ES2345695T3 - Composiciones de liposomas inmunogenicas. - Google Patents

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Abstract

Una composición de liposomas inmunogénica que comprende: lípidos formadores de vesículas; y una construcción de proteína antigénica que es un producto de fusión hidrosoluble que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrófobo, en la que el dominio hidrófobo está asociado con la membrana de la composición de liposomas inmunogénica.

Description

Composiciones de liposomas inmunogénicas.
Antecedentes de la invención
El uso de vacunas ha proporcionado históricamente un método seguro y eficaz para proteger a poblaciones grandes frente a una amplia variedad de enfermedades infecciosas. La inmunización frente a organismos víricos y frente a otros organismos microbianos es en general segura y eficaz, y ha sido responsable de gran parte de la mejora en la longevidad experimentada por los individuos en los países desarrollados. Sin embargo puede producirse una serie de efectos secundarios dependiendo de la naturaleza de la vacuna y del inmunógeno específico. En el pasado, una inactivación inadecuada del virus intacto ha conducido a una infección no intencionada, en lugar de a la protección tras la vacunación (Tigertt, 1959, Military Med., 124:342). A veces la inmunización con organismos intactos, como la gripe, puede precipitar el desarrollo de enfermedades autoinmunológicas dirigidas contra tejidos normales, como el síndrome de Guillain Barre (Langmuir et al., 1984, J. Epidemiol., 119:841). Además de los propios agentes, la presencia de sustancias dentro de las células o del medio complejo puede producir la inducción de graves reacciones alérgicas frente a proteínas extrañas (Yamana y Uemura, 1988, Epidem. Inf., 100:291). Puesto que los procedimientos de vacunación eficaces a menudo requieren múltiples inmunizaciones, estos acontecimientos adversos pueden reducir la eficacia de la vacuna y pueden reducir la aceptación ciudadana del procedimiento de vacunación. Las técnicas de biología molecular modernas se han ensayado en fechas recientes para intentar proporcionar una mejor seguridad y eficacia a las nuevas preparaciones de vacunas. Las estrategias potenciales actualmente en estudio incluyen las vacunas basadas en técnicas de ADN recombinante (Conry et al., 1994, Cancer Res., 54:1164; Hu et al., 1988, J. Virol., 62:176), la generación de péptidos sintéticos sencillos como antígenos (Nardelli et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 165:459) y la inyección directa de material genético en tejidos para estimular respuestas protectoras (Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745). En particular, el uso de antígenos peptídicos sencillos para inducir respuestas de inmunización específicas ha sido el centro de muchos estudios. Esta estrategia resulta atractiva porque tiene el potencial de proporcionar especificidad inmunológica, un mayor control de los procesos de fabricación, y la eliminación de la mayoría de las fuentes secundarias de materiales o contaminantes asociados con la producción del inmunógeno.
Sin embargo, el uso de fragmentos peptídicos o proteínas purificados para la vacunación depende del transporte del material hacia el sitio de inmunización por un vehículo del antígeno eficaz. En potencia, uno de los vehículos más seguros han sido los complejos de vacuna basados en lípidos/liposomas. Desde hace tiempo los liposomas se han establecido como una técnica comercialmente viable, porque pueden reducir las toxicidades de los fármacos, prolongar la circulación en la corriente sanguínea, y alterar la biodistribución y la farmacocinética de las moléculas del fármaco (Fujii, 1996, Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel Dekker, Nueva York, NY, p. 491). Cuando se administran in vivo, los liposomas circulan en la sangre y son eliminados por el sistema fagocítico de monocitos/macrófagos, en particular en los tejidos del hígado, del bazo, de los nódulos linfáticos y del pulmón (Claasen, 1996, Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel Dekker, Nueva York, NY, p. 649). La capacidad de los liposomas para dirigir el patrón de distribución antigénico sugiere que un inmunógeno liposómico estaría expuesto de forma máxima al sistema inmunológico. Hasta la fecha se han ensayado varios sistemas basados en lípidos, incluyendo péptidos conjugados con lípidos (Nardelli et al., et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 165:459), la reconstitución de subunidades de la proteína completa en presencia de lípidos (Morein y Simons, 1985, Vaccines, 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech, 13:527) y la asociación de proteínas con liposomas preformados (Therien y Shahum, 1989, Immunol. Lett., 22:253; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166). Aunque estas estrategias han demostrado ser inmunológicamente activas, las dificultades técnicas asociadas con la producción a gran escala de las proteínas y de sus vehículos lipídicos, así como las restricciones del precio, hacen que sean menos atractivas como tecnología comercial. Por tanto, es necesario un sistema o una estrategia mejores para preparar antígenos proteicos para aprovechar el potencial ofrecido por los liposomas en el desarrollo de vacunas.
El documento EP-A-0247497 describe liposomas funcionalizados que contienen un compuesto anfifílico de alto peso molecular, como LPS. Un antígeno, como un anticuerpo, puede inmovilizarse sobre los liposomas utilizando el compuesto anfifílico como espaciador.
El documento FR-A-2754543 describe liposomas que comprenden FHA de Bordetella, una proteína heteróloga y lípidos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición de liposomas inmunogénica que comprende lípidos formadores de vesículas y una construcción antigénica que es un producto de fusión hidrosoluble que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrófobo, en el que el dominio hidrófobo es un péptido y, según una realización preferida, consiste en aproximadamente 15 a aproximadamente 500 restos aminoácidos, más preferiblemente menos de aproximadamente 300, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 50 restos, en la que al menos uno o más de los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
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Según una realización de la presente invención, la composición de liposomas inmunogénica comprende además uno o más adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen moléculas lipófilas, como lípido A y otros lipopolisacáridos, Quil A, QS21, MF59, P_{3}CSS, MTP-PE, así como moléculas hidrosolubles, incluyendo citoquinas como IL-2, IL-4, IL-12, los interferones y similares. Otros ejemplos de citoquinas se proporcionan en la tabla 1 que aparece a continuación.
Según otra realización de la invención, la construcción antigénica comprende además una región conectora que une el o los determinantes antigénicos con el dominio hidrófobo. En una realización preferida, la región conectora es un péptido que consiste en 1 a aproximadamente 200 restos aminoácidos. Preferiblemente, los restos aminoácidos son aminoácidos naturales, como Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y/o Val.
La presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un animal hospedante, que comprende administrar una cantidad inmunogénicamente eficaz de una composición de liposomas como se describió anteriormente. Aunque el hospedante puede ser cualquier animal, incluyendo aves de corral, preferiblemente el animal hospedante es un mamífero y más preferiblemente un ser humano. En ciertas realizaciones preferidas, la composición de liposomas inmunogénica comprende además uno o más adyuvantes adecuados.
La presente invención proporciona además un módulo de ADN para su inserción en un vector que comprende secuencias que codifican una proteína de fusión inmunogénica hidrosoluble, en el que la proteína de fusión comprende un dominio de proteína hidrófobo y uno o más determinantes antigénicos.
La presente invención proporciona también un método para preparar una composición de liposomas inmunogénica que comprende expresar un gen que codifica una proteína de fusión hidrosoluble que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrófobo; disolver lípidos y la proteína de fusión en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos adecuados; formar una película lipídica evaporando el disolvente orgánico; hidratar la película lipídica; y dispersar la película lipídica hidratada para formar una composición de liposomas inmunogénica.
La presente invención proporciona además un método para preparar una composición de liposomas inmunogénica que comprende expresar un gen que codifica una proteína de fusión hidrosoluble que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrófobo; disolver la proteína de fusión en un tampón acuoso; hidratar polvos lipídicos o una película lipídica con el tampón que contiene la proteína de fusión; y dispersar los polvos o las películas lipídicos para formar una composición de liposomas inmunogénica.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de liposomas inmunogénica que comprende expresar un gen que codifica una proteína de fusión hidrosoluble que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrófobo; disolver la proteína de fusión en un tampón acuoso; y añadir la proteína de fusión a liposomas preformados para formar una composición de liposomas inmunogénica.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de liposomas inmunogénica que comprende sintetizar de modo químico una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrófobo; y preparar una composición de liposomas inmunogénica mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente.
Tal como se emplea en la presente, "asociado con la membrana" significa que el dominio hidrófobo está al menos parcialmente incrustado en la membrana del liposoma, y preferiblemente no está unido de forma covalente a los lípidos formadores de vesículas. El dominio hidrófobo también puede estar unido a una "cola" de ácidos grasos lipídica que en sí misma está incrustada en la membrana.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la eficacia de una composición de liposomas según la presente invención para proteger frente al HSV2.
La figura 2 muestra una comparación de la eficacia de una composición de liposomas según la presente invención con otras composiciones de vacuna.
La figura 3 muestra la curva de supervivencia de ratones que muestra la capacidad de HSV2g(1-23)-HD liposómica para provocar una respuesta inmunológica protectora.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un sistema de transporte de antígenos diseñado para mejorar la eficacia y la seguridad de una inmunización frente a una diversidad de agentes microbianos y de cánceres. El inmunógeno puede ser codificado por un módulo génico que consiste en un dominio hidrófobo (HD) condensado con una secuencia antigénica específica. Se prepara un plásmido que contiene las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el HD y el epitopo antigénico y se expresa en un hospedante adecuado, como por ejemplo E. coli, P. pastoris, células de insecto, células COS-1 o células CHO (Genetic Engineering News, 18:17 (1998)). Cuando la proteína se ha expresado y purificado se formula en un liposoma. En presencia de una membrana, la proteína se asocia con la bicapa lipídica para formar una estructura estable con la porción hidrófoba asociada con la membrana y el epitopo antigénico orientado hacia el medio acuoso. El plásmido puede modificarse con sitios de restricción en localizaciones clave de modo que diferentes epitopos antigénicos puedan sustituirse con facilidad, proporcionando con ello la capacidad de utilizar diferentes epitopos antigénicos para proporcionar la máxima protección tras la inmunización. Una de las características exclusivas de este módulo es que el componente proteico puede producirse en células hospedantes en grandes cantidades, puede purificarse con facilidad, y después puede incorporarse en los liposomas. Esto proporciona una flexibilidad máxima para determinar el epitopo más apropiado que estimule la protección frente a agente microbianos o frente a cánceres, mientras que se mantiene el objetivo final de la preparación a gran escala y la distribución comercial de la vacuna.
Por tanto, la presente invención proporciona varias ventajas: (1) los epitopos pueden cargarse con facilidad para proporcionar la máxima flexibilidad en el diseño de la vacuna; (2) pueden insertarse múltiples epitopos en la molécula vehículo; (3) pueden incluirse secuencias antigénicas grandes (es decir, proteínas de la envuelta o dominios de receptores) si se desea, y; (4) la proteína vehículo expresada es hidrosoluble y puede purificarse con facilidad utilizando métodos convencionales de preparación de proteínas. La síntesis de la construcción antigénica como un producto de fusión hidrosoluble minimiza los problemas potenciales de la producción a gran escala provocados por la región hidrófoba de la proteína. Por tanto, la construcción de una proteína que posee un dominio hidrófobo para la inserción en la membrana del liposoma y que siga siendo hidrosoluble sería una ventaja importante. En algunas circunstancias, puede utilizarse una cantidad pequeña de agentes solubilizantes, como guanidina, urea, dodecilsulfato de sodio, octil glucósido o desoxicolato, durante el proceso de purificación. La presente invención también proporciona construcciones que comprenden dos o más antígenos. Estas construcciones pueden representarse como:
H_{2}N - Sitio del antígeno I - HD - Sitio del antígeno II - COOH
La invención también contempla el uso de hélices transmembrana individuales de origen natural o sintéticas, o haces de hélices (2-12). Los sitios antigénicos pueden localizarse en el extremo N- o C-terminal o pueden estar situados entre los bucles formados entre las hebras individuales del haz.
El término "antígeno" tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier sustancia (incluyendo una proteína o una proteína-polisacárido, lipopolisacárido, subunidad microbiana, patógeno completo o marcadores de cáncer) que, cuando es extraña para el animal hospedante y tras acceder al tejido de dicho animal, estimula a macrófagos, a células presentadoras de antígenos y a la formación de anticuerpos específicos del antígeno, y reacciona de manera específica in vivo o in vitro con dichos anticuerpos. Además, el antígeno estimula la proliferación y/o la activación de linfocitos T con receptores para el antígeno y antígenos de reacción cruzada (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), células T citotóxicas y células T auxiliares), y puede reaccionar con los linfocitos para iniciar la serie de respuestas denominada inmunidad mediada por células. En las composiciones inmunogénicas de la presente invención se prefiere que el antígeno esté presente en una cantidad de aproximadamente 0,1-20 mg/ml de antígeno-HD. Más preferiblemente, el antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 0,5-5 mg/ml de antígeno-HD.
Un "determinante antigénico" es la porción de un antígeno es la porción de un antígeno o construcción antigénica que determina su especificidad inmunológica. De manera habitual, un determinante antigénico, o hapteno, es un péptido, una proteína o un polisacárido en antígenos naturales. En antígenos artificiales puede ser una sustancia de bajo peso molecular, como un derivado de ácido arsanílico. Un determinante antigénico reaccionará específicamente in vivo o in vitro con un anticuerpo o con linfocitos T inducidos por una forma antigénica del determinante antigénico (por ejemplo, el determinante antigénico está unido a una sustancia inmunogénica).
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Los determinantes antigénicos que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención pueden derivarse de los antígenos presentados a continuación, sólo como ejemplo:
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Patógenos víricos
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3 
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Toxina bacterianas*
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5 
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Patógenos bacterianos
6
7
8 
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Patógenos fúngicos
9 
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Patógenos parasitarios
10
11 
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Cánceres**
12
Otros ejemplos de antígenos y patógenos que pueden utilizarse se encuentran en Milich, 1989 (Adv. Immunol., 45:195), Hoshino y Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 185:179), o Venugopal y Gould, 1994 (Vaccine, 12:966). Según una realización, se emplean la subunidad gp120 del gen env y p27 del gen gag del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En otra realización, el determinante antigénico puede derivarse de un antígeno seleccionado de gD o gB de HSV, gp120 de VIH, gB de CMV, E2 de HCV, HA o NA de INFV, P5 o P6 de la gripe, proteína fimbrial y proteína D.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "dominio hidrófobo" (HD) significa cualquier proteína, péptido, lípido o molécula con una región o estructura hidrófoba que tenga una superficie específica mayor que 5 nm^{2}. Los ejemplos de HD potenciales incluyen cualquier segmento transmembrana (TM) (por ejemplo, glicoforina A; Tomita y Marchesi, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:2964), el dominio hidrófobo del citocromo b_{5} (Taylor y Roseman, 1995, BBA, 1278:35), el dominio T de la toxina de la difteria (Choe et al., 1992, Nature, 357:216), el dominio II de la exotoxina A de Pseudomonas (Allured et al., 1986, PNAS, 83:1320), el haz de 4 hélices del transductor sensorial de la penicilina (Hardt et al., 1997, Mol. Microbiol., 23:935), el haz de 7 hélices de la bacteriorrodopsina (Henderson y Unwin, 1975, Nature, 257:28), el haz de 12 hélices de la lac permeasa (Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:537), y el dominio formador de poro de la colicina (Parker et al., 1989, Nature, 357:93).
El término "vector", tal como se emplea en la presente, se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) derivado de un plásmido, un cósmido, un fágmido o un bacteriófago, o derivado de modo sintético, en el que pueden insertarse o clonarse fragmentos de ácidos nucleicos. El vector puede contener uno o más sitios de restricción exclusivos para este fin, y puede ser capaz de una replicación autónoma en un hospedante u organismo definido, de manera que la secuencia clonada se reproduce. La molécula del vector puede conferir algún fenotipo bien definido al organismo hospedante que pueda seleccionarse o que pueda detectarse con facilidad. Algunos componentes de un vector pueden ser una molécula de ADN que incorpore elementos reguladores para la transcripción, la traducción, la estabilidad y la replicación del ARN y de otras secuencias del ADN.
La expresión "módulo de ADN", tal como se emplea en la presente, se refiere a secuencias genéticas dentro del vector que pueden expresar la proteína de fusión descrita en la presente. El módulo de ácido nucleico está orientado posicional y secuencialmente dentro del vector de modo que el ácido nucleico en el módulo pueda transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, traducirse al producto de proteína de fusión. Preferiblemente, el módulo tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para su inserción fácil en un vector, por ejemplo, tiene sus sitios de endonucleasas de restricción en cada extremo.
Aunque se prefiere que las construcciones antigénicas puedan producirse mediante técnicas recombinantes, debe entenderse que las construcciones pueden sintetizarse mediante mediante cualquier medio conocido en la técnica, como por ejemplo mediante medios químicos. Esto puede ser particularmente útil cuando el dominio hidrófobo comprende un resto aminoácido no natural o mimético. Así, aunque la realización preferida emplea métodos recombinantes para producir la proteína de fusión antigénica, la presente invención también proporciona un método que comprende preparar las construcciones antigénicas mediante medios de síntesis química o mediante una combinación de medios recombinantes y químicos, y preparar una formulación de lípidos inmunogénica como se describió anteriormente.
Según la presente invención, el liposoma desempeña un papel clave en el transporte del antígeno, puesto que el complejo de antígeno-liposoma es presentado directamente al sistema inmunológico tras su retirada de la circulación por las células del sistema inmunológico. Además, la elección de las vías inmunoestimulantes puede alterarse realizando cambios en la composición lipídica del liposoma. Por ejemplo, pueden formularse diferentes moléculas inmunoestimulantes, como el lípido A (Asano y Kleinerman, 1993, J. Immunother., 14:286), P_{3}CSS (Lex et al., 1986, J. Immunol., 137:2676), muramil di- y tripéptido-PE (Fidler et al., 1981, PNAS, 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166) y lípidos catiónicos (Walker et al., 1992, PNAS, 89:7915) en los liposomas para estimular diferentes vías inmunológicas. Pueden emplearse otros adyuvantes, como por ejemplo MF59, Quil A, QS21 o alumbre, junto con el complejo de antígeno-liposoma. Además, pueden añadirse moléculas inmunorreguladoras, como citoquinas, para provocar una respuesta inmunológica.
Los liposomas utilizados en la práctica de la presente invención pueden prepararse a partir de una amplia gama de lípidos formadores de vesículas, incluyendo fosfatidil éteres y ésteres, como fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilcolina (PC); glicéridos, como dioleoilglicerosuccinato; cerebrósidos; gangliósidos; esfingomielina; esteroides, como colesterol; y otros lípidos, así como otros excipientes, como palmitato de vitamina E o vitamina C (véanse también las patentes de EEUU nº 4.235.871; 4.762.720; 4.737.323; 4.789.633, 4.861.597; y 4.873.089). Los ejemplos de lípidos basados en PC incluyen, pero no se limitan a diestearoilfosfatidilcolina (C-18) (DSPC); dipalmitoilfosfatidilcolina (C-16) (DPPC); dimiristoilfosfatidilcolina (C-14) (DMPC); y dioleilfosfatidilcolina (C-18, insaturado) (DOPC). Se prefiere que los lípidos estén en fase fluida a la temperatura corporal (aproximadamente 38-39ºC). Por tanto, los lípidos con una T_{m} por encima de la temperatura corporal, como DSPC y DPPC, son menos preferidos (pero no obstante pueden seguir siendo útiles). Los lípidos que tienen una T_{m} por debajo de la temperatura corporal, como DMPC o DOPC, son más preferidos. Además, se prefiere que la formulación lipídica no contenga colesterol en más de aproximadamente 10%. Se prefieren particularmente las composiciones lipídicas que comprenden colesterol aproximadamente al 0-10%, PG aproximadamente al 0-15% y PC aproximadamente al 0-100%. En ciertas realizaciones preferidas, la composición puede comprender también un adyuvante o adyuvantes aproximadamente al 1-10%; preferiblemente, un adyuvante está presente en una cantidad menor que aproximadamente 5%.
La preparación de liposomas es muy conocida en la técnica anterior. En general, los liposomas se han preparado mediante una serie de técnicas diferentes incluyendo la inyección de etanol (Batzri et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta., 298:1015); infusión de éter (Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta., 443:629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta., 542:137); eliminación de detergentes (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta., 265:241); evaporación de disolventes (Matsumato et al., 1977, J. Colloid Interface Sci., 62:149); evaporación de disolventes orgánicos a partir de emulsiones de cloroformo en agua (REV) (Szoka Jr. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194); extrusiones de MLV o EUV a través de una membrana de policarbonato de nucleoporos (Olson et al., 1979, Biochem. Biophys. Acta., 557:9); congelación y descongelación de mezclas de fosfolípidos (Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186); así como sonicación y homogenización.
Por convención, los liposomas se clasifican por tamaño y se emplea un acrónimo de 3 letras para denominar el tipo de liposoma que se está analizando. Las vesículas multilaminares se denominan en general "MLV". Las vesículas unilaminares pequeñas se denomina "SUV", y las vesículas unilaminares grandes se denominan "LUV". Estas denominaciones a veces son seguidas por la composición química del liposoma. Para un análisis de la nomenclatura y un resumen de los tipos conocidos de liposomas, véase Storm et al., 1998, PSIT, 1:19-31.
La presente invención contempla el uso de composiciones de liposomas con un adyuvante adecuado. Sin embargo, la presente invención también contempla el uso de la construcción antigénica, que no está asociada con un liposoma, junto con un adyuvante adecuado. Por tanto, la composición de vacuna o inmunogénica está formada por dos componentes: un antígeno unido a un dominio hidrófobo; y un sistema adyuvante adecuado. Los ejemplos de sistemas vehículo potenciales farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a liposomas, emulsiones, adyuvante de Freund (completo o incompleto), alumbre, ISCOM y virus con envuelta.
Los métodos para utilizar la presente invención emplearán una cantidad inmunogénicamente eficaz de la composición de liposomas, es decir, una cantidad de la composición que, junto con cualquier excipiente o vehículo añadido, producirá una respuesta inmunogénica detectable en el hospedante. Cuando la composición se vaya a emplear como composición de vacuna, la cantidad eficaz será la cantidad que, junto con cualquier excipiente o vehículo añadido, provocará que el hospedante produzca una respuesta inmunológica específica y suficiente para impartir protección al hospedante frente a la posterior exposición a un microbio (vacunación profiláctica), o para impartir protección al hospedante que ya está enfermo (vacunación terapéutica).
Habiendo descrito la invención de modo general, ésta se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados que se proporcionan sólo como ilustración y no pretenden ser limitantes de la invención a menos que se indique.
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Ejemplos Ejemplo I HSV2
Preparación de HSV2gD(1-23)-TM. El segmento N-terminal de 23 aminoácidos de la proteína de la envuelta gD de HSV2 se acopló con un segmento transmembrana (TM) mediante síntesis química en un sintetizador de péptidos automático. El péptido sintetizado se rompió mediante métodos de ruptura de HF convencionales y se purificó mediante HPLC preparativa utilizando una columna Waters C18 y una fase móvil de acetonitrilo al 100% con TFA al 0,1%. Se
demostró que el péptido era al menos 95% puro mediante una espectrometría de masas y una electroforesis capilar.
Preparación de los liposomas. Los liposomas se prepararon mediante sonicación de sondas según procedimientos descritos previamente (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 36:4959). Brevemente, los lípidos (con o sin proteína) se disolvieron en un disolvente orgánico, como cloroformo/metanol. Se crearon películas lipídicas finas pipeteando partes alícuotas de las disoluciones lipídicas en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el disolvente a 65ºC bajo una corriente de nitrógeno gaseoso. Las películas se colocaron al vacío durante al menos ocho horas para eliminar el disolvente orgánico residual. La preparación de los liposomas se consigue hidratando las películas lipídicas con un tampón e incubando la suspensión a 65ºC durante 5-10 minutos antes de la sonicación de sondas. Los liposomas entonces se filtran a través de un filtro de 0,22 \mum para esterilizar la preparación. Se ajusta el tamaño de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica y se sigue la formación de agregados durante al menos cuatro semanas.
Una formulación liposómica de HSV2gD(1-23)-TM particularmente preferida tiene una proporción molar de DMPC:Col:DNWG (dimiristoilfosfatidilcolina:colesterol:dimiristoilfosfatidilglicerol) 15:2:3, con 2,5% en peso de lípido A.
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Procedimientos de vacunación y ensayo para la inducción de una respuesta inmunológica frente a virus
Antígeno. Ratones hembra BALB/c o C57BL/6 (6-8 semanas de edad) fueron inyectadas por vía subcutánea una vez semanal durante dos, tres o cuatro semanas con al menos la preparación de vacuna o un tampón. Los sitios de las inyecciones se controlaron para observar reacciones adversas, como el desarrollo de granulomas y/o la formación de costras. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna mediante la vía intranasal fueron anestesiados con halotano, y la composición (10-20 \mul) se administró a las fosas nasales para su inspiración utilizando una punta estéril sobre un micropipeteador (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622).
A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación y después de la exposición vírica se midió la respuesta inmunológica de los ratones al antígeno vírico. El ensayo de anticuerpos de neutralización vírica se realizó utilizando placas de grupos de 24 pocillos que contenían 1 x 10^{5} células BHK a las cuales se les había añadido diferentes diluciones de suero de ratón mezclado con virus. Tras una incubación de 48-72 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2}, las monocapas de células se estudiaron para observar citotoxicidad, y se ensayó la valoración del anticuerpo neutralizante. Se midieron los anticuerpos precipitantes contra el virus incubando diferentes diluciones de suero con 5-10 \mug de antígeno vírico o 25-50 \mul de cepa de HSV2 (1 x 10^{5} PFU). Los liposomas que contenían el epitopo antigénico también se utilizaron como dianas para un ensayo de ELISA/anticuerpos como se había descrito previamente (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Los resultados de este último ensayo se utilizarán para medir el nivel de unión y la configuración isotípica de los anticuerpos.
Se ensaya una respuesta de hipersensibilidad de tipo retrasada al antígeno vírico en ratones vacunados utilizando un ensayo de la almohadilla de la pata. Los animales vacunados se anestesiaron con halotano y se les inyectaron 50 \mul de HSV2 inactivado con ultravioleta en una almohadilla de la pata trasera y 50 \mul de células no infectadas lisadas en la almohadilla de la otra pata trasera. Veinticuatro, cuarenta y ocho y setenta y dos horas más tarde se midió el grado de hinchamiento de la almohadilla de la pata utilizando un calibrador Vernier y se comparó con las mediciones de la línea de base. También se mide la actividad de células T de estos animales mediante la producción de citoquinas en respuesta a una incubación de células T esplénicas con el antígeno vírico. Los bazos se retiran de los animales vacunados y se preparan homogeneizados de bazo desmenuzando cuidadosamente los bazos con un émbolo estéril y haciendo pasar las células a través de una malla de tamiz de nailon. Las suspensiones celulares se enjuagan y se cultivan a 1 x 10^{6} células/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Tras la incubación de las células a 37ºC durante 3 ó 4 días con diferentes cantidades de antígeno vírico, los sobrenadantes de los pocillos se recolectan y se ensayan para la presencia de citoquinas. Se emplean kits de ELISA de citoquinas disponibles en el mercado para definir el perfil de citoquinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-\gamma, \beta-actina y TNF-\alpha de PharMingen, Inc. (San Diego, CA)). La detección de proteínas de citoquina en sobrenadantes de cultivos de tejidos mediante un ELISA de "sándwich" se realiza utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citoquinas concretas. Brevemente, las placas de ELISA se revisten durante la noche con un mAb anticitoquina de ratón de rata. Las placas se bloquean con suero de ternera fetal al 3% en PBS durante 2 horas, y después se añaden a cada pocillo partes alícuotas de cada muestra de ensayo. Se añade a cada pocillo mAb antirratón de rata biotinilado específico de citoquina, seguido de avidina peroxidasa. Se logra una reacción de color mediante la adición de sustratos colorimétricos. Las placas se leen en un espectrofotómetro de ELISA y se calculan las concentraciones de citoquinas a partir de una curva patrón obtenida a partir de citoquinas recombinantes control.
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Modelo de encefalitis de ratón por HSV2 para ensayar las preparaciones de vacunas liposómicas
Ratones hembra BALB/c vacunados o no vacunados (control) (10-12 semanas de edad) se expusieron por vía intraperitoneal a una dosis letal (1 x 10^{5} PFU) de HSV2 transferido en el cerebro. Los ratones que se expusieron por vía vaginal a una dosis letal de HSV2 primero se pretratan con estrógeno subcutáneo una semana antes de la exposición y en el día (-1) antes de la exposición. Entonces se anestesian con una inyección intraperitoneal de acepromazina y quetamina. Entonces se administra el HSV2 (10-30 \mul) por vía vaginal utilizando una punta estéril sobre un micropipeteador después de limpiar primero la vagina con un algodón Calgiswab seco (McDermott et al., 1984, J. Virol., 51:747). Los animales se controlan durante 80 días después de la exposición para observar la supervivencia (a diario), la pérdida de peso (un día sí y uno no durante las primeras dos semanas y después una vez semanal), la aparición de pelo, y los síntomas neurológicos (disminución del nivel de actividad, arrastramiento o parálisis de las extremidades).
Proliferación de células T inducida por antígenos. La sensibilización del hospedante al antígeno gD se mide utilizando un ensayo de proliferación de células T inducida por antígenos. Se preparan homogeneizados de bazo desmenuzando cuidadosamente los bazos con un émbolo estéril y haciendo pasar las células a través de una malla de tamiz de nailon. Las células se suspenden en medio RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal (FCS) al 10%, tampón Hepes 10 mM, L-glutamina (2 mM), penicilina (25 IU/ml) y estreptomicina (25 \mug/ml). Las células se cultivan a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml con o sin gD (5-20 \mug/ml) en placas con fondo en U de 96 pocillos durante 4 días en CO_{2} al 5%. Los cultivos se pulsan con 20 \mul de tinte de resazurina durante 3 horas y después se mide la fluorescencia en un Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Análisis de ARNm específico de citoquina. Se estudiaron las células T procedentes de animales inmunizados y no inmunizados para observar los niveles de ARNm específico de citoquina para las principales citoquinas que pueden reflejar una sensibilización asociada a la inmunización, incluyendo IL-2, IFN-\gamma, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Las células T se obtuvieron de los bazos como se describió previamente. El ARN total se aisló utilizando una modificación (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) de un método descrito por Chomczynsky y Sacchi (Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem., 162:156). Se rompen células frescas o congeladas (2 x 10^{6}) en 1 ml de disolución desnaturalizante (tiocianato de guanidinio 4 mM, citrato de sodio 25 mM (pH 7,0), sarcosilo al 0,5%, y 2-mercaptoetanol 0,1 mM). El ARN se precipita incubando con un volumen de isopropanol durante la noche a -20ºC. La concentración de ARN total se ajusta a 260 nM y las muestras se conservan a -80ºC hasta que se analizan.
Se realiza el análisis de las citoquinas utilizando una modificación de un método descrito por Cosenza et al. (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16). Se prepara ADNc monocatenario mediante la transcripción de 2 \mug de ARN total en 20 \mul de mezcla de reacción total utilizando la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se emplean cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia para las citoquinas murinas (tabla 1) para amplificar fragmentos de ADN de un tamaño predeterminado para cada uno de los genes de citoquina de interés.
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TABLA 1 Cebadores oligonucleotídicos utilizados para el análisis semicuantitativo de citoquinas de ratón*
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La mezcla de PCR consistía en 1 \mul de ADNc, 2,5 \mul de 10x tampón de PCR, 1 \mul de cada uno de los cebadores 5' y 3', 2,5 \mul de 10x dNTP (2 mmol/l), y 0,125 \mul de ADN polimerasa termoestable de T. aquaticus (Boehringer Mannheim) en un volumen final de 25 \mul. Se emplean cebadores específicos de \beta-actina para amplificar un fragmento de 548 pb como control interno. La mezcla de PCR se cubre con aceite mineral y la amplificación se realiza después de una incubación de la mezcla durante 7 minutos a 94ºC, 38 ciclos con una desnaturalización de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos de asociación de los cebadores a 60ºC, 60 segundos de extensión a 72ºC, y una incubación de 7 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR se separan en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Las bandas se visualizan bajo luz UV, se fotografían y se cuantifican densitométricamente a partir de la fotografía utilizando el paquete informático Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond, CA).
Mediciones de citoquinas mediante ELISA. Se emplean kits de ELISA para citoquinas disponibles en el mercado para definir el perfil de citoquinas segregado por las células T CD4^{+} esplénicas aisladas a partir de animales inmunizados y no inmunizados. La detección de las proteínas de citoquina en sobrenadantes de cultivos tisulares de células T esplénicas mediante un ELISA de "sándwich" se realiza utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citoquinas concretas. Brevemente, se revisten placas de ELISA durante la noche con un mAb anticitoquina de ratón de rata. Las placas se bloquean con FCS al 3% en PBS durante 2 horas, después se añaden partes alícuotas de cada muestra a cada pocillo. Se añade a cada pocillo el mAb antirratón de rata biotinilado específico de citoquina, seguido de avidina peroxidasa. Se logra una reacción de color mediante la adición de sustancias colorimétricas. Las placas se leen en un espectrofotómetro de ELISA y se calculan las concentraciones de citoquinas a partir de una curva patrón obtenida a partir de citoquinas recombinantes control.
Respuestas de CTL anti-HSV2. Después de la vacunación se evalúa la presencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno en las células T esplénicas. Se obtienen linfocitos esplénicos como se describió previamente. Se agrupan los linfocitos de cada grupo de tratamiento (n = 5) y después se cultivan durante 3 días sin antígeno a 10^{7} células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos. Se incuban células diana EL-4 (H2^{b}) (ATTC) con un péptido que se corresponde con el epitopo de CTL gB de HSV2 localizado entre los restos 495-505 (Hanke et al., 1991, J. Virol., 65:1177) para células restringidas H2^{b} y se incuba durante 4 horas a 37ºC. Las dianas se lavan y se añaden valoraciones de 100 \mul que contienen 1 x 10^{4} células a cada pocillo. Se lavan los linfocitos efectores, se añaden a los pocillos a diversas concentraciones y se cultivan durante 4 horas a 37ºC. Utilizando el kit CitoTox 96 (Promega, Madison, WI) se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la lactato deshidrogenasa (LDH) del sobrenadante medida en un lector de placas de ELISA convencional (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica del antígeno de HSV2 se realiza según criterios convencionales. Los datos se expresan como porcentaje de lisis específica = 100 x [(experimental - efector espontáneo - diana espontáneo)/(diana máximo - diana espontáneo)].
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Resultados
La curva de supervivencia presentada en la figura 1 demuestra la eficacia de los péptidos liposómicos para proteger a los ratones frente a la exposición sistémica con una dosis letal de HSV2, así como establece el número de inoculaciones requeridas para lograr una protección del 100%. La figura 1 muestra el número de dosis de vacuna HSV2gD(1-23)-TM liposómica requerido para proteger a ratones BALB/c frente a una exposición letal de HSV2. Grupos de 7 ratones recibieron 2, 3 ó 4 inmunizaciones antes de la exposición a una dosis letal de HSV2. Con cuatro vacunaciones, ninguno de los animales inmunizados con la vacuna liposómica mostró complicaciones neurológicas asociadas con la infección por HSV2, ni se detectaron otras señales de infección a lo largo del estudio. De manera más importante, todos los ratones sobrevivieron a la exposición letal a HSV2. Con dos o tres inmunizaciones semanales, menos del 100% de los ratones fueron protegidos. Por contraste, los ratones que recibieron cuatro vacunaciones de un placebo (es decir, un tampón) no resultaron protegidos frente a la exposición a HSV2.
La HSV2gD(1-23)-TM liposómica también se ensayó en tres grupos de ratones C57BL/6 y se descubrió que provocaba unos efectos protectores similares comparables con los resultados obtenidos con los ratones BALB/c. La tabla 2 resume estos resultados. Los ratones del grupo 1 fueron vacunados en las semanas 1 y 4 por vía subcutánea; los ratones del grupo 2 fueron vacunados en la semana 1 por vía subcutánea y en la semana 4 por vía intrarectal; y los ratones del grupo 3 (grupo control) no recibieron vacunación. Una semana después de la vacunación final (en la semana 4), los ratones fueron expuestos por vía intraperitoneal a una dosis letal de HSV2 y se controlaron durante 3 semanas para observar la mortalidad y la morbilidad. Al igual que con los ratones BALB/c, los grupos de ratones que recibieron vacunaciones con la HSV2gD(1-23)-TM liposómica presentaban un número significativo de supervivientes cuando se vacunaron mediante una inyección subcutánea o cuando recibieron dosis cebadoras subcutáneas seguidas de refuerzos mucósicos.
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TABLA 2 Resumen de los resultados que comparan la supervivencia de ratones C57BL/6 para diversos tratamientos de vacunación con la HSV2gD(1-23)-TM liposómica
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La figura 2 muestra la comparación entre la HSV2gD(1-23)-TM liposómica con otros métodos de presentación de antígenos. Cada grupo de 7 ratones recibió 4 inmunizaciones antes de la exposición a una dosis letal de HSV2. De nuevo, cuatro inoculaciones con la vacuna HSV2gD(1-23)-TM liposómica produjeron una protección del 100% de los ratones frente a una dosis letal de HSV2. Cuatro inmunizaciones con HSV2gD(1-23)-TM no liposómica, o con liposomas sin HSV2gD(1-23)-TM no fueron capaces de proporcionar una protección significativa frente a una exposición letal a HSV2. Esto demuestra claramente que los liposomas y los componentes proteícos modificados deben asociarse entre sí para lograr una respuesta inmunológica eficaz. De particular importancia es el descubrimiento de que la vacuna HSV2gD(1-23)-TM liposómica proporciona una protección mucho mejor que las inmunizaciones con virus inactivados por calor, porque se cree que las vacunas basadas en virus en general proporcionan un buen estímulo para una respuesta inmunológica (Desrosiers, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovir., 8:1457).
Al final del estudio, los ratones se sacrificaron y el suero se recogió para caracterizar la naturaleza de la respuesta inmunológica en ese momento. Se descubrió que el suero de los ratones vacunados contenía grandes valoraciones de anticuerpos (1:100) que reconocen específicamente al péptido utilizado para estimular la respuesta inmunológica y, además, provocan la precipitación de virus activos, lo cual sugiere que los anticuerpos reconocen un epitopo sobre la superficie del virus. Los anticuerpos también precipitan los liposomas de HSV2gD(1-23)-TM y no los liposomas sin el péptido, lo cual sugiere que reconocen el epitopo gD de HSV2 de manera específica.
La tabla 3 a continuación proporciona un resumen de los ensayos inmunológicos que demuestran que la HSV2gD(1-23)-TM liposómica administrada por vía subcutánea una vez semanal durante cuatro semanas genera una respuesta inmunológica más fuerte cuando se compara con adyuvantes convencionales. La vacunación con el antígeno mezclado con adyuvante de Freund incompleto o alumbre no fue capaz de proporcionar protección al ratón frente a la exposición vírica. Los datos obtenidos a partir del ensayo de anticuerpos neutralizantes y la respuesta de hipersensibilidad retrasada establecen un paralelo entre los datos de supervivencia y la mayor valoración de anticuerpos (respuesta de células B) y la mayor cantidad de hinchamiento de la almohadilla de la pata (respuesta de células T) observadas para el grupo de la HSV2gD(1-23)-TM liposómica. Otra ventaja importante asociada con el tratamiento con la HSV2gD(1-23)-TM liposómica es que, a diferencia de los resultados en ratones que recibieron adyuvante de Freund incompleto con el antígeno, no se produjo irritación ni inflamación en el sitio de la inyección en ninguno de los ratones (17/17 mostraron un enrojecimiento en el sitio de la inyección con adyuvante de Freund incompleto frente a 0/17 con la HSV2gD(1-23)-TM liposómica). Cuando se empleó alumbre, 17/17 de los ratones desarrollaron granulomas palpables en el sitio de la inyección. Por contraste, la HSV2gD(1-23)-TM liposómica no provocó la formación de granulomas en ninguno de los ratones. En resumen, estos resultados sugieren que las respuestas de células B y/o T (juzgadas mediante las valoraciones de anticuerpos neutralizantes y el grado de hinchamiento de la almohadilla de la pata) contribuyen a la respuesta inmunológica protectora provocada por la HSV2gD(1-23)-TM liposómica en ratones contra una dosis letal de HSV2.
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TABLA 3 Resumen de los resultados que comparan las respuestas inmunológicas de la HSV2gD(1-23)-TM liposómica, el adyuvante de Freund incompleto mezclado con HSV2gD(1-23)-TM, el alumbre mezclado con HSV2gD(1-23)-TM, y un grupo control que sólo recibió PBS
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Ejemplo II HSV2
Preparación de HSV2gD(1-23)-HD. Se generó una construcción génica que codificaba HSV2gD(1-23)-HD utilizando oligonucleótidos solapantes que codificaban el epitopo gD unido a un dominio hidrófobo de 45 aminoácidos (HD). La construcción se construyó mediante el sucesivo alargamiento y amplificación de la región codificadora del gen. El gen entonces se acopló en un vector de expresión pTrcHis y se verificó mediante análisis de la secuencia. Se inició un estudio de expresión a pequeña escala mediante una inducción con IPTG 1 mM y se confirmó mediante un análisis de la transferencia Western utilizando los anticuerpos de ratón generados en los estudios de vacunación con la HSV2gD(1-23)-TM liposómica. La proteína también se analizó mediante SDS-PAGE y se encontró una banda que se correspondía con el peso molecular esperado (aproximadamente 6 kD) según se juzgó mediante tinción de Coomassie. Habiendo demostrado que la proteína esperada se expresaba a pequeña escala, se completó una fermentación discontinua de 10 litros de E. coli que contenía la construcción pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD, que produjo aproximadamente 60 gramos de pasta celular. Tras la inducción, la expresión de HSV2gD(1-23)-HD fue verificada mediante una transferencia Western del transcurso del tiempo de la fermentación. Se lisaron bacterias de aproximadamente 30 gramos de pasta celular mediante una prensa French en un tampón que contenía desoxicolato al 1% e imidazol 5 mM. Después de una centrifugación para sedimentar los residuos celulares, se descubrió que HSV2gD(1-23)-HD se encontraba predominantemente en el sobrenadante soluble acuoso.
Se logró una purificación haciendo pasar el sobrenadante que contenía la proteína HSV2gD(1-23)-HD soluble a través de una columna de Sepharose quelante cargada con níquel. La columna se lavó sucesivamente con disoluciones que contenían imidazol 5 mM, imidazol 200 mM, y después imidazol 5 mM con desoxicolato al 1% para eliminar todas las proteínas residuales. La proteína HSV2gD(1-23)-HD eluyó por último con una disolución de imidazol 200 mM, desoxicolato al 1%. Las fracciones pico se identificaron mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie y mediante transferencia Western. Todas las fracciones pico que contenían HSV2gD(1-23)-HD se reunieron y se concentraron utilizando un concentrador Millipore Ultraprep. Se demostró que el concentrado final contenía HSV2gD(1-23)-HD pura, según se juzgó por la presencia de una única banda en un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie. A partir de este primer ensayo se obtuvieron aproximadamente 2-3 mg de HSV2gD(1-23)-HD para la formulación de liposomas y los estudios de vacunación.
La preparación liposómica y los procedimientos de vacunación, los ensayos de inducción de una respuesta inmunológica, el modelo de encefalitis de ratón por HSV2, la proliferación de células T inducida por antígenos, el análisis de ARNm específico de citoquina, las mediciones de citoquinas con ELISA, y las respuestas de CTL anti-HSV2 se realizaron fundamentalmente como se describe en el ejemplo I.
Resultados. La curva de supervivencia que aparece en la figura 3 muestra la capacidad de la HSV2gD(1-23)-HD para provocar una respuesta inmunológica protectora. Se observó que el porcentaje de supervivencia con esta formulación concreta era del 40%. En comparación, los animales control tratados con tampón no mostraron supervivientes, mientras que el grupo control de HSV2gD(1-23)-TM presentó 100% de supervivencia.
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Ejemplo III VIH
Preparación de VIH (gp120-HD) y VIH (\Delta gp120-HD) en células COS-1. Para el estudio de epitopos conformacionales se obtiene la secuencia de gp120 a partir del plásmido pHXB2-env que contenía el gen gp160 (NHI AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD) amplificando el ADN plasmídico mediante PCR y subclonando el producto de 1536 pb para la secuenciación mediante el método de didesoxinucleótidos. Utilizando el cebador 5' (sentido) que se corresponde con los primeros 21 pb del gen gp120 de VIH ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT y un cebador 3' (antisentido) que se corresponde con los nuclótidos 1515 a 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC, eliminando la proteína gp41 de VIH, se clona el segmento gp120 y se amplifica mediante PCR. Además, cada cebador está flanqueado por sitios de enzimas de restricción convenientes que se corresponden con los sitios de clonación múltiple del vector de expresión pcDNA4-His. El producto de la PCR se acopla en el pcDNA4-His que contiene el dominio HD como un plásmido de módulo génico (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Se fabrican mutantes de deleción mediante amplificación con PCR utilizando dos parejas de cebadores 5' y 3' que excluyen los nucleótidos que codifican restos en la proteína gp120; éstos incluyen \Delta136-151gp120, \Delta128-194gp120 y \Delta123-203gp120. Los cebadores contenían secuencias de enzimas de restricción convenientes que permiten el acoplamiento de estos dos productos génicos. Por tanto, cada mutación está reemplazada por dos aminoácidos codificados por el sitio de restricción específico de interés. Los genes finales se verificaron mediante secuenciación del ADN utilizando el protocolo y los reactivos del kit AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados se ensayaron en el aparato de secuenciación del kit ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se analizaron con el kit del programa informático AM v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Los plásmidos se transfectaron en células COS-1 (ATCC, Rockville, MD) utilizando el reactivo DEAE-dextrano. Los transfectantes estables se seleccionaron utilizando zeocina (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y se clonaron mediante dilución limitante. Las proteínas gp120-HD se purificaron mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. Los clones que producen niveles altos de proteína se evalúan mediante un análisis de la transferencia Western o un análisis FACS. El conector de histidina de VIH(gp120)-HD, VIH\Delta136-151gp120, VIH\Delta128-194gp120 y VIH\Delta123-203gp120 se elimina mediante ruptura con enteroquinasa después de completar la purificación. Si es necesario se realiza una cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba para purificar aún más las proteínas VIHgp120-HD y VIH\Deltagp120-HD.
Preparación de VIH-HD. La secuencia de nucleótidos que combina tres epitopos (CTL, célula T auxiliar, y célula B) se selecciona de secuencias descubiertas en diferentes proteínas de VIH (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGP-GRAFYTTK (SEQ ID NO:19)) y se derivan de esta secuencia de proteína utilizando las preferencias de codones de E. coli (Looman et al., 1987, EMBO J., 6:2489). El gen sintético que codifica la secuencia de VIH se ensambla mediante síntesis, hibridación, PCR, y acoplamiento de oligonucleótidos solapantes. El gen de longitud completa ensamblado que codifica los fragmentos de VIH se amplifica mediante PCR y después se acopla en un plásmido de expresión. Los genes finales se verifican mediante la secuenciación del ADN.
Los plásmidos pTrc-His que contienen VIH-HD se transforman en E. coli. Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 \mug/ml) a 37ºC hasta la mitad de la fase logarítmica. En este momento se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se estudian los momentos de tiempo cada hora para determinar la expresión posinducción óptima de las proteínas de VIH-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se recogen mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se lisan y se centrifugan. El lisado se ensaya para determinar la presencia de proteínas. Las proteínas de VIH-HD se purifican mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. Si es necesario se realiza una cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba para purificar aún más las VIH-HD.
Preparación de los liposomas. Los liposomas se preparan mediante sonicación de sondas según procedimientos descritos previamente (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 36:4959). Brevemente, los lípidos (con o sin proteína) se disolvieron en un disolvente orgánico, como cloroformo/metanol. Se crearon películas lipídicas finas pipeteando partes alícuotas de las disoluciones lipídicas en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el disolvente a 65ºC bajo una corriente de nitrógeno gaseoso. Las películas se colocaron al vacío durante al menos ocho horas para eliminar el disolvente orgánico residual. La preparación de los liposomas se consigue hidratando las películas lipídicas con un tampón e incubando la suspensión a 65ºC durante 5-10 minutos antes de la sonicación de sondas. Los liposomas entonces se filtran a través de un filtro de 0,22 \mum para esterilizar la preparación. Se ajusta el tamaño de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica y se sigue la formación de agregados durante al menos cuatro semanas.
Procedimiento de vacunación y ensayo para la inducción de una respuesta inmunológica frente a un antígeno vírico. Ratones hembra BALB/c (6-8 semanas de edad) fueron vacunadas por vía subcutánea en las semanas 1, 4 y 8 con la preparación de vacuna o un tampón. Los sitios de las inyecciones se controlaron para observar reacciones adversas, como el desarrollo de granulomas y/o la formación de costras. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna mediante la vía intranasal fueron anestesiados con halotano, y el artículo de ensayo (10-20 \mul) se administró a las fosas nasales para su inspiración utilizando una punta estéril sobre un micropipeteador (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622).
Medición de las respuestas de anticuerpos mediante ELISA. A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación (por ejemplo, 1 x por semana) se midió la respuesta inmunológica de los ratones al antígeno vírico. Los liposomas que contenían el epitopo antigénico también se utilizaron como dianas para un ensayo de ELISA/anticuerpos como se había descrito previamente (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Los resultados de este último ensayo se utilizaron para medir el nivel de unión y la configuración isotípica de los anticuerpos.
Ensayo de la hipersensibilidad de tipo retrasada (DTH). Se ensaya la respuesta DTH al antígeno vírico en ratones vacunados utilizando un ensayo de la almohadilla de la pata. Los animales vacunados se anestesiaron con halotano y fueron inyectados con 50 \mul del antígeno liposómico o del antígeno libre en la almohadilla de una pata trasera y con 50 \mul de tampón en la almohadilla de la otra pata trasera. Veinticuatro, cuarenta y ocho y setenta y dos horas más tarde se midió el grado de hinchamiento de la almohadilla de la pata utilizando un calibrador Vernier y se comparó con las mediciones de la línea de base.
Análisis de ARNm específico de citoquina. Se estudiaron las células T procedentes de animales inmunizados y no inmunizados para observar los niveles de ARNm específico de citoquina para las principales citoquinas que pueden reflejar una sensibilización asociada a la inmunización, incluyendo IL-2, IFN-\gamma, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Se aislaron células T esplénicas como se describió previamente a la 1 y 4 semana después de la inmunización. El ARN total se aisló utilizando una modificación (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) de un método descrito por Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem., 162:156. Se rompen células frescas o congeladas (2 x 10^{6}) en 1 ml de disolución desnaturalizante (tiocianato de guanidinio 4 mM, citrato de sodio 25 mM (pH 7,0), sarcosilo al 0,5%, y 2-mercaptoetanol 0,1 mM). El ARN se precipita incubando con un volumen de isopropanol durante la noche a -20ºC. La concentración de ARN total se ajusta a 260 nM y las muestras se conservan a -80ºC hasta que se analizan.
Se realiza el análisis de las citoquinas utilizando una modificación (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) de un método descrito por por Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem., 162:156. Se prepara ADNc monocatenario mediante la transcripción de 2 \mug de ARN total en 20 \mul de mezcla de reacción total utilizando la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se emplean cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia para las citoquinas murinas (tabla 1) para amplificar fragmentos de ADN de un tamaño predeterminado para cada uno de los genes de citoquina de interés. La mezcla de PCR consistía en 1 \mul de ADNc, 2,5 \mul de 10x tampón de PCR, 1 \mul de cada uno de los cebadores 5' y 3', 2,5 \mul de 10x dNTP (2 mmol/l), y 0,125 \mul de ADN polimerasa termoestable de T. aquaticus (Boehringer Mannheim) en un volumen final de 25 \mul. Se emplean cebadores específicos de \beta-actina para amplificar un fragmento de 548 pb como control interno. La mezcla de PCR se cubre con aceite mineral y la amplificación se realiza después de una incubación de la mezcla durante 7 minutos a 94ºC, 38 ciclos con una desnaturalización de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos de asociación de los cebadores a 60ºC, 60 segundos de extensión a 72ºC, y una incubación de 7 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR se separan en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Las bandas se visualizan bajo luz UV, se fotografían y se cuantifican densitométricamente a partir de la fotografía utilizando el paquete informático Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond, CA).
Medición de las citoquinas mediante ELISA en células T esplénicas. La actividad de células T de estos animales también se mide mediante la producción de citoquinas en respuesta a la incubación de células T esplénicas con antígeno vírico. Los bazos se retiran de los animales vacunados y se preparan homogeneizados de bazo desmenuzando cuidadosamente los bazos con un émbolo estéril y haciendo pasar las células a través de una malla de tamiz de nailon. Las suspensiones celulares se enjuagan y se cultivan a 1 x 10^{5} células/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Tras la incubación de las células a 37ºC durante 3 ó 4 días con diferentes cantidades de antígeno vírico, los sobrenadantes de los pocillos se recolectan y se ensayan para la presencia de citoquinas. Se emplean kits de ELISA de citoquinas disponibles en el mercado para definir el perfil de citoquinas. La detección de proteínas de citoquina en sobrenadantes de cultivos de tejidos mediante un ELISA de "sándwich" se realiza utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citoquinas concretas. Brevemente, las placas de ELISA se revisten durante la noche con un mAb anticitoquina de ratón de rata. Las placas se bloquean con suero de ternera fetal al 3% en PBS durante 2 horas, y después se añaden a cada pocillo partes alícuotas de cada muestra de ensayo. Se añade a cada pocillo mAb antirratón de rata biotinilado específico de citoquina, seguido de avidina peroxidasa. Se logra una reacción de color mediante la adición de sustratos colorimétricos. Las placas se leen en un espectrofotómetro de ELISA y se calculan las concentraciones de citoquinas a partir de una curva patrón obtenida a partir de citoquinas recombinantes control. Todos los kits de ELISA de citoquinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-\gamma, \beta-actina y TNF-\alpha) se adquirieron en PharMingen, Inc. (San Diego, CA).
Proliferación de células T inducida por antígenos. La sensibilización del hospedante a los antígenos de HSV se mide utilizando un ensayo de proliferación de células T inducida por antígenos. Se aíslan homogeneizados de bazo como se describió previamente. Las células se suspenden en medio RPMI 1640 que contenía FCS al 10%, tampón Hepes 10 mM, L-glutamina (2 mM), penicilina (25 IU/ml), estreptomicina (25 \mug/ml), y gentamicina (80 \mug/ml). Las células se cultivan a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml con o sin el péptido VIH-HD (5 \mug/ml) en placas con fondo en U de 96 pocillos durante 3-4 días en CO_{2} al 5%. Los cultivos se pulsan con 20 \mul de tinte de resazurina durante 3 horas y después se mide la fluorescencia en un Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Respuestas de CTL anti-VIH. Después de la vacunación se evalúa la presencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno en las células T esplénicas. Se obtienen linfocitos esplénicos como se describió previamente. Se agrupan los linfocitos de cada grupo de tratamiento (n = 5) y después se cultivan durante 3 días sin antígeno a 10^{7} células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos. Se incuban células diana de linfoma L5198Y (H2^{d}) (ATTC) con un péptido que se corresponde con el epitopo de CTL de VIH para células restringidas H2^{d} y se incuba durante 4 horas a 37ºC. Las dianas se lavan y se añaden valoraciones de 100 \mul que contienen 1 x 10^{4} células a cada pocillo. Se lavan los linfocitos efectores, se añaden a los pocillos a diversas concentraciones y se cultivan durante 4 horas a 37ºC. Utilizando el kit CitoTox 96 (Promega, Madison, WI) se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la lactato deshidrogenasa (LDH) del sobrenadante medida en un lector de placas de ELISA convencional (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica del antígeno de HSV2 se realiza según criterios convencionales. Los datos se expresan como porcentaje de
lisis específica = 100 x [(experimental - efector espontáneo - diana espontáneo)/(diana máximo - diana espontáneo)].
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Ejemplo IV Virus de la gripe (INFV)
Preparación de INFV-HD. La secuencia de nucleótidos de los epitopos elegidos se deriva de la secuencia de la proteína utilizando las preferencias de codones de E. coli (Looman et al., 1987, EMBO J., 6:2489). La secuencia o secuencias antigénicas insertadas en el módulo génico se corresponden con los epitopos de NP (147-161, TYQR
TRALVRTGMDP; 55-69 (SEQ ID NO:20), RLIQNSLTIERMVLS (SEQ ID NO:21)) y HA (91-108, SKAFSNCYPY
DVPDYASL (SEQ ID NO:22)). Puede construirse una vacuna de epitopos de combinación que consiste en un epitopo T-B como se indica en Brumeanu et al., 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (SEQ ID NO:23)) (Brumeanu et al., 1997, J. Virol., 71:5473). Cuando se obtiene la secuencia o secuencias apropiadas, un gen sintético que codifica la INFV-HD se ensambla mediante síntesis, hibridación, PCR, y acoplamiento de oligonucleótidos solapantes. El gen de longitud completa ensamblado que codifica los fragmentos de INFV se amplifica mediante
PCR y se acopla en un plásmido de expresión. Los genes finales se verifican mediante la secuenciación del ADN.
Los plásmidos que contienen INFV-HD se transforman en E. coli. Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 \mug/ml) a 37ºC hasta la mitad de la fase logarítmica. En este momento se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se estudian los momentos de tiempo cada hora para determinar la expresión posinducción óptima de las proteínas de INFV-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se recogen mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se lisan y se centrifugan. El lisado se ensaya para determinar la presencia de proteínas. Las proteínas de INFV-HD se purifican mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. Si es necesario se realiza una cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba para purificar aún más las INFV-HD.
Modelo de infección vírica. La cepa de INFV utilizada para demostrar la eficacia de la vacuna es una reordenación del virus A/PR/8/34 denominada PR8. El virus se cultiva en huevos de gallina embrionados de 10 a 12 días de edad mediante inoculación alantoica, seguido de una incubación a 37ºC en un agitador durante 40-48 horas y 20-24 horas a 4ºC, y después se recupera del fluido alantoico. Se realiza un ensayo de hemaglutinación vírica con eritrocitos de gallina al 0,5% en placas de microvaloración de 96 pocillos para determinar las unidades hemaglutinantes (HAU)/ml de la cepa vírica.
En el modelo de ratones BALB/c se demostró que 1200 HAU de la cepa PR8, administrados por vía intranasal con una punta estéril de un micropipeteador a ratones anestesiados con metofano (20 \mul), producían síntomas pronunciados de infección para el día 4, incluyendo una menor movilidad, falta de acicalamiento, una pérdida del 20% de peso corporal y la muerte en dos semanas. Utilizando un ensayo de citolisis MDCK realizado en placas de microvaloración de 96 pocillos con un criterio de valoración del 50%, se descubrió que había una alta valoración de virus infecciosos en homogeneizados de pulmón preparados 4 días después de la infección.
Procedimientos de vacunación y ensayo para la inducción de una respuesta inmunológica al antígeno vírico. Ratones hembra BALB/c (6-8 semanas de edad) fueron inyectadas por vía subcutánea en las semanas 1, 4 y 8 con la preparación de vacuna o un tampón. Los sitios de las inyecciones se controlaron para observar reacciones adversas, como el desarrollo de granulomas. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna mediante la vía intranasal fueron anestesiados con metofano, y el artículo de ensayo (10-20 \mul) se administró a las fosas nasales para su inspiración utilizando una punta estéril sobre un micropipeteador (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622).
Detección mediante RT-PCR de ARN de INFV en tejido pulmonar. La detección mediante RT-PCR de ARN de INFV se realizó en los pulmones de animales experimentales 4 días después de la exposición vírica para establecer la eficacia de la inmunización para prevenir la infección vírica. Muestras de pulmón tomadas de los ratones se someten a una congelación inmediata, se trituran y el polvo congelado se conserva a -70ºC hasta que se procesa para su evaluación. El aislamiento del ARN total y el análisis de RT-PCR para el ARN vírico se realizan utilizando una modificación de técnicas descritas previamente (Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem., 162:156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol., 151:5228; Lakeman y Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857). Los cebadores que se emplean son específicos para el gen de matriz (segmento 7) del virus de la gripe A (Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol., 34:2604). El ensayo de RT-PCR se realiza utilizando los reactivos y el protocolo del sistema de RT-PCR Titan One Tube (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Brevemente, se incuba de 1 pg a 1 \mug de molde de ARN total en presencia de dNTP 0,2 mM, cebador antisentido FAM1 0,4 \muM (5'-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3' (SEQ ID NO:24)), cebador sentido FAM2 0,4 \muM (5'-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3' (SEQ ID NO:25)), DTT 5 mM, inhibidor de ARNasa 5 U, MgCl_{2} 1,5 mM, y enzimas de AMV/alta fidelidad expandida bajo las siguientes condiciones: un ciclo a 60ºC durante 30 minutos; 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 68ºC durante 45 segundos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 68ºC durante 45 segundos, aumentando la extensión en 5 segundos cada ciclo; seguido de un ciclo a 68ºC durante 7 minutos. Un resultado positivo se basa en una banda visible de 212 pb en un gel de agarosa-NuSieve al 1,5% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) teñido con bromuro de etidio y fotografiado con un transiluminador de UV (BioRad Gel Doc 1000). Este método ha demostrado ser sensible y muy específico para medir la presencia de ADN vírico (Lakeman y Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857).
Secuencia del dominio HA1. La secuencia del dominio HA1 (segmento 4) puede aclararse amplificando el dominio HA1 a partir de un ARN vírico en una reacción de RT-PCR. Después el producto de 1100 pb se subclona para la secuenciación y se secuencia utilizando el método de terminación de didesoxinucleótidos. El ensayo de RT-PCR se realiza utilizando el sistema de RT-PCR Titan One Tube como se indicó anteriormente con las siguientes diferencias: los cebadores de la amplificación son el cebador de ADNc (5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAA-3' (SEQ ID NO:26)) y el cebador de PCR (5'-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3' (SEQ ID NO:27)) (Pyhala et al., 1995, J. Gen. Virol., 76:205), y las condiciones son 1 ciclo a 60ºC durante 30 minutos; a 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos, a 68ºC durante 45 segundos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos, y a 68ºC durante 45 segundos, aumentando la extensión en 5 segundos cada ciclo; seguido de un ciclo a 68ºC durante 7 minutos. El producto de 1100 pb se subclona en el vector de clonación TA PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para su posterior secuenciación. La secuenciación se realiza utilizando el protocolo y los reactivos del kit AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados se ensayan en un aparato de secuenciación del kit ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se analizan con el kit del programa informático AM v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Medición de las respuestas de anticuerpos mediante ELISA. A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación se mide la respuesta inmunológica de los ratones al antígeno vírico. Los liposomas que contienen el epitopo antigénico también se emplean como dianas para el ensayo de ELISA/anticuerpos como se describió anteriormente (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Los resultados de este último ensayo se emplean para medir el nivel de unión y la configuración isotípica de los anticuerpos.
Proliferación de células T inducida por antígenos. La sensibilización del hospedante a los antígenos de INFV se mide utilizando la proliferación de células T inducida por antígenos. Se retiran los bazos de ratones vacunados y se preparan homogeneizados desmenuzando cuidadosamente los bazos con un émbolo estéril y haciendo pasar las células a través de una malla de tamiz de nailon. Las células se suspenden en medio RPMI 1640 que contenía FCS al 10%, tampón Hepes 10 mM, L-glutamina (2 mM), penicilina (25 IU/ml), estreptomicina (25 \mug/ml) y gentamicina (80 \mug/ml). Las células se cultivan a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml con o sin los péptidos sintetizados de modo químico que se corresponden con los antígenos (5 \mug/ml) en placas con fondo en U de 96 pocillos durante 3-4 días en CO_{2} al 5%. Los cultivos se pulsan con 20 \mul de tinte de resazurina durante 3 horas y después se mide la fluorescencia en un Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Respuestas de CTL anti-INFV. Después de la vacunación se evalúa la presencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno en las células T esplénicas. Se obtienen linfocitos esplénicos como se describió previamente. Se agrupan los linfocitos de cada grupo de tratamiento (n = 5) y después se cultivan durante 3 días sin antígeno a 10^{7} células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos. Se incuban células diana de mastocitoma P815 o de linfoma L5178 (H2^{d}) (ATTC) con un péptido que se corresponde con el epitopo de CTL NP de INFV (aminoácidos 147-158) para células restringidas H2^{d} y se incuba durante 4 horas a 37ºC. Las dianas se lavan y se añaden valoraciones de 100 \mul que contienen 1 x 10^{4} células a cada pocillo. Se lavan los linfocitos efectores, se añaden a los pocillos a diversas concentraciones y se cultivan durante 4 horas a 37ºC. Utilizando el kit CitoTox 96 (Promega, Madison, WI) se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la lactato deshidrogenasa (LDH) del sobrenadante medida en un lector de placas de ELISA convencional (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica del antígeno de HSV2 se realiza según criterios convencionales. Los datos se expresan como porcentaje de lisis específica = 100 x [(experimental - efector espontáneo - diana espontáneo)/(diana máximo - diana espontáneo)].
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Ejemplo V H. influenzae (NTHi) y H. influenzae de tipo b (Hib) no tipificables
Clonación de las proteínas de NTHi. La secuencia del gen de longitud completa que codifica P6 se obtiene a partir de una cepa de NTHi mediante una amplificación por RT-PCR del ARNm de P6 (Deich et al., 1988, J. Bacteriol., 170:489; Nelson et al., 1988, Inf. Immun., 56:128; Looman et al., 1987, EMBO J., 6:2489). La amplificación se realiza utilizando los reactivos y el protocolo del sistema de RT-PCR Titan One Tube (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Brevemente, las bacterias se incuban en presencia de dNTP 0,2 mM, cebador antisentido H-InvfP6AS 0,4 \muM (5'-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3' (SEQ ID NO:28)), cebador sentido H-InvfP6S 0,4 \muM (5'-AATTTC
CAGCTTGGTCTCCA-3' (SEQ ID NO:29)), DTT 5 mM, inhibidor de ARNasa 5 U, MgCl_{2} 1,5 mM, y enzimas AMV/alta fidelidad expandida bajo las siguientes condiciones: un ciclo a 60ºC durante 30 minutos; 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 68ºC durante 45 segundos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 68ºC durante 45 segundos, aumentando la extensión en 5 segundos cada ciclo; seguido de un ciclo a 68ºC durante 7 minutos. Un resultado positivo se basa en una banda visible de 867 pb en un gel de agarosa-NuSieve al 1,0% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) teñido con bromuro de etidio y fotografiado utilizando un sistema de imágenes digitales (BioRad, Gel Doc 2000). El producto de la PCR se subclona para su secuenciación en el vector TA 2.1 utilizando los reactivos y el protocolo del kit TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realiza la preparación del plásmido a pequeña escala utilizando el método de lisis alcalina convencional (Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, p. 125). El inserto del producto de la PCR se secuencia mediante el método de terminación de didesoxi convencional utilizando el protocolo y los reactivos del kit AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados se ensayaron en el aparato de secuenciación del kit ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se analizaron con el programa informático analizador de secuencias AlfWin v.2.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Preparación de NTHi(P6)-HD. Cuando se obtiene el gen que codifica P6 se ensambla un gen sintético que codifica NTHi-(P6)-HD mediante síntesis, hibridación, PCR, y acoplamiento de oligonucleótidos solapantes. El segmento HD se añade al extremo N- o C-terminal de la proteína a través de un conector compuesto de glicina y serina. Esto permite ensayar el efecto que tiene la localización relativa del HD con respecto al antígeno sobre el procesamiento por el sistema inmunológico. El gen de longitud completa ensamblado que codifica el fragmento NTHi-(P6)-HD se amplifica mediante PCR y se acopla en un plásmido de expresión. El gen final se verifica mediante la secuenciación del ADN.
El plásmido que contiene NTHi-(P6)-HD se transforma en E. coli . Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 \mug/ml) a 37ºC hasta la mitad de la fase logarítmica. En este momento se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se estudian los momentos de tiempo cada hora para determinar la expresión posinducción óptima de la proteína NTHi-(P6)-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se recogen mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se lisan y se centrifugan. El lisado y el sedimento celular se ensayan para determinar la presencia de proteínas. Se emplea una disolución al 1-2% de desoxicolato de sodio para extraer la proteína NTHi-(P6)-HD del sedimento celular lisado. Entonces se purifica la NTHi-(P6)-HD mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. Si es necesario se realiza una cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba para purificar aún más la NTHi-(P6)-HD.
Preparación de los liposomas. Hay tres estrategias generales para preparar liposomas de NTHi-(P6)-HD estables. En la primera, los liposomas se formulan de forma que la proteína y los lípidos se disuelven juntos en el disolvente orgánico (cloroformo/metanol) y después se secan para formar una película fina. Tras la resuspensión en un tampón acuoso, los lípidos y la proteína se ensamblan en estructuras de bicapa grandes. La suspensión entonces se sonica para fabricar vesículas unilaminares pequeñas (SUV). Para los diseños de proteínas más pequeños este método funciona bien. Sin embargo, para estos experimentos puede no ser deseable exponer la proteína a condiciones de disolvente duras por el potencial de desnaturalizar la proteína. Por tanto, para evitar cambios conformacionales no deseados puede utilizarse un segundo método que implica solubilizar la NTHi-(P6)-HD en el tampón de resuspensión antes de la hidración de la película lipídica. Tras la hidratación con los lípidos, la proteína se asocia de forma espontánea con la membrana recién formada y se incorpora en la bicapa lipídica de las SUV durante la sonicación. El tercer método implica preparar los liposomas sin la proteína NTHi-(P6)-HD y después añadirla a las SUV que ya están formadas, permitiendo que la HD se integre en la bicapa lipídica. Los liposomas se preparan mediante sonicación de sondas según procedimientos previamente descritos (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 36:4959). Brevemente, los lípidos (con o sin proteína) se disuelven en un disolvente orgánico, como cloroformo/metanol. Se crean películas lipídicas finas pipeteando partes alícuotas de las disoluciones lipídicas en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el disolvente a 65ºC bajo una corriente de nitrógeno gaseoso. Las películas se colocan al vacío durante al menos ocho horas para eliminar el disolvente orgánico residual. Como alternativa, pueden prepararse polvos de lípidos con la composición deseada mediante una técnica como el secado por pulverización y después utilizarse en lugar de las películas lipídicas. La preparación de los liposomas se consigue hidratando las películas o los polvos lipídicos con un tampón e incubando la suspensión a 65ºC durante 5-10 minutos antes de la sonicación de sondas. Los liposomas entonces se filtran a través de un filtro de 0,22 \mum para esterilizar la preparación. Se ajusta el tamaño de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica y se sigue la formación de agregados durante al menos cuatro semanas. Es posible que la conformación de la proteína NTHi-(P6)-HD deba ser conservada. Por tanto, de las tres estrategias que pueden utilizarse para preparar los liposomas, los inventores prevén que la adición de la proteína como un componente de la disolución hidratante o la adición a los liposomas después de que se hayan formado puedan ser preferidas.
Cepas bacterianas. Las cepas de NTHi 9333 (aislado de fluido espinal), 35056 (aislado de infección de tracto respiratorio superior), 43095 (aislado de otitis media), 49766 (aislado de abscesos pulmonares, la cepa de referencia para el ensayo de susceptibilidad microbiana) (ATCC) y la cepa de Hib 51654 (ATCC) se utilizaron para demostrar la eficacia en el medio de infección bacteriana. Antes de su uso se subcultiva una cepa congelada del organismo en caldo de cultivo de infusión cerebrocardíaca fresca suplementada con NAD (2 \mug/ml) y heme (10 \mug/ml) y se incuba durante 24 horas a 37ºC con dióxido de carbono al 10%. Se emplea una curva patrón para cada organismo que consiste en unidades formadoras de colonias frente a la turbidez a 480 nm, para ajustar el inóculo de bacterias necesario para los ensayos bactericidas o para la dosis de exposición intraperitoneal.
Procedimientos de vacunación y ensayo para la inducción de una respuesta inmunológica a antígenos bacterianos. Se inmunizan grupos de ratas recién nacidas (n = 6 por grupo) en los días posnatales 5, 12, 19 y 26, o en los días 5 y 26 con la preparación de la vacuna de ensayo o con tampón. La vacunación sistémica de las ratas se realiza mediante una inyección subcutánea de las vacunas liposómicas. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna mediante la vía intranasal fueron anestesiados con metofano, y el artículo de ensayo (10-20 \mul) se administró utilizando una punta estéril sobre un micropipeteador (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622). Las ratas recién nacidas se alojaron con sus madres amamantadoras y se controló la aparición de reacciones adversas al procedimiento de vacunación. Las ratas recién nacidas se anestesiaron con halotano y la sangre se recogió mediante punción cardíaca y los conductos mucósicos se enjuagaron con disolución salina para recoger las secreciones mucósicas. Los animales se eutanizaron con dióxido de carbono. Se midieron las valoraciones de anticuerpos bactericidas del suero y del fluido mucósico como se describe a continuación.
Para el estudio de exposición intraperitoneal, las ratas recién nacidas (26 días de edad) se expusieron a las bacterias y se controló su sangre y CSF (fluido cerebroespinal) para determinar la carga bacteriana comparada con ratas sin vacunar. La toma de muestras de sangre y CSF para determinar las bacterias dos días después de la exposición indicó que existe una carga bacteriana significativa en los animales (es decir, 1 x 10^{4} CFU/ml en sangre; 1 x 10^{4} CFU/ml en CSF). El suero de las ratas de 26 días de edad vacunadas que contenía altas valoraciones de anticuerpos bactericidas se administra por vía intravenosa a ratas de 6 días de edad. Al día siguiente, las ratas recién nacidas (n = 10) reciben una dosis intraperitoneal de NTHi como se describe a continuación. Las ratas recién nacidas entonces se controlan para la morbilidad y la mortalidad. Los supervivientes se eutanizan después de 26 días y se recoge la sangre y el CSF y se cultiva para determinar la presencia de NTHi.
Exposición intraperitoneal con NTHi. Un cultivo de 24 horas de NTHi transferido in vivo se ajusta a 5 x 10^{7}-5 x 10^{9} CFU/ml, y 100 \mul de este cultivo se inyectan por vía intraperitoneal en ratas de 5-10 días de edad (Smith et al., 1973, Inf. Immun., 8:278). Las ratas recién nacidas expuestas permanecen con sus madres amamantadoras después de la inoculación. A las 18-96 horas después de la exposición, al menos 90% de las ratas recién nacidas mueren utilizando esta dosis de bacterias transferidas.
Medición de las respuestas de anticuerpos específicas de antígeno mediante ELISA. Se ensayan muestras de suero y mucósicas procedentes de cada rata para observar la presencia de anticuerpos IgG e IgA específicos para el antígeno P6. Se añade P6 nativo clonado o la proteína NTHi-(P6)-HD a placas de 96 pocillos tratadas de forma apropiada para su incubación durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se bloquean con albúmina de suero bovina al 1% en tampón bicarbonato, pH 9,6 durante 30 minutos a 37ºC. Las placas entonces se enjuagan con Tween 20 al 0,05%/PBS. Se añaden diluciones de cada muestra de suero y mucósica a las placas revestidas con antígeno, seguido de una incubación durante 2 horas a 37ºC y un enjuagado con tampón Tween/PBS al final de la incubación. Se añaden anticuerpos monoclonales unidos a fosfatasa alcalina específicos para IgG o IgA de rata a los pocillos durante una hora a 37ºC. Los pocillos entonces se enjuagan con tampón Tween/PBS y se añade a los pocillos sustrato de PNPP en tampón dietanolamina, pH 9,5, para iniciar la reacción colorimétrica. Las reacciones se detienen con hidróxido de sodio 0,75 N y se leen a 405 nm en un lector de placas de ELISA Spectramax. Se calculan las concentraciones de IgG e IgA de rata a partir de una curva patrón obtenida a partir de muestras control de concentraciones conocidas de IgG o IgA de rata revestidas sobre placas de 96 pocillos y se tratan como se describió anteriormente.
Ensayo de anticuerpos bactericidas. Las muestras de suero que se van a ensayar para la presencia de anticuerpos bactericidas se incuban a 56ºC durante 30 minutos para inactivar el complemento. Los sueros de ensayo entonces se diluyen en serie en disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Un cultivo bacteriano de 24 horas se ajusta a 5 x 10^{4} CFU/ML en tampón PCM estéril compuesto de PBS con CaCl_{2} 0,15 mM y MgCl_{2} 1 mM que contenía albúmina de suero bovina (BSA). Los sueros de ratas recién nacidas no vacunadas se emplean como la fuente del complemento. Estos sueros se reúnen, se dividen en partes alícuotas y se conservan a -70ºC hasta su uso. Se añaden bacterias (20 \mul), suero diluido en serie (20 \mul), complemento (20 \mul) y 40 \mul de BSA al 1% en tampón PCM a cada pocillo de una placa de grupos de 96 pocillos. Para determinar la concentración bacteriana inicial se cultivan partes alícuotas de 10 \mul de una mezcla de las muestras en el momento cero sobre placas de agar BHI fresco que contenían agar nutriente y suplementadas con NAD y heme. Tras la incubación de las mezclas de reacción a 37ºC con dióxido de carbono al 10% durante una hora con agitación, 10 \mul de cada pocillo se cultivan por duplicado y se incuban durante la noche a 37ºC en presencia de dióxido de carbono al 10% para determinar las CFU/pocillo. Los controles incluyen un pocillo sin suero para asegurar que el complemento solo no está matando a las bacterias, y un pocillo con suero de ensayo pero sin complemento para asegurar que el complemento del suero en la muestra de ensayo se ha inactivado con éxito. Todos los ensayos se realizan por triplicado y las diluciones que producen 50% de muerte en las bacterias se emplean para comparar la actividad entre diferentes sueros.
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Ejemplo VI Virus de la hepatitis C
Preparación de HCV(E2/NS1)-HD y HCV(E2/NS1\DeltaHVR1)-HD en células CHO. La secuencia de nucleótidos de la proteína E2/NS1 de HCV se deriva de la amplificación mediante PCR de una cepa de HCV obtenida como se describe a continuación. Utilizando un cebador 5' que se corresponde con los primeros 21 pb del gen E2/NS1, CAAACCAT
GATCGCCCACGGA, y un cebador 3' que se corresponde con los restos 622 a 628, GAAGTTGACAGTGCAGGGG
TA, se elimina el dominio transmembrana (Cocquerel, L. et al., 1998, J. Virol., 72(3):2183-2191). Además, cada cebador está flanqueado por sitios de restricción convenientes. El producto de la PCR se acopla en pcDNA3.1His que contiene el dominio HD como un plásmido de módulo génico (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Se construye HCV(E2/NS1\DeltaHVR1)-HD delecionando el HVR1 del gen E2/NS1 que se corresponde con los primeros 27 aminoácidos desde el resto 384 al resto 410. El mutante de deleción se fabrica mediante amplificación con PCR utilizando un cebador 5' CAACTCATCAACACCAATGGC, y el mismo cebador 3' utilizado para el control de tipo salvaje. Los genes finales se verifican mediante secuenciación del ADN. Los plásmidos se transfectan en células CHO (Deen, K.C. et al., 1988, Nature, 331:82) (ATCC, Rockville, MD) utilizando el reactivo de lipofección (lipofectamina, Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) según el protocolo recomendado por el fabricante. Los transfectantes estables se seleccionan utilizando G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) y se clonan mediante dilución limitante. La identificación de clones que producen niveles altos de proteína se evalúa mediante un análisis de la transferencia Western. Las proteínas HCV(E2/NS1)-HD y HCV(E2/NS1\DeltaHVR1)-HD se purifican mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. El conector de histidina se elimina mediante ruptura de enteroquinasa después de completar la purificación. Si es necesario se realiza una cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico y/o de interacción hidrófoba para purificar aún más las proteínas HCV(E2/NS1)-HD y HCV(E2/NS1\DeltaHVR1)-HD.
Preparación de las proteínas HCV(HVR1)-HD y HCV(C)-HD en E. coli. Las secuencias de nucleótidos de los epitopos elegidos se derivan de la secuencia de proteína utilizando las preferencias de codones de E. coli (Looman et al., 1987, EMBO J., 6:2489). La secuencia o secuencias antigénicas que se van a insertar en el módulo génico se corresponden con los epitopos de NP (147-161, TYORTRALVRTGMDP; 55-69, RLIONSLTIERMVLS) y HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL). Cuando se obtiene la secuencia o secuencias apropiadas, un gen sintético que codifica HCV-HD, flanqueado por sitios de restricción convenientes, se ensambla mediante síntesis, hibridación, y acoplamiento de oligonucleótidos solapantes. Brevemente, el ensamblaje de los fragmentos se logra calentando hasta 65ºC y acoplando los oligonucleótidos a medida que se vuelve a temperatura ambiente. Tras una incubación durante 2 minutos en hielo, los fragmentos se acoplan con ADN ligasa. El gen de longitud completa ensamblado que codifica los fragmentos de HCV se amplifica mediante PCR, se rompe mediante enzimas de restricción y se aisla mediante electroforesis en gel. El gen HCV entonces se acopla en un plásmido de expresión roto de manera similar que contiene el gen HD (por ejemplo, pTrcHis o pQE30). Los genes finales se verifican mediante la secuenciación del ADN.
Los plásmidos que contienen HCV-HD se transforman en E. coli. Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 \mug/ml) a 37ºC hasta la mitad de la fase logarítmica. En este momento se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se estudian los momentos de tiempo cada hora para determinar la expresión posinducción óptima de las proteínas de HCV-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se recogen mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se lisan y se centrifugan. El lisado se ensaya para determinar la presencia de proteínas. Las proteínas de HCV-HD se purifican mediante afinidad selectiva al níquel unido a un soporte sólido. El conector de histidina se elimina mediante ruptura con enteroquinasas después de completar la purificación. Si es necesario se realiza una cromato-
grafía de exclusión molecular, de intercambio iónico o de interacción hidrófoba para purificar aún más las HCV-HD.
La preparación liposómica y los procedimientos de vacunación, los ensayos de inducción de una respuesta inmunológica, las mediciones de la respuesta de anticuerpos mediante ELISA, el ensayo de DTH, el análisis de ARNm específico de citoquina, las mediciones de citoquinas con ELISA, la proliferación de células T inducida por antígenos, y las respuestas de CTL anti-VIH se realizaron fundamentalmente como se describe en el ejemplo III anterior.

Claims (23)

1. Una composición de liposomas inmunogénica que comprende:
lípidos formadores de vesículas; y
una construcción de proteína antigénica que es un producto de fusión hidrosoluble que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrófobo, en la que el dominio hidrófobo está asociado con la membrana de la composición de liposomas inmunogénica.
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2. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, que comprende además uno o más adyuvantes.
3. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, en la que la construcción antigénica se sintetiza de modo químico.
4. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el dominio hidrófobo es un péptido.
5. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 4, en la que el dominio hidrófobo consiste en aproximadamente 15 a aproximadamente 500 restos aminoácidos.
6. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 5, en la que el dominio hidrófobo comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
7. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el determinante antigénico se deriva de un antígeno seleccionado del grupo que consiste en gD o gB de HSV, gp120 de VIH, gB de CMV, E2 de HCV, HA o NA de INFV, y P6 de H. influenzae.
8. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, en la que la construcción antigénica comprende además una región conectora que une el uno o más determinantes antigénicos con el dominio hidrófobo.
9. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 8, en la que la región conectora es un péptido.
10. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 9, en la que la región conectora consiste de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 restos aminoácidos.
11. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 10, en la que los restos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
12. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, que comprende una construcción antigénica que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrófobo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 12, en la que la construcción antigénica comprende además una región conectora que une el uno o más determinantes antigénicos con el dominio hidrófobo.
14. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 12, que comprende además uno o más adyuvantes.
15. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el uno o más determinantes antigénicos es un determinante antigénico de una toxina o patógeno bacteriano, de un patógeno vírico, de un patógeno fúngico, o de un patógeno parasitario.
16. Una composición de liposomas inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para inmunizar un animal hospedante.
17. Una composición de liposomas inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para inducir una respuesta inmunológica en un animal hospedante.
18. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 16 ó 17, en la que el animal hospedante es un mamífero.
19. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 18, en la que el mamífero es un ser humano.
20. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 19, en la que el determinante antigénico se selecciona del grupo que consiste en gD o gB de HSV, gp120 de VIH, gB de CMV, E2 de HCV, HA o NA de INFV, y P6 de H. influenzae.
21. Una composición de liposomas inmunogénica según la reivindicación 16 ó 17, en la que el animal es un ave.
22. Un método para fabricar una composición de liposomas inmunogénica que comprende:
expresar un gen que codifica una proteína de fusión hidrosoluble que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrófobo; y
(a) disolver lípidos formadores de vesículas y la proteína de fusión en un disolvente orgánico adecuado;
formar una película lipídica o un polvo secado por pulverización lipídico mediante la evaporación del disolvente orgánico;
hidratar la película o el polvo lipídicos; y
dispersar la película o el polvo lipídicos hidratados para formar una composición de liposomas inmunogénica; o
(b) disolver la proteína de fusión en un tampón acuoso;
hidratar un polvo lipídico o una película lipídica con el tampón que contiene la proteína de fusión; y
dispersar el polvo o la película lipídicos para formar una composición de liposomas inmunogénica; o
(c) disolver la proteína de fusión en un tampón acuoso; y
añadir la proteína de fusión a liposomas preformados para formar una composición de liposomas inmunogénica.
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23. Una composición de liposomas inmunogénica que puede obtenerse mediante un método según la reivindicación 22.
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