ES2337967T3 - Induccion xenobiotica de la expresion genica del citocromo p450 cyp3a4. - Google Patents
Induccion xenobiotica de la expresion genica del citocromo p450 cyp3a4. Download PDFInfo
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Abstract
Constructo genético, que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que forma un intensificador transcripcional de la producción o expresión del citocromo P450 CYP3A4, y (ii) un gen codificante de una molécula de informador, en el que la secuencia de nucleótidos incluye cada uno de los elementos de respuesta nuclear siguientes de la región 5''-flanqueante de CYP3A4: SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5.
Description
Inducción xenobiótica de la expresión génica del
citocromo P450 CYP3A4.
La presente invención se refiere a la modulación
o realización de la expresión génica y/o a la formación de enzimas
de la subfamilia del citocromo P450 CYP3A humano y animal no
humano.
El desarrollo de fármacos terapéuticos para el
uso médico y veterinario resulta importante para la mejora y el
avance de las modalidades de tratamiento en seres humanos y
animales. Por desgracia, se ha encontrado que muchos fármacos
desarrollados y utilizados posteriormente presentan vidas medias
limitadas in vivo debido al metabolismo rápido del receptor.
Resultaría ventajoso disponer de un sistema para cribar nuevos
fármacos potenciales para la susceptibilidad a la acción metabólica
en los pacientes.
Un citocromo P450 (P450) denominado CYP3A4 es un
gen humano importante que codifica un enzima expresado en el hígado
y en menor grado en un abanico de otros tejidos. Cuantitativamente
es el P450 más abundante en el hígado humano. El enzima CYP3A4
resulta crucial para el metabolismo de muchos compuestos químicos
exógenos (xenobióticos), incluyendo fármacos terapéuticos, así como
un abanico de compuestos endógenos, tales como las hormonas
esteroideas. Los cambios del nivel de expresión de CYP3A4 pueden
afectar drásticamente a la tasa de eliminación de los fármacos
terapéuticos y, de esta manera, presentar un impacto sobre su
efectividad. Un abanico de compuestos químicos exógenos, incluyendo
algunos fármacos terapéuticos (en lo sucesivo denominados
"inductores xenobióticos") son capaces de incrementar la tasa
transcripcional del gen CYP3A4 y por lo tanto la formación del
enzima CYP3A4. El resultado es un gran incremento de la eliminación
de los fármacos metabolizados por CYP3A4, reduciendo de esta manera
su efecto terapéutico.
Los presentes inventores han obtenido una
molécula de ADN, situada aproximadamente a 7 kilobases en el lado
5' del sitio de inicio de transcripción del gen del P450 CYP3A4
humano, que es responsable de la inducción transcripcional del gen
CYP3A4 por parte de inductores xenobióticos, incluyendo fármacos
terapéuticos, y que también se encuentra implicada en la expresión
constitutiva de dicho gen. Esta molécula de ácidos nucleicos,
denominada "módulo intensificador sensible a los xenobióticos"
(XREM) por los presentes inventores, presenta varios usos
beneficiosos.
La referencia de Hashimoto et al., Eur.
J. Biochem. 218:585-595, 1993, describe el gen
CYP3A4, incluyendo la secuencia promotora proximal.
La referencia de Dogra et al., Clinical
and Experimental Pharmacology and Physiology 25 (enero de
1998):1-9, describe la activación transcripcional
de genes P450 por diferentes clases de inductores químicos.
La referencia de Ogg et al., Eur. J. Drug
Metabolism and Pharmacokinetics
22(4):311-313, 1997, describe un ensayo
in vitro de un gen informador para la evaluación de la
inducción xenobiótica del gen CYP3A4 humano.
La referencia Lehmann et al., J. Clin.
Invest 5:1016-1023, 1998, describe la activación del
receptor PXR nuclear huérfano humano por compuestos que regulan la
expresión del gen CYP3A4 y provocan interacciones
farmacológicas.
La referencia de Barwick et al., Mol.
Pharm 50:16-26, 1996, describe la activación
transcripcional inducible por glucocorticoides de CYP3A4 humano
transitoriamente expresado y CYP3A6 de conejo en cultivos primarios
de hepatocitos de rata y de conejo adulto.
La invención proporciona un constructo genético
según se define en las reivindicaciones. La invención también
proporciona un método según se define en las reivindicaciones.
La presente memoria proporciona una molécula
aislada de ácidos nucleicos que incluye una secuencia de nucleótidos
que forma un intensificador transcripcional de la producción o
expresión del citocromo P450 (P450) CYP3A4.
Preferentemente, la molécula aislada de ácidos
nucleicos incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente
igual a la mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1) o una secuencia de
nucleótidos funcionalmente equivalente o una porción de la misma,
codificante de un intensificador de CYP3A4, o una secuencia que se
hibrida con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº
1), o una secuencia que muestra una homología de por lo menos 60%
con la secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1). Más
preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos presenta una
homología de por lo menos 80% con la secuencia de nucleótidos de la
figura 1 (SEC ID nº 1) y más preferentemente la molécula de ácidos
nucleicos presenta una homología de por lo menos 90% con dicha
secuencia.
La presente memoria proporciona una molécula
aislada de ácidos nucleicos que incluye elementos de respuesta de
receptor nuclear de la región 5'-flanqueante de
CYP3A4. Los elementos de respuesta son:
XREM-DR3-1 GAA TGAACTTGC TGACCC TCT
(SEC ID nº 2); XREM-ER6 CCT TGAAAT CATGTC GGTTCA AGC
(SEC ID nº 3); XREM-DR6 AGG TGAATC ACAAGC TGAACT
TCT (SEC ID nº 4) y XREM-DR3-2 ATA
TATTGT TAT TGAACT ATC (SEC ID nº 5).
Debido a que los presentes inventores han
identificado varios elementos de respuesta específicos en el
intensificador de CYP3A4, se apreciará que la secuencia SEC ID nº 1
puede utilizarse para identificar otros elementos de respuesta.
Debido a que la secuencia completa del intensificador no resulta
necesaria para la utilización posterior, se encuentra comprendido
dentro del alcance de la presente invención la utilización de
elementos de respuesta del intensificador con secuencias
intermedias o conectoras procedentes de otras fuentes.
Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos
aislada presenta una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual
a la mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1).
En una forma preferente, el CYP3A4 es CYP3A4
humano. Sin embargo, se apreciará que la presente invención también
se refiere a otros enzimas de la subfamilia de CYP3A humana y a
enzimas de la subfamilia CYP3A de animales no humanos.
La inducción de CYP3A4 preferentemente se debe a
uno o más inductores xenobióticos.
La presente memoria también proporciona
polinucleótidos que se hibridan con la secuencia mostrada en la
figura 1 (SEC ID nº 1). Preferentemente, el polinucleótido se
hibrida con la secuencia indicada en la figura 1 (SEC ID nº 1) bajo
condiciones de alta astringencia. Tal como se utiliza en la presente
memoria, las condiciones astringentes son aquéllas que: (a)
utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para
el lavado, por ejemplo NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015
M/NaDodSO_{4} al 0,1% a 50ºC, (b) utilizan durante la hibridación
un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo
formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%, Ficoll
al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampón de fosfato sódico 50
mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC, o (c)
utilizan formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075
M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5x
solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml),
SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 4 2ºC en 0,2xSSC y SDS al
0,1%.
El polinucleótido capaz de hibridarse con la
secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEC ID nº 1) puede
presentar una longitud inferior a 5.000 nucleótidos, sin embargo,
puede presentar una longitud inferior a 1.000, o incluso inferior a
500 nucleótidos. Preferentemente, los polinucleótidos hibridantes
presentan una longitud de por lo menos 10, más preferentemente de
por lo menos 18 nucleótidos.
En una realización, la presente invención
proporciona un constructo genético adecuado para la utilización en
la medición del grado de inducción de un gen informador, incluyendo
el constructo una molécula de ácidos nucleicos según el primer
aspecto de la presente invención (según las reivindicaciones)
operablemente ligada a una molécula de ácidos nucleicos codificante
de una molécula de informador.
Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos
codificante de la molécula de informador codifica un enzima. La
molécula de ácidos nucleicos codificante del informador puede
codificar el enzima CYP3A4 o un enzima funcionalmente equivalente.
Entre los ejemplos de moléculas informadoras adecuadas se incluyen
la luciferasa de luciérnaga, la beta-galactosidasa,
la cloranfenicol acetiltransferasa, la fosfatasa alcalina y la
proteína fluorescente verde. Alternativamente, el ácido nucleico
puede codificar un ARN mensajero (ARNm) que puede detectarse
mediante técnicas estándares, tales como la transferencia northern
o los ensayos de protección frente a ribonucleasa.
Sin embargo, se apreciará que la molécula de
ácidos nucleicos codificante de la molécula de informador puede ser
cualquier molécula de ácidos nucleicos o gen que, al expresarse,
presente una actividad detectable. La molécula de ácidos nucleicos
codificante de la molécula de informador se encuentra necesariamente
asociada al sistema del citocromo P450, aunque el inductor de
transcripción (XREM) utilizado se deriva de dicho sistema génico.
También se apreciará que la molécula de ácidos nucleicos codificante
del gen informador puede incluir más de una molécula de
informador.
La presente memoria describe un sistema de
ensayo que incluye el constructo de la invención, de manera que al
exponer el sistema a un inductor xenobiótico, se incrementa la
expresión de la molécula de ácidos nucleicos codificante de la
molécula de informador.
El sistema de ensayo incluye dentro de su
alcance células que contienen el constructo (XREM) y sistemas libres
de células capaces de proporcionar soporte a la función del
constructo (XREM). Dichos sistemas libres de células típicamente
contienen extractos celulares, tales como extractos nucleares,
aunque no en todos los casos. El sistema de ensayo también incluye
sistemas experimentales que determinan la unión de compuestos al
constructo (XREM). Entre ellos se incluyen las huellas de ADNasa I
y los ensayos de retardo en gel. Estos sistemas de ensayo pueden
utilizarse para detectar la activación del constructo (XREM), pero
no resultan tan convenientes para el cribado en masa de compuestos
como los constructos de gen informador. Preferentemente, el
incremento de la expresión resulta en un incremento de la actividad
de producto del gen informador.
La célula puede ser cualquier célula adecuada,
incluyendo células bacterianas, vegetales o animales. El constructo
puede existir en forma de una entidad genética separada en la célula
o puede incorporarse en el genoma de la célula. Además, la célula
puede formar parte de un animal transgénico.
En una realización, la presente invención
proporciona un método (según se define en las reivindicaciones)
para cribar un compuesto para la inducción xenobiótica de la
expresión de CYP3A4 en una célula, incluyendo el método exponer un
sistema de ensayo de la presente invención al compuesto y medir la
inducción o el potencial de expresión de la molécula de ácidos
nucleicos codificante de la molécula de informador.
El método según la presente invención resulta
particularmente adecuado para cribar nuevos fármacos terapéuticos.
Aunque pueden encontrarse disponibles muchos fármacos potenciales en
la etapa de desarrollo, en el caso de que un fármaco induzca la
expresión de CYP3A4 in vivo, su adecuación como agente
terapéutico eficaz se ve reducida. Durante la utilización, la vida
media del fármaco será más corta debido a que resulta metabolizado
por el enzima CYP3A4 inducido en el hígado del paciente. Otro
problema que puede surgir es que el fármaco cause la aceleración
del metabolismo o la eliminación de otros fármacos proporcionados al
paciente. Con frecuencia se requieren "cócteles" de fármacos o
combinaciones de fármacos para tratar muchas enfermedades. En el
caso de que uno de los fármacos administrados presente la tendencia
a incrementar la eliminación de uno o más de los demás fármacos
utilizados en el tratamiento de una enfermedad particular, esto
resultará altamente no deseable y podría resultar en una reducción
de la eficacia del tratamiento.
Se apreciará que, en el caso de que un compuesto
o nuevo fármaco no consiga inducir la expresión del gen informador
al someterlo a ensayo mediante el método según la presente
invención, este hecho es una indicación de que el compuesto o nuevo
fármaco podría no ser un inductor xenobiótico y, por lo tanto, un
candidato adecuado para el desarrollo posterior. Un procedimiento
de cribado resultaría beneficioso en el desarrollo de fármacos
terapéuticos, debido a que los candidatos no adecuados pueden
descartarse en una etapa temprana del desarrollo. Además, también
pueden desarrollarse compuestos químicos alternativos o relacionados
basados en un resultado negativo del compuesto en el cribado de
ensayo.
La memoria describe exponer un animal
transgénico y medir en el animal la inducción del gen informador
tras la exposición al compuesto químico o fármaco.
La presente memoria proporcionar el XREM como
herramienta de análisis genético. A este respecto, se introducen
mutaciones que responden a variantes alélicas en seres humanos y se
observan sus consecuencias funcionales. Además, debido a que XREM
presenta una función definida de regulación transcripcional, puede
utilizarse para la determinación de la variación alélica.
La utilización puede implicar la determinación
de la variación alélica dentro del XREM (relevante para la
expresión constitutiva), y la utilización de la mutación dirigida a
sitio del XREM para determinar el impacto de la variación
alélica.
En la totalidad de la presente memoria, a menos
que el contexto indique lo contrario, el término "comprenden",
o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se
entenderá que implican la inclusión del elemento, número entero o
etapa, o de los grupos de elementos, números enteros o etapas, que
se indican, aunque sin sugerir la exclusión de cualquier otro
elemento, número entero o etapa, o grupos de elementos, números
enteros o etapas.
Con el fin de que la presente invención se
entienda más claramente, se describen formas preferentes mediante
la referencia a los ejemplos y dibujos siguientes.
La figura 1 muestra una secuencia de la región
XREM del gen CYP3A4. La numeración de las bases es relativa y no
indica la localización dentro de la estructura del gen CYP3A4.
La figura 2 muestra un ejemplo de una serie de
constructos de deleción de la región 5'-flanqueante
del gen CYP3A4 utilizados para definir los elementos sensibles a
xenobióticos. El factor de inducción de la expresión del gen
informador de la luciferasa se refiere al tratamiento con un potente
inductor de CYP3A4 (rifampicina 5 \muM) en comparación con
vehículo solo (dimetilsulfóxido al 0,1%). Dicho factor se normalizó
respecto a la actividad de un vector informador básico pGL3
"vacío". Todos los constructos se transfectaron temporalmente
en células HepG2.
La figura 3 muestra el efecto de la
cotransfección de un vector de expresión hPXR
(pSG-hPxR) sobre células HepG2 que contienen un
constructo informador CYP3A4 XREM en presencia o en ausencia de un
potente inductor de CYP3A4 (rifampicina 5 \muM). La inserción
muestra una vista magnificada de los efectos sobre las células de
control.
La figura 4 muestra el efecto de diversos
fármacos inductores sobre células HepG2 que contenían un constructo
informador CYP3A4 XREM y un vector de expresión hPXR en comparación
con vehículo (dimetilsulfóxido) al 0,1% solo. Leyenda: 1, DMSO, 2,
rifampicina; 3, RU-486; 4, clotrimazol; 5,
fenobarbital; 6, metirapona; 7, pregnenalona
16\alpha-carbonitrilo.
La figura 5 muestra el efecto de las deleciones
y de la mutagénesis dirigida un sitio de elementos de respuesta de
receptor nuclear putativo sobre la inducción transcripcional de la
región 5'-flanqueante de CYP3A4 por la rifampicina
5 \muM. Las partes en negro corresponden a elementos mutados. La
numeración es respecto al sitio de inicio de transcripción.
\newpage
La figura 6 muestra un constructo optimizado de
región 5'-flanqueante de CYP3A4 acoplado a un gen
informador de la luciferasa (Luc) para determinar la capacidad de
los xenobióticos de inducir la activación transcripcional del gen
CYP3A4. La numeración es respecto al sitio de inicio de
transcripción.
A menos que se indique lo contrario, las
técnicas de ADN recombinante utilizadas en la presente invención
son procedimientos estándares bien conocidos para el experto en la
materia. Dichas técnicas se describen y se explican en la
literatura en fuentes tales como: J. Perbal, A Practical Guide to
Molecular Cloning, John Wiley and Sons, 1984; J. Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, 1989; T.A. Brown (editor), Essential Molecular
Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press, 1991;
D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical
Approach, volúmens 1 a 14, IRL Press, 1995 y 1996; y F.M. Ausubel
et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988,
incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).
Los polinucleótidos mutantes presentan una o más
mutaciones que son deleciones, inserciones o sustituciones de
residuos nucleótidos. Los mutantes pueden ser naturales (es decir,
aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo
mediante la realización de mutagénesis dirigida a un sitio en el
ADN). De esta manera, resulta evidente que los polinucleótidos de
la invención pueden ser naturales o recombinantes (es decir,
preparados utilizando técnicas de ADN recombinante).
Una variante alélica es una variante que es de
origen natural dentro de un organismo individual.
Las secuencias de nucleótidos son homólogas en
el caso de que se encuentren relacionadas a partir de la divergencia
de un ancestro común. En consecuencia, en una especie un homólogo
del polinucleótido será un polinucleótido equivalente al que se
encuentra naturalmente en otra especie. Dentro de cualquier especie
dada un homólogo puede existir como numerosas variantes alélicas, y
éstas se consideran homólogos del polinucleótido. Pueden obtenerse
variantes alélicas y homólogos específicos mediante las técnicas
estándares siguientes conocidos para el experto en la materia.
Entre los homólogos específicos preferentes se incluyen aquellos
obtenidos de representantes del mismo filum, más preferentemente de
la misma clase taxonómica y todavía más preferentemente del mismo
orden taxonómico.
Un polinucleótido es idéntico por lo menos al
70%, según se determina mediante métodos bien conocidos para el
experto en la materia (por ejemplo el método descrito por Smite,
T.F. y Waterman, M.S., Ad. Appl. Math. 2:482-489,
1981; o por Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., J. Mol. Biol.
48:443-453, 1970), al de la presente invención se
describe en la presente invención, al igual que las proteínas con
una identidad de por lo menos 80% o 90%, y más preferentemente de
por lo menos 95%, respecto del polinucleótido descrito en la
presente invención. Lo anterior se refiere generalmente a una
región de por lo menos 60, preferentemente de por lo menos 90,
residuos nucleótidos contiguos.
Mediante la expresión "sustancialmente
purificado" los presentes inventores se refieren a un
polinucleótido que ha sido separado de lípidos, ácidos nucleicos,
otros polipéptidos o polinucleótidos y otras moléculas
contaminantes.
Mediante la expresión "fragmento activo"
los presentes inventores se refieren a un fragmento de una secuencia
mostrada en la figura 1 que codifica un intensificador
transcripcional del citocromo P450 (P450) denominado CYP3A4.
CYP3A4 es un gen importante en la farmacología
clínica del ser humano. Además de su papel crucial en el metabolismo
de los fármacos terapéuticos y de las hormonas esteroides
endógenas, algunos estudios recientes han asociado un polimorfismo
no codificante en una región reguladora putativa de este gen, con el
cáncer de próstata y el desarrollo de leucemia secundaria a
quimioterapia del cáncer. Una comprensión de la regulación génica de
CYP3A4 resultará importante para el desarrollo de fármacos
terapéuticos. Además, el gen CYP3A4 representa una nueva diana para
la manipulación farmacológica y una herramienta para tanto el
análisis farmacogenético como posiblemente la predicción de
enfermedades. Sin embargo, una comprensión completa de la regulación
y genética de CYP3A4 resulta necesaria para alcanzar dichos
objetivos. La presente invención se refiere a un módulo regulador
dentro de la región 5'-flanqueante del gen CYP3A4
que es responsable de su inducción xenobiótica y de la expresión
constitutiva.
Los P450s hepáticos humanos son hemoproteínas
unidas a membrana activas en el metabolismo de un amplio abanico de
sustratos lipofílicos. Las proteínas P450 resultan de considerable
relevancia para la medicina, no sólo debido a su papel central en
el metabolismo de fármacos y de otros xenobióticos, sino también
debido a sus muchos sustratos lipofílicos "naturales" o
"endógenos". Entre ellos se incluyen las hormonas esteroideas,
ácidos grasos (especialmente leucotrienos), colesterol y sales
biliares. Se considera probable que el sistema P450 evolucionó
debido a su papel crucial en el metabolismo del colesterol y de los
esteroides. Un pequeño subconjunto de P450s hepáticas humanas
expresadas constitutivamente, incluyendo CYP3A4, resulta de
particular interés debido a que cuantitativamente son las formas
más importantes y catalizan un abanico de reacciones biológicamente
importantes.
CYP3A4, el citocromo P450 predominante en el
hígado humano, comprende hasta 60% de la cantidad total de proteína
citocromo P450 hepático. CYP3A4 se encuentra implicado en el
metabolismo de un extenso abanico de fármacos y esteroides
endógenos. Se ha estimado que más de 60% de todos los fármacos
terapéuticos son metabolizados total o parcialmente por dicho
enzima. Los cambios del nivel de expresión de CYP3A4 pueden
presentar un impacto drástico sobre el metabolismo de los fármacos
terapéuticos y causar de esta manera varias interacciones
importantes entre fármacos. Además, el nivel variable de expresión
constitutiva de dicho enzima presenta una contribución importante a
la variabilidad interindividual del metabolismo oxidativo de los
fármacos. Además, CYP3A4 es la ruta principal del metabolismo
oxidativo de las hormonas esteroideas, catalizando la
6\beta-hidroxilación de varios esteroides
endógenos, tales como cortisol, andrestenediona y testosterona, así
como la 2-hidroxilación y la
4-hidroxilación del estradiol para formar estrógenos
catacol. En el ser humano se encuentran dos otros citocromos P450
de la subfamilia CYP3A. CYP3A7 se encuentra principalmente en el
hígado fetal, mientras que CYP3A5 se encuentra principalmente en el
hígado de adultos, así como en los pulmones y en los riñones.
CYP3A4 se encuentra sometido a múltiples niveles
de regulación transcripcional. Entre ellos se incluyen la inducción
xenobiótica (por ejemplo por algunos fármacos terapéuticos), la
regulación específica de tejido, así como variabilidad sustancial
de la expresión constitutiva (hasta de 10 veces entre individuos no
expuestos a inductores o inhibidores conocidos).
Los genes CYP3A en varias especies de mamífero,
incluyendo el ser humano, son transcripcionalmente inducibles por
varios fármacos terapéuticos estructuralmente diferentes. Basándose
en la premisa de que la inducción xenobiótica de CYP3A4 se
encuentra mediada por un elemento de respuesta en la región
5'-flanqueante de este gen, los presentes
inventores han clonado 22 kilobases (kb) del gen CYP3A4 en el lado
5' del sitio de inicio de transcripción. Lo anterior se utilizó
para generar una serie de deleción de constructos que cubrían 13 kb
de la región 5'-flanqueante que se encontraban
ligados a un gen informador de luciferasa para el análisis de la
actividad transcripcional. Estos constructos se utilizaron para
transfectar temporalmente una línea celular de hepatoblastoma
humano (HepG2), así como cultivos primarios de hepatocitos de rata y
de conejo. Mediante la comparación de las células transfectadas
tratadas con agentes inductores, tales como rifampicina, con
controles no tratados, los presentes inventores determinaron que el
elemento de respuesta [denominado en lo sucesivo módulo
intensificador sensible a xenobióticos (XREM)] se encontraba
aproximadamente localizado entre -7,2 kb y -7,8 kb en el lado 5'
del sitio de inicio de transcripción (figura 2). Los presentes
estudios demuestran que XREM es un elemento complejo que abarca
varios cientos de pares de bases (figura 1, SEC ID nº 1). Las
huellas de ADNasa I muestran además que dicha región es rica en
interacciones de ADN-proteína y aparentemente es
capaz de unirse a varios factores de transcripción, de entre los que
el recientemente descrito receptor humano de pregnano X (hPXR) (el
receptor de pregnenano X es idéntico al receptor de pregnano
activado (PAR) y el receptor de esteroide X (SXR))
[1-3] es el más importante para la regulación
inducida por xenobióticos de CYP3A4.
Los presentes inventores han demostrado que hPXR
forma el enlace vital entre el inductor xenobiótico (por ejemplo
rifampicina) y elementos situados dentro de XREM. En el ser humano,
el tratamiento de rifampicina típicamente induce la expresión del
gen CYP3A4 incrementándola 50 veces o más. En el caso de que un
constructo informador adecuado que contenga la secuencia de XREM se
transfecte en células HepG2, el tratamiento de rifampicina resulta
en una inducción de 3 a 5 veces de la expresión del gen informador.
Sin embargo, los presentes inventores han demostrado que la
cotransfección del constructo de gen informador que contiene XREM
con un vector de expresión hPXR restaura totalmente la inducción
provocada por la rifampicina (figura 3). Los presentes inventores
también han demostrado que otros fármacos, tales como fenobarbitona
y clotrimazol, también actúan sobre XREM a través del hPXR (figura
4), demostrando que lo anterior es un mecanismo general para la
inducción xenobiótica del gen CYP3A4.
El hPXR es un receptor nuclear huérfano
perteneciente a la superfamilia génica de receptores nucleares [4],
Algunos estudios de otros laboratorios sugieren que se une a ADN en
forma de heterodímero con el receptor de retinoide X (RXR)
[1-3]. Los presentes inventores han identificado
varios elementos de respuesta putativos de receptor nuclear dentro
de XREM dispuestos en forma de repeticiones directas con un
espaciador de 3 bases (DR3), de repeticiones directas con un
espaciador de 6 bases (DR6) o de repeticiones revertidas con un
espaciador de 6 bases (ER6) (Tabla 1). Con el fin de evaluar la
afinidad de dichos elementos de respuesta putativos para los
heterodímeros hPXR-RXR, se llevaron a cabo ensayos
de desplazamiento de electromovilidad (EMSA) utilizando hPXR y RXR
transcritos/traducidos in vitro. Estos ensayos demostraron
que XREM-DR3-1 y
Prox-ER6 se unen eficientemente a heterodímeros
hPXR-RXR, resultando en un desplazamiento en el gel,
aunque no resultó evidente ningún desplazamiento con
XREM-DR6 ni
XREM-DR3-2. A pesar de este
resultado, los presentes inventores han demostrado mediante
experimentos de mutagénesis dirigida a sitio que las dos últimas
respuestas resultan funcionalmente importantes (figura 5). El
XREM-ER6 no se unió a heterodímeros
hPXR-RXR, aunque con menor afinidad que
XREM-DR3-1 o
Prox-ER6.
Al delecionar XREM de los constructos de gen
informador que contenían la región 5'-flanqueante de
CYP3A4, no se observó actividad de inducción xenobiótica,
demostrando que la región XREM resulta esencial para el proceso de
la inducción xenobiótica. Además, al unir XREM a un promotor de gen
heterólogo, tal como un promotor mínimo de timidina quinasa del
virus herpes simplex, se observó inducción xenobiótica, demostrando
que XREM no depende de manera absoluta de otros elementos situados
dentro del gen CYP3A4. Sin embargo, para una sensibilidad
xenobiótica máxima, los presentes inventores han determinado que
resulta necesario un elemento ER6 en el interior de la región
promotora proximal del gen CYP3A4 (Prox-ER6, Tabla
1). Resulta importante apreciar que el elemento
Prox-ER6 no presenta actividad de inducción
xenobiótica en ausencia del XREM.
A partir de los resultados anteriormente
proporcionados, se determinó una secuencia optimizada de ADN para
el análisis de la inducción xenobiótica del gen CYP3A4. Este gen
incluye la región XREM, así como las bases -356 a +53 del promotor
proximal de CYP3A4 y se denomina constructo nº 5 (figura 6).
Típicamente, esta secuencia de ADN se encuentra unida a un gen
informador y se estudió en células, o en un sistema libre de
células, adecuados. Los presentes inventores determinaron que la
línea celular HepG2 cultivada en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino al 10%, transfectada
utilizando un reactivo comercialmente disponible
(FuGene-6, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania)
funciona bien.
Expresión específica de tejido y constitutiva de
genes de la subfamilia de CYP3A.
Los mecanismos que determinan la expresión
restringida a tejidos y constitutiva de CYP3A4 probablemente son
similares, si no iguales. La comprensión de estos aspectos de la
regulación génica resultan críticos para una explicación definitiva
de por qué los seres humanos muestran una variabilidad
interindividual tan marcada en el metabolismo de fármacos mediado
por CYP3A4.
Las P450s de la subfamilia CYP3A humana se
expresan predominantemente en el hígado. Sin embargo, se produce
una expresión restringida a tejido extrahepático significativa.
CYP3A4 se expresa en cantidades significativas en el intestino
delgado, colon y páncreas, así como en el tejido mamario. Los
niveles relativos de expresión constitutiva en hígado e intestino
muestran poca concordancia, sugiriendo que en cada tejido actúan
mecanismos diferentes. Aunque CYP3A4 se expresa constitutivamente
en todos los hígados humanos adultos, existe una variabilidad de
factor 10 del ARNm de CYP3A4 entre muestras de hígado. La
variabilidad de la expresión intestinal es todavía más marcada,
informándose de una variación de factor 30.
En el caso de la expresión hepática de CYP3A4
utilizando constructos informadores que contienen la región
5'-flanqueante del gen CYP3A4, los presentes
inventores han demostrado que preferentemente resultan necesarios
factores específicos del hígado para proporcionar soporte a la
transcripción de CYP3A4. Al comparar una línea celular derivada de
hígado (HepG2) con una línea no derivada de hígado
(NIH-3T3) para su capacidad de proporcionar soporte
a la activación transcripcional, en presencia o en ausencia de hPXR,
la línea celular no derivada de hígado fue marcadamente inferior.
Lo anterior sugiere claramente un papel opcional de los factores de
transcripción específicos del hígado. Sin embargo, es conocido de
los presentes inventores que las células HepG2, aunque son una
línea celular derivada de hígado humano, no expresan
constitutivamente CYP3A4 en cantidades significativas. Los
presentes inventores han encontrado que un receptor nuclear huérfano
humano, denominado receptor \beta constitutivo humano de
androstano (hear-\beta) [5], al cotransfectarse en
células HepG2 con un constructo informador de región
5'-flanqueante de CYP3A4, provoca un incremento de 6
a 10 veces en la actividad de informador.
hCAR-\beta no requiere ligando para transactivar
las secuencias de ADN reguladoras y la expresión de las mismas se
encuentra restringida prácticamente por completo al hígado. Los
experimentos realizados utilizando constructos de deleción muestran
que la respuesta del gen CYP3A4 frente al receptor
hCAR-\beta depende de XREM. Además, tal como se
ha observado para la inducción xenobiótica con hPXR, se ha observado
expresión constitutiva mediada por hCAR-\beta
tras la unión de XREM al promotor mínimo de timidina quinasa, aunque
a un nivel inferior al observado con el promotor nativo. Los
experimentos preliminares sugieren que existe cooperatividad entre
XREM y el elemento Prox-ER6 en la expresión
constitutiva mediada por hCAR-\beta. Sin embargo,
el promotor nativo por sí solo no muestra ninguna respuesta frente
a la cotransfección con hCAR-\beta.
El citocromo P450 3A4 (CYP3A4), el P450 de
expresión predominante en el hígado humano adulto, se encuentra
sometido a la inducción transcripcional por una diversidad de
compuestos xenobióticos no relacionados estructuralmente,
incluyendo el antibiótico rifampicina. Los presentes inventores han
transfectado una línea celular derivada de hígado humano (HepG2)
con diversos constructos de CYP3A4-gen informador de
luciferasa que contenían un conjunto anidado de deleciones 5' del
promotor de CYP3A4. La transcripción inducible por rifampicina del
gen informador únicamente se observó en el constructo más largo. El
tratamiento de rifampicina de células transfectadas con el
constructo - 13000/+53-luciferasa resultó en un
incremento de 3 a 5 veces en la actividad de gen informador. Este
constructo resultó activado de una manera dependiente de la dosis
por la rifampicina, con una inducción máxima a 5 \muM. Se preparó
un conjunto adicional de clones por deleción y la región sensible se
localizaba en las bases -7800 a -7200, aproximadamente. Los
mutantes por deleción generados por reacción en cadena de la
polimerasa sugieren que, la respuesta a la rifampicina se basa en la
integridad de una región más grande que comprende varios cientos de
bases, y no en un elemento corto de acción en cis. Dicha región,
conjuntamente con un promotor mínimo de CYP3A4 (-362 a +53) fue
capaz de proporcionar sensibilidad frente a la rifampicina al gen
informar. La inducción era independiente de la orientación del
fragmento -7800/-7200 y su posición relativa respecto al promotor
proximal de CYP3A4. Los constructos de gen informar heterólogo, que
contienen la región intensificadora distal de CYP3A4 ligada al
promotor de timidina quinasa del gen del herpes simplex, también
fueron capaces de inducir la expresión de luciferasa tras el
tratamiento de rifampicina. El análisis de la secuencia de
nucleótidos de dicha región reveló varios sitios putativos de unión
de factor transcripcional. En resumen, los presentes inventores han
identificado una región intensificadora en el gen CYP3A4 capaz de
mediar en la activación transcripcional por parte de la
rifampicina.
rifampicina.
Mediante la utilización de una serie de
constructos de deleción de la región 5'-flanqueante
del gen CYP3A4, los presentes inventores han descubierto una
secuencia de ADN, situada aproximadamente a 7,5 kilobases en el
lado 5' del sitio de inicio transcripcional del gen de P450 CYP3A4
humano, que es responsable de la inducción transcripcional del gen
CYP3A4 por parte de inductores xenobióticos, incluyendo fármacos
terapéuticos. Los presentes inventores han denominado a dicho
elemento "módulo intensificador sensible a xenobióticos"
(XREM). Este trabajo inicialmente se llevó a cabo con el potente
inductor de CYP3A4 rifampicina, un antibiótico utilizado comúnmente
para tratar la tuberculosis. Sin embargo, algunos estudios
preliminares con otros fármacos sugieren que XREM podría ser capaz
de responder a un amplio abanico de compuestos químicos. Los
presentes inventores han utilizado la secuencia de ADN que contiene
XREM procedente de CYP3A4 para construir modelos de cultivo celular
que responden a inductores xenobióticos mediante el incremento de la
transcripción del gen CYP3A4 de una manera análoga a la que ocurre
en el ser humano.
Los presentes inventores cotransfectaron un
constructo de una región 5'-flanqueante de CYP3A4,
que contiene XREM y unida a un informador de luciferasa, en células
HepG2 con o sin un constructo de expresión hPXR
(pSG-hPXR). La adición de hPXR incrementó
sustancialmente la tasa de transcripción del constructo informador,
tanto constitutivamente (tratado con vehículo solo) y tras la
adición de un inductor xenobiótico (rifampicina 5 \muM). La
observación de que la adición de hPXR solo incrementa la tasa de
transcripción del informador que contiene CYP3A4 XREM indica que
hPXR es capaz de cierta transactivación en ausencia del ligando o
que existe un ligando endógeno para hPXR dentro de las células
HepG2.
Se ha demostrado que hPXR se une a elementos de
respuesta a ADN de acción en cis (PXRE) en forma de heterodímero
con el receptor de retinoide x (RXR). El PXRE aparentemente consiste
generalmente de una repetición de la secuencia TGAACT, en forma de
repetición directa o revertida/invertida. Los presentes inventores
han identificado varios elementos de respuesta putativos de
receptor nuclear (PXREs) dentro de XREM mostrados en la Tabla 1.
Los presentes inventores han llevado a cabo
experimentos de retardo de la movilidad en gel con sondas
oligonucleótidas marcadas con ^{32}P para determinar si los
heterodímeros hPXR-RXR son capaces de unirse a los
PXREs putativos dentro de XREM.
Para examinar adicionalmente la contribución de
los PXREs putativos dentro de la región XREM a la inducción
transcripcional de CYP3A4 por la rifampicina, se creó una serie de
constructos de informador de luciferasa que contenían deleciones
y/o mutagénesis dirigida a un sitio de los PXREs (figura 5). La
deleción de la región que contenía PXRE
XREM-DR3-1 (-7834 a -7610 pb)
resultó en la eliminación prácticamente completa de la actividad
transcripcional. Esto no se debió únicamente a la pérdida de función
de XREM-DR-3, debido a que la
mutagénesis dirigida a un sitio de dicho PXRE resultó en una
pérdida de actividad de sólo 47%. La mutación de
XREM-DR6 también redujo la tasa de transcripción
(hasta 52% de la del tipo salvaje) a pesar de la aparente
incapacidad de dicho motivo para unirse al heterodímero
hPXR-RXR en el experimento de retardo en gel. Una
posibilidad es que dicho sitio se una a otros factores de
transcripción o que sea un sitio de baja afinidad para
hPXR-RXR.
Podrá apreciarse que el PXRE putativo en el
interior de la región promotora proximal que consiste del motivo
Prox-ER6 no presenta función propia. Sin embargo, la
mutagénesis dirigida a un sitio de Prox-ER6 en un
constructo que contiene el XREM completo reduce la tasa de
transcripción (hasta 41% de la del tipo salvaje) (figura 5),
sugiriendo la existencia de cooperatividad entre XREM y
Prox-ER6.
XREM media en la inducción transcripcional del
gen CYP3A4 producida por muchos xenobióticos, no sólo la
rifampicina.
Muchos fármacos inducen la transcripción del gen
CYP3A4. Debido a sus potentes propiedades de inducción, los
presentes inventores utilizaron rifampicina para identificar y
caracterizar el XREM. Para determinar si un constructo informador
que contenía XREM era capaz de responder a otros xenobióticos, se
trataron células HepG2 transfectadas con XREM con un abanico de
fármacos (figura 4). Se encontró que RU-486
(mifaprostona) y clotrimazol inducían el constructo XREM de una
manera análoga a la producida in vivo. Los presentes
inventores también examinar un amplio abanico de fármacos que es
conocido que induce CYP3A4 in vivo, y encontraron que el
modelo in vitro desarrollado refleja estrechamente la
realidad in vivo.
La invención presenta varias áreas de
aplicación, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, el desarrollo
de fármacos terapéuticos. En algunas de dichas áreas de aplicación,
se utilizan constructos de ADN que contienen XREM para determinar
los efectos de compuestos sobre la transcripción del gen CYP3A.
Entre estos constructos se incluyen genes informadores que permiten
la medición cómoda de la actividad génica. Entre dichos genes
informadores se incluyen cloranfenicol acetiltransferasa,
luciferasa, fosfatasa alcalina y proteína fluorescente verde,
aunque podría utilizarse cualquier producto génico detectable,
incluyendo el ARN mensajero (ARNm). Dichos constructos génicos se
introducen transitoria o permanentemente en células en cultivo
adecuadas, o en forma de transgén en animales transgénicos. Pueden
cotransfectarse constructos de ADN adicionales conjuntamente con
constructos que contienen XREM para proporcionar condiciones
adecuadas para responder a preguntas particulares respecto a la
regulación del gen CYP3A. Entre dichos constructos cotransfectados
se incluyen los plásmidos de expresión para hPXR y
hCAR-\beta, que los presentes inventores han
demostrado que interaccionan con XREM. Los presentes estudios
también han demostrado que existen muchas interacciones de
proteína-ADN dentro de XREM, de manera que es
probable que otros constructos cotransfectados demuestren ser útiles
para determinadas situaciones.
Otro área de aplicación es la utilización de la
secuencia de XREM para examinar el ADN genómico humano para la
presencia de polimorfismos relevantes para la expresión del gen
CYP3A4. Dichos polimorfismos pueden relacionarse con varias áreas
de utilización, incluyendo la predicción de la capacidad
metabolizadora de fármacos y asociaciones con enfermedades.
La inducción de los enzimas de la subfamilia
CYP3A por parte de fármacos terapéuticos se considera generalmente
un efecto no deseable. Dicha inducción podría incrementar la
eliminación del fármaco mismo o de fármacos coadministrados. Esto
generalmente reduce la efectividad de los fármacos. La capacidad de
cribar fármacos potenciales para la inducción de CYP3A durante la
etapa temprana del desarrollo resulta útil en el aspecto de que
dichos fármacos pueden descartarse en favor de aquellos que no
presentan dicha actividad. La información obtenida de dicho cribado
de fármaco también permite desarrollar relaciones de
estructura-función, indicando las moléculas o
partes de moléculas que presentan una tendencia a inducir CYP3A4.
Este conocimiento permitiría la utilización del diseño racional de
fármacos para sintetizar nuevos compuestos que presentan
características más favorables. Este procedimiento puede aplicarse
a fármacos existentes que inducen no deseablemente los CYP3As, tales
como los listados en la
Tabla 2.
Tabla 2.
Además de los anteriormente indicados, existen
usos terapéuticos potenciales para fármacos diseñados
específicamente para inducir o inhibir la formación de enzima CYP3A
como su acción primaria. Pueden utilizarse inductores de CYP3A4
para acelerar el metabolismo de toxinas xenobióticas o sustancias
producidas endógenamente que son sustratos de CYP3A4. Los
inhibidores de CYP3A4 podrían utilizarse para superar la inducción
no deseable de CYP3A4 por parte de fármacos terapéuticos, tales
como los listados en la Tabla 2. SE apreciará que existen muchos
usos potenciales de los fármacos diseñados específicamente para
modular la formación del enzima CYP3A, diferentes de los indicados
en la presente memoria. La secuencia de XREM resulta útil para
identificar dichos fármacos.
XREM como herramienta para el análisis
farmacogenético/susceptibilidad a enfermedades.
Existen marcadas diferencias interindividuales
en la capacidad de las personas para metabolizar los compuestos
xenobióticos (tales como los fármacos terapéuticos) y los compuestos
endógenos (tales como hormonas secretadas endógenamente). Por lo
menos algunas de estas diferencias pueden relacionarse con
polimorfismos en los genes codificantes de los enzimas o proteínas
transportadoras que interaccionan con dichos xenobióticos o con
compuestos producidos endógenamente.
Algunos miembros de la superfamilia génica de
citocromos P450 se encuentran implicados en el metabolismo de un
amplio abanico de sustratos lipofílicos. Los P450s de la subfamilia
CYP3A (tales como CYP3A4) se encuentran particularmente implicados
en el metabolismo de fármacos terapéuticos y de hormonas esteroideas
producidas endógenamente. Se ha reconocido perfectamente que
existen marcadas diferencias interindividuales en el metabolismo de
los sustratos de CYP3A (de hasta 20 veces). Sin embargo, hasta al
momento no se han encontrado polimorfismos dentro de la región
codificante de la proteína CYP3A4 del gen CYP3A4 que expliquen
dichas diferencias. Esto sugiere fuertemente que es la regulación
de la expresión génica de CYP3A que explica dichas diferencias
interindividuales.
Los presentes inventores han demostrado que la
región XREM de CYP3A4 es un elemento regulador importante para el
control transcripcional de la expresión de dicho gen. Se infiere que
los polimorfismos dentro de XREM podrían afectar significativamente
a la transcripción génica y a la expresión de la proteína CYP3A4,
explicando de esta manera, por lo menos en parte, las diferencias
interindividuales en el metabolismo mediado por CYP3A.
Rebbeck y colaboradores recientemente han
descrito un polimorfismo en la región 5'-flanqueante
proximal del gen CYP3A4 que se correlaciona con formas más severas
de cáncer prostático [6] y una incidencia reducida de leucemia
secundaria a quimioterapia del cáncer [7]. Se supone que dicho
polimorfismo causó dichos cambios debido a efectos sobre la
expresión de CYP3A4, aunque esto todavía no ha sido demostrado.
De esta manera, la utilización de la secuencia y
función de XREM proporciona una herramienta potencialmente potente
para la búsqueda de polimorfismos del gen CYP3A. El cribado para
dichos polimorfismos resultaría de considerable utilidad para
determinar la capacidad de un individuo para metabolizar fármacos
(análisis farmacogenético) o para determinar la susceptibilidad a
enfermedades (por ejemplo el cáncer de próstata). El método para
llevar a cabo dicho cribado típicamente implica la amplificación de
la región de ADN genómico de interés (en el presente caso, XREM)
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A
continuación, el producto de PCR puede examinarse para
polimorfismos utilizando una de entre varias técnicas, tales como
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), la
secuencia del ADN o de polimorfismos conformacionales monocatenarios
(SSCP) de ADN.
Utilización de XREM como intensificador
inducible para la expresión génica en el contexto más amplio de la
biología molecular, la transgenética y la expresión génica
dirigida.
El concepto de la utilización de una parte de un
gen de citocromo P450 como interruptor genético se ha demostrado
anteriormente utilizando el gen CYP1A1. Debido a que la región XREM
del gen CYP3A4 es capaz de regular la transcripción en respuesta a
xenobióticos así como de determinadas hormonas esteroideas, resulta
potencialmente útil como interruptor genético dentro del contexto
más amplio de la biología molecular y la expresión génica dirigida.
Un ejemplo es la activación de un transgén en el hígado de un animal
mediante un mecanismo dependiente de PXR/XREM.
1. Lehmann JM, et al.
(1998) The human orphan nuclear receptor PXR is activated by
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interactions J Clin Invest 102:1015-1023.
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new pathway for CYP3A induction. Proc Natl Acad Sci USA
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Association of CYP3A4 genotype with
treatment-related leukemia. Proc Natl Acad
Sci USA 95:13176-81.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: University of Sydney
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Sydney
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Gales del Sur
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2006
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inducción xenobiótica de la expresión génica
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARATERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 632 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGAACTT GCTGACCCTC T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTGAAATC ATGTCGGTTC AAGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTGAATCA CAAGCTGAAC TTCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATATTGTT ATTGAACTAT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATGAACTC AAAGGAGGTC AGTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATGAACTT CATGAACTGT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: University of Sydney
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Sydney
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Gales del Sur
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2006
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inducción xenobiótica de la expresión génica
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 632 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGAACTT GCTGACCCTC T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTGAAATC ATGTCGGTTC AAGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTGAATCA CAAGCTGAAC TTCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS D ELA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATATTGTT ATTGAACTAT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATGAACTC AAAGGAGGTC AGTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATGAACTT CATGAACTGT C
\hfill21
Claims (7)
1. Constructo genético, que comprende:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que forma un intensificador transcripcional de la producción o expresión del citocromo P450 CYP3A4, y
- (ii)
- un gen codificante de una molécula de informador,
en el que la secuencia de nucleótidos incluye
cada uno de los elementos de respuesta nuclear siguientes de la
región 5'-flanqueante de CYP3A4: SEC ID nº 2, SEC ID
nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5.
2. Constructo genético según la reivindicación
1, en el que la secuencia de nucleótidos es SEC ID nº 1.
3. Constructo genético según la reivindicación 1
ó 2, que comprende además una secuencia de nucleótidos de secuencia
SEC ID nº 6.
4. Constructo genético según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula de ácidos nucleicos
forma un intensificador transcripcional que resulta activado en
respuesta a la rifampicina.
5. Constructo genético según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de informador es
la luciferasa de luciérnaga, la beta-galactosidasa,
la fosfatasa alcalina, la proteína fluorescente verde o la
cloranfenicol acetiltransferasa.
6. Célula que comprende un constructo genético
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Método para el cribado de un compuesto para
la inducción xenobiótica de la expresión de CYP3A4 en una célula,
que incluye exponer un constructo genético según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 a un compuesto y medir la inducción o el
potencial de expresión de la molécula de ácidos nucleicos
codificante de la molécula de informador.
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