ES2338105T3 - Anticuerpo monoclonal humano especifico para lipopolisacaridos (lps) de serotipo iats 06 pseudomonas aeruginosa. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende SEQ ID NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3, o un fragmento Fab o F(ab'')2 o una mezcla de los mismos; o un derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS, en donde el derivado es una muteína del anticuerpo monoclonal humano que lleva de una a cinco sustituciones conservadoras en cualquiera de las regiones CDR en la cadena pesada y/o ligera.
Description
Anticuerpo monoclonal humano específico para
lipopolisacáridos (LPS) de serotipo IATS O6 de Pseudomonas
aeruginosa.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal humano específico para el serotipo IATS O6 de P.
aeruginosa, un hibridoma que lo produce, ácidos nucleicos que lo
codifican y células huésped transfectadas con los mismos. Además,
la presente invención se refiere a métodos para producir dicho
anticuerpo monoclonal. Además, la presente invención se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo o
al menos un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.
Las enfermedades infecciosas emergieron
drásticamente durante las últimas décadas. Las enfermedades
infecciosas, incluyendo las infecciones respiratorias, son una de
las principales causas de enfermedad en el mundo. En 1998, las
enfermedades infecciosas se cobraron 16 millones de vidas y se
clasificaron como la segunda causa principal de muerte en el mundo.
Uno de los mayores problemas son las infecciones intrahospitalarias
o nosocomiales. Tales infecciones han aumentado desde 7,2/1000 días
de paciente en 1975 hasta 9,8/1000 días de paciente en 1995, un
aumento del 36%. Junto con S. aureus resistente a meticilina
(SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV), P.
aeruginosa es responsable de hasta el 34% de todas las
infecciones intrahospitalarias. Las principales víctimas de las
infecciones por P. aeruginosa son pacientes de fibrosis
quística, victimas de quemaduras, pacientes entubados, pacientes en
las unidades de cuidados intensivos, pacientes de cáncer y SIDA,
así como pacientes inmunosuprimidos que se han sometido a trasplante
de órganos.
Para la prevención de infecciones crónicas por
P. aeruginosa en pacientes de fibrosis quística, se ha
establecido una vacuna octavalente conjugada que consiste en los 8
serotipos de LPS más relevantes de P. aeruginosa acoplados a
toxina A detoxificada de P. aeruginosa para la inmunización
activa. Los estudios a largo plazo con esta vacuna han mostrado que
la proporción de pacientes infectados de forma crónica cayó desde
alrededor del 72% hasta el 32% a la edad de 18 años. Sin embargo, la
vacunación activa solo es posible en pacientes inmunocompetentes,
así como en situaciones previsibles. De esta manera, la mayoría de
las víctimas de P. aeruginosa no se pueden inmunizar
activamente con la vacuna octavalente. Debido a esto y debido al
hecho de que la mayoría de las cepas de P. aeruginosa son
multirresistentes, existe una necesidad de una herramienta
terapéutica alternativa para tratar a los pacientes infectados con
P. aeruginosa. Un intento es crear anticuerpos monoclonales
humanos basados en la tecnología de hibridomas o usando clonación de
repertorio por presentación en fagos.
Ambos métodos y los anticuerpos creados mediante
los mismos muestran serios inconvenientes.
La tecnología del hibridoma se basa en la
inducción de células B murinas de la especificidad deseada mediante
inmunización con un antígeno de elección e inmortalización mediante
fusión con un compañero de mieloma, que es el planteamiento clásico
de "Kohler y Milstein". Después de ello, la información
genética de un clon productor de anticuerpo se puede volver a
clonar y humanizar, bien mediante injerto de CDR o mediante la
tecnología de presentación en fago.
Se sabe que los anticuerpos monoclonales murinos
dirigidos contra LPS bacteriano reconocen epítopos diferentes que
los anticuerpo humanos. Por lo tanto, la generación de anticuerpos
monoclonales en ratones seguida por humanización no produciría
necesariamente el aislamiento de anticuerpos con la especificidad de
interés para su uso en seres humanos. Ha habido diferentes intentos
de generar anticuerpos monoclonales humanos contra grupos de LPS de
P. aeruginosa. Sin embargo, muchos de ellos carecen de
funciones efectoras y por lo tanto no eran protectores.
US-4834975 por Siadak et
al., divulga un anticuerpo monoclonal humano C5B7 que es
específico para LPS del inmunotipo 1 de Fisher de P.
aeruginosa (correspondiente a IATS O6). Dicho anticuerpo tiene
propiedades opsonofagocíticas y protege ratones in vivo a
una dosis de 50 \mug.
Según esto, un problema técnico subyacente a la
presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal humano
específico para LPS de un serotipo particular de P.
aeruginosa en donde el anticuerpo muestra gran capacidad de
protección, en particular in vivo.
El problema técnico se resuelve mediante los
anticuerpos monoclonales humanos como se definen a continuación.
Según la presente invención, se proporciona un
anticuerpo monoclonal humano específico para LPS del serotipo IATS
O6 de P. aeruginosa en donde la región variable de la cadena
ligera del anticuerpo comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ
ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en
donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo
comprende SEQ ID NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región
CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3; o un fragmento o derivado del
mismo capaz de unirse a dicho LPS.
La presente invención proporciona además un
hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal y los ácidos
nucleicos que codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo,
respectivamente. Además, la presente invención proporciona vectores
y células huésped, que comprenden el ácido nucleico. Además, se
proporcionan métodos para producir los anticuerpos monoclonales.
Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden
al menos un anticuerpo y/o al menos un ácido nucleico, y segundos
usos médicos de las mismas.
Sorprendentemente, se ha determinado que los
anticuerpos monoclonales humanos según la invención muestran gran
capacidad de protección. En particular, se demostró que el
anticuerpo monoclonal humano era opsonofagocítico in vitro.
Incluso más importante, los anticuerpos monoclonales según la
presente invención muestran capacidad de protección in vivo
determinada por la protección a septicemia en el modelo murino de
heridas por quemadura como se muestra en los ejemplos.
Según la presente invención el anticuerpo es
específico para el LPS del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa
y muestra un valor de opsonofagocitosis determinado usando bacterias
conjugadas a fluorescencia de menos de 0,01 \mug/ml. No se ha
descrito ningún anticuerpo en la técnica anterior que muestre
actividad opsonofagocítica.
Al contrario que los anticuerpos del estado de
la técnica, el anticuerpo monoclonal según la presente invención
reconoce aislados clínicos con gran especificidad. Se identificaron
38 de 38 muestras de pacientes infectados con P. aeruginosa
del serotipo IATS O6 usando este anticuerpo. Sin estar vinculados a
ninguna teoría, se asume que el anticuerpo monoclonal es capaz de
reconocer cada uno de los subtipos de IATS O6 conocidos en técnica
anterior. Esta propiedad hace el anticuerpo particularmente útil
para el diagnóstico y la terapia. De esta manera, el anticuerpo
según la presente invención muestra una fiabilidad insuperable.
El término "anticuerpo monoclonal humano"
como se usa aquí abarca cualquier anticuerpo monoclonal humano
parcial o total independientemente de la fuente de la que obtiene
el anticuerpo monoclonal. Se prefiere la producción del anticuerpo
monoclonal humano por un hibridoma. También se puede obtener el
anticuerpo monoclonal mediante ingeniería genética y en particular
injerto de CDR de los segmentos CDR como se define en las
reivindicaciones en anticuerpos monoclonales disponibles cambiando
las regiones CDR del anticuerpo base con los segmentos CDR
específicos como se define en las reivindicaciones.
El término "región CDR" significa la región
determinante de complementariedad de un anticuerpo, es decir, la
región que determina la especificidad de un anticuerpo por un
antígeno particular. Tres regiones CDR (CDR1 a CDR3) son
responsables de la unión al antígeno en la cadena pesada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de las regiones CDR en la cadena
pesada son como sigue:
Región CDR1, aminoácidos 31 a 35 en el exón
V_{H}
Región CDR2, aminoácidos 50 a 65 en el exón
V_{H}
Región CDR3, aminoácidos 95 y siguientes en el
exón V_{H}
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de las regiones CDR son
independientes de la clase de anticuerpo, es decir, IgM, IgA o
IgG.
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de las regiones CDR en la cadena
ligera kappa son como sigue:
Región CDR1, aminoácidos 24 a 34 en el exón
V_{\chi}
Región CDR2, aminoácidos 50 a 56 en el exón
V_{\chi}
Región CDR3, aminoácidos 89 y siguientes en el
exón V_{\chi}
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de la región CDR en la cadena
ligera lambda son como sigue:
Región CDR1, aminoácidos 23 a 36 en el exón
V_{\lambda}
Región CDR2, aminoácidos 49 a 60 en el exón
V_{\lambda}
Región CDR3, aminoácidos 88 y siguientes en el
exón V_{\lambda}
\vskip1.000000\baselineskip
Los alineamientos de aminoácidos en los exones
V_{H}, V_{\chi} y V_{\lambda} se pueden obtener del índice
Vbase
(http:www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901).
El término "serotipo" significa cualquier
serotipo conocido de P. aeruginosa. Se muestra una tabla de
concordancia de las diferentes nomenclaturas actualmente usadas para
los diferentes serotipos de P. aeruginosa en la tabla I de
la especificación.
El término "fragmento" significa un
fragmento Fab o F(ab')_{2} o una mezcla de los mismos.
El término "derivado" abarca una muteína
del anticuerpo monoclonal humano en donde la muteína lleva al menos
una sustitución conservadora en cualquiera de las CDR en la cadena
pesada y/o la cadena ligera como se indica en las reivindicaciones.
Más preferiblemente, la muteína no tiene más de 5, particularmente
preferido no más de 2 sustituciones conservadoras. La capacidad del
fragmento o derivado del anticuerpo de unirse al serotipo
particular de LPS se determina mediante ELISA directo como se
describe en la sección de materiales y métodos: el LPS particular
se inmoviliza en la fase sólida de las placas de ELISA. Los
fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos se incuban con
el LPS inmovilizado, y los anticuerpos o derivados de los mismos
unidos se visualizan mediante un anticuerpo secundario adecuado
conjugado con una enzima.
Según la presente invención, el término
"sustitución conservadora" significa un cambio de un aminoácido
que pertenece a un grupo físico-químico particular
con un aminoácido que pertenece al mismo grupo
físico-químico. Los grupos
físico-químicos se definen como sigue:
El grupo de los aminoácidos no polares
comprende: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina,
prolina, fenilalanina y triptófano. El grupo de los aminoácidos que
tienen cadenas laterales polares sin carga comprende asparraguina,
glutamina, tirosina, cisteína y cistina. El grupo
físico-químico de los aminoácidos que tienen una
cadena lateral polar cargada positivamente comprende lisina,
arginina e histidina. El grupo físico-químico de
aminoácidos que tienen una cadena lateral polar cargada
negativamente comprende ácido aspártico y ácido glutámico, también
denominados aspartato y glutamato.
Según la presente invención, se proporciona un
anticuerpo específico para LPS del serotipo IATS O6 de P.
aeruginosa como se ha explicado anteriormente.
Según una forma de realización adicional la
presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano
específico para LPS o el LPS del serotipo IATS O6 de P.
aeruginosa en donde
la región variable de la cadena ligera del
anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la
región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:8; o una variante de dicho anticuerpo
capaz de unirse a dicho LPS en donde la región variable de la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo es al
menos el 85% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de
la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos
el 85% homóloga a SEQ ID NO:8.
El término "homología" conocido para el
experto en la materia designa el grado de relación entre dos o más
moléculas de polipéptidos, que se determina mediante la conformidad
entre las secuencias. El porcentaje de "homología" se
determina del porcentaje de regiones homólogas en dos o más
secuencias, teniendo en cuenta las brechas u otras características
de secuencia.
La homología de polipéptidos mutuamente
relacionados se puede determinar por medio de procedimientos
conocidos. Como regla, se usan programas especiales de ordenador
con algoritmos que consideran los requerimientos especiales. Los
procedimientos preferidos para la determinación de la homología en
primer lugar generan la mayor conformidad entre las secuencias
estudiadas. Los programas informáticos para la determinación de la
homología entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados al
paquete de programas de CGC, incluyendo GAP (Devereux J et al.,
Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group
University of Wisconsin, Madison (WI); BLASTP, BLASTN y FASTA
(Altschul S et al., J. Molec. Biol. 215:
403-410 (1990)). El programa BLAST X se puede
obtener del Centro Nacional para Información en Biotecnología (NCBI)
y de otras fuentes (BLAST Handbook, Altschul S et al., NCB
NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., J. Mol. 215:
403-410 (1990)). También se puede usar el muy
conocido algoritmo de Smith Waterman para la determinación de
homología.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros preferidos para la comparación de
secuencias incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48
(1970), 443-453
Matriz de comparación: BLOSUM62 de Henikoff
& Henikoff, PNAS USA 89 (1992), 10915-10919
Penalización por brecha: 12
Penalización por longitud de brecha: 2
\vskip1.000000\baselineskip
El programa GAP también es adecuado para su uso
con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los
parámetros estándar (parámetros por defecto) para comparaciones de
secuencias de aminoácidos, en los que las brechas en los extremos
no disminuyen el valor de homología. Con secuencias muy pequeñas
comparadas a la secuencia de referencia, puede ser necesario además
aumentar el valor de expectativa hasta 100.000 y en algunos casos
reducir la longitud de palabra (tamaño de palabra) hasta 2.
Se pueden usar algoritmos modelo, penalizaciones
por brecha abierta, penalizaciones por extensión de brecha y
matrices de comparación adicionales incluyendo aquellos nombrados en
el manual del programa, Wisconsin Package, Versión 9, Septiembre
1997. La elección dependerá de la comparación a realizarse y además
de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, donde se
prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una gran base de
datos de secuencias, donde se prefieren FASTA o BLAST.
Una conformidad del 85% determinada con los
algoritmos anteriormente mencionados se describe como una homología
del 85%. Lo mismo se aplica para grados de homología mayores.
En la forma de realización preferida, las
muteínas según la invención tienen una homología de más del 95%.
Se prefiere además que la cadena ligera del
anticuerpo monoclonal humano según la presente invención sea de
tipo kappa o lambda. Particularmente preferido, la cadena ligera es
de tipo kappa. La cadena ligera puede ser bien una cadena natural
incluyendo una cadena ligera reorganizada de forma natural,
genéticamente modificada o de tipo sintético. Si el anticuerpo
según la presente invención que es específico para IATS O6 es de
tipo kappa, entonces se prefiere que la cadena ligera derive de la
línea germinal L12a
(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/VSEQ.php#L12a/PCRdil6-5+).
Según una forma de realización preferida
adicional, la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de la
presente invención se selecciona de todos los isotipos humanos, es
decir, IgM, IgA o IgG. Preferiblemente, la cadena pesada es del
tipo IgM. Si el anticuerpo es del tipo IgM, entonces muestra las
propiedades ventajosas de gran avidez por LPS de P.
aeruginosa, une de forma eficaz el complemento y de esta manera
media la muerte directa de las bacterias y/o opsoniza eficazmente
bacterias para fagocitosis. Además, IgM es resistente a la
degradación proteolítica por elastasa de P. aeruginosa,
mientras que otros isotipos como IgG o IgA se pueden degradar. Los
anticuerpos IgM son eficaces en cantidades bajas. De 1 a 4 \mug
por ratón fueron completamente protectores en el modelo murino de
septicemia por quemadura.
Se prefiere que la cadena pesada variable derive
de la línea germinal DP-75
(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/VSEQ.
php#DP-75/V1-2...+).
php#DP-75/V1-2...+).
La cadena ligera y la cadena pesada pueden estar
unidas covalentemente como un anticuerpo de cadena sencilla (por
ejemplo, scFv bivalente, scFv bifuncional y scFv biespecífico) o
unidas de forma no covalente entre sí.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, el anticuerpo monoclonal humano es de secuencia
de aminoácidos completamente humana.
"Consiste completamente en secuencia de
aminoácidos humana" significa que la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo monoclonal humano deriva de una línea germinal humana.
Esto se puede obtener de diferentes modos. Por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal humano que consiste en secuencias humanas de
aminoácidos se puede obtener de un hibridoma en donde la célula B
es una célula B humana. De forma alternativa, el anticuerpo
monoclonal humano se puede obtener mediante injerto de CDR de las
regiones CDR como se indica en las reivindicaciones en anticuerpos
monoclonales humanos disponibles produciendo de esta manera un
anticuerpo monoclonal humano específico para un serotipo de LPS de
P. aeruginosa según la presente invención.
La secuencia de aminoácidos completamente humana
del anticuerpo monoclonal humano previene la aparición de efectos
secundarios no deseados como reacciones de rechazo o choque
anafiláctico.
Adicionalmente preferido, el anticuerpo
monoclonal humano muestra reconocimiento esencialmente antigénico
humano. "Reconocimiento esencialmente antigénico humano"
significa que el reconocimiento antigénico por el anticuerpo
monoclonal humano según la presente invención es esencialmente
idéntico al reconocimiento de antígeno por un individuo humano
sano. En particular, se requiere que las partes Fc de la cadena
ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humano sean de tipo
humano para asegurar la interacción con el sistema del complemento
humano y para reducir el riesgo de generación de los denominados
HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón).
Según una forma de realización preferida
adicional, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención
se puede obtener a partir de una célula B humana o un hibridoma
obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una célula de
mieloma o heteromieloma.
Las células B humanas se pueden obtener mediante
inmunización de individuos sanos o pacientes y posterior recogida
de muestras de sangre de las que se pueden aislar células B de una
manera conocida (Current Protocols in Immunology. Capítulo 7.1.
Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord
blood. Publicado por Wiley & sons, Eds: JC Coligan et
al.). La célula B humana se puede fusionar con un mieloma o
heteromieloma para producir un hibridoma según técnicas conocidas
según el planteamiento clásico de Kohler y Milstein. Las células de
mieloma adecuadas son derivados de P3X63 tales como P3X63Ag8.653
(ATCC CRL-1580) o SP2/0 (ATCC
CRL-1646). Las células de heteromieloma adecuadas
son por ejemplo, F3B6 (ATCC HB-8785). El hibridoma
resultante se puede seleccionar según procedimientos conocidos. Los
hibridomas se cultivan en un medio de cultivo adecuado y el
anticuerpo producido se recupera del sobrenadante.
Además, la presente invención proporciona ácidos
nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera,
respectivamente, del anticuerpo monoclonal humano de la presente
invención. El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico natural
derivado de la línea germinal o de reorganización que se produce en
células B, de forma alternativa los ácidos nucleicos pueden ser
sintéticos. Los ácidos nucleicos sintéticos también incluyen ácidos
nucleicos que tienen modificados los enlaces internucleósidos
incluyendo fosfotioéster para aumentar la resistencia de los ácidos
nucleicos a la degradación. El ácido nucleico puede estar manipulado
genéticamente o producido sintéticamente por completo mediante
síntesis de nucleótidos.
La presente invención proporciona además
vectores que comprenden al menos un ácido nucleico que codifica la
cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano de la presente
invención y/o al menos un ácido nucleico que codifica la cadena
pesada del anticuerpo monoclonal humano de la presente invención.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en el mismo vector o
pueden estar presentes en forma de vectores binarios. El vector
preferiblemente comprende el promotor unido operativamente al ácido
nucleico para facilitar la expresión del ácido nucleico que
codifica la cadena ligera y/o pesada. Preferiblemente, el vector
también incluye un origen para la replicación y mantenimiento en
una célula huésped. El vector también puede comprender una secuencia
de nucleótidos que codifica una secuencia señal localizada 5' del
ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada. La
secuencia señal puede facilitar la secreción al medio de la cadena
codificada.
Preferiblemente, el vector deriva de adenovirus,
virus de la vacuna, baculovirus, virus SV40, retrovirus, virus de
plantas o bacteriófagos tales como derivados de lambda o M13. El
vector particularmente preferido es un vector que contiene las
regiones constantes de las cadenas pesadas de las Ig humanas y
cadenas ligeras humanas, tal como el sistema de vector integrado
para expresión eucariota de inmunoglobulinas descrito por Persic y
col. (Persic et al. 1997. Gene. 187(1):
9-18).
El vector puede comprender además una secuencia
de nucleótidos que codifica una etiqueta His que produce la
expresión de una construcción para producir un producto de fusión
con una etiqueta His en el extremo N-terminal de la
cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal humano que
facilita la purificación de la proteína en una columna de níquel
mediante formación de quelatos.
Además, la presente invención proporciona
células huésped que comprenden el vector y/o el ácido nucleico
adecuadas para la expresión del vector. En la técnica se conocen
numerosos sistemas de expresión procariotas y eucariotas en donde
se prefieren células huésped eucariotas tales como células de
levadura, células de insecto, células vegetales y células de
mamífero tales como células HEK293, células PerC6, células CHO,
células COS o células HELA y derivados de las mismas.
Particularmente preferidas son líneas celulares de producción
humana. Se prefiere que las células huésped transfectadas secreten
el anticuerpo producido al medio de cultivo. Si se alcanza
expresión intracelular, se realiza renaturalización según
procedimientos estándar tales como por ejemplo, Benetti PH et
al., Protein Expr Purif Agosto; 13:283-290,
(1998).
La presente invención también proporciona
métodos para producir el anticuerpo monoclonal humano. En una forma
de realización, el anticuerpo monoclonal humano se produce
cultivando el hibridoma descrito anteriormente. El anticuerpo
monoclonal producido se secreta al sobrenadante y se puede purificar
a partir del mismo aplicando técnicas cromatográficas
convencionales.
De forma alternativa, el anticuerpo monoclonal
humano es producido por la célula huésped que comprende un vector
según la presente invención y cultivando la célula huésped en
condiciones adecuadas para la expresión recombinante de la cadena
de anticuerpo codificada. Preferiblemente, la célula huésped
comprende al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera
y al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y es
capaz de ensamblar el anticuerpo monoclonal humano de modo que se
genera una estructura tridimensional que es equivalente a la
estructura tridimensional de un anticuerpo monoclonal humano
producido por una célula B humana. Si la cadena ligera se produce
por separado de la cadena pesada, entonces ambas cadenas se pueden
purificar y posteriormente ensamblar para producir un anticuerpo
monoclonal humano que tiene esencialmente la estructura
tridimensional de un anticuerpo monoclonal humano producido por una
célula B humana.
El anticuerpo monoclonal humano también se puede
obtener mediante expresión recombinante de la cadena ligera y/o
pesada codificada en donde el ácido nucleico se produce mediante el
aislamiento de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo
monoclonal humano de una manera conocida y el injerto de la
secuencia de ácido nucleico que codifica las CDR como se define en
las reivindicaciones en el ácido nucleico aislado.
Según una forma de realización preferida
adicional, el anticuerpo monoclonal humano según la presente
invención está modificado. Las modificaciones incluyen di-, oligo-
o polimerización de la forma monomérica, por ejemplo mediante
entrecruzamiento usando diciclohexilcarbodiimida. Los di-, oligo- o
polímeros producidos de esta manera se pueden separar mediante
filtración en gel. Las modificaciones adicionales incluyen
modificaciones de la cadena lateral, por ejemplo modificaciones de
los residuos de
\varepsilon-amino-lisina o
modificaciones de los extremos amino y carboxi terminales,
respectivamente. Modificaciones adicionales incluyen modificaciones
postraduccionales, por ejemplo, glicosilación y/o desglicosilación
parcial o total de la proteína y formación de puentes disulfuro. El
anticuerpo también se puede conjugar a un marcador, tal como un
marcador enzimático, fluorescente o radioactivo.
La presente invención proporciona además
composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo
monoclonal humano y/o al menos un ácido nucleico que codifica una
cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal humano.
La composición farmacéutica puede comprender
además ingredientes farmacéuticamente aceptables conocidos en la
técnica.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas
se aplican para el tratamiento de enfermedades producidas por P.
aeruginosa en infecciones tales como septicemia, bronquitis
crónica, infecciones locales, principalmente en paciente
inmunodeprimidos y/o en pacientes con función respiratoria
deteriorada. Las composiciones farmacéuticas están pensadas además
para la profilaxis y/o tratamiento de infecciones intrahospitalarias
(nocosomiales). Puesto que las víctimas principales de infecciones
por P. aeruginosa son pacientes de fibrosis quística,
víctimas de quemaduras, pacientes entubados, pacientes en unidades
quirúrgicas y/o de cuidados intensivos, pacientes de cáncer y SIDA,
pacientes inmunodeprimidos, pacientes inmunosuprimidos, pacientes
diabéticos, así como adictos a drogas intravenosas, las
composiciones farmacéuticas están pensadas en particular para la
profilaxis y/o tratamiento de enfermedades causadas por P.
aeruginosa en dicho grupo de pacientes.
La composición farmacéutica puede comprender
además fármacos antibióticos, preferiblemente acoplados al nuevo
anticuerpo monoclonal.
Las composiciones farmacéuticas comprenden el
nuevo anticuerpo monoclonal en un rango de concentración de
0,5-8 mg/kg de peso corporal.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar de cualquier forma conocida tales como administración
intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea,
intraperitoneal, tópica, intranasal o como un nebulizador de
inhalación.
La presente invención también proporciona un kit
de prueba para el diagnóstico de infecciones por P.
aeruginosa que comprende al menos un anticuerpo monoclonal
humano de la presente invención y opcionalmente ingredientes
adecuados adicionales para llevar a cabo la prueba de
diagnóstico.
El kit de prueba es adecuado para el diagnóstico
fiable específico de una infección por P. aeruginosa. Un
ensayo de prueba se puede basar en una prueba ELISA convencional en
forma líquida o unida a membrana. La detección puede ser directa o
indirecta como se conoce en la técnica en donde el anticuerpo se
conjuga opcionalmente a un marcador enzimático, fluorescente o
radiactivo.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
pero no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención.
Formas de realización adicionales serán evidentes para el experto en
la materia al estudiar la especificación y teniendo en cuenta el
conocimiento general normal.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 se refiere a la secuencia de ADN y
aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 310BO6.
La figura 2 se refiere a la secuencia de ADN y
aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa de
310BO6.
La figura 3 se refiere al análisis por
inmunotransferencia de la especificidad de serotipo del anticuerpo
monoclonal 310BO6. La figura 3a muestra una tinción con plata de LPS
de diferentes serotipos separados en SDS PAGE. La figura 3b muestra
un análisis de inmunotransferencia de LPS de diferentes serotipos
separados en SDS PAGE usando el anticuerpo monoclonal 310BO6.
La figura 4 se refiere al patrón de
reconocimiento de aislados clínicos de P. aeruginosa del
serotipo IATS O6 por el anticuerpo monoclonal 310BO6 en comparación
con otro anticuerpo monoclonal específico para IATS O6.
La figura 5 se refiere a la actividad
opsonofagocítica del anticuerpo monoclonal 310BO6 dirigido contra el
serotipo IATS O6 de P. aeruginosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales y métodos se han
usados en los ejemplos 1 a 4:
Para el cribado y análisis de anticuerpos en
sobrenadantes de cultivos celulares, se realizó un ELISA como se ha
descrito en otra parte (Cryz, S.J. et al., 1987. J. Clin.
Invest. 80(1):51-56) con algunos cambios.
Brevemente, se prepararon soluciones madre de LPS, lipopolisacárido
de P. aeruginosa (producido internamente) a una
concentración de 2 mg/ml en trietilamina 36 mM. Para el
recubrimiento, la solución se diluyó a 10 \mug/ml en PBS que
contenía azida de sodio al 0,02% (PBS-Az). Esta
solución se mezcló con un volumen igual de seroalbúmina humana
metilada a 10 \mug/ml (HSA; producida internamente como sigue: se
disolvieron 2 g de HSA liofilizada en 200 ml de metanol absoluto.
Después de añadir 1,68 ml de HCl al 37%, la solución se almacenó
durante al menos 3 días a temperatura ambiente en la oscuridad con
agitación ocasional. El precipitado se recoge mediante una
centrifugación de 10 minutos (4500 rpm, rotor GS1), y se lava dos
veces con metanol absoluto y dos veces con éter anhídrido
resuspendiendo el precipitado en el disolvente. El precipitado se
seca durante 2 horas en un desecador y el precipitado seco se
resuspende en H_{2}O y se almacena en alícuotas a -20ºC. La
concentración de proteína fue de 0,85 mg/ml) en
PBS-Az agitando suavemente durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Se recubrieron placas de ELISA de NUNC® con
la solución LPS-HSA a 100 \mul/pocillo durante la
noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas 3 veces
con 300 \mul de PBS a pH 7,4 (producido internamente) que
contenía Tween20 al 0,05% (#93773; Fluka Chemie AG, Suiza)
(PBS-T), se incubaron los sobrenadantes de cultivos
celulares diluidos 1:2 en PBS durante 2 horas a 37ºC. Después de
lavar las placas 3 veces con PBS-T, los anticuerpos
unidos se detectaron con anticuerpo de cabra
anti-IgM humano conjugado a peroxidasa de rábano (#
074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc. Gaithersburg, MD) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT al 5%
(v/v). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se lavaron 3
veces con PBS-T. La unión del anticuerpo se
visualizó añadiendo 100 \mul/pocillo de OPD (ortofenildiamina 0,4
mg/ml en ácido cítrico 24 mM e hidrogenofosfato de disodio 52 mM
que contenía solución sustrato de H_{2}O_{2} al 0,0012% (V/V).
La reacción de color se paró después de 2-3 minutos
mediante la adición de 50 \mul/pocillo de HCl 1 M. La densidad
óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm usando el software
Softmax Pro®.
Para la cuantificación de IgM en los
sobrenadantes de cultivos celulares, las placas de ELISA se
recubrieron con anticuerpo de cabra anti-IgM humano
sin conjugar a 1 \mug/ml en PBS durante la noche a 4ºC. Las placas
se lavaron 3 veces con PBS-T y se incubaron los
sobrenadantes celulares y los estándares en diluciones de dos
veces. Como estándar se usó suero humano estándar (Behring)
empezando a una concentración de 0,5 \mug/ml. Todas las
diluciones se hicieron en PBS-T. Las placas se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en una mesa
oscilante. Después de lavar las placas 3 veces con
PBS-T, los anticuerpos unidos se detectaron con
anticuerpo de cabra anti-IgM humano conjugado a
peroxidasa de rábano (KPL) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT
al 5% (v/v). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura
ambiente en una mesa oscilante y se lavaron 3 veces con
PBS-T. La unión de anticuerpo se visualizó añadiendo
150 \mul/pocillo de solución sustrato OPD. La reacción de color
se paró después de 1 minuto mediante adición de 50 \mul/pocillo de
HCl 1 M. La densidad óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm
usando software Softmax Pro®.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN de células de hibridoma usando el
kit RNeasy de Qiagen. Se sintetizó el ADNc con la tecnología SMART
(Becton Dickenson). Para la PCR de la segunda hebra se usaron los
siguientes cebadores (Tabla III): (1) IgM constante inverso (con
\mu): 5'-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC
G-3' (SEQ ID NO:11); (2) kappa constante inverso
(con \kappa): 5'-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT
CC-3' (SEQ ID NO:12). Los cebadores directos estaban
incluidos en el kit SMART. Para la secuenciación se han usado los
siguientes cebadores: (3) secuencia IgM (seq \mu):
5'-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3' (SEQ
ID NO:13) y (4) secuencia kappa (seq \kappa):
5'-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3' (SEQ
ID NO:14). La secuenciación se realizó en Microsynth AG (Balgach,
Suiza) y las secuencias se compararon con las secuencias de línea
germinal existentes usando el software V-Base
DNAplot
(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron LPS de diferentes serotipos
(producidos internamente) (Tabla I) en un gel en gradiente de
poliacrilamida con SDS en condiciones reductoras (gel preformado
del 4-15%; BioRad). Después de la separación (15
mA/gel, 60 minutos), el gel se transfirió a filtros de
nitrocelulosa y los sitios libres de unión se bloquearon con PBS
que contenía SFT al 5% (V/V). La nitrocelulosa se incubó en
sobrenadante celular sin diluir durante 2 horas a temperatura
ambiente en una mesa oscilante. Después de lavar 3 veces en
PBS-T y 2 veces en PBS, el filtro de nitrocelulosa
se incubó con anticuerpo de cabra anti-IgM humano
conjugado a fosfatasa alcalina diluido 1:500 en PBS que contenía
SFT al 5% (V/V) durante 90 minutos a temperatura ambiente en una
mesa oscilante. Después de lavar 3 veces en PBS-T y
2 veces en PBS, los anticuerpos unidos se visualizaron usando el
sustrato de fosfatasa alcalina BCIP/NBT (fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indoilo/nitroazul
de tetrazolio) (KPL), y la reacción de color se paró después de 5
minutos con
H_{2}O.
H_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer bacterias de diferentes
aislados clínicos (véase la tabla II) en medio de Luria a 37ºC
hasta una densidad óptica a 600 nm de 1, y se fijaron en formalina
al 37% (concentración final de formalina: 0,5%) durante la noche a
37ºC. Las bacterias fijadas se diluyeron 1:50 en PBS y se
inmovilizaron en placas de ELISA. Después de bloquear las placas
con PBS que contenía suero fetal de ternera al 5% (v/v), se
incubaron el anticuerpo monoclonal 310BO6 y otro anticuerpo
monoclonal, ambos dirigidos contra el serotipo IATS O6 de P.
aeruginosa, con las bacterias fijadas durante 2 horas a 37ºC.
Después de lavar las placas 3 veces con PBS-T, los
anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo de cabra
anti-IgM humano conjugado a peroxidasa de rábano (#
074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc. Gaithersburg, MD) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT al 5%
(v/v). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se lavaron 3
veces con PBS-T. La unión de anticuerpo se
visualizó añadiendo 100 \mul/pocillo de OPD (ortofenildiamina 0,4
mg/ml en ácido cítrico 24 mM e hidrogenofosfato de disodio 52 mM
que contenía solución sustrato de H_{2}O_{2} al 0,0012% (V/V).
La reacción de color se paró después de 2-3 minutos
mediante la adición de 50 \mul/pocillo de HCl 1 M. La densidad
óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm usando software
Softmax Pro®.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la actividad biológica, se
ensayó la actividad opsonofagocítica de los anticuerpos monoclonales
anti-LPS de P. aeruginosa. Para este fin, se
hicieron crecer bacterias de P. aeruginosa, del serotipo
IATS O6, según la tabla 1, en medio TSBG (medio tríptico de soja 30
g/l que contenía glucosa al 1% (peso/volumen)) durante la noche.
Después de lavar dos veces las bacterias con PBS frío, el
precipitado bacteriano se resuspendió en 5 ml de tampón bicarbonato
0,1 M, pH 8,0. Se añadieron 50 \mul de éster succinimidílico de
5-(y -6)-carboxifluoresceína
(5(6)-FAM, SE; Molecular Probes, Eugene, OR;
10 mg/ml en dimetilsulfóxido), y se incubaron a 37ºC durante 1
hora. Las bacterias se fijaron mediante adición de 100 \mul de
formaldehído al 37% e incubación durante la noche a 37ºC. Para
eliminar el colorante no conjugado, las bacterias se lavaron 6 veces
mediante centrifugación y resuspensión en 20 ml de PBS estéril
frío. Las bacterias marcadas se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Para
el ensayo, se diluyó una alícuota de las bacterias hasta una
densidad óptica a 550 nm de 1, seguido por una dilución 1:50 en
HBSS-BSA (solución equilibrada de sales de Hanks que
contenía BSA al 0,1%). Se mezclaron 20 \mul de las bacterias con
10 \mul de diferentes diluciones de sobrenadante de cultivo
celular de hibridoma que contenían el anticuerpo monoclonal 310BO6,
o un anticuerpo monoclonal control no específico, respectivamente.
Después de 30 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 10 \mul
de suero de gazapo (Charles River Laboratories, Alemania) como
fuente de complemento, y se incubaron las sondas durante otros 30
minutos a 37ºC. Se añadieron 40 \mul de células
HL-60 diferenciadas (la línea celular promielocítica
HL-60 se diferenció a células granulocíticas
incubando las células durante 3 días en medio de Dulbecco modificado
por Iscoves (IMDM; Sigma) suplementado con suero fetal de ternera
al 10% (v/v) y dimetilformamida 100 mM) a las bacterias opsonizadas
para obtener una concentración final de 1,25 x 10^{6} células/ml.
Después de incubar durante 90 minutos a 37ºC en un agitador, las
células se recogieron transfiriéndolas a 2 ml de tampón de lavado de
células (PBS con azida al 0,02% (v/v); Becton Dickenson). Después
de centrifugar durante 5 minutos a 250 x g, el precipitado celular
se resuspendió en 150 \mul de tampón de lavado celular y se
analizó mediante citometría de flujo. Se determinó la actividad
opsonofagocítica positiva analizando la fluorescencia verde de las
células HL-60 en comparación con la tinción de
fondo. La tinción de fondo se determinó incubando las bacterias
conjugadas con fluoresceína en presencia de complemento con células
HL-60.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la capacidad protectora in
vivo de los anticuerpos monoclonales anti-LPS de
P. aeruginosa en el modelo murino de septicemia por
quemaduras. Los ratones NMRI (18-20 g; Charles River
Laboratories) recibieron aproximadamente de 1 a 5 \mug en un
volumen de 0,2 ml de los anticuerpos monoclonales por vía
intravenosa 4 horas antes de la provocación. Como control, se
inyectaron 0,2 ml de sobrenadante de anticuerpo inespecífico. Para
la provocación, se anestesiaron grupos de 5 ratones hembra en una
atmósfera de
3-cloro-1,1,2-trifluoroetil-difluorometil-éter
(Ethrane, Abbott Lab., Chicago, IL). Los ratones se sometieron a 10
segundos de abrasión con etanol en un área de 2 cm^{2} del lomo.
Se inyectaron inmediatamente diferentes concentraciones (en el
intervalo de 70 cfu/ratón a 70.000 cfu/ratón) de los organismos de
provocación (P. aeruginosa IATS O6; cepa PA220; véase la
tabla 1) resuspendidos en 0,5 ml de PBS por vía subcutánea en la
zona quemada. Los animales se observaron durante 5 a 7 días. Se
determinó la capacidad protectora dividiendo la DL_{50} de los
ratones protegidos por la DL_{50} de ratones control que habían
recibido el sobrenadante del anticuerpo inespecífico.
\vskip1.000000\baselineskip
La especificidad del anticuerpo se determina
mediante la secuencia de ADN y aminoácidos, respectivamente. Se
determinaron las secuencias de ADN de los fragmentos variables de
las cadenas pesada y ligera. Brevemente, se aisló el ARN total de
las células de hibridoma, y se sometió a transcripción inversa para
dar ADNc completo usando la tecnología SMART. En este
planteamiento, se añadió un cebador universal al extremo 5' del
ADNc. Usando este cebador y los cebadores específicos C\kappa y
C\mu representados en la tabla III, se amplificaron mediante PCR
las regiones variables y las regiones constantes de IgM y kappa. Los
fragmentos de PCR se purificaron después mediante escisión de geles
de agarosa y se usaron como moldes para secuenciación con los
cebadores representados en la tabla III.
Las secuencias de las regiones variables se
compararon posteriormente con el índice Vbase. Los resultados con
la comparación con las secuencias de la línea germinal se expresan
como número de mutaciones de "reemplazo y silenciosas" (R:S),
como se representa en la tabla IV. Las secuencias de ADN y
aminoácidos se representan en las figuras 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la monorreactividad del anticuerpo
monoclonal dirigido contra el LPS de P. aeruginosa de
serotipo IATS O6 mediante inmunotransferencia. Se separaron las
preparaciones de LPS de P. aeruginosa de diferentes
serotipos como se representan en la tabla I mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se
incubaron con el sobrenadante del cultivo de células de hibridoma
que contenía el anticuerpo monoclonal 310BO6 dirigido contra el
serotipo IATS O6 de P. aeruginosa y los anticuerpos unidos
se detectaron mediante anticuerpo de cabra anti-IgM
humano conjugado con fosfatasa alcalina y sustrato de color. Como
se muestra en la figura 3, el anticuerpo monoclonal 310BO6 sólo
reacciona con el LPS del serotipo IATS O6.
\vskip1.000000\baselineskip
En comparación con otro anticuerpo monoclonal
humano contra P. aeruginosa de serotipo IATS O6, 310BO6
reconoce un amplio rango de aislados clínicos de P.
aeruginosa de serotipo IATS O6, que pertenecen a diferentes
subtipos de IATS O6. Como se demuestra en la figura 4 en un ELISA en
células enteras, 310BO6 reconoce intensamente todos los aislados
clínicos probados, mientras que el anticuerpo adicional reaccionó
selectivamente con PA220. En este ensayo, las bacterias de los
diferentes aislados de P. aeruginosa de serotipo IATS O6 se
usaron según los métodos descritos anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede medir la eficacia protectora de los
anticuerpos anti-LPS de P. aeruginosa in
vitro mediante la capacidad de opsonizar bacterias, seguida por
fagocitosis. Para la determinación de la actividad de opsonización
de 310BO6, se incubaron P. aeruginosa de serotipo IATS O6
(cepa PA220) conjugadas con fluoresceína en presencia o ausencia de
complemento con concentraciones crecientes (1
ng/ml-3\mug/ml) del anticuerpo monoclonal 310BO6
dirigido contra P. aeruginosa de serotipo IATS O6, seguido
por incubación con células granulocíticas humanas (células
HL-60 diferencias con dimetilformamida). Estas
células fagocitaron P. aeruginosa de serotipo IATS O6 tras
opsonización por 310BO6 y complemento.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ejemplo 4 se demostró la función efectora
in vitro del anticuerpo monoclonal 310BO6 contra P.
aeruginosa de serotipo IATS O6. Sin embargo, un anticuerpo con
potencial terapéutico debe ser activo no solo in vitro sino
también in vivo. Esta actividad in vivo de 310BO6 se
demostró mediante la prevención de septicemia en el modelo de
murino de septicemia por quemaduras. En este modelo, los ratones
recibieron sobrenadante de cultivos de hibridoma que contenían 5
\mug de anticuerpo 310BO6 dirigido contra P. aeruginosa de
serotipo IATS O6 o, como control, sobrenadante de cultivo celular de
otra línea celular de hibridoma humano que produce un anticuerpo
humano IgM/\kappa inespecífico, 4 horas antes de la provocación.
Para inducir el choque séptico por quemaduras, los ratones se
anestesiaron y se sometieron a 10 segundos de abrasión con etanol
en el lomo. Inmediatamente después de la quemadura, los ratones se
provocaron con al menos tres registros diferentes de P.
aeruginosa de serotipo IATS O6 (de 70 cfu/ratón a 7.000
cfu/ratón en el grupo control que recibió anticuerpo monoclonal
inespecífico y de 700 cfu/ratón a 70.000 cfu/ratón en el grupo que
recibió 310BO6) resuspendidos en 0,5 ml de PBS. Los ratones se
observaron durante 5 a 7 días, y el potencial protector de los
anticuerpos se expresó como veces de aumento en los títulos de la
DL_{50} de bacterias de provocación (tabla V). Se calculó la
dosis letal (50%; DL_{50}) según el método de Reed y Muench (Reed,
L.J. y Muench, H., 1938. Amer. J. Hyg. 27:493).
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Berna Biotech
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo monoclonal humano
específico para lipopolisacáridos (LPS) de serotipo IATS O6 de
Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> seq26888-01996
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera de CDR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera de CDR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera de CDR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de CDR1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip1cm10
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<210> 5
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de CDR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
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<210> 6
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<211> 15
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de CDR3
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<400> 6
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\hskip1cm12
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<210> 7
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<211> 107
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de la cadena
ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de la cadena
pesada
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de la cadena
pesada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 321
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de la cadena
ligera
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 372
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de la cadena
pesada
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacgctgc tcgtatccga cg
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcaggcaca caacagaggc agttcc
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgctcgta tccgacgg
\hfill18
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<210> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaacagag gcagttcc
\hfill18
Claims (21)
1. Anticuerpo monoclonal humano específico para
el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS O6 de P.
aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada,
en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo
comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región
CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable
de la cadena pesada del anticuerpo comprende SEQ ID NO:4 en la
región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la
región CDR3, o un fragmento Fab o F(ab')_{2} o una mezcla
de los mismos; o un derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS,
en donde el derivado es una muteína del anticuerpo monoclonal
humano que lleva de una a cinco sustituciones conservadoras en
cualquiera de las regiones CDR en la cadena pesada y/o ligera.
2. Anticuerpo monoclonal humano específico para
LPS del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa en donde la región
variable de la cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada
tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; o una variante de
dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS en donde la secuencia
de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del
anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia
de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8.
3. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2 en donde la cadena ligera es de tipo
kappa.
4. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2 en donde la cadena ligera es de tipo
lambda.
5. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 en donde la cadena pesada es del tipo
IgM, IgA o IgG.
6. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 en donde el anticuerpo consiste
completamente en secuencia humana de aminoácidos.
7. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 en donde el anticuerpo muestra
reconocimiento antigénico humano.
8. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 en donde el anticuerpo está modificado
en el N-terminal, internamente y/o en el
C-terminal.
9. Anticuerpo monoclonal humano de la
reivindicación 8 en donde la modificación se selecciona de al menos
una de oligomerización y conjugación a un fármaco y/o un
marcador.
10. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7 obtenible de una célula B humana o un
hibridoma obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una
célula de mieloma o heteromieloma.
11. Hibridoma capaz de producir el anticuerpo
monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó
10.
12. Ácido nucleico que codifica la cadena ligera
del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 ó 10.
13. Ácido nucleico que codifica la cadena pesada
del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 ó 10.
14. Vector que comprende al menos un ácido
nucleico que codifica la cadena ligera de la reivindicación 12 y/o
al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de la
reivindicación 13.
15. Vector según la reivindicación 14, en donde
el vector también comprende un promotor unido operativamente al
ácido nucleico para facilitar la expresión del mismo.
16. Célula huésped que comprende el vector de la
reivindicación 14 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 12 ó
13.
17. Un método para producir el anticuerpo
monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10
que comprende los pasos de cultivar el hibridoma de la
reivindicación 11 en condiciones que permitan la secreción de un
anticuerpo, y para cultivar la célula huésped de la reivindicación
16 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo
monoclonal humano.
\newpage
18. Composición farmacéutica que comprende al
menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y/o al menos un ácido nucleico de la
reivindicación 12 ó 13.
19. Uso del anticuerpo monoclonal humano de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o del ácido nucleico de
la reivindicación 12 ó 13 para la preparación de un medicamento para
la profilaxis y/o tratamiento de una infección por P.
aeruginosa en un paciente humano.
20. Uso según la reivindicación 19 en donde la
infección por P. aeruginosa es una infección
intrahospitalaria.
21. Kit de prueba para el diagnóstico de una
infección por P. aeruginosa en una muestra que comprende al
menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y/o al menos un ácido nucleico de la
reivindicación 12 ó 13.
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