ES2337146T3 - Complejos inhibidores hdm2 y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO: 1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3221 y un grupo espacio tetragonal de P43212.

Description

Complejos inhibidores HDM2 y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención tiene que ver generalmente con los campos de la biología molecular, la cristalización de proteínas, el análisis de difracción con rayos X, la determinación de la estructura tridimensional, el modelado molecular y el diseño racional de fármacos basado en la estructura. La presente invención proporciona péptidos HDM2 cristalizados así como descripciones de los patrones de péptidos así como las descripciones de los patrones de difracción de rayos X. Los patrones de difracción de rayos X de los cristales en cuestión tienen suficiente resolución de manera que se puede determinar la estructura tridimensional de HDM2 con resolución atómica, se pueden identificar los sitios de unión al ligando de HDM2, y se pueden modelar las interacciones de los ligandos con los restos aminoácido de HDM2.

Los mapas de alta resolución proporcionados por la presente invención y los modelos preparados utilizando tales mapas también permiten el diseño de ligandos que pueden funcionar como agentes activos. De este modo, la presente invención tiene aplicaciones en el diseño de agentes activos, que incluyen, pero no están limitados a, aquellos que encuentran uso como inhibidores de oncoproteínas MDM2 y HDM2.

Antecedentes de la invención HDM2: Estructura y Función

La HDM2 (proteína de dobles diminutos humana 2) es el producto de la expresión en exceso de hdm2, un oncogén que es expresado en exceso en un subgrupo de tumores humanos incluyendo sarcomas de tejidos blandos, glioblastomas y carcinomas mamarios (Oliner, J.D. et al., Nature, 358(6381):80-83 (1992); Reifenberger, G. et al., Cancer Res., 53:2736-2739 (1993); Bueso-Ramos, C.E. et al., Breast Canc. Res. Treat., 37(2):179-188 (1996)).

La caracterización funcional de este oncogén reveló una interacción entre HDM2 y p53, un supresor tumoral central para detener el crecimiento celular y la apoptosis (Momand, G.P. et al., Cell, 69:1237 (1992)). HDM2 es una diana transcripcional de p53, y como tal, HDM2 y p53 forman un bucle regulado precisamente (Wu, X. et al., Genes and Dev., 7:1126-1132 (1992)). HDM2 es regulado adicionalmente por la ubiquitinación y por la formación de un complejo con Arf, que secuestra HDM2 en el nucleolo (Tao, W. and Levine, A.J., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96 (12): 6937-6941 (1999); Weber, J.D. et al., Nat. Cell Biol., 1(1):20-26 (1999)).

Existen numerosas lineas de evidencia que sugieren que HDM2 también puede funcionar independientemente de p53. Se han encontrado variantes de empalme de HDM2 que no contienen el dominio de unión a p53 en tumores humanos y se ha demostrado que poseen capacidad transformante (Sigalas, I. et al. Nat. Med. 2(8):912-917 (1996)). Los estudios in vivo también han demostrado que el espectro de tumores que se desarrollan en ratones transgénicos que expresan HDM2 en exceso es diferente del espectro encontrado en ratones nulos para p53 y que HDM2 puede inducir sarcomagénesis en animales nulos para p53 (Jones, S.N. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95 (26) :15608-15612 (1998)). Por último, otros compañeros de unión de HDM2 podrían ayudar a la función de HDM2 a lo largo de la ruta oncogénica, por ejemplo, inhibición por HDM2 de la detención de G1 independiente de p53 inducida por MTBP (Boyd, M.T. et al., J. Biol. Chem. 275 (41):31883-318 90 (2000)).

Los informes sobre el aumento de la muerte de células tumorales tras la inhibición de hdm2 por nucleótidos antisentido (Chen, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (1): 195-200 (1998); Chen, L. et al., Mol. Med., 5(1):21-34 (1999); Tortora, G. et al., Int. J. Cancer, 88 (5): 804-809 (2000)) y las mini-proteínas de unión a HDM2 (Bottger, A. et al., Curr. Biol., 7(11):860-869 (1997)) corroboran la predicción de que la inhibición de HDM2 activará p53 y a su vez desencadenará la apoptosis. Siguiendo con esta idea, cabría esperar que un inhibidor de molécula pequeña generado contra el surco de unión a p53 de HDM2 evitara la interacción de las dos proteínas e indujera la actividad de p53. Se ha sugerido adicionalmente que la inhibición de la interacción entre p53 y HDM2 actuará de forma aditiva o sinérgica con los agentes quimioterapéuticos convencionales en el tratamiento de neoplasmas, y esto también es apoyado por el trabajo en el que se utilizan constructos hdm2 antisentido (Wang, H. et al., Clin. Canc. Res. 7(11):3613-3624 (2001)).

MDM2: Estructura y Función

El mdm2, el homólogo murino de HDM2 se encontró originalmente en cromosomas diminutos dobles de ratón y se identificó inicialmente como uno de los tres genes amplificados en una línea celular tumorigénica (Cahilly-Snyder., L. et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:235-244' (1987)). Se encontró con posterioridad que su producto proteico forma un complejo con p53, que se observó primero en una línea celular de fibroblastos de rata (Clon 6) previamente transfectada con un gen p53 de ratón sensible a la temperatura (Michalovitz, D. et al., Cell 62:671-680 (1990)). La linea de células de rata creció bien a 37ºC pero mostró una detención en G1 cuando se desplazaba a 32ºC, lo que concordaba completamente con un desplazamiento dependiente de la temperatura observado en la conformación y la actividad de p53. No obstante, el complejo p53-MDM2 solamente se observaba en abundancia a 32ºC, temperatura a la cual p53 se encontraba predominantemente en forma funcional o de "tipo salvaje" (Barak, Y. et al., EMBO J. 11:2115-2121 (1992) y Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245 (1992)). Desplazando la línea celular de rata a 32ºC y bloqueando la síntesis de proteína de novo se demostró que solamente la p53 de "tipo salvaje" inducía la expresión del gen mdm2, explicando de ese modo la abundancia diferencial del complejo en términos de la actividad transcripcional de p53 (Barak, Y. et al., EMBO J. 12:461-468 (1993)). La explicación se desarrolló adicionalmente mediante la identificación de un sitio de unión al ADN para p53 de tipo salvaje en el primer intrón del gen mdm2 (Wu, X. et al., Genes Dev. 7:1126-1132 (1993)). Los constructos informadores que empleaban este sitio de unión al ADN de p53 revelaron que eran inactivados cuando p53 de tipo salvaje era expresada simultáneamente con MDM2.

Esta inhibición de la actividad transcripcional de p53 puede estar causada por el bloqueo por MDM2 del dominio de activación de p53 y/o el sitio de unión al ADN. Por consiguiente, se propuso que la expresión de mdm2 está autorregulada, por medio del efecto inhibidor de la proteína MDM2 sobre la actividad transcripcional de p53 de tipo salvaje. Este bucle de retroalimentación autorreguladora de p53-mdm2 proporcionó una nueva percepción en cuanto a cómo podría estar regulado el crecimiento celular por p53. Se considera que hasta un tercio de los sarcomas humanos superan el control del crecimiento regulado por p53 mediante la amplificación del gen mdm2 (Oliner, J.D. et al., Nature 358:80-83 (1992)). Por lo tanto, la interacción entre p53 y MDM2 representa una diana terapéutica potencial clave.

p53: Interacción con HDM2 y MDM2

p53 es un factor de transcripción para numerosas proteínas que ocasionan la detención del ciclo celular o la muerte celular mediante apoptosis, tales como p21, 14-3-3\sigma, y bax. El nivel y la actividad transcripcionales de p53 se incrementan por los daños en el ADN celular. La proteína MDM2 inhibe la función de p53 uniéndose a una hélice N-terminal anfipática de p53, abrogando la interacción de p53 con otras proteínas y su actividad de transactivación. La interacción con MDM2 también dirige p53 a la degradación de proteína dependiente de ubiquitina. MDM2 también muestra efectos independientes de p53 sobre el ciclo celular, posiblemente mediante la interacción directa con algunos de los efectores aguas abajo tales como pRB y EF2 (Revisado por Zhang, R. and Wang, H., Cur. Pharm. Des. 6:393-416 (2000)).

Las mutaciones de la proteína p53 se producen en el 50% de todos los cánceres humanos (revisado por Agarwal, M.L. et al. J. Biol. Chem. 273:1-4 (1998); Levine, A.J., Cell 88:323-331(1997); y, referencias citadas en Oren; M., J. Biol. Chem. 274:36031-36034 (1999)). En circunstancias normales, p53 es una proteína latente y muy lábil, que funciona con una vida media muy corta de unos pocos minutos (Rogel, A. et al., Mol. Cell. Biol. 5:2851-2855 (1985)). La lesión o el estrés del ADN inducen un notable incremento de la estabilidad de p53 (Kastan, M.B. et al., Cancer Res. 51:6304-6311 (1991)). Además, estas señales también activan la función de p53 como activador transcripcional de la maquinaria apoptótica, una función normalmente suprimida por la inhibición autorreguladora de su dominio de transactivación. La cantidad de p53 presente en la célula está estrechamente regulada por un bucle de retroalimentación negativa entre p53 y el oncogén hdm2.

p53 se localiza en el núcleo celular e induce la expresión de hdm2 a través de su dominio de transactivación. El hdm2 expresado con posterioridad se une a los restos 19-26 del dominio de transactivación de p53, lo inactiva (Chen, J. et al., Mol. Cell. Biol. 16:2445-2452 (1996); Haupt, Y. et al., EMBO J. 15:1596-1606 (1996); Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245 (1992)) y bloquea el reclutamiento de los factores de transcripción necesarios para la expresión génica (Lu, H. et al., PNAS 92:5154-5158 (1995); Thut, C.J. et al., Science 267:00-104 (1995)). Además, el complejo p53-hdm2 es lanzado al citoplasma donde se produce la degradación. Este estrecho control a través de la retroalimentación negativa es crítico para la supervivencia del organismo. La inactivación de hdm2 en ratones con el gen hdm2 desactivado conduce a una letalidad embrionaria temprana, pero es completamente evitada por la inactivación simultánea de p53 (Jones, S.N. et al., Nature 378:206-208 (1995); Montes de Oca Luna, R. et al., Nature 378:203-206 (1995)). Por otra parte, la expresión excesiva de hdm2 puede conducir a la inhibición de p53 y promover el cáncer. El exceso de HDM2 también promueve el cáncer independientemente de p53 (Lundgren, K. et al., Genes and Dev. 11:714-725 (1997); Sun, P. et al., Science 282:2270-2272 (1998)).

Como se ha comentado antes, la inhibición de la interacción entre HDM2 y p53 es una diana atractiva para la terapia del cáncer (Lane, D.P., TIBS 22: 372-374 (1997)). Se ha demostrado que la inhibición de la formación del complejo entre p53 y HDM2 eleva los niveles de p53 en la célula (Bottger, A. et al., Current Biol. 7:860-869 (1997)). Asimismo, el bloqueo de la unión de HDM2 a p53 sería terapéuticamente útil en la restauración del control del ciclo celular para las células que expresan en exceso HDM2 como tratamiento de primera línea contra el cáncer. Más generalmente, la inhibición de HDM2 puede incrementar la eficacia de quimioterapia y radiación en cánceres normales para p53 aumentando la apoptosis y las rutas de señalización que detienen el crecimiento. Este enfoque puede volver las células tumorales que contienen p53 funcional más susceptibles a los agentes quimioterapéuticos.

Un método para identificar los inhibidores del complejo de proteínas p53/HDM2 consiste en determinar las especificidades de aminoácidos de los bolsillos de unión de HDM2 mediante cristalografía con el fin de establecer un modelo para la interacción. Utilizando este método, Kussie et al. identificaron los antagonistas peptídicos basados en p53 (Kussie, P.H. et al., Science 274:948-953 (1996)). Una estructura cristalina de una forma truncada de HDM2 (restos 17-125) y un péptido de 15 unidades derivado de un dominio de transactivación N-terminal de p53 fueron publicados por Kussie et al. (Kussie et al., (1996)). Kussie et al. también publicaron una estructura cristalina de MDM2 (Kussie et al., (1996)) derivada de Xenopus laevis (restos 13 a 118), que tenía una identidad de secuencia de 71% con HDM2. Basándose en el modelado molecular, Garcia-Echeverria et al. publicaron un modelo de un peptidomimético de 8 unidades, derivado del péptido p53 de tipo salvaje de 15 unidades, unido al dominio N-terminal de hdm2 (Garcia-Echeverria, C. et al., J. Med. Chem. 43:3205-3208 (2000)). Se cree que no se ha descrito la estructura cristalina de HDM2 con compuestos inhibidores, tales como inhibidores de molécula pequeña, por ejemplo, u otros péptidos.

Por lo tanto, continúa existiendo la necesidad de desarrollar sistemas de modelado para diseñar y seleccionar moléculas pequeñas, potentes que inhiban las interacciones entre HDM2 (y sus homólogos) y los ligandos de unión naturales tales como p53.

Compendio de la invención

La presente invención incluye un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 de SEQ ID NO: 1, con un ligando, donde el ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53 y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal P3_{2}21 y un grupo espacio tetragonal P4_{3}2_{1}2.

La invención comprende adicionalmente un método para la producción de un complejo cristalino que comprende un polipéptido HDM2-ligando que comprende: (a) poner en contacto el polipéptido HDM2 con dicho ligando en una solución adecuada que comprende PEG y NaSCN; y, b) cristalizar dicho complejo resultante de polipéptido de HDM2-ligando a partir de dicha solución, donde el polipéptido HDM2 consiste en los restos aminoácido 17-111 del SEQ ID NO: 1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Representación de cintas de HDM2 unido a al compuesto 338437.

Figura 2 Ajuste del compuesto 338437 en el sitio activo de HDM2 representado como una superficie molecular.

Figura 3 Representación de cintas de una superposición entre hdm2 en la forma cristalina trigonal y en la forma tetragonal. La desviación RMS entre las posiciones del átomo de C alfa es de 0,25 Angstroms.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Como ocurre generalmente en biotecnología y química, la descripción de la presente invención ha requerido el uso de numerosos términos de la técnica. Aunque no resulta práctico hacerlo exhaustivamente, se proporcionan aquí las definiciones para algunos de estos términos para facilitar su referencia. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente conocido por los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las definiciones de otros términos también aparecen en otra parte en la presente memoria. No obstante, se debe considerar que las definiciones proporcionadas aquí y en otra parte en la presente memoria determinan el alcance y el significado pretendido de los términos definidos. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales cualesquiera similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "coordenadas atómicas" o "coordenada de estructura" hace referencia a las coordenadas matemáticas que describen las posiciones de los átomos en los cristales de HDM2 en el formato del Banco de Datos de Proteínas (PDB), incluyendo X, Y, Z y B, para cada átomo. Los datos de difracción obtenidos de los cristales se utilizan para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad repetitiva del cristal. Los mapas de densidad de electrones se pueden utilizar para establecer las posiciones (esto es las coordenadas X, Y y Z) de los átomos individuales del cristal. Los expertos en la técnica entienden que un grupo de coordenadas de estructura determinadas por cristalografía de rayos X no carece de desviación típica. Para los fines de esta invención, cualquier grupo de coordenadas de estructura para HDM2 de cualquier fuente que tenga una desviación cuadrática media de los átomos distintos de hidrógeno de menos de aproximadamente 1,5 \ring{A} cuando se superponen a las posiciones de los átomos distintos de hidrógeno de las correspondientes coordenadas atómicas de la Tabla 1 o la Tabla 2 se considera esencialmente idéntico u homólogo. En una realización más preferida, cualquier grupo de coordenadas de estructura para HDM2 de cualquier fuente que tenga una desviación cuadrática media de los átomos distintos de hidrógeno de menos de aproximadamente 0,75 \ring{A} cuando se superponen a las posiciones de los átomos distintos de hidrógeno de las correspondientes coordenadas atómicas de la Tabla 1 o la Tabla 2 se considera esencialmente idéntico u homólogo.

El término "tipo de átomo" hace referencia al elemento químico cuyas coordenadas se miden. La primera letra de la columna de la Tabla 1 identifica el elemento.

Los términos "X", "Y" y "Z" hacen referencia a la posición atómica definida cristalográficamente del elemento medido con respecto al origen cristalográfico seleccionado. El término "B" hace referencia a un factor térmico que mide la variación media de la posición de un átomo con respecto a su posición media.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "cristal" hace referencia a cualquier disposición ordenada tridimensional de las moléculas de difracta los rayos X.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "portador" en una composición hace referencia a un diluyente, coadyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se mezcla el producto.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "composición" hace referencia a la combinación de distintos elementos o ingredientes para formar un todo. Una composición comprende más de un elemento o ingrediente. Para los fines de esta invención, una composición a menudo, pero no siempre, comprende un portador.

Según se utiliza en la presente memoria, "mdm2" se emplea para representar un gen doble diminuto murino 2, y los genes homólogos encontrados en otros animales.

Según se utiliza en la presente memoria, "MDM2" se emplea para representar una proteína obtenida como resultado de la expresión del oncogén mdm2. En el significado de este término, se entenderá que MDM2 abarca todas las proteínas codificadas por mdm2, sus mutantes, sustituciones conservativas de aminoácidos, sus proteínas de empalme alternativas, y sus proteínas fosforiladas. Adicionalmente, según se utiliza en la presente memoria, se entenderá que el término "MDM2" incluye los homólogos de MDM2 de otros animales.

Según se utiliza en la presente memoria, "hdm2" se emplea para representar el gen humano, que es homólogo al gen mdm2 de ratón.

Según se utiliza en la presente memoria, "HDM2" se emplea para representar una proteína obtenida como resultado de la expresión del oncogén hdm2. En el significado de este término, se entenderá que HDM2 abarca todas las proteínas codificadas por hdm2, sus mutantes, las sustituciones conservativas de aminoácidos, sus proteínas de empalme alternativas, y sus proteínas fosforiladas. Como ejemplo, HDM2 incluye la proteína que comprende el SEQ ID NO: 2 y sus variantes que comprenden una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con el SEQ ID NO: 2, o preferiblemente una identidad de secuencia de 80%, 85%, 90% y 95% con el SEQ ID NO: 2, o más preferiblemente, una identidad de secuencia de al menos 95% o más con el SEQ ID NO: 2.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "REA", una abreviatura de Relaciones Estructura-Actividad, hace referencia en conjunto a las relaciones estructura-actividad/propiedades de la estructura pertenecientes a las relaciones entre la actividad/propiedades de un compuesto y su estructura química.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "estructura molecular" hace referencia a la disposición tridimensional de las moléculas de un compuesto concreto o un complejo de moléculas (p. ej., la estructura tridimensional de HDM2 y los ligandos que interaccionan con HDM2).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "modelado molecular" hace referencia al uso de métodos computacionales, preferiblemente métodos asistidos por ordenador, para dibujar modelos reales de la apariencia de las moléculas y para realizar predicciones sobre las relaciones es estructura-actividad de los ligandos. Los métodos utilizados en el modelado molecular abarcan desde los gráficos moleculares a la química computacional.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "modelo molecular" hace referencia a la disposición tridimensional de los átomos de una molécula conectados por enlaces covalentes o a la disposición tridimensional de los átomos de un complejo que comprende más de una molécula, p. ej., un complejo proteína-ligando.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "gráfico molecular" hace referencia representaciones 3D de las moléculas, por ejemplo, una representación 3D producida utilizando métodos computacionales asistidos por ordenador.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "química computacional" hace referencia a cálculos de las propiedades físicas y químicas de las moléculas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sustitución molecular" hace referencia a un método que implica generar un modelo preliminar de un cristal de HDM2 cuyas coordenadas son desconocidas, orientando y posicionando dichas coordenadas atómicas descritas en la presente invención de manera que explique óptimamente el patrón de difracción observado del cristal desconocido. Después se pueden calcular las fases a partir de este modelo y combinarlas con las amplitudes observadas para dar una síntesis de Fourier aproximada de la estructura cuyas coordenadas son desconocidas. (Rossmann, M.G., ed., "The Molecular Replacement Method", Gordon & Breach, New York, 1972).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "homólogo" hace referencia a la molécula de proteína HDM2 o a la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína, o un dominio funcional de dicha proteína de una primera fuente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 30%, 40% o 50% o una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 60%, 70% o 75%, o una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80%, o más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85%, o incluso más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90%, y muy preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de al menos aproximadamente 95%, 97% o 99%, con la proteína, la molécula de ácido nucleico o cualquiera de sus dominios funcionales, de una segunda fuente. La segunda fuente puede ser una versión de la molécula de la primera fuente que ha sido alterada genéticamente mediante cualquier método disponible para cambiar la secuencia de aminoácidos primaria o la secuencia de nucleótidos o puede ser de la misma especie o de una especie diferente a la de la primera fuente.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sitio activo" hace referencia a regiones de HDM2 o un motivo estructural de HDM2 que están implicadas directamente en la función o actividad de HDM2.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "sitio de unión" o "bolsillo de unión" hacen referencia a una región de HDM2 o un complejo molecular que comprende HDM2 que, como resultado de la secuencia de aminoácidos primaria de HDM2 y/o de su forma tridimensional, se asocia favorablemente con otra entidad química o compuesto incluyendo ligandos o inhibidores.

Para los fines de esta invención, cualquier sitio activo, sitio de unión o bolsillo de unión definido por un grupo de coordenadas de estructura para HDM2 o para un homólogo de HDM2 de cualquier fuente que tenga una desviación cuadrática media de átomos distintos de hidrógeno de menos de aproximadamente 1,5 \ring{A} cuando se superponen sobre las posiciones de los átomos distintos de hidrógeno de las correspondientes coordenadas atómicas de la Tabla 1 o la Tabla 2 se considera esencialmente idéntico u homólogo. En una realización más preferida, cualquier grupo de coordenadas de estructura para HDM2 o un homólogo de HDM2 de cualquier fuente que tenga una desviación cuadrática media de átomos distintos de hidrógeno de menos de aproximadamente 0,75 \ring{A} cuando se superponen sobre las posiciones de los átomos distintos de hidrógeno de las correspondientes coordenadas atómicas de la Tabla 1 o Tabla 2 se considera esencialmente idéntico u homólogo.

El término "desviación cuadrática media" representa la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de la desviación de la media.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácidos" hace referencia a los isómeros L de los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, ácido \gamma-carboxiglutámico, arginina, ornitina, y lisina. A menos que se indique específicamente, todos los aminoácidos referidos en esta solicitud están en forma L.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácidos no naturales" hace referencia a aminoácidos que no se encuentran naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, selenometionina.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido cargado positivamente" incluye cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas normales. Los ejemplos de los aminoácidos naturales cargados positivamente son arginina, lisina, e histidina.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido cargado negativamente" incluye cualquier aminoácido que tenga cadenas laterales cargadas negativamente en condiciones fisiológicas normales. Los ejemplos de los aminoácidos naturales cargados negativamente son el ácido aspártico y el ácido glutámico.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido hidrófobo" incluye cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral no polar, no cargada que sea relativamente insoluble en agua. Los ejemplos de los aminoácidos hidrófobos de origen natural son alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido hidrófilo" hace referencia a cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral polar, no cargada que sea relativamente soluble en agua. Los ejemplos de los aminoácidos hidrófilos naturales son serina, treonina, tirosina, asparagina, glutamina y cisteina.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "enlace de hidrógeno" hace referencia a dos átomos hidrófilos (O o N), que comparten un hidrógeno que se une covalentemente solamente a un átomo, a la vez que interacciona con el otro.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "interacción hidrófoba" hace referencia a interacciones realizadas por dos restos o átomos hidrófobos (tal como C).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sistema conjugado" hace referencia a más de dos dobles enlaces adyacentes entre sí, en los cuales los electrones están completamente deslocalizados en el sistema completo. Esto también incluye los restos aromáticos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "resto aromático" hace referencia a aminoácidos con cadenas laterales que tienen un sistema conjugado deslocalizado. Los ejemplos de los restos aromáticos son fenilalanina, triptófano, y tirosina.

Según se utiliza en la presente memoria, la frase "que inhibe la unión" hace referencia a la prevención o reducción de la asociación directa o indirecta de una o más moléculas, péptidos, proteínas, enzimas, o receptores, o la prevención o reducción de la actividad normal de una o más moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores, p. ej., la prevención o reducción de la asociación directa o indirecta de HDM2 y p53.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "inhibidor competitivo" hace referencia a inhibidores que se unen a HDM2 en los mismos sitios que sus compañeros de unión (p. ej., p53), compitiendo de ese modo directamente con ellos. La inhibición competitiva puede, en algunos casos, ser completamente revertida aumentando la concentración de sustrato.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "inhibidor acompetitivo" hace referencia a uno que inhibe la actividad funcional de HDM2 uniéndose a un sitio diferente al de sus sustratos p. ej. (p53).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "inhibidor no competitivo" hace referencia a uno que se puede unir a la forma libre o a la forma unida a p53 de HDM2.

Los expertos en la técnica pueden identificar inhibidores como competitivos, acompetitivos, o no competitivos ajustando con ordenador los datos cinéticos de la enzima utilizando métodos convencionales, Véase, por ejemplo, Segel, I.H., Enzyme Kinetics, J. Willey & Sons, (1975).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "isómero R o S" hace referencia a dos posibles estereoisómeros de un carbono quiral de acuerdo con el sistema de Cahn-Ingold-Prelog adoptado por la Unión de Química Pura yy Aplicada (IUPAC). Cada grupo anclado al carbono quiral es asignado primero a una preferencia o prioridad a, b, c, o d basándose en el número atómico del átomo que está anclado directamente al carbono quiral. Al grupo con el número atómico más alto se le da la preferencia más alta a, al grupo con el siguiente número atómico más alto se le da el siguiente preferencia más elevada b; y así sucesivamente. El grupo con la preferencia más baja (d) es dirigido después fuera del visor. Si el rastro de la ruta de a a b a c es contrario al sentido de las agujas del reloj, el isómero se denomina (S); en la dirección opuesta, en el sentido de las agujas del reloj, el isómero se denomina (R).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "ligando" hace referencia a cualquier molécula, o entidad química que se une con o a HDM2, una subunidad de HDM2, un dominio de HDM2, un motivo estructural diana de HDM2 o un fragmento de HDM2. De este modo, los ligandos incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de molécula pequeña, por ejemplo.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "inhibidor de molécula pequeña" hace referencia a compuestos útiles en la presente invención que tienen actividad inhibidora de MDM2 o HDM2 medible. Además de las moléculas orgánicas pequeñas, se contempla que son útiles en los métodos descritos los péptidos, los anticuerpos, los péptidos cíclicos y los peptidomiméticos. Se excluyen de la invención los péptidos p53 descritos por Kussie et al., Garcia-Echeverria et al., y los péptidos derivados de la presentación en fagos que inhiben la unión de mdm2 a p53 (Bottger, V.A.,et al., Oncogene 13(10): 2141-2147 (1996)). Los inhibidores preferidos son moléculas pequeñas, preferiblemente de menos de 700 Daltons, y más preferiblemente de menos de 450 Daltons. Los ejemplos de las clases de compuestos que tienen esta propiedad incluyen los compuestos descritos en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/275.629; en la en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/331.235; en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/379.617; y, en la Solicitud de los Estados Unidos Núm. 10/097.249, incorporadas aquí en su totalidad.

Según se utilizan en la presente memoria los términos "unir", "unión", "enlace" o "enlazado" cuando se utilizan en referencia a la asociación de átomos, moléculas, o grupos químicos, hacen referencia a cualquier contacto físico o asociación de dos o más átomos, moléculas, o grupos químicos.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "enlace covalente" o "enlace de valencia" hacen referencia a un enlace químico entre dos átomos de una molécula creado por la compartición de electrones, normalmente por pares, por los átomos enlazados.

Según se utiliza en la presente memoria, "enlace no covalente" hace referencia a una interacción entre átomos y/o moléculas que no implica la formación de un enlace covalente entre ellos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "proteína nativa" hace referencia a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la de una proteína aislada de su fuente u organismo natural.

Realizaciones específicas Realizaciones detalladas

La presente invención describe un cristal como se define en las reivindicaciones. En una realización preferida, el cristal comprende una celda unitaria seleccionada del grupo que consiste en: una celda que tiene unas dimensiones de aproximadamente 98,6 \ring{A}, 98,6 \ring{A} y 74,7 \ring{A}, y aproximadamente alfa=90º, beta=90º y gamma=120º; y, una celda que tiene una dimensiones de aproximadamente 54,3 \ring{A}, 54,3 \ring{A}, 83,3 \ring{A} y aproximadamente alfa=90º, beta= 90º y gamma=90º.

En otro aspecto de la invención, la invención incluye un método para la producción de un complejo cristalino que comprende un polipéptido HDM2-ligando que comprende: (a) poner en contacto el polipéptido HDM2 con dicho ligando en una solución adecuada que comprende PEG y NaSCN; y, b) cristalizar dicho complejo resultante de polipéptido HDM2-ligando de dicha solución, donde, el polipéptido HDM2 consiste en los restos aminoácido 17-111 del SED ID NO: 1. En otra realización, PEG tiene un intervalo de peso molecular medio de 100 a 1000, donde dicho PEG está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v y dicho NaSCN está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM. En una realización preferida, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 400 y está presente en solución a aproximadamente 2% p/v y dicho NaSCN está presente en solución a aproximadamente 100 mM. En una realización muy preferida, la solución comprende adicionalmente (NH_{4})_{2}SO_{4} aproximadamente 1,8-2,4 M y tampón para HDM2 aproximadamente 100 mM. En una realización, el remplazo de uno o más restos aminoácido comprende adicionalmente remplazar los aminoácidos del SEQ ID NO: 2 seleccionados del grupo que consiste en Val^{53}, Leu^{54}, Phe^{55}, Leu^{57}, Gly^{58}, Gln^{59}, Ile^{61}, Met^{62}, Tyr^{67}, Gln^{72}, His^{73}, Ile^{14}, Val^{75}, Phe^{86}, Phe^{91}, Val^{93}, Lys^{94}, Glu^{95}, His^{96}, Ile^{99}, Tyr^{100}, e Ile^{103}. En otra realización, el inhibidor potencial se selecciona de una base de datos. En una realización preferida, el inhibidor potencial se diseña de novo. En otra realización preferida, el inhibidor potencial se diseña a partir de un inhibidor conocido. En una realización muy preferida, la etapa de empleo de dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial comprende las etapas de: a) identificar entidades químicas o fragmentos capaces de asociarse con HDM2 modificado; y b) ensamblar las entidades químicas o fragmentos identificados en una única molécula para proporcionar la estructura de dicho inhibidor potencial. En una realización, el inhibidor potencial es un inhibidor competitivo de SEQ ID NO: 4 (Gly^{16}-SEQ ID NO: 2). En una realización diferente, el inhibidor potencial es un inhibidor no competitivo o acompetitivo de SEQ ID NO: 4 (Gly^{16}-SEQ ID NO: 2). En otra realización más, el inhibidor es identificado mediante el método.

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A. Modelado de la Estructura Tri-Dimensional de HDM2

Los datos de las coordenadas atómicas proporcionados en la Tabla 1, Tabla 2 o los datos de las coordenadas derivados de proteínas homólogas se pueden utilizar para construir un modelo tridimensional de HDM2. Se puede utilizar cualquiera de los métodos computacionales disponibles para construir el modelo tridimensional. Como punto de partida, se puede utilizar el patrón de difracción de rayos X obtenido del ensamblaje de las moléculas o átomos en una versión cristalina de HDM2 o un homólogo de HDM2 para construir un mapa de la densidad de electrones utilizando herramientas bien conocidas por los expertos en la técnica de los mecanismos de la cristalografía y la difracción de rayos X. Después se puede utilizar la información de las fases adicionales extraída de los datos de difracción y disponible en la literatura publicada y/o de experimentos complementarios para completar la reconstrucción.

Para los conceptos y procedimientos básicos de recogida, análisis, y utilización de los datos de difracción de rayos X para la construcción de las densidades de electrones, véanse, por ejemplo, Campbell et al., 1984, Biological Spectroscopy, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA; Cantor et al., 1980, Biophysical Chemistry, Parte II: Techniques for the study of biological structure and function, W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA; A.T. Brunger, 1993, X-Flor Version 3.1: A system for X-ray crystallography and NMR, Yale Univ. Pr., New Haven, CT; M.M. Woolfson, 1997, An Introduction to X-ray Crystallography, Cambridge Univ. Pr., Cambridge, UK; J. Drenth, 1999, Principles of Protein X-ray Crystallography (Springer Advanced Texts in Chemistry), Springer Verlag; Berlin; Tsirelson et al., 1996, Electron Density and Bonding in Crystals: Principles, Theory and X-ray Diffraction Experiments in Solid State Physics and Chemistry, Inst. of Physics Pub.; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.942.428; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.037.117; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.200.910 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.365.456 ("Method for Modeling the Electron Density of a Crystal"), cada una de los cuales se incorpora específicamente en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Para la información básica sobre el modelado molecular, véanse, por ejemplo, M. Schlecht, Molecular Modeling on the PC, 1998, John Wiley & Sons; Gans et al., Fundamental Principals of Molecular Modeling, 1996, Plenum Pub. Corp.; N.C. Cohen (editor), Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, 1996, Academic Press; and W.B. Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling, 1996. Las Patentes de los Estados Unidos que proporcionan información detallada sobre el modelado molecular incluyen las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.093.573; 6.080.576; 6.075.014; 6.075.123; 6.071.700; 5.994.503; 5.612.894; 5.583.973; 5.030.103; 4.906.122; y 4.812.12, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

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B. Métodos para Utilizar las Coordenadas Atómicas para Identificar y Diseñar Ligandos de Interés

Las coordenadas atómicas, tales como las descritas en la Tabla 1, la Tabla 2, la Tabla 3 o las coordenadas esencialmente idénticas u homólogas a las de la Tabla 1, Tabla 2, o la Tabla 3 se pueden utilizar con cualquiera de los métodos disponibles para preparar modelos tridimensionales de HDM2 así como para identificar y diseñar ligandos, inhibidores o moléculas antagónicas o agonísticas de HDM2.

Por ejemplo, se puede realizar el modelado tridimensional utilizando las coordenadas determinadas experimentalmente derivadas de los patrones de difracción de rayos X, tales como los de la Tabla 1 o la Tabla 2, por ejemplo, donde dicho modelado incluye, pero no está limitado a, trazado de ilustraciones de las estructuras reales, construcción de modelos físicos de las estructuras reales, y determinación de las estructuras de las subunidades relacionadas y los complejos HDM2/ligando y subunidad de HDM2/ligando utilizando las coordenadas. En semejante modelado molecular se pueden utilizar algoritmos de modelado molecular de difracción de rayos X o soporte lógico de modelado molecular para generar las coordenadas atómicas correspondientes a la estructura tridimensional de HDM2.

Como se ha descrito antes, el modelado molecular implica el uso de métodos computacionales, preferiblemente métodos asistidos por ordenador, para construir modelos reales de moléculas: que están identificablemente relacionados en secuencia con la estructura cristalina conocida. También implica el modelado de nuevos inhibidores de molécula pequeña enlazados a HDM2 empezando con las estructuras de HDM2 y/o HDM2 formando complejo con ligandos o inhibidores conocidos. Los métodos utilizados en el modelado de ligandos varían de los gráficos moleculares (esto es, representaciones 3D) a la química computacional (esto es, cálculos de las propiedades físicas y químicas) para realizar predicciones acerca de la unión de los ligandos o las actividades de los ligandos; para diseñar nuevos ligandos; y para predecir moléculas novedosas, incluyendo ligandos tales como fármacos, para la síntesis química, referidos en conjunto como diseño racional de fármacos.

Un enfoque para el diseño racional de fármacos consiste en investigar estructuras moleculares conocidas que se podrían unir a un sitio activo. Utilizando el modelado molecular, los programas de diseño racional de fármacos se pueden enfocar a una gama de estructuras moleculares diferentes de fármacos que se pueden ajustar al sitio activo de una enzima, y moviéndolas en un entorno tridimensional se puede decidir qué estructuras se ajustan al sitio realmente bien. Véanse, por ejemplo, las Solicitudes de los Estados Unidos Núms. 60/275.629; 60/331.235; 60/379.617; y, 10/097.249. Véanse, también, por ejemplo, los datos de las Tablas 1, 2 y 3.

Un enfoque alternativo pero relacionado del diseño racional de fármacos comienza con la estructura conocida de un complejo con un ligando de molécula pequeña y modela las modificaciones de esa molécula pequeña en un esfuerzo para realizar interacciones favorables adicionales con HDM2.

La presente descripción incluye el uso de técnicas de modelado molecular y computarizadas para diseñar y seleccionar y diseñar ligandos, tales como agonistas o antagonistas de molécula pequeña u otros agentes terapéuticos que interaccionan con HDM2. Tales agentes incluyen, pero no están limitados a 1,4-benzodiazepinas y sus derivados. Por ejemplo, la invención como se describe en la presente memoria incluye el diseño de ligandos que actúan como inhibidores competitivos de al menos una función de HDM2 uniéndose a todos, o una porción de, los sitios activos u otras regiones de HDM2.

Esta descripción también incluye el diseño de compuestos que actúan como inhibidores competitivos de al menos una función de HDM2. Estos inhibidores se pueden unir a todos, o a una porción de, los sitios activos u otras regiones de HDM2 ya unidos a su sustrato y pueden ser más potentes y menos no específicos que los inhibidores competitivos que compiten por los sitios activos de HDM2. De un modo similar, se pueden diseñar inhibidores no competitivos que se unen a e inhiben al menos una función de HDM2 esté éste unido o no a otra entidad química utilizando las coordenadas atómicas de HDM2 o los complejos que comprenden HDM2.

Las coordenadas atómicas también proporcionan la información necesaria para sondear un cristal de HDM2 con moléculas compuestas por diversos rasgos químicos diferentes para determinar los sitios óptimos para la interacción entre los inhibidores candidato y/o los activadores y HDM2. Por ejemplo, los datos de la difracción de rayos X de alta resolución recogidos de los cristales saturados con disolvente permiten determinar dónde se adhiere cada tipo de molécula de disolvente. Las moléculas pequeñas que se unen a esos sitios pueden ser diseñadas y sintetizadas después y sometidas a ensayo en cuanto a su actividad inhibidora (Travis, J., Science 262:1374 (1993)).

La presente invención también incluye métodos para el escrutinio computacional de bases de datos de moléculas pequeñas y bibliotecas para entidades químicas, agentes, ligandos, o compuestos que se pueden unir en su totalidad, o en parte, a HDM2. En este escrutinio, se puede juzgar la calidad del ajuste de tales entidades o compuestos al sitio o los sitios de unión mediante complementariedad de la forma o mediante la energía de interacción estimada (Meng, E. C. et al., J. Coma. Chem. 13:505-524 (1992)).

El diseño de los compuestos que se unen para promover o inhibir la actividad funcional de HDM2 generalmente implica la consideración de dos factores. Primero, el compuesto debe ser capaz de asociarse físicamente y estructuralmente con HDM2. Las interacciones moleculares no covalentes importantes en la asociación de HDM2 con el compuesto, incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals e hidrófobas. Segundo, el compuesto debe ser capaz de asumir una conformación que le permita asociarse con HDM2. Aunque ciertas porciones del compuesto pueden no participar directamente en la asociación con HDM2, esas porciones todavía pueden influir en la conformación global de la molécula. Esto, a su vez, puede tener un impacto significativo sobre las afinidades de unión, la eficacia terapéutica, las cualidades de tipo fármaco y la potencia. Tales requerimientos conformacionales incluyen la estructura tridimensional global y la orientación de la entidad química o el compuesto en relación con todo o parte del sitio activo u otra región de HDM2, o el espaciamiento entre los grupos funcionales de un compuesto que comprende varias entidades químicas que interaccionan directamente con HDM2.

El efecto agonístico, antagónico o de unión inhibidor, pronosticado, potencial de un ligando u otro compuesto sobre HDM2 se puede analizar antes de su síntesis real y someterlo a ensayo mediante el uso de técnicas de modelado por ordenador. Si la estructura teórica del compuesto dado sugiere una interacción y una asociación insuficientes entre éste y HDM2, se pueden obviar la síntesis y el ensayo del compuesto. No obstante, si el modelado por ordenador indica una interacción fuerte, se puede sintetizar la molécula después y someterla ensayo en cuanto a su capacidad para interaccionar con HDM2. De esta manera, se puede evitar la síntesis de compuestos no operativos. En algunos casos, se sintetizan compuestos inactivos en el pronóstico del modelado y después se someten a ensayo para desarrollar una REA (relación estructura-actividad) para los compuestos que interaccionan con una región específica de HDM2.

Un experto en la técnica puede utilizar uno de los numerosos métodos para escrutar fragmentos de entidades químicas, compuestos, o agentes en cuanto a su capacidad para asociarse con HDM2 y más concretamente con los bolsillos de unión o sitios activos individuales de HDM2. Este procedimiento puede comenzar por la inspección visual, por ejemplo, del sitio activo en la pantalla del ordenador basada en las coordenadas atómicas de HDM2 o HDM2 formando complejo con un ligando. Las entidades químicas, los compuestos, o los agentes seleccionados se pueden situar después en diferentes orientaciones, o acoplarse dentro de un bolsillo de unión individual de HDM2. El acoplamiento se puede completar utilizando un soporte lógico tal como Quanta y Sybyl, seguido de minimización de la energía y de dinámica molecular con campos de fuerza mecánica molecular convencionales, tales como CHARMM y AMBER.

Los programas de ordenador especializados también pueden ayudar en el procedimiento de selección de entidades químicas. Estos incluyen pero no están limitados a: GRID (Goodford, P.J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med Chem. 28:849-857 (1985), asequible de Oxford University, Oxford, UK); MCSS (Miranker, A. y M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method". Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34 (1991), asequible de Molecular Simulations, Burlington, Mass); AUTODOCK (Goodsell, D.S. y A.J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics 8:195-202 (1990), asequible de Scripps Research Institute, La Jolla, CA); y DOCK (Kuntz, I.D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol. 161:269-288 (1982), asequible de University of California, San Francisco, CA).

El uso de un soporte lógico tal como GRID, un programa que determina los sitios de interacción probable entre sondas con diferentes características de grupos funcionales y la superficie macromolecular, se emplea para analizar los sitios de la superficie para determinar estructuras de proteínas o compuestos inhibidores similares. Los cálculos con GRID, con grupos inhibidores adecuados en las moléculas (p. ej., aminas primarias protonadas) como sonda, se utilizan para identificar manchas calientes potenciales en torno a posiciones accesibles en niveles de perfil energético potenciales adecuados. El programa DOCK se puede utilizar para analizar un sitio activo o un sitio de unión al ligando y sugerir ligandos con propiedades estéricas complementarias.

Una vez que se han seleccionado las entidades químicas, los compuestos, o los agentes adecuados, estos se pueden ensamblar en un único ligando o compuesto o inhibidor o activador. El ensamblaje puede continuar mediante inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la imagen tridimensional. Esto puede estar seguido por la construcción de un modelo manual utilizando un soporte lógico tal como Quanta o Sybyl.

Los programas útiles para ayudar a conectar las entidades químicas individuales, o los agentes incluyen, pero no están limitados a: CAVEAT (Bartlett, P.A. et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". En Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, págs. 82-196 (1989)); Sistemas de Bases de Datos 3D tales como MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA y Martin, Y.C., "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem. 35: 2145-2154 (1992); y HOOK (asequible de Molecular Simulations, Burlington, Mass.).

Se encuentran disponibles numerosas metodologías para investigar las bases de datos tridimensionales para someter a ensayo hipótesis de farmacóforos y seleccionar compuestos para su escrutinio. Estas incluyen el programa CAVEAT (Bacon et al., J. Mol. Biol. 225:849-858 (1992)). Por ejemplo, CAVEAT utiliza bases de datos de compuestos cíclicos que pueden actuar como "espaciadores" para conectar cualquier número de fragmentos químicos ya situados en el sitio activo. Esto permite al experto en la técnica generar rápidamente cientos de posibles maneras para conectar los fragmentos ya conocidos o que se sospecha que son necesarios para una unión estrecha.

En lugar de proseguir para construir un inhibidor, activador, agonista o antagonista de HDM2 en una modalidad por etapas como entidad química de una vez como se ha descrito antes, tales compuestos pueden ser diseñados como un todo o "de novo" utilizando un sitio activo vacío o incluyendo opcionalmente algunas porciones de moléculas conocidas. Estos métodos incluyen: LUDI (Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, págs. 61-78 (1992), asequible de Biosym Technologies, San Diego, CA); LEGEND (Nishibata, Y. y A. Itai, Tetrahedron 47:8985 (1991), asequible de Molecular Simulations, Burlington, Mass); y LeapFrog (asequible de Tripos Associates, St. Louis, Mo.).

Por ejemplo, el programa LUDI puede determinar una lista de sitios de interacción en los cuales colocar tanto enlaces de hidrógeno como fragmentos hidrófobos. Después LUDI utiliza una biblioteca de conectores para conectar hasta cuatro sitios de interacción diferentes en fragmentos. Después se utilizan los grupos "formadores de puentes" más pequeños tales como -CH2- y -COO- para conectar estos fragmentos. Por ejemplo, para la enzima DHFR, se reprodujeron las ubicaciones de los grupos funcionales clave en el inhibidor bien conocido metotrexato por medio de LUDI. Véase también, Rotstein y Murcko, J. Med. Chem. 36: 1700-1710 (1992).

También se pueden emplear otras técnicas de modelado molecular de acuerdo con esta invención. Véase, p. e j., Cohen, N.C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med Chem. 33:883-894 (1990). Véase también, Navia, M.A. y M.A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, págs. 202-210 (1992).

Una vez que se ha diseñado o seleccionado un compuesto mediante los métodos anteriores, se puede someter a ensayo y optimizar la afinidad con la cual ese compuesto se puede unir o asociar con HDM2 mediante evaluación computacional y/o sometiendo a ensayo su actividad biológica después de sintetizar el compuesto. Los inhibidores o compuestos pueden interaccionar con el HDM2 en más de una conformación que es similar en su energía de unión total. En esos casos, se supone que la energía de deformación de la unión es la diferencia entre la energía del compuesto libre y la energía media de las conformaciones observadas cuando el compuesto se une a HDM2.

Un compuesto diseñado o seleccionado para unirse o asociarse con HDM2 puede ser adicionalmente optimizado computacionalmente de manera que en su estado unido carezca preferiblemente de interacción electrostática repulsiva con HDM2. Semejantes interacciones no complementarias (p. ej., electrostáticas) incluyen las interacciones repulsivas carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo. Específicamente, la suma de todas las interacciones electrostáticas entre el inhibidor y HDM2 cuando se une el inhibidor, constituye preferiblemente una contribución neutra o favorable a la entalpía de la unión. Los compuestos de unión débil también se diseñarán mediante estos métodos con el fin de determinar REA. Véanse, por ejemplo, las Solicitudes de los Estados Unidos Núms. 60/275.629; 60/331.235; 60/379.617; y, 10/097.249.

El soporte lógico para ordenador específico se encuentra disponible en la técnica para evaluar la energía de deformación y la interacción electrostática de los compuestos. Los ejemplos de los programas diseñados para tales usos incluyen: Gaussian 92, revisión C (M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa., COPYRGT 1992); AMBER, versión 4.0 (P.A. Kollman, University of California en San Francisco, COPYRGT 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. COPYRGT 1994); e Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. COPYROT 1994). Otros sistemas de soporte físico y paquetes de soporte lógico serán conocidos por los expertos en la técnica.

Una vez que un compuesto que se asocia con HDM2 ha sido seleccionado o diseñado óptimamente, como se ha descrito antes, se pueden realizar sustituciones en algunos de sus átomos o grupos laterales con el fin de mejorar o modificar sus propiedades de unión. Generalmente, las sustituciones iniciales son conservativas, esto es, el grupo de sustitución tendrá aproximadamente el mismo tamaño, forma, carácter hidrófobo y carga que el grupo original. Se debe entender, por supuesto, que se deben evitar los componentes conocidos en la técnica por alterar la conformación. Tales compuestos químicos sustituidos se pueden analizar después en cuanto a su eficacia de ajuste a HDM2 mediante los mismos métodos computarizados descritos con detalle, más arriba.

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C. Uso del Modelado de Estructura por Homología para Diseñar Ligandos con Unión Modulada o Actividad para HDM2

La presente descripción incluye el uso de las coordenadas atómicas y las estructuras de HDM2 y/o HDM2 formando complejo con un inhibidor para diseñar modificaciones para compuestos de partida, tales como (4-Ácido clorofenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético; Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético; y sus derivados que se unirán más estrechamente o interaccionarán más específicamente con la enzima diana. Véanse, las Solicitudes de los Estados Unidos Núms. 60/275.629; 60/331.235; 60/379.617; y, 10/097.249, que describen los compuestos 1 y 2 y sus derivados, todos los cuales se incorporan en la presente memoria en su totalidad.

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Compuesto 1 (338437)

Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]-diazepin-4-il]-acético

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1

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Compuesto 2 (876273)

Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético

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2

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La estructura de un complejo entre el HDM2 y el compuesto de partida se puede utilizar para guiar la modificación de ese compuesto para producir nuevos compuestos que tengan otras propiedades deseables para aplicación industrial y otros usos (p. ej., como fármacos), tales como estabilidad química, solubilidad o permeabilidad de membrana. (Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3 (1997)).

Los compuestos de unión, agonistas, antagonistas y demás que son conocidos en la técnica incluyen, pero no están limitados a, péptidos p53 y antagonistas de molécula pequeña. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de los Estados Unidos Núms. 60/275.629; 60/331.235; 60/379.617; y, 10/097.249. Tales compuestos pueden ser difundidos en o empapados con los cristales estabilizados de HDM2 para formar un complejo para recoger los datos de difracción de rayos X. Alternativamente, los compuestos, conocidos y desconocidos en la técnica, pueden ser cristalizados simultáneamente con HDM2 mezclando el compuesto con HDM2 antes de la precipitación.

Para producir compuestos de alta afinidad y muy específicos a la medida, se puede comparar la estructura de HDM2 con la estructura de una molécula no elegida como diana seleccionada y un híbrido construido cambiando la estructura de los restos en el sitio de unión para un ligando por los restos en las mismas posiciones de la molécula no diana. El procedimiento por medio del cual se logra este modelado es referido como modelado de estructuras por homología. Esto se realiza computacionalmente eliminando las cadenas laterales de la molécula o diana de estructura conocida y remplazándolas por cadenas laterales de la estructura desconocida situadas en posiciones estéricamente plausibles. De este modo se puede entender cómo difieren las formas de las cavidades de los sitios activos de las moléculas diana y no diana. Este procedimiento, por lo tanto, proporciona información concerniente a cómo se puede alterar químicamente un ligando unido con el fin de producir compuestos que se unan estrechamente y específicamente a la diana deseada pero simultáneamente se evite estéricamente la unión a la molécula no elegida como diana. Del mismo modo, el conocimiento de las porciones de los ligandos unidos que están orientados al disolvente permitiría la introducción de otros grupos funcionales para fines farmacéuticos adicionales. El uso del modelado de estructuras por homología para diseñar moléculas (ligandos) que se unan más estrechamente a la enzima diana que a la enzima no diana tiene una amplia aplicabilidad.

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D. Análisis de Alto Rendimiento

Se puede utilizar cualquier escrutinio de alto rendimiento para someter a ensayo nuevos compuestos que se identifican o diseñan por su capacidad para interaccionar con HDM2. Para una información general sobre el escrutinio de alto rendimiento, véanse, por ejemplo, Devlin, 1998, High Throughput Screening, Marcel Dekker; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.763.263. Los análisis de alto rendimiento utilizan una o más técnicas de análisis diferentes incluyendo, pero no limitadas a, las descritas más abajo.

Inmunodiagnósticos e Inmunoanálisis. Estos son un grupo de técnicas utilizadas para la medición de sustancias bioquímicas específicas, comúnmente a bajas concentraciones en mezclas complejas tales como fluidos biológicos, que dependen de la especificidad y la elevada afinidad mostradas por anticuerpos adecuadamente preparados y seleccionados por sus antígenos complementarios. Una sustancia que se vaya a medir debe, necesariamente, ser antigénica - ya sea una macromolécula inmunogénica o una pequeña molécula hapténica. Para cada muestra se añade una cantidad limitada, conocida de anticuerpo específico y se estima la fracción de antígeno que se combina con él, expresada a menudo como razón unido:libre, utilizando como indicador una forma del antígeno marcado con un radioisótopo (radio-inmunoanálisis), molécula fluorescente (fluoroinmuno-análisis), radical libre estable (inmunoanálisis de recubrimiento mediante rotación), enzima (inmunoanálisis con enzima), u otra marca fácilmente distinguible.

Los anticuerpos pueden estar marcados de diferentes maneras, incluyendo: análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA); radioinmunoanálisis (RIA); inmunoanálisis fluorescente (FIA); inmunoanálisis quimioluminiscente (CLIA); y marcaje del anticuerpo con partículas de oro coloidal (inmunooro).

Los formatos de análisis comunes incluyen el análisis sándwich, el análisis competitivo o de competición, el análisis de aglutinación con látex, el análisis homogéneo, el formato de placa de microtitulación y el análisis basado en micropartículas.

Análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA). El ELISA es una técnica inmunoquímica que evita los riesgos de los productos radioquímicos y el coste de los sistemas de detección por fluorescencia. En lugar de eso, el análisis utiliza enzimas como indicadores. ELISA es una forma de inmunoanálisis cuantitativo basado en el uso de anticuerpos (o antígenos) que están unidos a una superficie portadora insoluble, que se utiliza después para "capturar" el antígeno relevante (o anticuerpo) en la solución de ensayo. Después se detecta el complejo antígeno-anticuerpo midiendo la actividad de una enzima apropiada que se había anclado previamente al antígeno (o anticuerpo).

Para información sobre las técnicas de ELISA, véanse, por ejemplo, Crowther, (1995) ELISA - Theory and Practice (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe & Kemeny, (1998) ELISA and Other Solid Phase Immunoassays - Theoretical and Practical Aspects, John Wiley; Kemeny, (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press; Ishikawa, (1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) Elsevier.

Análisis Colorimétricos para Enzimas. Una colorimetría es cualquier método de análisis químico cuantitativo en el que se determina la concentración o cantidad de un compuesto comparando el color producido por la reacción de un reactivo tanto con un patrón como con cantidades de ensayo del compuesto, a menudo utilizando un colorímetro. Un colorímetro es un dispositivo para medir la intensidad de color o las diferencias en la intensidad de color, ya sea visualmente o fotoeléctricamente.

Los análisis colorimétricos convencionales de la actividad enzimática de la beta-galactosidasa son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Norton et al., Mol. Cell. Biol. 5:281-290 (1985). Se puede realizar un análisis colorimétrico de los productos lisados celulares completos utilizando O- nitrofenil-beta-D-galactopiranósido (ONPG, Sigma) como sustrato en un análisis colorimétrico con beta-galactosidasa convencional (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). También se encuentran disponibles análisis colorimétricos automatizados para la detección de la actividad beta-galactosidasa, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.733.720.

Análisis de Inmunofluorescencia. La microscopía de inmunofluorescencia es una técnica en la que un antígeno o anticuerpo se vuelve fluorescente por conjugación con un colorante fluorescente y después se deja reaccionar con el anticuerpo o antígeno complementario en una sección de tejido o frotis. La localización del antígeno o anticuerpo se puede determinar después observando la fluorescencia mediante microscopía con luz ultravioleta.

Para información general sobre técnicas inmunofluorescentes, véanse, por ejemplo, Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy - A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Para explicaciones detalladas de las técnicas inmunofluorescentes aplicables a la presente invención, véanse la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.912.176; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.869.264; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.866.319; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.861.259.

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E. Bases de datos y Sistemas Computarizados

Se pueden "proporcionar" una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos de HDM2 y/o los datos de difracción de rayos X, útiles para el modelado molecular por ordenador de HDM2 o una de sus porciones, en diversos medios para facilitar su uso. Según se utiliza en la presente memoria, "proporcionar" hace referencia a una manufactura, que contiene, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos y/o coordenadas atómicas derivadas de los datos de difracción de rayos X de la presente invención, p. ej., una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de HDM2, uno de sus fragmentos representativos, o uno de sus homólogos. Semejante método proporciona la secuencia de aminoácidos y/o los datos de difracción de rayos X en una forma que permite al experto en la técnica el análisis y modelado molecular de la estructura tridimensional de HDM2 o moléculas relacionadas, incluyendo uno de sus subdominios.

En una aplicación de esta realización, las bases de datos que comprenden datos pertenecientes a HDM2, o a al menos uno de sus subdominios, su secuencia de aminoácidos y ácido nucleico y/o datos de difracción de rayos X se registran en un medio legible con ordenador. Según se utiliza en la presente memoria, "medio legible con ordenador" hace referencia a cualquier medio que se pueda leer y al que se pueda acceder directamente por medio de un ordenador. Semejante medio incluye, pero no está limitado a: medios de almacenamiento magnético, tales como discos flexibles, medios de almacenamiento en disco duro, y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico tales como discos ópticos o CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente cómo se puede utilizar cualquiera de los medios legibles con ordenador conocidos en la actualidad para crear una manufactura que comprenda un medio legible con ordenador que tenga registrada una secuencia de aminoácidos y/o los datos de difracción de rayos X de la presente invención.

Según se utiliza en la presente memoria, "registrado" hace referencia a un procedimiento para almacenar información en un medio legible con ordenador. Un experto en la técnica puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos conocidos en la actualidad para registrar información en un medio legible con ordenador para generar manufacturas que comprendan la información de la secuencia de aminoácidos y/o coordenadas atómicas/datos de difracción de rayos X de la presente invención.

Se encuentran disponible para los expertos en la técnica diversas estructuras de almacenamiento de datos para crear un medio legible con ordenador que tenga registrada una secuencia de aminoácidos y/o coordenadas atómicas/datos de difracción de rayos X de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos se basará generalmente en los métodos elegidos para acceder a la información almacenada. Además, se pueden utilizar diversos programas de procesamiento de datos y formatos para almacenar la información de la secuencia y de los datos de rayos X en un medio legible con ordenador. La información de la secuencia puede ser representada en un archivo de texto creado con un procesador de texto, formateada en un soporte lógico disponible en el mercado tal como WordPerfect y MICROSOFT Word, o representado en forma de archivo ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, tal como DB2, Sybase, Oracle, o similar. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesadores de texto (p. ej., archivo de texto o base de datos) con el fin de obtener medios legibles con ordenador que tengan registrada la información de la presente invención.

Proporcionando medios legibles con ordenador que tengan secuencias y/o coordenadas atómicas basadas en los datos de difracción de rayos X, los expertos en la técnica pueden acceder rutinariamente a la secuencia y a las coordenadas atómicas o a los datos de difracción de rayos X para modelar una molécula relacionada, un subdominio, un mimético, o uno de sus ligandos. Se encuentran disponibles al público y comercialmente algoritmos por ordenador que permiten al experto en la técnica acceder a estos datos proporcionados en un medio legible con ordenador y analizarlos para el modelado molecular y/o el DRF (diseño racional de fármacos). Véase, p. ej., Biotechnology Software Directory, MaryAnn Liebert Publ., New York (1995).

La descripción proporciona adicionalmente sistemas, concretamente sistemas con una base computacional, que contienen la secuencia y/o los datos de difracción descritos en la presente memoria. Tales sistemas se diseñan para realizar la determinación de la estructura y el DRF para HDM2 o al menos uno de sus subdominios. Los ejemplos no limitantes son las estaciones de trabajo asequibles de Silicon Graphics Incorporated y sistemas operativos basados en Sun Microsystems running UNIX, Windows NT o IBM OS/2.

Según se utiliza en la presente memoria, "un sistema con una base computacional" hace referencia a los medios de soporte físico, medios de soporte lógico, y medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar la secuencia y/o los datos de difracción de rayos X. Los medios de soporte físico mínimos de los sistemas con una base computacional de la presente invención comprenden una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida, y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente cuáles de los sistemas con una base computacional disponibles en la actualidad son adecuados. Se proporciona opcionalmente un dispositivo de visualización, tal como un monitor para visualizar los datos de la estructura.

Como se ha establecido antes, los sistemas con una base computacional comprenden un medio de almacenamiento de datos que tiene almacenados la secuencia y/o las coordenadas atómicas/datos de difracción de rayos X y los medios de soporte físico y los medios de soporte lógico necesarios para apoyar e implementar un método de análisis. Según se utiliza en la presente memoria, "medios de almacenamiento de datos" hace referencia a una memoria que puede almacenar una secuencia o coordenada atómica/datos de difracción de rayos X, o medios de acceso a la memoria que puedan acceder a manufacturas que tengan registrados en ellas las secuencias o los datos de rayos X.

Según se utiliza en la presente memoria, "métodos de búsqueda" o "métodos de análisis" hace referencia a uno o más programas que son implementados en un sistema con una base computacional para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la secuencia o los datos de rayos X almacenados en el medio de almacenamiento de datos. Los métodos de búsqueda se utilizan para identificar fragmentos o regiones de una proteína que correspondan a una secuencia diana o un motivo diana concretos. Se describen públicamente diversos algoritmos conocidos y diversos soportes lógicos disponibles en el mercado para llevar a cabo métodos de búsqueda y se pueden utilizar en los sistemas con una base computacional. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que cualquiera de los algoritmos o paquetes de soporte lógico de implementación disponibles para llevar a cabo análisis computacionales puede ser adaptado para su uso en los presentes sistemas con una base computacional.

Según se utiliza en la presente memoria, "un motivo estructural diana", o un "motivo diana", hace referencia a cualquier secuencia o combinación de secuencias seleccionadas racionalmente en las que las secuencias se eligen basándose en una configuración tridimensional o un mapa de densidad electrónica que se concibe basándose en el plegamiento del motivo diana. Existen diversos motivos diana conocidos en la técnica. Los motivos diana de proteínas incluyen, pero no están limitados a, sitios activos enzimáticos, sitios de unión a inhibidores, subdominios estructurales, epítopos, dominios funcionales y secuencias señal. Se conocen motivos similares para el ARN. Se pueden utilizar diversos formatos estructurales para los medios de entrada y salida de información en los sistemas con una base computacional.

Se pueden utilizar diversos medios comparativos para comparar una secuencia diana o un motivo diana con los medios de almacenamiento de datos para identificar motivos estructurales o mapas de densidad de electrones derivados en parte de las coordenadas atómicas/datos de difracción de rayos X. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que se puede utilizar cualquiera de los programas de modelado por ordenador disponibles al público como método de búsqueda para los sistemas con una base computacional.

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F. Fragmentos y Porciones de Moléculas Diana

Se pueden preparar fragmentos de HDM2, por ejemplo fragmentos que comprenden sitios activos definidos por dos o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Ser^{17}, Ile^{19}, Leu^{82} y Arg^{97}, mediante cualquier método adecuado incluyendo métodos sintéticos o recombinantes. Tales fragmentos se pueden utilizar después como se ha descrito antes, por ejemplo, análisis de elevado rendimiento para detectar interacciones entre agentes eventuales y el sitio activo del fragmento.

Para la expresión recombinante y la producción de los fragmentos de la invención, se pueden preparar moléculas de ácido nucleico que codifiquen el fragmento. Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" se define como un ARN o ADN que codifica una proteína o péptido como se ha definido antes, o es complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica tales péptidos, o hibrida con semejante ácido nucleico y se mantiene unido establemente a él en condiciones de restricción apropiadas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos de la invención pueden diferir en la secuencia debido a la degeneración del código genético o pueden diferir en la secuencia ya que codifican proteínas o fragmentos de proteínas que difieren en la secuencia de aminoácidos. La homología o la identidad de la secuencia entre dos o más de tales moléculas de ácido nucleico se determina mediante análisis BLAST (Herramienta Básica de Búsqueda de Alineamientos Locales) utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin et al., Proc. Notl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) y Altschul, et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), incorporados en su totalidad como referencia) que se adaptan para la búsqueda de similitud de secuencias.

El enfoque utilizado por el programa BLAST consiste en considerar primero segmentos similares entre una secuencia problema y una secuencia de la base de datos, evaluar después la significación estadística de todos los emparejamientos que se identifican y finalmente resumir solamente aquellos emparejamientos que satisfacen un umbral de significación previamente seleccionado. Para una discusión de las cuestiones básicas en la búsqueda de similitud de las bases de datos de secuencias, véase Altschul et al. (Nat. Genet. 6, 119-129 (1994)) que se incorpora en su totalidad como referencia. Los parámetros de búsqueda para el histograma, las descripciones, los alineamientos, el valor esperado (esto es, el umbral de significación estadística para referir los emparejamientos frente a las secuencias de la base de datos), el corte, la matriz y el filtro se encuentran en los ajustes por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn, y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915-10919 (1992), incorporada en su totalidad como referencia). Se ajustaron cuatro parámetros blastn como sigue: Q=10 (penalización de la creación de espacios); R=10 (penalización de la ampliación de espacios); wink=1 (genera éxitos de palabras en la posición winkº a lo largo de la cuestión); y gapw=16 (ajusta la anchura de la ventana en la cual se generan los alineamientos con espacios). Los ajustes de los parámetros de Blastp equivalentes fueron Q=9; R=2; wink=1; y gapw=32. Una comparación Bestfit entre secuencias, asequible en el paquete GCG versión 10.0, utiliza parámetros de ADN GAP=50 (penalización de la creación de espacios) y LEN=3 (penalización de la ampliación de espacios) y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP=8 y LEN=2.

"Condiciones restrictivas" son aquellas que (1) emplean una fuerza iónica baja y una elevada temperatura de lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS al 0,1% a 50ºC o (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%, 5x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 mg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%. Un experto en la técnica puede determinar y variar fácilmente las condiciones restrictivas apropiadamente para obtener una señal de hibridación clara y detectable.

Según se utiliza en la presente memoria, se dice que una molécula de ácido está "aislada" cuando la molécula de ácido nucleico está esencialmente separada del ácido nucleico contaminante que codifica otros polipéptidos de la fuente de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico codificantes (esto es, los oligonucleótidos sintéticos) y aquellas que se utilizan como sondas o cebadores específicos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o para sintetizar secuencias génicas que codifican proteínas se pueden sintetizar fácilmente mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método del fosfotriéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103: 185-3191 (1981)) o utilizando métodos de síntesis automatizados. Además, se pueden preparar fácilmente segmentos de ADN más grandes mediante métodos bien conocidos, tales como la síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen diferentes segmentos modulares del gen, seguido de ligación de oligonucleótidos para construir el gen modificado completo.

Las moléculas de ácido nucleico codificantes pueden ser modificadas adicionalmente para que contengan una marca detectable con fines diagnósticos y como sondas. Se conocen en la técnica varias de estas marcas y se pueden emplear fácilmente con las moléculas codificantes descritas en la presente memoria. Las marcas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, biotina, nucleótidos radiomarcados y similares. Un artesano experto puede emplear cualquiera de las marcas conocidas en la técnica para obtener una molécula de ácido nucleico codificante marcada.

La presente descripción proporciona adicionalmente moléculas de ADN recombinante (rADN) que contienen una secuencia codificante para una secuencia de proteína para un fragmento de proteína como se ha descrito antes. Según se utiliza en la presente memoria, una molécula de rADN es una molécula de ADN que ha sido sometida a manipulación molecular. Los métodos para generar moléculas de rADN son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). En las moléculas de rADN preferidas, se conecta operablemente una secuencia de ADN codificante a secuencias de control de la expresión y/o secuencias vectoras.

La elección de las secuencias vectoras y de control de la expresión a las cuales está conectada operablemente una de las secuencias codificantes de proteína de la presente invención depende directamente, como es bien sabido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas (p. ej., expresión de proteína, y célula anfitriona que vaya a ser transformada). Un vector puede ser capaz de dirigir la replicación o la inserción en el cromosoma anfitrión, y preferiblemente también la expresión, del gen estructural incluido en la molécula de rADN.

Los elementos de control de la expresión que se utilizan para regular la expresión de una secuencia codificante de proteína conectada operablemente son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, y otros elementos reguladores. Preferiblemente, el promotor inducible es fácilmente controlado, por ser sensible a un nutriente en el medio de la célula anfitriona.

La presente invención proporciona adicionalmente células anfitrionas transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de proteína. La célula anfitriona puede ser o bien procariótica o bien eucariótica. Las células eucarióticas útiles para la expresión de una proteína no están limitadas, con tal que la línea celular sea compatible con los métodos de cultivo de la célula y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión del producto génico. Las células anfitrionas eucarióticas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, levaduras, células de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrados tales como las líneas celulares de ratón, rata, mono o ser humano. Las células anfitrionas eucarióticas preferidas incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) asequibles de la ATCC como CCL61, células embrionarias de ratón Swiss NIH NIH-3T3 asequibles de la ATCC como CRL1658, células de riñón de cría de hámster Chino (BHK), y líneas celulares de cultivos de tejidos eucarióticos similares.

Las células anfitrionas transformadas se pueden cultivar en condiciones que permitan la producción de la proteína recombinante. Opcionalmente la proteína recombinante se aísla del medio o de las células; la recuperación y la purificación de la proteína puede no ser necesaria en algunos casos en los que se pueden tolerar ciertas impurezas.

También se pueden preparar kits con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico, fragmentos de proteínas, vectores y/o células anfitrionas descritos antes, opcionalmente empaquetados con los reactivos necesarios para un análisis específico, tales como los descritos antes. En tales kits, los fragmentos de proteína u otros reactivos se pueden anclar a un soporte sólido, tal como cuentas de vidrio o plástico.

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G. Procedimientos Integrados

Se proporciona el modelado molecular para el diseño racional de fármacos (DRF) de miméticos y ligandos de HDM2. Como se ha descrito antes, el paradigma del diseño de fármacos utiliza programas de modelado por ordenador para determinar miméticos y ligandos potenciales que se espera que interaccionen con sitios de la proteína. Los miméticos o ligandos potenciales se escrutan después en busca de actividad y/o unión y/o interacción. Para los miméticos o ligandos relacionados con HDM2, se pueden seleccionar métodos de escrutinio a partir de análisis para al menos una actividad biológica de HDM2, p. ej., como el bloqueo de la unión a p53, de acuerdo con las etapas de los métodos conoci-
dos. Véanse, por ejemplo, Kussie et al., Science 274:948-953 (1996); Bottger et al., J. Mol. Biol. 269:744-756 (1997).

De este modo, las herramientas y metodologías proporcionadas se pueden utilizar en procedimientos para identificar y diseñar ligandos que se unen de la manera deseable a la diana. Tales procedimientos utilizan un procedimiento iterativo por medio del cual se sintetizan los ligandos, se someten a ensayo y se caracterizan. Se pueden diseñar nuevos ligandos basándose en la información adquirida en el ensayo y la caracterización de los ligandos iniciales y después se pueden someter a ensayo y caracterizar tales ligandos recién identificados. Esta serie de procedimientos se puede repetir tantas veces como sea necesario para obtener ligandos con las propiedades de unión deseables.

Las siguientes etapas sirven como ejemplo del procedimiento global:

1.

Se selecciona una actividad biológica de una diana (p. ej., unión a p53).

2.

Se identifica un ligando que parece estar asociado en cierto modo con la actividad biológica seleccionada (p. ej., el ligando puede ser un inhibidor de una actividad conocida). La actividad del ligando se puede someter a ensayo mediante métodos in vivo y/o in vitro.

Un ligando de la presente invención puede ser, pero no está limitado a, al menos uno seleccionado entre un lípido, un ácido nucleico, un compuesto, una proteína, un elemento, un anticuerpo, un sacárido, un isótopo, un carbohidrato, un agente formador de imágenes, una lipoproteína, una glicoproteína, una enzima, una sonda detectable, y un anticuerpo o uno de sus fragmentos, o cualquiera de sus combinaciones, que pueden estar marcados detectablemente por ejemplo con anticuerpos de marcaje. Tales marcas incluyen, ero no están limitadas a, marcas enzimáticas, radioisótopos o compuestos o elementos radiactivos, compuestos o metales fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Alternativamente, se puede utilizar cualquier otro agente diagnóstico o terapéutico conocido en un método de la invención. Los compuestos adecuados se someten a ensayo después en busca de sus actividades en relación con la diana.

Los complejos entre HDM2 y los ligandos se elaboran mediante co-cristalización o más comúnmente difundiendo el ligando de molécula pequeña en el cristal. Los datos de difracción de rayos X del cristal complejo se miden y se calcula la diferencia en el mapa de densidad de electrones. Este procedimiento proporciona la localización precisa del ligando unido sobre la molécula diana. La diferencia de Fourier se calcula utilizando las amplitudes de difracción medidas y las fases de estas reflexiones se calculan a partir de las coordenadas.

3.

Utilizando los métodos de la presente invención, se emplea la cristalografía de rayos X para crear mapas de densidad de electrones y/o modelos moleculares de la interacción con la molécula diana.

La entrada de las coordenadas de la diana en los programas de ordenador comentados antes da como resultado el cálculo de la estructura más probable de la macromolécula. Estas estructuras se combinan y se perfeccionan mediante cálculos adicionales utilizando tales programas para determinar la estructura tridimensional probable o real de la diana incluyendo los sitios activos o de unión potenciales o reales de los ligandos. Tales programas de modelado molecular (y afines) útiles para el diseño racional de fármacos de ligandos o miméticos, también son proporcionados por la presente invención.

4.

Los mapas de densidad electrónica y/o los modelos moleculares obtenidos en la Etapa 3 se comparan con los mapas de densidad electrónica y/o los modelos moleculares de una diana que no contiene el ligando y se utilizan las diferencias observadas/calculadas para localizar específicamente la unión del ligando sobre la diana o subunidad.

5.

Las herramientas de modelado, tales como la química computacional y el modelado por ordenador, se utilizan para ajustar o modificar la estructura del ligando de manera que puedan realizar interacciones adicionales o diferentes con la diana.

El diseño de ligandos utiliza programas de modelado por ordenador que calculan cómo interaccionan las diferentes moléculas con los diferentes sitios de una diana. Este procedimiento determina ligandos o miméticos potenciales de los ligandos.

El diseño de ligandos utiliza programas de modelado por ordenador que calculan cómo interaccionan diferentes moléculas con los diferentes sitios de la diana, subunidad, o uno de sus fragmentos. De este modo, este procedimiento determina los ligandos potenciales o miméticos de ligandos.

6.

El ligando recién diseñado de la Etapa 5 se puede someter a ensayo en cuanto a su actividad biológica utilizando ensayos in vivo o in vitro apropiados, incluyendo los métodos de escrutinio de elevado rendimiento comentados antes.

Los ligandos o miméticos potenciales se escrutan después en busca de actividad relacionada con HDM2, o a al menos uno de sus fragmentos. Tales métodos de escrutinio se seleccionan entre los análisis para al menos una actividad biológica de la diana nativa.

Los ligandos o miméticos resultantes, son útiles para tratar, escrutar o prevenir enfermedades en animales, tales como mamíferos (incluyendo seres humanos) y aves.

7.

Por supuesto, cada una de las etapas anteriores puede ser modificada según se desee por los expertos en la técnica con el fin de perfeccionar el procedimiento para el objetivo concreto en mente. Asimismo, se pueden recoger datos adicionales de difracción de rayos X en HDM2, complejos HDM2/ligando, motivos diana estructurales de HDM2 y complejos de subunidad HDM2/ligando en cualquier etapa o fase del procedimiento. Tales datos de difracción adicionales se pueden utilizar para reconstruir mapas de densidad electrónica y modelos moleculares que pueden ayudar adicionalmente al diseño y selección de ligandos con los atributos de unión deseables.

Se debe entender que se considera que la presente descripción incluye los estereoisómeros así como los isómeros ópticos, p. ej., mezclas de enantiómeros así como enantiómeros individuales y diastereoisómeros, que surgen como consecuencia de la asimetría estructural en los compuestos, ligandos o miméticos seleccionados de la presente serie.

Algunos de los compuestos o agentes descritos o descubiertos por los métodos de la presente memoria pueden contener uno o más centros asimétricos y de ese modo dar lugar a enantiómeros, diastereoisómeros, y otras formas estereoisoméricas. También se pretende que la presente descripción abarque todas esas posibles formas así como sus formas racémicas y resueltas y sus mezclas. Cuando los compuestos descritos o descubiertos en la presente memoria contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique de otro modo, se pretende incluir los isómeros geométricos tanto E como Z. También se pretende que todos los tautómeros estén incluidos en la presente invención.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "estereoisómeros" es un término general para todos los isómeros de moléculas individuales que difieren solamente en la orientación de sus átomos en el espacio. Este incluye enantiómeros e isómeros de compuestos con más de un centro quiral que no son imágenes especulares entre sí (diastereoisómeros).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "centro quiral" hace referencia a un átomo de carbono al cual están anclados cuatro grupos diferentes.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "enantiómero" o "enantiomérico" hace referencia a una molécula que no es superponible sobre su imagen especular y por consiguiente es ópticamente activa donde el enantiómero rota el plano de la luz polarizada en una dirección y su imagen especular rota el plano de la luz polarizada en la dirección opuesta.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "racémico" hace referencia a una mezcla de partes iguales de enantiómeros y que es ópticamente activa.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "resolución" hace referencia a la separación o concentración o agotamiento de una de las dos formas enantioméricas de una molécula. En el contexto de esta solicitud el término "resolución" también hace referencia a la cantidad de detalle que se puede resolver mediante el experimento de difracción. O en otros términos, puesto que la alteración inherente de un patrón de difracción del cristal de una proteína se desvanece en un cierto ángulo de difracción \theta_{max}, la distancia correspondiente d_{min} de los retículos cristalinos recíprocos se determina mediante la ley de Bragg.

3

En la práctica, en la cristalografía de proteínas es habitual citar la resolución nominal de una densidad de electrones de una proteína en términos de d_{min}, la distancia de retículos cristalinos mínima a la cual los datos están incluidos en el cálculo del mapa.

Los compuestos también son útiles en la inhibición de la interacción entre p53 y MDMX. MDMX, también conocida como MDM4, es una proteína celular implicada en la regulación del ciclo celular. Por ejemplo, véase Riemenschneider et al., Cancer Res. 59 (24):6091-6096 (1999).

Sin una descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, elaborar y utilizar los cristales de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo por lo tanto, apuntan específicamente a las realizaciones preferidas de la presente invención, y no se consideran limitantes en modo alguno del resto de la descripción.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción y Expresión de la Proteína de Fusión GST-HDM2

Los ADNc que codificaban los restos 17-125 de HDM2 se clonaron y se expresaron como sigue: se realizó la PCR utilizando el artículo de la ATCC número 384988 que contenía la secuencia de MDM2 humana parcial como molde y los siguientes cebadores:

Directo:	5'-CTCTCTCGGATCCCAGATTCCAGCTTCGGAACAAGAG
Inverso:	5'-TATATATCTCGAGTCAGTTCTCACTCACAGATGTACCTGAG.

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Después se digirió el producto de la PCR con BamHI y XhoI (sitios de reconocimiento de la secuencia subrayados en los cebadores), se purificó en gel, y se ligó en pGEX4t-3 que también había sido digerido con BamHI y XhoI. El plásmido purificado se transformó en la cepa BL21 de E. coli. Se produjo la proteína a 37ºC en matraces de 2 L con sacudimiento que contenían 800 ml de LB (medio Laura Bertani) + 100 \mug/ml de ampicilina y con un suplemento de glicerol al 0,2%. Brevemente se inocularon 16 ml de cultivo durante la noche y se indujo con IPTG 1 mM cuando la absorbancia a 600 alcanzó una DO de 0,6-0,8. Las células se recogieron 5 horas después de la inducción.

Para HDM2 23-114, los cebadores utilizados fueron los siguientes:

5'-CGACGATTGGATCCGAACAAAGACCCTG

3'-GGCTACTACTCCGAGTCATTCCTGCTGATTGACTAC

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Para HDM2 17-111, los cebadores utilizados fueron

5'-CTCTCTCGGATCCCAGATTCAGCTTCCGGAACAAGAG

3'-TTCAGCAGCTCGAGTCAATTGACTACTACCAAGTTC

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Los fragmentos de PCR fueron clonados y expresados como antes con algunas excepciones. Se utilizó la cepa BL21 RIL de E. coli para la expresión. Las células se hicieron crecer a 37ºC hasta A_{600} de 0,2, después se transfirieron a la temperatura ambiente y se indujeron a A_{600} de 0,6-0,8 con IPTG 0,1 M. Las células se recogieron 5 horas después de la inducción, se centrifugaron, y se resuspendieron en PBS hasta 10 ml/g de pasta celular.

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Producción de Proteína

Las células se lisaron en un microfluidificador Avestin, se centrifugaron, y el sobrenadante se unió a una resina de glutation Sefarosa 4B (Pharmacia). La resina se lavó con PBS y el constructo HDM2 de interés se escindió de la GST-resina mediante la adición de 2 \mug/ml de trombina (Enzyme Research Labs). La HDM2 escindida se cargó sobre una resina Sepharose SP Fast Flow (Pharmacia), y se hizo eluir con HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Se añadió glutation hasta 5 mM, y la proteína se almacenó a -70ºC. La proteína resultante tiene una Glicina N-terminal antes del aminoácido 17 (Serina).

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Preparación de Proteína para la Cristalografía

Se formó un complejo de HDM2 17-111 con el compuesto de interés mediante diálisis a una concentración de 0,7 mg/ml, el tampón se llevó a HEPES 20 mM, 7,4, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, se filtró a través de un filtro de 0,02 \mum, y se concentró a 10 mg/ml.

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Ejemplo 2 Cristalización y Recogida de Datos

En un experimento de cristalización típico, se mezclaron 1-2 \mul de proteína HDM2, formando complejo con un compuesto y concentrada a aprox. 10 mg/ml, a una razón 1:1 con solución del pocillo ((NH_{4})_{2}SO_{4} 1,8-2,4 M, tampón 100 mM pH 6,5-9,0, PEG 400 al 2%, NaSCN 100 mM) y se colocaron sobre un cubre de vidrio. El cubre se invirtió y se selló sobre un reservorio de 500-1000 \mul de solución del pocillo y se incubó a 4ºC. Los cristales normalmente aparecieron durante la noche y fueron fáciles de recoger después de 3-7 días. Los cristales se recogieron con un asa de nailon, se colocaron durante menos de 30 segundos en crio-solución ((NH_{4})_{2}SO_{4} 2,2 M, bis-tris-propano 100 mM pH 7,5, PEG 400 al 2%, NaSCN 100 mM, glicerol al 15%) y se congelaron mediante inmersión en nitrógeno líquido o propano líquido. Se recogieron los datos a 120K en un ánodo giratorio Bruker AXS M06XCE y un detector SMART 6000 CCD. Los datos de difracción se procesaron con el paquete Proteum (Bruker AXS).

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Ejemplo 3 Métodos de Análisis: Análisis de Unión al Péptido

La inhibición de la unión de MDM2 a p53 se midió utilizando un análogo del péptido p53 que se unía a MDM2 restos 17-125. La estructura cristalina publicada de este complejo (Kussie, P.H., et al., Science 274:948-953 (1996)) valida que este fragmento contiene el sitio de unión a p53, y los autores de la presente invención han resuelto la estructura de rayos X del análogo del péptido p53 MPRFMDYWEGLN, descrito por ser un inhibidor peptídico de la interacción MDM2-p53 (Bottger, A., et al., J Mol Biol 269:744-756 (1997)). En el análisis se utiliza el péptido RFMDYWEGL con fluoresceína en el extremo N (Fl-nonámero). El compuesto se incubó durante 15 minutos con el péptido con fluoresceína Fl-nonámero 30 nM y HDM2 17-125 120 nM en HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, octil-glucósido 3 mM. La polarización de la marca de fluoresceína se midió mediante excitación a 485 nm y emisión a 530 nm. La polarización se expresó como el porcentaje de un compuesto no de control, sin utilizar MDM2 con Fl-nonámero como fondo.

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Ejemplo 4 Coordenadas Atómicas de HDM2: Tabla 1 (Compuesto 1)

La Tabla 1 describe las coordenadas atómicas tridimensionales de HDM2 formando complejo con el compuesto 1 (338437) Ácido ((4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]-diazepin-4-il]-acético y unida a agua en el formato pdb convencional. Los datos cristalográficos relevantes están contenidos en la sección OBSERVACIÓN de la Tabla 1. Dos moléculas de HDM2, relacionadas por una simetría no cristalográfica, están presentes en la unidad asimétrica y se identifican por CHAINID de A para la primera molécula y B para la segunda molécula. El compuesto (compuesto 1) está presente con el nombre DCB. El compuesto 1 y la molécula de HDM2 que comparten el mismo CHAINID están formando un complejo.

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Ejemplo 5 Coordenadas Atómicas de HDM2: Tabla 2 (Compuesto 2)

Se co-cristalizaron el compuesto 2 Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidrobenzo-[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético (876273) y la proteína HDM2 como se ha descrito antes en el Ejemplo 2. La Tabla 2 describe las coordenadas atómicas tridimensionales de HDM2 formando complejo con el compuesto 2 (876273) (Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético). Los datos cristalográficos relevantes están contenidos en la sección OBSERVACIÓN de la Tabla 2. Los datos se recogieron como se ha descrito antes. Se pueden observar diferentes formas cristalinas en las mismas condiciones de cristalización utilizadas para obtener la forma cristalina trigonal.

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Ejemplo 6 Coordenadas Atómicas de HDM2: Tabla 3

La Tabla 3 describe las coordenadas atómicas tridimensionales de HDM2 co-cristalizada con el compuesto 2 (compuesto 876273: Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético) en un grupo espacio tetragonal alineado con la estructura de HDM2 formando complejo con el compuesto 1 (compuesto 338437 (Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético). Los datos cristalográficos relevantes están contenidos en la sección OBSERVACIÓN de la Tabla 3. Los datos se recogieron como se ha descrito antes.

El formato pdb se describe en diferentes sitios de la red. Dependiendo del programa cristalográfico se pueden encontrar modificaciones minoritarias de la aplicación para este formato. Un buen cebador es proporcionado por este enlace en CCP4 "www.ccp4.ac.uk/html/pdbformat.html". Se puede encontrar una descripción más ampliada en la página inicial RCSB.

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Ejemplo 7 Introducción por Fases: Construcción del Modelo y Perfeccionamiento

Se obtuvieron fases mediante sustitución molecular utilizando la estructura de HDM2 publicada como modelo de búsqueda en CNX (Brunger, A.T., et al., P.D.. Acta Cryst D54:905-921 (1998); Accelrys Inc.). Se llevaron a cabo ciclos alternantes de perfeccionamiento de la estructura y construcción del modelo de acuerdo con los protocolos convencionales utilizando CNX y O (Jones, T.A., et al., Acta Cryst A47: 110-119 (1991)).

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Ejemplo 8 Rasgos Estructurales de HDM2

Figura 1. Representación de cintas de HDM2 unido al compuesto 1 (compuesto 338437: (Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético).

Figura 2. Ajuste del compuesto 1 (compuesto 338437: (Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético en el sitio activo de HDM2 presentado como una superficie molecular.

TABLA 1 Compuesto 338437 Ácido ((4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]acético

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TABLA 2 Compuesto 876273 (Ácido ((8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-4-(4-cloro-fenil)-acético)

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TABLA 3 Superpuesto: formas cristalinas trigonal y tetragonal

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Claims (9)

1. Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO: 1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3_{2}21 y un grupo espacio tetragonal de P4_{3}2_{1}2.

2. El cristal de la reivindicación 1, donde el cristal difracta eficazmente los rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas para una resolución de al menos aproximadamente 3,0 \ring{A}.

3. El cristal de la reivindicación 1, donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético; Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético); y sus derivados.

4. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende un polipéptido HDM2-ligando que comprende:

(a)

poner en contacto el polipéptido HDM2 con dicho ligando en una solución adecuada que comprende PEG y NaSCN; y,

(b)

cristalizar dicho complejo resultante de polipéptido HDM2-ligando de dicha solución,

donde el polipéptido HDM2 consiste en los restos aminoácido 17-111 del SEQ ID NO:1.

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5. El método de la reivindicación 4, donde dicho PEG tiene un intervalo de peso molecular medio de 100 a 1.000, donde dicho PEG está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v y dicho NaSCN está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente
150 mM.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicho PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 400 y está presente en solución a aproximadamente 2% p/v y dicho NaSCN está presente en solución a aproximadamente 100 mM.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicha solución comprende adicionalmente (NH_{4})_{2}SO_{4} aproximadamente 1,8-2,4 M y tampón aproximadamente 100 mM.

8. Un método para la producción de un cristal de la reivindicación 1 que comprende:

(i)

formar un complejo de un péptido que consiste en los aminoácidos 17-111 del SEQ ID NO: 1 con una pequeña molécula;

(ii)

concentrar dicho complejo; y

(iii)

permitir que dicho complejo concentrado cristalice.

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9. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende:

mezclar 1-2 \mul de proteína HDM2 que consiste en los aminoácidos 17-111 del SEQ ID NO: 1 formando complejo con una molécula pequeña y concentrada a aprox. 10 mg/ml a una razón 1:1 con solución de pocillo ((NH_{4})_{2}SO_{4} 1,8-2,4 M y tampón 100 mM pH 6,5-9,0, PEG 400 al 2%, NaSCN 100 mM);

colocar dicha solución mixta sobre un cubre de vidrio;

invertir el cubre de vidrio y sellar el cubre de vidrio sobre un reservorio de 500-1000 \mul de solución de pocillo;

incubar el cubre de vidrio a 4ºC durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días para permitir la formación de cristales; y

recoger los cristales.