ES2337115B2 - Metodo para la deteccion del riesgo de desarrollar vitreorretinopatiaproliferante (vrp). - Google Patents
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Abstract
Método para la detección del riesgo de
desarrollar vitreorretinopatía proliferante (VRP).
La presente invención se refiere a un método que
permite identificar el riesgo de desarrollar vitreorretinopatía
proliferante en aquéllas personas que son sometidas a cirugías
oculares. Más concretamente, el método se basa en la detección de
una serie de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP: "single
nucleotide polymorphisms") o grupos de SNPs (Haplotipos) que
predisponen al desarrollo de la enfermedad.
Description
Método para la detección del riesgo de
desarrollar vitreorretinopatía proliferante (VRP).
La presente invención se refiere a un método que
permite identificar el riesgo de desarrollar vitreorretinopatía
proliferante en aquéllas personas que son sometidas a cirugías
oculares. Más concretamente, el método se basa en la detección de
una serie de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP: "single
nucleotide polymorphisms") o grupos de SNPs (Haplotipos) que
predisponen al desarrollo de la enfermedad.
La vitreorretinopatía proliferante (VRP) es una
respuesta cicatrizal anómala, que constituye la causa más frecuente
del fracaso de la cirugía de desprendimiento de retina (DR) y para
la que, a pesar de los avances que ha vivido la oftalmología en las
últimas décadas, aún siguen sin conocerse sus causas o los factores
que predisponen a la misma.
Desde hace más de 20 años se han realizado
importantes esfuerzos para conocer factores predictores del riesgo
de sufrir esta complicación, en un intento por identificar a los
pacientes que se beneficiarían de terapias más específicas o para
mejorar la comprensión de los mecanismos intrínsecos que provocan
esta complicación.
Hasta el momento, todos los trabajos en esta
línea se han desarrollado en base al análisis de las características
clínicas de los pacientes con DR con y sin VRP, y los modelos
predictivos establecidos en función de éstas variables, aunque
explican parcialmente el riesgo de desarrollar esta complicación,
son incapaces de aportar un análisis con valores de sensibilidad y
especificidad satisfactorios.
En 2006 Sanabria et al realizaron un
estudio piloto sobre el componente genético en el desarrollo de la
VRP, encontrándose una distribución diferente de los (SNP)
estudiados en los codones 10 y 25 del Transforming Growth Factor
beta 1 (TGF-beta1) entre los pacientes con y sin
VRP, lo que les llevó a concluir que éstos podrían conferir una
mayor susceptibilidad a presentar esta complicación (Sanabria
Ruiz-Colmenares et al. Acta Ophthalmol Scand.
Jun; 84(3):309-13 (2006)). Sin embargo, estos
resultados no consiguen demostrar en absoluto existencia de factores
genéticos que predispongan al desarrollo de VRP, puesto que el
escaso tamaño muestral de ese trabajo no permite utilizar las
herramientas estadísticas adecuadas para el análisis de datos
genéticos.
La confirmación de la contribución genética de
un individuo a presentar una mayor susceptibilidad para el
desarrollo de la VRP y, así como, la identificación del perfil
genético que confiere ese incremento del riesgo, permitiría la
apertura de nuevas posibilidades de tratamiento enfocados hacia el
desarrollo de terapias más personalizadas.
Los autores de la presente invención han
conseguido demostrar, sorprendentemente, la presencia de factores
genéticos que predisponen al desarrollo de VRP. El análisis de estos
factores genéticos, vendrán a completar los estudios de aquéllos
factores clínicos que en la actualidad ya se emplean para determinar
el riesgo que un determinado sujeto tiene a padecer VRP tras una
intervención ocular.
Tal y como informa el articulo publicado en 2005
de Nature Genetics (Nat. Genet 37:1299-1300), aunque
muchos de los 7 millones de SNPs que se conocen tienen unas
frecuencias superiores al 5%, en la actualidad no existen
herramientas que permitan llevar a cabo el análisis en bloque de
todos ellos. Este hecho, que supone la dificultad de hacer un
estudio genético completo, unido al desconocimiento acerca de qué
genes podrían estar relacionados con la VRP llevó a la necesidad de
llevar a cabo la selección de todos aquellos genes que a
priori pudiesen, de algún modo, estar relacionados con la
complicación.
Para la selección de los marcadores, fue
necesaria la formulación de una hipótesis de partida que planteó la
posibilidad de que algunos marcadores de genes de citoquinas,
factores nucleares y factores de crecimiento involucrados en la
inflamación y en procesos fibróticos, así como los intermediarios
correspondientes de las vías de señalización, pudieran estar
presentes de forma significativa en pacientes que hubiesen
desarrollado VRP tras un DR.
Así, se seleccionaron para el análisis 30 genes
candidatos involucrados en los diferentes mecanismos implicados en
la inflamación y en procesos profibróticos en general, que se
detallan a continuación:
El TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG,
IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF,
PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1,
IGF-11, IGF2, IGF-IR.
El gen del TNF\alpha está ubicado en el
cromosoma 6, dentro de una región en medio del complejo mayor de
histocompatibilidad. Los genes ubicados en esta región presentan un
alto desequilibrio de ligamiento, de forma tal que los marcadores
estudiados en un gen señalan a otros marcadores en otros genes
dentro de la región. Se considera además que la mayoría regula la
expresión del TNF\alpha. De esta forma, se ha descrito esta región
como TNF block (bloque del TNF). El bloque del TNF está compuesto
por los siguientes genes: los llamados genes del TNF (TNF\alpha;
LTA; LTB), el gen del AIF1, el gen del NCR3, el gen del NFKBIL1, el
gen del ATP6P1G, y el gen del BAT1. (Allcock, R. J. N.; Windsor, L.;
Gut, I. G.; Kucharzak, R.; Sobre, L.; Lechner, D.; Garnier, J.-G.;
Baltic, S.; Christiansen, F. T.; Price, P.
High-density SNP genotyping defines 17 distinct
haplotypes of the TNF block in the Caucasian population:
implications for haplotype tagging. Hum. Mutat. 24:
517-525, 2004). En el presente trabajo se han
incluido marcadores ubicados en los genes que componen este bloque y
se han denominado indistintamente TNF.
A partir de estos genes, se seleccionaron un
total de 230 de SNPs, que se encontraban distribuidos entre los 30
genes candidatos mencionados anteriormente y que se analizaron para
un total de 450 muestras. De todos los SNPs analizados únicamente
aquéllos localizados en los genes SMAD7, TNF, PIK3CG y TNFR2
presentaron una asociación significativa con la VRP, una vez
analizados un total de 88.650 polimorfismos para el total de
muestras. Estos resultados demuestran la existencia de factores
genéticos que predisponen al desarrollo de VRP y, más concretamente,
la asociación de determinados genes con la complicación.
En una segunda fase, y a partir de los modelos
estadísticos se identificaron combinaciones de SNPs que permiten
evaluar el riesgo de desarrollar una VRP en un paciente nuevo. Se
identificaron modelos predictivos de 2,10 y 42 SNP.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere a un método para la determinación del riesgo de
desarrollar VRP (en adelante, método de la invención) que comprende
identificar en una muestra la presencia de factores de riesgo o la
ausencia de factores de protección de cualquiera de los marcadores
seleccionados del siguiente grupo de marcadores genéticos:
- i)
- Marcadores ubicados en el gen SMAD7,
- ii)
- Marcadores ubicados en el gen TNF,
- iii)
- Marcadores ubicados en el gen PIK3CG,
- iv)
- Marcadores ubicados en el gen TNFR2,
- v)
- marcadores ligados a cualquiera de los marcadores anteriores, preferentemente con un desequilibrio de ligamiento (r^{2}) mayor o igual 0.70, 0.80 ó 0.90 y más preferentemente ubicados en el mismo gen. Los marcadores ubicados en los mencionados genes son, preferentemente, SNPs que pueden ser seleccionados, sin ninguna limitación, de las bases de datos dbSNP, HapMap, etc.
donde la presencia de al menos uno de los de los
marcadores i-v es indicativa de la existencia de un
mayor o menor riesgo a desarrollar VRP.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, los marcadores ubicados en los genes SMAD7, TNF,
PIK3CG, TNFR2 pueden ser seleccionados del grupo que comprende, sin
ningún tipo de limitación, SNPs, microsatélites, minisatélites,
inserciones, deleciones, variaciones del numero de copias,
inversiones y traslocaciones, donde dichos marcadores pueden ser
analizados mediante técnicas sobradamente conocidas en el estado de
la técnica (Nat Rev Genet. 2001 Dec;
2(12):930-42, Forensic Sci. Int. (2005) 154:
181-194, Nature. 2006,
444(7118):444-54, PCR Methods Appl.
3:13-22, 1993, etc).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente
invención los marcadores genéticos ubicados en los genes SMAD7, TNF,
PIK3CG, TNFR2 son seleccionados respectivamente del grupo que
comprende:
- i)
- rs7226855 (tabla 2),
- ii)
- rs2229094, rs2256974, rs2857706 (tabla 2) y haplotipos de TNF seleccionados de la tabla 3.
- iii)
- El haplotipo seleccionado de la tabla 3 (PIK3CG).
- iv)
- El haplotipo seleccionado de la tabla 3 (TNFR2), ó
- v)
- Marcadores ligados a cualquiera de los marcadores anteriores, preferentemente con un desequilibrio de ligamiento (r^{2}) entre marcadores de r^{2} mayor o igual 0.70, y más preferentemente SNPs que pueden ser seleccionados, sin ninguna limitación, de las bases de datos dbSNP, HapMap, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aun más preferida de este
aspecto de la invención el método comprende las etapas de:
- i)
- Extracción y purificación de material genético (genómico o mitocondrial) a partir de una muestra,
- ii)
- Amplificación de al menos uno de los marcadores mencionados anteriormente,
- iii)
- Identificación de los marcadores mediante técnicas sobradamente conocidas en el estado de la técnica.
- iv)
- Determinación del riesgo a desarrollar VRP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos necesarios para llevar a
cabo la amplificación de los marcadores genéticos pueden ser
desarrollados, sin ningún tipo de limitación, a partir la
información disponible en bases de datos tales como
EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk) o NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov) y programas informáticos tales como Primer 3,
Assay Design 3.0, entre otros.
En una realización preferida de la invención el
método de la invención puede estar automatizado empleando cualquiera
de las técnicas seleccionadas del grupo de sistemas que comprende,
sin ningún tipo de limitación: MassArray system de SequenomTM,
SNPlex genotipyng system de Applied Biosystems, GenomeLab SNPstream
system, entre otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un método para la determinación del riesgo de desarrollar VRP que
comprende los siguientes pasos:
- a.
- Extraer el material genético de una muestra biológica aislada.
- b.
- Genotipar al menos un SNP ubicado en al menos uno de los genes seleccionados del grupo que comprende: TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR, preferentemente seleccionados de cualquiera de las tablas 1 y 8.
- c.
- Seleccionar al menos un SNP del paso 2 a partir de procedimientos basados en la minimización del error de predicción.
- d. \hskip0.5cm i)
- Introducir los datos de genotipado de los SNPs seleccionados en el paso c) de una muestra problema en un modelo ajustado mediante la aplicación de la técnica Random Forest, ó
- ii)
- Introducir los datos de genotipado de los SNPs seleccionados en el paso c) de una muestra problema en un modelo ajustado mediante la aplicación de cualquiera de las técnicas Support Vector Machines con kernel lineal ó Support Vector Machines con Kernel radial.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida de este aspecto
de la invención, los SNPs genotipados de cada uno de los genes del
paso b deben formar un conjunto mínimo de SNPs representativos,
localizados en un determinado gen o región capaces de caracterizar a
dicho gen/región. La selección de este conjunto implica la
eliminación de aquellos SNPs que proporcionan información redundante
debido al alto desequilibrio de ligamiento respecto del conjunto de
SNPs elegido.
En una realización preferida de este segundo
aspecto de la invención en el paso b) se genotipa al menos un SNP o
conjunto mínimo de SNPs donde dicho SNPs son TagSNPs y/o están
ubicado en exones o regiones promotoras del gen.
En una más realización también preferida de este
aspecto de la invención en el paso b) se genotipan al menos dos SNPs
que se encuentran en bloques de desequilibrio diferentes, y más
preferentemente en genes distintos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización todavía más preferida de este
aspecto de la invención en el paso c) la selección del los SNPs del
paso 2 (SNPs más informativos) se realiza por cualquiera por
cualquiera de los siguientes procedimientos:
- a.
- un procedimiento basado en la búsqueda exhaustiva del mejor subconjunto de SNPs
- b.
- un procedimiento basado en la búsqueda secuencial partiendo del subconjunto formado por todos los SNPs del paso 2 y desestimando progresivamente aquellos SNPs cuya eliminación del modelo no proporciona un menor error de predicción (Díaz-Uriarte R. y Álvarez de Andrés S. (2006). BMC Bioinformatics 2006, 7:3 doi:10.1186/1471-2105-7-3)
- c.
- un procedimiento basado en la búsqueda secuencial partiendo del subconjunto formado por un único SNP y seleccionando progresivamente aquellos SNPs del paso 2 cuya incorporación al modelo proporciona un menor error de predicción.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aun más preferida de este
aspecto de la invención los SNPs de los genes TNF, TNFR2, TGFB1,
TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1,
NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2,
MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR son
seleccionados de la tabla 8 y, en una realización preferida los
genes seleccionados del paso c) son aquellos presentados en
cualquiera de las tablas 4, 5 o 6.
Un tercer aspecto de la invención proporciona un
Kit (en adelante kit de la invención) para determinar el riesgo de
desarrollar VRP que comprende medios capaces de llevar a cabo la
reacción de detección de los marcadores genéticos ubicados en los
genes SMAD7, TNF, PIK3CG, TNFR2. Dichos medios de detección pueden
comprender, sin ningún tipo de limitación, oligonucleótidos, enzimas
(polimerasas, enzimas de restricción, etc.), tampones, dNTPs, y
cualquier otro reactivo requerido para la puesta a punto del
kit.
Figura 1.- Cada punto representa el número de
SNPs frente a la estimación de error que se comete al clasificar a
los individuos utilizando cada SNP para cada modelo. El error de
predicción mejora a medida añadimos SNPs al modelo, hasta alcanzar
un punto en el que, mientras más SNPs se utilizan, peor es la
predicción.
Figura 2. Cada punto representa el número de
SNPs frente a la estimación de error que se comete al clasificar a
los individuos utilizando cada SNP para cada modelo. El error de
predicción mejora a medida añadimos SNPs al modelo, hasta alcanzar
un punto en el que, mientras más SNPs se utilizan, peor es la
predicción.
Figura 3. Curvas ROC. Establece la capacidad de
predicción del modelo. Cuanto más se aleje de la diagonal (hacia
arriba), mejor capacidad de predicción tiene el modelo.
A continuación se presentan una serie de ensayos
realizados por los inventores, cuya finalidad es ilustrar y poner de
manifiesto la especificidad y efectividad de la invención, no
suponiendo en ningún caso una limitación a la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de genes candidatos se realizó en
función de la información disponible sobre patologías inflamatorias
o profibróticas. Para ello se realizó una extensa busqueda
bibliográfica en las bases de datos públicas PubMed y OMIM
(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/), que llevó a la selección de los
siguientes 30 genes:
TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG,
IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF,
PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1,
IGF-11, IGF2, IGF-IR
\vskip1.000000\baselineskip
La búsqueda y selección de los polimorfismos se
realizó utilizando las bases de datos públicas, como dbSNP o HapMap.
Se seleccionaron aquellos polimorfismos que fueran bialélicos, como
la mayoría de los SNPs, y aquellas deleciones que no superaran las 6
pares de bases.
Para la selección se tuvieron en cuenta los
siguientes criterios:
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \sqbullet
-
\vtcortauna
En función de los criterios utilizados se
preselecionaron 230 polimorfismos, distribuidos entre los 30 genes
candidatos, que de algún modo podría estar relacionados con la
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pacientes, seleccionados a partir de centros
de referencia ubicados en 5 comunidades autónomas españolas
diferentes, se clasificaron según las características clínicas que
presentaban en el momento de su inclusión en el estudio, siendo
asignados en los grupos caso o control:
Para el grupo VRP (casos) se incluyeron
pacientes con DR primario que tuviesen una o más de las siguientes
características:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Para el grupo DR (controles) se
incluyeron pacientes con DR primario que tras 3 meses de seguimiento
no hubiesen desarrollado una VRP.
Esta clasificación fenotípica de los pacientes
fue efectuada por cada investigador de acuerdo a los criterios
clínicos mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calculó el tamaño muestral adecuado teniendo
en cuenta la incidencia de la VRP en el entorno. Según la fórmula de
tamaño muestral para muestras de distinto tamaño, considerando como
casos a los pacientes con VRP y controles a los pacientes con DR, se
estimó necesario recoger muestras de 150 casos de VRP y 300 DR. Con
ese tamaño muestral se tendría una potencia del 90% para detectar
diferencias significativas entre los grupos caso y control.
\vskip1.000000\baselineskip
La toma de muestra se realizó a partir de sangre
periférica, extrayendo 6 mi de cada uno de los pacientes incluido en
el estudio que se conservaron en tubos de plástico con EDTA a 4ºC.
Los envíos de las muestras desde los diferentes centros implicados
en el estudio se enviaron al Laboratorio de Biología Molecular del
IOBA a temperatura ambiente, una vez por semana.
A medida que se recibieron las muestras de
sangre periférica, se realizó la extracción de ADN según el
protocolo que se detalla en el kit comercial REAL Kit para
extracción de DNA de sangre periférica SSS ref: RBM02.
Las muestras de ADN se almacenaron en tubos
Eppendorf a -20ºC, identificados con el código de barras
correspondiente. La cuantificación del ADN se realizó con la técnica
de real time-PCR. En aquellos casos en los que hubo
alguna duda sobre la pureza de la muestra se llevó a cabo la
verificación mediante espectrofotometría. Para ello se utilizó el
espectrofotómetro BioPhotometer, de la casa Eppendorf y se tomó como
punto de corte de índice de pureza de la muestra 1,6.
Una vez extraído el ADN de todas las muestras se
enviaron al Centro Nacional de Genotipado de Santiago de Compostela,
donde se realizó el genotipado de las mismas.
Las muestras de ADN se remitieron al centro de
genotipado en placas de 96 pocilios debidamente numeradas y
selladas, en concentraciones de 100 ng/ul y con un volumen de 50 ul
cada uno.
\vskip1.000000\baselineskip
El genotipado de las muestras se llevó a cabo de
forma enmascarada y tanto lo casos como los controles se analizaron
simultáneamente y bajo las mismas condiciones. Se utilizó para este
proceso una plataforma de alto rendimiento (SNPlex genotyping System
de Applied Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimaron las frecuencias alélicas y
genotípicas, y se verificó el equilibrio de
Hardy-Weinberg tanto en la muestra global como en
los controles.
Se establecieron las asociaciones nominales de
los diferentes SNPs con los grupos control y enfermedad utilizando
los modelos de chi-cuadrado y el Test exacto de
Fisher y se ajustaron modelos de regresión logística para elegir el
mejor modelo de herencia para cada SNP. Como cada individuo posee 2
alelos y el riesgo puede depender de cada uno de los ellos, se
definieron 5 modelos de herencia: co-dominante, en
donde cada alelo aporta un riesgo independiente; dominante, en donde
una copia del alelo en cuestión es suficiente para modificar el
riesgo (homocigoto para ese alelo y heterocigoto tienen el mismo
riesgo); recesivo, son necesarias 2 copias del alelo para modificar
el riesgo; sobre-dominante, es decir, ser
heterocigoto es un riesgo, y aditivo, en donde cada copia del alelo
involucrado modifica el riesgo, de manera que ser homocigoto para
ese alelo implica el doble de riesgo.
Se identificaron los posibles haplotipos
consistentes con los datos observados en la muestra, considerando
conjuntos formados por todos los SNPs estudiados por gen y
subconjuntos de alelos consecutivos de tamaño 2 hasta tantos
marcadores estudiados en cada gen menos 1. Se estimaron las
frecuencias haplotípicas en la muestra total y en cada grupo por
separado utilizando el algoritmo EM. Se utilizó un estadístico score
para contrastar la asociación entre los haplotipos y el estado
caso/control de la muestra. Para este análisis también se ajustaron
modelos de herencia: en este caso aditivo, recesivo y dominante.
Estos resultados se corrigieron utilizando el
método corrección para comparaciones múltiples en dos pasos
propuesto por Rosemberg (Rosenberg P.S. et al. (2006) Che A.,
Chen B.E. Statist Med, 25: 3134-49), en el que en un
primer paso cada asociación de un gen con la enfermedad se resume
utilizando un único p-valor que combina los análisis
de SNPs simples y de bloques haplotípicos y en una segunda etapa
estos p-valores por gen, se ajustan controlando la
tasa de falsos descubrimientos (False Discovery Rate, FDR)
utilizando el q-valor (Storey J.D. et al
(2003). Annals of Statistics, 31: 2013-35).
\vskip1.000000\baselineskip
En la toma de muestras se recogieron finalmente
un total de 450 muestras, 312 del grupo control y 138 del grupo
casos, entre los diferentes centros incluidos en el estudio. Una vez
reunidas todas las muestras y hecha la extracción y cuantificación
del DNA genómico, se realizó el genotipado de las mismas. Todas las
muestras pudieron ser analizadas.
De los SNPs seleccionados para su estudio, 6 no
pudieron ser estudiados por problemas en el diseño de los
oligonucleótidos y 27 no pudieron ser estudiados por fallos en el
procedimiento de genotipado. Se estudiaron pues 197 SNPs por
muestra, lo que supuso un total de 88.650 polimorfismos.
Para todos los polimorfismos se verificó que
cumplían con el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto
en la muestra global como en el grupo control y casos, excepto el
rs4916944 del PDGFA, por lo que éste también fue eliminado del
análisis. Además, también se estimaron las frecuencias genotípicas
para cada polimorfismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron las asociaciones de cada SNP por
separado con el estado caso- control y de acuerdo al modelo de
herencia que mejor explica la distribución de genotipos que existen
en la muestra. Se encontraron un total de 22 asociaciones
significativas distribuidas en 15 genes diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los bloques haplotípicos analizados
verificaron el desequilibrio, es decir, los alelos no se comportaron
con independencia entre si. Del análisis global de los haplotipos
completos de cada gen consistentes con la muestra (formados por
todos los alelos estudiados en cada gen) se observó que existía una
asociación significativa con el estado caso/control para los 4 de
los 30 genes estudiados.
Además se analizó qué ocurre con los haplotipos
formados por subconjuntos de alelos consecutivos de tamaño 2 hasta
tantos marcadores como se hubiesen estudiado por gen menos 1. Así,
se encontraron también asociaciones significativas de haplotipos
consistentes con la muestra en 11 genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Fijando el nivel de FDR (False Discovery Rate)
(Benjamini, et al. (1995). Controlling the
False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Múltiple
Testing. J Roy Stat. Soc. (Ser B) 57:
p.289-300), es decir, la proporción de falsos
positivos esperados entre los contrastes que resultaron
significativos, en 5%, se encontraron 4 genes significativamente
asociados con el estado caso/control: el PIK3CG
(p-valor: 0,009; q-valor: 0,03), el
SMAD7 (p-valor: 0,004;
q-valor:0,0250), el TNF (p-valor:
0,005; q-valor: 0,0250), y el TNFR2
(p-valor: 0,019; q-valor:
0,0475).
Este paso de corrección de los resultados
obtenidos previamente es imprescindible para establecer la
asociación significativa de un gen o un marcador genético con una
determinada enfermedad, ya que de no aplicarse las asociaciones
obtenidas a priori podrían ser erróneas. En el presente
estudio la aplicación de esta corrección supuso el descarte de más
del 70% de los genes candidatos iniciales.
Tabla de genes que resultan significativos con
el estado caso/control tras la corrección FDR para comparaciones
múltiples.
En las tablas 2 a 3 se muestran las asociaciones
simples y múltiples de genes de la tabla 1 que resultaron estar
significativamente asociados con la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta segunda fase y a partir de los modelos
estadísticos, se identificaron combinaciones de SNPs que permiten
evaluar el riesgo de desarrollar una VRP en un paciente nuevo. Se
identificaron modelos predictivos de 2, 10 y 42 SNP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mide la correlación del SNP con la presencia
o no de VRP usando lo que se conoce como "ganancia de
información" (IG, Information Gain) ((Cover T.M., Thomas J.A.
(1991). Elements of information theory. New York: John Wiley):
técnica de aprendizaje automatizado (machine learning) que consiste
en conseguir reducir la entropía como consecuencia de realizar una
división en los datos. La entropía, que denotamos por H, es una
medida del grado de incertidumbre que existe sobre un conjunto de
datos.
En nuestro contexto, dado un SNP concreto
consideramos dos variables, X = {AA,aa,Aa} que representa el
genotipo observado e Y = {0,1} que representa el estado
caso/control. Los pasos para determinar si este SNP es o no
informativo son los siguientes:
1) Calcular la entropía de la variable Y como
2 donde p_{k} es la probabilidad de pertenecer a
cada uno de los grupos, k=0 para los controles y k=1 para los casos.
Esta probabilidad se estima como la proporción de individuos de la
muestra que pertenecen al grupo concreto.
2) Calcular la entropía de la variable Y
condicionada a cada uno de los valores de X como
200 donde x_{i} \epsilon {AA, aa, Aa} y
H(Y/X = x_{i}) es la entropía de la variable Y entre
los pacientes cuyo genotipo observado es x_{i}
3) Calcular la IG como IG(Y/X) =
H(Y)-H(Y/X), de forma que un valor
de IG pequeño significaría que el SNP no es informativo.
4) Determinar la significación estadística de IG
utilizando un test de permutaciones (Welch W.J., 1990. Construction
of permutation test. J Am Statist Assoc, 85: 693-8).
La hipótesis que se contrasta es que el SNP no es buen predictor del
estado caso/control. El p-valor para cada uno de los
SNP se determina permutando aleatoriamente el estado caso/control
observado y calculando en cada caso el valor de IG en esa
permutación. El p-valor será la proporción de
permutaciones para las que el valor de IG es mayor o igual que el
valor original. Se contrasta el valor informativo de cada SNP con
10.000 permutaciones. Puesto que el número de contrastes es alto,
utilizamos el nivel de significación basado en el método
False-Discovery rate (Benjamini Y., Hochberg Y.
1995).
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo es ajustar modelos que clasifiquen
bien a nuevos individuos una vez conocido su perfil genotípico, es
decir que minimicen el error de predicción. Debido a las dimensiones
de los datos, se hace necesario elegir entre todas las variables
(SNPs) disponibles, conjuntos que predigan el estado de un individuo
de la manera más precisa posible.
Se han utilizado técnicas de aprendizaje
automatizado (Machine Learning Techniques). Este tipo de técnicas
tratan de construir de forma semi-automática
modelos estadísticos predictivos. Hay muchos tipos de modelos, pero
es imposible, a priori, determinar que clase de modelo es más
apropiado para un conjunto de datos dado. Por ese motivo, se prueban
diferentes tipos de modelos y posteriormente se validan, para
finalmente seleccionar el modelo más fiable en cuanto a su capacidad
predictiva.
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El modelo de Naïve Bayes utiliza las frecuencias
de los diferentes valores de cada SNP en pacientes cuyo estado
caso/control es conocido para predecir el estado de nuevos
pacientes, cuyo perfil genotípico es conocido pero no su estado. Es
el modelo más simple, pero asume que las distintas variables
predictoras (SNPs) son independientes entre sí dado el estado
caso/control. A pesar de que esta hipótesis es típicamente falsa, en
la práctica funciona bien.
Con el método Naïve Bayes simplemente se tabulan
el número de veces que un SNP particular ocurre como homocigoto o
heterocigoto en una población (caso o control). Esta tabulación
proporciona directamente una probabilidad condicionada de la forma.
Para clasificar a un nuevo paciente, se utilizó la regla de
Bayes.
La clase con la mayor probabilidad es la que se
elige para el paciente no clasificado.
Para seleccionar los SNPs más relevantes,
teniendo en cuenta que el objetivo es conseguir la máxima exactitud
en la discriminación, se ha utilizado un método de eliminación
recursiva (backward). Se parte del modelo estimado a partir de todos
los SNPs y se calcula su exactitud a través del error de
cross-validación. En el segundo paso se clasifican
los datos utilizando N-1 SNPs, donde N es el número
total de SNPs, N veces, quitando cada vez un SNP. Se comprueba si al
eliminar cada uno de los SNPs aumenta la exactitud y en caso
afirmativo, se descarta dicho SNP. Se repite el proceso hasta que el
hecho de eliminar un SNP conlleve una pérdida de exactitud
significativa.
Para calcular el error de
cross-validación, utilizamos la técnica de
validación cruzada del tipo n-fold
(n-fold cross validation). Esta técnica es un
proceso iterativo, de forma que en cada paso se dividen los datos en
n-1 muestras de entrenamiento (training set) y 1
muestra de contraste (test set). Con las muestras de entrenamiento
se ajusta el mejor modelo posible y con la muestra de contraste se
comprueba la validez de dicho modelo. El proceso continúa hasta que
todos los grupos se han utilizado como muestra de contraste. El
error de cross-validación, será la media de los
errores cometidos con cada una de las muestras de contraste. En este
caso se ha utilizado n=20.
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La técnica de SVM tiene como objetivo obtener un
hiperplano óptimo capaz de separar lo mejor posible dos clases. El
caso más sencillo es en el que un hiperplano (líneas de más de 2
dimensiones) es capaz de separar correctamente todos los puntos,
pero esto no ocurre siempre. Es posible aplicar funciones kernel
cuya misión es transformar el espacio de partida en otro espacio,
donde sea posible resolver el problema. Por ejemplo, supongamos que
tenemos sólo 2 variables (SNPs) y que los datos no pueden ser
correctamente separados en los dos grupos, caso/control, por una
línea recta (kernel lineal). SVM creará un modelo apropiado,
modificando el espacio de partida. Así por ejemplo, un kernel
cuadrático podría convertir puntos 2-dimensionales
en puntos 3-dimensionales: {SNP1, SNP2}->{SNP1 x
SNP1, SNP1 x SNP2, SNP2 x SNP2}, en donde el problema pueda ser
resuelto a través de hiperplanos. El SVM podría llevar a cabo la
partición de los puntos en este nuevo espacio a través de
hiperplanos. Claramente la elección del kernel es muy importante en
este tipo de modelos, los más relevantes son el lineal, el radial y
el polinómico. Un tutorial sobre esta técnica puede encontrarse en
(Burges C.J.C. (1998). A Tutorial on Support Vector Machines for
Pattern Recognition. Data Mining and Knowledge Discovery,
2:121-67).
Como en el caso del modelo Naïve Bayes, para
seleccionar los SNPs más relevantes se ha utilizado un método de
eliminación recursiva (backward) basado en minimizar el error de
cross-validación, calculado a partir de validación
cruzada de tipo n-fold, con n=20.
\vskip1.000000\baselineskip
Los modelos estadísticos basados en árboles de
decisión trabajan de forma recursiva creando particiones de un
conjunto de datos dado para conseguir la mejor clasificación de los
individuos en relación a una variable respuesta, en nuestro caso el
estado caso/control.
Hay varios algoritmos para construir modelos
predictivos basados en árboles de decisión. En el desarrollo de la
invención se utilizó el método conocido como CART (Classification
and Regression Tress) (Breiman L.F., et al (1984).
Classification and regression trees. Chapman & Hall, New York).
In Machine Learning, 45, 5-32 (2001)), un método de
árbol binario, que se construye según el siguiente proceso: en
primer lugar se encuentra la variable predictora que mejor divide
los datos en los 2 grupos (caso/control). Los datos se separan en
estos dos grupos y el proceso se aplica separadamente a cada uno de
ellos. El proceso continúa hasta que se alcance un criterio de
parada relacionado, habitualmente, bien con un mínimo número de
datos en cada subgrupo, bien con un máximo número de variables
predictoras que puedan intervenir en el modelo o bien con ambos
parámetros a la vez. En cada paso se añade un nuevo "nodo" al
árbol, que en este contexto se corresponde con un SNP.
En este tipo de modelos es muy frecuente el
problema de sobreajuste (overfitting) que surge al utilizar
demasiadas variables predictoras en relación a la cantidad de datos
disponibles y se traduce en modelos poco generalizables. Para
asegurar que el árbol de decisión ajustado no está sobreajustado, se
utiliza lo que se conoce como la "poda" (pruning) del árbol que
consiste en eliminar subárboles que podrían ser erróneos. Hay muchas
técnicas de poda, aquí se ha utilizado la regla "1 desviación
estándar" (1 Standard Error rule) que se basa en el error de
cross-validación. Según esta regla el árbol con
mejores propiedades de generalización es el modelo más simple con un
error de cross-validación menor que menor error de
cross-validación + 1 error estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Básicamente, los Random Forest (Breiman, L.
Random Forests. In Machine Learning, 45, 5-32
(2001)) son modelos consistentes en una colección de árboles de
decisión, de forma que cada árbol se construye a partir de una serie
de variables seleccionadas aleatoriamente. Una vez construido el
modelo para clasificar a un nuevo individuo, cada uno de los árboles
emite un "voto", asignándose a la clase que tenga un mayor
número de votos.
Un resultado de este tipo de modelo son varias
medidas de la importancia de cada una de las variables implicadas.
La más importante está basada en el decrecimiento del error de
precisión cuando los valores de una variable en un nodo de un árbol
se permutan aleatoriamente. Esta es la medida que se utiliza en el
procedimiento de selección de los SNPs más predictivos.
Para seleccionar SNPs se utiliza el proceso
iterativo propuesto por Díaz-Uriarte y Álvarez de
Ándres (Díaz-Uriarte R. y Álvarez de Andrés S.
(2006). BMC Bioinformatics 2006, 7:3
doi:10.1186/1471-2105-7-3).
En cada iteración, se construye un nuevo modelo después de descartar
aquellas variables con menor medida de importancia en la iteración
anterior. La diferencia con otros métodos que existen de eliminación
progresiva de variables radica en que no se recalculan las medidas
de importancia en cada paso del algoritmo, mejorando así el posible
problema de sobreajuste. Se elige el modelo más simple (con menor
número de variables) con una tasa de error menor que la mínima tasa
de error + 1 error estándar (1 Estándar Error rule).
\vskip1.000000\baselineskip
Para validar el modelo se utiliza la técnica de
validación cruzada del tipo n-fold
(n-fold cross validation). Es un proceso iterativo,
de forma que en cada paso se dividen los datos en
n-1 muestras de entrenamiento (training set) y 1
muestra de contraste (test set). Con las muestras de entrenamiento
se ajusta el mejor modelo posible y con la muestra de contraste se
comprueba la validez del modelo. El proceso continúa hasta que todos
los grupos se han utilizado como muestra de contraste.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando esta técnica se obtendrá un valor
predicho por el modelo para cada una de las observaciones, lo que
permite utilizar las siguientes herramientas de evaluación:
Sensibilidad. Proporción de casos que son
clasificados como tal por el modelo predictivo, por tanto da una
idea de la utilidad del modelo para identificar a los casos. Es una
característica intrínseca de la prueba no viéndose afectada por la
prevalencia de la enfermedad.
Especificidad. Proporción de controles
que son clasificados como tal por el modelo predictivo, por tanto da
una idea de la utilidad del modelo para identificar a los controles.
Al igual que la sensibilidad es una característica intrínseca de la
prueba no viéndose afectada por la prevalencia de la enfermedad.
Proporción de falsos positivos.
Proporción de pacientes controles clasificados por el modelo como
casos.
Proporción de falsos negativos.
Proporción de pacientes casos clasificados por el modelo como
controles.
Exactitud. Proporción de pacientes
clasificados correctamente por el modelo.
Índice J de Youden o seguridad
diagnóstica. Se calcula como Sensibilidad + Especificidad -1.
Cuanto más se aproxima a 1, mayor es la calidad del resultado
predicho por el modelo.
Odds ratio diagnóstica. Indica cuántas
veces es más frecuente que el modelo clasifique bien a un paciente.
Es la misma interpretación que cualquier otra
odds-ratio, si es >1 la relación que existe entre
lo que predice el modelo y lo realmente observado es positiva, es
decir, es más probable acertar; si es <1 es más probable no
acertar con la clasificación y si es 1 indica que no hay relación
entre lo que predice el modelo y lo realmente observado.
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En función de los valores obtenidos para cada
modelo, se seleccionaron los siguientes modelos que se ajustaron con
los SNPs de la tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
En este tipo de modelos no pueden existir
valores pérdida en las variables predictoras (SNP). Hay dos
opciones: (1) imputar los valores pérdida, completando los genotipos
que faltan en función del resto de genotipos observados en el mismo
paciente, y (2) sólo considerar los pacientes para los que hay los
datos completos. En este último caso se seleccionaron 166 pacientes,
de los cuales 114 (68.7%) eran controles y 52 (31.3%) casos.
Se ajustaron modelos utilizando los kernel
lineal, radial y polinómico de grado 2 y 3 (cuadrático y cúbico). A
continuación se presentan únicamente aquéllos modelos para los que
se obtuvieron resultados satisfactorios.
kernel lineal (Muestra sin tener en
cuenta los casos con valores perdidos)
Se seleccionaron, utilizando el método de
eliminación backward, 42 SNPs (tabla 4) con un error de predicción
estimado del 16.1%. Fig. 1. La presencia de estos 42 SNPs es
indicativa de un mayor riesgo a desarrollar VRP.
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\vskip1.000000\baselineskip
kernel radial (Muestra imputando los
valores perdidos).
\newpage
Se seleccionaron, utilizando el método de
eliminación backward, 10 SNPs (tabla 5) con un error de predicción
estimado del 22,4% (Fig. 2). La presencia de estos 21 SNPs es
indicativa de un menor riesgo de desarrollar VRP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2.- Modelo basado en Random Forest
(Muestra sin tener en cuenta los casos con valores perdidos)
En este tipo de modelos no pueden existir
pérdidas en las variables predictoras (SNP). Hay dos opciones: (1)
imputar los valores pérdidas, completando los genotipos que faltan
en función del resto de genotipos observados en el mismo paciente, y
(2) sólo considerar los pacientes para los que tenemos los datos
completos. En este último caso se seleccionaron 166 pacientes, de
los cuales 114 (68.7%) son controles y 52 (31.3%) casos, resultado
que la presencia los SNPs presentados en la tabla 2 es indicativa de
un mayor riesgo a desarrollar VRP, según se presenta en la tabla de
riesgo siguiente.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las medidas de la capacidad predictiva de cada
uno de los modelos los modelos seleccionados se muestra en la
siguiente tabla (tabla 7). Comentar brevemente los resultados
obtenidos.
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\vskip1.000000\baselineskip
Para los modelos basados en SVM y en Random
Forest se imputan los valores pérdidas. El clasificador de Naïve
Bayes y los árboles de decisión, permiten trabajar con este tipo de
valores. Fig. 10 (Curvas ROC).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (3)
1. Método para la obtención de datos útiles para
la determinación del riesgo de desarrollar Vitreo Retinopatía
Proliferante (VRP) que comprende identificar en una muestra
biológica aislada las variantes polimórficas del gen SMAD 7
asociadas al SNP rs7226855.
2. Método para la obtención de datos útiles para
la determinación del riesgo de desarrollar Vitreo Retinopatía
Proliferante (VRP) que comprende el método de obtención de datos
según la reivindicación 1, donde la variante polimórfica del gen
SMAD 7 identificada es el SNP rs7226855.
3. Método para pronosticar el riesgo de
desarrollar Vitreo Retinopatía Proliferante (VRP) que comprende
llevar a cabo el método para la obtención de datos según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, donde la presencia de
variantes polimórficas del gen SMAD 7 asociadas al SNP rs7226855, o
la presencia del SNP rs7226855 se identifica como un factor de
riesgo a desarrollar VRP.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200702532A ES2337115B2 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Metodo para la deteccion del riesgo de desarrollar vitreorretinopatiaproliferante (vrp). |
| PCT/ES2008/070175 WO2009040461A2 (es) | 2007-09-26 | 2008-09-23 | Método para la detección del riesgo de desarrollar vitreorretinopatía proliferante (vrp). |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702532A ES2337115B2 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Metodo para la deteccion del riesgo de desarrollar vitreorretinopatiaproliferante (vrp). |
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ID=40511942
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| WO (1) | WO2009040461A2 (es) |
Citations (2)
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| ES2251977T3 (es) * | 1999-04-15 | 2006-05-16 | Hormos Medical Corporation | Diagnostico de riesgo de una persona de desarrollar retinopatia diabetica. |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2006123943A1 (en) * | 2005-05-20 | 2006-11-23 | Synergenz Bioscience Limited | Methods of analysis of polymorphisms and uses thereof |
-
2007
- 2007-09-26 ES ES200702532A patent/ES2337115B2/es active Active
-
2008
- 2008-09-23 WO PCT/ES2008/070175 patent/WO2009040461A2/es not_active Ceased
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009040461A3 (es) | 2009-06-11 |
| ES2337115A1 (es) | 2010-04-20 |
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