ES2355719T3 - Vacuna contra el dengue que contiene una deleción común de 30 nucleótidos en la utr en 3' del dengue tipos 1 y 2. - Google Patents

Abstract

Virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 o rDEN2Δ30 atenuado que contiene una deleción de 30 nucleótidos (Δ30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue tipo 1 ó 2, en el que dicha deleción de 30 nucleótidos corresponde a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10562-10591 para el dengue tipo 1 y a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10541-10570 para el dengue tipo 2.

Description

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Vacuna contra el dengue que contiene una deleción común de 30 nucleótidos en la UTR en 3' del dengue tipos 1 y 2.

Campo de la invención

La invención se refiere a una vacuna contra el virus del dengue que contiene una deleción común de 30 nucleótidos (\Delta30) en la región no traducida en 3' del genoma del virus del dengue serotipos 1 y 2.

Antecedentes de la invención

El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue está ampliamente distribuido por todas las regiones tropicales y semitropicales del mundo y se transmite a seres humanos por vectores de mosquitos. El virus del dengue es una causa importante de hospitalización y muerte en niños en al menos ocho países asiáticos tropicales (OMS 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2ª edición, Ginebra). Hay cuatro serotipos de virus del dengue (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) que provocan anualmente unos 50-100 millones de casos estimados de fiebre del dengue y 500.000 casos de la forma más grave de infección por virus del dengue conocida como fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (FHD/SCD) (Gubler, D.J. y Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). Esta última enfermedad se observa predominantemente en niños y adultos que experimentan una segunda infección por virus del dengue con un serotipo diferente del de su primera infección por virus del dengue y en infección primaria de lactantes que todavía tienen anticuerpo materno específico del dengue circulante (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-180; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-575). Es necesaria una vacuna contra el dengue para atenuar la carga de la enfermedad provocada por el virus del dengue, pero no se ha autorizado ninguna. Debido a la asociación de una enfermedad más grave con la infección por virus del dengue secundaria, una vacuna satisfactoria debe inducir simultáneamente inmunidad para los cuatros serotipos. La inmunidad está mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glicoproteína de la envuelta (E), una proteína estructural del virión. La infección con un serotipo induce inmunidad homotípica de larga duración y una inmunidad heterotípica de corta duración (Sabin, A. 1955 Am J Trop Med Hyg 4:198-207). Por tanto, el objetivo de la inmunización es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, lo que puede lograrse de la mejor manera desde el punto de vista económico usando vacunas de virus atenuados vivos. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna atenuada viva para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. y Heinz, F.X. 1996 en: Fields Virology, Fields, D.M et al. eds. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, págs. 961-1034).

Se han desarrollado varios candidatos a vacuna contra el dengue atenuada viva y se han evaluado en seres humanos y primates no humanos. Los primeros candidatos a vacuna contra el dengue atenuada viva fueron mutantes de espectro de huéspedes desarrollados mediante pase en serie de virus del dengue de tipo natural en los cerebros de ratones y selección de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. y Hotta, S. 1944 Jpn J Bacteriol 1:96-99; Sabin, A.B. y Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisserman, C.L. et al. 1963 Am J Trop Med Hyg 12:620-623). Aunque estos virus candidatos a vacuna eran inmunogénicos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular desaconsejó el desarrollo adicional. Se han desarrollado candidatos a vacuna de DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 atenuada viva mediante pase en serie en cultivo de tejido no humano (Angsubhakom, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-559; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-195; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33: 684-698; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-226; Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188) o mediante mutagénesis química (McKee, K.T. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-442). Se ha comprobado que es muy difícil lograr un equilibrio satisfactorio entre atenuación e inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e inmunogénica de manera satisfactoria contra cada uno de los cuatros virus del dengue (Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188; Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-47).

Dos importantes avances usando tecnología de ADN recombinante han hecho posible recientemente desarrollar candidatos a vacuna contra virus del dengue atenuada viva prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado métodos para recuperar virus del dengue infeccioso a partir de células transfectadas con transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo así posible derivar virus infecciosos que portan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc mediante mutagénesis dirigida al sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-5143). En segundo lugar, es posible producir virus quiméricos antigénicos en los que la región que codifica para proteínas estructurales del clon de ADNc de longitud completa del virus del dengue se reemplaza por la de un serotipo de virus del dengue diferente o de un flavivirus más divergente (Bray, M. y Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-10346; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-5190; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-3028; Pletnev, A.G. y Men, R 1998 PNAS USA 95:1746-1751). Se han usado estas técnicas para construir virus del dengue quiméricos intertípicos que han mostrado ser eficaces en la protección de monos frente a la exposición a virus del dengue homólogo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-4166). También está usándose una estrategia similar para desarrollar vacunas contra virus del dengue quiméricas antigénicas atenuadas basándose en la atenuación del virus de la vacuna contra la fiebre amarilla o la atenuación de virus del dengue sometidos a pase en cultivo celular (Monath, T.P. et al. 1999 Vacuna 17:1869-1882; Huang, C.Y. et al. 2000 J. Virol 74:3020-3028).

Otro estudio examinó el nivel de atenuación para seres humanos de un mutante de DEN4 que portaba una deleción de 30 nucleótidos (\Delta30) introducida en su región no traducida en 3' mediante mutagénesis dirigida al sitio y que se encontró previamente que estaba atenuado para monos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-3937). Se llevaron a cabo estudios adicionales para examinar si esta mutación \Delta30 presente en el candidato a vacuna DEN4 era el determinante principal de su atenuación para monos. Se encontró que la mutación \Delta30 era de hecho el determinante principal de la atenuación para monos, y que especificaba un equilibrio satisfactorio entre atenuación e inmunogenicidad para seres humanos (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13).

Sumario de la invención

La mutación atenuante \Delta30 previamente identificada, creada en el virus del dengue tipo 4 (DEN4) mediante la eliminación de 30 nucleótidos de la UTR en 3', también puede atenuar una cepa de tipo natural del virus del dengue tipo 1 (DEN1). La eliminación de 30 nucleótidos de la UTR en 3' de DEN1 en una región altamente conservada homóloga a la región de DEN4 que abarca la mutación \Delta30 produjo un virus recombinante atenuado en monos rhesus en un nivel similar al virus recombinante DEN4\Delta30. Esto establece la transportabilidad de la mutación \Delta30 y su fenotipo de atenuación para un tipo de virus del dengue distinto de DEN4. La transferibilidad eficaz de la mutación \Delta30, descrita en este trabajo, establece la utilidad de la mutación \Delta30 para atenuar y mejorar la seguridad de vacunas contra el virus del dengue comercializables de serotipo 1 y 2. Se prevé una vacuna contra el virus del dengue tetravalente que contiene virus del dengue tipos 1, 2, 3 y 4, cada uno atenuado mediante la mutación \Delta30. Se prevé también una vacuna contra el virus del dengue tetravalente que contiene virus quiméricos antigénicos recombinantes en los que los genes estructurales del virus del dengue tipos 1, 2 y 3 reemplazan a los de DEN4\Delta30; 1, 2 y 4 reemplazan a los de DEN3\Delta30; 1, 3 y 4 reemplazan a los de DEN2\Delta30; y 2, 3 y 4 reemplazan a los de DEN1\Delta30. En algunos casos, tales virus del dengue quiméricos están atenuados no sólo mediante la mutación \Delta30, sino también por su naturaleza quimérica. La presencia de la mutación atenuante \Delta30 en cada componente de virus impide la reversión a un virus de tipo natural por recombinación intertípica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La vacuna contra el virus del dengue tetravalente atenuada viva contiene virus del dengue que representan cada uno de los 4 serotipos, conteniendo cada serotipo su conjunto completo de proteínas estructurales y no estructurales de tipo natural inalteradas y una mutación atenuante \Delta30 compartida. La ubicación relativa de la mutación \Delta30 en la región no traducida (UTR) en 3' de cada componente se indica mediante una flecha.

Figura 2. A. La mutación \Delta30 elimina 30 nucleótidos contiguos (sombreados) de la UTR en 3' de DEN4. Los nucleótidos se numeran desde el extremo terminal 3'. B. Alineación de la secuencia de nucleótidos de la región TL2 de DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 y sus derivados \Delta30. También se muestra la región correspondiente para cada uno de los cuatro serotipos de DEN. Las letras mayúsculas indican homología de secuencia entre los 4 serotipos, el subrayado indica apareamiento de nucleótidos para formar la estructura de tallo. C. Estructura secundaria pronosticada de la región TL2 de cada serotipo de DEN. Los nucleótidos que se eliminan mediante la mutación \Delta30 están en un recuadro (DEN1 - entre los nucleótidos 10562 - 10591, DEN2 Tonga/74 - entre los nucleótidos 10541 - 10570, DEN3 Sleman/78 - entre los nucleótidos 10535 - 10565, y DEN4 - entre los nucleótidos 10478 - 10507).

Figura 3. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con candidatos a vacuna rDEN4 que portan mutaciones derivadas 5-FU. Se inocularon grupos de cuatro o dos (rDEN4 y rDEN4\Delta30) monos con 5,0 log_{10} UFP de virus por vía subcutánea. Se recogió suero diariamente y se determinaron los títulos de virus mediante ensayo de placas en células Vero. El límite de detección del virus era de 0,7 log_{10} UFP/ml. Se indican los títulos de virus medios para cada grupo.

Figura 4. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con candidatos a vacuna rDEN4 que portan pares de mutaciones de carga a alanina en NS5. Se inocularon grupos de cuatro o dos (rDEN4 y rDEN4\Delta30) monos con 5,0 log_{10} UFP de virus por vía subcutánea. Se recogió suero diariamente y se determinaron los títulos de virus mediante ensayo de placas en células Vero. El límite de detección del virus era de 1,0 log_{10} UFP/ml. Se indican los títulos de virus medios para cada grupo. No se detectó viremia en ningún mono tras el día 4.

Figura 5. La mutación \Delta30 atenúa tanto DEN1 como DEN4 para monos rhesus. Se inmunizaron grupos de 4 monos por vía subcutánea con 5,0 log_{10} UFP del virus indicado. Se recogió suero cada día tras la inmunización y se determinaron los títulos de virus y se muestran como log_{10} UFP/ml media.

Figura 6. A. Diagrama del plásmido de ADNc de longitud completa p2 (Tonga/74). Las regiones subclonadas se indican por encima del plásmido. La numeración comienza en el extremo 5' de la secuencia viral. B. La mutación \Delta30 elimina los 30 nucleótidos indicados de la secuencia de UTR en 3' para crear p2\Delta30.

Figura 7. Niveles de viremia en monos rhesus inoculados con los candidatos a vacuna DEN2 (Tonga/74), rDEN2 y rDEN2\Delta30. Se inocularon grupos de cuatro monos con 5,0 log_{10} UFP de virus por vía subcutánea. Se recogió suero diariamente y se determinaron los títulos de virus mediante ensayo de placas en células Vero. El límite de detección del virus era de 0,7 log_{10} UFP/ml. Se indican los títulos de virus medios para cada grupo. No se detectó viremia en ningún mono tras el día 8.

Figura 8. A. Diagrama del plásmido de ADNc de longitud completa p3 (Sleman/78). Las regiones subclonadas se indican por encima del plásmido. La numeración comienza en el extremo 5' de la secuencia viral. Se muestra la secuencia y la ubicación de la inserción del ligador SpeI. B. La mutación \Delta30 elimina los 31 nucleótidos indicados de la secuencia de UTR en 3' para crear p3\Delta30.

Figura 9. A. Se construyeron virus del dengue quiméricos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN2 (Tonga/74) en el antecedente genético de DEN4. La ubicación relativa de la mutación \Delta30 en la UTR en 3' se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertípicas 1, 2 y 3. B. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones de uniones intertípicas. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados en el ensamblaje de cada ADNc quimérico.

Figura 10. Cinética de crecimiento en células Vero de virus rDEN2/4\Delta30 quiméricos que codifican para mutaciones de adaptación a células Vero individuales o combinadas. Se infectaron células Vero con los virus indicados a una MOI de 0,01. En los puntos de tiempo tras la infección indicados, se extrajeron muestras de 1 ml de medio de cultivo tisular, se clarificaron mediante centrifugación y se congelaron a -80ºC. Se sometió a ensayo el nivel de replicación del virus mediante titulación de placas en células C6/36. El límite inferior de la detección era de 0,7 log_{10} UFP/ml. Los niveles de replicación en el día 4 tras la infección se indican mediante la línea discontinua.

Figura 11. A. Se construyeron virus del dengue quiméricos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN3 (Sleman/78) en el antecedente genético de DEN4. La ubicación relativa de la mutación \Delta30 en la UTR en 3' se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertípicas 1, 2 y 3. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados en el ensamblaje de cada ADNc quimérico. B. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones de uniones intertípicas. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados en el ensamblaje de cada ADNc quimérico.

Figura 12. A. Se construyeron virus del dengue quiméricos recombinantes introduciendo o bien las regiones CME o bien las ME de DEN1 (Puerto Rico/94) en el antecedente genético de DEN4. La ubicación relativa de la mutación \Delta30 en la UTR en 3' se indica mediante una flecha y se indican las uniones intertípicas 1, 2 y 3. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados en el ensamblaje de cada ADNc quimérico. B. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones de uniones intertípicas. Se indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados en el ensamblaje de cada ADNc quimérico.

Breve descripción de las secuencias

1

Breve descripción de las SEQ ID NO

2

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3

Descripción detallada de la realización preferida Introducción

En el presente documento, se usa un enfoque molecular para desarrollar una vacuna contra el virus del dengue atenuada viva genéticamente estable. En el presente documento también se describe una vacuna tetravalente. Cada componente de la vacuna tetravalente, concretamente DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, debe estar atenuado, ser genéticamente estable e inmunogénico. Es necesaria una vacuna tetravalente para garantizar protección simultánea frente a cada uno de los cuatro virus del dengue, impidiendo de ese modo la posibilidad de desarrollar las enfermedades más graves fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (FHD/SCD), que se producen en seres humanos durante la infección secundaria con un virus del dengue de tipo natural heterotípico. Puesto que los virus del dengue pueden experimentar recombinación genética en la naturaleza (Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96:7352-7), la vacuna tetravalente no debe poder experimentar genéticamente un acontecimiento de recombinación entre sus cuatro componentes de virus que pudiese conducir a la generación de virus que carecen de mutaciones atenuantes. Los enfoques previos para desarrollar una vacuna contra el virus del dengue tetravalente se han basado en derivar independientemente cada uno de los cuatro componentes de virus a través de procedimientos mutagénicos separados, tales como pase en células de cultivo tisular derivadas de un huésped heterólogo. Esta estrategia ha producido candidatos a vacuna atenuados (Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44­7). Sin embargo, es posible que pudiesen producirse en las vacunas intercambios génicos entre los cuatro componentes de estas vacunas tetravalentes derivadas independientemente, creando posiblemente un virus recombinante virulento. Se han generado polivirus virulentos derivados de recombinación en vacunas tras la administración de una vacuna contra poliovirus trivalente (Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74:8434-43).

La presente invención proporciona un virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 o rDEN2\Delta30 atenuado que contiene una deleción de 30 nucleótidos (\Delta30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue tipo 1 ó 2 en el que dicha deleción de 30 nucleótidos corresponde a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10562-10591 para el dengue tipo 1 y a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10541-10570 para el dengue tipo 2.

La presente descripción también describe: (1) mejoras para el candidato a vacuna rDEN4\Delta30 descrito anteriormente, 2) virus recombinantes rDEN3\Delta30 atenuados que contienen una deleción de 30 nucleótidos (\Delta30) en una sección de la región no traducida en 3' (UTR) que es homóloga a aquella en el virus recombinante rDEN4\Delta30, (3) un método para generar una vacuna contra el virus del dengue tetravalente compuesta por rDEN1\Delta30, rDEN2\Delta30, rDEN3\Delta30 y rDEN4\Delta30, 4) virus quiméricos antigénicos atenuados, rDEN1/4\Delta30, rDEN2/4\Delta30 y rDEN3/4\Delta30, para los que se han reemplazado las regiones génicas CME, ME o E de rDEN4\Delta30 por aquellas derivadas de DEN1, DEN2 o DEN3; alternativamente rDEN1/3\Delta30, rDEN2/3\Delta30 y rDEN4/3\Delta30 para los que se han reemplazado las regiones génicas CME, ME o E de rDEN3\Delta30 por aquellas derivadas de DEN1, 2 ó 4; alternativamente rDEN2/2\Delta30, rDEN3/2\Delta30 y rDEN4/2\Delta30 para los que se han reemplazado las regiones génicas CME, ME o E de rDEN2\Delta30 por aquellas derivadas de DEN1, 3 ó 4; y alternativamente rDEN2/1\Delta30, rDEN3/1\Delta30 y rDEN4/1\Delta30 para los que se han reemplazado las regiones génicas CME, ME o E de rDEN1\Delta30 por aquellas derivadas de DEN2, 3 ó 4, y 5) un método para generar una vacuna contra el virus del dengue tetravalente compuesta por rDEN1/4\Delta30, rDEN2/4\Delta30, rDEN3/4\Delta30 y rDEN4\Delta30, alternativamente rDEN2/3\Delta30, rDEN2\Delta30, rDEN4/3\Delta30 y rDEN3\Delta30, alternativamente rDEN1/2\Delta30, rDEN3/2\Delta30, rDEN2\Delta30 y rDEN2\Delta30, y alternativamente rDEN2/1\Delta30, rDEN3/1\Delta30, rDEN4/1\Delta30 y rDEN1\Delta30. Estas vacunas tetravalentes son únicas puesto que contienen una mutación atenuante compartida común que elimina la posibilidad de generar un virus de tipo natural virulento en una vacuna puesto que cada componente de la vacuna posee la misma mutación por deleción atenuante \Delta30. Además, la vacuna tetravalente rDEN1\Delta30, rDEN2\Delta30, rDEN3\Delta30, rDEN4\Delta30 es la primera en combinar la estabilidad de la mutación \Delta30 con una amplia antigenicidad. Puesto que la mutación por deleción \Delta30 está en la UTR en 3' de cada virus, todas las proteínas de los cuatro virus componentes están disponibles para inducir una respuesta inmunitaria protectora. Por tanto, el método proporciona un mecanismo de atenuación que mantiene cada una de las proteínas de los virus DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 en un estado que conserva la capacidad completa de cada una de las proteínas de los cuatro virus para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares frente a todas

\hbox{las
proteínas estructurales  y no estructurales presentes en cada
serotipo de virus del dengue.}

Tal como se describió anteriormente, se diseñó por ingeniería genética el virus recombinante de DEN4, rDEN4\Delta30 (denominado anteriormente 2A\Delta30), para que contuviese una deleción de 30 nucleótidos en la UTR en 3' del genoma viral (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). La evaluación en monos rhesus mostró que el virus estaba significativamente atenuado en relación con el virus original de tipo natural, siendo todavía altamente inmunogénico y completamente protector. Además, un ensayo clínico de fase I con voluntarios humanos adultos mostró que el virus recombinante rDEN4\Delta30 era seguro e inmunogénico de manera satisfactoria (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Para desarrollar una vacuna tetravalente que porta una mutación atenuante compartida en una región no traducida, se seleccionó la mutación \Delta30 para atenuar virus del dengue de tipo natural de serotipos 1, 2 y 3 puesto que atenuaba virus DEN4 de tipo natural para monos rhesus y era segura en seres humanos (figura 1).

La mutación \Delta30 se describió y caracterizó por primera vez en el virus DEN4 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-7). En DEN4, la mutación consiste en la eliminación de 30 nucleótidos contiguos que comprenden los nucleótidos 10478 - 10507 de la UTR en 3' (figura 2A) que forman una estructura de tallo-bucle supuesta denominada TL2 (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202). Entre los flavivirus, porciones grandes de la UTR forman estructuras secundarias altamente conservadas (Hahn, C.S. et al. 1987 J Mol Biol 198:33-41; Proutski, V. et al. 1997 - Nucleic Acids Res 25:1194-202). Aunque los nucleótidos individuales no se conservan necesariamente en estas regiones, un apareamiento de bases adecuado conserva la estructura de tallo-bucle en cada serotipo, un hecho que no es fácilmente evidente cuando sólo se considera la secuencia primaria (figura 2B, C).

Quimeras del dengue inmunogénicas y métodos para su preparación

En el presente documento se describen quimeras del dengue inmunogénicas y métodos para preparar las quimeras del dengue. Las quimeras del dengue inmunogénicas son útiles, solas o en combinación en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como composiciones inmunogénicas para minimizar, inhibir o inmunizar individuos y animales frente a la infección por virus del dengue.

Las quimeras descritas en el presente documento comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleótidos adicionales seleccionadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente. Estas quimeras pueden usarse para inducir una respuesta inmunogénica frente al virus del dengue.

Una quimera preferida puede ser una quimera de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una proteína estructural de un virus del dengue de un primer serotipo, y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para proteínas no estructurales de un virus del dengue de un segundo serotipo diferente del primero. El virus del dengue del segundo serotipo puede ser DEN4. La proteína estructural puede ser la proteína C de un virus del dengue del primer serotipo, la proteína prM de un virus del dengue del primer serotipo, la proteína E de un virus del dengue del primer serotipo, o cualquier combinación de las mismas.

El término "residuo" se usa en el presente documento para referirse a un aminoácido (D o L) o un mimético de aminoácido que se incorpora en un péptido mediante un enlace amida. Como tal, el aminoácido puede ser un aminoácido que se produce de manera natural o, a menos que se limite de otra forma, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se producen de manera natural (es decir, miméticos de aminoácido). Además, un mimético de enlace amida incluye modificaciones de la estructura principal del péptido bien conocidas por los expertos en la técnica.

Además, un experto en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en la secuencia de aminoácidos, o en la secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos, que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos del 5%, más normalmente menos del 1%) en una secuencia codificada son variaciones modificadas de manera conservativa, en las que las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Se conocen bien en la técnica tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas de uno por otro:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparagina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "quimera de virus", "virus quimérico", "quimera del dengue" y "virus del dengue quimérico" significan un constructo infeccioso que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleótidos adicionales derivadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente.

Tal como se usa en el presente documento, "constructo infeccioso" indica un virus, un constructo viral, una quimera viral, un ácido nucleico derivado de un virus o cualquier poción del mismo, que puede usarse para infectar una célula.

Tal como se usa en el presente documento, "quimera de ácido nucleico" significa un constructo que comprende ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para la inmunogenicidad de un virus del dengue de un serotipo y secuencias de nucleótidos adicionales derivadas de la estructura principal de un virus del dengue de un serotipo diferente. En consecuencia, cualquier virus quimérico o quimera de virus va a reconocerse como ejemplo de una quimera de ácido nucleico.

Debe entenderse que las proteínas estructurales y no estructurales incluyen cualquier proteína que comprenda o cualquier gen que codifique para la secuencia de la proteína completa, un epítopo de la proteína, o cualquier fragmento que comprenda, por ejemplo, tres o más residuos de aminoácido de las mismas.

Quimeras del dengue

El virus del dengue es un patógeno de flavivirus transmitido por mosquitos. El genoma del virus del dengue contiene una región no traducida en 5' (UTR en 5'), seguida por una región que codifica para una proteína de la cápsida (C), seguida por una región que codifica para una proteína de premembrana/membrana (prM), seguida por una región que codifica para una proteína de la envuelta (E), seguida por la región que codifica para las proteínas no estructurales(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) y finalmente una región no traducida en 3' (UTR en 3'). Las proteínas estructurales virales son C, prM y E, y las proteínas no estructurales son NS1-NS5. Las proteínas estructurales y no estructurales se traducen como una única poliproteína y se procesa por proteasas virales y celulares.

Las quimeras del dengue descritas en el presente documento son constructos formados fusionando genes de proteínas estructurales de un virus del dengue de un serotipo, por ejemplo DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4, con genes de proteínas no estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente, por ejemplo, DEN1, DEN2, DEN3 o
DEN4.

Las quimeras del dengue atenuadas, inmunogénicas descritas en el presente documento contienen uno o más de los genes de proteínas estructurales, o partes antigénicas de las mismas, del virus del dengue de un serotipo contra el cual va a conferirse inmunogenicidad, y los genes de proteínas no estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente.

La quimera descrita en el presente documento contiene un genoma de virus del dengue de un serotipo como estructura principal, en el que el/los gen(es) de proteína(s) estructural(es) que codifica(n) para proteína(s) C, prM o E del genoma del dengue, o combinaciones de las mismas, se reemplaza(n) por el/los gen(es) de proteína(s) estructural(es)
correspondiente(s) de un virus del dengue de un serotipo diferente frente al que va a protegerse. La quimera viral resultante tiene las propiedades de atenuación, en virtud de estar quimerizada con un virus del dengue de otro serotipo, y tiene por tanto una virulencia reducida, aunque expresa epítopos antigénicos de los productos génicos estructurales y por tanto es inmunogénica.

Puede usarse el genoma de cualquier virus del dengue como estructura principal en las quimeras atenuadas descritas en el presente documento. La estructura principal puede contener mutaciones que contribuyen al fenotipo de atenuación del virus del dengue o que facilitan su replicación en el sustrato celular usado para su fabricación, por ejemplo, células Vero. Las mutaciones pueden ser en la secuencia de nucleótidos que codifica para proteínas no estructurales, la región no traducida en 5' o la región no traducida en 3'. La estructura principal también puede contener mutaciones adicionales para mantener la estabilidad del fenotipo de atenuación y para reducir la posibilidad de que la quimera o el virus atenuado pudiese revertir de nuevo al virus de tipo natural virulento. Por ejemplo, una primera mutación en la región no traducida en 3' y una segunda mutación en la región no traducida en 5' proporcionarán estabilidad adicional del fenotipo de atenuación, si se desea. En particular, una mutación que es una deleción de 30 nucleótidos de la región no traducida en 3' del genoma de DEN4 entre los nucleótidos 10478-10507 da como resultado una atenuación del virus DEN4 (Men et al. 1996 J. Virology 70:3930-3933; Durbin et al. 2001 Am J Trop Med 65:405-413, 2001). Por tanto, puede usarse el genoma de cualquier virus del dengue tipo 4 que contenga una mutación de este tipo en este locus como estructura principal en las quimeras atenuadas descritas en el presente documento. Además, pueden usarse también otros genomas de virus del dengue que contengan una mutación por deleción análoga en la región no traducida en 3' de los genomas de otros serotipos de virus del dengue como estructura
principal.

Tales mutaciones pueden lograrse mediante mutagénesis dirigida al sitio usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que los ensayos de selección de virulencia, tal como se describen en el presente documento y tal como se conocen bien en la técnica, pueden usarse para distinguir entre estructuras principales virulentas y atenuadas.

Construcción de quimeras del dengue

Pueden producirse las quimeras del virus del dengue descritas en el presente documento sustituyendo al menos uno de los genes de proteínas estructurales del virus del dengue de un serotipo frente al cual se desea inmunidad en una estructura principal de genoma de virus del dengue de un serotipo diferente, usando técnicas de ingeniería genética recombinante bien conocidas por los expertos en la técnica, concretamente, eliminando un gen del virus del dengue designado de un serotipo y reemplazándolo por el gen correspondiente deseado de un virus del dengue de un serotipo diferente. Alternativamente, usando las secuencias proporcionadas en GenBank, pueden sintetizarse las moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas del dengue usando técnicas de síntesis de ácidos nucleicos conocidas e insertarse en un vector apropiado. Por tanto, se produce un virus atenuado, inmunogénico usando técnicas de ingeniería genética recombinante conocidas por los expertos en la técnica.

Tal como se mencionó anteriormente, el gen que va a insertarse en la estructura principal codifica para una proteína estructural del dengue de un serotipo. El gen del dengue de un serotipo diferente que puede insertarse es un gen que codifica para una proteína C, una proteína prM y/o una proteína E. La secuencia insertada en la estructura principal del virus del dengue puede codificar para las proteínas estructurales tanto prM como E del otro serotipo. La secuencia insertada en la estructura principal del virus del dengue puede codificar para las proteínas estructurales C, prM y E del otro serotipo. La estructura principal del virus del dengue es el genoma del virus DEN1, DEN2, DEN3 o DEN4, o un genoma de virus del dengue atenuado de cualquiera de estos serotipos, e incluye el/los gen(es) sustituido(s) que codifica(n) para la(s) proteína(s) estructural(es) C, prM y/o E de un virus del dengue de un serotipo diferente, o el/los gen(es) sustituido(s) que codifica(n) para la(s) proteína(s) estructural(es) prM y/o E de un virus del dengue de un serotipo diferente.

Pueden evaluarse quimeras de ácido nucleico o virus quiméricos adecuados que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas estructurales del virus del dengue de cualquiera de los serotipos para determinar su utilidad como vacunas examinándolos para detectar marcadores fenotípicos de atenuación que indiquen una reducción en la virulencia con conservación de la inmunogenicidad. La antigenicidad y la inmunogenicidad pueden evaluarse usando la reactividad in vitro o in vivo con anticuerpos frente al dengue o suero inmunorreactivo usando procedimientos de examen rutinarios conocidos por los expertos en la técnica.

Vacunas contra el dengue

Los virus proporcionan virus vivos, atenuados útiles como inmunógenos o vacunas. En una realización preferida, los virus presentan alta inmunogenicidad mientras que al mismo tiempo no producen efectos letales o patogénicos peligrosos.

Los virus quiméricos o las quimeras de ácido nucleico descritos en el presente documento pueden comprender los genes estructurales de un virus del dengue de un serotipo en una estructura principal de virus del dengue de tipo natural o atenuado de un serotipo diferente. Por ejemplo, la quimera puede expresar los genes de proteínas estructurales de un virus del dengue de un serotipo en cualquiera de un virus del dengue o un antecedente de virus del dengue atenuado de un serotipo diferente.

La estrategia descrita en el presente documento de usar un antecedente genético que contiene regiones no estructurales de un genoma de virus del dengue de un serotipo y, mediante quimerización, las propiedades de atenuación, para expresar los genes de proteínas estructurales de un virus del dengue de un serotipo diferente ha conducido al desarrollo de candidatos a vacuna contra el dengue viva, atenuada que expresan genes de proteínas estructurales de inmunogenicidad deseada. Por tanto, pueden diseñarse candidatos a vacuna para el control de patógenos del
dengue.

Los virus usados en las quimeras descritas en el presente documento se hacen crecer normalmente usando técnicas conocidas en la técnica. Se realizan entonces titulaciones de las unidades formadoras de focos (UFF) o placas de virus y se cuentan las placas o UFF con el fin de evaluar la viabilidad, el título y las características fenotípicas de los virus que se han hecho crecer en cultivo celular. Se mutagenizan virus de tipo natural para derivar materiales de partida de candidatos atenuados.

Se construyen clones infecciosos quiméricos a partir de diversos serotipos del dengue. Si se desea, también puede lograrse la clonación de fragmentos de ADNc específicos de virus. Los fragmentos de ADNc que contienen los genes de proteínas estructurales o proteínas no estructurales se amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de ARN del dengue con diversos cebadores. Se clonan los fragmentos amplificados en los sitios de escisión de otros clones intermedios. Se secuencian entonces los clones del dengue intermedios, quiméricos para verificar la secuencia del ADNc insertado específico del dengue.

Pueden obtenerse plásmidos quiméricos de longitud de genoma completa construidos insertando la región génica de proteínas estructurales o no estructurales de virus del dengue en vectores usando técnicas recombinantes bien conocidas por los expertos en la técnica.

Métodos de administración

Las quimeras virales descritas en el presente documento se combinan individual o conjuntamente con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable para su administración como inmunógeno o vacuna a seres humanos o animales. Las expresiones "portador farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" se usan en el presente documento queriendo decir cualquier composición o compuesto incluyendo, pero sin limitarse a, agua o solución salina, un gel, ungüento, disolvente, diluyente, base de pomada fluida, liposoma, micela, micela gigante, y similares, que sea adecuado para su uso en contacto con tejido humano o animal vivo sin provocar respuestas fisiológicas adversas, y que no interaccione con los otros componentes de la composición de manera perjudi-
cial.

Las formulaciones de vacuna o inmunogénicas pueden presentarse de manera conveniente en una forma farmacéutica unitaria de unidad formadora de placas (UFP) o unidad formadora de focos (UFF) y prepararse usando técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de llevar a asociación el principio activo y el/los portador(es) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan llevando a asociación de manera uniforme e íntima el principio activo con vehículos líquidos. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de comprimidos, gránulos y polvos estériles comúnmente usados por un experto habitual en la técnica.

Formulaciones de dosificación unitarias preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada de las mismas, del componente administrado. Debe entenderse que además de los componentes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente usados por un experto habitual en la técnica.

La composición de vacuna o inmunogénica puede administrarse a través de diferentes vías, tales como oral o parenteral, incluyendo, pero sin limitarse a, bucal y sublingual, rectal, mediante aerosol, nasal, intramuscular, subcutánea, intradérmica y tópica. La composición puede administrarse en diferentes formas, incluyendo, pero sin limitarse a, disoluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas y liposomas. Se espera que puedan requerirse desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dosis por programa de inmunización. Las dosis iniciales pueden oscilar desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 100.000 UFP o UFF, con un intervalo de dosificación preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 20.000 UFP o UFF, un intervalo de dosificación más preferido de desde aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 12.000 UFP o UFF y un intervalo de dosificación lo más preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 4000 UFP o UFF. La dosificación de las inyecciones de refuerzo puede oscilar desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 20.000 UFP o UFF, con un intervalo de dosificación preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 15.000, un intervalo de dosificación más preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000 UFP o UFF y un intervalo de dosificación lo más preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 UFP o UFF. Por ejemplo, el volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración. El volumen de las inyecciones intramusculares puede oscilar desde aproximadamente 0,1 ml hasta 1,0 ml.

La composición puede almacenarse a temperaturas de desde aproximadamente -100ºC hasta aproximadamente 4ºC. La composición también puede almacenarse en un estado liofilizado a diferentes temperaturas incluyendo temperatura ambiente. La composición puede esterilizarse a través de medios convencionales conocidos por un experto habitual en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, filtración. La composición también puede combinarse con agentes bacteriostáticos para inhibir el crecimiento bacteriano.

Programa de administración

La composición de vacuna o inmunogénica descrita en el presente documento puede administrarse a seres humanos, especialmente a individuos que viajan a regiones en las que está presente infección por virus del dengue, y también a los habitantes de esas regiones. El momento óptimo para la administración de la composición es aproximadamente de uno a tres meses antes de la exposición inicial al virus del dengue. Sin embargo, la composición también puede administrarse tras la infección inicial para mejorar la evolución de la enfermedad, o tras la infección inicial para tratar la enfermedad.

Adyuvantes

Puede administrarse una variedad de adyuvantes conocidos por un experto habitual en la técnica conjuntamente con el virus quimérico en la composición de vacuna o inmunogénica de esta invención. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: polímeros, copolímeros tales como copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, incluyendo copolímeros de bloque, polímero p 1005, adyuvante completo de Freund (para animales), adyuvante incompleto de Freund; monooleato de sorbitano, escualeno, adyuvante CRL-8300, alumbre, QS 21, muramil dipéptido, motivos de oligonucleótido CpG y combinaciones de motivos de oligonucleótido CpG, trehalosa, extractos bacterianos, incluyendo extractos micobacterianos, endotoxinas destoxificadas, lípidos de membrana o combinaciones de los mismos.

Secuencias de ácido nucleico

Secuencias de ácido nucleico de virus del dengue de un serotipo y virus del dengue de un serotipo diferente son útiles para diseñar cebadores y sondas de ácido nucleico para la detección de quimeras de virus del dengue en una muestra o espécimen con alta sensibilidad y especificidad. Pueden usarse sondas o cebadores correspondientes a virus del dengue para detectar la presencia de un virus de vacuna. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos correspondientes son útiles como herramientas de laboratorio para estudiar los organismos y las enfermedades y para desarrollar terapias y tratamientos para las enfermedades.

Los cebadores y las sondas de ácido nucleico se hibridan selectivamente con moléculas de ácido nucleico que codifican para virus del dengue o secuencias complementarias de las mismas. Por "selectivo" o "selectivamente" quiere decirse una secuencia que no se hibrida con otros ácido nucleicos para prevenir la detección adecuada de la secuencia del virus del dengue. Por tanto, en el diseño de los ácidos nucleicos hibridantes, la selectividad dependerá de los otros componentes presentes en la muestra. El ácido nucleico hibridante debe tener al menos el 70% de complementariedad con el segmento del ácido nucleico con el que se hibrida. Tal como se usa en el presente documento para describir ácidos nucleicos, la expresión "se hibrida selectivamente" excluye los ácidos nucleicos hibridantes al azar ocasionales, y por tanto tiene el mismo significado que "específicamente hibridante". Los cebadores y las sondas de ácido nucleico selectivamente hibridantes descritos en el presente documento pueden tener al menos el 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99% de complementariedad con el segmento de la secuencia con la que se hibridan, preferiblemente el 85% o más.

La presente descripción también contempla secuencias, sondas y cebadores que se hibridan selectivamente con el ácido nucleico codificante o la hebra complementaria, u opuesta, del ácido nucleico. Puede producirse hibridación específica con ácido nucleico con sustituciones o modificaciones minoritarias en el ácido nucleico, siempre que se mantenga una capacidad de hibridación especie-especie funcional. Por "sonda" o "cebador" quiere decirse secuencias de ácido nucleico que pueden usarse como sondas o cebadores para la hibridación selectiva con secuencias de ácido nucleico complementarias para su detección o amplificación, sondas o cebadores que pueden variar en longitud desde aproximadamente 5 hasta 100 nucleótidos, o preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta 50 nucleótidos, o lo más preferiblemente de manera aproximada 18-24 nucleótidos. Se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos aislados que se hibridan selectivamente con los ácidos nucleicos específicos de especie en condiciones rigurosas y deben tener al menos cinco nucleótidos complementarios a la secuencia de interés tal como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Si se usan como cebadores, la composición puede incluir al menos dos moléculas de ácido nucleico que se hibridan con diferentes regiones de la molécula diana de modo que se amplifica una región deseada. Dependiendo de la longitud de la sonda o el cebador, la región diana puede oscilar entre el 70% bases complementarias y complementariedad completa y todavía hibridar en condiciones rigurosas. Por ejemplo, para el fin de detectar la presencia del virus del dengue, el grado de complementariedad entre el ácido nucleico hibridante (sonda o cebador) y la secuencia con la que se hibrida es al menos suficiente para distinguir la hibridación con un ácido nucleico de otros organismos.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican para el virus del dengue pueden insertarse en un vector, tal como un plásmido, y expresarse de manera recombinante en un organismo vivo para producir polipéptidos y/o péptido de virus del dengue recombinante.

Las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen una sonda de diagnóstico que sirve para notificar la detección de un amplicón de ADNc amplificado a partir del molde de ARN genómico viral usando una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT/PCR), así como amplímeros directos e inversos que se diseñan para amplificar el amplicón de ADNc. En ciertos casos, uno de los amplímeros se diseña para contener una mutación específica de virus de vacuna en el extremo 3' terminal del amplímero, lo que hace de manera eficaz que la prueba sea incluso más específica para la cepa de vacuna debido a la extensión del cebador en el sitio diana, y en consecuencia se producirá amplificación sólo si el molde de ARN viral contiene esa mutación
específica.

Se han desarrollado recientemente sistemas de detección de secuencias de ácido nucleico basados en PCR automatizada. Se usa ampliamente el ensayo TaqMan (Applied Biosystems). Una estrategia desarrollada más recientemente para pruebas genéticas de diagnóstico hace uso de balizas moleculares (Tyagi y Kramer, 1996 Nature Biotechnology 14:303-308). Los ensayos con balizas moleculares emplean colorantes indicadores y extintores que difieren de los usados en el ensayo TaqMan. Un experto en la técnica puede usar estos y otros sistemas de detección.

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Ejemplo de referencia 1

Mejora del candidato a vacuna contra el virus del dengue rDEN4\Delta30

Se evaluó la seguridad del candidato a vacuna contra el dengue-4 atenuada viva recombinante, rDEN4\Delta30, en veinte voluntarios humanos que recibieron una dosis de 5,0 log_{10} unidades formadoras de placas (UFP) (Durbin A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-413). Se encontró que el candidato a vacuna era seguro, se toleraba bien y era inmunogénico en todas las vacunas. Sin embargo, cinco de los vacunados experimentaron una elevación transitoria en los niveles de alanina aminotransferasa, tres experimentaron neutropenia y diez vacunados desarrollaron un exantema macular asintomático, lo que sugiere que puede ser necesario atenuar adicionalmente este candidato a
vacuna.

Actualmente, está realizándose un estudio de disminución a escala de la dosis, controlado por placebo, doble ciego, aleatorizado para determinar la dosis infecciosa humana 50 (DIH_{50}) de rDEN4\Delta30. Cada cohorte de dosis consiste en aproximadamente veinte vacunados y cuatro receptores de placebo. Hasta la fecha, se han recogido datos completos para dosis de 3,0 log_{10} UFP y 2,0 log_{10} UFP. rDEN4\Delta30 infectaba al 100% de los vacunados cuando se administraron 3,0 log_{10} UFP y al 95% de los vacunados cuando se administraron 2,0 log_{10} UFP (tabla 1). El candidato a vacuna provocó enfermedad no sintomática a cualquier dosis (tabla 1). Un vacunado que recibió 3,0 log_{10} UFP experimentó una elevación transitoria en los niveles de alanina aminotransferasa y aproximadamente un cuarto de los vacunados experimentaron neutropenia a ambas dosis (tabla 1). La neutropenia fue transitoria y leve. Más de la mitad de los vacunados desarrollaron un exantema macular a ambas dosis; la aparición del exantema no estaba correlacionada con la dosis de vacunación ni con la viremia (tabla 1 y tabla 2). Ni el título pico ni la aparición de la viremia difirieron entre las dosis de 3,0 log_{10} UFP y 2,0 log_{10} UFP, aunque ambas medidas de viremia eran significativamente inferiores para estas dosis que para una dosis de 5,0 log_{10} UFP (tabla 3). El candidato a vacuna era inmunogénico en el 95% de los vacunados a ambas dosis y los anticuerpos neutralizantes no disminuyeron entre los días 28 y 42 tras la vacunación (tabla 4). Aunque no se ha determinado todavía la DIH_{50}, es claramente inferior a 2,0 log_{10} UFP. De manera interesante, las disminuciones en la dosis de vacuna no han tenido ningún efecto sistemático sobre la inmunogenicidad, viremia, neutropenia benigna o la aparición de exantema. Por tanto, no será posible necesariamente atenuar adicionalmente rDEN4\Delta30 disminuyendo la dosis de virus administrada, y deben desarrollarse otros
enfoques.

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TABLA 1 Resumen clínico de rDEN4\Delta30

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TABLA 2 Patrón de exantema en vacunados

5

TABLA 3 Resumen de viremia de rDEN4\Delta30

6

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TABLA 4 Inmunogenicidad de rDEN4\Delta30

8

Se han utilizado dos enfoques para atenuar adicionalmente rDEN4\Delta30. El primero es la generación y caracterización de mutaciones puntuales atenuantes en rDEN4 usando mutagénesis con 5'-fluorouracilo (Blaney, J.E. Jr. et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. Jr. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740). Este enfoque ha identificado un panel de mutaciones puntuales que confieren una gama de fenotipos de sensibilidad a la temperatura (ts) y placas pequeñas (sp) en células Vero y HuH-7 y fenotipos de atenuación (att) en cerebro de ratón lactante y ratones SCID con injerto de células HuH-7 (ratones SCID-HuH-7). En este ejemplo, se ha introducido un subconjunto de estas mutaciones en rDEN4\Delta30 y se han evaluado los fenotipos de los virus resultantes.

Un segundo enfoque fue crear una serie de mutaciones de carga a alanina apareadas en pares contiguos de residuos de aminoácido con carga en el gen NS5 de rDEN4. Tal como se demostró previamente, una mutación de 32 pares contiguos individuales de residuos de aminoácido con carga en NS5 de rDEN4 confería una gama de fenotipos ts en células Vero y HuH-7 y una gama de fenotipos att en cerebro de ratón lactante (Hanley, K.H. et al. 2002 J. Virol. 76 525-531). Tal como se demuestra a continuación, estas mutaciones también confieren un fenotipo att en ratones SCID-HuH-7. Estas mutaciones se han introducido, o bien como pares individuales o bien como conjuntos de dos pares, en rDEN4\Delta30 para determinar si son compatibles con la mutación \Delta30 y si potencian los fenotipos att de
rDEN4\Delta30.

Se ha caracterizado un panel de virus rDEN4 que portan mutaciones puntuales individuales que poseen fenotipos sensibles a la temperatura y/o de placas pequeñas en cultivo tisular y niveles variables de replicación atenuada en cerebro de ratón lactante en comparación con virus rDEN4 de tipo natural (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75:9731-9740). Se han seleccionado tres mutaciones para combinarse con la mutación por deleción \Delta30 para evaluar su capacidad para restringir adicionalmente la replicación de rDEN4\Delta30 en monos rhesus. En primer lugar, se combinó previamente la mutación de cambio de sentido en NS3 en el nucleótido 4995 (Ser > Pro) que confiere sensibilidad a la temperatura en células Vero y HuH-7 y replicación restringida en cerebro de ratón lactante con la mutación \Delta30 (Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75:9731-9740). Se encontró que el virus resultante, rDEN4\Delta30-4995, estaba más restringido (1.000 veces) en la replicación en cerebro de ratón que el virus rDEN4\Delta30 (<5 veces) en comparación con el virus rDEN4 de tipo natural. En segundo lugar, se combinó una mutación de cambio de sentido en el nucleótido 8092 (Glu > Gly) que también confiere sensibilidad a la temperatura en células Vero y HuH-7 y replicación restringida 10.000 veces en cerebro de ratón lactante con la mutación \Delta30 en este caso. En tercer lugar, se combinó una sustitución en la UTR en 3' en el nucleótido 10634 que confiere sensibilidad a la temperatura en células Vero y HuH-7, tamaño de placas pequeño en células HuH-7 y replicación restringida aproximadamente 1.000 veces en cerebro de ratón lactante y ratones SCID con trasplante de células HuH-7, con la mutación \Delta30 en este caso (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139).

Para la presente investigación, se introdujeron fragmentos subclonados de p4 (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13) que contenían las mutaciones anteriores en el clon de ADNc p4\Delta30. Para la transcripción y recuperación de virus, se linealizó el ADNc con Acc65I (isoesquizómero de KpnI que se escinde dejando sólo un único nucleótido en 3') y se usó como molde para la transcripción mediante ARN polimerasa SP6 tal como se describió anteriormente (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se transfectaron células de mosquito C6/36 usando transfección mediada por liposomas y se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular entre los días cinco y siete. Se diluyó de manera terminal dos veces en células Vero el virus recuperado y se pasó dos (rDEN4\Delta30-4995) o tres (rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634) veces en células Vero.

Se determinaron las secuencias genómicas completas de los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y
rDEN4\Delta30-10634 tal como se describió anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). Tal como se esperaba, cada derivado de virus rDEN4\Delta30 contenía la mutación \Delta30. De manera inesperada, en el virus rDEN4\Delta30-4995, los cambios de nucleótidos en el codón que contenía el nucleótido 4995 dieron como resultado un cambio de aminoácido Ser > Leu en vez de un cambio Ser > Pro puesto que se diseñó el ADNc de p4\Delta30-4995 para introducir el cambio Ser > Pro (tabla 5). De hecho, se encontró que el clon de ADNc de p4\Delta30-4995 codificaba para un cambio Ser > Pro en el nucleótido 4995, de modo que no está claro cómo la población de virus adquirió la mutación Ser > Leu. No obstante, se evaluó este virus para valorar el genotipo especificado por esta mutación de cambio de sentido. También se encontró que el virus rDEN4\Delta30-4995 contenía una mutación incidental en los nucleótidos 4725-6 que dio como resultado un cambio en un único aminoácido (Ser > Asp). Los virus rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634 contenían las sustituciones de nucleótidos apropiadas así como mutaciones imprevistas adicionales en E, NS4B y NS4B, respectivamente (tabla 5).

TABLA 5 Mutaciones de UTR y de cambio de sentido presentes en derivados de virus rDEN4\Delta30 que portan mutaciones puntuales introducidas

9

La replicación de los tres virus rDEN4\Delta30 modificados se comparó con los virus rDEN4\Delta30 y rDEN4 de tipo natural en el modelo de cerebro de ratón lactante y ratones SCID con trasplante de células HuH-7 (ratones SCID-HuH-7). Se realizaron los experimentos tal como se describió anteriormente (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75: 9731-9740). En resumen, para la infección de cerebro de ratón lactante, se inocularon a grupos de ratones de seis-siete días de edad por vía intracerebral 4,0 log_{10} UFP de virus y se extrajo el cerebro de cada ratón cinco días después. Entonces se congelaron los sobrenadantes clarificados de suspensiones de cerebro al 10% a -70ºC, y se determinó el título de virus mediante ensayo de placas en células Vero. Para el análisis de la replicación del virus DEN4 en ratones SCID-HuH-7, se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones SCID de cuatro a seis semanas de edad 10^{7} células HuH-7. De cinco a seis semanas tras el trasplante, se infectaron los ratones mediante inoculación directa en el tumor de 4,0 log_{10} UFP de virus, y se obtuvo suero para la titulación del virus mediante punción en la cola en el día 7. Se determinó el título de virus mediante ensayo de placas en células
Vero.

El virus rDEN4 de tipo natural se replicó a 6,0 log_{10} UFP/g en cerebro de ratón lactante, y rDEN4\Delta30 estaba restringido en su replicación en 0,7 log_{10} UFP/g, lo que es similar a las observaciones previas (tabla 6) (Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol. 75: 9731-9740). Se encontró que los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634 tenían una replicación restringida en cerebro de ratón lactante en comparación con el virus rDEN4 de 3,3, 2,8 y 2,4 log_{10} UFP/g, respectivamente. Estos resultados indican que las mutaciones atenuantes adicionales sirven para restringir adicionalmente la replicación del virus rDEN4\Delta30 en cerebro de ratón oscilando desde 50 veces (rDEN4\Delta30-10634) hasta 400 veces (rDEN4\Delta30-4995). En ratones SCID-HuH-7, el título de virus del virus rDEN4\Delta30 era 0,4 log_{10} UFP/ml inferior al virus rDEN4, lo que también es similar a los estudios previos (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se encontró que cada virus rDEN4\Delta30 modificado estaba restringido adicionalmente en su replicación en ratones SCID-HuH-7 (tabla 6). Los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-1063 tenían replicación restringida en ratones SCID-HuH-7 en comparación con el virus rDEN4 de 2,9, 1,1 y 2,3 log_{10} UFP/g por debajo del nivel del virus rDEN4 de tipo natural, respectivamente. Se hicieron dos importantes observaciones: (1) las mutaciones 4995, 8092 y 10634 eran compatibles para su viabilidad con la mutación \Delta30, y (2) estos tres virus rDEN4\Delta30 modificados tenían una reducción de entre 10 y 1.000 veces en la replicación en comparación con el virus rDEN4 de tipo natural, lo que permite que virus con un intervalo amplio de atenuación en este modelo se evalúen adicionalmente en monos o seres humanos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 La adición de mutaciones puntuales en NS3, NS5 o la UTR en 3' al virus rDEN4\Delta30 atenúa adicionalmente el virus para cerebro de ratón lactante y ratones SCID-HuH-7

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Basándose en los hallazgos en los dos modelos de ratón de infección por virus DEN4, se evaluó cada uno de los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634 en el modelo de macaco rhesus de infección por DEN4 que se ha descrito anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). En resumen, se inocularon a grupos de cuatro (rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634) o dos (rDEN4, rDEN4\Delta30, simulado) monos 5,0 log_{10} UFP de virus por vía subcutánea. Se observaron diariamente los monos y se recogió suero en los días de 0 a 6, 8, 10 y 12, y se determinaron los títulos de virus mediante ensayo de placas en células Vero para la medición de la viremia. En el día 28, se extrajo suero y se sometió a prueba el nivel de anticuerpos neutralizantes mediante ensayo de reducción de placas en células Vero tal como se describió anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413).

Se detectó la viremia comenzando en el día 1 tras la infección y terminando en el día 4 en todos los monos (tabla 7, figura 3). La viremia estaba presente en cada mono infectado con los virus rDEN4, rDEN4\Delta30 o rDEN4\Delta30-10634, pero sólo 2 de 4 monos infectados con los virus rDEN4\Delta30-4995 o rDEN4\Delta30-8092 tenían viremia detectable. Tal como se esperaba, la infección con virus rDEN4 dio como resultado el mayor número medio de días virémicos por mono (3,0 días) así como título de virus pico medio (2,2 log_{10} UFP/ml). Los monos infectados con el virus rDEN4\Delta30 tenían tanto un número medio inferior de días virémicos por mono (2,0 días) como título de virus pico medio (1,1 log_{10} UFP/ml) en comparación con el virus rDEN4. Grupos de monos infectados con cada uno de los virus rDEN4\Delta30 modificados tenían un número medio adicionalmente restringido de días virémicos, teniendo los inoculados con el virus rDEN4\Delta30-8092 el menor valor, 0,5 días, una reducción de 4 veces en comparación con el virus rDEN4\Delta30. El título de virus pico medio de monos infectados con rDEN4\Delta30-4995 (0,9 log_{10} UFP/ml) o rDEN4\Delta30-8092 (0,7 log_{10} UFP/ml) también era inferior al de los infectados con el virus rDEN4\Delta30. Sin embargo, el título de virus pico medio de monos infectados con rDEN4\Delta30-10634 (1,3 log_{10} UFP/ml) era ligeramente superior al de los infectados con rDEN4\Delta30 particularmente en el día 2 (figura 3).

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TABLA 7 La adición de mutaciones puntuales a rDEN4\Delta30 atenúa adicionalmente el virus para monos rhesus

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Se sometió a prueba el suero recogido en el día 0 y 28 para determinar el nivel de anticuerpos neutralizantes contra rDEN4. No se encontró ningún anticuerpo neutralizante detectable contra DEN4 en el día 0, tal como se esperaba, puesto que los monos se seleccionaron previamente para que fuesen negativos para anticuerpos neutralizantes contra flavivirus (tabla 7). En el día 28, los monos infectados con rDEN4 tenían un título de anticuerpos neutralizantes séricos medio (dilución recíproca) de 398 que era aproximadamente dos veces superior al de monos infectados con el virus rDEN4\Delta30 (1:181). Este resultado y el nivel de viremia dos veces superior en monos infectados con el virus rDEN4 son similares a los resultados obtenidos anteriormente (Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413). Los monos infectados con los virus rDEN4\Delta30-4995 (1:78), rDEN4\Delta30-8092 (1:61) y rDEN4\Delta30-10634 (1:107) tenían cada uno un título de anticuerpos neutralizantes séricos medio reducido en comparación con monos infectados con el virus rDEN4\Delta30. Los cuatro monos que no tenían viremia detectable tenían títulos de anticuerpos neutralizantes séricos que indicaban que estaban de hecho infectados. A pesar del ligero aumento en el título de virus pico medio del virus rDEN4\Delta30-10634 en comparación con el virus rDEN4\Delta30, el virus rDEN4\Delta30-10634 tenía un título de anticuerpos neutralizantes séricos medio inferior en comparación con monos infectados con el virus rDEN4\Delta30. Esto y el número medio inferior de días virémicos por mono sugieren que la mutación 10634 puede atenuar la replicación del virus rDEN4\Delta30 en monos.

En el día 28 tras la inoculación, se expusieron todos los monos a 5,0 log_{10} UFP de virus rDEN4 de tipo natural por vía subcutánea. Se observaron los monos diariamente y se recogió suero en los días de 28 a 34, 36 y 38, y se determinaron los títulos de virus mediante ensayo de placas en células Vero para la medición de la viremia tras la exposición. Veintiocho días tras la exposición al virus rDEN4, se extrajo suero y se sometió a prueba el nivel de anticuerpos neutralizantes mediante ensayo de reducción de placas en células Vero. Los monos inoculados de manera simulada tenían un título de virus pico medio de 2,3 log_{10} UFP/ml tras la exposición con un número medio de días virémicos de 3,5 (tabla 8). Sin embargo, los monos inoculados con rDEN4, rDEN4\Delta30 o cada uno de los virus rDEN4\Delta30 modificados no tenían viremia detectable, lo que indica que a pesar de la disminución en la replicación e inmunogenicidad de los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634, cada uno era suficientemente inmunogénico para inducir protección frente a rDEN4 de tipo natural. Los aumentos en el título de anticuerpos neutralizantes medio eran mínimos (< 3 veces) tras la exposición en todos los grupos de inoculación excepto para el infectado de manera simulada, lo que proporciona pruebas adicionales de que los monos estaban protegidos frente a la
exposición.

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TABLA 8 rDEN4\Delta30 que contiene mutaciones puntuales adicionales protege a monos rhesus frente a la exposición al virus DEN4 de tipo natural

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Tomados juntos, estos resultados indican que las tres mutaciones puntuales (4995, 8092 y 10634) descritas anteriormente atenúan adicionalmente el candidato a vacuna rDEN4\Delta30 en cerebro de ratón lactante, ratones SCID-HuH-7 y monos rhesus. Debido a las mutaciones imprevistas adicionales (tabla 4) presentes en cada virus rDEN4\Delta30 modificado, los fenotipos no pueden atribuirse directamente a las mutaciones puntuales 4995, 8092 y 10634 individuales. Sin embargo, la presencia de fenotipos de atenuación en ratones similares en otros virus rDEN4 que portan una de estas tres mutaciones apoya la opinión de que las mutaciones puntuales 4995, 8092 y 10634 son responsables de los fenotipos att en los virus rDEN4\Delta30 modificados. Puesto que los virus rDEN4\Delta30-4995, rDEN4\Delta30-8092 y rDEN4\Delta30-10634 demostraron una disminución en su replicación en monos rhesus mientras que conservaban una inmunogenicidad suficiente para conferir inmunidad protectora, se contemplan estos virus como vacunas contra el dengue para seres humanos.

Se generaron a continuación virus DEN4 que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina. Se identificó un subconjunto de siete grupos de mutaciones de carga a alanina descritas anteriormente que conferían una disminución de entre 10 veces y 1.000 veces en la replicación en ratones SCID-HuH-7 y cuya secuencia no mutada estaba bien conservada en los cuatro serotipos del dengue. Se introdujeron estas mutaciones como pares individuales y como dos conjuntos de pares en rDEN4\Delta30 usando técnicas de clonación convencionales. Se realizó la transcripción y la recuperación de virus y la dilución terminal de virus tal como se describió anteriormente. El ensayo del nivel de sensibilidad a la temperatura de los virus mutantes de carga-grupo a alanina en células Vero y HuH-7, el nivel de replicación en el cerebro de ratones lactantes y el nivel replicación en ratones SCID-HuH-7 se realizó tal como se describió anteriormente.

La introducción de un par de mutaciones de carga a alanina en rDEN4 produjo virus recuperable en todos los casos (tabla 9). La introducción de dos pares de mutaciones de carga a alanina produjo virus recuperable en dos de tres casos (no era recuperable rDEN4\Delta30-436-437-808-809).

rDEN4\Delta30 no es ts en células Vero o HuH-7. En cambio, siete de los siete conjuntos de mutaciones de carga a alanina usados en este ejemplo conferían un fenotipo ts en células HuH-7 y cinco conferían también un fenotipo ts en células Vero. Los seis virus que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina mostraron un fenotipo ts tanto en células Vero como HuH-7 (tabla 9). rDEN4\Delta30 no está atenuado en cerebro de ratón lactante, mientras que cinco de los siete conjuntos de mutaciones de carga a alanina conferían un fenotipo att en cerebro de ratón lactante (tabla 10). Cuatro de los virus que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina estaban atenuados en cerebro de ratón lactante (tabla 10). En un caso (rDEN4\Delta30-23-24-396-397), la combinación de dos mutaciones que no producían atenuación solas dio como resultado un virus atenuado. Generalmente, los virus que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina mostraron niveles de replicación en el cerebro de ratón lactante más similares a su virus original mutante de carga a alanina que a rDEN4\Delta30.

rDEN4\Delta30 está atenuado en ratones SCID-HuH-7, como lo están seis de los siete virus mutantes de carga a alanina usados en este ejemplo. Los virus que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina tendían a mostrar niveles similares o ligeramente inferiores de replicación en ratones SCID-HuH-7 en comparación con su virus original mutante de carga a alanina (tabla 10). En tres casos, los virus que portaban mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina mostraron al menos una reducción cinco veces mayor en ratones SCID-HuH-7 que rDEN4\Delta30.

Se determinó la secuencia genómica completa de cinco virus (rDEN4-200-201, rDEN4\Delta30-200-201, rDEN4-436-437 [clon 1], rDEN4\Delta30-436-437 y rDEN4-23-24-200-201) que se replicaban a > 10^{5} UFP/ml en células Vero a 35ºC y que mostraban una reducción de cien veces o mayor en su replicación en ratones SCID-HuH-7 (tabla 11). Cada uno de los cinco contenía una o más mutaciones imprevistas. En un virus, rDEN4\Delta30-436-437, la mutación adicional se ha asociado anteriormente con adaptación a células Vero (Blaney, J.E. Jr. et al. 2002 Virology 300:125-139). Cada uno de los virus restantes contenía al menos una mutación incidental cuyo efecto fenotípico se desconoce. En consecuencia, los fenotipos descritos no pueden atribuirse directamente a las mutaciones de carga a alanina. Sin embargo, el hecho de que los virus rDEN4 y rDEN4\Delta30 que portan las mismas mutaciones de carga a alanina compartan fenotipos similares proporciona un fuerte apoyo a la capacidad de las mutaciones de carga a alanina para potenciar la atenuación de rDEN4\Delta30. Debido a que rDEN4-436-437 [clon 1] contenía 4 mutaciones imprevistas, se preparó un segundo clon de este virus. rDEN4-436-437 [clon 2] contenía sólo una mutación incidental (tabla 11), y mostró los mismos fenotipos que rDEN4-436-437 en cultivo celular y ratones SCID-HuH-7. Se usó rDEN4-436-437 [clon 2] en el estudio con monos rhesus descrito a continuación.

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Basándose en la atenuación en el modelo de ratón SCID-HuH7, se evaluaron cuatro de los virus mutantes de carga a alanina (rDEN4-200-201, rDEN4\Delta30-200-201, rDEN4-436-437 [clon 2], rDEN4\Delta30-436-437) en macacos rhesus tal como se describió anteriormente. Como con el estudio de virus que portaban mutaciones puntuales atenuantes, se detectó viremia en el día 1 tras la infección y acabó para el día 4 en todos los monos (figura 4, tabla 12). Se detectó viremia en la mayoría de los monos infectados; sólo uno de los cuatro monos infectados con rDEN4\Delta30-200-201 y uno de los cuatro monos infectados con rDEN4\Delta30-436-437 no mostraron viremia detectable. Los monos infectados con rDEN4 mostraron el mayor título de virus pico medio; y en cada caso los virus que portaban la mutación \Delta30 mostraron una disminución de aproximadamente 0,5 log en el título de virus pico medio en relación con sus virus originales y una disminución de 0,5 a 2 días en el número medio de días virémicos por mono. Los monos infectados con virus que portaban las mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina mostraron una reducción de dos veces en la viremia pico media en relación con los infectados con rDEN4\Delta30. Esto sugiere que la adición de las mutaciones de carga a alanina atenúa adicionalmente rDEN4\Delta30 para macacos rhesus.

Tal como se esperaba, ninguno de los monos en este estudio mostró niveles detectables de anticuerpos neutralizantes en el día 0. En el día 28, cada mono infectado con un virus mostró niveles detectables de anticuerpos neutralizantes, lo que indica que todos los monos, incluso los que no mostraban viremia detectable, se habían infectado realmente. Como en el estudio de mutaciones puntuales atenuantes, los monos infectados con rDEN4 tenían un título de anticuerpos neutralizantes séricos medio (dilución recíproca) que era aproximadamente dos veces el de monos que se habían infectado con rDEN4\Delta30. Los monos infectados con rDEN4-200-201 y rDEN4-436-437 [clon 2] tenían títulos de anticuerpos neutralizantes medios similares a rDEN4, y los infectados con rDEN4\Delta30-200-201 y rDEN4\Delta30-436-437 tenían títulos de anticuerpos neutralizantes medios similares a rDEN4. En cada caso, la adición de la mutación \Delta30 a un virus dio como resultado una disminución de dos veces en los anticuerpos neutralizantes. Por tanto, aunque la adición de mutaciones de carga a alanina a rDEN4\Delta30 disminuyó la viremia pico media por debajo de la de rDEN4\Delta30 solo, no afectó a los niveles de anticuerpos neutralizantes.

TABLA 12 La adición de mutaciones de carga a alanina apareadas a rDEN4\Delta30 atenúa adicionalmente el virus para monos rhesus

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Tras la exposición a rDEN4 en el día 28, los monos infectados de manera simulada tenían un título de virus pico medio de 1,5 log_{10} UFP/ml y un número medio de días virémicos de 3,0 (tabla 13). Sin embargo, ninguno de los monos inoculado previamente con rDEN4, rDEN4\Delta30 o los virus mutantes de carga a alanina mostró viremia detectable. Adicionalmente, ninguno de los monos mostró un aumento mayor de cuatro veces en el título de anticuerpos neutralizantes séricos. En conjunto, estos datos indican que la infección con cualquiera de los virus, incluyendo los que portan mutaciones tanto \Delta30 como de carga a alanina, protegían a los macacos rhesus frente a la exposición a rDEN4.

TABLA 13 rDEN4\Delta30 que contiene mutaciones de carga a alanina protege a monos rhesus frente a la exposición a virus DEN4 de tipo natural

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La adición de mutaciones de carga a alanina a rDEN4\Delta30 puede conferir una gama de fenotipos ts tanto en células Vero como HuH-7 y fenotipos att en cerebro de ratón lactante y puede o bien potenciar o bien dejar sin cambios la atenuación en ratones SCID-HuH-7. De la manera más importante, la adición de estas mutaciones puede disminuir la viremia producida por rDEN4\Delta30 en macacos rhesus sin disminuir el título de anticuerpos neutralizantes o la eficacia protectora. Por tanto, se contempla que la adición de tales mutaciones a rDEN4\Delta30 potencia la atenuación en seres humanos. Además, se contempla que las mutaciones que están añadiéndose no cambian el nivel global de atenuación, sino que estabilizan el fenotipo de atenuación porque por sí mismas son atenuantes independientemente incluso en ausencia de la mutación \Delta30. Las mutaciones de carga a alanina son particularmente útiles porque se producen fuera de las regiones génicas estructurales, y por tanto pueden usarse para atenuar virus quiméricos con genes estructurales. Además, implican cambios de al menos tres nucleótidos, lo que hace que sea poco probable que reviertan a la secuencia de tipo natural.

Se ha identificado una serie de mutaciones puntuales que potencian la replicación de rDEN4 en cultivo tisular de células Vero; estas se ubican principalmente en el gen NS4B (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol 75:9731-9740). Las mutaciones de adaptación a células Vero confieren dos características deseables para un candidato a vacuna. En primer lugar, potencian el rendimiento de virus en células Vero, el sustrato previsto para la producción de la vacuna, y por tanto hacen que la producción de la vacuna sea más rentable. En segundo lugar, aunque cada una de estas mutaciones de adaptación a Vero son mutaciones puntuales, es probable que sean extremadamente estables durante la fabricación de la vacuna, porque proporcionan una ventaja selectiva en células Vero. También se mostró que al menos una mutación de adaptación a células Vero, en la posición 7129, disminuía la infectividad en mosquitos de rDEN4; una escasa infectividad en mosquitos es otra característica deseable de un candidato a vacuna del dengue. Para investigar la generalidad de este hallazgo, se sometió a prueba el efecto del resto de las mutaciones de adaptación a células Vero sobre la capacidad de rDEN4 para infectar mosquitos Aedes aegypti alimentados con harina de sangre infecciosa. La tabla 14 muestra la infectividad de cada virus que porta una única mutación de adaptación a células Vero a título alto. De éstas, sólo una mutación, en la posición 7182, estaba asociada con una disminución grande de la infectividad en mosquitos. Por tanto, 7182 puede ser una mutación particularmente valiosa para incluir en un candidato a vacuna de rDEN4, ya que tiene efectos opuestos sobre la replicación en células Vero y en mosquitos.

TABLA 14 Efecto de las mutaciones de adaptación a células Vero sobre la infectividad en mosquitos de rDEN4

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Ejemplo 1

Generación y caracterización de un virus DEN1 recombinante que contiene la mutación \Delta30

En primer lugar, se buscó determinar si la mutación \Delta30 podía atenuar satisfactoriamente un virus DEN de tipo natural distinto del serotipo DEN4. Para hacer esto, se introdujo la mutación \Delta30 en el ADNc de DEN1 (pacífico occidental). Se digirió el clon de ADNc pRS424DEN1WP (Puri, B. et al. 2000 Virus Genes 20:57-63) con BamHI y se usó como molde en una PCR usando polimerasa Pfu con el cebador directo 30 (nt 10515-10561 y 10592-10607 de DEN1) y el cebador de secuenciación inverso M13 (101 nt más allá del extremo 3' de la secuencia del genoma de DEN1). El producto de PCR resultante tenía 292 pb y contenía la mutación \Delta30. Se digirió parcialmente el ADNc de pRS424DEN1WP con Apa I, luego se digirió hasta el final con Sac II y se aisló el vector en gel, se mezcló con el producto de PCR y se usó para transformar la cepa de levadura YPH857 para producir crecimiento sobre placas que carecen de triptófano (Polo, S. et al. 1997 J Virol 71:5366-74). Se confirmaron colonias de levaduras positivas mediante PCR y análisis con enzimas de restricción. Se usó ADN aislado de dos colonias de levaduras independientes para transformar la cepa STBL2 de E. coli. Se preparó ADN de plásmido adecuado para generar transcritos de ARN y se verificó la presencia de la mutación \Delta30 mediante análisis de secuencia.

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Para la transcripción y generación de virus, se usó ADNc (designado pRS424DEN1\Delta30) que se linealizó con Sac II como molde en una reacción de transcripción usando ARN polimerasa SP6 tal como se describió (Polo, S. et al. 1997 J Virol 71:5366-74). Se introdujeron por electroporación reacciones de transcripción en células LLC-MK2 y se confirmó la infección mediante observación del CPE e inmunofluorescencia y se recogieron en el día 14. Se amplificaron reservas de virus en células de mosquito C6/36 y se titularon en células LLC-MK2. Se secuenció el genoma del virus resultante, rDEN1\Delta30, para confirmar la presencia de la mutación \Delta30. La mutación \Delta30 elimina los nucleótidos 10562-10591 de DEN1 (figura 2B, C), que corresponde a la TL2 de DEN1. El virus se replica de manera eficaz en cultivo de células Vero a títulos de 6,5 log_{10} UFP/ml, lo que indica que la mutación \Delta30 es compatible con un crecimiento eficaz de DEN1 en cultivo celular, una propiedad esencial para la fabricación de la vacuna. Usando técnicas similares, se generó un virus original rDEN1. Se identificaron mutaciones imprevistas que surgieron del pase del virus en cultivo tisular tanto en rDEN1 como rDEN1\Delta30 usando análisis de secuencia y se indican en la tabla 15. Se derivó un virus rDEN1\Delta30 adicional mediante transfección y amplificación en células Vero. Aunque este virus no se evaluó en los estudios descritos a continuación, su análisis de secuencias se incluye en la tabla 15. A continuación se examinaron las propiedades de rDEN1\Delta30 como vacuna in vivo.

TABLA 15 Mutaciones de cambio de sentido presentes entre los virus DEN1 recombinantes y correlación de mutaciones de la región NS4B con las encontradas en DEN4

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* Comparación de nucleótidos y aminoácidos de la región NS4B seleccionada

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+Homología entre los cuatro serotipos

Los nucleótidos están subrayados en múltiplos pares de 10.

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Se realizó la evaluación de la replicación, inmunogenicidad y eficacia protectora de rDEN1\Delta30 y el virus rDEN1 original de tipo natural (derivado del ADNc de pRS424DEN1WP) en monos rhesus juveniles tal como sigue. Se inyectaron por vía subcutánea a monos seronegativos para el virus del dengue 5,0 log_{10} UFP de virus en una dosis de 1 ml dividida entre dos inyecciones en cada lado de la zona del hombro superior. Se observaron los monos diariamente y se recogió sangre en los días 0 - 10 y 28 y se almacenó el suero a -70ºC. Se determinó el título de virus en muestras de suero mediante ensayo de placas en células Vero tal como se describió anteriormente (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se determinaron los títulos de neutralización por reducción de placas para las muestras de suero del día 28 tal como se describió anteriormente (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se expusieron todos los monos en el día 28 a una única dosis de 5,0 log_{10} UFP de rDEN1 de tipo natural y se recogió sangre durante 10 días. Se determinó el título de virus en sueros tras la exposición mediante ensayo de placas en células Vero. Los monos a los que se les inoculó rDEN1 de tipo natural de longitud completa fueron virémicos durante 2 - 3 días con un título pico medio de 2,1 log_{10} UFP/ml (tabla 16), y los monos a los que se les inoculó rDEN1\Delta30 fueron virémicos durante menos de 1 día con un título pico medio de 0,8 log_{10} UFP/ml, lo que indica que la mutación \Delta30 puede atenuar DEN1. Tal como se esperaba para un virus atenuado, la respuesta inmunitaria, tal como se midió mediante el título de anticuerpos neutralizantes, era inferior tras la inoculación con rDEN1\Delta30 en comparación con la inoculación con rDEN1 de tipo natural (tabla 16), aunque suficientemente alta para proteger a los animales frente a la exposición con el virus DEN1 de tipo natural. No se detectó rDEN1 de tipo natural en ninguna muestra de suero recogida tras la exposición al virus, lo que indica que los monos estaban completamente protegidos tras la inmunización con o bien rDEN1 de tipo natural de longitud completa o bien el virus recombinante rDEN1\Delta30. El nivel de atenuación especificado por la mutación \Delta30 era comparable en los antecedentes genéticos tanto de DEN1 como de DEN4 (figura 5).

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TABLA 16 La mutación \Delta30 atenúa rDEN1 para monos rhesus

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Tal como se notificó anteriormente, el virus rDEN4 se replicó a más de 6,0 log_{10} UFP/ml de suero en ratones SCID-HuH-7, mientras que la replicación del virus rDEN4 que porta la mutación \Delta30 se redujo en aproximadamente 10 veces (Blaney, J.E. Jr. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se comparó la replicación de rDEN1\Delta30 con la de rDEN1 de tipo natural en ratones SCID-HuH-7 (tabla 17). rDEN1\Delta30 se replicó a un nivel de aproximadamente 100 veces menos que su original rDEN1 de tipo natural. Este resultado valida adicionalmente el uso del modelo de ratón SCID-HuH-7 para la evaluación de cepas atenuadas de virus DEN, con resultados que se correlacionan estrechamente con los observados en monos rhesus.

TABLA 17 La mutación \Delta30 atenúa rDEN1 para ratones HuH-7-SCID

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Finalmente, se evaluó la infectividad de rDEN1 y rDEN1\Delta30 para mosquitos, usando los métodos descritos en detalle en el ejemplo de referencia 3. Previamente, se mostró que la mutación \Delta30 disminuía la capacidad de rDEN4 para cruzar la barrera del intestino medio del mosquito y establecer una infección de las glándulas salivales (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-419). Sin embargo, ni rDEN1 ni rDEN1\Delta30 pudieron infectar el intestino medio de mosquitos Aedes aegypti eficazmente por medio de una harina de sangre artificial (tabla 18), de modo que no era posible determinar si \Delta30 podría bloquear adicionalmente la infección de glándulas salivales. Un estudio previo también mostró que la \Delta30 no tenía ningún efecto sobre la infectividad rDEN4 para mosquitos Toxorhynchites splendens infectados por medio de inoculación intratorácica (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-419), y se observó un patrón similar para rDEN1 y rDEN1\Delta30 (tabla 18). La base genética para la incapacidad de rDEN1 para infectar el intestino medio del mosquito no se ha definido en este momento. Sin embargo, esta importante propiedad de infectividad restringida para el intestino medio del mosquito es sumamente deseable en un candidato a vacuna puesto que serviría para restringir en gran medida la transmisión del virus de vacuna desde un vacunado hasta un vector de mosquito.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 18 Los virus DEN1 y DEN1\Delta30 son ambos sumamente infecciosos para Toxorhynchites splendens, pero no infectan Aedes aegypti eficazmente

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Por tanto, la mutación \Delta30, descrita por primera vez en DEN4, se transfirió satisfactoriamente a rDEN1. Se demostró que el virus resultante, rDEN1\Delta30, estaba atenuado en monos y ratones SCID-HuH-7 a niveles similares al virus recombinante rDEN4\Delta30, estableciendo de ese modo la conservación del fenotipo de atenuación especificado por la mutación \Delta30 en un antecedente de virus DEN diferente. Basándose en los resultados favorables de rDEN4\Delta30 en ensayos clínicos recientes (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13), se pronostica que rDEN1\Delta30 estará adecuadamente atenuado en seres humanos. Para completar la vacuna tetravalente, se contempla preparar virus recombinantes rDEN2 y rDEN3 atenuados que portan la mutación \Delta30 (véanse los ejemplos 3 y 4 más adelante). La demostración de que la mutación \Delta30 especifica un fenotipo que puede transportarse a otro serotipo de DEN tiene importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna tetravalente. Esto indica que se espera que la mutación \Delta30 tenga un efecto correspondiente sobre los virus de tipo natural DEN2 y
DEN3.

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Ejemplo 2

Generación y caracterización de un virus DEN2 recombinante que contiene la mutación \Delta30

La evaluación de rDEN1\Delta30 mostró que estaba atenuado de manera satisfactoria. Basándose en este resultado, se buscó extender esta tecnología a la creación de un candidato a vacuna contra DEN2. Para hacer esto, se introdujo la mutación \Delta30 en el ADNc de DEN2. Se eligió un virus DEN2 aislado de una epidemia de dengue de 1974 en el Reino de Tonga (Tonga/74) (Gubler, D. J. et al. 1978 Am J Trop Med Hyg 27:581-589) para representar DEN2 de tipo natural. Se secuenció el genoma de DEN2 (Tonga/74) en su totalidad y sirvió como secuencia consenso para la construcción de un clon de ADNc de longitud completa (apéndice 1). Se generaron fragmentos de ADNc de DEN2 (Tonga/74) mediante transcripción inversa del genoma tal como se indica en la figura 6A. Se subclonó cada fragmento en un vector de plásmido y se secuenció para verificar que correspondía con la secuencia consenso tal como se determinó para el virus. Esto produjo siete fragmentos de ADNc clonados que abarcaban el genoma. Se modificaron los fragmentos clonados tal como sigue: el fragmento X, que representa el extremo 5' del genoma, se puso colindante al promotor de SP6; se modificó el fragmento L para que contuviese un sitio de restricción SpeI silencioso en la traducción en el nucleótido genómico 2353; se modificó el fragmento R para que contuviese un sitio de restricción SpeI silencioso en la traducción en el nucleótido genómico 2353, y para estabilizar el clon de longitud completa final, se crearon dos mutaciones silenciosas en la traducción adicionales en los nucleótidos 2362 - 2364 y 2397 para garantizar que estuviesen presentes codones de terminación de la traducción en todos los marcos de lectura distintos del usado para sintetizar la poliproteína del virus; se modificó el fragmento A en el nucleótido 3582 para suprimir un sitio de restricción SpeI que se produce de manera natural y en el nucleótido 4497 para suprimir un sitio de restricción KpnI que se produce de manera natural; se modificó el fragmento C en el nucleótido 9374 para suprimir un sitio de restricción KpnI que se produce de manera natural; y el fragmento Y, que representaba el extremo 3' del genoma, se puso colindante al sitio de restricción KpnI. Se añadió cada fragmento progresivamente entre los sitios de restricción AscI y KpnI del clon p4 de ADNc de DEN4 (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13) para generar un clon de ADNc de DEN2 de longitud completa (p2) con el mismo antecedente de vector usado satisfactoriamente para generar rDEN4 y rDEN4\Delta30. Se secuenció el clon p2 de ADNc para confirmar que la región genómica del virus correspondía con la secuencia consenso de DEN2 (Tonga/74), con la excepción de las modificaciones silenciosas en la traducción indicadas anteriormente. Se introdujo la mutación \Delta30 en el fragmento Y para generar el fragmento Y\Delta30. Para crear p2\Delta30, se sustituyó la región del fragmento Y de p2 por el fragmento Y\Delta30 (figura
6A, B).

Para la transcripción y generación de virus infecciosos, se linealizó ADNc (p2 y p2\Delta30) con Acc65I (isoesquizómero de KpnI que se escinde dejando sólo un único nucleótido en 3') y se usó como molde en una reacción de transcripción usando ARN polimerasa SP6 tal como se describió anteriormente (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139). Se introdujeron transcritos en células Vero o células de mosquito C6/36 usando transfección mediada por liposomas y se recogieron sobrenadantes de cultivo celular en el día 7.

Se recuperó virus rDEN2 del ADNc de p2 tanto en células Vero como C6/36, mientras que se recuperó rDEN2\Delta30 del clon de ADNc p2\Delta30 sólo en células C6/36 (tabla 19). El nivel de virus infeccioso recuperado en células C6/36 era comparable para los clones de ADNc p2 y p2\Delta30 cuando se sometieron a ensayo mediante titulación de placas e inmunotinción en células Vero o C6/36. Tal como se observó anteriormente, la eficacia de la transfección en células C6/36 fue superior a la de células Vero. Se recuperaron dos virus rDEN2\Delta30 a partir de clones de ADNc independientes, n.º 2 y n.º 10.

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TABLA 19 Se recupera virus rDEN2 en células Vero y C6/36, pero se recupera virus rDEN2\Delta30 sólo en células C6/36

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Para producir reservas de trabajo de virus rDEN2 y rDEN2\Delta30, se pasaron las cosechas de transfección y se diluyeron terminalmente en células Vero, y se determinaron las secuencias genómicas de los virus. Se diluyó terminalmente la cosecha de transfección en células Vero de virus rDEN2 usa vez en células Vero, y se pasaron clones de virus individuales una vez en células Vero. Para evaluar si estaba presente cualquier mutación de adaptación a células Vero homóloga identificada en la región NS4B 7100-7200 de rDEN4 en estos clones de virus, se secuenciaron siete clones diluidos terminalmente independientes a lo largo de esta región. Cada uno de los siete virus rDEN2 contenía una sustitución de un único nucleótido en esta región en el nucleótido 7169 (U > C) dando como resultado un cambio de aminoácidos Val > Ala. Este nucleótido corresponde a la mutación 7162 identificada en rDEN4 (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139), que tiene un fenotipo de adaptación a células Vero conocido que sugiere que esta mutación puede conferir un fenotipo de potenciación de la replicación en virus rDEN2. Se secuenció completamente un clon de virus rDEN2 y además de la mutación 7169, se encontró una mutación de cambio de sentido (Glu > Ala) en NS5 en el residuo 3051 (tabla 20).

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TABLA 20 Mutaciones de cambio de sentido que se acumulan en virus rDEN2 y rDEN2\Delta30 tras la transfección o el pase en células Vero

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Debido a que los virus tanto rDEN2 como rDEN2\Delta30 que se hicieron crecer en células Vero adquirieron la misma mutación en el nucleótido 7169, que corresponde a la mutación de adaptación a células Vero identificada anteriormente en rDEN4 en el nucleótido 7162, se pensó que esta mutación estaba asociada con adaptación al crecimiento de rDEN2 y rDEN2\Delta30 en células Vero. En previsión de que la mutación 7169 pueda permitir que rDEN2\Delta30 se recupere directamente en células Vero, se introdujo la mutación en el plásmido de ADNc de rDEN2\Delta30 para crear p2\Delta30-7169. Se sintetizaron transcritos a partir de p2\Delta30-7169, así como se introdujeron p2 y p2\Delta30 en células Vero o células de mosquito C6/36 usando transfección mediada por liposomas tal como se describió anteriormente. Se recuperó virus rDEN2\Delta30-7169 a partir del ADNc de p2\Delta30-7169 tanto en células Vero como C6/36, mientras que se recuperó rDEN2\Delta30 a partir del clon de ADNc p2\Delta30 sólo en células C6/36 (tabla 21). La mutación 7169 es tanto necesaria como suficiente para la recuperación de rDEN2\Delta30 en células Vero.

TABLA 21 El virus rDEN2\Delta30-7169 que contiene la mutación de adaptación a células Vero 7169 se recupera tanto en células Vero como C6/36

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Para evaluar inicialmente la capacidad de la mutación \Delta30 para atenuar el virus rDEN2 en un modelo animal, se evaluó la replicación de los virus DEN2 (Tonga/74), rDEN2 y rDEN2\Delta30 en ratones SCID-HuH-7. Previamente, se había demostrado que la atenuación de los candidatos a vacuna en ratones SCID-HuH-7 era predictiva de la atenuación en el modelo de infección de mono rhesus (ejemplo de referencia 1 y ejemplo 1). Se recuperaron los virus recombinantes sometidos a prueba en este experimento en células C6/36. El aislado de virus DEN2 Tonga/74, rDEN2, y dos virus rDEN2\Delta30 independientes, (clones 20A y 21A) que se derivaron de dos clones de ADNc p2\Delta30 independientes, se diluyeron terminalmente dos veces en células C6/36 antes de la producción de una reserva de trabajo en células C6/36. Estos virus no deben contener ninguna mutación de adaptación a células Vero. El virus DEN2 Tonga/74 se replicó a un título de virus medio de 6,2 log_{10} UFP/ml en el suero de ratones SCID-HuH-7, y el virus rDEN2 se replicó a un nivel similar, 5,6 log_{10} UFP/ml (tabla 22). Ambos virus rDEN2\Delta30 estaban restringidos más de 100 veces en su replicación en comparación con el virus rDEN2. Estos resultados indican que la mutación \Delta30 tiene un efecto atenuante sobre la replicación del virus rDEN2 similar al observado para los virus rDEN4 y
rDEN1.

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TABLA 22 La mutación \Delta30 restringe la replicación del virus rDEN2 en ratones SCID-HuH-7

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También se determinó la replicación del virus DEN2 en ratones SCID-HuH-7 usando DEN2 (Tonga/74), rDEN2 y rDEN2\Delta30 que se pasaron en células Vero (véase la tabla 20, notas al pie b y d). Tanto rDEN2 como rDEN2\Delta30 habían adquirido una mutación en NS4B, nucleótido 7169, que correspondía a la mutación 7162 identificada en rDEN4 como mutación de adaptación a células Vero. En presencia de la mutación 7169, la mutación \Delta30 redujo la replicación de rDEN2\Delta30 en 1,0 log_{10} UFP/ml (tabla 23). Previamente, usando virus que se hicieron crecer en células C6/36 y que carecían de la mutación 7169, la mutación \Delta30 redujo la replicación de rDEN2\Delta30 en aproximadamente 2,5 log_{10} UFP/ml (tabla 22). Estos resultados indican que la adaptación al crecimiento en células Vero en DEN2 también puede conferir una ligera ventaja de crecimiento en células de hígado HuH-7. No obstante, la atenuación conferida por la mutación \Delta30 todavía puede apreciarse en estos virus adaptados al crecimiento en células Vero.

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TABLA 23 La mutación \Delta30 restringe la replicación del virus rDEN2 adaptado a células Vero en ratones SCID-HuH-7

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Se realizó la evaluación de la replicación, inmunogenicidad y eficacia protectora de virus rDEN2\Delta30 y rDEN2 original de tipo natural en monos rhesus juveniles tal como sigue. Se inyectaron por vía por vía subcutánea a monos seronegativos para el virus del dengue 5,0 log_{10} UFP de virus en una dosis de 1 ml dividida entre dos inyecciones en cada lado de la zona del hombro superior. Se observaron los monos diariamente y se recogió sangre en los días 0 - 10 y 28 y se almacenó el suero a -70ºC. Se pasaron los virus usados en este experimento en células Vero, y los virus recombinantes contenían las mutaciones mostradas en la tabla 20 (véanse las notas al pie b y d). Se determinó el título de virus en muestras de suero mediante ensayo de placas en células Vero tal como se describió anteriormente (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se determinaron los títulos de neutralización por reducción de placas para las muestras de suero del día 28 tal como se describió anteriormente (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se expusieron todos los monos en el día 28 a una única dosis de 5,0 log_{10} UFP de DEN2 de tipo natural (Tonga/74) y se recogió sangre durante 10 días. Se determinó el título de virus en sueros tras la exposición mediante ensayo de placas en células Vero. Los monos a los que se les inoculó DEN2 de tipo natural (Tonga/74) o rDEN2 fueron virémicos durante 4-5 días con un título pico medio de 2,1 o 1,9 log_{10} UFP/ml,
respectivamente.

Los monos a los que se les inoculó rDEN2\Delta30 fueron virémicos durante 2 - 3 días con un título pico medio de 1,7 log_{10} UFP/ml (tabla 24, figura 7), lo que indica que la mutación \Delta30 puede atenuar DEN2, aunque no al mismo bajo nivel observado en rDEN1\Delta30 (tabla 16). Tal como se esperaba para un virus atenuado, la respuesta inmunitaria, tal como se midió mediante el título de anticuerpos neutralizantes, era inferior tras la inoculación con rDEN2\Delta30 en comparación con la inoculación con DEN2 de tipo natural (Tonga/74) o rDEN2 (tabla 24), aunque suficientemente alta para proteger a los animales frente a la exposición al virus DEN2 de tipo natural (tabla 25). Por tanto, la disminución del número de días de viremia para rDEN2\Delta30, la disminución del título pico medio y la disminución de la respuesta de anticuerpos séricos indica que la mutación \Delta30 atenúa rDEN2 para monos
rhesus.

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TABLA 24 rDEN2\Delta30 está ligeramente más atenuado para monos rhesus que rDEN2

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TABLA 25 rDEN2\Delta30 protege a monos rhesus frente a la exposición al virus DEN2 de tipo natural

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Se evaluó la infectividad de DEN2 (Tonga/74), rDEN2 y rDEN2\Delta30 para mosquitos Aedes aegypti por medio de una harina de sangre artificial usando los métodos descritos en detalle en el ejemplo de referencia 3. Sin embargo, a dosis de 3,3 a 3,5 log_{10} UFP ingeridas, ninguno de estos tres virus infectó a ningún mosquito, lo que indica que DEN2 (Tonga/74) es escasamente infeccioso para Aedes aegypti. Como con rDEN1, queda por definir la base genética para esta falta de infectividad. La importante propiedad de infectividad restringida para el intestino medio del mosquito es sumamente deseable en un candidato a vacuna porque serviría para restringir en gran medida la transmisión del virus desde un vacunado hasta un vector de mosquito.

Varias mutaciones de cambio de sentido identificadas en rDEN4 han demostrado conferir una replicación atenuada en cerebro de ratón lactante y/o ratones SCID-HuH-7 (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139; Blaney, J. E. et al. 2001 J Virol 75:9731-9740). Además, se han caracterizado mutaciones de cambio de sentido que potencian las replicación de virus rDEN4 en células Vero. La conservación de secuencia significativa entre los serotipos de virus DEN proporciona una estrategia mediante la cual se contempla que las mutaciones identificadas en virus rDEN4 se usen para conferir fenotipos similares en virus rDEN2. Seis mutaciones identificadas en virus rDEN4 que están en un sitio conservado en virus rDEN2 van a introducirse en los clones de ADNc p2 y p2\Delta30 (tabla 26). Específicamente, van a evaluarse dos mutaciones de rDEN4, NS3 4891 y 4995, que confieren fenotipos de adaptación a células Vero y replicación disminuida en cerebro de ratón, una mutación, NS4B 7182, que confiere un fenotipo de adaptación a células Vero, y tres mutaciones, NS1 2650, NS3 5097 y UTR en 3' 10634 que confieren replicación disminuida en cerebro de ratón y ratones SCID-HuH-7. Se han introducido estas mutaciones en fragmentos subclonados de los clones de ADNc p2 y p2\Delta30, y se han usado para generar clones de ADNc de longitud completa mutantes (tabla 26), a partir de los cuales se han recuperado virus en células C6/36 (tabla 27). Se contempla que la evaluación de estos virus rDEN2 mutantes determina que tales mutaciones puntuales pueden transportarse a un serotipo de virus DEN diferente y confiere un fenotipo útil similar, tal como se ha demostrado para la mutación por deleción
\Delta30.

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TABLA 27 Se recuperan virus rDEN2 que contienen mutaciones 5-FU conservadas en células C6/36

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Ejemplo de referencia 2

Generación y caracterización de un virus DEN3 recombinante que contiene la mutación \Delta30

Debido a que rDEN1\Delta30 se atenuó satisfactoriamente, se buscó extender esta tecnología a la creación de un candidato a vacuna contra DEN3. Para hacer esto, se introdujo la mutación \Delta30 en el ADNc de DEN3, de manera similar al método usado para crear rDEN2\Delta30. Se escogió un aislado de virus DEN3 de una epidemia de dengue de 1978 en la zona rural de Sleman, Indonesia Central (Sleman/78) (Gubler, D. J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30:1094-1099) para representar DEN3 de tipo natural. Se secuenció el genoma de DEN3 (Sleman/78) en su totalidad y sirvió como secuencia consenso para la construcción de un clon de ADNc de longitud completa (apéndice 2). Se generaron fragmentos de ADNc de DEN3 (Sleman/78) mediante transcripción inversa del genoma tal como se indica en la figura 8A. Se subclonó cada fragmento en un vector de plásmido y se secuenció para verificar que coincidía con la secuencia consenso tal como se determinó por el virus. Esto produjo seis fragmentos de ADNc clonados que abarcaban el genoma. Se modificaron los fragmentos clonados tal como sigue: el fragmento 5, que representa el extremo 5' del genoma se puso colindante al promotor de SP6 precedido por un sitio de restricción AscI; se modificó el fragmento 1L para que contuviese un sitio de restricción SpeI silencioso en la traducción en el nucleótido genómico 2345; se modificó el fragmento 1R para que contuviese un sitio de restricción SpeI silencioso en la traducción también en el nucleótido genómico 2345, y para estabilizar el clon de longitud completa final, se crearon tres mutaciones silenciosas en la traducción en los nucleótidos 2354 - 2356, 2360 - 2362 y 2399 para garantizar que estaban presentes codones de terminación de la traducción en todos los marcos de lectura distintos de los usados para sintetizar la poliproteína de virus; se modificó el fragmento 3 en el nucleótido 9007 para suprimir un sitio de restricción KpnI que se produce de manera natural; y el fragmento 4, que representa el extremo 3' del genoma se puso colindante a un sitio de restricción KpnI. Se añadió cada fragmento progresivamente entre los sitios de restricción AscI y KpnI del clon de ADNc de DEN4 p4 (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13) para generar un clon de ADNc de DEN3 de longitud completa con los mismos antecedentes de vector usados satisfactoriamente para generar rDEN4 y rDEN2. Sin embargo, no pudo recuperarse un clon estable, de longitud completa, en E. coli cuando se combinaron los fragmentos 1L y 1R en la misma molécula de ADNc. Para superar esta inestabilidad, se introdujo un ligador de ADN sintético (figura 8A) que contenía codones de terminación redundantes en cada uno de los marcos de lectura abiertos directos e inversos en el sitio de restricción SpeI al mismo tiempo que se añadía el fragmento 1L para completar el constructo de ADNc de longitud completa. El clon p3 resultante que contenía la secuencia de ligador era estable en E. coli, lo que indica que la secuencia de ligador era suficiente para interrumpir cualquier elemento perjudicial que exista en esta región. Se secuenció el clon p3 de ADNc y se encontró que el genoma del virus coincidía con la secuencia consenso de DEN3 (Sleman/78), con la excepción de la secuencia de ligador y las modificaciones silenciosas en la traducción indicadas anteriormente (apéndice 2 - se muestra con la secuencia de ligador eliminada). Se introdujo la mutación \Delta30 en el fragmento 4 para generar el fragmento 4\Delta30. Para crear p3\Delta30, se reemplazó la región del fragmento 4 de p3 por el fragmento 4\Delta30 (figura 8A, B).

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Para la transcripción y generación de virus infeccioso, se digirieron los plásmidos de ADNc p3 y p3\Delta30 con SpeI y se volvieron a ligar para eliminar la secuencia de ligador, se linealizaron con Acc65I (isoesquizómero de KpnI que escinde dejando sólo un único nucleótido en 3'), y se usaron como moldes en una reacción de transcripción usando ARN polimerasa SP6 tal como se describió anteriormente (Blaney, J. E. et. al. 2002 Virology 300:125-139). Se introdujeron transcritos en células Vero o células de mosquito C6/36 usando transfección mediada por liposomas y se recogieron sobrenadantes de cultivo celular en el día 14.

Se recuperó el virus rDEN3 a partir del ADNc p3 tanto en células Vero como C6/36, mientras que rDEN3\Delta30 se recuperó a partir del clon de ADNc p3\Delta30 sólo en células C6/36 (tabla 28). El nivel de virus infeccioso recuperado en células C6/36 era comparable para los clones de ADNc p3 y p3\Delta30 cuando se sometieron a ensayo mediante titulación de placas en células Vero o C6/36. Tal como se observó anteriormente, la eficacia de transfección en células C6/36 era mayor que en células Vero. Se recuperaron dos virus rDEN3\Delta30 a partir de clones de ADNc independientes, n.º 22 y n.º 41.

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TABLA 28 El virus rDEN3 se recupera en células Vero y C6/36, pero el virus rDEN3\Delta30 sólo se recupera en células C6/36

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Para producir reservas de trabajo de virus, se pasarán las cosechas de transfección y se diluirán terminalmente en células Vero, y se determinarán las secuencias genómicas de los virus. Para mejorar el rendimiento de virus en células Vero, se introdujo la mutación de adaptación a células Vero previamente identificada en rDEN4 en el nucleótido 7162 en la región NS4B homóloga de p3 y p3\Delta30 para crear p3-7164 y p3\Delta30-7164. Esta mutación crea una sustitución de Val por Ala en la posición de aminoácido 2357. Tal como se demuestra para rDEN2\Delta30, esta mutación permitía la recuperación directa del virus en células Vero (tabla 27) y se prevé que tenga el mismo efecto para
rDEN3\Delta30.

Para evaluar inicialmente la capacidad de la mutación \Delta30 para atenuar el virus rDEN3 en un modelo animal, se evaluará la replicación de los virus DEN3 (Sleman/78), rDEN3 y rDEN3\Delta30 en ratones SCID-HuH-7 y monos rhesus. Previamente, se ha demostrado que la atenuación de los candidatos a vacuna en ratones SCID-HuH-7 es predictiva de la atenuación en el modelo de infección de mono rhesus (ejemplo de referencia 1 y ejemplo 1). Se contempla que la evaluación de estos virus rDEN3 mutantes determine que las mutaciones por deleción \Delta30 pueden transportarse al serotipo de virus DEN3 y conferir un fenotipo útil similar, tal como se ha demostrado para DEN1, DEN2 y
DEN4.

En resumen, la estrategia de introducción de la mutación \Delta30 en los virus DEN de tipo natural de cada serotipo para generar una formulación de vacuna tetravalente adecuadamente atenuada es un enfoque único y atractivo por varios motivos. En primer lugar, la mutación responsable de la atenuación es una deleción de 30 nucleótidos en la UTR en 3', garantizando así que todas las proteínas estructurales y no estructurales expresadas por cada uno de los cuatro componentes de la vacuna tetravalente son proteínas de tipo natural auténticas. Tales proteínas de tipo natural debe provocar una respuesta de anticuerpos que es de base amplia, en lugar de basada únicamente en las proteínas M y E que están presentes en candidatos a vacuna contra el virus del dengue quiméricos (Guirakhoo, F. et al. 2001 J Virol 75: 7290-304; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Las singularidad de este enfoque deriva del hecho de que otras vacunas contra el virus del dengue atenuadas vivas tienen mutaciones en sus proteínas estructurales o no estructurales (Butrapet, S. et al. 2000 J Vitro/74:3011-9; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91), por tanto la respuesta inmunitaria inducida por estos virus será frente a una proteína mutante, en lugar de frente a una proteína de tipo natural. En segundo lugar, las mutaciones por deleción son genéticamente más estables que las mutaciones puntuales, y la reversión del fenotipo de atenuación es improbable. En seres humanos, DEN4\Delta30 presente en el suero de los vacunados conservaba su mutación \Delta30, confirmando su estabilidad genética in vivo (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Las mutaciones atenuantes en otros candidatos a vacuna atenuada viva contra el dengue se basan en mutaciones puntuales menos estables (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9: Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91). En tercer lugar, puesto que la mutación \Delta30 es común a cada uno de los cuatro virus de la vacuna tetravalente, la recombinación entre cualquiera de los cuatro serotipos de vacuna no conduciría a una pérdida de la mutación atenuante o reversión a un fenotipo de tipo natural. Se ha observado recombinación entre componentes de la vacuna de la polio trivalente (Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74: 8434-43), y se han descrito virus del dengue recombinantes que se producen de manera natural (Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96:7352-7), lo que indica la capacidad de este flavivirus para intercambiar elementos genéticos entre dos virus diferentes. Claramente, el intercambio de genes se logra fácilmente entre diferentes serotipos de virus DEN usando técnicas de ADNc recombinante (Bray, M. y Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). En cuarto lugar, los virus con proteínas estructurales de tipo natural parecen ser más infecciosos que los virus con proteínas estructurales alteradas (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-80). Esto permite el uso de una baja cantidad de cada uno de los cuatro componentes de virus en la vacuna final, contribuyendo al bajo coste de fabricación. La fabricación de bajo coste es un elemento esencial para definir la utilidad final de una vacuna contra el virus del
dengue.

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Ejemplo de referencia 3

Generación y caracterización de virus DEN2 quiméricos intertípicos que contienen la mutación \Delta30

Los cuatro serotipos de virus del dengue se definen por respuestas de anticuerpos inducidas por las proteínas estructurales del virus, principalmente por una respuesta de anticuerpos neutralizantes frente a la proteína de la envuelta (E). Estas proteínas estructurales incluyen la glicoproteína E, una proteína de membrana (M), y una proteína de la cápsida (C). La partícula de virus maduro consiste en una vaina proteica externa bien organizada que rodea a una membrana de bicapa lipídica y un núcleo de nucleocápsida interna peor definida (Kuhn, R.J. et al. 2002 Cell 108:717-25). La glicoprotína E es el antígeno protector principal e induce fácilmente anticuerpos neutralizantes del virus que confieren protección frente a infección por virus del dengue. Una vacuna contra el dengue eficaz debe contener por tanto mínimamente la proteína E de los cuatro serotipos, concretamente DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, induciendo de ese modo amplia inmunidad y descartando la posibilidad de desarrollar las enfermedades más graves FHD/SCD, que se producen en seres humanos durante la infección secundaria con un virus del dengue de tipo natural heterotípico. Basándose en una estrategia notificada previamente (Bray, M. y Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6), se está usando una tecnología de ADNc recombinante para desarrollar una vacuna contra el virus del dengue tetravalente atenuada de un conjunto de virus del dengue quiméricos intertípicos que portan las proteínas estructurales de cada
serotipo.

Tras la identificación de un virus recombinante DEN4 inmunogénico y adecuadamente atenuado, concretamente DEN4A30 (Durbin, A.P et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13), se han generado virus quiméricos basándose en el ADNc de DEN4 en los que los genes C-M-E (CME) o M-E (ME) se han reemplazado por los genes correspondientes derivados de la cepa de Nueva Guinea C (NGC) de DEN2 prototípica (figura 9A). Para crear los virus quiméricos de CME, se reemplazó la región BglII/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región similar derivada de DEN2. Igualmente, para crear los virus quiméricos de ME, se reemplazó la región PstI/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región homóloga derivada de DEN2. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las uniones resultantes se muestran en la figura 9B. El número de registro de GenBank para la secuencia de nucleótidos de rDEN4\Delta30 es AF326837. El número de registro de GenBank para DEN2 NGC es M29095, que representa la cepa neurovirulenta de ratón de DEN2 NGC y difiere de la cepa prototípica usada en este caso tal como se documentó previamente (Bray, M. et al. 1998 J Virol 72:
1647-51).

Par la transcripción y generación de virus, se linealizaron clones de ADNc quiméricos y se usaron como molde en una reacción de transcripción usando ARN polimerasa SP6 tal como se describe (Durbin, A.P et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se introdujeron transcritos en células Vero usando transfección mediada por liposomas y se recogió virus del dengue recombinante en el día 7. Se confirmaron los genomas de los virus resultantes mediante análisis de secuencia del ARN viral aislado a partir de virus recuperado tal como se describió previamente (Durbin, A.P et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13). Se identificaron mutaciones imprevistas que surgieron del pase del virus en cultivo tisular en todos los virus y se enumeran en la tabla 29. Particularmente, cada virus contenía una mutación de cambio de sentido en NS4B correspondiente a una mutación identificada previamente a partir de rDEN4 y asociada con adaptación a la replicación en células Vero (véase la tabla 30 para la correlación de las posiciones de nucleótido entre rDEN4 y virus quiméricos). Todos los virus se replicaban en células Vero a títulos en exceso de 6,0 log_{10} UFP/ml, lo que indica que los virus quiméricos, incluso los que contenían la mutación \Delta30, se replican eficazmente en cultivo celular, una propiedad esencial para la fabricación de la
vacuna.

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TABLA 29 Mutaciones de cambio de sentido observadas entre los virus DEN2/4 quiméricos que se hacen crecer en células Vero

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TABLA 30 Diferencias de longitud de nucleótidos (nt) para virus quiméricos DEN en comparación con rDEN4

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Los resultados de un estudio de seguridad, inmunogenicidad y eficacia en monos se presentan en la tabla 31. Los monos a los que se les inoculó DEN2 de tipo natural fueron virémicos durante aproximadamente 5 días con un título pico medio de 2,1 log_{10} UFP/ml, mientras que los monos a los que se les inoculó cualquiera de los virus DEN2 quiméricos fueron virémicos durante 1,2 días o menos y tuvieron un título pico medio inferior a 1,0 log_{10} UFP/ml. Esta reducción en la magnitud y la duración de la viremia indica claramente que los virus quiméricos que contienen las proteínas o bien CME o bien de DEN2 estaban más atenuados que el virus DEN2 NGC original. Ni los animales que recibieron los virus DEN2 de tipo natural ni los que recibieron virus quiméricos DEN2/4 estaban enfermos. La disminución de la replicación de los virus atenuados en monos va acompañada por una reducción en la respuesta inmunitaria de monos inoculados. Esto se indica en la tabla 31 mediante aproximadamente una reducción de 5 veces en el nivel de anticuerpos neutralizantes tras la inoculación con los virus quiméricos en comparación con los títulos logrados en animales a los que se les inoculó el virus de tipo natural. La adición de la mutación \Delta30 al virus quimérico de CME atenuó adicionalmente el virus, de manera que rDEN2/4\Delta30(CME) no se replicaba en monos en un nivel detectable y no inducía una respuesta inmunitaria detectable. Este virus parecía estar sobreatenuado, y si se observaran resultados similares en seres humanos, este virus no sería adecuado para su uso como vacuna. Sin embargo, la adición de la mutación \Delta30 al virus quimérico de ME no atenuó adicionalmente este virus quimérico y el virus rDEN2/4\Delta30(ME) resultante parece estar atenuado satisfactoriamente y ser inmunogénico para su uso como vacuna.

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TABLA 31 La quimerización entre los tipos 2 y 4 de virus del dengue da como resultado virus recombinantes que están atenuados para monos rhesus

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Tal como se describió en los ejemplos anteriores, los ratones SCID a los que se han trasplantado células HuH-7 son un modelo sensible para la evaluación de la atenuación del virus del dengue. Cada virus DEN2/4 quimérico se inoculó en grupos de ratones SCID-HuH-7 y se determinaron los niveles de virus en el suero (tabla 32). Los virus quiméricos se replicaron hasta niveles entre 20 y 150 veces inferiores que cualquiera de los virus originales (rDEN4 y DEN2-NGC). Los virus quiméricos de CME estaban ligeramente más atenuados que los virus quiméricos de ME comparables, proporcionando la mutación \Delta30 a una reducción en la replicación de 0,5 log_{10}. Este nivel de atenuación ejercido por la mutación \Delta30 era similar al observado previamente para rDEN4\Delta30.

TABLA 32 La quimerización entre los tipos 2 y 4 del virus del dengue da como resultado virus recombinantes que están atenuados para ratones HuH-7-SCID

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Para evaluar los niveles de replicación de cada virus quimérico DEN2/4 en mosquitos, se infectaron experimentalmente dos géneros diferentes de mosquitos. Se infectaron Aedes aegypti mediante ingestión de una harina de sangre que contenía virus. Evaluando la presencia de antígeno de virus tanto en tejido de cabeza como de intestino medio, pudo determinarse la infectividad para los tejidos localizados (intestino medio), y también pudo medirse la capacidad del virus para diseminarse y replicarse en tejidos más allá de la barrera del intestino medio (cabeza). La presencia de virus en la cabeza se ve limitada por la capacidad del virus ingerido para replicarse en el intestino medio y luego diseminarse hasta las glándulas salivares en la cabeza, así como la capacidad innata del virus para replicarse en las glándulas salivares. La inoculación intratorácica de virus en Toxorhynchites splendens evita la barrera del intestino medio del mosquito. Los virus originales rDEN4 y DEN2-NGC infectan fácilmente Ae. aegypti y T. splendens (tabla 33), pareciendo ser DEN2-NGC mucho más infeccioso en T. splendens. Cada uno de los virus quiméricos rDEN2/4 se sometió también a prueba en ambos tipos de mosquito. En muchos casos no fue posible inocular a Ae. aegypti una reserva de virus sin diluir de título suficiente para lograr una infección detectable debido a la muy baja infectividad de varios de los virus. No obstante, está claro que los virus quiméricos rDEN2/4 son menos infecciosos para el intestino medio y la cabeza. Los virus originales rDEN4 y DEN2-NGC, administrados a una dosis máxima de aproximadamente 4,0 log_{10} UFP, eran detectables en el 74% y el 94% de las preparaciones de intestino medio, y el 32% y el 71% de las preparaciones de cabeza, respectivamente. Entres los virus quiméricos, el nivel más alto de infectividad, tal como se observa para rDEN2/4\Delta30(CME), dio como resultado sólo el 26% de muestras de intestino medio infectadas y el 6% de muestras de cabeza. En el T. splendens más permisivo, los virus quiméricos rDEN2/4 fueron generalmente menos infecciosos que cualquier virus original, siendo los virus quiméricos de CME menos infecciosos que los virus de ME. Previamente se ha notificado para DEN4 que la mutación \Delta30 no tiene un efecto apreciable sobre la infectividad de virus en T. splendens similar al observado en este caso para los virus quiméricos rDEN2/4 (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-419).

TABLA 33 Los virus quiméricos del dengue 2/4 son menos infecciosos en comparación con cualquier cepa de virus parental en mosquitos

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La quimerización de los genes estructurales de DEN2 con el virus rDEN4\Delta30 dio como resultado un virus, rDEN2/4\Delta30(CME), que tenía replicación disminuida en células Vero en comparación con cualquier virus original. Para evaluar las mutaciones de adaptación a células Vero (Blaney, J. E. et al. 2002 Virology 300:125-139) como medio para aumentar el rendimiento de virus de un candidato a vacuna contra DEN en células Vero, se introdujeron mutaciones seleccionadas en este virus quimérico. Por consiguiente, se recuperaron virus rDEN2/4\Delta30(CME) que portaban mutaciones de adaptación, terminalmente diluidos, y se propagaron en células C6/36 para determinar si podía aumentarse el rendimiento de virus en células Vero.

Se generaron virus rDEN2/4\Delta30(CME) que portaban mutaciones de adaptación a células Vero tal como sigue. Se cortaron fragmentos de ADN a partir de constructos de ADNc de rDEN4 que abarcaban mutaciones de adaptación a células Vero de DEN4 individuales o dobles y se introdujeron en el clon de ADNc de rDEN2/4\Delta30(CME). La presencia de la mutación de adaptación a células Vero se confirmó mediante análisis de secuencia, y se transfectaron transcritos de ARN derivados de los clones de ADNc

\hbox{mutantes, se diluyeron terminalmente y se 
propagaron en células C6/36.}

Para la evaluación de la cinética de crecimiento, se infectaron células Vero con los virus indicados a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. Se lavaron monocapas de células confluentes en frascos de cultivo tisular de 25 cm^{2} por duplicado y se recubrieron con un inóculo de 1 ml que contenía el virus indicado. Tras una incubación de dos horas a 37ºC, se lavaron las células tres veces en MEM y se añadieron 5 ml de MEM complementado con FBS al 2%. Se retiró una alícuota de 1 ml de medio de cultivo tisular, se reemplazó por medio nuevo, y se designó el punto de tiempo día 0. A los puntos de tiempo indicados tras la infección, se retiraron muestras de 1 ml de medio de cultivo tisular, se clarificaron mediante centrifugación y se congelaron a -80ºC. El nivel de replicación del virus se sometió a ensayo mediante titulación de placas en células C6/36 y se visualizó mediante tinción con inmunoperoxidasa. El límite de detección era < 0,7 log_{10} UFP/ml.

Las propiedades de crecimiento de virus rDEN2/4\Delta30(CME) que portaban mutaciones de adaptación a células Vero individuales en NS4B -7153, -7162, -7163, -7182, NS5 -7630 o tres combinaciones de mutaciones se compararon en células Vero con el virus rDEN2/4\Delta30 (CME) (figura 10). Sin una mutación de adaptación a células Vero introducida, el rendimiento del virus rDEN2/4\Delta30(CME) tenía un pico a 4,4 log_{10} UFP/ml. Cada mutación de adaptación individual y las mutaciones combinadas conferían un aumento sustancial en la replicación. Específicamente, rDEN2/4\Delta30(CME)-7182 creció al título más alto de 7,1 log_{10} UFP/ml, lo que era un aumento de 500 veces en el rendimiento. rDEN2/4\Delta30(CME)-7162 tuvo el rendimiento más bajo pero aún se aumentó 125 veces con respecto al nivel de replicación por el virus rDEN2/4\Delta30(CME). Las introducción de dos mutaciones de adaptación en el virus rDEN2/4\Delta30(CME) no aumentó significativamente el rendimiento de virus con respecto a los virus que portaban mutaciones de adaptación a células Vero individuales. El aumento observado de hasta 500 veces en el rendimiento de virus mediante la introducción de una mutación de adaptación a células Vero en este candidato a vacuna quimérica demuestra el valor de identificar y caracterizar secuencias promotoras de la replicación específicas en virus DEN.

Estos resultados tienen particular importancia para el desarrollo de una vacuna contra el virus del dengue atenuada viva. En primer lugar, está claro que la quimerización conduce a la atenuación del virus resultante, tal como se indica por estudios en monos rhesus, ratones HuH7-SCID y mosquitos. Aunque no se llegó a esta conclusión en el estudio previo con los virus quiméricos DEN2/DEN4 o DEN1/DEN4 (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6), el examen cuidadoso de los datos sugeriría que los virus quiméricos están más atenuados en monos en comparación con los virus originales de tipo natural. En segundo lugar, la mutación \Delta30 puede aumentar adicionalmente esta atenuación de una manera dependiente de virus quiméricos. Específicamente, en este ejemplo, los virus quiméricos que portaban la región CME de DEN2 se sobreatenuaron mediante la adición de \Delta30, mientras que el fenotipo de atenuación de virus quiméricos que portaban sólo la región ME de DEN2 no se alteró por la adición de la mutación \Delta30. Este hallazgo inesperado indica que en una vacuna tetravalente compuesta por virus de componentes individuales que portan una mutación atenuante compartida, tal como la mutación \Delta30, sólo pueden utilizarse los virus quiméricos de ME puesto que los virus quiméricos de CME que portan la mutación \Delta30 pueden sobreatenuarse en monos rhesus y podrían proporcionar sólo inmunogenicidad limitada en seres humanos.

Ejemplo de referencia 4

Generación y caracterización de virus DEN3 quiméricos intertípicos que contienen la mutación \Delta30

Se han generado virus quiméricos a base del ADNc de DEN4 en los que los genes CME o ME se han reemplazado por los genes correspondientes derivados de DEN3 (Sleman/78), un aislado de virus del brote de dengue de 1978 en la región de Sleman de Indonesia (Gubler, D.J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30:1094-1099) (apéndice 2). Tal como se describe en el ejemplo 5 para los virus quiméricos DEN2, se generaron virus quiméricos de CME para DEN3 reemplazando la región BglII/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región similar derivada de DEN3 (Sleman/78) (figura 11A). Igualmente, para crear los virus quiméricos de ME, se reemplazó la región PstI/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región similar derivada de DEN3 (Sleman/78). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las uniones resultantes se muestran en la figura 11B. Se confirmaron los genomas de los virus resultantes mediante análisis de secuencia del ARN viral aislado a partir de virus recuperado tal como des describió previamente (Durbin, A.P et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13). Se identificaron mutaciones imprevistas que surgían del pase de virus en cultivo tisular en todos los virus y se enumeran en la tabla 34. Particularmente, cada virus contenía una mutación de cambio de sentido en NS4B correspondiente a una mutación previamente identificada a partir de rDEN4 y asociada con la adaptación al crecimiento en células Vero (véase la tabla 30 para la correlación de las posiciones de nucleótido entre rDEN4 y virus quiméricos). Todos los virus se replicaban en células Vero a títulos en exceso de 5,7 log_{10} UFP/ml, lo que indica que los virus quiméricos, incluso los que contienen la mutación \Delta30, se replican

\hbox{eficazmente en cultivo celular, una propiedad esencial
para la  fabricación de la vacuna.}

TABLA 34 Mutaciones de cambio de sentido observadas entre los virus DEN3/4 quiméricos que se han hecho crecer en células Vero

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Tal como se describe en los ejemplos anteriores, los ratones SCID con trasplante de células HuH-7 son un modelo sensible para la evaluación de la atenuación del virus del dengue. Se inoculó cada virus DEN3/4 quimérico en grupos de ratones SCID-HuH-7 y se determinaron los niveles de virus en el suero (tabla 35). Mientras que el virus quimérico rDEN3/4 (CME) no se atenuó, los virus quiméricos restantes se replicaron a niveles entre 40 y 400 veces inferiores que cualquiera de los virus originales (rDEN4 y DEN3-Sleman/78). En el virus quimérico de CME, proporcionando la mutación \Delta30 una extraordinaria reducción de 2,7 log_{10} en la replicación. Este nivel de atenuación conferido por la mutación \Delta30 en el virus quimérico de CME era mucho mayor que el observado previamente para rDEN4\Delta30. El virus rDEN3/4 (ME) tenía una reducción de la replicación de 100 veces en comparación con cualquier virus original, lo que indica que la quimerización de ME era atenuante per se. La adición de la mutación \Delta30 a rDEN3/4 (ME) no dio como resultado una atenuación adicional.

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TABLA 35 La quimerización entre los tipos 3 y 4 de virus del dengue da como resultado virus recombinantes que están atenuados para ratones HuH-7-SCID

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Se realizó la evaluación de la replicación e inmunogenicidad de los virus recombinantes quiméricos DEN3 y el virus DEN3 de tipo natural en monos tal como se describe en el ejemplo de referencia 3. Los resultados de este estudio de seguridad e inmunogenicidad en monos se presentan en la tabla 36. Los monos a los que se les inoculó rDBN3/4(CME) y DEN de tipo natural (Sleman/78) fueron virémicos durante aproximadamente 2 días con un título pico medio de entre 1,6 y 1,8 log_{10} UFP/ml, respectivamente, lo que indica que la quimerización de los genes estructurales CME de DEN3 no conducía a la atenuación de la replicación del virus, un patrón diferente del observado para la quimerización de DEN2 (tabla 31). Sin embargo, la quimerización de los genes estructurales de ME dio como resultado virus atenuados con viremia no detectable en monos, aunque todos los monos experimentaron seroconversión con un aumento de más de 10 veces en los niveles de anticuerpos séricos. Tal como se espera para un virus atenuado, la respuesta inmunitaria, tal como se mide mediante el título de anticuerpos neutralizantes, era inferior tras la inoculación con cualquiera de los virus quiméricos en comparación con la inoculación con DEN3 de tipo natural (Sleman/78), aunque suficientemente alta para proteger a los animales frente a la exposición al virus DEN3 de tipo natural (tabla 37). Está claro que la adición de la mutación \Delta30 a rDEN3/4(CME) podía atenuar adicionalmente el virus resultante rDEN3/4\Delta30 (CME).

TABLA 36 La mutación \Delta30 atenúa adicionalmente rDEN3/4(CME) para monos rhesus

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TABLA 37 Los virus quiméricos rDEN3/4 protegen a monos rhesus frente a la exposición al virus DEN3 de tipo natural

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Para evaluar los niveles de replicación de cada virus quimérico DEN3/4 en mosquitos, se infectaron Aedes aegypti mediante ingestión de una harina de sangre que contenía virus (tabla 38). Los virus originales rDEN4 y DEN3 (Sleman/78) infectan fácilmente Ae. aegypti. También se sometió a prueba cada uno de los virus quiméricos rDEN3/4. En muchos casos no fue posible infectar Ae. aegypti con una reserva de virus sin diluir de título suficiente para lograr una infección detectable debido a la muy baja infectividad de varios de los virus. A una dosis de aproximadamente 2,8 - 2,9 log_{10} UFP, rDEN4, DEN3 (Sleman/78) y rDEN3/4(CME) eran igualmente infecciosos y se diseminaban hasta la cabeza con igual eficacia. Para los virus quiméricos restantes, la infección no fue detectable incluso a una dosis de 3,4 log_{10} UFP, lo que indica que la replicación de rDEN3/4(ME) y rDEN3/4\Delta30(CME) está restringida en Ae. aegypti. Comparando la infectividad de rDEN3/4(CME) y rDEN3/4\Delta30(CME), está claro que la mutación \Delta30 puede atenuar adicionalmente el virus quimérico para mosquitos.

TABLA 38 Capacidad de virus quiméricos DEN3/4 para infectar Aedes aegypti alimentados con una harina de sangre infeciosa

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Ejemplo de referencia 5

Generación y caracterización de virus DEN1 quiméricos intertípicos que contienen la mutación \Delta30

Se han generado virus quiméricos a base del ADNc de DEN4 en los que los genes CME o ME se han reemplazado por los genes correspondientes derivados de DEN1 (Puerto Rico/94), un aislado de virus a partir de un brote de dengue de 1994 en Puerto Rico (apéndices 3 y 4). Tal como se describe en el ejemplo de referencia 2 para los virus quiméricos DEN2, se generaron virus quiméricos de CME para DEN1 reemplazando la región BglII/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región similar derivada de DEN1 (Puerto Rico/94) (figura 12A). Igualmente, para crear los virus quiméricos de ME, se reemplazó la región PstI/XhoI del ADNc o bien para rDEN4 o bien para rDEN4\Delta30 por una región similar derivada de DEN1 (Puerto Rico/94). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las uniones resultantes se muestran en la figura 12B.

Para la transcripción y generación de virus, se linealizaron clones de ADNc quiméricos y se usaron como molde en una reacción de transcripción usando ARN polimerasa SP6 tal como se describe. Se introdujeron transcritos en células de mosquito C6/36 usando transfección mediada por liposomas y se recogió virus del dengue recombinante entre el día 7 y 14. Posteriormente se hicieron crecer virus en células Vero y se clonaron biológicamente mediante dilución terminal en células Vero. Todos los virus se replicaban en células Vero a títulos en exceso de 6,0 log_{10} UFP/ml, lo que indica que los virus quiméricos, incluso los que contenían la mutación \Delta30, se replican eficazmente en cultivo celular. Actualmente se ha iniciado el análisis de la secuencia genómica para identificar mutaciones imprevistas que surgen del pase del virus en cultivo tisular.

Para evaluar los niveles de replicación de los virus quiméricos DEN1/4(CME) y rDEN1/4\Delta30(CME) en mosquitos, se infectaron Aedes aegypti mediante la ingestión de una harina de sangre que contenía virus (tabla 39). El virus original rDEN4 infecta Ae. aegypti con una DMI_{50} de 4,0 log_{10} UFP. Sin embargo, el virus original DEN1 (Puerto Rico/94), no puede infectar Ae. aegypti a una dosis de hasta 3,4 log_{10} UFP. Por tanto, los virus quiméricos de CME DEN1/4 y rDEN1/4\Delta30 comparten esta incapacidad para infectar Ae. aegypti. Por tanto, en Ae. aegypti es innecesario evaluar el efecto de la mutación \Delta30 sobre la infectividad de los virus quiméricos DEN1/4, de una manera similar a la usada para los virus quiméricos DEN2/4 y DEN3/4.

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TABLA 39 Incapacidad de virus quiméricos DEN1/4 para infectar Aedes aegypti alimentados con una harina de sangre infecciosa

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Tal como se describe en los ejemplos anteriores, los ratones SCID con trasplante de células HuH-7 son un modelo sensible para la evaluación de la atenuación del virus del dengue. Se inoculó cada virus DEN1/4 quimérico en grupos de ratones SCID-HuH-7 y se determinaron los niveles de virus en el suero (tabla 40). Los virus quiméricos se replicaron a niveles entre 15 y 250 veces inferiores que cualquiera de los virus originales, rDEN4 y DEN1 (Puerto Rico/94). Los virus quiméricos de CME estaban más atenuados que los virus quiméricos de ME comparables, proporcionando la mutación \Delta30 una reducción en la replicación de 0,8 log_{10}. Este nivel de atenuación ejercido por la mutación \Delta30 en los virus quiméricos de CME fue similar al observado previamente para rDEN4\Delta30. Sin embargo, el efecto atenuante de la mutación \Delta30 en los virus quiméricos de ME es imperceptible.

TABLA 40 La quimerización entre los tipos 1 y 4 de virus del dengue da como resultado virus recombinantes que están atenuados para ratones HuH-7-SCID

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69

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70

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83

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90

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99

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100

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101

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102

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109

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\cr
\cr}

110

\newpage

Aunque la presente invención se ha descrito en algún detalle para fines de claridad y comprensión, un experto en la técnica apreciará que pueden hacerse diversos cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance verdadero de la invención. Todas las figuras, tablas, apéndices, patentes, publicaciones y solicitudes de patente, a los que se hace referencia anteriormente, se incorporan al presente documento por referencia.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> The Government of the United States of America, representado por la secretaría del Departamento de Salud y Servicios Humanos

\hskip1cm

Whitehead, Stephen S.

\hskip1cm

Murphy, Brian R.

\hskip1cm

Markoff, Lewis

\hskip1cm

Falgout, Barry

\hskip1cm

Blaney, Joseph

\hskip1cm

Hanley, Kathryn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> VACUNA TETRAVALENTE CONTRA EL DENGUE QUE CONTIENE UNA DELECIÓN DE 30 NUCLEÓTIDOS COMÚN EN LA UTR EN 3' DE LOS TIPOS 1, 2, 3 y 4 DE DENGUE, O VIRUS DEL DENGUE QUIMÉRICOS ANTIGÉNICOS 1, 2, 3, y 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> NIH230.001PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/377.860

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 03-05-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/436.500

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 23-12-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip0,8cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip0,8cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dengue 1 delta 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcccaag acuaga

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dengue 2 delta 30

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcccaag acuaga

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dengue 3 delta 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcccaag acuaga

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dengue 4 delta 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcccaag acuaga

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región TL2 del plásmido p2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggggccca aggtgagatg aagctgtagt ctcactggaa ggactagagg t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región TL2 de p2 delta 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggggccca agactagagg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región TL2 del plásmido p3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggggcccga gctctgaggg aagctgtacc tccttgcaaa ggactagagg t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región TL2 de p3 delta 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggcccaa gactagaggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador SpeI en p3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actagttaga ctaacttaag tcaactagt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtttgttt gaatagagag cagatctctg atgaataacc aacgaaaaaa g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attatcacat ggataggaat gaactcgagg aacacttcaa tggctatgac g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcttgaacg ggagaaaaag gtctgcaggc atgatcatta tgctgattcc a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN2/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtttgttt gaatagagag cagatctctg gaaaaatgaa caaccaacgg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttttaacct ggatagggtt gaactcgagg aacacttcaa tggctatgac g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcttgaacg ggagaaaaag gtctgcagtc tgtctcatga tgatgttacc a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN3/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN1/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtttgttt gaatagagag cagatctctg gaaaaatgaa caaccaacgg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 1 de rDEN1/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN1/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgacat ggctaggatt aaactcgagg aacacttcaa tggctatgac g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 2 de rDEN1/4

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN1/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcttgaacg ggagaaaaag gtctgcagcc atgctcctca tgctgctgcc c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unión 3 de rDEN1/4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 4

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacgggcgc cgt

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggcctgga

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatccccggg ac

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagctctct c

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatctccac ccgga

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtcgaatc

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plásmido p2 de dengue 2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

132

\hskip0,8cm

133

\hskip0,8cm

134

\hskip0,8cm

135

\hskip0,8cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 2 (Tonga/74)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

137

\hskip0,8cm

138

\hskip0,8cm

139

\hskip0,8cm

140

\hskip0,8cm

141

\hskip0,8cm

142

\hskip0,8cm

143

\hskip0,8cm

144

\hskip0,8cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plásmido p3 de dengue 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

146

\hskip0,8cm

147

\hskip0,8cm

148

\hskip0,8cm

149

\hskip0,8cm

150

\hskip0,8cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del dengue 3 (Sleman/78)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

152

\hskip0,8cm

153

\hskip0,8cm

154

\hskip0,8cm

155

\hskip0,8cm

156

\hskip0,8cm

157

\hskip0,8cm

158

\hskip0,8cm

159

\hskip0,8cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región quimérica CME de dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

161

\hskip0.8cm

1610

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 775

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región quimérica CME de dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip0,8cm

162

\hskip0,8cm

163

\hskip0,8cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región quimérica ME de dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 774

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región quimérica ME de dengue 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

166

\hskip0,8cm

167

Claims (7)

1. Virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 o rDEN2\Delta30 atenuado que contiene una deleción de 30 nucleótidos (\Delta30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue tipo 1 ó 2, en el que dicha deleción de 30 nucleótidos corresponde a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10562-10591 para el dengue tipo 1 y a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10541-10570 para el dengue tipo 2.

2. Virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 atenuado o rDEN2\Delta30 atenuado según la reivindicación 1, que comprende además una mutación que confiere un fenotipo, siendo el fenotipo sensibilidad a la temperatura en células Vero o la línea celular hepática humana HuH-7, restricción de célula huésped en células de mosquito o la línea celular hepática humana HuH-7, adaptación a célula huésped para la replicación mejorada en células Vero, o atenuación en ratones o monos.

3. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 atenuado o rDEN2\Delta30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacéutica para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora.

4. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 atenuado o rDEN2\Delta30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una vacuna que va a administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria protectora.

5. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 atenuado o rDEN2\Delta30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención de una enfermedad provocada por el virus del dengue.

6. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1\Delta30 atenuado o rDEN2\Delta30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una vacuna que va a administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para prevenir una enfermedad provocada por el virus del dengue.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el sujeto es un ser humano.