ES2337301T3 - Metodo normalizado y optimizado de reaccion en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa en tiempo real para la deteccion de mrd en leucemia. - Google Patents
Metodo normalizado y optimizado de reaccion en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa en tiempo real para la deteccion de mrd en leucemia. Download PDFInfo
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Abstract
Conjuntos de ácidos nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 20 y SEQ ID Nº 22.
Description
Método normalizado y optimizado de reacción en
cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en
tiempo real para la detección de MRD en leucemia.
La presente invención se refiere a un método de
PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR) para la
detección de enfermedad residual mínima en pacientes leucémicos a
través de la amplificación de un transcrito de gen de fusión.
Los protocolos de tratamiento actuales para la
leucemia linfoblástica aguda (ALL), la leucemia mieloide aguda
(AML) y la leucemia mieloide crónica (CML) se basan en factores de
pronóstico, que contribuyen a la estratificación de la
terapia.(1-3). Los factores de pronóstico clave
identificados en la leucemia a lo largo de los años incluyen
características antes del tratamiento tales como edad, recuento de
glóbulos blancos, perfiles inmunofenotípicos, anomalías
cromosómicas específicas, genes de fusión aberrantes y mutaciones,
tales como alteraciones del gen FLT3 en la AML. La respuesta a la
terapia inicial proporciona un marcador de pronóstico adicional bien
conocido; en particular, la presencia o ausencia de blastocitos en
la médula ósea tras la terapia de inducción en ALL y AML, o la
respuesta citogenética en pacientes con CML.
Sin embargo, es importante hacer hincapié en que
el desenlace del paciente no puede predecirse de manera fiable
partiendo de la base de tales parámetros clásicos, subrayando así la
posible importancia de las pruebas de enfermedad residual mínima
(MRD). A lo largo de los últimos diez años, los desarrollos
tecnológicos han permitido la detección de células leucémicas más
allá del umbral de la citomorfología o la cariotipificación (4).
Actualmente se usan tres técnicas diferentes con
una sensibilidad de al menos una célula leucémica en un fondo de
10^{3} células normales: 1. inmunofenotipificación, 2. reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando ADN genómico para la detección
de redisposiciones de clones de inmunoglobulina (Ig) y genes del
receptor de células T (TCR) en ALL, y 3. transcriptasa
inversa-PCR (RT-PCR) para la
detección de redisposiciones de genes, principalmente transcritos
de FG que resultan de translocaciones cromosómicas. Aunque los dos
primeros miden directamente la carga tumoral, el último método mide
la expresión génica.
La información de MRD en pacientes con leucemia
se ha establecido claramente como un factor de pronóstico
independiente en tres situaciones patológicas: 1) ALL en la
infancia, en particular tras la terapia de inducción; 2) detección
de BCR-ABL en pacientes con CML tras trasplante
alogénico de células madre, permitiendo la dirección de la
infusiones de leucocitos del donante y 3) detección de
PML-RARA en pacientes con leucemia promielocítica
aguda (APL) tras la terapia de consolidación, confiriendo beneficio
a la terapia preventiva en el punto de la recidiva molecular en
comparación con la recidiva manifiesta. Estos datos han conducido a
la introducción de la monitorización molecular en la estrategia de
estratificación en algunos ensayos terapéuticos multicéntricos
actuales.
Sin embargo, el impacto clínico de la detección
de MRD en otros tipos de leucemias sigue teniendo que demostrarse
en grandes series de pacientes.
Con el fin de abordar el problema de la falta de
metodología de diagnóstico normalizada, hace ocho años laboratorios
europeos realizaron un programa de colaboración a través de una
acción concertada BIOMED-1.
Esta acción concertada condujo al desarrollo de
ensayos de RT-PCR anidada normalizados que lograron
sensibilidades de al menos 10^{-4} (ARN diluido en ARN) adecuadas
para la detección de MRD así como para la detección diagnóstica
(5).
Sin embargo, los análisis de PCR de "punto
final" no permiten la cuantificación precisa de los niveles de
MRD. Esta limitación se destacó por el hallazgo de bajos niveles de
transcritos de AML1-ETO, CBFB-MYH111
o PML-RARA,(1) en pacientes en remisión clínica a
largo plazo y por la detección de ARNm de BCR-ABL a
niveles muy bajos en individuos sanos. Se ha logrado un análisis de
PCR cuantitativa mediante PCR competitiva. Laboratorios expertos
mostraron que esta técnica permite la predicción precisa de la
recidiva, lo que sugiere que podría usarse un análisis de este tipo
para adaptar el tratamiento en la CML positiva para
BCR-ABL o en los pacientes con AML con transcritos
de CBFB-MYH11 o AML1-ETO.
Sin embargo, esta PCR competitiva requiere mucho
trabajo y lleva mucho tiempo, lo que impide tanto la normalización
como el análisis multicéntrico a gran escala.
Más recientemente, se ha introducido la PCR
cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR) (6). Ha habido
numerosos manuscritos de laboratorios individuales que demostraban
la fiabilidad de esta tecnología y su posible valor clínico para
los estudios de MRD usando transcritos de FG como dianas de PCR
tales como BCR-ABL en CML, o ALL,
PML-RARA, AML1-ETO y
CBFB-MYH11 en AML y TEL-AML1 en
pacientes con ALL.
\newpage
Sin embargo, los procedimientos de
RQ-PCR normalizados todavía están justificados con
el fin de aplicar esta tecnología innovadora para estudios de MRD a
gran escala en ensayos terapéuticos multicéntricos.
Los presentes inventores diseñaron un proyecto
conjunto de protección de la salud y el consumidor de la Comisión
Europea (SANCO) mediante el programa "Europe Against Cancer"
(Europa contra el cáncer) (EAC) con el fin de desarrollar la
normalización y el análisis de control de calidad para la
RQ-PCR, basándose en la plataforma ABI 7700
(Applied Biosystems, Foster City - EE.UU.) ya que fue la primera
tecnología de este tipo disponible. El objetivo principal era
establecer un protocolo normalizado que permitiera la comparación de
los datos de MRD con el fin de evaluar la eficacia relativa de cada
estrategia terapéutica para la leucemia que lleva un marcador
molecular apropiado. Se seleccionaron los transcritos de genes de
fusión que se producían más frecuentemente en la leucemia,
cubriendo hasta del 30 al 40% de la ALL y la AML en niños y adultos
y más del 95% de los pacientes con CML.
Tal como se mencionó anteriormente en el
presente documento, en comparación con la RT-PCR
convencional, la RQ-PCR permite la cuantificación
precisa de la expresión génica. Una característica atractiva de esta
técnica es que pueden evaluarse parámetros cruciales tales como la
calidad y la cantidad del ARN. Esto se lleva a cabo mediante la
amplificación paralela del gen diana y uno o más genes control (CG),
también denominados genes de referencia endógenos o
constitutivos.
Un CG adecuado en algunas aplicaciones del
análisis de RQ-PCR puede definirse como un gen con
una expresión estable en todas las células nucleadas entre
diferentes muestras analizadas que no resulta afectado por ningún
tratamiento experimental. La amplificación alterada de los CG debe
ir acompañada por una reducción correspondiente de la cantidad de
transcritos del gen diana, lo que refleja variaciones en la calidad
y la cantidad del ARN y en la eficacia de síntesis del ADNc. Por
tanto, la cuantificación de la expresión del CG podría usarse para
detectar muestras de mala calidad, basándose en valores de
referencia observados en un gran número de muestras recientes.
Además, la RQ-PCR permitiría evaluar una
sensibilidad experimental por muestra, lo que es particularmente
importante para las muestras de seguimiento negativas para la
PCR.
Aunque la bibliografía sobre los ensayos de
RQ-PCR está ampliándose rápidamente, hasta ahora no
se ha publicado un esfuerzo concertado relacionado con la selección
de CG apropiados.
La elección de un CG sigue siendo un tema
crucial y todavía tiene que encontrarse un consenso. Hasta la fecha,
todavía se usan numerosos CG para la detección de MRD mediante
RQ-PCR: ABL, ACTB, B2M, GAPDH, PBGD, TBP y ARNr
18s. La inclusión del análisis de CG debe mejorar significativamente
la fiabilidad de la detección de MRD en pacientes leucémicos.
Sin embargo, esto depende de manera crítica de
la optimización y la normalización de los ensayos de CG y FG.
Por estos motivos, los inventores de la presente
solicitud se han centrado más particularmente en el diseño, la
optimización y la normalización del análisis de
RQ-PCR de FG con referencia especial a la selección
y validación de CG adecuados para el análisis de
RQ-PCR en un gran panel de muestras normales y
leucémicas.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención es proporcionar una mejora significativa en un método de
reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa
cuantitativa (RQ-PCR) para la detección de
enfermedad residual mínima en pacientes leucémicos a través de la
amplificación de un transcrito de gen de fusión.
La invención proporciona un conjunto de ácidos
nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR que
comprende una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº
21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº
20 y SEQ ID Nº 22 cuando el gen de fusión es
BCR-ABL m-bcr.
La invención proporciona además un conjunto de
ácidos nucleicos BCR-ABL para RQ-PCR
que comprende una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID
Nº 21 y cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ
ID Nº 23 y SEQ ID Nº 22 cuando el gen de fusión es
BCR-ABL M-bcr.
La invención proporciona además el uso de los
conjuntos de ácidos nucleicos en un método de RQ-PCR
para la detección de enfermedad residual mínima en pacientes
leucémicos, en el que dicho método de RQ-PCR
comprende: (i) seleccionar muestras amplificables y cualificadas de
pacientes para el análisis posterior; (ii) definir las condiciones
óptimas para realizar la reacción de RT; (iii) definir las
condiciones óptimas para el protocolo de RQ-PCR; y
(iv) establecer un procedimiento normalizado para el análisis de los
datos, en el que se amplifica un transcrito de gen de control
apropiado en paralelo al transcrito de gen de fusión.
La presente invención podría proporcionar
ventajosamente la base para una referencia internacional de estudios
de MRD usando el análisis de RQ-PCR de transcritos
de FG.
En el método de la invención, debe amplificarse
un transcrito de gen de control apropiado en paralelo al transcrito
de gen de fusión.
La inclusión de genes de control para corregir
variaciones de la muestra hace que el método de la invención pueda
aplicarse para la detección de transcritos de genes, creando así una
plataforma para estudios futuros, en la que los ensayos de
RQ-PCR deben ser cruciales para evaluar la eficacia
terapéutica, particularmente para fármacos innovadores como los
inhibidores para proteínas de tirosina cinasa,
fosfatidil-inositol-3-cinasa
o farnesil-transferasa.
Las estrategias terapéuticas se adaptarán según
tales evaluaciones de MRD normalizadas. Una gran mejora será la
ayuda de tales datos biológicos en la toma de una decisión
terapéutica, tal como en el trasplante alogénico no relacionado, la
infusión de linfocitos de donante o básicamente la elección de la
estrategia terapéutica más eficaz.
Además, el método normalizado definido para
marcadores en la leucemia aguda y crónica según la presente
invención podría ser un modelo para otros marcadores biológicos en
oncohematología y más ampliamente, en el campo de la oncología.
Los programas de normalización y control de
calidad para tecnologías novedosas tales como la detección
semiautomática de MRD en la actualidad, pero también las
tecnologías de chip ADN de alto rendimiento en el futuro, son
obligatorios para garantizar que los avances logrados a través de
las metodologías genómicas innovadoras produzcan el máximo beneficio
en la mejora del desenlace de pacientes con leucemia.
El gen de control que va a usarse en el método
de la invención se selecciona del grupo que consiste en ABL,
B2M y GUS.
Preferiblemente, las secuencias de cebador
directo, sonda y cebador inverso para ABL, B2M y GUS
son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 1 (ENF1003), SEQ ID Nº 2 (ENPr1043) y SEQ ID Nº 3 (ENR1063); y
- SEQ ID Nº 7 (ENF1102), SEQ ID Nº 8 (ENPr1142) y SEQ ID Nº 9 (ENR 1162).
Las secuencias y la ubicación de estos tres
genes de control preferidos se facilitan en la tabla 37.
Lo más preferiblemente, el gen de control
seleccionado que va a usarse en el método de la invención es
ABL.
En un aspecto preferido de esta realización,
todas las muestras con un valor de ABL dentro de un intervalo
de referencia, respectivamente desde 1,3x10^{3} hasta
1,3x10^{5} copias o Ct desde 21,9 hasta 29,3, se consideran como
una muestra amplificable y están cualificadas para el análisis
posterior.
En el método de la invención pueden usarse
conjuntos adicionales de cebadores y sondas específicos para
transcritos de genes de fusión adicionales, tal como sigue:
- -
- cuando el gen de fusión es E2A-PBX1, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 10 (ENF101), SEQ ID Nº 11 (ENP141) y SEQ ID Nº 12 (ENR161).
- -
- cuando el gen de fusión es MLL-AF4, las secuencias correspondientes de cebadores directos, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 13 (ENF207), SEQ ID Nº 14 (ENF208), SEQ ID Nº 15 (ENP242) y SEQ ID Nº 16 (ENR262).
- -
- cuando el gen de fusión es TEL-AML1, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 17 (ENF301), SEQ ID Nº 18 (ENPr341) y SEQ ID Nº 19 (ENR361)
- SEQ ID Nº 20 (ENF402), SEQ ID Nº 21 (ENP541) y SEQ ID Nº 22 (ENR561).
- -
- cuando el gen de fusión es BCR-ABL M-bcr, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 23 (ENF501), SEQ ID Nº 21 (ENP541) y SEQ ID Nº 22 (ENR561).
- -
- cuando el gen de fusión es SIL-TAL1, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 26 (ENF601), SEQ ID Nº 27 (ENP641) y SEQ ID Nº 28 (ENR664).
\newpage
- -
- cuando el gen de fusión es PML-RARA, las secuencias correspondientes de cebadores directos, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 29 (ENF903), SEQ ID Nº 30 (ENF906), SEQ ID Nº 31 (ENF905), SEQ ID Nº 32 (ENP942) y SEQ ID Nº 33 (ENR962).
- -
- cuando el gen de fusión es CBFB-MYH11, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebadores inversos del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 34 (ENF803), SEQ ID Nº 35 (ENPr843), SEQ ID Nº 36 (ENR862), SEQ ID Nº 37 (ENR863) y SEQ ID Nº 38 (ENR865).
- -
- cuando el gen de fusión es AML-ETO, las secuencias correspondientes de cebador directo, sonda y cebador inverso del mismo son respectivamente tal como sigue:
- SEQ ID Nº 39 (ENF701), SEQ ID Nº 40 (ENP747) y SEQ ID Nº 41 (ENR761).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias y las posiciones de estos
cebadores y sondas se facilitan en las tablas 5, 8, 11, 14, 17, 21,
24, 27 y 30.
En la realización más preferida del método de la
presente invención, la etapa (ii) de dicho método es tal como
sigue:
añadir 1 \mug de ARN total en 10 \mul de
H_{2}O;
incubar a 70ºC durante 10 min.;
\vskip1.000000\baselineskip
enfriar en hielo y añadir los siguientes
reactivos hasta un volumen final de 20 \mul:
Transcriptasa inversa (o bien de MMLV o
Superscript I o II): 100 U
Tampón RT (según la RTasa usada)
DNTP: 1 Mm
DTT: 10 Mm
Hexámeros aleatorios: 25 \muM
Inhibidor de ARNasa: 20 U
\vskip1.000000\baselineskip
Incubar posteriormente a:
Temperatura ambiente durante 10 min.;
42ºC durante 45 min.; y
99ºC durante 3 min.
Colocar la muestra a 4ºC tras la etapa de RT;
y
diluir el ADNc final con 30 \mul de
H_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa (iii) del método de la invención puede
ser tal como sigue:
volumen final: 25 \mul;
5 \mul de ADNc final (100 ng de equivalente de
ARN); cebadores: 300 nM cada uno;
sonda: 200 nM excepto para la sonda de
AML1-ETO (100 nM);
mezcla maestra: 12,5 \mul (1X)
\vskip1.000000\baselineskip
Incubar la muestra:
a 50ºC durante 2 min.; y
a 95ºC durante 10 min.;
\vskip1.000000\baselineskip
seguido por 50 ciclos:
95ºC durante 15 s; y
60ºC durante 1 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, la etapa (iv) del método de la
invención continúa tal como sigue:
fijar un umbral común a 0,1 excepto para
PML-RARA (0,05); y
fijar una línea base común entre el ciclo 3 y el
15, excepto para B2M (3-10).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describirá ahora en más
detalle con referencia a las siguientes tablas y a los dibujos
adjuntos en los que:
la figura 1 ilustra el principio de detección
mediante RQ PCR usando una sonda de hidrólisis (TaqMan^{TM}). a)
La sonda bifluorescente (R: indicador, Q: extintor) hibrida en la
secuencia de nucleótidos complementaria del molde durante la
reacción de PCR. b) La sonda se degrada durante la fase de extensión
mediante la enzima ADN polimerasa dando como resultado una
fluorescencia creciente detectada por la máquina en el tubo de
PCR;
la figura 2 ilustra la amplificación del
plásmido MLL (ex 10)-AF4 (ex 4) usando los conjuntos
de cebador y sonda de EAC. a) Gráficas de la amplificación (escala
de log_{10}) de cinco diluciones de plásmido de ADN (de 10^{6}
a 10 moléculas), b) curva patrón obtenida con las cinco diluciones
de plásmido;
la figura 3 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión E2A-PBX1 cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR (ENF101 -
ENP141 - ENR161). El número bajo los cebadores y la sonda se refiere
a sus posiciones de nucleótido en 5' en el transcrito de gen normal
(véase la tabla 5);
la figura 4 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para E2A-PBX1 en una
muestra de ARN negativa;
la figura 5 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión E2A-PBX1
entre BM (médula ósea) y PB (sangre periférica) en el diagnóstico
usando o bien ABL, B2M o bien GUS como gen de control. La razón
(NCN) se define como la razón entre el número de copias de
E2A-PBX1 por una copia del gen ABL o GUS y 100
copias del gen B2M. La mediana de los valores corresponde a la línea
en negrita. El recuadro se refiere al intervalo definido por los
percentiles 25º y 75º. Todas las diferencias entre BM y PB por gen
de control no son significativas en muestras apareadas (n = 10,
prueba de Wilcoxon). n: número de muestras de pacientes;
la figura 6 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión MLL-AF4 cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR. Se dispone
de dos conjuntos de RQ-PCR con una sonda común y un
cebador inverso común en el exón 5 de AF4 (ENR262 - ENP242). El
primer cebador usa un cebador directo en el exón 9 de MLL (ENF207)
y el segundo conjunto usa un cebador directo en el exón 10 de MLL
(ENF208). Los transcritos de FG MLL-AF4 que carecen
del exón 5 de AF4 no pueden amplificarse mediante los conjuntos de
EAC. Tomados juntos, los conjuntos cubren aproximadamente el 75% de
las variantes de MLL-AF4 o bien en pacientes
lactantes o bien en no lactantes (véase la frecuencia relativa en
el lado derecho del diagrama). El número bajo los cebadores y la
sonda se refiere a sus posiciones de nucleótido en 5' en el
transcrito de gen normal (véase la tabla 8);
la figura 7 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
un ARN de la línea celular RS4;11 en una muestra de ARN de PBMNC
negativa;
la figura 8 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión MLL-AF4
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. La razón (NCN) se define como la razón entre
el número de copias de MLL-AF4 por una copia del gen
ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los valores
corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. n: número de
muestras de pacientes;
la figura 9 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión TEL-AML1 cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR (ENF301 -
ENPr341 - ENR361). El número bajo los cebadores y la sonda se
refiere a sus posiciones de nucleótido en 5' en el transcrito de
gen normal (véase la tabla 11);
la figura 10 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para TEL-AML1 en una
muestra de ARN negativa;
la figura 11 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión TEL-AML1
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. La razón (NCN) se define como la razón entre
el número de copias de TEL-AML1 por una copia del
gen ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los valores
corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. Todas las
diferencias entre BM y PB por gen de control no son significativas
en muestras apareadas (n = 23, prueba de Wilcoxon). n: número de
muestras de pacientes;
la figura 12 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión BCR-ABL cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR. Para
m-bcr, el conjunto: ENF402 - ENP541 - ENR561 y para
M-bcr, el conjunto: ENF501 - ENP541 - ENR561. El
número bajo los cebadores y la sonda se refiere a sus posiciones de
nucleótido en 5' en el transcrito de gen normal (véase la tablas 14
y 17). La frecuencia relativa se refiere a la proporción del
transcrito e1-a2 entre las variantes de
m-bcr y la proporción de los transcritos
b3-a2 y b2-a2 entre las variantes de
M-bcr;
la figura 13 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para BCR-ABL
m-bcr en una muestra de ARN negativa;
la figura 14 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión BCR-ABL
m-bcr entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien
ABL, B2M o bien GUS como gen de control. La razón (NCN) se define
como la razón entre el número de copias de BCR-ABL
m-bcr por una copia del gen ABL o GUS y 100 copias
del gen B2M. La mediana de los valores corresponde a la línea en
negrita. El recuadro se refiere al intervalo definido por los
percentiles 25º y 75º. n: número de muestras de pacientes;
la figura 15 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para BCR-ABL
M-bcr en una muestra de ARN negativa;
la figura 16 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión BCR-ABL
M-bcr entre BM y PB usando o bien ABL, B2M o bien
GUS como gen de control. a) En muestras de CML, b) en muestras de
ALL. La razón (NCN) se define como la razón entre el número de
copias de BCR-ABL M-bcr por una
copia del gen ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los
valores corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere
al intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. n: número de
muestras de pacientes;
la figura 17 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión BCR-ABL
entre m-bcr ALL, M-bcr ALL y
M-bcr CML en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o
bien GUS como gen de control. PB y BM se reunieron según cada grupo
para comparar la expresión del gen de fusión BCR-ABL
entre m-bcr ALL, M-bcr ALL y
M-bcr CML. No se observó ninguna diferencia
significativa entre m-bcr y M-bcr
ALL con el gen de control o bien B2M o bien GUS (prueba de
Mann-Whitney). Se encontró una diferencia altamente
significativa entre muestras de ALL (n = 41) y CML (n = 29)
positivas para BCR-ABL con el gen de control o bien
B2M o bien GUS (prueba de Mann-Whitney). n: número
de muestras de pacientes;
la figura 18 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión SIL-TAL1 cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR (ENF601 -
ENP641 - ENR664). El número bajo los cebadores y la sonda se refiere
a sus posiciones de nucleótido en 5' en el transcrito de gen normal
(véase la tabla 21);
la figura 19 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para SIL-TAL1 en una
muestra de ARN negativa;
la figura 20 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión SIL-TAL1
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. La razón (NCN) se define como la razón entre
el número de copias de SIL-TAL1 por una copia del
gen ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los valores
corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. Todas las
diferencias entre BM y PB por gen de control no son significativas
en muestras apareadas (n = 5, prueba de Wilcoxon). n: número de
muestras de pacientes;
la figura 21 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión PML-RARA cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR. Se dispone
de tres conjuntos para cubrir todas las variantes del transcrito
PML-RARA. Se usan una sonda común (ENP942) y un
cebador inverso común (ENR962) en el exón 3 del gen RARA. Las
variantes BCR1, BCR2 y BCR3 se amplifican respectivamente con los
cebadores directos ENF903, ENF906 y ENF905. La frecuencia relativa
de cada transcrito particular aparece en el lado derecho del
diagrama. El número bajo los cebadores y la sonda se refiere a sus
posiciones de nucleótido en 5' en el transcrito de gen normal (véase
la tabla 24);
la figura 22 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para PML-RARA BCR1 en
una muestra de ARN negativa;
\newpage
la figura 23 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión PML-RARA
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. La razón (NCN) se define como la razón entre
el número de copias de PML-RARA por una copia del
gen ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los valores
corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. Todas las
diferencias entre BM y PB por gen de control no son significativas
en muestras apareadas (n = 6, prueba de Wilcoxon) excepto para NCN
de B2M (p=0,03). n: número de muestras de pacientes;
la figura 24 es un diagrama esquemático de los
transcritos de gen de fusión CBFB-MYH11 cubiertos
por el conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR. a)
Tipo A: conjunto ENF803 - ENPr843 - ENR862, b) Tipo D: conjunto
ENF803 - ENPr843 - ENR863, c) Tipo E: conjunto ENF803 - ENPr843 -
ENR865. La frecuencia relativa de cada transcrito particular
aparece en el lado derecho del diagrama. El número bajo los
cebadores y la sonda se refiere a sus posiciones de nucleótido en
5' en el transcrito de gen normal (véase la tabla 27);
la figura 25 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para CBFB-MYH11 en una
muestra de ARN negativa: a) fijar el tipo A en la línea celular
ME-1, b) fijar el tipo D en la muestra del paciente,
c) fijar el tipo E en la muestra del paciente;
la figura 26 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión CBFB-MYH11
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. Las muestras se reunieron según su origen (BM
o PB), independientemente del tipo de transcrito. La razón (NCN) se
define como la razón entre el número de copias de
CBFB-MYH11 por una copia del gen ABL o GUS y 100
copias del gen B2M. La mediana de los valores corresponde a la
línea en negrita. El recuadro se refiere al intervalo definido por
los percentiles 25º y 75º. n: número de muestras de pacientes;
la figura 27 es un diagrama esquemático del
transcrito de gen de fusión AML1-ETO cubierto por el
conjunto de cebador y sonda de RQ-PCR. Códigos de
EAC (ENF701, ENP747, ENR761). El número bajo los cebadores y la
sonda se refiere a sus posiciones de nucleótido en 5' en el
transcrito de gen normal (véase la tabla 30). La sonda se ubica en
el punto de rotura;
la figura 28 ilustra las gráficas de
amplificación de diluciones de 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4} de
una muestra de ARN positiva para AML1-ETO en una
muestra de ARN negativa. a) Gráfica de amplificación clásica. b)
Fenómeno de curva de aumento gradual ("creeping curve")
observado en muestras de NAC;
la figura 29 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de gen de fusión AML1-ETO
entre BM y PB en el diagnóstico usando o bien ABL, B2M o bien GUS
como gen de control. La razón (NCN) se define como la razón entre
el número de copias de AML1-ETO por una copia del
gen ABL o GUS y 100 copias del gen B2M. La mediana de los valores
corresponde a la línea en negrita. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. Todas las
diferencias entre BM y PB por gen de control no son significativas
en muestras apareadas (n = 10, prueba de Wilcoxon). Sin embargo, no
se recomienda el uso del gen GUS debido al gran intervalo de
valores observados para la razón AML1-ETO/GUS. n:
número de muestras de pacientes;
la figura 30 ilustra la influencia de las etapas
de pre-PCR en la cuantificación del transcrito del
gen ABL de cuatro muestras codificadas sometidas a prueba en 11
laboratorios asignados aleatoriamente durante el ensayo
aleatorizado equilibrado (fase IIIb, red de
PML-RARA). a) No hay diferencia significativa entre
las muestras codificadas usando un modelo lineal global, b)
diferencia altamente significativa entre laboratorios para las
mismas muestras. Líder de red que envía las muestras codificadas a
otros laboratorios. La dilución de 10^{-1} se excluyó del
análisis porque no podía considerarse idéntica a las otras cuatro.
Las muestras diluidas 10^{-3} y 10^{-4} también aparecen en las
figuras 31
y 32;
y 32;
la figura 31 ilustra los resultados por
laboratorio de la amplificación del transcrito de gen de fusión
PML-RARA en tres muestras codificadas durante el
ensayo aleatorizado equilibrado (fase IIIb). a) Valor de Ct del
transcrito de FG. b) NCN de ABL del transcrito de FG de las 3
muestras codificadas. Las diluciones fueron dilución 10^{-1}
(\blacksquare), 10^{-3} (\ding{115}) y 10^{-4} (\bullet)
de ARN de NB-4 en una muestra de ARN negativa. El CG
mejoró enormemente la linealidad de los resultados (véase también
la figura 32). Las muestras diluidas 10^{-3} y 10^{-4} también
aparecen en la figura 30.
La figura 32 es un diagrama esquemático de los
resultados obtenidos durante el ensayo aleatorizado equilibrado
(fase IIIb) dentro de la red de PML-RARA. Se
analizaron tres muestras positivas para PML-RARA
codificadas: 10^{-1} (eje Y = 4), 10^{-3} (eje Y = 2) y
10^{-4} (eje Y = 1) en 11 laboratorios diferentes. Resultados
mostrados en el eje X: a) el valor de Ct o b) la razón
PML-RARA/ABL de cada muestra codificada según la
dilución. Estas muestras son idénticas a las que aparecen en las
figuras 30 y 31. El coeficiente de correlación r y la curva de
regresión calculados a partir de estas muestras aparecen en la
figura. Con el fin de comparar ambas figuras, se usó una escala
idéntica para el eje X. Se ha realizado el mismo análisis para cada
red de FG durante la fase IIIb para los valores de Ct y delta Ct y
CN y NCN. Los resultados aparecen en la tabla 33;
la figura 33 ilustra la comparación de la
expresión del transcrito de FG en muestras leucémicas en el
diagnóstico. a) Usando ABL como gen de control, b) usando B2M como
gen de control, c) usando GUS como gen de control. La razón (NCN)
se define como la razón entre el número de copias del transcrito de
FG por una copia del transcrito del gen ABL o GUS o 100 copias del
transcrito del gen B2M. La mediana de los valores corresponde a la
línea en negrita. El recuadro se refiere al intervalo definido por
los percentiles 25º y 75º. Se reunieron las muestras de BM y PB por
transcrito. n: número de muestras de pacientes para cada transcrito
particular;
la figura 34 ilustra un diagrama esquemático de
los tres transcritos de CG seleccionados cubiertos por los
conjuntos de RQ-PCR de EAC. Conjunto de EAC de ABL:
ENF1003, ENPr1043, ENR1063, conjunto de EAC de B2M: conjunto de
ENF1302, ENPr1342, ENR1362 y conjunto de EAC de GUS: ENF1102,
ENPr1142, ENR1162. El número bajo los cebadores y las sondas se
refiere a sus posiciones de nucleótido en 5' en el transcrito de gen
(véase la tabla 37).
ENF = cebador directo, ENPr = sonda inversa TaqMan, ENR = cebador inverso;
ENF = cebador directo, ENPr = sonda inversa TaqMan, ENR = cebador inverso;
la figura 35 ilustra la optimización de la
reacción del ADNc para RQ-PCR. a) Efecto de la
concentración de transcriptasa inversa (RT) sobre la
RT-RQ-PCR. Se sometieron a
transcripción inversa siete alícuotas de ARN de la línea celular
K562 para dar ADNc usando cebador aleatorio 25 mM y diluciones de
dos veces de 0,5-32 U de RT de MMLV por microlitro
de reacción de ADNc. Se llevó a cabo la PCR TaqMan usando conjuntos
de cebadores para B2M, GAPDH, ABL y BCR-ABL en cada
ADNc y se representaron los valores promedio de CT de los cuatro
genes diana en cada ADNc frente a la concentración de RT. b)
Comparación de diferentes tipos de cebador de ADNc en ARN de K562:
Mezcla de cebadores específicos del gen diana (1 mM cada uno),
cebadores de hexámeros aleatorios (25 mM), un cebador de
oligo(dT) (5 mM) y sin cebador. c) Efecto de la concentración
de cebador sobre el rendimiento de ADNc. Se sometieron a
transcripción inversa alícuotas de ARN de las líneas celulares K562
y REH usando 5 U de RT de MMLV por microlitro de reacción de ADNc y
cebador de hexámeros aleatorios 1-125 mM. Se
monitorizaron los rendimientos de ADNc mediante PCR TaqMan usando
B2M, GAPDH y ABL. Se representaron los Ct promedio de los tres
genes diana en cada ADNc frente a la concentración de cebador;
la figura 36 ilustra la reproducibilidad entre
laboratorios de la síntesis del ADNc evaluada mediante la
amplificación del transcrito del gen B2M. Se prepararon
centralmente (laboratorio n.º1) diluciones de diez veces de ARN de
la línea celular RS4;11 en ARN de E. coli y se distribuyeron
las alícuotas en nieve carbónica a los laboratorios miembros del
grupo de CG. Cada laboratorio realizó la síntesis del ADNc y el
análisis de TaqMan. Se observaron resultados similares para los
transcritos de los genes ABL y GUS;
la figura 37 ilustra la variación en la
expresión de CG en muestras de PB normales. Se analizaron PBMNC
(células mononucleares de sangre periférica) de 30 donantes
normales con los conjuntos de RQ-PCR específicos de
los genes CYC, GUS, TBP, ABL y B2M. Cada línea representa los datos
de una muestra;
la figura 38 ilustra la comparación de la
expresión de los tres transcritos de CG en 310 muestras recientes
normales y leucémicas: a) ABL, b) B2M y c) GUS. Para muestras
normales, el análisis se realizó según el tejido (BM, PB o PBSC);
se encontraron niveles de expresión comparables entre PB y PBSC para
el transcrito del gen B2M y entre BM y PBSC para el transcrito del
gen GUS tras el análisis de comparaciones múltiples a
posteriori. En la esquina superior derecha, el resultado del
modelo lineal global realizado según el tipo de muestra (normal,
ALL, AML o CML) y el tejido. La línea en negrita corresponde a la
mediana de los valores. El recuadro se refiere al intervalo
definido por los percentiles 25º y 75º. Se realizó un análisis
similar con muestras leucémicas archivadas (véanse los
resultados);
la figura 39 ilustra la comparación de la
expresión de los tres transcritos de CG en muestras leucémicas
archivadas en el diagnóstico según el FG. a) ABL, b) B2M, c) GUS.
Se combinaron los datos de las muestras de BM y PB por transcrito
de FG. En la esquina superior derecha, el resultado del modelo
lineal global según el transcrito de FG. La línea en negrita
corresponde a la mediana de los valores. El recuadro se refiere al
intervalo definido por los percentiles 25º y 75º. En la red de
TEL-AML1, sólo se sometieron a prueba 30 de 57
muestras para determinar la expresión del transcrito de GUS;
la figura 40 ilustra la correlación entre los
tres CG seleccionados de EAC. a) En muestras recientes normales, b)
en muestras de leucemia. Los resultados aparecen globalmente más
extendidos en las muestras de leucemia en comparación con las
muestras normales. Esta observación podría estar relacionada con el
aumento del número de muestras (184 frente a 126) y laboratorios
(14 frente a 6) incluidos, y a una heterogeneidad eficaz de la
expresión de CG; y
la figura 41 ilustra la monitorización
longitudinal de MRD de un paciente positivo para
MLL-AF4 usando los conjuntos de
RQ-PCR ABL y MLL-AF4 de EAC. El
tiempo 0 era el diagnóstico, el tiempo 12 era la recidiva
citológica. En valor en el diagnóstico es 1 (100%) y los resultados
positivos de FG posteriores se expresan con respecto a la muestra
de diagnóstico. Cuatro meses tras el diagnóstico, la muestra de PB
se degradó claramente (valor de Ct de ABL: 32,3, CN de ABL: 257).
Aunque el resultado aparece en la figura, debe tenerse cuidad en la
interpretación de este resultado negativo. El cálculo se realizó
según los métodos de \Delta\DeltaCt y NCN encontrados en la
tabla 40. Ambos métodos de cálculo conducen a resultados similares
tanto para el valor de MRD como para la sensibilidad, por
consiguiente sólo se muestra un gráfico.
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El objetivo de las fases I y II era la selección
inicial de cebadores y sondas además de la formación de los
miembros.
Durante la fase IIIa, se compararon diferentes
curvas patrón (es decir, generadas usando plásmidos de ARN, ADNc o
ADN) y se realizó la validación final de los conjuntos de
cebador/sonda seleccionados dentro de redes específicas. En
paralelo, los inventores realizaron su primera ronda de control de
calidad (QC1).
Durante la fase IIIb, todos los laboratorios
implicados emprendieron pruebas de los conjuntos de cebador/sonda
para FG seleccionados, en muestras de control de calidad codificadas
preparadas centralmente (QC2). Estas pruebas de las dianas del
transcrito de FG se realizaron por laboratorios seleccionados
aleatoriamente fuera de las redes del transcrito de FG
originales.
Durante la fase IVa, se realizó la tercera ronda
de control de calidad (QC3) incluyendo muestras de ARN de línea
celular no diluidas.
Durante la fase IVb, se determinaron los valores
de referencia de los niveles del transcrito de FG normalizados en
muestras de pacientes y líneas celulares leucémicas usando el
conjunto de cebador/sonda de EAC según el protocolo normalizado de
EAC.
Además, se establecieron intervalos de
referencia para los genes de control en sangre periférica (PB),
médula ósea (BM) y células madre de PB normales en muestras
recientes.
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Las tecnologías de RQ-PCR
disponibles en la actualidad permiten la detección de la emisión de
fluorescencia durante la reacción de PCR a partir de una
(TaqMan^{TM}) o dos (Light Cycler) sondas de oligonucleótido
internas, o un colorante fluorescente; siendo la fluorescencia
detectada proporcional a la cantidad de diana presente en la
muestra 7.
Se decidió ejecutar el protocolo de EAC usando
la plataforma ABI 7700 con sondas TaqMan puesto que ésta era la
primera tecnología de RQ-PCR robusta disponible que
permitía el análisis de un gran número de muestras en una única
ejecución (formato de placa de 96 pocillos). El ensayo de la
nucleasa 5' (tecnología de TaqMan) usa una única sonda de
oligonucleótido interna que lleva un fluoróforo indicador en 5' (por
ejemplo FAM) y un fluoróforo extintor en 3' (por ejemplo TAMRA).
Durante la fase de extensión, la sonda TaqMan se hidroliza mediante
la actividad nucleasa de la Taq polimerasa, dando como resultado la
separación de los fluorocromos indicador y extintor y en
consecuencia un aumento en la fluorescencia (figura 1). En la
tecnología TaqMan, el número de ciclos de PCR necesarios para
detectar una señal por encima del umbral se denomina umbral de
ciclo (Ct) y es directamente proporcional a la cantidad de diana
presente al comienzo de la reacción (figura 2a). El \DeltaRn
corresponde al aumento en la intensidad de fluorescencia cuando se
alcanza la fase de meseta. Usando patrones o calibradores con un
número de moléculas conocido, puede establecerse una curva patrón y
determinarse la cantidad precisa de diana presente en la muestra de
prueba (figura 2b). La pendiente teórica de la curva patrón es
-3,32 para una reacción de PCR con eficacia máxima. Usando una
cantidad conocida de moléculas de ADN para la curva patrón, el
punto de ordenada en el origen del eje Y define el numero de ciclos
teóricamente necesarios para detectar una molécula.
Se diseñaron ensayos para detectar nueve genes
de fusión asociados con la leucemia, incluyendo sus variantes de
punto de rotura más comunes que dan lugar a 15 dianas de ARN:
E2A-PBX1, MLL-AF4 (exón 9 - exón 5,
exón 10 - exón 4 y exón 11 - exón 5 variantes),
TEL-AML1, BCR-ABL
(M-bcr y m-bcr),
SIL-TAL1, PML-RARA (bcr1, bcr2 y
bcr3), CBFB-MYH11 (tipo A, D y E) y
AML1-ETO.
Además, se evaluaron 14 genes constitutivos para
determinar su idoneidad para servir como genes de control para las
variaciones de calidad de una muestra a otra y la cuantificación de
la expresión génica. Finalmente se seleccionaron tres genes de
control (ABL, B2M y GUS); los inventores analizaron la expresión del
gen ABL durante las fases II-III y los tres genes
de control seleccionados (ABL, B2M y GUS) durante fase IV.
Se diseñaron cebadores y sondas usando el
software Primer Express (Applied Biosystems) basándose en su
ubicación en dos exones separados y en la secuencia del amplicón
generado por los conjuntos de cebador descritos en el programa
BIOMED-1 (5). Se representan en el diagrama
esquemático de la estructura de exón/intrón del FG correspondiente
(véanse los ejemplos 1-9). Durante los dos primeros
encuentros se realizó una selección inicial de cebadores y sondas;
se evaluaron conjuntos recién diseñados para cada diana molecular,
así como conjuntos "internos" ya disponibles procedentes de
laboratorios experimentados. La selección de los conjuntos se basó
en: 1) la ausencia de artefactos de amplificación no específicos; 2)
una buena eficacia con una pendiente próxima a -3,32 (eficacia
teórica del 100%); 3) una buena sensibilidad (al menos dilución
10^{-4} de ARN o 100 copias para dilución de plásmido); 4) la
robustez de la reacción con un valor de \DeltaRn >1,0 en la
fase de meseta para las diluciones más altas (tabla 4). Tales
resultados tenían que alcanzarse en al menos el 80% de los
laboratorios participantes para que se seleccionara un conjunto de
cebador/sonda particular. Los posibles conjuntos de cebador/sonda
se sometieron a prueba en paralelo en diluciones en serie de líneas
celulares y plásmidos, y se seleccionó el conjunto con el mejor
perfil de rendimiento, particularmente en lo que se refiere a la
sensibilidad. Si ninguno de los conjuntos de cebador/sonda
satisfacía los criterios de selección, se diseñaban y evaluaban
nuevos conjuntos. Globalmente, partiendo de 47 conjuntos de cebador
y de 44 sondas que se sometieron a prueba durante las primeras
fases, finalmente se seleccionaron 12 conjuntos de cebador y nueve
sondas para las 15 dianas (véanse los diagramas en cada sección de
los ejemplos). En cada caso, la sensibilidad del análisis de
RQ-PCR basado en TaqMan parecía ser comparable al
análisis de RT-PCR anidada previamente normalizado
(5). En el gen BCR, aparece Y (citidina o timidina) en el cebador de
BCR en la posición 3188, según el polimorfismo recientemente
descrito.
En la selección de CG inicial, se usó una placa
de control endógeno humano previamente desarrollada (facilitada
amablemente por Applied Biosystems) que contenía conjuntos de
cebador y sonda para 11 CG, tal como recomendaba el fabricante
(tabla 36). Se analizaron seis conjuntos de cebador y sonda para CG
adicionales, diseñados por laboratorios de EAC: un conjunto de EAC
y uno interno para Abelson (ABL), un conjunto interno para
beta-2-microglobulina (B2M), dos
conjuntos de EAC para porfobilinógeno desaminasa (PBGD y PBGD2) y un
conjunto interno para el factor de transcripción IID (TBP) (tabla
36). Tras la selección, el número de CG se redujo finalmente a tres,
que se sometieron a análisis adicional (figura 34 y tabla 37). Se
diseñaron cebadores y sondas de oligonucleótidos empleando el
programa Primer Express 1.0 (Applied Biosystems) y el programa Oligo
6 (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO, EE.UU.). Los
conjuntos de cebador y sonda también se sometieron a prueba usando
100 ng de ADN genómico por PCR para confirmar que los ensayos eran
específicos para ADNc.
Se prepararon muestras de ARN y/o ADNc
centralmente por los líderes de la red de FG (tabla 1) y se
distribuyeron en nieve carbónica a los miembros de sus redes
respectivas durante las fases I a IVa. Se usó comúnmente ARN de
línea celular positiva para el transcrito de FG (véase la tabla 1
para comprobar las líneas celulares específicas), excepto para los
transcritos de FG poco frecuentes (PML-RARA bcr2 y
bcr3 y CBFB-MYH11 tipo D y E) para los que el líder
de red facilitó el ARN del paciente. Estas muestras de ARN se
diluyeron en ARN de linfocitos de PB (PBL) o ARN de línea celular
negativa para el transcrito de FG. Las líneas celulares se
adquirieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania), ATCC (Manassas, VA,
EE.UU.) o se facilitaron directamente por laboratorios académicos
(TOM-1, ME-1 y PF382) y se pusieron
en cultivo según las instrucciones de proveedor. Durante la fase
III, los laboratorios líderes de la red prepararon series de
diluciones equivalentes de ADNc. Durante la fase IVb, los ARN de
las muestras de los pacientes, positivos para el transcrito de FG
relevante, y que se habían almacenado durante menos de 18 meses, se
analizaron localmente no diluidos y/o diluidos en una disolución de
1 \mug/\mul de ARNr 16S y 23S de E. coli (Roche, Meylan,
Francia) por duplicado.
Se amplificaron los productos de PCR de los
transcriptos de genes ABL, B2M y GUS para la preparación de
plásmidos respectivamente con ABL-F
(5'-CCT TCA GCG GCG AGT AGC-3') y
ABL-R (5'-GGA CAC AGG CCC ATG GTA
C-3'), B2M-F
(5'-CCT TGA GGC TAT CCA GCG T-3') y
B2M-R (5'-CCT GCT CAG ATA CAT CAA
ACA TG-3') y GUS-F
(5'-CCT GTG ACC TTT GTG AGC AA-3')
y GUS-R (5'-GTC TGC CGT GAA CAG TCC
A-3'). Se usaron las condiciones de PCR de la acción
concertada BIOMED-1.(5) El protocolo para la
clonación y preparación de diluciones de plásmido ya se ha dado a
conocer. Para los plásmidos de ABL y GUS, se usaron tres diluciones
(10^{5}, 10^{4} y 10^{3} copias en 5 \mul) para calcular la
curva patrón. Para el plásmido de B2M, se usaron tres diluciones
diferentes (10^{7}, 10^{6} y 10^{5} copias en 5 \mul). Los
coeficientes de variación correspondientes para los valores de Ct
eran inferiores al 4% (ABL), 5% (B2M) o 3% (GUS) para todas las
diluciones (datos de todas las fases).
A partir de sangre periférica (PB) heparinizada,
médula ósea (BM) y células madre de PB (PBSC), se obtuvieron
células mononucleares (MNC) mediante centrifugación en gradiente de
densidad Ficoll-Hypaque. Todas las tomas de
muestras de los pacientes se realizaron según los protocolos
aprobados por los comités éticos locales de las instituciones dadas
y/o las áreas geográficas. La línea celular RS4;11 se hizo crecer en
medio RPMI1640 con suero bovino fetal al 10% y se recogió en la
fase de crecimiento exponencial. El ARN se extrajo mediante métodos
habituales en los laboratorios participantes empleando o bien un
reactivo TRIzol (Invitrogen, Cergy, Francia), un reactivo RNAzol
(Biotech Italia, Roma, Italia) o un sistema basado en columna
(Qiagen, Hilden, Alemania) según las recomendaciones del
fabricante. Tras la extracción y el aislamiento, se determinó la
concentración de ARN mediante la medición la densidad óptica a 260
nm y el ARN se almacenó a -80ºC hasta su uso.
\newpage
Se generaron productos de PCR de los 15
transcritos de FG diferentes a partir de ARN de línea celular o de
pacientes mediante RT-PCR usando los cebadores A y B
de BIOMED-1, tal como se describió anteriormente.
(5) Los productos de PCR se clonaron en vector PCR II TOPO
(Invitrogen, Groningen, Países Bajos). Los clones de plásmido
seleccionados se secuenciaron para la confirmación de su inserto
(Genome Express, Grenoble, Francia). Tras la producción en masa
posterior, los plásmidos se extrajeron usando el kit QIAFILTER
Plásmido MIDI (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) y se cuantificaron
mediante espectrofotometría. Se estimó el número de copias para 1
\mug según el peso molecular del vector y el inserto. Entonces se
linearizaron 20 \mug de plásmido con las enzimas de restricción
BamHI o HindIII durante 1 h a 37ºC con agitación. El plásmido
digerido se diluyó en serie en una disolución de Tris 10 mM, EDTA 1
mM pH 8, que contenía 20 ng/\mul de ARNr 16S y 23S de E.
coli (Roche). Se prepararon cinco diluciones sucesivas (200.000,
20.000, 200, 20 y 2 copias por microlitro). La curva patrón
correspondiente generó una pendiente media de -3,45 y una ordenada
en el origen de 39,8\pm1 Ct. Se obtuvo un valor de Ct medio de
22,51 para la dilución de 20.000 copias/\mul.
Se estableció un protocolo de EAC común para
todas las dianas moleculares (transcritos de FG y CG) durante las
fases I y II y luego se usaron por cada laboratorio durante la
totalidad de las fases III y IV (tabla 4).
Esta reacción se adaptó del protocolo de
BIOME-1.24 Partiendo de un \mug de ARN total, las
principales modificaciones implicaron la alteración de las
concentraciones de hexámeros aleatorios (25 \muM) y de la
transcriptasa inversa (100 U) o bien de MMLV o bien Superscript
(Invitrogen; Roche), lo que mejoró significativamente la
sensibilidad del ensayo.
Todas las reacciones de RQ-PCR
se llevaron a cabo en una plataforma 7700 ABI (Applied Biosystems,
Foster City, EE.UU.) usando cebadores y sondas TaqMan facilitadas
amablemente por Applied Biosystems conjuntamente con la mezcla
maestra TaqMan Universal adquirida del mismo fabricante. El número
de ciclos de amplificación fue de 50 (el protocolo detallado se
describe en la tabla 3).
Con el fin de optimizar los resultados y ahorrar
costes, la fase II implicaba la evaluación de la influencia de las
concentraciones de cebador y sonda (900 y 300 nM para los cebadores
y 200 y 100 nM para las sondas) y el volumen de reacción (50 \mul
frente a 25 \mul) en la sensibilidad del ensayo.
Tras exhaustivas pruebas dentro de redes de FG
usando diluciones en serie de ARN de línea celular positiva para FG
en ARN negativo para FG (de 10^{-1} a 10^{-5}) y plásmido (de
10^{6} a 10 copias), se obtuvieron resultados óptimos usando un
volumen de 25 \mul, con una concentración de 300 nM de cebadores y
de 200 de sonda, excepto para AML1-ETO para el que
se eligió una sonda 100 nM (véase el ejemplo 9).
Para el análisis de datos comparativos, se
seleccionó un conjunto umbral común a 0,1 con el fin de estar en la
fase exponencial. Un valor umbral de este tipo normalmente se
encuentra por encima de las denominadas "curvas de aumento
gradual" que se observaban en raras ocasiones en algunos
controles negativos; definiéndose las "curvas de aumento
gradual" como la curva de amplificación a partir de una muestra
negativa que surge lentamente durante la reacción de PCR. Aunque el
mecanismo que subyace a este último fenómeno no está completamente
claro, el examen de la vista de "múltiples componentes" revela
que no es indicativo de amplificación específica (véase más
adelante). Sin embargo, para PML-RARA el umbral se
fijó a 0,05 debido a la fase exponencial relativamente corta de la
amplificación por PCR (bajo \DeltaRn). La línea base se calculó a
partir de los ciclos 3 a 15 (para ABL y GUS) excepto para los genes
de control de expresión alta en los que se usaron los ciclos 3 a 10
(para B2M). Adicionalmente, los inventores usaron diluciones de ARN
positivo (de pacientes o líneas celulares) en PBL normales o un ARN
de línea celular negativa para FG (de 10^{-1} a 10^{-6}) durante
las fases I a IIIa y series de diluciones idénticas usando ADNc
durante la fase IIIa.
Se realizó una comparación entre las curvas
patrón de ARN, ADNc y plásmido con el fin de determinar la
influencia de la etapa de RT en los resultados (pendiente de la
curva patrón, sensibilidad y reproducibilidad) para cada
laboratorio. Los líderes de red de FG enviaron a los laboratorios
diferentes dentro de su red diana (de 4 a 12 miembros, véase la
tabla 1) diluciones en serie preparadas centralmente de ARN de línea
celular positiva para el transcrito de FG y los ADNc
correspondientes, además de diluciones en serie del plásmido de
control de FG correspondiente (200.000, 20.000, 200, 20 y 2 copias
por \mul).
QC1 (fase IIIa) y QC3 (fase IVa) se llevaron a
cabo por laboratorios específicos (tabla 1) mientras que QC2 (fase
IIIb) implicó a laboratorios elegidos aleatoriamente (véase la
sección de ensayo aleatorizado equilibrado).
Los controles positivos en todos los
experimentos y rondas de QC se referían a muestras de pacientes y
líneas celulares bien definidas (tablas 1 y 2). Se usaron dos tipos
de controles negativos: 1) muestras de ARN negativas para FG
codificadas y 2) controles negativos conocidos para comprobar la
contaminación de productos de PCR. Estos últimos controles de
contaminación se referían a controles sin amplificación (NAC), que
contenían ARN de E. coli en lugar de ADNc humano, y
controles sin molde (NTC), que contenían agua en lugar de ADNc
humano. Particularmente, se consideró que los controles negativos
NAC y NTC eran de la mayor importancia para la identificación de
contaminación cruzada de productos de PCR, porque este problema se
subestima con frecuencia.
Un pocillo positivo se definió como una
amplificación sigmoidea (escala logarítmica) con un valor de Ct
inferior al valor de Ct en la ordenada en el origen Y de la curva
patrón del plásmido + un Ct. La amplificación en muestras de ARN
del FG se realizó por triplicado y por duplicado para la expresión
de CG. Se definió una muestra falsa negativa como una muestra de
ARN positiva con menos del 50% de pocillos positivos (0/2, 0/3 ó
1/3). Se definió un resultado falso positivo como una muestra
negativa, con al menos el 50% de pocillos positivos (1/2, 2/3 ó
3/3).
Los criterios para la sensibilidad y la
reproducibilidad se definieron durante los experimentos de QC
mediante muestras codificadas para cada transcrito de FG (tabla 4).
Se supuso que un experimento era reproducible para una dilución
particular si más del 80% de los laboratorios detectaban al menos
dos pocillos positivos con una diferencia de Ct inferior a 1,5 Ct.
La sensibilidad del experimento se definió como la última dilución
que mostraba al menos el 50% de pocillos positivos en más del 80% de
los laboratorios, cualesquiera que fueran los valores de Ct.
Este ensayo se diseñó por el Departamento de
Información Médica (Marsella, Francia). El objetivo era evaluar
hasta qué punto los resultados de RQ-PCR eran
comparables entre los laboratorios para la cuantificación de MRD de
transcritos de FG en un entorno clínico según el protocolo de EAC.
El estudio se centró en dos puntos principales: 1) comparación de
los resultados entre laboratorios para un transcrito de FG
particular, lo que es crucial para los estudios multicéntricos y 2)
la linealidad de la metodología de RQ-PCR en
experimentos de dilución, lo que es importante para evaluar la
carga tumoral potencial durante el tratamiento. El ensayo
aleatorizado equilibrado parecía ser un estudio estadístico
apropiado para evaluar estos dos puntos sin realizar todos los
análisis de RQ-PCR (n = 15) en cada laboratorio
participante (n = 25).
Los estadísticos asignaron aleatoriamente los 25
laboratorios participantes a nueve redes. Se sometió a prueba cada
uno de los nueve transcritos de FG principales en 11 laboratorios
(excepto para la red de CBFB-MYH11, n = 12),
incluyendo el líder de red del transcrito de FG implicado,
constituyendo un total de 100 experimentos de
RQ-PCR. Cada laboratorio sometió a prueba cinco
muestras codificadas para cuatro dianas diferentes constituyendo un
total de 500 muestras codificadas analizadas en este estudio de QC2
(tabla 2). Los ARN de control positivos para el transcrito de FG se
diluyeron (diluciones 10^{-1}, 10^{-3} y 10^{-4}) en una
muestra de ARN negativa (HL60 o PBL).
Se usó un diseño de placa común; el gen de
control (ABL), el transcrito de FG y las diluciones de plásmido
(ABL n = 3, FG n = 5) se amplificaron por triplicado, mientras que
se ejecutaron cuatro controles negativos (NAC y NTC para las dianas
de ABL y FG) por duplicado. Los datos sin procesar se recopilaron y
se analizaron por cada líder de red de FG. Se diseñaron hojas de
cálculo de Excel comunes para recopilar los resultados dentro de
cada red de FG y luego se enviaron a Marsella para el posterior
análisis estadístico (véase más adelante). El único criterio de
exclusión para las muestras de ARN codificadas fue un valor de Ct de
ABL fuera del intervalo normal [22-29,3] tal como
se define por ensayos realizados dentro de la red de CG durante la
fase IIIa.
Para someter a prueba los 14 CG candidatos (17
conjuntos de cebador y sonda), se obtuvieron datos i) de placa de
control endógeno de ABI, ii) conjuntos internos y iii) conjuntos de
cebador y sonda de EAC recién diseñados. Para la placa de control
endógeno de ABI, cinco laboratorios sometieron a prueba un total de
65 muestras archivadas diferentes: 22 muestras de PBMNC normales,
15 de ALL (4 de PB/11 de BM), 15 de CML (10 de PB/5 de BM) y 13 de
AML (5 de PB/8 de BM) obtenidas en el diagnóstico. Este número se
redujo a 53 para TFRC (para un laboratorio se perdieron
parcialmente los datos) y a 21 para el ARNr 18S (datos disponibles
de un laboratorio únicamente). Se esperaba un mínimo de cuatro
muestras de PB normales y cuatro muestras leucémicas por
laboratorio. Para los conjuntos de cebador y sonda internos para
ABL, B2M y TBP, se sometieron a prueba 20 muestras en un
laboratorio: se sometieron a prueba 4 muestras de PBMNC normales, 3
de ALL, 7 de AML y 6 de CML. Para cada conjunto de ABL, PBGD y
PBGD2 de EAC, se sometieron a prueba 36 muestras: 4 de PBMNC, 11 de
ALL, 7 de AML y 14 de CML en dos laboratorios. Los resultados
apareados obtenidos con dos conjuntos de cebador diferentes para el
mismo CG (un laboratorio únicamente) estuvieron disponibles para
tres CG: ABL (n = 20), B2M (n = 12) y TBP (n = 12). Todos estos
experimentos se llevaron a cabo antes de haber optimizado la etapa
de RT y antes de establecer un umbral común para el análisis de los
datos.
En el estudio prospectivo, se sometieron a
prueba muestras recientes normales (de PB, BM o PBSC), de ALL, AML
o CML (o bien de PB o bien de BM) en laboratorios individuales para
los tres CG seleccionados de EAC (tabla 37). Se aislaron MNC y se
lisaron las células (etapa inicial del procedimiento de extracción
del ARN) en el mismo día en que se obtuvieron las muestras.
Inicialmente, se recogieron 316 muestras (tabla 38). Se excluyeron
seis muestras de leucemia porque el análisis de CG resultó imposible
debido a una escasa amplificación del plásmido de B2M. Por
consiguiente, sólo se analizaron 310 muestras para definir los
valores de referencia en el mismo conjunto de muestra. La
información sobre la presencia de un supuesto transcrito de FG no
estaba disponible.
Para el estudio retrospectivo (fase IVb), se
sometieron a prueba 311 muestras archivadas de ALL, AML o CML (o
bien de PB o bien de BM) con un transcrito de FG identificado en
laboratorios individuales para los tres CG seleccionados de EAC,
aunque estos laboratorios no estuvieran incluidos en la red de FG
correspondiente. Los resultados se recopilaron y se tabularon por
los líderes de red de FG. Sólo se seleccionaron para el análisis
las muestras con un valor de Ct de CG dentro del intervalo de
referencia definido más adelante. En la red de
TEL-AML1, sólo se sometieron a prueba 30 de 57
muestras para determinar la expresión del transcrito de GUS. En la
red de E2A-PBX1, no estaban disponibles los datos de
la expresión de B2M para una muestra.
Los datos de RQ-PCR de CG y FG
se recopilaron y se analizaron por cada líder de red de FG. Se
usaron los valores de Ct medio o \DeltaCt medio (Ct [FG] medio -
Ct [CG] medio) y el valor medio del log10 del número de copias (CN)
para cada gen usado. El número de copias normalizado (NCN) se
definió como el CN del FG por una copia del transcrito de CG (valor
medio de log10 [FG CN] - valor medio de log10 [CG CN]) excepto para
la normalización al nivel del transcrito del gen B2M para el que
los resultados se expresaron por 100 copias. Puesto que el CN no
mostró una distribución normal, se usó el valor logarítmico del CN
para el análisis estadístico. Para una comprensión más fácil, los
resultados obtenidos en una forma logarítmica se convirtieron
posteriormente en valores decimales. El nivel de significación se
fijó en p<0,05. En las tablas y en las figuras, cuando el valor
de p estaba entre 0,05 y 0,1, aunque no fuera estadísticamente
significativo, se anotaron los números. Cuando el valor de p era
> 0,1, el resultado aparece como no significativo (NS). Las
correlaciones entre el nivel de expresión de genes diferentes se
midieron mediante el coeficiente de correlación de Pearson (r). Los
diagramas de cajas usados para representar los datos muestran la
mediana de los valores (línea oscura) dentro de un recuadro que
contiene el 50% de las muestras (percentiles 25º a 75º). El análisis
estadístico se llevó a cabo en Marsella, Francia, usando el
software SPSS 10.1 (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.).
Se sometieron a prueba cuatro parámetros por
muestra (Ct, \DeltaCt, CN y NCN) usando un modelo lineal global.
Se fijó el número de laboratorio como un efecto aleatorio y se
analizaron los datos. Cuando los resultados no eran comparables
entre laboratorios (p<0,05) para el parámetro y el transcrito
seleccionados, se usó un análisis de comparaciones múltiples a
posteriori (método de Tukey) para evaluar el número de
laboratorios reproducibles con otros (p\geq0,05) definiendo un
subgrupo. Para esto, se escogieron dos criterios para estimar la
reproducibilidad de los resultados: el número de subgrupos (Sn) y el
número de laboratorios (Ln) reproducibles con al menos otros dos
laboratorios tal como se define por una diferencia no significativa
entre la media (p\geq0,05) según el método de Tukey. Cuando un
laboratorio particular estaba presente en dos o más subgrupos, sólo
se contó una vez. El mejor parámetro para comparar los resultados
entre laboratorios era el que tenía el mayor valor de Ln y el menor
valor de Sn. Idealmente, sólo se esperaba un subgrupo (Sn = 1) que
contenía todos los laboratorios (Ln = 11 ó 12 por red o Ln = 25 para
el ensayo completo).
Se eligió el coeficiente de correlación de
Pearson para medir la linealidad de la cuantificación de los
transcritos de FG usando las tres muestras positivas codificadas.
Para cada transcrito de FG, el mejor parámetro (\Delta\DeltaCt
o NCN) para evaluar los resultados era el que tenía el mayor
coeficiente de correlación.
Se excluyeron las muestras de leucemia del
análisis si la amplificación del CG no estaba dentro del intervalo
normal para muestras recientes definido tal como sigue: Ct de ABL
[21,8-29,4], Ct de B2M [15,6-24,9] y
Ct de GUS [20,8-28,0]. La comparación entre PB y BM
se llevó a cabo con pruebas no paramétricas (prueba de datos
apareados de Wilcoxon para al menos cinco muestras apareadas o
prueba U de Mann-Whitney para pruebas no apareadas).
Al menos se esperaban cinco muestras apareadas por transcrito de
FG. El intervalo de expresión del 95% para NCN se refiere al
intervalo entre el percentil 3º y el 97º para el gen seleccionado.
Los coeficientes de correlación entre el CN de FG y cada CN de CG
se facilitan antes de la normalización por el CG. Para la/las
línea(s) celular(es), se muestra la mediana de los
valores obtenida en la misma muestra en ocho laboratorios
diferentes.
El grupo del gen de control comenzó con una
selección de CG candidatos en muestras de PB normales y leucémicas
en el diagnóstico usando: i) placa de control endógeno humano
previamente desarrollada (ABI) que contenía conjuntos de
cebador/sonda para 11 CG usados comúnmente y ii) seis conjuntos de
cebador/sonda (tabla 36). De los 17 conjuntos de cebador/sonda que
cubren 14 CG, la red tenía como objetivo identificar al menos uno
con una mediana de expresión alta (Ct entre 16,4 y 23,0) y al menos
uno con una mediana de expresión media (Ct entre 23,0 y 29,6).
Estos límites definidos arbitrariamente cubrían un intervalo de dos
logaritmos (6,6 Ct). El límite inferior se seleccionó con el fin de
obtener un número de registros adecuado para los cálculos de la
línea base y el límite superior para lograr sensibilidad suficiente
para la evaluación de la muestra.
Los CG seleccionados deben cumplir los
siguientes criterios principales: i) ausencia de pseudogenes
(conocidos o encontrados durante las pruebas), ii) expresión alta o
media, excluyendo la expresión muy alta o baja, iii) expresión de
CG no significativamente diferente entre muestras de PB normales y
muestras leucémicas y iv) expresión de CG no significativamente
diferente entre PB y BM. También se identificaron criterios
minoritarios para la exclusión: i) ubicación del cromosoma X con el
fin de evitar cualquier posible efecto del sexo en la dosificación,
ii) variabilidad dentro de un tipo leucémico (ALM, ALL o CML) en el
diagnóstico o PB normal, y iii) expresión dependiente del ciclo
celular.
Se excluyeron dos CG según su nivel de
expresión: ARNr 18S y TBP se sometieron a prueba con conjuntos de
cebador y sonda de ABI (tabla 36). Entre los cuatro CG altamente
expresados (PO, ACTB, GAPD y B2M), se sabía que sólo B2M no tenía
pseudogenes. Sin embargo, la expresión de B2M analizada por el
conjunto de ABI difirió significativamente entre las muestras
normales y leucémicas y entre PB y BM (p<0,001 en ambos casos, n
= 65, prueba de Mann-Whitney). Por tanto, se
descartó el conjunto de B2M de ABI. Entre los cinco CG restantes con
expresión media en la placa de ABI, se descartaron tres debido a
razones minoritarias: HPRT y PGK (ubicación en el cromosoma X) y
TFRC (expresión variable en células hematopoyéticas).
Entre los seis conjuntos de cebador y sonda
adicionales, que cubrían cuatro CG, el conjunto de
RQ-PCR para B2M interno parecía ser adecuado puesto
que no se observó diferencia estadísticamente significativa entre
PB y BM. La comparación entre muestras normales y leucémicas no fue
posible puesto que sólo se sometieron a prueba cuatro muestras
normales (véase Material y métodos). Entre los CG con expresión
media, el transcrito de TBP amplificado con el conjunto de EAC era
de mediana de nivel de expresión adecuada (Ct = 25,7). Los conjuntos
para PBGD y PBGD2 mostraron medianas de valores de Ct similares (Ct
= 27). Sin embargo, debido a la presencia de sitios de inicio de
transcripción alternativos, finalmente se descartaron estos
conjuntos para PBGD. Las medianas de los valores de Ct de los dos
conjuntos para ABL no eran idénticas (tabla 36) aunque los valores
de Ct estaban correlacionados
(r = 0,87, n = 20). Se prefirió el conjunto de EAC para ABL puesto que la mediana del valor de Ct era inferior.
(r = 0,87, n = 20). Se prefirió el conjunto de EAC para ABL puesto que la mediana del valor de Ct era inferior.
Por tanto, tras el primer proceso de selección,
el número de genes se redujo a cinco: ABL, B2M, CYC, GUS y TBP
(tabla 36).
Estos cinco CG seleccionados inicialmente se
sometieron a análisis adicional usando cinco muestras de PB
preparadas localmente de donantes normales en cada uno de los seis
laboratorios de CG. El análisis de RQ-PCR se llevó
a cabo usando protocolos de RT y PCR de EAC optimizados. Las
variaciones en los valores de Ct de ABL, B2M, CYC y GUS eran
comparables y estuvieron todos dentro de tres valores de Ct (figura
37). Las líneas de conexión de esos cuatro CG eran casi paralelas.
Por tanto, las variaciones en los valores de Ct podían atribuirse a
diferencias en la eficacia de la síntesis del ADNc y/o a la
variación en la cantidad inicial de ARN (véase más adelante). En
cambio, el transcrito del gen TBP mostró una variación de cinco
valores de Ct (igual a 32 veces) y líneas de muestra no paralelas,
lo que indica una variación mayor en la expresión del gen TBP
(figura 37). El gen TBP se excluyó por tanto del análisis
adicional.
Puesto que no se disponía de las secuencias de
cebador y sonda usadas para la placa de control endógeno humano, se
diseñaron y se sometieron a prueba nuevos conjuntos de cebador y
sonda (conjuntos de EAC) para los genes CYC y GUS. Se evaluaron
tres conjuntos de cebador/sonda para CYC diferentes en dos
laboratorios y se encontró que cada conjunto amplificaba el ADN
genómico debido a la presencia de pseudogenes. Por tanto, se excluyó
CYC del análisis adicional.
Para evaluar el riesgo de resultados falsos
positivos debido a pseudogenes u homologías genómicas fortuitas, se
sometieron a prueba conjuntos de cebador/sonda de EAC para ABL, B2M
y GUS en cinco laboratorios en 150 muestras de ADN genómico (30 por
laboratorio) obtenidas de donantes normales y pacientes leucémicos.
Todos los análisis de RQ-PCR para B2M y GUS fueron
negativos, mientras que el 7% (10/150) de las muestras fueron
positivas en la RQ-PCR para ABL en tres de cinco
laboratorios de prueba (n = 2, 3 y 5 resultados positivos,
respectivamente). Sin embargo, los valores de Ct oscilaron desde 35
hasta 45 (datos no mostrados) y, por tanto, estaban muy alejados de
los valores de Ct obtenidos usando muestras de ARN de buena calidad.
Por consiguiente, aunque estuviera presente algo de ADN restante en
la muestra de ARN, esto no afectaría significativamente a los datos
de CG. Por tanto, los inventores decidieron no excluir el conjunto
de cebador para ABL basándose en la amplificación de bajo nivel del
ADN. En conclusión, se seleccionaron los conjuntos de cebador/sonda
para ABL, B2M y GUS mostrados en la tabla 37 para pruebas
adicionales como posibles CG candidatos.
Tras haber establecido las condiciones óptimas
para la síntesis del ADNc y los protocolos de RQ-PCR
y haber definido los CG más adecuados en los estudios iniciales, la
red de EAC pasó a establecer la variación biológica en la expresión
de los CG seleccionados en muestras normales y leucémicas.
Este estudio prospectivo se llevó a cabo en
donantes normales (n = 126) así como en pacientes leucémicos en el
diagnóstico (n = 184). Se sometieron a prueba PBSC normales (n =
26), puesto que la MRD también puede estudiarse en estas células
recogidas particulares. Los laboratorios que contribuían, así como
el tipo y los números de muestras, se muestran en la tabla 38.
En las muestras normales, la expresión del gen
ABL no difirió significativamente entre PB, BM y PBSC (figura 38a).
Por el contrario, la expresión del gen B2M difirió
significativamente entre los tres tipos diferentes de muestras (PB,
PBSC y BM) si se analizaban usando un modelo lineal global
(p<0,001, n = 126). Sin embargo, el análisis de comparaciones
múltiples a posteriori reveló que el nivel de expresión de
B2M en muestras de PB o PBSC era comparable (figura 38b). La
expresión del gen GUS era significativamente diferente entre los
tres tipos de muestras usando un modelo lineal global (p<0,001, n
= 126). El análisis de comparaciones múltiples a posteriori
mostró que la expresión de GUS era significativamente inferior en
PB, pero no significativamente diferente entre BM y PBSC (figura
38c). En muestras leucémicas, la expresión de CG no fue
significativamente diferente entre BM y PB o entre ALL, AML y CML,
excepto para la expresión de GUS (p = 0,03, n = 184) (figuras 38a,
b, c).
La comparación entre las muestras normales y
leucémicas mostró que sólo la expresión de ABL no difería
significativamente (p = 0,21, n = 310, (figura 38a). En
contraposición, se encontraron diferencias significativas
(p<0,001,
n = 310) para la expresión de B2M y GUS usando un modelo lineal global (figuras 38b y c). Cuando se analizaron los valores de Ct en lugar de CN en las mismas muestras (n = 310), se obtuvieron resultados comparables.
n = 310) para la expresión de B2M y GUS usando un modelo lineal global (figuras 38b y c). Cuando se analizaron los valores de Ct en lugar de CN en las mismas muestras (n = 310), se obtuvieron resultados comparables.
Los inventores decidieron establecer valores de
referencia en muestras recientes con el fin de evaluar el intervalo
de expresión de CG y posteriormente identificar muestras de mala
calidad (véase la sección Material y método). Los valores de
referencia se definieron mediante una diana (mediana de los valores)
y dos límites (percentiles 3º y 97º). Las muestras (el 6% de las
muestras recientes) fuera de este intervalo se consideraron
resultados inesperados. Las muestras con un valor de Ct demasiado
alto y por consiguiente un CN demasiado bajo eran presumiblemente
muestras degradadas o muestras que contenían un inhibidor, mientras
que las muestras con un valor de Ct demasiado bajo y, por tanto, un
valor de CN demasiado alto podrían estar relacionadas con una
cuantificación de ARN sobreestimada. Los valores de referencia,
basados en 126 muestras normales y 184 muestras leucémicas en el
diagnóstico se muestran en la tabla 39.
En muestras normales (n = 126), se encontró una
diferencia de aproximadamente 50 veces en la expresión de ABL y GUS
y una diferencia de hasta 70 veces en la expresión de B2M (tabla
39). En muestras de leucemia
(n = 184), se observó una diferencia de aproximadamente 100 veces en la expresión de los genes ABL y GUS y una diferencia de hasta 500 veces en la expresión de B2M (tabla 39). Un enfoque paramétrico usando el valor medio (y no la mediana) y dos desviaciones estándar dieron resultados similares a los de la metodología basada en percentiles (datos no mostrados).
(n = 184), se observó una diferencia de aproximadamente 100 veces en la expresión de los genes ABL y GUS y una diferencia de hasta 500 veces en la expresión de B2M (tabla 39). Un enfoque paramétrico usando el valor medio (y no la mediana) y dos desviaciones estándar dieron resultados similares a los de la metodología basada en percentiles (datos no mostrados).
Se obtuvieron datos sobre muestras leucémicas
archivadas en el diagnóstico (n = 311) con un transcrito de FG
identificado a partir de los grupos de FG. Se seleccionaron muestras
no degradadas según los valores de referencia definidos
anteriormente, excluyendo así casos con escasa o ninguna
amplificación de CG debido a la degradación o a la presencia de
inhibidores. ABL fue un CG más restrictivo para incluir muestras en
comparación con GUS o B2M (proporción de muestras excluidas,
respectivamente, el 11%, 9% y 6%) dando como resultado un número
inferior de muestras analizadas para este CG. Dado que en la red de
TEL-AML1 sólo se sometieron a prueba 30 de 57
muestras para la expresión del transcrito de GUS, finalmente estuvo
disponible el resultado de sólo 257 muestras para este CG.
Se llevó a cabo un análisis similar al anterior
realizado en muestras de leucemia recientes (véase anteriormente).
Sólo el CN del transcrito del gen ABL no difirió significativamente
entre el tipo de tejidos y de leucemia (p = 0,50,
n = 277) o entre los grupos de transcrito de FG, cuando se combinaron muestras de BM y PB (p = 0,10, n = 277, figura 6a). En contraposición, el CN del transcrito del gen B2M era significativamente diferente entre los tipos de tejidos y de leucemia (p = 0,03, n = 290) y entre los grupos de transcrito de FG (p = 0,04, n = 290, figura 39b). Además, la expresión del gen GUS difirió significativamente entre los tipos de tejidos y de leucemia (p<0,001, n = 257) y entre los grupos de transcrito de FG (p<0,001, n = 257, figura 39c).
n = 277) o entre los grupos de transcrito de FG, cuando se combinaron muestras de BM y PB (p = 0,10, n = 277, figura 6a). En contraposición, el CN del transcrito del gen B2M era significativamente diferente entre los tipos de tejidos y de leucemia (p = 0,03, n = 290) y entre los grupos de transcrito de FG (p = 0,04, n = 290, figura 39b). Además, la expresión del gen GUS difirió significativamente entre los tipos de tejidos y de leucemia (p<0,001, n = 257) y entre los grupos de transcrito de FG (p<0,001, n = 257, figura 39c).
El nivel de expresión de los tres CG estaba
siempre correlacionado (p<0,01), independientemente de los
valores de Ct o CN usados. La mayor correlación se encontró entre
los valores de Ct de ABL y B2M (r = 0,73) o GUS
(r = 0,72) en muestras normales recientes (figura 40a) y entre los valores de Ct de ABL y GUS (r = 0,80) en muestras de leucemia recientes (figura 40b).
(r = 0,72) en muestras normales recientes (figura 40a) y entre los valores de Ct de ABL y GUS (r = 0,80) en muestras de leucemia recientes (figura 40b).
En las muestras de leucemia archivadas, la mayor
correlación se encontró entre los valores de Ct de los genes B2M y
GUS (r = 0,67), mientras que la correlación más baja se observó
entre los valores de Ct de los genes ABL y GUS en las mismas
muestras (r = 0,54), lo que sugiere una cinética de degradación
diferencial de estos dos genes. Finalmente, la correlación entre la
expresión del transcrito de FG y la expresión del transcrito del
gen ABL fue superior o idéntica a los otros dos CG seleccionados de
EAC.
Previamente se mostró que la expresión del gen
ABL no difería significativamente entre las muestras normales y
leucémicas en el diagnóstico. Además, de estos tres CG sometidos a
prueba ampliamente, la expresión del gen ABL tuvo la mayor
correlación con los transcritos de FG en muestras de diagnóstico. En
el estudio de los presentes inventores, en un modelo de detección
de MRD (fase IIIb), la normalización de la expresión de FG con
respecto a la de ABL como CG mejoró la reproducibilidad de los
resultados del transcrito de FG obtenidos en comparación con los
valores de Ct o CN sin procesar (no normalizados). Por tanto, los
inventores proponen usar ABL como CG de primera elección para la
normalización en muestras de diagnóstico y de seguimiento. Como
segunda elección, los inventores recomiendan usar o bien B2M o GUS,
dependiendo de su correlación relativa con la expresión del
transcrito de FG respectivo y la variabilidad del NCN en el
diagnóstico. En la práctica, la identificación de muestras aisladas
con un bajo nivel de expresión de CG sugiere la degradación del ARN
o la presencia de inhibidores en tales muestras. Por otra parte, la
observación de amplificación de CG reducida o ausente para todas
las muestras sometidas a prueba es indicativa de un problema con los
reactivos durante las reacciones de RT o PCR. Finalmente, el CN del
transcrito de CG para cada muestra de ARN de los pacientes permite
la normalización de la eficacia de las etapas de
pre-PCR.
No se observaron diferencias significativas en
los valores de Ct para las diluciones más bajas de ARN, ADNc
(10^{-3} y 10^{-4}) y plásmido (10^{6}, 10^{5} y 10^{3}
copias), incluso entre muestras de ADN preparadas central y
localmente. Para las diluciones más altas, los valores de Ct fueron
más reproducibles entre laboratorios para el ADNc (diluciones
10^{-3} y 10^{-4}) y el plásmido (10 y 100 copias) distribuidos
centralmente que para las diluciones de ARN. Los CV respectivos
eran inferiores al 5% para el ADNc y los plásmidos y al 11% para el
ARN a la dilución más alta. En dos redes diana (AML
1-ETO y CBFB-MYH 11 tipo A), esta
observación dio incluso como resultado significativamente menos
resultados positivos para las muestras para las que se realizó RT
localmente en comparación con las muestras de ADNc preparadas
centralmente. Las pendientes estabilizadas con diluciones de ADNc o
plásmido eran próximas a la pendiente teórica de -3,32 (eficacia del
100%) para la inmensa mayoría de los laboratorios participantes. En
contraposición, las pendientes de las diluciones de ARN eran
indicativas de la menor eficacia de la reacción debido probablemente
a la degradación del ARN durante el transporte. Finalmente, los
niveles de sensibilidad de las diluciones de ARN para todas las
dianas fueron comparables a las PCR anidadas normalizadas diseñadas
en el programa BIOMED-1 24 y fueron incluso mejores
para las variantes de bcr2 y bcr3 de PML-RARA.
Generalmente, todos los laboratorios podían detectar diez copias de
plásmido (véanse las fases IIIa y b).
Este ensayo se estableció con el fin de detectar
diferencias en la cuantificación de los transcritos entre
laboratorios. Los laboratorios se escogieron aleatoriamente para
amplificar cuatro transcritos de FG diferentes, generalmente fuera
de sus redes de FG originales (véase la sección Material y métodos).
Esta metodología también es de importancia como ronda de QC para
detectar si la falsa negatividad y positividad son proporcionalmente
idénticas a otras fases para las que sólo los laboratorios que se
centraban en un FG particular estaban realizando los
experimentos.
Los inventores observaron resultados muy
similares para las tres diluciones de plásmido de ABL entre los 25
laboratorios. Los inventores encontraron para la dilución de
plásmido de ABL de 105 copias: 22,30 \pm 0,38 (Ct \pm Sd, n =
296) y un CV correspondiente del 1,7%. Los inventores encontraron un
efecto de laboratorio significativo (fijado como un efecto
aleatorio) en la medición de Ct de ABL para las tres diluciones de
plásmido de ABL (p<0,001,
n = 296). Pero la diferencia entre laboratorios opuestos fue de no más de 1,2 Ct. Una diferencia de este tipo bien podría no ser relevante desde un punto de vista clínico. Según los criterios definidos en la sección de Material y métodos, todos los laboratorios tuvieron resultados reproducibles para el valor de Ct de cada dilución de plásmido de ABL.
n = 296). Pero la diferencia entre laboratorios opuestos fue de no más de 1,2 Ct. Una diferencia de este tipo bien podría no ser relevante desde un punto de vista clínico. Según los criterios definidos en la sección de Material y métodos, todos los laboratorios tuvieron resultados reproducibles para el valor de Ct de cada dilución de plásmido de ABL.
No se encontró ninguna diferencia significativa
dentro de las redes entre muestras altamente diluidas (10^{-3} y
10^{-4}) y muestra negativas cuando se comparó la expresión de ABL
usando los valores de Ct o CN (resultados de la red de
PML-RARA facilitados como ejemplo en la figura 30a),
excepto para la red de CBFB-MYH11 (p = 0,03). Por
el contrario, los inventores encontraron diferencias altamente
significativas (p<0,001) entre laboratorios dentro de cada red
para las mismas muestras (resultados de la red de
PML-RARA facilitados como ejemplo en la figura
30b). Por tanto, los valores de Ct y CN eran dependientes del
laboratorio de pruebas y no de la muestra. Estos datos sugieren
fuertemente que las variaciones se producen durante las etapas de
pre-PCR (transporte y eficacia de RT).
Los inventores se centraron en el mejor
parámetro (Ct, CN, \DeltaCt o NCN) para expresar los resultados
de la RQ-PCR en un modelo de dilución en serie. Los
inventores calcularon los coeficientes de correlación
correspondientes en tres muestras diluidas medidas en 11
laboratorios diferentes (red de PML-RARA como
ejemplo en la figura 31). Los coeficientes de correlación fueron
superiores para el método de NCN en cinco FG, ligeramente
superiores con el método de \DeltaCt en dos FG, mientras que ambos
métodos fueron equivalentes para los dos FG restantes (tabla 33).
Sólo para la cuantificación de los transcritos de
E2A-PBX1, ABL parecía no ser útil como CG para
normalizar los resultados de RQ-PCR. En general, se
encontró que el uso de los transcritos del gen ABL para la
normalización mejora enormemente la linealidad de los resultados
(red de PML-RARA como ejemplo en la figura 32) y
evitaba el solapamiento en los valores de Ct y CN de FG observado
entre diluciones diferentes.
Finalmente, los inventores comprobaron los
resultados de este modelo para la cuantificación de MRD. La curva
de correlación entre el valor de Ct (eje Y) y el valor de CN (log10,
eje X) para los pocillos relacionada con las muestras positivas
para FG codificadas (n = 824, lo que cubre las nueve dianas de FG)
mostró una pendiente media y una ordenada en el origen de -3,35 y
39,7, respectivamente. Estos buenos resultados indicaron que
incluso con nueve conjuntos de plásmidos diferentes (uno por
transcrito), la cuantificación de los transcritos de FG en las
muestras de ARN era similar, independientemente de cuál fuera el
conjunto de plásmido.
Los inventores compararon 55 muestras apareadas
de BM y PB tomadas en el momento del diagnóstico. No se analizaron
dos pares adicionales en la red de MLLAF4 debido al número
insuficiente. El análisis estadístico reveló que la fuente de las
muestras no tenía un efecto significativo en el nivel de expresión
en el diagnóstico del FG relevante expresado como NCN, excepto para
PML-RARA usando B2M o GUS como CG. Estos análisis
sugerirían que cualquier fuente de material diagnóstico podría
actuar como una referencia adecuada para los estudios de MRD.
Globalmente, la mediana del NCN de cada transcrito de FG era
variable, oscilando desde 8,5 copias (E2A-PBX1)
hasta 0,1 copias (SIL-TAL1) por copia de transcrito
de gen ABL (figura 33a). También se observó un resultado de este
tipo con los CG B2M y GUS. Los niveles de expresión relativos de los
diferentes FG fueron generalmente constantes independientemente del
CG usado para la normalización (figura 33b, c), aunque se observó
cierta heterogeneidad en algunos casos (véase
PML-RARA, AML1-ETO y
SIL-TAL1 en la sección de ejemplos). En la mayoría
de los casos, el NCN del transcrito de FG en muestras de pacientes
era comparable a los observados en los controles de la línea
celular correspondiente (véase cada ejemplo). Estos resultados se
corrigieron según la proporción de blastocitos en la muestra cuando
se dispuso de la información.
Se diluyó ARN de pacientes o líneas celulares
positivas para FG en ARN de E. coli, usando etapas de
dilución de diez veces (de 10^{-1} a 10^{-6}, véase la sección
Material y métodos). Se observó una concordancia en los
experimentos de dilución limitante entre la última dilución positiva
del ARN de pacientes o líneas celulares y la sensibilidad
pronosticada partiendo de la base de los niveles de FG y CG en el
ARN no diluido correspondiente. Estos datos indicaban que la
cuantificación del CG y el FG con CN en la muestra pura era
correcta. Un análisis de regresión lineal en las mismas diluciones
mostró que la razón FG/CG no cambiaba significativamente (inferior
a un factor de dos) a lo largo de 3 a 5 diluciones logarítmicas,
dependiendo del nivel de expresión de FG en la muestra pura. Estos
resultados indicaron eficacias de amplificación de
RQ-PCR iguales para el FG y el CG en un gran
intervalo de diluciones.
La monitorización de MRD mediante el análisis
por RQ-PCR está convirtiéndose en una herramienta
para la toma de decisiones en ensayos terapéuticos multicéntricos.
Por este motivo, es de capital importancia que los resultados de la
RQ-PCR se expresen de una manera uniforme. La
mayoría de las publicaciones usaban una razón de número de copias
entre el FG y el CG con una curva patrón, expresándose esta razón
como un valor decimal o un porcentaje. Para obtener la curva
patrón, los laboratorios usaban o bien ADNc de línea celular o bien
ADN de plásmido. Hasta ahora, pocos autores usaban el método de
\Delta\DeltaCt y, que los inventores sepan, hasta ahora no se
había usado una curva patrón de ADNc de diagnóstico.
Se trataron cuatro posibilidades: 1) diluciones
de ARN de línea celular, 2) porcentaje del número de células
positivas con respecto a la muestra de diagnóstico, 3) razones de
número de copias y 4) el método de \Delta\DeltaCt.
- 1)
- Las diluciones de ARN de línea celular parecían ser muy sensibles a la degradación durante el transporte, tal como se muestra en el estudio de los inventores. La variabilidad de expresión para una línea celular puede verse sometida a grandes variaciones. Una posible variación de este tipo depende de la fuente de la línea celular, del momento del cultivo celular en el que se ha realizado la extracción del ARN y finalmente de la eficacia de la RT. Para estudios multicéntricos, la opción para superar tales dificultades podría ser preparar y distribuir centralmente el ADNc.
- 2)
- Los resultados expresados como frecuencia de células positivas tendrían la enorme ventaja de permitir la comparación directa con otras técnicas de MRD. Además, permitiría una determinación más fiable de la cinética de reducción del transcrito de FG dentro de pacientes individuales, dada la variabilidad en los niveles de expresión del transcrito de FG entre pacientes tal como se observó en este estudio. Sin embargo, un enfoque de este tipo depende de la disponibilidad del material de diagnóstico frente al cual pueden considerarse los niveles relativos de MRD. Puesto que el nivel preciso de expresión de FG y sus variaciones durante el tratamiento a nivel de una única célula no están totalmente claros, los inventores decidieron finalmente expresar los resultados en cuanto a las razones entre la diana (transcrito de FG) y la referencia (transcrito de CG) en los experimentos de los inventores.
- 3)
- La razón (NCN) se expresó como copias de FG por copia del transcrito del gen ABL o GUS y por 100 copias del transcrito del gen B2M debido a su alto nivel de expresión. Esta razón debe ser independiente de la cantidad de ARN de partida. Para este fin, los inventores usaron curvas patrón de plásmido, que ofrecen la posibilidad de cuantificar directamente el número de copias de los transcritos. Los datos de los inventores muestran que los plásmidos son calibradores adecuados para la normalización del análisis de RQ-PCR entre laboratorios o dentro de un laboratorio. El ADN de plásmido es probablemente una buena opción que proporciona estabilidad y robustez que es poco probable que se logre cuando se usa la producción de ADNc a gran escala como posible material de QC. Los posibles inconvenientes de este método son: en primer lugar, el riesgo de contaminación, aunque los inventores usaron diluciones de plásmido que contenían copias de FG dentro del mismo intervalo que las muestras de pacientes. Siempre se requieren las precauciones rigurosas habituales para el análisis de PCR para limitar este riesgo. En segundo lugar, el uso de calibradores de plásmido reduce el número de pocillos disponible para las muestras de pacientes y aumenta ligeramente el coste. En tercer lugar, los calibradores introducen etapas/cálculos adicionales que aumentan posiblemente la variabilidad. Finalmente, los plásmidos de ADN no evalúan directamente la eficacia de la RT; sin embargo, el nivel de expresión de CG en muestras de pacientes representa claramente un control de las etapas de pre-PCR.
- 4)
- El método de \Delta\DeltaCt (boletín de usuario n.º 2 de Applied Biosystems) no tiene esas desventajas, aunque tiene sus propias limitaciones. El método se basa en las eficacias relativas de los ensayos de FG y CG que son comparables y constantes de una placa a otra; por tanto, resulta crítico que se incluyan rutinariamente patrones de ARN o ADNc positivos, para permitir que se detecte el deterioro en el rendimiento del ensayo por una elevación en el valor de Ct tal como se encontró una vez en el estudio de los inventores para el análisis de 70 muestras de CML, incluyendo 17 muestras apareadas. Este método puede ser muy eficaz en laboratorios expertos y puede usarse para determinar el nivel relativo de MRD en comparación con la muestra de diagnóstico. Hay preocupaciones de que este enfoque puede no prestarse por sí mismo a la evaluación de variaciones entre experimentos en el entorno dentro de un laboratorio o entre laboratorios. Esto puede crear dificultades en la comparación de los datos de RQ-PCR entre grupos diferentes, particularmente cuando se usan diferentes máquinas (hay al menos ocho proveedores en la actualidad).
Cuando se encuentra una ausencia de
amplificación del transcrito de FG en una muestra de pacientes
durante el seguimiento, es necesario evaluar el límite de detección
para el ensayo particular para determinar la fiabilidad y la
relevancia clínica del resultado obtenido. Para abordar esta
cuestión, los inventores proponen dos fórmulas para calcular el
nivel de sensibilidad de un experimento dado. El uso de valores de
números de copias se notificará más adelante en el presente
documento.
La fórmula se basa en los resultados de
experimentos de dilución de E. coli y en la correlación entre
el CN de FG y el CN de CG con una pendiente próxima a 1 en muestras
de diagnóstico (véase cada ejemplo particular). En esta fórmula, la
sensibilidad está directamente relacionada con el NCN del FG en el
diagnóstico y el CN de CG de la muestra. Idealmente, el cálculo
debe basarse en el NCN de diagnóstico de los pacientes, tras la
corrección para el porcentaje de blastocitos. Si no está disponible,
pueden usarse datos de EAC. En este modelo, deben amplificarse 10
copias del plásmido de FG por cada transcrito de fusión particular.
Si sólo pueden amplificarse 100 copias, la sensibilidad debe
reducirse en un log10.
SENS =
-log_{10} (NCN) - log_{10} (CN de
CG)
En esta fórmula, SENS es la sensibilidad (log10)
del experimento para la muestra de diagnóstico y debe expresarse
como 10^{SENS}, NCN es o bien la razón de la muestra de pacientes
en el diagnóstico o si no está disponible, la mediana de NCN
correspondiente a partir de los datos de EAC.
La fórmula es válida para todos los CG en el
diagnóstico pero se deber ser consciente del sesgo hacia la
subestimación para la razón BCR-ABL/ABL para
muestras que contienen un alto nivel de células leucémicas. Sin
embargo, sólo el gen ABL no mostró ninguna diferencia significativa
entre BM y PB y entre muestras normales y muestras leucémicas en el
diagnóstico. Por tanto, esta fórmula sólo puede usarse con ABL como
CG sin ninguna corrección para evaluar el nivel de sensibilidad del
experimento durante el seguimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente A presenta una T-ALL
(ALL de células T) pediátrica en el diagnóstico. La búsqueda del
transcrito de FG SIL-TAL1, en su muestra de PB
sigue siendo negativa. La cuantificación del transcrito del gen ABL
usando RQ-PCR con el protocolo de EAC de los
inventores es de 46000 copias. Por tanto, la sensibilidad estimada
del experimento basándose en los datos de EAC para la mediana de la
expresión del transcrito de FG SIL-TAL1 en PB
(0,09, tabla 22) en el diagnóstico es:
SENS =
-log_{10} (0,09) - log_{10} (46000) = -3,6 (o
10^{-3,6})
El paciente B presenta una recidiva tardía de
una ALL de precursores de células B positiva para
TEL-AML1. La cuantificación del transcrito de FG
TEL-AML1 en su muestra de PB es de 419000 copias. La
cuantificación del transcrito del gel ABL en la misma muestra es de
17000 copias. La razón TEL-AML1/ABL para este
paciente es de 25 (419000/17000). Por tanto, la sensibilidad
estimada basada en la expresión de FG TEL-AML1 en
este paciente es:
SENS =
-log_{10} (25) - log_{10} (17000) = -5,6 (o
10^{-5,6})
Se realizó el seguimiento del mismo paciente B 3
meses después mediante RQ-PCR para la detección del
transcrito de FG TEL-AML1 en muestras de PB y BM.
El transcrito de FG TEL-AML1 no se detecta mediante
RQ-PCR en ambas muestras. Los resultados de la
cuantificación del transcrito del gen ABL en las muestras de PB y BM
son respectivamente 7700 y 13700 copias. Basándose en la
observación de que NCN de TEL-AML1 no difiere
significativamente entre PB y BM (figura 11), se usa la razón en
este paciente en la recidiva (419000/17000) para calcular la
sensibilidad de este experimento:
SENS (BM) =
-log_{10} (419/17) - log_{10} (13700) = -5,5 (o
10^{-5,5})
SENS (PB) =
-log_{10} (419/7) - log_{10} (7700) = -5,3 (o
10^{-5,3})
En comparación con el seguimiento del transcrito
de FG mediante RT-PCR clásica, la sensibilidad en
este caso se basa en muestras de pacientes y no de líneas
celulares. El umbral de sensibilidad calculado con esta metodología
es claramente más preciso que el basado en RT-PCR
clásica en diluciones de líneas celulares (5).
La invención se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos no limitativos.
El transcrito de FG leucemogénico
E2A-PBX1 resulta de la fusión de los genes E2A y
PBX1 (anteriormente pr1), a través de t(1;19)(q23;p13). La
t(1;19)(q23;p13) se encuentra en el 3-5% de
la ALL de precursores de células B infantil y en el 3% de la ALL de
precursores de células B de adultos. En el 95% de los casos, se
expresan los transcritos de E2A-PBX1. Esta
expresión está estrechamente asociada con la detección de cadenas de
Ig p citoplasmáticas. Las ALL de precursores de células B restantes
con t(1;19) son negativas para E2A-PBX1 y no
muestran redisposición del gen E2A.
El gen E2A, ubicado en el cromosoma 19, codifica
para los factores de unión al potenciador de Ig de
hélice-bucle-hélice, E12 y E47, y
el gen PBX1 en el cromosoma 1 codifica para una proteína de
secuencia homeótica ("homeobox") de unión al ADN. La
organización genómica de E2A está bien definida y los puntos de
rotura se producen casi exclusivamente en el intrón de 3,5 kb entre
el exón 13 y 14. La organización genómica de PBX1 no se conoce aún
completamente y los puntos de rotura están dispersos a lo largo de
una región intrónica de aproximadamente 50 kb entre el exón 1 y el
2. La mayoría de casos con transcritos de FG
E2A-PBX1 muestran una unión constante del exón 13
de E2A al exón 2 de PBX1 (figura 3). Se ha descrito un transcrito de
FG variante en aproximadamente el 5-10% de los
pacientes positivos para E2A-PBX1. Se caracteriza
por la inserción de un tramo de 27 nucleótidos en la unión
E2A-PBX1. Esta secuencia insertada surge
probablemente de un exón cortado y empalmado de manera alternativa
de PBX1.
El FG codifica para un activador transcripcional
quimérico que contiene el dominio activador transcripcional
N-terminal de E2A unido al dominio de secuencia
homeótica de unión a ADN C-terminal de PBX1. La
actividad transformante de las proteínas de E2A-PBX1
se ha demostrado tanto in vitro como in vivo.
Se han notificado varios estudios que usan
amplificación mediante RT-PCR del transcrito de FG
E2A-PBX1 para evaluar MRD. Se realizaron todos con
un ensayo cualitativo que mostraba un umbral de detección de hasta
10^{-4/-5}. En ninguno de estos informes la presencia o ausencia
de transcritos de E2A-PBX1 durante del seguimiento
predice el desenlace del tratamiento. La serie más grande incluía
71 pacientes, no se encontraron diferencias en la supervivencia
libre de acontecimientos entre pacientes positivos para PCR y
negativos para PCR analizados al final del tratamiento de
consolidación. Todos estos estudios señalan las limitaciones de la
evaluación cualitativa de MRD en la monitorización de pacientes con
ALL positivos para t(1;19), y subrayan la importancia de
enfoques cuantitativos tales como métodos de
RQ-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre dos conjuntos de cebadores y sonda
sometidos a prueba, se eligió uno: ENF101, ENR 161 y ENP 141. Las
posiciones y secuencias de nucleótidos se muestran en la figura 3 y
en la tabla 5, respectivamente. Este conjunto se seleccionó
basándose en los valores de \DeltaRn superiores en la fase de
meseta con diluciones altas del ARN de la línea celular 697
positiva para E2A-PBX1 (también conocida como ACC42)
en ARN de HL60. Durante los experimentos de fase II y fase III,
este conjunto de cebadores y sonda permitió detectar una dilución
10^{-4} de ARN de 697 en ARN de HL60 en siete de siete
laboratorios; un ejemplo de gráficas de amplificación típicas
(diluciones de ARN de línea celular 10^{-1}, 10^{-3}, 10^{-4})
se muestra en la figura 4. Se concluyó que ENF101, ENR 161 y ENP
141 son adecuados para la cuantificación de todos los transcritos
de fusión de E2A-PBX1, incluyendo la forma
variante.
Se analizaron una línea celular, 697, y 27
muestras de diagnóstico (14 muestras de BM y 13 de PB). Se disponía
de los porcentajes de blastocitos (definidos morfológicamente) en
todas excepto en dos muestras (1 de PB y 1 de BM) y oscilaban desde
el 74 hasta el 100% (mediana = 96%). La mediana de los valores y el
intervalo del 95% para los genes de control y los valores de Ct de
E2A-PBX1, así como el número de copias de
E2A-PBX1 normalizado (corregido según el porcentaje
de blastocitos), se notifican en la tabla 6. Los valores de Ct
detectados para E2A-PBX1 y CG en la línea celular
697 y en las muestras de pacientes eran comparables, lo que indica
que se expresan a niveles similares. Se observó el coeficiente de
correlación más alto entre transcritos de ABL y
E2A-PBX1. Entre las muestras de PB y BM, diez eran
muestras apareadas, recogidas en el mismo paciente en la
presentación de la enfermedad. No pudo observarse diferencia
estadísticamente significativa entre BM y PB en lo que se refiere a
Ct o NCN en muestras apareadas (figura 5).
Durante las diversas rondas de QC, se sometieron
a prueba 11 muestras negativas (cinco de ARN negativo, tres de NAC
y tres de NTC) y cinco muestras positivas (diluciones 10^{-3} (2
muestras) y 10^{-4} (3 muestras) de ARN de la línea celular 697
en ARN de HL60) en ocho de 10 laboratorios (tabla 7). La
amplificación de E2A-PBX1 de las muestras negativas
representa 156 pocillos. Se encontró que tres pocillos
(correspondientes a 3 muestras diferentes) eran positivos (2%),
pero ninguna de estas muestras se consideró positiva según los
criterios definidos en la sección Material y métodos. La
amplificación de E2A-PBX1 de las muestras positivas
representa 78 pocillos. Se encontró que sólo un pocillo era
negativo (1%). Según los criterios definidos en la sección Material
y métodos, se encontró que las cinco muestras positivas eran
positivas, tal como se esperaba a partir del umbral de sensibilidad
definido en fases previas.
\vskip1.000000\baselineskip
La t(4;11)(q21;q23) es la translocación
de 11q23 más frecuente en la ALL de precursores de células B e
implica a los genes MLL (HRX, Htrx, ALL1) y AF4 (FEL). Mientras que
se observa positividad para MLL-AF4 en el 5% de los
casos de ALL pediátrica y en adultos, este subgrupo representa del
40 al 60% de la ALL inducida por terapia y de lactantes. La función
de MLL de mamíferos se desconoce todavía en gran parte, pero parece
desempeñar un papel principal en la segmentación durante el
desarrollo. Una desactivación de AF4 en ratón reciente sugirió que
este gen codifica para un supuesto factor de transcripción que está
implicado en la ontogenia del linaje linfoide. Se ha sugerido que
el aumento de resistencia de la leucemia positiva para
MLL-AF4 a la muerte celular inducida por estrés
mostrado in vitro contribuye a su mal pronóstico.
Al nivel molecular, los puntos de rotura en los
genes MLL y AF4 están diseminados dentro de los intrones, entre el
exón 8 y el 12 (MLL) y el exón 3 y el 7 (AF4), siendo algunos
transcritos más frecuentes en la ALL o bien de adultos o bien de
lactantes.(5) Se notificó que usando una técnica de
RT-PCR anidada con una sensibilidad de 10^{-4},
se obtenían niveles bajos de expresión de transcritos de
MLL-AF4 en hasta el 13% de la ALL pediátrica en el
diagnóstico, siendo algunos de ellos negativos para la redisposición
de MLL-AF4 mediante análisis de tipo Southern, y en
aproximadamente el 25% de muestras de hígado fetal o BM normal
recientes. Basándose en estos datos, los autores sugirieron que los
ensayos de RT-PCR para los transcritos de FG
MLL-AF4 no eran adecuados para monitorizar la MRD.
Sin embargo, estos hallazgos notables no se han confirmado hasta la
fecha por otros grupos ni mediante otras técnicas.
No obstante, en el mismo periodo, el primer
estudio de MRD prospectivo, que usaba RT-PCR
anidada, en 25 pacientes positivos para MLL-AF4,
mostró una correlación significativa entre la positividad de la PCR,
la recidiva y la supervivencia. La heterogeneidad de los
transcritos de FG MLL-AF4, su relativamente baja
incidencia en ALL infantil y de adultos y su mal pronóstico con la
terapia clásica explican el escaso número de estudios de MRD
notificados para esta diana de RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los tres conjuntos de sondas y seis
de cebadores sometidos a prueba, se adoptaron una sonda común
ENP242 y un cebador inverso común ENR262, ambos ubicados en el exón
5 de AF4 (figura 6 y tabla 8). Debido a la gran variedad de los
transcritos de FG MLL-AF4, no pudo diseñarse un
conjunto de cebador/sonda común para todas las variantes de
MLL-AF4. Se usaron dos cebadores directos en el gen
MLL con el fin de amplificar al menos el 90% de los transcritos de
FG MLL-AF4 de no lactantes y el 60% de lactantes:
ENF207 (exón 9) y ENF208 (exón 10) (5). Que los inventores sepan,
no se han publicado hasta la fecha conjuntos de cebador/sonda para
RQ-PCR para MLL-AF4 o cualquier otro
transcrito de FG MLL.
Se disponía de tres líneas celulares para las
pruebas: RS4;11 (exón 10 de MLL-exón 4 de AF4),
MV4-11 (exón 9 de MLL-exón 5 de
AF4) y ALL-PO que expresaba dos transcritos
alternativos (exón 10 y 11 de MLL-exón 5 de AF4).
Se construyeron tres plásmidos: exón 9-exón 5, exón
10-exón 4 y exón 11-exón 5 de
MLL-AF4. Un ejemplo de gráficas de amplificación
típicas (diluciones de ARN de línea celular 10^{-1}, 10^{-3},
10^{-4}) se muestra en la figura 7; los datos de sensibilidad de
los inventores en el material de la línea celular eran comparables
a los observados anteriormente para la detección de transcritos de
FG MLL-AF4 usando un ensayo de PCR anidada (5). El
fenómeno de "curva de arrastre" era un acontecimiento raro
dentro de las muestras negativas y la mayor parte de los
laboratorios relacionados (véase la sección Material y métodos y el
ejemplo 9).
Entre las 22 muestras incluidas (14 de BM y ocho
de PB, incluyendo dos muestras apareadas), la mayoría de ellas (n =
19) se reclutaron de los protocolos terapéuticos franceses
LALA-FRALLE para ALL y se sometieron a prueba en
Marsella. El porcentaje de blastocitos en las muestras no se conocía
para todas las muestras; de este modo los resultados no se
corrigieron según esta proporción. La expresión normalizada del
transcrito de FG MLL-AF4 (NCN) parecía ser similar
entre líneas celulares (n = 3) y pacientes (tabla 9). No se
observaron diferencias en NCN de MLL-AF4 entre
muestras de PB y BM (figura 8). Se redujo el intervalo del 95% de la
expresión cuando se usó o bien ABL o bien GUS como CG (tabla 9) en
comparación con los resultados obtenidos con B2M o sin ningún CG.
Además, la correlación entre los niveles de transcrito de
MLL-AF4 y ABL era la más alta observada entre los
tres genes de control en las muestras de diagnóstico (tabla 9).
Se observaron pocas muestras falsas negativas
(6%, 7/110) para las diluciones 10^{-3} y 10^{-4}. La
amplificación del ADNc de MLLAF4 dentro de muestras negativas
(muestras negativas para FG, NAC y NTC), también denominada falsa
positividad, se limitó al 3% (5/176) y se restringió a laboratorios
individuales (tabla 10). El valor de Ct en los pocillos falsos
positivos era siempre mayor de 30 y la mayoría de las veces superior
a 37.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de FG
TEL(ETV6)-AML1(CBFA2, RUNX1) resultan
de la t(12;21)(p13;q22) críptica y se encuentran en
aproximadamente el 25% de la ALL de precursores de células B
infantil. Tanto TEL como AML1 codifican para factores de
transcripción nucleares, que son críticos para la hematopoyesis
normal. Su fusión condujo a leucemogénesis mediante la alteración
de la función normal de TEL y/o la creación de un represor
transcripcional que afecta a la expresión del gen diana AML1. Se
han descritos dos punto de rotura de translocación recurrentes. El
principal rompe dentro del intrón 5 de TEL y el intrón 1 de AML1,
generando transcritos de FG exón 5 de TEL-exón 2 de
AML1. El minoritario se encuentra en aproximadamente el 10% de las
ALL positivas para TEL-AML1 y rompe dentro del
intrón 2 de AML1, generando transcritos de FG exón 5 de
TEL-exón 3 de AML1 que son 39 pb más cortos (figura
9). Este último transcrito de FG, junto con transcritos que carecen
del exón 3 de AML1, se detectan también en casos con fusión del
exón 2 de AML1, como resultado de corte y empalme alternativo. Se
han descrito casos con puntos de rotura en el intrón 4 de TEL, pero
siguen siendo excepcionales.
El pronóstico de ALL positiva para
TEL-AML1 es todavía controvertido. Hay un acuerdo en
que la presencia de los transcritos de FG TEL-AML1
está asociada con una alta probabilidad de supervivencia libre de
acontecimientos durante 4 años. Sin embargo, algunos autores,
aunque no otros, notificaron tasas de recidiva similares a las de
la ALL en general, produciéndose una mayoría de las recidivas fuera
de la terapia. Todavía no está claro si estas variaciones de un
estudio a otro se deben a sesgos metodológicos o a diferencias en la
eficacia de los regímenes de quimioterapia.
Pocos estudios han notificado hasta la fecha
resultados de MRD para pacientes con ALL positiva para
TEL-AML1. La mayoría de estos estudios se basaban
en una evaluación cualitativa o semicuantitativa del nivel de
transcrito. La alta frecuencia de positividad para el transcrito de
TEL-AML1 en la ALL de precursores de células B
indujo a varios grupos a desarrollar estrategias de
RT-PCR cuantitativa dirigidas a este transcrito para
seguir la MRD. Los datos preliminares muestran que todavía puede
detectarse MRD tras la terapia de inducción en del 40 al 50% de los
pacientes, y que se encuentran altos niveles de MRD en algunos
pacientes. Sin embargo, a pesar de la frecuencia relativamente alta
de la fusión TEL-AML1, sólo se han analizado hasta
la fecha pequeñas series de pacientes (siempre menos de 30
pacientes), y la poca frecuencia de las recidivas además de su
posible aparición tardía hacía difícil realizar cualquier
correlación clínica hasta la fecha.
La línea celular usada para las pruebas fue
REH,93, que presenta una fusión de exón 5 de
TEL-exón 2 de AML1. Se usaron también dos
constructos de plásmido, uno que contenía el "transcrito largo"
(exón 5 de TEL-exón 2 de AML1), y el otro que
contenía el "transcrito corto" (exón 5 de
TEL-exón 3 de AML1) (véase la sección Materiales y
métodos).
Al final de la fase de optimización, se
seleccionó un conjunto de cebador/sonda (ENF 301 en el exón 5 de
TEL, ENR361 en el exón 3 de AML1 y ENPr341 en el exón 5 de TEL) a
partir de los cinco conjuntos que se sometieron a prueba
inicialmente (figura 9 y tabla 11). Un ejemplo de gráficas de
amplificación típicas (diluciones de ARN de línea celular
10^{-1}, 10^{-3}, 10^{-4}) se muestra en la figura 10; las
condiciones de RT y PCR optimizadas permitieron detectar una
dilución 10^{-4} de la línea celular REH en ARN de PBL y 10 copias
de plásmidos en el 100% de los casos, lo que concuerda con los
resultados obtenidos previamente en la acción concertada
BIOMED-1 (5). Debe indicarse que variantes
moleculares tales como transcritos con una fusión del exón 4 de TEL
siguen sin detectarse usando este conjunto de cebadores.
Se estudió la expresión de
TEL-AML1 en la línea celular REH y en 57 muestras de
la ALL de precursores de células B positivas para
TEL-AML1, 30 de BM y 27 de PB, incluyendo 23
muestras apareadas (tabla 12). Las muestras contenían del 18% al
100% de blastocitos leucémicos. Se obtuvo una mayoría de estas
células de pacientes del Hospital Saint-Louis
(París, FR). Se calculó el NCN y se ajustó al porcentaje de
blastocitos presentes en cada muestra.
La expresión de TEL-AML1 en la
línea celular REH estaba dentro del intervalo detectado en muestras
de leucemia primarias.
No se observaron diferencias significativas para
NCN de ABL en la expresión de TEL-AML1 cuando se
compararon muestras de PB y BM recogidas en el diagnóstico en los
mismos pacientes (figura 11).
Tal como se esperaba a partir del umbral de
sensibilidad definidos en fases previas, se encontró que las
diluciones de ARN 10^{-3} y 10^{-4} de la línea celular REH
eran siempre positivas (tabla 13) según los criterios definidos en
la sección Métrica y métodos. Se encontró que una dilución
5.10^{-5} era positiva en 7/7 laboratorios. Durante las diversas
rondas de QC, se sometieron a prueba 11 muestras negativas (seis
muestras de ARN negativo y cinco de NAC o NTC) en de 7 a 11
laboratorios, correspondientes a un total de 279 pocillos de
amplificación (tabla 13). Se encontró que nueve de estos pocillos
(3%) eran falsamente positivos, correspondientes a tres muestras
falsas positivas de 93 (3%) según los criterios mencionados
anteriormente. Estos pocillos falsos positivos se observaron en 6
laboratorios diferentes. No se observó ningún caso de falsa
positividad con 3 pocillos positivos y los valores de Ct eran
siempre superiores a 39. Todos los pocillos falsos positivos
correspondían a ARN negativo, mientras que NAC y NTC eran siempre
negativos. Esta observación sugiere que estos resultados falsos
positivos podrían deberse a contaminaciones producidas antes de la
amplificación, tal como la etapa de RT.
El FG BCR-ABL está asociado con
la formación del cromosoma Filadelfia (Ph) y es una de las anomalías
genéticas más comunes detectadas en leucemias. En ALL, se detecta
Ph en el 25-30% de los casos adultos y el
2-5% de los casos infantiles. Menos frecuentemente,
está asociado con leucemia mieloide aguda. En el subconjunto de
ALL, se sabe que esta lesión genética confiere un pronóstico muy
malo y, por consiguiente, su detección es importante al planear
terapias agresivas, incluyendo trasplante alogénico de médula ósea.
Además, se encuentra el cromosoma Ph en más del 95% de los casos de
CML y es el distintivo de esta enfermedad. A nivel molecular, el
cromosoma Ph o t(9;22) da como resultado la yuxtaposición de
la parte 5' del gen BCR (cromosoma 22) con la parte 3' del gen ABL
(cromosoma 9). En la inmensa mayoría de los pacientes, los puntos de
rotura en el gen BCR están agrupados dentro de tres regiones bien
definidas: i) una secuencia de 55 Kb del primer intrón, denominada
región de agrupamiento de puntos de rotura minoritaria ("minor
breakpoint cluster region") (m-bcr), ii) una
región de 5,8 Kb que abarca los exones 12 a 16, denominada región de
agrupamiento de puntos de rotura principal ("major breakpoint
cluster region") (M-bcr) y iii) finalmente el
intrón 19, denominado \mu-bcr. Un análisis de los
puntos de rotura de \mu-bcr no se tratará
adicionalmente debido a su extrema poca frecuencia. En el caso de
los puntos de rotura de m-bcr, el primer exón del
gen BCR (el) está yuxtapuesto con el segundo exón del gen ABL (a2).
El transcrito de fusión resultante (el-a2) codifica
para una proteína quimérica de 190 Kda (p190). Este tipo de FG
BCR-ABL se encuentra en el 65% de los adultos y el
80% de los niños con ALL positiva para Ph. Sólo en casos
esporádicos se encuentra el gen BCR-ABL que codifica
para p190 en CML.
A pesar de los enormes esfuerzos, todavía no se
entienden completamente los mecanismos moleculares mediante los que
la proteína BCR-ABL híbrida alcanza capacidad
transformante. Sin embargo, la proteína BCR-ABL
muestra una actividad tirosina cinasa aumentada y desregulada y
parece desregular las rutas de transducción de señales dependientes
de citocinas normales conduciendo a la inhibición de la apoptosis y
mediante crecimiento independiente de factores de crecimiento.
Todos los estudios sobre el valor clínico de MRD
en pacientes con ALL Ph+ indican que las células positivas para
BCR-ABL no pueden erradicarse ni siquiera mediante
quimioterapia intensa. En una serie de 36 pacientes con ALL Ph+
tratados mediante SCT, se notificó que la evaluación mediante
RT-PCR de MRD era, mediante análisis de múltiples
variables, el mejor indicador de pronóstico para detectar una
remisión completa continua. Recientemente, se notificó el
seguimiento mediante análisis de RQ PCR de 13 pacientes con ALL
positivos para m-bcr. Todos estos datos sugieren
que, en pacientes con ALL Ph+, la monitorización cuantitativa de
células leucémicas residuales podría demostrar ser más valiosa que
su detección cualitativa para ayudar a tomar una decisión
clínica.
Se sometió a prueba la eficacia de cuatro
conjuntos de cebador/sonda diferentes, diseñados usando el software
"Primer Express^{TM}", en experimentos de dilución en serie
1:10 de ARN de la línea celular TOM-1 (unión
e1-a2 o m-bcr) en ARN de células
HL60. Todos los conjuntos de cebador/sonda estaban libres de
artefactos de amplificación no específicos, aunque dos conjuntos
eran superiores en cuanto a la sensibilidad y al valor de
\DeltaRn en la fase de meseta. Ambos conjuntos tenían eficacias de
amplificación comparables y alcanzaron una sensibilidad de
10^{-5} y \DeltaRn >3,0 en la dilución de la línea celular
10^{-1}. Tras pruebas extensas, se seleccionó el conjunto que
incluía ENF402 (ubicado en el exón 1 de BCR), ENR561 y la sonda
ENP541, ambos ubicados en el exón 2 de ABL. Tanto el cebador
inverso como la sonda son comunes para el conjunto usado para la
detección mediante RQ-PCR de los transcritos de FG
BCR-ABL (M-bcr) (figura 12, tabla
14). Un ejemplo de gráficas de amplificación típicas (diluciones de
ARN de línea celular 10^{-1}, 10^{-3}, 10^{-4}) se muestra en
la figura 13.
Para establecer intervalos de referencia de los
transcritos de m-bcr, los inventores determinaron la
expresión de FG en 17 muestras de BM y siete muestras de PB de
pacientes con ALL secuenciales en el diagnóstico así como
preparadas centralmente y ARN distribuido de la línea celular
TOM-1 (tabla 15). Para el FG y los tres transcritos
de CG sometidos a ensayo, se amplificaron series separadas de
diluciones de plásmidos en cada experimento para calcular el número
de copias del transcrito. Aunque las muestras con Ct de ABL >29,3
se excluyeron del análisis debido a que no eran adecuadas para la
amplificación, los valores de Ct de todos los transcritos eran
generalmente inferiores en las líneas celulares que en el material
del paciente (tanto BM como PB), lo más probablemente debido a la
baja calidad de algunos de los ARN del paciente. Sin embargo, tras
la normalización respecto a la expresión de los genes de control,
los niveles de transcrito de m-bcr eran comparables
en pacientes y en la línea celular TOM-1, y muy
similares en cuatro muestras de BM y PB apareadas (figura 14).
Los cebadores y la sonda usados para amplificar
el ARNm de ABL también pueden amplificar el ARNm del FG
BCR-ABL y, por tanto, el ensayo de la expresión
génica de ABL usado para normalizar los datos puede verse afectado
por los niveles del transcrito de m-bcr en las
muestras.
Sólo 3/129 pocillos dieron resultados falsos
negativos (véase Materiales y métodos para los detalles) en las
tres rondas de QC y en todos los casos la falsa negatividad se
obtuvo para las diluciones 10^{-4} de TOM-. Además, se detectaron
resultados falsos positivos en el 5,3% de las pruebas de PCR
(13/246, tabla 16).
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de los casos de CML están asociados
con la presencia de t(9;22) lo que da como resultado un
pequeño cromosoma 22 derivado conocido como cromosoma Filadelfia.
Como consecuencia, el protooncogén ABL en el cromosoma 9 se fusiona
con el gen BCR en el cromosoma 22. En pacientes con CML y
aproximadamente el 35% de pacientes adultos con ALL positivos para
Filadelfia, el punto de rotura en el cromosoma 22 está ubicado entre
los exones 12 a 16 del gen BCR, en la denominada región de
agrupamiento de puntos de rotura principal (M-bcr).
El punto de rotura en el cromosoma 9 está ubicado en la mayoría de
los casos entre los exones 1 y 2 en el gen ABL. El producto de
transcripción de este FG BCR-ABL es un ARN de fusión
aberrante de 8,5 kb con dos variantes de unión b2a2 y/o b3a2 que da
lugar a la proteína quimérica BCR-ABL (p210), una
tirosina cinasa con actividad desregulada. Pueden observarse casos
raros con trascritos de BCR-ABL b2a3 y b3a3.
Debido a su alta sensibilidad, se ha usado de
manera amplia RT-PCR cualitativa para monitorizar la
enfermedad residual en CML, produciendo resultados parcialmente
contradictorios. El análisis secuencial de pacientes que recibieron
trasplante de BM alogénico (BMT) mostró que la positividad para PCR
repetida se correlacionaba con un aumento del riesgo de recidiva.
Por el contrario, otros estudios no encontraron ninguna correlación
entre la positividad para PCR y la recidiva posterior y mostraron
que los supervivientes a largo plazo de BMT alogénico podrían ser
positivos para PCR incluso años tras el trasplante sin sufrir nunca
recidiva.
Varios grupos desarrollaron un método de
RT-PCR competitiva para cuantificar el nivel de
transcritos de FG BCR-ABL en un esfuerzo por
mejorar el valor predictivo de la detección de ARNm de
BCR-ABL. El análisis secuencial de pacientes que
habían experimentado BMT mostró que la monitorización de los niveles
de transcritos de FG BCR-ABL puede ser útil para
predecir una recidiva inminente mientras que el paciente está
todavía en remisión hematológica y citogenética. Basándose en
estudios de RT-PCR cuantitativa, dos grupos han
propuesto definir un parámetro de "recidiva molecular".
Además, la cuantificación de los transcritos de FG
BCR-ABL también se ha demostrado que es útil para
monitorizar la respuesta en pacientes tratados con
\alpha-interferón e imatinib.
A pesar de muchos informes alentadores, la
monitorización de los trascritos de FG BCR-ABL con
RT-PCR competitiva ha tenido un impacto clínico
limitado, debido parcialmente al hecho de que este enfoque es
difícil de normalizar. Desde la llegada de la PCR en tiempo real,
varios grupos han publicado informes que describen la viabilidad de
monitorizar pacientes con CML con esta técnica. Sin embargo, la
mayoría de los estudios de RQ-PCR incluían
demasiados pocos pacientes o pacientes de diferentes protocolos
terapéuticos que junto con las diferencias metodológicas hacen
difícil evaluar el impacto clínico y definir directrices generales
para monitorizar pacientes con CML con RQ-PCR. La
disponibilidad de un protocolo normalizado para la
RQ-PCR facilitará la comparación de datos entre
diferentes centros, haciendo posible definir un umbral en el que es
probable que un paciente experimente recidiva y en última instancia
evaluar el impacto de una intervención terapéutica temprana
basándose en la cinética de los transcritos de FG
BCR-ABL.
Se diseñaron dos cebadores de BCR directos
alternativos, uno ubicado en el exón 13 de BCR (exón b2) y el
segundo en el exón 14 de BCR (exón b3) y una sonda y un cebador de
ABL inverso, ambos en el segundo exón del gen ABL (figura 12). Este
conjunto, junto con cinco conjuntos comparables ya disponibles
dentro de la red, se evaluó para determinar la sensibilidad así
como la robustez de la reacción de PCR (véase la sección Materiales
y métodos). Basándose en estos parámetros, se eligió el conjunto
diseñado por el grupo de EAC. Dado que se amplificaron series de
diluciones de la línea celular K-562 con igual
eficacia con cualquiera de los dos cebadores directos, se
seleccionó un cebador directo común ENF501, ubicado en el exón 13 de
BCR (exón b2) para amplificar ambas variantes de fusión de
BCR-ABL b3-a2 y
b2-a2 (figura 12, tabla 17). Un ejemplo de gráficas
de amplificación típicas (diluciones de ARN de línea celular
10^{-1}, 10^{-3}, 10^{-4}) se muestra en la figura 15.
Se cuantificó la expresión de los transcritos de
BCR-ABL M-bcr en 29 pacientes con
CML con el fin de establecer el intervalo de niveles de expresión
de FG en muestras de diagnóstico (tabla 18, figura 16a). Estas
muestras incluían 15 muestras de BM y 14 de PB. La expresión del FG
BCR-ABL en relación con CG era muy similar entre BM
y PB. No se encontraron grandes variaciones en los niveles de
expresión de BCR-ABL M-bcr entre
pacientes individuales. Se encontró que la expresión de ARNm de
BCR-ABL en la línea celular K-562
era superior que en muestras de diagnóstico de CML en dos
logaritmos en relación con el gen B2M y un logaritmo en relación con
el gen GUS (véase la tabla 18).
Además de muestras de diagnóstico de pacientes
con CML en fase crónica, se cuantificó la expresión de
BCR-ABL M-bcr en muestras de
diagnóstico de ALL positivas para BCR-ABL
M-bcr (tabla 19, figura 16b). Se encontró que la
expresión de BCR-ABL en relación con B2M y GUS era
superior en muestras de ALL en comparación con muestras de CML
(tablas 18 y 19). Los inventores observaron una diferencia
estadística en el nivel de expresión de FG entre pacientes con CML
y ALL con M-bcr o bien con B2M o bien con GUS como
CG (p=0,001), mientras que no se observaron diferencias entre
m-bcr y M-bcr en ALL (figura
17).
El conjunto de cebadores diseñado para
amplificar el gen de control ABL está ubicado en el exón 2 y también
amplifica el FG BCR-ABL. Por este motivo, el uso de
ABL como gen de control podría introducir un sesgo para cuantificar
BCR-ABL en muestras de ALL Ph+ y de CML cuando una
gran proporción de las células expresa BCR-ABL. El
uso de la razón (BCR-ABL/ABL) conduciría
teóricamente a una subestimación de la carga tumoral en estas
muestras dado que la razón máxima es uno. Sin embargo, este sesgo
tuvo un impacto minoritario en la cuantificación relativa de
transcritos de FG en el diagnóstico (véase a continuación). Los
inventores encontraron valores de hasta 3,0 en muestras de BM y de
hasta 4,4 en muestras de PB de pacientes con CML en el diagnóstico
(tabla 18), aunque todas las medianas de las razones
BCR-ABL/ABL eran inferiores a 1, excepto para PB de
pacientes con CML en el diagnóstico (tablas 15 y 18). Estos
resultados inesperados obtenidos con calibradores de plásmidos se
confirmaron sin calibradores (método de ACt) e ilustran claramente
los límites de precisión de la cuantificación de transcritos
génicos mediante RQ-PCR. Se observaron resultados
similares en un contexto de oligocentro.
El porcentaje de falsos positivos era del 4,9%
(14/285) para la primera y segunda rondas de control de calidad
(tabla 20). Los laboratorios que mostraron los resultados falsos
negativos tenían una reducción consecuente en la sensibilidad para
todas las dianas en una fase particular, lo que indicaba que la
causa de la inferior sensibilidad era una eficacia de RT inferior en
vez de un problema relacionado con la PCR.
En la tercera ronda de control de calidad (fase
IVa), se observó una tasa de falsa positividad (5,5%, 6/110)
similar a las fases previas a pesar de una frecuencia
particularmente alta (18%, 4/22) de resultados falsos positivos
dentro de muestras negativas para FG (tabla 20). Esta observación se
explica posiblemente por la inclusión del ARN de
K-562 no diluido entre las muestras codificadas, en
lugar de la dilución 10^{-1} y de ese modo el aumento del riesgo
de contaminar accidentalmente pocillos vecinos cuando se pipetea el
ADNc sobre la placa de PCR. Debe indicarse que la mayoría de las
muestras falsas positivas (NAC/NTC) se concentraron en laboratorios
individuales mientras que el resto de los laboratorios (un
laboratorio por ronda de QC) mostró sólo ocasionalmente pocillos
falsos positivos individuales o no mostró falsos positivos.
La microdeleción en 1p32 es la aberración
cromosómica más frecuente encontrada en T-ALL
infantil. La microdeleción implica el gen TAL1 (gen de leucemia 1
aguda de células T, también conocida como leucemia de células madre
(SCL) o gen 5 de leucemia de células T (TCL5)) y el gen SIL (locus
interruptor de SCL), que está ubicado a aproximadamente 90 kb en el
sentido de 5'. Como resultado, las secuencias codificantes de TAL1
se colocan bajo el control del promotor de SIL, que se expresa en
células T, y por consiguiente el gen TAL1 se expresa de manera
ectópica en la T-ALL implicada.
El gen TAL1, en particular los exones 4, 5 y 6,
codifica para una proteína de 42 kDa, que es un factor de
transcripción de hélice-bucle-hélice
básico (bHLH). La proteína de TAL1 puede formar heterodímeros con
otros factores de transcripción bHLH, incluyendo miembros de la
familia de E2A, y es un factor esencial para el desarrollo de todos
los linajes hematopoyéticos. El gen SIL es un miembro de la familia
génica inmediata-temprana, pero su función en
células hematopoyéticas no está aún bien definida.
Aunque tanto los genes SIL como TAL1 contienen
varios puntos de rotura de deleción conservados, la mayoría de los
casos (\geq 95%) implican el punto de rotura sildb1 en combinación
con el punto de rotura taldb1 o taldb2. Mediante corte y empalme
alternativo, pueden formarse tres transcritos de
SIL-TAL1 diferentes, de los que el transcrito de
tipo II es el más predominante. No hay relación aparente entre la
aparición de los transcritos de SIL-TAL1 y el
pronóstico o desenlace.
Se encuentran exclusivamente transcritos de
SIL-TAL1 en T-ALL, en la que están
presentes en el 5-25% de los pacientes. La
frecuencia está relacionada con el inmunofenotipo de la
T-ALL (la presencia del FG SIL-TAL1
está restringida a la T-ALL CD3- y
TCR\alpha\beta+) y la aparición de deleciones génicas de TCRD.
Los transcritos de FG SIL-TAL1 parecen ser más
frecuentes en niños en comparación con adultos.
La detección de deleciones de TAL1 al nivel del
ADN ya se ha descrito. Un informe reciente describió un método de
RQ-PCR a base de TaqMan para la detección de
deleciones de TAL1 a nivel del ADN en pacientes con
T-ALL. En ese informe, se colocaron el cebador
directo y la sonda en el exón 1b de SIL (y parte del siguiente
intrón) y el cebador inverso se ubicó en el exón 1b de TAL1. Usando
la línea celular CEM, pudo obtenerse una sensibilidad de 10^{-5},
que es equivalente a un único genoma leucémico. Que los inventores
sepan, no se han publicado hasta la fecha conjuntos de
cebadores/sonda para RQ-PCR para transcritos de FG
SIL-TAL1.
Inicialmente, se sometieron a prueba tres sondas
TaqMan (ubicadas en el exón 1a de SIL, el exón 4 de TAL1 y el exón
5 de TAL1), dos cebadores directos (ambos en el exón 1a de SIL) y
cinco cebador inversos (dos en el exón 3 de TAL1, dos en el exón 4
de TAL1 y uno en el exón 6 de TAL1) para determinar la especificidad
y eficacia.
Se seleccionaron un único cebador directo
(ENF601; ubicado en el exón 1a de SIL), un cebador inverso (ENR664;
ubicado en el exón 3 de TAL1) y una sonda (ENP641; ubicada en el
exón 1a de SIL) (figura 18 y tabla 21). Un ejemplo de gráficas de
amplificación típicas (diluciones de ARN de línea celular 10^{-1},
10^{-3}, 10^{-4}) se muestra en la figura 19.
El conjunto de cebador/sonda seleccionado
detectará prácticamente todos los transcritos de
SIL-TAL1 (el tipo II más común así como el tipo
III), pero no detectará translocaciones de TAL1 o la expresión
"aberrante" del gen TAL1 sin redisposiciones aparentes.
Se sometió a prueba ARN sin diluir de seis
líneas celulares positivas para SIL-TAL1 diferentes
por duplicado para determinar la expresión de CG (ABL, B2M y GUS) y
por triplicado para determinar la expresión del FG
SIL-TAL1 (tabla 22). En tres laboratorios, se
incluyó también un total de dieciséis pacientes positivos para
SILTAL1 en el diagnóstico (10 muestras de BM y 10 de PB, incluyendo
cinco pares).
Los valores de Ct para los transcritos de CG
eran significativamente inferiores en las líneas celulares en
comparación con las muestras de pacientes (tabla 22), lo que puede
deberse al hecho de que se usaron muestras de pacientes almacenadas
o alternativamente a que su expresión es superior en líneas
celulares que en muestras de pacientes primarias. La expresión del
transcrito de SIL-TAL1 (Ct, CN y NCN) era comparable
entre las seis líneas celulares sometidas a prueba, pero en los
pacientes se encontró una variación ligeramente más grande en la
expresión del transcrito de FG SIL-TAL1 (tabla 22).
No obstante, la expresión normalizada del transcrito de FG
SIL-TAL1 no era diferente entre líneas celulares y
pacientes. Además, la comparación entre muestras de BM y PB
(incluyendo cinco pares) mostró que la expresión del transcrito de
SIL-TAL1 era similar en ambos compartimentos
(figura 20).
Se observó falsa positividad en dos de 46
muestras negativas para FG (4,3%) y en ninguno de 162 pocillos de
NAC/NTC (0%) dando como resultado una falsa positividad total del
1,0% (2/208). Sólo se observó falsa negatividad en la primera ronda
de QC (fase IIIa), pero estaba ausente en las dos siguientes rondas
de QC (tabla 23). Por tanto, la falsa negatividad no parece ser un
problema, aunque esto puede depender del nivel de transcritos de FG
SIL-TAL1 en la muestra de células leucémicas.
Los transcritos de FG PML-RARA,
que son el resultado molecular de la translocación
t(15;17)(q22;q21), están asociados con la mayoría de los
casos de APL, un subconjunto de AML distinto con citomorfología
M3.
La APL representa el 10-15% de
la AML de novo en adultos más jóvenes en el sur de Europa.
Entre pacientes pediátricos, se considera habitualmente que la
incidencia de APL es inferior y que representa el
3-9%, aunque datos publicados de estudios
cooperativos italianos indican que la APL se produce en niños
italianos con la misma incidencia observada en adultos. Además,
varias pequeñas series de diferentes países en América central y
del sur han indicado una frecuencia mayor de la esperada de APL
pediátrica.
Los dos genes fusionados en la t(15;17)
son PML, ubicado en el cromosoma 15 y el gen del receptor \alpha
de ácido retinoico (RARA) en el cromosoma 17. Se ha mostrado que
otros genes se fusionan a RARA en ejemplos poco comunes de casos de
APL morfológica negativos para la t(15;17), tales como PLZF
en el cromosoma 11q23, NPM en 5q35, NUMA en 11q13 y STAT5B en
17q21.
La proteína quimérica PML-RARA
es un represor transcripcional. En ausencia de ligando (ácido
retinoico, RA), se une al ADN junto con correpresores tales como
SMRT (mediador de silenciamiento para RAR y TR) y
N-CoR (correpresor de receptor nuclear) y hace que
la cromatina sea inaccesible a activadores transcripcionales o la
maquinaria de transcripción basal.
Los puntos de rotura de RARA se producen siempre
en el intrón 2, que tiene 17 Kb de longitud (figura 21). En cambio,
tres regiones del locus de PML están implicadas en los puntos de
rotura de la translocación t(15;17): el intrón 6 (bcr1; 55%
de los casos), el exón 6 (bcr2; 5%) y el intrón 3 (bcr3; 40%)
(figura 21). Como consecuencia, hay tres posibles isoformas de
PML-RARA, denominadas larga (L, o bcr1), variante
(V, o bcr2) y corta (S, o bcr3). Debe indicarse que el tamaño de
los productos de PCR varía en casos positivos para bcr2, debido a
las posiciones variables de los puntos de rotura en el exón 6 del
gen PML y a la inclusión de un número variable de nucleótidos
derivados del intrón 2 de RARA en el transcrito de FG. Se forman
transcritos quiméricos de PML-RARA y
RARA-PML como consecuencia de la translocación
recíproca entre los loci de PML y RARA. Sin embargo, la observación
de que los transcritos de FG RARA-PML están
presentes en la mayoría pero no en todos los casos de APL, ha
favorecido el uso de los transcritos de FG PML-RARA
como diana de PCR para la detección de células con APL en el
diagnóstico y durante la monitorización. Se han desarrollado
condiciones normalizadas para el análisis mediante
RT-PCR de los transcritos de FG
PML-RARA mediante la acción concertada
BIOMED-1 (5). Se han diseñado conjuntos de
cebadores para permitir la detección de los diversos transcritos de
FG PML-RARA, generados mediante la existencia de
diferentes regiones
de puntos de rotura de PML así como la presencia de corte y empalme alternativo entre exones centrales de PML.
de puntos de rotura de PML así como la presencia de corte y empalme alternativo entre exones centrales de PML.
En la última década, la disponibilidad de
terapia de diferenciación con ácido todo-trans
retinoico (ATRA) ha producido una mejora notable en el desenlace de
pacientes con APL. El desafío es cómo identificar el subgrupo
relativamente pequeño de pacientes con riesgo particular de recidiva
que no pueden distinguirse de manera fiable basándose en las
características antes del tratamiento y que se beneficiarían
posiblemente de un tratamiento más intenso en la primera remisión.
Globalmente, hay un acuerdo general de que una prueba positiva para
PML-RARA tras la consolidación es un factor de
pronóstico fuerte de recidiva hematológica posterior, mientras que
resultados repetidamente negativos están asociados con
supervivencia a largo plazo en la mayoría de los pacientes. Un
grupo notificó que la reaparición de positividad para PCR, detectada
mediante la vigilancia de BM cada tres meses de médulas realizada
tras la finalización de la terapia, era altamente predictiva de
recidiva. Usando una estrategia de este tipo, se pronosticaron
satisfactoriamente aproximadamente el 70% de las recidivas. Se ha
usado una perspectiva diferente en la aplicación de MRD para
identificar pacientes con APL con riesgo superior de recidiva
mediante el ensayo MRC ATRA, en el que se evaluó la cinética de
lograr una remisión molecular. Finalmente, tiene que comprobarse
todavía el beneficio del tratamiento temprano
en el momento de la recidiva molecular, aunque las pruebas preliminares apoyan una estrategia de este tipo.
en el momento de la recidiva molecular, aunque las pruebas preliminares apoyan una estrategia de este tipo.
Entre los diferentes métodos (cariotipificación
convencional, FISH e inmunotinción de PML con anticuerpos
específicos), la detección mediante RT-PCR de los
transcritos de FG PML-RARA parece ser el único
enfoque adecuado para la detección de MRD (5). Además, la PCR
cuantitativa podría proporcionar información sobre la correlación
entre los diferentes niveles de enfermedad en fases tempranas de la
terapia y el desenlace clínico. Sin embargo, ha habido
relativamente pocos estudios que notifiquen el uso de
RQ-PCR en pacientes con APL.
Se evaluaron una sonda y dos cebadores inversos
en el exón 3 del gen RARA en combinación con siete cebadores
directos en el gen PML. Se diseñaron cinco cebadores directos en el
exón 6 de PML, dos y tres cebadores específicos para los puntos de
rotura bcr1 y bcr2 respectivamente, mientras que se diseñaron dos
cebadores para bcr3 en el exón 3 de PML. Basándose en datos
publicados sobre la localización de los puntos de rotura de PML
bcr2, se diseñaron los cebadores directos respectivos en el exón 6
de PML con el fin de cubrir al menos el 80% de los casos de bcr2.
La única línea celular disponible para las pruebas era
NB-4,165 que tiene un punto de rotura de PML bcr1;
para la evaluación de los conjuntos de cebador/sonda bcr2 y bcr3, se
usó ARN de BM de pacientes en el diagnóstico. Se prepararon
constructos de plásmido para las tres variantes de punto de rotura
de PML-RARA (véase la sección Materiales y
métodos).
Tras amplias pruebas en la línea celular y
diluciones de plásmido y ARN del paciente, se seleccionaron tres
conjuntos de cebador/sonda específicos, basándose en la sensibilidad
máxima: la sonda de RARA ENP942, el cebador inverso común de RARA
ENR962 y tres cebadores directos de PML ENF903 (para bcr1), ENF906
(para bcr2) y ENF905 (para bcr3), respectivamente (figura 21). Las
secuencias se enumeran en la tabla 24. Aunque puede usarse
posiblemente ENF906 para amplificar casos de bcr1 así como de bcr2,
la comparación directa de ENF906 y ENF903 para la amplificación de
PML-RARA en diluciones en serie de la línea celular
NB-4 reveló que este último cebador proporciona un
ensayo más sensible para la amplificación de casos de bcr1. Un
ejemplo de gráficas de amplificación típicas (ARN 10^{-1},
10^{-3}, 10^{-4} de NB-4 (bcr1) en ARN de PBL)
se muestra en la figura 22.
Se estudió la expresión de
PML-RARA en la línea celular NB-4 y
en 16 pacientes positivos para AML-M3 bcr1. (Tabla
25, figura 23). Las muestras de pacientes consistían en 14 muestras
de BM y 9 de PB, incluyendo seis muestras de BM/PB apareadas,
obtenidas en el diagnóstico. Las muestras contenían del 10% al 100%
de blastocitos leucémicos. Se calcularon los números de copias
normalizados y se ajustaron para el porcentaje de blastocitos
presentes en cada muestra. La expresión de PML-RARA
en la línea celular NB-4 estaba dentro del intervalo
de expresión de FG detectado en muestras de leucemia primaria.
Se estudió la expresión de
PML-RARA en seis pacientes positivos para bcr3 en el
diagnóstico, que consistían en seis muestras de BM y cuatro de PB
(incluyendo cuatro muestras de BM/PB apareadas). Aunque el número
era muy limitado, no se observaron diferencias significativas en la
expresión de PML-RARA bcr3 cuando se compararon PB
y BM en muestras apareadas excepto para los resultados normalizados
para B2M (véase la figura 23).
Durante las diversas rondas de QC, se sometieron
a prueba 145 muestras negativas en de 7 a 11 laboratorios durante
las tres fases (tabla 26). Cinco de 100 muestras de NAC/NTC (5%) y
cinco de 45 muestras negativas para FG (11%) eran falsamente
positivas para la amplificación de bcr1 (tabla 26). Globalmente, la
frecuencia de falsa positividad era del 6,9% (10/145). La
denominada falsa positividad se limitó a laboratorios individuales
y el valor de Ct en el pocillo falso positivo era siempre mayor de
30 y la mayoría de las veces superior a 35.
En cambio, según los criterios mencionados
anteriormente, no se observó ninguna muestra falsa negativa (n =
96) para las diluciones 10^{-3} y 10^{-4}, ni para bcr1, bcr2 ni
bcr3. Ninguno de los 42 pocillos sometidos a prueba
independientemente para bcr2 y bcr3 a la dilución 10^{-4} resultó
falsamente positivo. Sólo 8 de 180 pocillos (4,4%) sometidos a
prueba para bcr1 a la dilución 10^{-4} resultaron falsamente
negativos.
La inversión pericéntrica del cromosoma 16,
inv(16)(p13q22), se encuentra en aproximadamente el
8-9% de los casos de AML recién diagnosticados. Las
AML positivas para inv(16) se incluyen con las de la
translocación t(8;21) en un grupo denominado generalmente
leucemias de "factor de unión central" ("Core Binding
Factor") (CBF), caracterizándose ambas por redisposiciones
de genes que codifican para componentes del factor de transcripción
heterodimérico CBF, que desempeña un papel esencial en la
hematopoyesis. Inv(16) o la t(16;16)(p13;q22) poco
común conducen a la fusión del gen de la cadena CBFB con el gen
MYH11 de la cadena pesada de la miosina del músculo liso. El ARNm
de FG resultante puede detectarse mediante RT-PCR y
representa un marcador molecular adecuado tanto para estudios de
diagnóstico como de monitorización. Hasta la fecha, se han
notificado diez transcritos de FG CBFB-MYH11
diferentes. Más del 85% de los pacientes positivos tienen el
transcrito de tipo A; los transcritos de tipo D y E representan
cada uno casi el 5%, mientras que los otros tipos se producen en
casos esporádicos. La AML positiva para CBFB-MYH11
se considera habitualmente que tiene un pronóstico favorable,
obteniendo más del 50% de los pacientes CR (respuesta completa) a
largo plazo. Tales resultados favorables con quimioterapia
convencional condujeron a algunos autores a considerar que el BMT
alogénico no está indicado para consolidar la primera CR en estos
pacientes, ni siquiera cuando se dispone de un donante adecuado. No
obstante, la tasa de recidiva es todavía alta, lo que indica que se
necesitan métodos fiables para detectar MRD durante el CR
hematológico con el fin de adaptar mejor la intensidad de la terapia
tras la remisión a cohortes específicas de pacientes. Hasta la
fecha, el uso de métodos basados en RT-PCR
cualitativa empleados para detectar transcritos de FG
CBFB-MYH11 no permitió la discriminación constante
de subgrupos de pronóstico de pacientes en CR. De hecho, el uso de
RT-PCR anidada convencional ha producido resultados
de MRD conflictivos: mientras que en la mayoría de los informes se
encontró que la inmensa mayoría de los pacientes en CR prolongada
eran negativos para PCR, algunos supervivientes a largo plazo nunca
se convirtieron en negativos para RT-PCR. Además,
el 10-20% de los pacientes negativos para PCR
experimentó finalmente recidiva, lo que sugiere que lograr la
negatividad para PCR no es sinónimo de cura. Algunas de las
dificultades al interpretar los resultados anteriores se derivan de
la falta de normalización de las metodologías implicadas. Los
estudios de RT-PCR cuantitativa usando
RQ-PCR o PCR competitiva permitieron monitorizar la
disminución de transcritos de FG CBFB-MYH11 durante
las fases tempranas de las terapias de inducción y consolidación.
Sin embargo, debido al bajo número de pacientes
examinados hasta la fecha, no fue posible definir una cinética o un nivel de punto de corte para pronosticar la recidiva.
examinados hasta la fecha, no fue posible definir una cinética o un nivel de punto de corte para pronosticar la recidiva.
Durante la fase I, los inventores sometieron a
prueba seis conjuntos de cebador/sonda: tres para la forma A, dos
para la D y una para la E. Dado que los transcritos de
CBFB-MYH11 de tipo A, D y E representan
aproximadamente el 95% de todos los casos, con el fin de amplificar
estos transcritos, los inventores decidieron usar un cebador
directo común ubicado en el exón 5 de CBFB (ENF803) y una sonda
común ubicada en el exón 5 de CBFB (ENPr843). Se eligieron tres
cebadores inversos diferentes ubicados respectivamente en el exón 12
de MYH11 para el tipo A (ENR862), el exón 8 de MYH11 para el tipo D
(ENR863) y el exón 7 de MYH11 para el tipo E (ENR865) (figura 24 y
tabla 27). Un ejemplo de gráficas de amplificación típicas
(diluciones de ARN 10^{-1}, 10^{-3}, 10^{-4}) se muestra en
la figura 25 para los tres tipos de transcritos de
CBFB-MYH11.
Se sometió a prueba ARN puro de la línea celular
ME-1 (tipo A) en ocho laboratorios diferentes (tabla
28). Además, se analizaron muestras de BM o PB de diagnóstico de 24
pacientes de tipo A, tres de tipo D y cuatro de tipo E (figura 26).
Los valores de transcritos de FG en el diagnóstico eran similares en
las tres categorías de pacientes, aunque muestran un intervalo de
variación de paciente a paciente de un logaritmo.
No se observó ningún resultado falso negativo
para la dilución 10^{-3}, mientras que a la dilución 10^{-4} se
observó un máximo del 12% de resultados falsos negativos (tabla 29).
La falsa positividad estaba ausente durante todas las fases en
pocillos de NAC y NTC (0%, n = 104), mientras que se observó un
único caso (2 pocillos de 16) de falsa positividad durante la fase
IVa en una muestra negativa para FG codificada y se debía a
contaminación (tabla 29).
El gen de fusión AML1(CBFA2,
RUNX1)-ETO (MTG8) resulta de la
t(8;21)(q22;q22) que es la redisposición cromosómica más
común asociada con AML, detectándose en aproximadamente el 8% de los
casos de AML en niños y adultos jóvenes. El gen AML 1 codifica para
la subunidad \alpha2 del factor de transcripción heterodimérico
CBF (factor de unión central) que es crítico para el desarrollo
hematopoyético y cuya subunidad \beta está alterada por la
inv(16)/t(16;16) que conduce al FG
CBFB-MYH11 FG (véase el ejemplo 8).
Tal como se muestra en la figura 27, los puntos
de rotura de AML1 están ubicados en el intrón 5, mientras que los
puntos de rotura de ETO se producen en el sentido de 5' del exón 2.
Esto da lugar a un único tipo de transcrito de FG
AML1-ETO, en el que el exón 5 de AML1 está fusionado
con el exón 2 de ETO (5), simplificándose de ese modo las
estrategias de selección molecular y monitorización de MRD en
comparación con FG con múltiples regiones de puntos de rotura,
tales como t(4;11) con MLL-AF4,
t(15;17) con PML-RARA e inv(16) con
CBFB-MYH11.
AML1-ETO es una importante diana
de PCR para la detección de MRD en vista del desenlace generalmente
favorable de los pacientes con la t(8;21), de manera que se
ha mostrado que el uso rutinario de BMT en la primera CR no
confiere beneficio de supervivencia global. Por tanto, es de
importancia primordial identificar el subgrupo relativamente
pequeño de pacientes con alto riesgo de recidiva que podrían
beneficiarse de la terapia adicional. Sin embargo, el papel de la
detección de MRD en la AML positiva para AML1-ETO ha
sido algo controvertido en vista de la detección de transcritos de
FG en pacientes con remisión a largo plazo tras la quimioterapia,
PBSCT/BMT autólogo e incluso BMT alogénico. Se ha observado que la
detección de transcritos residuales en pacientes que están curados
de su enfermedad proporciona pruebas de que AML1-ETO
es insuficiente para mediar AML y se ha mostrado recientemente que
se relaciona con una fracción de células madre, monocitos y células
B presente en la médula en remisión. Por tanto, es probable que los
informes relativamente frecuentes de positividad para PCR en
pacientes que se consideran curados de AML positiva para
t(8;21) reflejen los niveles superiores de sensibilidad
logrados comúnmente para ensayos de RT-PCR de
AML1-ETO (normalmente de 1 en 105 a de 1 en 106),
en comparación con los de otras dianas de FG de AML (normalmente 1
en 104-105). A pesar del hecho de que un reciente
estudio haya mostrado que la RT-PCR cualitativa
convencional tiene el potencial de proporcionar un factor de
pronóstico independiente en la AML positiva para
AML1-ETO, ha habido algunos problemas referentes a
la idoneidad de los ensayos de "punto final" sensibles para la
detección de MRD como medio de determinación del enfoque de
tratamiento en este subgrupo de pacientes.
A lo largo de los últimos años, se han
investigado métodos de RT-PCR cuantitativa para
determinar si pueden identificar de manera más fiable el subgrupo
relativamente pequeño de pacientes destinados a recidiva. Ensayos
de RT-PCR competitiva han revelado la variación en
la expresión de AML1-ETO en relación con ABL entre
casos en el diagnóstico (10 veces en BM, 32 veces en PB) y sugieren
que los ARNm de AML1-ETO y ABL tienen estabilidad
comparable. Además, estos estudios revelaron cinéticas variables de
reducción del transcrito de FG tras la quimioterapia. Los pacientes
con niveles bajos o indetectables de transcritos de
AML1-ETO estaban asociados con el mantenimiento de
CCR, mientras que números altos o crecientes de transcritos
pronosticaban recidiva. Estos datos preliminares prometedores
sugieren que la RQ-PCR es probablemente valiosa para
la monitorización de MRD en este subconjunto de AML, con las
ventajas añadidas de que esta última técnica es menos laboriosa,
más reproducible y más susceptible de normalización prestándose por
sí misma a su uso en ensayos clínicos a gran escala. Estudios
preliminares de RQ-PCR han confirmado esencialmente
los resultados obtenidos mediante RT-PCR
competitiva, revelando una variación de 3,5-20 veces
en los niveles de expresión de FG AML1-ETO en BM de
diagnóstico que no estaba relacionada con el porcentaje de
blastocitos y que es necesario tener en cuenta cuando se evalúa la
respuesta a la terapia. Además, se indicó la variabilidad en la
cinética de respuesta a la quimioterapia y de manera interesante,
se detectaron también transcritos de AML1-ETO en
pacientes con remisión a largo plazo de AML. Sin embargo, el valor
predictivo de la RQ-PCR sigue teniendo que
establecerse en grandes números de pacientes sometidos a un enfoque
de tratamiento constante.
Inicialmente, se sometieron a prueba las
secuencias de cebador y sonda publicadas por Marcucci et al
(7) junto con dos conjuntos "internos". Mientras que el primer
conjunto de cebador/sonda era superior en lo que se refiere a la
sensibilidad, los inventores observaron señales de fondo recurrentes
significativas en las muestras de control negativo. Por tanto, los
inventores decidieron diseñar dos nuevas sondas compatibles con
este conjunto de cebadores conduciendo a la selección de ENP747
colocado en el punto de rotura, junto con el cebador directo ENF701
colocado en el exón 5 de AML1 y el cebador inverso ENR761 en el exón
2 de ETO (figura 27 y tabla 30). (5) La línea celular disponible
para la pruebas era KASUMI-1. Se encontró que el
ensayo de RQ-PCR de AML1-ETO era
particularmente robusto, asociado con un \DeltaRn relativamente
alto (véase la figura 28a). Se evaluó por tanto la reducción en la
concentración de la sonda desde 200 nM hasta 100 nM. La disminución
en la concentración de la sonda no afectó a la sensibilidad del
ensayo y el artefacto de "aumento gradual de la línea base"
("baseline creeping") se observó sólo muy pocas veces
(figura 28b).
Se sometió a prueba ARN sin diluir de la línea
celular KASUMI-1 en cinco laboratorios diferentes
(tabla 31). Cuatro laboratorios diferentes emprendieron el análisis
de ARN de diagnóstico archivado de 22 muestras de pacientes. Todas
las diferencias entre BM y PB por gen de control no eran
significativas en muestras apareadas (n = 10, prueba de Wilcoxon).
Tras aplicar los criterios de exclusión, se evaluaron 12 muestras de
PB y 10 de BM (tabla 31).
La expresión del transcrito de FG
AML1-ETO (Ct y CN) era superior en la línea celular
KASUMI-1 que en las muestras de pacientes (mediana
de la diferencia de aproximadamente dos valores de Ct). Entre las
muestras de pacientes, no se observó ninguna diferencia en la
expresión del transcrito de FG AML1-ETO. Con
respecto a los genes de control, la expresión de ABL era comparable
entre la línea celular y las muestras de pacientes. Se observó
variación significativa en la expresión de B2M, tanto entre muestras
de pacientes y la línea celular como entre muestras de BM y PB.
Para GUS, se observaron resultados intermedios (tabla 31 y figura
29).
No se observaron resultados falsos negativos (de
un total de 112 muestras analizadas) para las diluciones 10^{-3}
y 10^{-4}, lo que está en línea con la buena sensibilidad del
ensayo de RQ-PCR (tabla 32). Globalmente, la
frecuencia de falsa positividad era del 9,7% (15/154). Seis de las
108 muestras NAC/NTC (5,6%) y nueve de las 46 muestras negativas
para FG (20%) eran falsamente positivas para la amplificación de
AML1-ETO (tabla 32). En muestras negativas para FG
codificadas, la falsa positividad se restringía en la mayoría de los
casos a laboratorios individuales.
- ABL:
- gen Abelson
- ALL:
- leucemia linfoblástica aguda
- LPA:
- leucemia promielocítica aguda
- B2M:
- beta-2-microglobulina
- BM:
- médula ósea
- BMT:
- trasplante de médula ósea
- CBF:
- factor de unión central
- CG:
- gen de control
- CML:
- leucemia mieloide crónica
- CN:
- número de copias
- COEF. de CORR.:
- coeficiente de correlación
- CV:
- coeficiente de variación
- EAC:
- Europe Against Cancer (Europa contra el cáncer)
- ENF:
- cebador directo de la red europea
- ENP:
- sonda TaqMan de la red europea
- ENPr:
- sonda inversa TaqMan de la red europea
- ENR:
- cebador inverso de la red europea
- FAM:
- 6-carboxi-fluoresceína
- FG:
- gen de fusión
- FISH:
- hibridación fluorescente in situ
- GUS:
- beta-glucuronidasa
- MGB:
- unión al surco menor
- MMLV:
- virus de la leucemia murina de Moloney
- MNC:
- células mononucleares
- MRD:
- enfermedad residual mínima
- MRDv:
- valor de enfermedad residual mínima
- NAC:
- control sin amplificación
- NCN:
- número de copias normalizado
- ND:
- no realizado
- NTC:
- control sin molde
- PB:
- sangre periférica
- PBL:
- linfocito de sangre periférica
- PBMN:
- células mononucleares de sangre periférica
- PBSCT:
- trasplante de células madre de sangre periférica
- PCR:
- reacción en cadena de la polimerasa
- QC:
- control de calidad
- RQ-PCR:
- reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
- RT:
- transcripción inversa
- SENSv:
- valor de sensibilidad
- TAMRA:
- 6-carboxi-tetrametil-rodamina
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<213> Humano
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Humano
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<210> 15
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Humano
\newpage
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Humano
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Humano
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 27
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<210> 28
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<212> ADN
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<213> Humano
\newpage
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 29
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<212> ADN
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<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 31
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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<400> 31
\hskip1cm83
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm84
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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<400> 33
\hskip1cm85
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm86
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm87
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
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<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 36
\hskip1cm88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm89
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm91
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm92
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm99
Claims (5)
1. Conjuntos de ácidos nucleicos
BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden
una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y
cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 20 y
SEQ ID Nº 22.
2. Conjuntos de ácidos nucleicos
BCR-ABL para RQ-PCR que comprenden
una sonda nucleotídica que tiene la secuencia SEQ ID Nº 21 y
cebadores directo e inverso que tienen las secuencias SEQ ID Nº 23 y
SEQ ID Nº 22.
3. Uso de los conjuntos según la reivindicación
1 ó 2 en un método de RQ-PCR para la detección de
enfermedad residual mínima en pacientes leucémicos, en el que el
conjunto de la reivindicación 1 se usa para amplificar transcritos
del gen de fusión BCR-ABL m-bcr y el
conjunto de la reivindicación 2 se usa para amplificar transcritos
del gen de fusión BCR-ABL M-bcr, y
dicho método de RQ-PCR comprende:
- (i)
- seleccionar muestras amplificables y cualificadas de pacientes para el análisis posterior;
- (ii)
- definir las condiciones óptimas para realizar la reacción de RT;
- (iii)
- definir las condiciones óptimas para el protocolo de RQ-PCR; y
- (iv)
- establecer un procedimiento normalizado para el análisis de los datos,
en el que se amplifica un transcrito de gen de
control apropiado en paralelo al transcrito de gen de fusión.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que se
fija un umbral común a 0,1 para estar en fase exponencial y una
línea base común entre los ciclos 3 y 15.
5. Uso según la reivindicación 3 ó 4, que
comprende someter muestras de ARN extraídas de las muestras que van
a analizarse a una reacción de RT que comprende
- \quad
- añadir 1 \mug de ARN total en 10 \mul de H_{2}O;
- \quad
- incubar a 70ºC durante 10 min.;
- \quad
- enfriar en hielo y añadir los siguientes reactivos hasta un volumen final de 20 \mul;
- \quad
- realizar la transcriptasa inversa (o bien de MMLV o bien Superscript I o II): 100 U;
- \quad
- usando:
- \quad
- tampón RT (según la RTasa usada)
- \quad
- DNTP: 1 Mm
- \quad
- DTT: 10 Mm
- \quad
- hexámeros aleatorios: 25 \muM
- \quad
- inhibidor de ARNasa: 20 U
- \quad
- incubar posteriormente a:
- \quad
- temperatura ambiente durante 10 min.;
- \quad
- 42ºC durante 45 min.; y
- \quad
- 99ºC durante 3 min.,
- \quad
- colocar la muestra a 4ºC tras la etapa de RT; y
- \quad
- diluir el ADNc final con 30 \mul de H_{2}O.
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