ES2337595T3 - Procedimiento para la deteccion de enfermedades relacionadas con priones. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de una isoforma relacionada con EET de la proteína priónica (PrPD) en una muestra de plasma de un mamífero que incluye un ser humano, en el que dicha PrPD está presente como isoforma sensible a la proteasa o como isoforma resistente a la proteasa, consistiendo el procedimiento en: a.tratamiento de la muestra de plasma con detergentes en concentraciones entre el 0,05 y el 1% para evitar la unión inespecífica de PrPC b.puesta en contacto de la muestra de plasma con un anticuerpo de captura revestido en los pocillos de una placa de microfiltración o perlas y capaz de reconocer un epítopo conformacional en PrPD, siendo dicho epítopo específico para la isoforma relacionada con EET PrPD pero no necesariamente indicativo para la isoforma resistente a proteasa de la proteína priónica, y siendo dicho anticuerpo de captura el anticuerpo monoclonal 15B3 (DSM2298), c.eliminación de las proteínas contaminantes por lavado y d.detección de posibles complejos de PrPD-anticuerpos de captura.
Description
Procedimiento para la detección de enfermedades
relacionadas con priones.
La presente invención se dirige a procedimientos
para la detección de enfermedades priónicas en animales y seres
humanos.
Las encefalopatías espongiformes transmisibles
(EET) o enfermedades priónicas son enfermedades neurodegenerativas
letales en animales y en el hombre. El inicio de la dolencia clínica
está precedido por un periodo de larga incubación de meses a
décadas. Los síntomas clínicos de las EET incluyen demencia y
pérdida de coordinación de movimientos. En los años 1980 se
encontró que un signo común de las EET era la acumulación de una
isoforma resistente a proteasa (PrP^{res} o PrP^{Sc}) anormal
de la proteína priónica codificada por el hospedador (PrP^{C}) en
anímales y seres humanos afectados. El descubrimiento de PrP^{Sc}
proporcionó un marcador molecular que demostró ser específico para
todas las enfermedades priónicas así como el principal, y muy
probablemente el único, constituyente de la partícula infecciosa,
denominada prión.
El núcleo resistente a la proteasa de
PrP^{Sc}, designado como PrP27-30, fue descubierto
analizando fracciones de proteinasa tratadas con K con una masa
molecular aparente de 27 a 30 kDa de encéfalo de hámster sirio para
infectividad por scrapie. La secuenciación
N-terminal de
PrP-27-30 condujo a la clonación del
gen PrP codificado por el hospedador y a la identificación de la
isoforma sensible a la proteasa de la proteína priónica (PrP^{C})
en animales no infectados. El evento patógeno clave en las EET es el
cambio conformacional de la proteína priónica codificada por el
hospedador (PrP^{C}) en la isoforma patológica denominada
PrP^{Sc} (después de su primera identificación en roedores
infectados experimentalmente con scrapie). Este cambio
conformacional implica el repliegue de estructuras helicoidales
\alpha de PrP^{C} en hojas \beta de PrP^{Sc}. Esta proteína
priónica replegada, PrP^{Sc}, difiere de PrP^{C} sólo en su
estructura terciaria y, así, tiene la misma secuencia de
aminoácidos, así como las mismas modificaciones
post-traslacionales como la glucosilación ligada a
N y el anclaje GPI. La PrP^{Sc} se agrega en fibrillas amiloides y
se acumula en tejido nervioso y en menor medida en tejidos
linforreticulares.
En un hospedador infectado, los niveles de
PrP^{Sc} son directamente proporcionales a las valoraciones de
priones. Después de inoculación experimental de roedores con agentes
de EET, PrP^{Sc} es detectable habitualmente en el sistema
nervioso central semanas antes de la aparición de enfermedad, y su
nivel aumenta hasta un máximo que se alcanza hasta meses antes de
que el animal muera. Durante la fase asintomática, la infectividad y
las PrP^{Sc} se detectan fácilmente en tejidos linforreticulares.
Recientemente, se ha encontrado que PrP^{Sc} se acumula también
en tejido muscular de hámsteres afectados oralmente con scrapie y en
ratones transgénicos infectados experimentalmente.
Aunque el prototipo de todas las enfermedades
priónicas, el scrapie en ovejas y cabras, se ha conocido desde hace
más de dos siglos, una nueva forma de enfermedad priónica animal
designada como encefalopatía espongiforme bovina (EEB) se ha
desarrollado, desde su primer reconocimiento en el Reino Unido en
1986, como una zoonosis. La magnitud en que el ganado infectado por
EEB ha entrado en la cadena alimentaria humana sigue siendo asunto
de debate y ha sido objeto de una serie de estudios. Un estudio
reciente publicado por el Colegio Imperial de Londres (Donnelly,
C.A., Ferguson, N.M., Ghani, A.C. y Anderson, R.M., Statistical
Methods in Medical Research 12, 177-190 (2003))
sugirió que basándose en nuevos datos epidemiológicos hasta 1,6
millones de reses infectadas por EEB podrían haber terminado en el
plato de los consumidores británicos.
Las enfermedades priónicas humanas comprenden
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), enfermedad de
Gerstmann-Straeussler-Scheinker
(GSS), insomnio familiar fatal (IFF) y kuru. Estas enfermedades
ilustran las tres manifestaciones de enfermedades priónicas en
general, es decir, las formas esporádicas de la enfermedad (del 80
al 90% de todos los casos de ECJ), las formas heredades ligadas a
mutaciones en el gen PrP humano (GSS familiar, ECJ familiar e IFF)
y las formas infecciosas que se adquieren por trasplante, inyección
o ingestión de productos derivados de tejidos contaminados con
priones (ECJ yatrogénica, vECJ y kuru). Con la aparición de una
nueva forma de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en
el Reino Unido en 1996, se ha iniciado un nuevo episodio en la
batalla contra enfermedades humanas causadas por patógenos
transportados por el alimento. Hasta la fecha, se han comunicado 146
casos de variante de ECJ (vECJ) en el Reino Unido, y la evidencia
científica convincente sostiene una relación causal entre EEB y
vECJ. Sin que se hayan identificado factores de riesgo evidentes en
estos pacientes, parece muy probable un vínculo causal con la
exposición a productos alimenticios contaminados con EEB. La
detección de vECJ antes de que los pacientes muestren síntomas
clínicos es una prioridad urgente, ya que podría reducir
espectacularmente el riesgo de contaminación de los suministros de
sangre y el equipo hospitalario. Recientemente, un paciente en el
Reino Unido desarrolló vECJ 6,5 años después de recibir una
transfusión sanguínea de un donante que desarrolló síntomas de vECJ
3,5 años después de la donación de sangre (Llewelyn y col., 2004,
The Lancet 363, 417-421). Esto suscitó la
posibilidad de que la vECJ pudiera transmitirse por transfusión
sanguínea y subraya la necesidad de una prueba de diagnóstico para
detectar priones en sangre y fracciones de la misma. En la presente
invención se desvela un procedimiento para detectar la forma
asociada a la enfermedad de PrP en plasma de mamíferos infectados
por
EET.
EET.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como PrP^{Sc} es el único marcador molecular
fiable para enfermedades priónicas, la detección inmunológica en
tejido encefálico de la parte resistente a la proteasa de PrP^{Sc}
es la base de pruebas de diagnóstico rápidas que se usan en la
actualidad para vigilancia activa de EEB y scrapie. Debido a la
lenta cinética de acumulación de PrP^{Sc} en la fase preclínica
de la enfermedad, las capacidades actuales de diagnóstico están
fuertemente limitadas en lo que respecta a la detección de la
enfermedad precozmente en el periodo de incubación. La invención
desvelada en la presente memoria descriptiva proporciona
procedimientos para la detección de enfermedades priónicas en la
fase preclínica.
Aunque PrP^{Sc} se definió originalmente como
una isoforma de PrP parcialmente resistente a la proteasa e
insoluble en detergentes, se han identificado varias enfermedades
priónicas que se asocian con PrP anormal que carece de la
resistencia clásica a la proteasa. Las formas de PrP que se asocian
con estas enfermedades priónicas se denominan PrP^{Sc}
"sensibles a la proteasa" para distinguirlas de las formas de
PrP^{Sc} resistentes a la proteasa.
Se piensa que la detección de la conformación
relacionada con la enfermedad de la proteína priónica en tejidos de
un animal o un ser humano human es un elemento de diagnóstico de
enfermedad priónica. Para distinguir la PrP relacionada con la
enfermedad de su precursor celular PrP^{C}, se requiere
tratamiento con proteasas para destruir completamente la PrP^{C},
pero sólo eliminar una parte de PrP^{Sc}
N-terminal sensible a la proteasa, o
alternativamente puede usarse un anticuerpo que sea capaz de
distinguir entre PrP^{C} y PrP^{Sc}. Se ha desvelado un
anticuerpo semejante que ha demostrado que reacciona sólo con
PrP^{Sc} nativa pero no con PrP^{C} en nuestra solicitud de
patente WO-98/37.210 y en Korth y col, (1997, Nature
390: 74-77) con el titulo "Immunological
detection of prions" que se incorpora en la presente memoria
descriptiva como referencia para desvelar y describir dichos
anticuerpos.
La mayoría de las pruebas que se usan en la
actualidad para el diagnóstico de enfermedades priónicas se efectúan
en tejido del sistema nervioso central que se obtiene post
mortem de un animal o un ser humano que muestra enfermedad
clínica o induce a sospecha de tener la enfermedad. Las pruebas de
diagnóstico se basan en el uso de un pretratamiento para hidrolizar
la forma sensible a la proteasa de la proteína priónica seguido por
la detección de la forma resistente a la proteasa de la proteína
priónica mediante un ensayo inmunológico. Sin embargo, dichos
ensayos no detectarán la forma de PrP^{Sc} sensible a la proteasa.
Por ejemplo, la solicitud de patente WO-00/52.197
reivindica un procedimiento para detectar PrP^{Sc} en suero de un
mamífero infectado por EET. Un inconveniente importante de este
procedimiento es el uso de un pretratamiento con proteasas para
hidrolizar PrP sensible a la proteasa.
El documento
US-6.620.629-B1 constituye la
técnica anterior más cercana para la presente invención y desvela
un procedimiento para la detección de una isoforma relacionada con
EET de la proteína priónica (PrP^{D}) (aquí denominada
PrP^{Sc}) en una muestra de plasma ([0087]) a partir de un
mamífero que incluye un ser humano, en el que dicha PrP^{D} está
presente bien como isoforma sensible a la proteasa o bien como
isoforma resistente a la proteasa. El documento
US-6.620.629-B1 no desvela el
tratamiento de la muestra de plasma con detergentes en
concentraciones entre el 0,05 y el 1% para prevenir unión
inespecífica de PrP^{C} y el uso de anticuerpo 15B3. A partir del
documento WO-98/37.210 (véase reivindicación 10) el
anticuerpo 15B3 ya es conocido.
Existe una necesidad urgente de proporcionar
procedimientos simples y robustos para la detección de formas de
PrP resistentes a la proteasa y sensibles a la proteasa que se
asocien con EET y kits de diagnóstico que permitan la detección de
la enfermedad en mamíferos vivos.
Un objeto de la presente invención es superar
los inconvenientes y fallos de la técnica anterior y proporcionar
un procedimiento para la detección de una isoforma relacionada con
EET de la proteína priónica (PrP^{D}) en una muestra de plasma.
En su forma más amplía, la invención se define en la reivindicación
independiente 1: un procedimiento para la detección de una isoforma
relacionada con EET de la proteína priónica (PrP^{D}) en una
muestra de plasma de un mamífero que incluye un ser humano, en el
que dicha PrP^{D} está presente como isoforma sensible a la
proteasa o como isoforma resistente a la proteasa, consistiendo el
procedimiento en: a. tratamiento de la muestra de plasma con
detergentes en concentraciones entre el 0,05 y el 1% para prevenir
la unión inespecífica de PrP^{C}, b. puesta en contacto de la
muestra de plasma con un anticuerpo de captura revestido en los
pocillos de una placa de microfiltración o perlas y capaz de
reconocer un epítopo conformacional en PrP^{D}, siendo dicho
epítopo específico para la isoforma PrP^{D} relacionada con EET
pero necesariamente indicativo de la isoforma resistente a proteasa
de la proteína priónica, y siendo dicho anticuerpo de captura el
anticuerpo monoclonal 15B3 (DSM2298), c. eliminación de las
proteínas contaminantes por lavado y d. detección de posibles
complejos de PrP^{D}-anticuerpos de captura. Las
reivindicaciones 2 y 3 están relacionadas con formas de realización
preferidas.
Dicho procedimiento ofrecería la ventaja de
detectar vehículos de una encefalopatía espongiforme transmisible
mediante detección selectiva de sangre en busca de la presencia de
PrP relacionadas con la enfermedad y podría prevenir, por ejemplo,
que se transmitiera vECJ accidentalmente por transfusión
sanguínea.
El término "PrP" se refiere a la secuencia
común de aminoácidos de las isoformas de proteínas priónicas y no a
las diferentes conformaciones.
El término "PrP^{C}" se refiere a la
isoforma de proteínas priónicas que es abundante en mamíferos
normales y no está relacionada con EET.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
El término "PrP^{D}" se refiere a una
forma de PrP relacionada con enfermedad (EET) que se define como una
isoforma alterada conformacionalmente de la proteína priónica del
hospedador normal. PrP^{D} incluye formas resistentes a la
proteasa y sensibles a la proteasa de PrP asociadas con
enfermedad.
El término PrP^{D}) se usa de forma sinónima:
para PrP alterada conformacionalmente, por ejemplo ovina, bovina o
humana, por citar sólo algunos ejemplos.
El término "anticuerpo" se refiere a
cualquier anticuerpo generado por inmunización de un animal o por
procedimientos de selección/reconocimiento in vitro. El
anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, incluyendo fragmentos
de los mismos como Fab o anticuerpos monocatenarios. El anticuerpo
puede estar diseñado por ingeniería genética, por ejemplo,
quimérico o humanizado.
Según la presente invención se desvela un
procedimiento según se define en la reivindicación independiente
1.
El procedimiento de la invención tiene en cuenta
que la isoforma PrP^{D} relacionada con EET puede estar presente
como isoforma sensible a la proteasa o como isoforma resistente a la
proteasa. En este contexto se proporciona que la muestra se trata
con un anticuerpo de captura especial capaz de reconocer un epítopo
conformacional en la isoforma PrP^{D} relacionada con EET. El
epítopo se elige para que sea específico de la isoforma PrP^{D}
relacionada con EET pero no necesariamente indicativo de la isoforma
resistente a proteasa de la proteína priónica. Usando un anticuerpo
de captura que reconozca el epítopo conformacional descrito se
obtienen resultados óptimos especialmente en muestras que pueden
contener la PrP^{D }relacionada con EET alternativamente en la
isoforma sensible a la proteasa o resistente a la proteasa.
En una forma de realización preferida, se usa el
procedimiento para analizar muestras que incluyen PrP^{D} sólo en
la isoforma sensible a la proteasa. Dichas muestras pueden
procesarse sólo usando un anticuerpo de captura según la
invención.
En la invención el procedimiento para detectar
PrP^{D} se efectúa en plasma preparado a partir de una muestra de
sangre según un procedimiento que forma parte de esta invención.
En otra forma de realización preferida la
muestra de plasma se trata con productos químicos para permitir
condiciones de unión óptimas para el complejo de
anticuerpo/PrP^{D}.
En la invención se usa el anticuerpo 15B3 para
detectar sólo PrP^{D} pero no la forma normal de PrP. El
anticuerpo 15B3 está disponible en Prionics AG, Zurich, Suiza, y los
procedimientos para generar dichos anticuerpos se han desvelado en
el documento WO-98/37.210. Las células de hibridoma
capaces de producir anticuerpo 15B3 se han depositado en relación
con el documento WO-98/37.210 en
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH con el número de acceso: DSM ACC2298.
En otra forma de realización preferida más de la
invención el complejo de anticuerpo/PrP^{D} se detecta directa o
indirectamente mediante un ensayo inmunológico.
Otra forma de realización preferida de la
invención proporciona un procedimiento para la detección del
complejo anticuerpo/PrP^{D} usando una ELISA tipo sándwich con un
anticuerpo etiquetado que reconoce el término N de la proteína
priónica.
Una forma de realización preferida de la
invención consiste en usar el procedimiento para la detección de
PrP^{D} para pruebas de muestras de sangre humana para decidir si
la sangre es segura para transfusión.
En la presente descripción se proporcionan kits
de diagnóstico para el diagnóstico de las EET en mamíferos
vivos.
Según la descripción, el procedimiento para
detección de PrP^{D} en el diagnóstico de las EET comprende
- 1)
- recogida de una muestra de sangre de un animal o un ser humano
- 2)
- preparación de sangre total, plasma, suero, glóbulos rojos (GR) o glóbulos blancos (GB) a partir de muestra de sangre y tratamiento de plasma para la unión del analito PrP^{D} con el anticuerpo
- 3)
- incubación de la muestra de sangre con un anticuerpo específico de PrP^{D} como anticuerpo de captura
- 4)
- lavado del complejo de anticuerpo/PrP^{D} para eliminar proteínas contaminantes
- 5)
- detección del complejo de anticuerpo/PrP^{D} con un ensayo inmunológico sensible.
En lo siguiente, se describirán en más detalle
las etapas individuales con referencia a los ejemplos específicos.
Debe entenderse que el procedimiento y los componentes desvelados no
se limitan a muestras, agentes químicos, anticuerpos, etiquetas o
ensayos en particular ya que pueden variar. A menos que se defina de
otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la
presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que
entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta
invención.
Se extrae una muestra de sangre de un mamífero y
se coloca en un recipiente que contiene un anticoagulante como
EDTA, citrato de sodio o heparina. Un anticoagulante preferido es
EDTA pero pueden usarse otros con resultados similares. La
separación del plasma de las células sanguíneas se realiza mediante
centrifugado a 1000x g. Otras muestras preferidas son líquidos
corporales como saliva, orina o liquido cefalorraquídeo. Si se usa
suero, la sangre se extrae en un recipiente sin anticoagulantes y se
deja coagular la sangre durante al menos 30 minutos a temperatura
ambiente seguido por centrifugado a 1000x g para separar el coágulo
sanguíneo del suero.
La muestra de plasma se mezcla con un volumen
igual de tampón que contiene un detergente para evitar la unión
inespecífica de PrP^{C} al anticuerpo. Existen amplias variedades
de detergentes que son adecuados para bloquear la unión
inespecífica y son conocidos para el experto en la materia. Los
detergentes preferidos son, laurilsarcosina sódica, desoxicolato
sódico, sulfobetaína, Tritón X-100,
NP-40, ZWITTERGENT, Tween-20,
Tween-80. El detergente preferido usado en un
formato de ensayo particular y para una especie en concreto puede
variar. Las concentraciones preferidas están entre el 0,05 y el
1%.
La muestra de plasma se pone en contacto con el
anticuerpo. En una forma de realización preferida de la invención
se usa un anticuerpo que es específico para la forma de PrP^{D}
asociada con la enfermedad. Un anticuerpo preferido es el
anticuerpo 15B3 que ha demostrado ser específico para PrP^{D},
aunque pueden usarse otros anticuerpos de forma similar. En una
forma de realización preferida en particular el anticuerpo se
recubre en los pocillos de una placa de microfiltración o en perlas
para capturar PrP^{D} en la muestra. A continuación se detecta el
complejo del anticuerpo con PrP^{D} en un ensayo inmunológico
usando un anticuerpo de detección que reconoce PrP. La detección
puede conseguirse por cualquier procedimiento inmunológico. Dichos
ensayos son bien conocidos para los expertos en la materia y pueden
incluir transferencia Western (inmunotransferencia), ensayos de
inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA),
inmuno-PCR o clasificación celular activada por
fluorescencia (FACS). La detección directa puede efectuarse usando
un anticuerpo para la proteína priónica que se conjuga con una
enzima como peroxidasa, fosfatasa alcalina o moléculas fluorescentes
o ácidos nucleicos. Alternativamente la detección puede hacerse
indirectamente usando un anticuerpo primario no marcado (anticuerpo
de antiproteína priónica) y secundario marcado.
La invención se ilustra en los siguientes
ejemplos no exclusivos y las figuras adjuntas. Los Ejemplos 3 a 5
se ofrecen sólo como ejemplos de referencia:
- Ejemplo 1:
- Determinación de PrP^{D} en plasma a partir de ganado negativo y positivo para EEB.
- Ejemplo 2:
- Determinación de PrP^{D} en plasma a partir de ovejas negativas y positivas a scrapie.
- Ejemplo 3:
- Determinación de PrP^{D} en homogeneizado encefálico a partir de ovejas negativas y positivas a scrapie.
- Ejemplo 4:
- Determinación de PrP^{D} en suero a partir de ovejas negativas y positivas a scrapie.
- Ejemplo 5:
- Determinación de PrP^{D} en glóbulos blancos a partir de ovejas negativas y positivas a scrapie.
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 1 es una gráfica que muestra los
resultados del Ejemplo 1. En este ejemplo se realizó un inmunoensayo
tipo sándwich usando 15B3 como anticuerpo de captura y un
anticuerpo que reconoce el término N de PrP como anticuerpo de
detección en muestras de plasma a partir de vacas infectadas por EEB
(Pos 1-Pos 2) frente a vacas normales
(Neg 1-Neg 23);
(Neg 1-Neg 23);
la fig. 2 es una gráfica que muestra los
resultados del Ejemplo 2. En este ejemplo se realizó un inmunoensayo
tipo sándwich usando 15B3 como anticuerpo de captura y un
anticuerpo que reconoce el término N de PrP como anticuerpo de
detección en muestras de plasma de ovejas infectadas por scrapie
(Pos I-Pos 6) frente a ovejas normales (Neg
1-Neg 16);
la fig. 3 es una gráfica que muestra los
resultados del Ejemplo 3. Los datos mostrados ilustran que es
posible discriminar el homogeneizado encefálico positivo para
scrapie (B) del homogeneizado encefálico negativo para scrapie (A)
usando análisis FACS. La curva en gris muestra la señal de
fluorescencia recibida con perlas recubiertas con anticuerpo 15B3.
La línea negra muestra la señal de fluorescencia obtenida con perlas
de control de isotipo;
la fig. 4 es una gráfica que muestra los
resultados del Ejemplo 4. Los datos mostrados ilustran que el suero
originado de una oveja infectada por scrapie (B) puede discriminarse
de una muestra de suero originada de una oveja no infectada por
scrapie (A) usando análisis FACS. El cuadrante superior derecho
ajustado al 5% en la muestra negativa (A) se suponía en la muestra
positiva (B) y muestra claramente un desplazamiento del 5 al
32%;
la fig. 5 es una gráfica que muestra los
resultados del Ejemplo 5. Los datos mostrados ilustran que los
glóbulos blancos originarios de una oveja infectada por scrapie (B)
pueden discriminarse de una muestra de glóbulos blancos originaria
de una oveja no infectada por scrapie (A) usando análisis FACS. El
cuadrante superior derecho ajustado al 5% en la muestra negativa
(A) se
\hbox{suponía en la muestra positiva (B) y muestra
claramente un desplazamiento del 5 al 36,9%.}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La gráfica de la fig. 1 muestra los resultados
de un primer experimento. Los datos mostrados ilustran que las
muestras de plasma positivas para EEB pueden distinguirse de las
muestras negativas usando el inmunoensayo tipo sándwich. Se muestra
la media de dobles
\hbox{medidas mientras que las barras de
error indican la diferencia con el valor más alto.}
Se recubrieron placas de 96 pocillos con 2
\mug/ml de anticuerpo anti-IgM diluido en solución
salina con tampón de fosfato (PBS) de pH 7,4, albúmina de suero
bovino (BSA) al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
eliminó el anticuerpo no ligado lavando las placas tres veces con
PBS de pH 7,4 que contenía Tween-20 al 0,05%.
Posteriormente se bloquearon las placas durante 2 horas y se lavaron
tres veces con PBS de pH 7,4 que contenía Tween-20
al 0,05%. El anticuerpo específico de conformación 15B3 en PBS de pH
7,4 a una concentración de 2 \mug/ml se unió a
anti-IgM durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después de lavar la placa tres veces con PBS de pH 7,4 que contenía
Tween 20 al 0,05%, se añadieron 110 \mul de Plasma de ganado
negativo y positivo para EEB diluido 1:1 con solución salina con
tampón Tris (TBS) que contenía desoxicolato (DOC) al 0,4% a la
placa y se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Se
eliminaron por lavado las proteínas no ligadas con TBS que
contenían DOC al 0,2%. Se diluyó el anticuerpo monoclonal 805
marcado con peroxidasa que reconocía los aminoácidos
25-40 de PrP a 10 ng/ml en un tampón que contenía
PBS de pH 7,4, caseína al 0,02%, Tween-20 al 0,1% y
se añadió durante 1 hora a los pocillos. El anticuerpo no ligado se
retiró mediante lavado tres veces con PBS de pH 7,4 que contenía
Tween-20 al 0,05%. Se añadieron a los pocillos 100
ml de solución de sustrato quimioluminiscente y se leyó en un
luminómetro de placas. Los valores se dan como unidades luminosas
relativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La gráfica de la fig. 2 muestra los resultados
de un segundo experimento. Los datos mostrados ilustran que las
muestras de plasma de ovejas positivas para scrapie pueden
distinguirse de las muestras negativas usando el inmunoensayo tipo
sándwich. Se muestra la media de dobles medidas, mientras que las
barras de error indican la diferencia con el valor más alto.
El recubrimiento de la placa con anticuerpo 15B3
se realizó según se describe en el ejemplo 1. Se añadieron a la
placa 110 \mul de Plasma a partir de ovejas negativas y positivas
para scrapie diluido al 1:1 con TBS que contenía Sarcosyl al 0,2% y
se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las proteínas no
ligadas se eliminaron por lavado con TBS que contenía Sarcosyl al
0,1%. Se diluyó anticuerpo monoclonal 805 marcado con POD que
reconocía los aminoácidos 25-40 de PrP a 10 ng/ml en
un tampón que contenía PBS de pH 7,4, caseína al 0,02%,
Tween-20 al 0,1% y se añadió durante 1 hora a los
pocillos. El anticuerpo no ligado se eliminó por lavado tres veces
con PBS de pH 7,4 que contenía Tween-20 al 0,05%. Se
añadieron a los pocillos 100 \mul de solución de sustrato
quimioluminiscente y se leyó en un luminómetro de placas. Los
valores se dan como unidades luminosas relativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La gráfica de la fig. 3 muestra los resultados
de un tercer experimento. Los datos mostrados ilustran que el
homogeneizado encefálico positivo para scrapie puede distinguirse de
las muestras negativas usando análisis FACS. Se muestra un
histograma mientras que el eje y indica los eventos y el eje x la
intensidad relativa de fluorescencia medida por el detector
FL-2.
Se recubrieron 60 ng de anticuerpo monoclonal
15B3 o anticuerpo de IgM de control de isotipo (Becton Dickinson
550963) en 3 \mul de Dynabeads anti-IgM magnético
(Dynal 110.15) en solución salina con tampón de fosfato (PBS) de pH
7,4 que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% durante 1
hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Se eliminó el
anticuerpo no ligado lavando las perlas tres veces con PBS de pH 7,4
que contenía BSA al 0,1%. Se añadieron las perlas a 1 ml de
solución salina con tampón Tris (TBS) que contenía Sarkosyl al
0,25% y 10 \mul de un homogeneizado encefálico positivo o negativo
para scrapie al 10% y se incubó durante toda la noche a 4ºC en una
rueda giratoria. Posteriormente se eliminaron las proteínas no
ligadas lavando las perlas tres veces con TBS que contenía Sarkosyl
al 0,2%. Posteriormente se añadieron las perlas a 200 \mul de PBS
de pH 7,4, Tween-20 al 0,1%, caseína al 0,02% que
contenía 2 \mug de anticuerpo monoclonal 805 biotinilado y se
incubó durante 15 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria.
Después de lavar tres veces con 200 \mul de PBS de pH 7,4 que
contenía Tween-20 al 0,1% y caseína al 0,02% se
añadieron 2,5 \mug de conjugado de
Estreptavidina-Ficoeritrina (Becton Dickinson
554061) en 200 \mul de PBS de pH 7,4, Tween-20 al
0,1%, caseína al 0,02% y se incubó durante 5 min adicionales a
temperatura ambiente. Después de eliminar el conjugado no ligado
por lavado se tomaron las perlas en 400 \mul de PBS de pH 7,4,
Tween-20 al 0,1%, caseína al 0,02% y se analizó por
FACS (Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia)
(MoFlow). La adquisición se realizó en modo lineal para FSC/SSC y
modo logarítmico para FL2. La adquisición de datos se realizó en
modo de lista. La línea de base de FL2 se ajustó en perlas 15B3 sin
incubación previa de la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La gráfica de la fig. 4 muestra los resultados
de un cuarto experimento. Los datos mostrados ilustran que el suero
positivo para scrapie (B) puede distinguirse de las muestras
negativas (A) usando análisis FACS. Se muestra una transferencia en
mancha mientras que el eje y indica el tamaño de las partículas
(dispersión hacia delante) y el eje x la intensidad relativa de la
fluorescencia medida por el detector FL2.
Se recubrieron 60 ng de anticuerpo monoclonal
15B3 en 3 \mul de Dynabeads anti-IgM magnéticas
(Dynal 110.15) en solución salina con tampón de fosfato (PBS) de pH
7,4 que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% durante 1
hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Se eliminó el
anticuerpo no ligado lavando las perlas tres veces con PBS de pH
7,4 que contenía BSA al 0,1%. Se añadieron las perlas a 500 \mul
de solución salina con tampón Tris (TBS) que contenía Sarkosyl al
0,2% y 250 \mul de un suero originario de un animal infectado con
scrapie y no infectado con scrapie respectivamente y se incubó
durante toda la noche a 4ºC en una rueda giratoria. Posteriormente
se eliminaron las proteínas no ligadas lavando las perlas tres veces
con TBS que contenía Sarkosyl al 0,2%. Posteriormente se añadieron
las perlas a 200 \mul de PBS de pH 7,4, Tween-20
al 0,1%, caseína al 0,02% que contenía 2 \mug de anticuerpo
monoclonal 805 biotinilado y se incubó durante 15 min a temperatura
ambiente en una rueda giratoria. Después de lavar tres veces con 200
\mul de PBS de pH 7,4 que contenía Tween-20 al
0,1% y caseína al 0,02% se añadieron a las perlas 2,5 \mug de
conjugado de Estreptavidina-Ficoeritrina (Becton
Dickinson 554061) en 200 \mul de PBS de pH 7,4,
Tween-20 al 0,1%, caseína al 0,02% y se incubó
durante 5 min adicionales a temperatura ambiente. Después de
eliminar por lavado el conjugado no ligado se tomaron perlas hasta
400 \mul de PBS de pH 7,4, Tween-20 al 0,1%,
caseína al 0,02% y se analizó por FACS (MoFlow). La adquisición se
realizó en modo lineal para FSC/SSC y modo logarítmico para FL2. La
adquisición de datos se realizó en modo de lista. La línea de base
FL2 se ajustó en perlas 15B3 sin incubación previa de la
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La gráfica de la fig. 5 muestra los resultados
de un quinto experimento. Los datos mostrados ilustran que los
glóbulos blancos extraídos de una oveja positiva para scrapie (B)
pueden distinguirse de las negativas para scrapie (A) usando
análisis FACS. Se muestra una transferencia de mancha mientras que
el eje y indica el tamaño de las partículas (dispersión hacia
delante) y el eje x la intensidad relativa de la fluorescencia
medida por el detector FL2.
Se recubrieron 60 ng de anticuerpo monoclonal
15B3 en 3 \mul de Dynabeads anti-IgM magnéticas
(Dynal 110.15) en solución salina con tampón de fosfato (PBS) de pH
7,4 que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% durante 1
hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Se eliminó el
anticuerpo no ligado lavando las perlas tres veces con PBS de pH
7,4 que contenía BSA al 0,1%. Se añadieron las perlas a 500 \mul
de solución salina con tampón Tris (TBS) que contenía Sarkosyl al
0,2% y 2 millones de glóbulos blancos originarios de un animal
infectado por scrapie y no infectado por scrapie respectivamente y
se incubó durante toda la noche a 4ºC en una rueda giratoria.
Posteriormente se eliminaron las proteínas no ligadas lavando las
perlas tres veces con TBS que contenía Sarkosyl al 0,2%.
Posteriormente se añadieron las perlas a 200 \mul de PBS de pH
7,4, Tween-20 al 0,1%, caseína al 0,02% que contenía
2 \mug de anticuerpo monoclonal 805 biotinilado y se incubó
durante 15 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria.
Después de lavar tres veces con 200 \mul de PBS de pH 7,4 que
contenía Tween-20 al 0,1% y caseína al 0,02% se
añadieron a las perlas 2,5 \mug de conjugado de
Estreptavidina-Ficoeritrina (Becton Dickinson
554061) en 200 \mul de PBS de pH 7,4, Tween-20 al
0,1%, caseína al 0,02% y se incubó durante 5 min adicionales a
temperatura ambiente. Después de eliminar por lavado el conjugado
no ligado se tomaron las perlas en 400 \mul de PBS de pH 7,4,
Tween-20 al 0,1%, caseína al 0,02% y se analizó por
FACS (MoFlow). La adquisición se realizó en modo lineal para FSC/SSC
y modo logarítmico para FL2. La adquisición de datos se realizó en
modo de lista. La línea de base FL2 se ajustó en perlas 15B3 sin
incubación previa de la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente lista de referencias citada por
el solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte
del documento de patente europeo. Aun cuando se ha puesto el máximo
en compilar las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este
respecto.
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- Korth y col. Nature,
1997, vol. 390, 74-77 [0009]
Claims (3)
1. Procedimiento para la detección de una
isoforma relacionada con EET de la proteína priónica (PrP^{D}) en
una muestra de plasma de un mamífero que incluye un ser humano, en
el que dicha PrP^{D} está presente como isoforma sensible a la
proteasa o como isoforma resistente a la proteasa, consistiendo el
procedimiento en:
- a.
- tratamiento de la muestra de plasma con detergentes en concentraciones entre el 0,05 y el 1% para evitar la unión inespecífica de PrP^{C}
- b.
- puesta en contacto de la muestra de plasma con un anticuerpo de captura revestido en los pocillos de una placa de microfiltración o perlas y capaz de reconocer un epítopo conformacional en PrP^{D}, siendo dicho epítopo específico para la isoforma relacionada con EET PrP^{D} pero no necesariamente indicativo para la isoforma resistente a proteasa de la proteína priónica, y siendo dicho anticuerpo de captura el anticuerpo monoclonal 15B3 (DSM2298),
- c.
- eliminación de las proteínas contaminantes por lavado y
- d.
- detección de posibles complejos de PrP^{D}-anticuerpos de captura.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la muestra de plasma incluye PrP^{D} sólo como isoforma
sensible a la proteasa.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, en el que el complejo anticuerpo/PrP^{D} se detecta directa o
indirectamente mediante un ensayo inmunológico.
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