus incluye al menos E2 y también puede incluir E1, 6K y E3. Una secuencia ejemplar de glucoproteínas de envoltura de virus Sindbis, cepa HR, se presenta como la SEC ID Nº. 17. Las secuencias de glucoproteínas de envoltura para otros arbovirus se pueden encontrar por ej., en GenBank. Por ejemplo, la secuencia que codifica las glucoproteínas del virus del Dengue se puede encontrar en el Acceso GQ252677 (entre otros en GenBank) y en la base de datos de variación de virus en NCBI y la secuencia que codifican glucoproteínas de envoltura del virus de la encefalitis equina venezolana en el Acceso NP 040824.

Aunque el receptor o los receptores celulares en las células dendríticas para alfavirus y virus Sindbis en particular, no se han identificado definitivamente hasta la fecha, un receptor parece ser CD-SIGN (Klimstra et al., J Virol 77: 12.022, 2.003). El uso de los términos "adhesión", "unión", "fijar como objetivo" y similares se usan indistintamente y no están destinados a indicar un mecanismo de la interacción entre glucoproteína de envoltura de virus Sindbis y un componente celular. El CD-SIGN (No Integrina Capturadora de ICAM-3 (Moléculas de Adhesión Intracelular 3) Específica de Células Dendríticas; también conocida como CD209) es receptor similar a lectina de tipo C capaz de unirse rápido y endocitosis de materiales (Geijtenbeek, T. B., et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2.004). Parece que E2 fija como objetivo el virus a células dendríticas a través de CD-SIGN. Como se muestra en la presente memoria, las células que expresan CD-SIGN son transducidas por partículas del vector vírico pseudotipificadas con E2 de virus Sindbis mejor (al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6

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pueden ser no funcionales o la integrasa y el sitio PPT pueden ser no funcionales o los sitios de unión y el sitio PPT pueden ser no funcionales o todos ellos pueden ser no funcionales.

Como se indicó anteriormente, una propuesta es preparar y usar una integrasa no funcional. La integrasa está implicada en la escisión de ADN romo bicatenario vírico y unión de los extremos a 5'-fosfatos en las dos cadenas de de un sitio diana cromosómico. La integrasa presenta tres dominios funcionales: dominio N-terminal, que contiene una unidad que se une a cinc (HHCC), el núcleo del dominio central, que contiene el núcleo catalítico y una unidad DD35E conservada (D64, D116, E152 en VIH-1) y un dominio C-terminal, que tiene propiedades de unión de ADN. Las mutaciones de punto introducidas en la integrasa son suficientes para romper la función normal. Se han construido y caracterizado muchas mutaciones de la integrasa (véase, Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy

18: 483, 2.007; Apolonia, Thesis submitted to University College London, Abril 2.009, págs. 82-97; Engelman et al. J Virol 69: 2.729, 1.995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1.121, 2.006). La secuencia que codifica la proteína integrasa puede ser suprimida o mutada para hacer la proteína inactiva, preferiblemente sin debilitar de manera significativa la actividad de la transcriptasa inversa o la fijación como objetivo nuclear, evitándose de ese modo sólo la integración del provirus en el genoma de la célula diana. Las mutaciones aceptables pueden reducir la catálisis de la integrasa, transferencia de cadenas, unión a sitios att, unión a un ADN cromosómico huésped y otras funciones. Por ejemplo, una sola sustitución de ácido aspártico a asparagina en el resto 35 de integrasa de VIH o SIV suprime completamente la integración de ADN vírico. Las supresiones de la integrasa estarán confinadas en general al dominio C-terminal. La supresión de secuencia codificadora para los restos 235-288 da como resultado una integrasa no funcional útil (Engelman et al. J Virol 69: 2.729, 1.995). Como ejemplos adicionales, se pueden generar mutaciones, por ejemplo, Asp64 (se proporcionan los números de los restos para VIH-1, se pueden determinar fácilmente los números de los restos correspondientes para la integrasa de otros lentivirus o retrovirus por un experto) (por ej., D64E, D64V), Asp116 (por ej., D116N), Asn120 (por ej., N120K), Glu152, GIn148 (por ej., Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (por ej.,W235E), Lys264 (por ej., K264R), Lys266 (por ej., K266R), Lys273 (por ej., K273R). Se pueden construir otras mutaciones y ensayar para integración, expresión de transgenes y cualquier otro parámetro deseable. Los ensayos para estas funciones son conocidos. Se pueden generar mutaciones por cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo mutagénesis dirigida y síntesis química de secuencia de ácidos nucleicos. Se pueden realizar una mutación o puede ser presente más de una de estas mutaciones en la integrasa. Por ejemplo, una integrasa puede presentar mutaciones en dos aminoácidos, tres aminoácidos, cuatro aminoácidos, etc.

Alternativamente o en combinación con el uso del mutante o los mutantes de la integrasa, los sitios de adhesión (att) en U3 y U5 también pueden ser mutados. La integrasa se une a estos sitios y el dinucleótido 3’-terminal se escinde en los dos extremos del genoma del vector. Un dinucleótido CA está situado en el extremo 3’ retraído; el CA es requerido para el proceso, mutación de la integración de los bloques de nucleótidos en el cromosoma huésped. La A del dinucleótido CA es el nucleótido más crítico para integración y las mutaciones en los dos extremos del genoma proporcionarán los mejores resultados (Brown et al J Virol 73: 9.011 (1.999). En una ejemplificación, el CA en cada extremo se cambia a TG. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo se cambia a TG en un extremo y GT en el otro extremo. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo se suprime; en otras ejemplificaciones, la A del CA es suprimido en cada extremo.

La integración también se puede inhibir por mutación o supresión de tramo de polipurina (PPT, por sus siglas en inglés) (patente internacional WO 2009/076524), situado de manera proximal a la LTR 3’. El PPT es una secuencia de polipurina de aproximadamente 15 nucleótidos que puede servir como un sitio de unión de cebador para la síntesis de ADN de cadena positiva. En este caso, las mutaciones o supresiones de PPT fijan como objetivo el proceso de transcripción inversa. Sin desear estar sujeto a un mecanismo, por mutación o supresión de PPT, la producción de ADN lineal se reduce radicalmente y esencialmente sólo se producen ciclos de ADN de LTR-1. La integración requiere un genoma del vector de ADN bicatenario lineal y la integración se elimina esencialmente sin él. Como se indicó anteriormente, un PPT se puede hacer no funcional por mutación o por supresión. Típicamente, se suprime el PPT completo de aproximadamente 15 nt, aunque en algunas realizaciones, se pueden realizar supresiones más cortas de 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt y 2 nt. Cuando se realizan mutaciones, típicamente se realizan múltiples mutaciones, especialmente en la mitad 5' del PPT (McWilliams et al., J Virol 77: 11.150, 2.003), aunque las mutaciones sencillas y dobles en las primeras cuatro bases aún reducen la transcripción. Las mutaciones realizadas en el extremo 3’ de PPT tienen en general un efecto más espectacular (Popozo y Levin J Virol 70: 5.288,1.996).

Estas diferentes propuestas para hacer no integrante un genoma del vector se pueden usar de manera individual o en combinación. Usar más de una propuesta se puede usar para construir un vector de seguridad a través de mecanismos redundantes. Así, se pueden combinar mutaciones o supresiones de PPT con mutaciones o supresiones del sitio att o con mutaciones de la Integrasa o se pueden combinar mutaciones o supresiones de PPT con tanto mutaciones o supresiones del sitio att como de mutaciones de la Integrasa. De manera similar, las mutaciones o supresiones del sitio att y las mutaciones de la Integrasa se pueden combinar entre sí o con mutaciones o supresiones de PPT.

2. Elementos reguladores

Como se discute en la presente memoria, el genoma vírico del vector comprende una secuencia de interés que es

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endonucleasa de restricción o determinar su secuencia de ADN por métodos convencionales.

También se pueden usar vectores construidos para expresión transitoria en células de mamífero. La expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicación de manera eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles del polipéptido codificado por el polinucleótido específico del antígeno en el vector de expresión. Véase Sambrook et al., supra, págs. 16.17-16.22. Otros vectores y métodos adecuados para adaptación a la expresión de los polipéptidos son conocidos en la técnica y se adaptan fácilmente a las circunstancias específicas.

Usando las explicaciones proporcionadas en la presente memoria, un experto en la materia reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión particular se puede ensayar por transinfección de células de empaquetamiento con un vector que comprende un gen que codifica una proteína informadora y midiendo la expresión usando una técnica adecuada, por ejemplo, midiendo la fluorescencia de un conjugado de proteína fluorescente verde. Son conocidos los genes informadores adecuados en la técnica.

3. Tipos de secuencias de interés.

La secuencia de interés no está limitada de ninguna manera e incluye cualquier ácido nucleico que un experto desee integrar, transcribir y expresar en la célula diana. El producto puede ser una proteína o un ácido nucleico. La secuencia de interés puede codificar una proteína o una molécula de ácido nucleico, incluyendo ARNsi, ARNmicro, un ARN bicatenario auto-complementario en que la región complementaria es mayor que aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud o un ARN que es complementario a un ARN mensajero, donde la unión de dicho ARN complementario (anti-sentido) al ARN mensajero bloquea su capacidad para que se traduzca en proteína. En algunos casos, la secuencia de interés puede codificar un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. En particular, son deseables antígenos tumorales y antígenos de enfermedades infecciosas de los agentes tales como VIH, SHV, HCV, HPV, malaria o tuberculosis.

En algunos casos, la secuencia de interés puede ser un gen que codifique un ARN inhibidor pequeño (ARNsi) o un ARNmicro (ARNmi) de interés que consigue aminorar la expresión de una molécula. Por ejemplo, el gen que codifican un ARNsi o un ARNmicro se puede usar para conseguir aminorar la expresión de reguladores negativos en una célula, incluyendo los que inhiben la activación o maduración de células dendríticas. Los ARNsi y los ARNmicro son conocidos en la técnica (Fire et al., Nature 391: 806, 1.998; véase también "The RNA Interference Resource" de Applied Biosystems, Trang et al. Oncogene Suppl 2: S52, 2.008; Taganov, K., et al. 2.007. Immunity 26: 133-137; Dahlberg, J. E. y E. Lund. 2.007. Sci. STKE 387: pe25; Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2.009). Alternativamente, la secuencia de interés puede codificar un ARN bicatenario auto-complementario en que la región complementaria es mayor que aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud o un ARN anti-sentido que es mayor que aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud. Los expertos en la materia apreciarán que las moléculas ARNsi, ARNmi, ARNds y ARN anti-sentido se pueden expresar de un activador de la ARN polimerasa III o, alternativamente, puede ser un componente de un ARN no codificador que se transcribe de un activador de la ARN polimerasa II.

Además, la secuencia de interés puede codificar más de un producto. En algunas configuraciones, la secuencia que se tiene que suministrar comprende múltiples genes que codifican al menos una proteína, al menos una molécula ARNsi, al menos una ARNmicro, al menos una ARNds o al menos una ARN anti-sentido o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la secuencia que se tiene que suministrar puede incluir uno o más genes que codifiquen uno o más antígenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. El antígeno o más antígenos se pueden asociar a una sola enfermedad o trastorno o se pueden asociar a múltiples enfermedades y/o trastornos. En algunos casos, se puede incluir un gen que codifique una proteína reguladora inmunitaria junto con un gen que codifique un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria y la combinación puede provocar y regular la respuesta inmunitaria en la dirección y magnitud deseadas. En otros casos, se puede construir una secuencia que codifica una molécula de ARNsi, ARNmicro, ARNds o ARN anti-sentido con un gen que codifique un antígeno contra el que se desee una respuesta inmunitaria y la combinación puede regular el alcance de la respuesta inmunitaria. Los productos se pueden producir como un producto de fusión inicial en que la secuencia codificadora está en relación funcional con un activador. Alternativamente, los productos se pueden codificar por separado y cada secuencia codificadora en relación funcional con un activador. Los activadores pueden ser iguales o diferentes.

En algunas configuraciones, los vectores contienen secuencias de polinucleótidos que codifican factores de maduración/estimuladores de células dendríticas. Las moléculas estimuladoras ejemplares incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible por fármacos (iCD40) y similares. Estos polinucleótidos están típicamente bajo el control de uno o más elementos reguladores que dirijan la expresión de las secuencias codificadoras en células dendríticas. La maduración de células dendríticas contribuye a vacunación exitosa (Banchereau, J y Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306 (2.005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15: 138-147 (2.003); Figdor, C. G. et al. Nat. Med. 10: 475-480 (2.004)). La maduración puede transformar las CD de células implicadas de manera activa en captura de antígenos en células especializadas para cebado de células T. Por ejemplo, el acoplamiento de CD40 por CD40L sobre células T colaboradoras con CD4 es una señal crítica para maduración de CD, dando como resultado una potente activación de células T CD8. Dichas moléculas estimuladoras se refieren también como factores de maduración o factores estimuladores de maduración.

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genoma vírico del vector es introducido en una estirpe celular de empaquetamiento que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar ARN genómico vírico, transcrito del genoma de vector vírico, en partículas víricas. Alternativamente, el genoma vírico del vector puede comprender uno o más genes codificadores de componentes víricos además de una o más secuencias de interés. Para prevenir la replicación del genoma en la célula diana, sin embargo, se retirarán normalmente los genes víricos endógenos requeridos para la replicación y se proporcionarán por separado en la estirpe celular de empaquetamiento.

En general, las partículas de vector lentivírico se producen por una estirpe celular que se transinfecta con uno o más vectores plásmidos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. Estas partículas de vector lentivírico no son típicamente competentes para la replicación, es decir, son sólo capaces de una sola vuelta de infección. Lo más frecuentemente, se utilizan múltiples vectores plásmidos para separar los diversos componentes genéticos que generan las partículas de vector lentivírico, principalmente para reducir la posibilidad de procesos de recombinación que podían de otro modo generar replicación de virus competentes. Se puede usar un solo vector de plásmido con los componentes lentivíricos si se desea, sin embargo. Como un ejemplo de un sistema que emplea múltiples vectores de plásmidos, se transinfecta una estirpe celular con al menos un plásmido que contiene el genoma vírico del vector (es decir, el plásmido del genoma del vector), incluyendo las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actúa en cis y la secuencia o las secuencias de interés, que con frecuencia se unen de manera operable a un activador heterólogo, al menos un plásmido que codifica los componentes enzimáticos y estructurales del virus (es decir, el plásmido de empaquetamiento que codifica componentes tales como, Gag y Pol), y al menos un plásmido de envoltura que codifica una glucoproteína de envoltura de Arbovirus. Se pueden usar plásmidos adicionales para mejorar la producción de partículas de retrovirus, por ej., plásmidos de expresión de Rev, como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las partículas víricas brotan a través de la membrana celular y comprenden un núcleo que incluye un genoma que contiene la secuencia de interés y una glucoproteína de envoltura de Arbovirus que fija como objetivo células dendríticas. Cuando la glucoproteína de Arbovirus es glucoproteína E2 de virus Sindbis, se logra que la glucoproteína presente unión reducida a sulfato de heparán comparado con la cepa de HR de referencia.

La transinfección de células de empaquetamiento con vectores plásmidos de la presente invención se puede llevar a cabo por métodos conocidos y el método que se tiene que usar no está limitado de ningún modo. Se conoce una serie de sistemas de suministro no víricos en la técnica, incluyendo por ejemplo, electroporación, sistemas de suministro a base de lípidos incluyendo liposomas, suministro de ADN "desnudo" y suministro usando compuestos de policiclodextrina, tales como los descritos en Schatzlein AG. (2.001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad). Se emplean típicamente métodos de tratamiento de lípidos o sales catiónicos, véase, por ejemplo, Graham et al. (1.973. Virol. 52: 456; Wigler et al. (1.979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1.373-76)). El método de precipitación de fosfato de calcio es lo más usado con frecuencia. Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir el vector en células, incluyendo microinyección nuclear y fusión de protoplastos bacterianos.

La estirpe celular de empaquetamiento proporciona los componentes, incluyendo proteínas reguladoras y estructurales víricas, que son requeridas en trans para el empaquetamiento del ARN genómico vírico en partículas del vector lentivírico. La estirpe celular de empaquetamiento puede ser cualquier estirpe celular que sea capaz de expresar proteínas lentivíricas y producir partículas del vector lentivírico funcionales. Algunas estirpes celulares de empaquetamiento adecuadas incluyen células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430). La estirpe celular de empaquetamiento puede expresar de manera estable las proteínas víricas necesarias. Dicha estirpe celular de empaquetamiento se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 6.218.181. Alternativamente, se puede transinfectar de manera transitoria una estirpe celular de empaquetamiento con moléculas de ácido nucleico que codifiquen una o más proteínas víricas necesarias junto con el genoma del vector vírico. Las partículas víricas resultantes se recogieron y se usaron para infectar una célula diana. El gen o los genes que codifican la glucoproteína o las glucoproteínas de envoltura se clonan normalmente en un vector de expresión, tal como pcDNA3 (Invitrogen, CA USA). Los vectores de expresión de células eucariotas son conocidos en la técnica y están disponibles en una serie de fuentes comerciales. Las células de empaquetamiento, tales como las células 293T se co-transinfectan después con el genoma vírico del vector que codifica una secuencia de interés (típicamente que codifica un antígeno), al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento de virus y un vector para la expresión de la molécula diana. La envoltura se expresa sobre la membrana de la célula de empaquetamiento y se incorpora al vector vírico.

En un caso hipotético, se usa uno o más vectores para introducir secuencias de polinucleótidos en una estirpe celular de empaquetamiento para la preparación de una partícula de vector lentivírico pseudotipificado con una glucoproteína de envoltura de virus Sindbis tal como E2, como se describe en la presente memoria. Los vectores pueden contener secuencias de polinucleótidos que codifican los diversos componentes del virus incluyendo la envoltura del virus Sindbis, una secuencia o secuencias de interés (que codifican típicamente un antígeno) y cualquier componente necesario para la producción del virus que no se proporcione por la célula de empaquetamiento.

En otros casos hipotéticos más, las células de empaquetamiento se co-transinfectan con un genoma del vector vírico que codifica un antígeno y uno o más vectores adicionales. Por ejemplo, además del vector vírico que codifica un

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Toxoplasma y polipéptidos de Trypanosoma.

Los ejemplos de antígenos de parásitos helmínticos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de Angiostrongylus, polipéptidos de Ascaris, polipéptidos de Brugia, polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria, polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, polipéptidos de Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de Diphyllobothrium, polipéptidos de Diplydium, polipéptidos de Dirofilaria, polipéptidos de Dracunculus, polipéptidos de Enterobius, polipéptidos de Filaroides, polipéptidos de Haemonchus, polipéptidos de Lagochilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos de Mansonella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de Nanophyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nematodirus, polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca, polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia, polipéptidos de Parafilaria, polipéptidos de Paragonimus, polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de Physaloptera, polipéptidos de Protostrongylus, polipéptidos de Setaria, polipéptidos de Spirocerca, polipéptidos de Spirometra, polipéptidos de Stephanofilaria, polipéptidos de Strongyloides, polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de Trichuris, polipéptidos de Uncinaria y polipéptidos de Wuchereria.

Los ejemplos de antígenos de ectoparásitos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos (incluyendo antígenos protectores así como alérgenos) de pulgas; garrapatas, incluyendo garrapatas duras y garrapatas blandas; moscas, tales como quirnomidos, mosquitos, moscas de la arena, simúlidos, tábanos, moscas de los cuernos, moscas del venado, moscas tsetsé, moscas de los establos, moscas causantes de miasis y mosquitos mordedores; hormigas; arañas, piojos; ácaros y chinches verdaderas, tales como chinches y chinches besuconas.

Una vez que se ha identificado y seleccionado un antígeno, se identifica una secuencia que codifica el antígeno deseado. Preferiblemente, la secuencia comprende un ADNc. Después de la infección vírica, la secuencia de interés (por ej., una que codifique el antígeno) se expresa por las células dendríticas diana. Si se ponen en contacto ex vivo, las células dendríticas diana se tienen que volver a transferir después al paciente, por ejemplo por inyección, donde interaccionan con células inmunitarias que sean capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno deseado. En realizaciones preferidas, se inyecta el virus recombinante al paciente donde transduce las células dendríticas diana in situ. Las células dendríticas expresan entonces el antígeno particular asociado a una enfermedad o trastorno que se tiene que tratar y el paciente puede incrementar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o el trastorno.

El genoma vírico del vector puede contener una secuencia de polinucleótidos que codifique más de un antígeno y en la transducción de una célula dendrítica diana, genera respuestas inmunitarias a la multitud de antígenos suministrados a la célula. En algunas realizaciones, los antígenos se relacionan con una sola enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, los antígenos se relacionan con múltiples enfermedades o trastornos.

En algunos de los virus, los factores de maduración de CD que activan y/o estimulan la maduración de las CD se suministran junto con la secuencia de interés. En alternativas, las CD se activan por suministro de factores de maduración de CD previamente a, de manera simultánea con o después de suministro del virus. Los factores de maduración de CD pueden ser proporcionados por separado de la administración del virus.

Como se describe en la presente memoria, uno o más factores de modulación inmunitaria o de maduración de CD pueden ser codificados por una o más secuencias que estén contenidas en el genoma vírico y se expresan después de que el virus infecta a la célula dendrítica. Las secuencias que codifican los factores de modulación inmunitarios también pueden ser proporcionadas en un vector separado que se co-transinfecta con el vector vírico que codifica uno o más antígenos en una estirpe celular de empaquetamiento.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para inmunotratamiento adoptivo en un paciente. Como se describió anteriormente, se identifica un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. Se obtiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado y se empaqueta en un virus recombinante. Se obtienen células dendríticas diana del paciente y se transducen con un virus recombinante que contiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado. Las células dendríticas se transfieren de nuevo después al paciente.

Las partículas víricas se pueden inyectar in vivo, donde infectan las CD y suministran una secuencia de interés, codificando típicamente un antígeno. La cantidad de partículas víricas es al menos 3X106 UI y puede ser al menos 1X107 UI, al menos 3X107UI, al menos 1X108 UI, al menos 3X108 UI, al menos 1X109 UI o al menos 3X109 UI. En intervalos seleccionados, las CD de los órganos linfoides del receptor se pueden usar para medir la expresión, por ejemplo, observar la expresión de marcador, tal como GFP o luciferasa. Las técnicas de control de ácido nucleico y las mediciones de actividad de la transcriptasa inversa (TI) también se pueden usar para analizar la biodistribución de partículas víricas. Las células T de células mononucleares de sangre periférica, ganglios linfáticos, bazos o tejido infectado con patógenos malignos o diana de receptores tratados con partículas de vector lentivírico se pueden medir de la magnitud y durabilidad de la respuesta a estimulación de antígenos. En las células de tejido distintas de las CD, tales como células epiteliales y células linfoides, se puede analizar la especificidad de suministro de genes in vivo.

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Está ampliamente convenido que el método potencial más eficaz para terminar la epidemia de SIDA (y otras enfermedades víricas) es una vacuna preventiva eficaz. Hasta la fecha, ningún método de vacunación contra VIH ha pasado con éxito una prueba de fase III. Así, hay una urgente necesidad de nuevas estrategias de vacunación eficaces. Una estrategia es la vacunación de las CD. En esta implantación, una secuencia que codifique una proteína vírica, tal como la descrita anteriormente, se clona en un vector vírico. Los pacientes son infectados con virus construidos como se describe en la presente memoria. En un modelo animal, se pueden usar virus informadores de VIH clonado de manera molecular (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) y aislados clínicos para provocar a los animales por inyección en la vena de la cola. Se puede controlar la evidencia de infección con el tiempo en los esplenocitos, ganglios linfáticos y sangre periférica. La multiplicación PCR para VIH-proteína gag y citometría de flujo para HAS en el virus informador se puede usar para ensayar la integración y replicación víricas. La vacunación de CD in situ productiva puede aumentar la resistencia a una provocación de VIH.

Las vacunas con frecuencia incluyen un adyuvante. Las partículas de vector lentivírico descritas en la presente memoria también se pueden administrar junto con un adyuvante. El adyuvante se puede administrar con las partículas de virus recombinante, antes de las partículas de virus recombinante o después de las partículas de virus recombinante. Si se administra con las partículas de virus, los adyuvantes deseables no rompen de manera significativa la integridad de las partículas de virus, de manera que se rompa la membrana vírica que contiene las glucoproteínas de envoltura.

Se puede usar una variedad de adyuvantes en asociación con el virus para provocar una respuesta inmunitaria al antígeno codificado en el genoma de vector vírico. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un antígeno sin causar cambios conformaciones en el antígeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado (MPL, por sus siglas en inglés) (véase la patente británica GB 2220211). QS21 es un glucósido de triterpeno o saponina aislados de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina encontrado en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Popozo and Newman, Plenum Press, NY, 1.995); Patentes de EE.UU. Nº 5.057.540). Otros adyuvantes son aceite en emulsiones acuosas (tal como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1.997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1.998). Alternativamente, Aβ se puede acoplar a un adyuvante. Por ejemplo, una versión de lipopéptido de Aβ se puede preparar por acoplamiento de ácido palmítico u otros lípidos directamente al N-terminal de Aβ, como se describe para vacunación de antígeno de la hepatitis B (Livingston, J. Immunol. 159, 1.383-1.392 (1.997)). Sin embargo, dicho acoplamiento no debería cambiar sustancialmente la conformación de Aβ a fin de afectar a la naturaleza de la respuesta inmunitaria al mismo. Se pueden administrar adyuvantes como componente de una composición terapéutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, al mismo tiempo con o después de administración del agente terapéutico.

Una clase de adyuvantes son sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina. Otra clase de adyuvantes son formulaciones de emulsión de aceite-en-agua. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como muramil péptidos (por ej., Nacetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn--glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida.TM.) u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite-en-agua incluyen (a) MF59 (patente internacional WO 90/14837), que contienen 5% de Escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partículas de submicrómetro usando un microfluidizador tal como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, que contiene 10% de Escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado con plurónico y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión en submicrómetros o sometido a agitador vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor y (c) sistema adyuvante de Ribi (RAS, por sus siglas en inglés), (Ribi Inmunicen, Hamilton, Monte.) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en: monofosforilípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS, por sus siglas en inglés), preferiblemente MPL+CWS (Detox™). Otra clase de adyuvantes preferidos son adyuvantes de saponina, tales como Stimulon. TM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o partículas generadas allí de tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen Adyuvante de Freund Completo (CFA, por sus siglas en inglés) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA, por sus siglas en inglés). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés), factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés).

Otro adyuvante que se puede usar con las composiciones en la presente memoria se identifica por la fórmula química (I):

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en la que los restos A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de: hidrógeno, fosfato y sales de fosfato. Sodio y potasio son contraiones ejemplares para las sales de fosfato. Los restos R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo con 3 a 23 carbonos, representado por C3-C23. Para más claridad se explicará que cuando un resto se "selecciona independientemente de" un grupo especificado con múltiples miembros, se debería entender que el miembro elegido para el primer resto no impacta o limita de ningún modo la elección del miembro seleccionado para el segundo resto. Los átomos de carbono a que se unen R1, R3, R5 y R6 son asimétricos, y así pueden existir en cualquier estereoquímica R o S. En una realización, todos esos átomos de carbono están en la estereoquímica R, mientras en otra realización todos esos átomos de carbono están en la estereoquímica S.

"Hidrocarbilo" se refiere a un resto químico formado completamente por hidrógeno y carbono, donde la disposición de los átomos de carbono puede ser cadena lineal o ramificada, no cíclica o cíclica, y el enlace entre átomos de carbono adyacentes puede ser completamente enlaces sencillos, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo saturado o puede haber enlaces dobles o triples presentes entre dos cualesquiera átomos de carbono adyacentes, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo insaturado y el número de átomos de carbono en el grupo hidrocarbilo está entre 3 y 24 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un alquilo, donde los alquilos de cadena lineal representativos incluyen: metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras los alquilos ramificados incluyen: isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Los hidrocarbilos cíclicos saturados representativos incluyen: ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras los hidrocarbilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares. Hidrocarbilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (referido como un "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente, si el hidrocarbilo es no cíclico y cicloalqueni y cicloalquinilo, respectivamente, si el hidrocarbilo es al menos parcialmente cíclico). Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen: etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3dimetil-2-butenilo y similares; mientras los alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen: acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo y similares.

El adyuvante de fórmula (I) se puede obtener por métodos sintéticos conocidos en la técnica, por ejemplo, la metodología sintética desvelada en la Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 2009/035528, así como las publicaciones identificadas en la Patente Internacional WO 2009/035528. Algunos de los adyuvantes también se pueden obtener comercialmente. Un adyuvante preferido es el Producto Nº 699800 como se identifica en el catálogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, véase E1 en combinación con E10, a continuación.

En diversas realizaciones de la invención, el adyuvante tiene la estructura química de fórmula (I) pero los restos A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de subconjuntos de las opciones proporcionadas previamente para estos restos, donde estos subconjuntos se identifican a continuación por E1, E2, etc.

E1: A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrógeno.

E2: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C3-C21 y R2 y R4 son hidrocarbilo C5-C23.

E3: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C5-C17 y R2 y R4 son hidrocarbilo C7-C19.

E4: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C15 y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C17.

E5: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C13 y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C15.

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E6: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C15 y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C17.

E7: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C13 y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C15.

E8: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20 y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20.

E9: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 y R2 y R4 son hidrocarbilo C13.

E10: R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.

En algunas opciones, cada uno de E2 a E10 se combina con la realización E1 y/o los grupos hidrocarbilo de E2 a E9 son grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo de cadena lineal.

El adyuvante de fórmula (I) se puede formular en una composición farmacéutica, opcionalmente con un coadyuvante, cada uno como se discute a continuación. Con respecto a esto se hace referencia a la Publicación de Patente de EE.UU. Nº 2008/0131466 que proporciona formulaciones, por ej., formulación acuosa (FA) y formulaciones de emulsión estables (ES) para adyuvante GLA, donde se pueden utilizar estas formulaciones para cualquiera de los adyuvantes de fórmula (I).

Se puede administrar un adyuvante con el virus de la invención como una única composición o se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración del virus recombinante de la invención. Se puede empaquetar y suministrar inmunógeno y adyuvante en el mismo vial o se puede empaquetar en viales separados y mezclar antes de su uso. Inmunógeno y adyuvante se empaquetan típicamente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica deseada. Si se empaquetan por separado inmunógeno y adyuvante, el empaquetamiento incluye típicamente instrucciones para mezclarlos antes de uso. La elección de un adyuvante y/o portador depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, la vía de administración, el plan de dosificación, la eficacia del adyuvante para las especies que se vacunan y, en los seres humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es uno que ha sido homologado o se puede homologar para administración a seres humanos por los órganos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante de Freund Completo no es adecuado para administración a seres humanos. Se prefieren alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, se pueden usar dos o más adyuvantes diferentes de manera simultánea, tal como alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21 y alumbre, QS21 y MPL juntos. También, se puede usar adyuvante de Freund Incompleto (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1.998)), opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.

E. Composiciones farmacéuticas y estuches.

También se consideran en la presente memoria composiciones farmacéuticas y estuches que contienen un virus proporcionado en la presente memoria y uno o más componentes. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir partículas del vector vírico como se proporciona en la presente memoria y un portador farmacéutico. Los estuches pueden incluir las composiciones farmacéuticas y/o combinaciones proporcionadas en la presente memoria y uno o más componentes, tales como instrucciones para uso, un dispositivo para administración de un compuesto a un individuo y un dispositivo para administración de un compuesto a un individuo.

Se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas que contienen partículas víricas como se proporcionan en la presente memoria y un portador farmacéutico adecuado. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria pueden estar en diversas formas, por ej., en forma sólida, líquida, polvo, acuosa o liofilizada. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica. Dichos portadores y/o aditivos se pueden formular por métodos convencionales y se pueden administrar al individuo en una dosis adecuada. Los agentes estabilizantes tales como lípidos, inhibidores de la nucleasa, polímeros y agentes quelantes pueden conservar las composiciones de degradación en el cuerpo.

Las partículas del vector vírico proporcionadas en la presente memoria se pueden empaquetar como estuches. Los estuches pueden incluir opcionalmente uno o más componentes tales como instrucciones para uso, dispositivos y reactivos adicionales y componentes, tales como tubos, envases y jeringas para práctica de los métodos. Los estuches ejemplares pueden incluir los virus proporcionados en la presente memoria y pueden incluir opcionalmente instrucciones para uso, un dispositivo para detectar un virus en un individuo, un dispositivo para administración del virus a un individuo y un dispositivo para administración de un compuesto a un individuo.

Los estuches que comprenden polinucleótidos que codifican un gen de interés (típicamente un antígeno) también se consideran en la presente memoria. El estuche puede incluir al menos un plásmido que codifique componentes de empaquetamiento de virus y variante de glucoproteína E2 de virus Sindbis codificador del vector. Algunos estuches contendrán al menos componentes de empaquetamiento de un plásmido codificador de virus, una variante de glucoproteína E2 de virus Sindbis codificador del vector y un vector codificador de al menos un factor de maduración de CD.

Los estuches que comprenden un vector vírico codificador de una secuencia de interés (típicamente un antígeno) y opcionalmente, una secuencia de polinucleótidos codificadora de un factor de maduración de CD también se

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transducción basado en ácidos nucleicos aguas abajo por partículas del vector lentivírico. Los lentivectores o vectores anfotrópicos se pseudotipifican después con VSVG y se usan para transducir células 293T. Alternativamente, se generan estirpes celulares por transducción estable de células 293T parentales con un plásmido que codifica CD-SIGN humana. Las células resultantes se someten a tinción con anticuerpos (anticuerpo

5 CD-SIGN anti-humano (BD Biosciences) y clasificación de células para proporcionar una población uniforme de estirpes celulares de CD-SIGN+.

En tres experimentos independientes, el vector lentivírico pseudotipificado con envoltura SIN-Var1 presentó títulos aproximadamente 10 veces mayores que los títulos pseudotipificados con SVGmu o con la cepa HR de virus Sindbis (Figura 3, gráfica superior). En un estudio posterior, se comparó la productividad de tres variantes de envoltura

10 Sindbis. Se muestra un resultado representativo. Las envolturas Sin-Var1, Sin-Var2 y SIN-Var3 generan partículas del vector lentivírico con similar título total.

La especificidad de las partículas del vector vírico que comprenden una glucoproteína E2 de la variante de virus Sindbis se evalúa por transducción del 293T.hCD-SIGN o las células 293T parentales y la medición de la expresión de un marcador visible (por ej., GFP) en las estirpes celulares.

15 Se sembraron células diana (293T.hCD-SIGN o células 293T) en una placa de cultivo de 24 pozos (0,2X106 células por pozo) y se transdujeron con sobrenadantes víricos (1 ml por pozo) centrifugando las placas a 262 rad/s (2.500 rpm) y 30°C durante 90 min. Con posterioridad, los sobrenadantes son reemplazados con medio de cultivo fresco y se incubaron durante 3 días a 37°C. El porcentaje de células que expresan el marcador se mide por citometría de flujo.

20 Como se muestra en la tabla a continuación, tanto la variante 1 de E2 como la variante 3 de E2 fijaron como objetivo preferentemente células (son específicas para las células) que expresan hCD-SIGN.

Tabla 1

Envoltura

Tipo de Célula GFU/ml Relación

VSV-G

hCD-SIGN 1,35E+08 1,19

293T

1,13E+08

Sin-Var3 (Exp 1)

293-hCD-SIGN 4,2E+07 35,4

293T

1,2E+06

Sin-Var3 (Exp 2)

hCD-SIGN 8,12E+07 11,09

293T

7,33E+06

Sin-Var2

293-hCD-SIGN 1,7E+08 18,2

293T

9,1E+06

Sin-VAR-1

hCD-SIGN 2,93E+08 13,75

293T

2,13E+07

Sin-HR

293-hCD-SIGN 6,4E+06 9,4

293T

6,8E+05

SVGmu (Exp 1)

293-hCD-SIGN 3,4E+06 27,0

293T

1,3E+05

SVGmu (Exp 2)

hCD-SIGN 4,65E+06 12,24

293T

3,80E+05

Ejemplo 4 Inmunogenicidad de partículas de vector lentivírico que comprende glucoproteínas de envoltura de virus Sindbis. 25 En este Ejemplo, se evalúa la inmunogenicidad para vectores lentivíricos pseudotipificados con diferentes envolturas

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Claims (1)

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