ES2338138T3 - Proceso para la preparacion de mezclas de polipeptidos utilizando acido bromhidrico purificado. - Google Patents
Proceso para la preparacion de mezclas de polipeptidos utilizando acido bromhidrico purificado. Download PDFInfo
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Abstract
En un proceso para obtener acetato de trifluroacetil glatiramer, donde durante el proceso se desprotege un lote de una mezcla de polipéptidos, cada uno de los cuales consiste esencialmente de alanina, glutamato de gama-bencilo, tirosina y trifluoroacetil lisina con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, comprende la mejora una etapa de pretratamiento de la solución con ácido bromhídrico con un consumidor de bromo con el fin de remover el bromo libre.
Description
Proceso para la preparación de mezclas de
polipéptidos utilizando ácido bromhídrico purificado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Una mezcla de polipéptidos que no tienen todos
la misma secuencia de aminoácidos denominados como acetato de
glatiramer (GA) se comercializaba con nombre comercial Copaxone® y
comprende las sales de acetato de polipéptidos que contienen ácido
L-glutámico, L-alanina,
L-tirosina y L-lisina en fracciones
molares promedio de 0.141, 0.427, 0.095 y 0.338, respectivamente.
El peso molecular promedio del Copaxone® está entre 4,700 y 11,000
daltons ("Copaxone", Physician's Desk Reference, (2000),
Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115.). Químicamente,
el acetato de glatiramer se denomina polímero de ácido
L-glutámico con L-alanina,
L-lisina, L-tirosina, acetato
(sal). Su fórmula estructural es:
(Glu, Ala, Lys, Tyr)_{x}
\cdot _{x}CH_{3}COOH (C_{5}H_{9}NO_{4} \cdot
C_{3}H_{7}NO_{2} \cdot C_{9}H_{11}NO_{3})_{x}
\cdot _{x}C_{2}H_{4}O_{2}
CAS-147245-92-9
CAS-147245-92-9
("Copaxone", Physician's Desk
Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ),
3115).
El acetato de glatiramer está aprobado para la
reducción de la frecuencia de reincidencias en pacientes con
esclerosis múltiple remitente con reincidencias. La esclerosis
múltiple ha sido clasificada como una enfermedad inmune. El acetato
de glatiramer también ha sido divulgado para su uso en el
tratamiento de otras enfermedades autoinmunes (Publicación No. US
2002/005466 A1 para R. Aharoni et al.), enfermedades no
autoinmunes inflamatorias (publicación No. US 2005/0014694 A1 para
V. Wee Yong et al., y Solicitud de Patente de los Estados
Unidos No. 2002/0077278 A1, publicada el 20 de junio de 2002 (Young
et al.)) y para promover la regeneración de los nervios y/o
evitar o inhibir la degeneración secundaria que puede seguir a una
lesión en el sistema nervioso primario (publicación No. US
2003/0004099 A1 para M. Eisenbach-Schwartz et
al.; y solicitud de Patente de los Estados Unidos No.
2002/0037848 A1, publicada el 28 de marzo de 2002
(Eisenbach-Schwartz)). Adicionalmente, el acetato
de glatiramer se ha divulgado como un tratamiento para enfermedades
inmunes mediadas (por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.
6,514,938 B1, emitida el 4 de febrero de 2003 (Gad et al.);
publicación internacional PCT No. WO 01/60392, publicada el 23 de
agosto de 2001 (Gilbert et al.); y publicación internacional
PCT No. WO 00/27417, publicada el 19 de mayo de 2000 (Aharoni et
al.) así como enfermedades asociadas con la desmielinización
(publicación internacional PCT No. WO -1/97846, publicada el 27 de
diciembre de 2001 (Moses et al.).
El proceso de manufactura tal como se detalla en
las patentes anteriores involucra hacer reaccionar polipéptidos
protegidos con 33% de ácido bromhídrico en ácido acético (Patente de
los Estados Unidos No. 5,800,808, emitida el 1 de septiembre de
1998 a Konfino et al.). Esta reacción de desprotección retira
el grupo protector gama bencilo del carboxilato 5 del residuo de
glutamato y rompe el polímero en polipéptidos más pequeños para
formar un polipéptido trifluoroacetilo. (Patente de los Estados
Unidos No. 5,800,808, emitida el 1 de septiembre de 1998 a Konfino
et al.). El tiempo necesario para obtener GA del peso
molecular promedio apropiado de entre 7,000 \pm 2,000 daltons
depende de la temperatura de reacción y del perfil de peso molecular
del acetato de glatiramer protegido (Patente de los Estados Unidos
No. 5,800,808, emitida el 1 de septiembre de 1998 a Konfino et
al.). La desprotección se presenta a una temperatura de entre
20ºC y 28ºC (Patente de los Estados Unidos No. 5,800,808, emitida
el 1 de septiembre de 1998 a Konfino et al.). Una reacción de
prueba se lleva a cabo en cada lote a diferentes períodos de
tiempo, para determinar el tiempo de reacción necesario a una
temperatura dada para alcanzar polipéptidos de trifluoroacetilo del
perfil de peso molecular apropiado. (Patente de los Estados Unidos
No. 5,981,589, emitida el 9 de noviembre de 1999 a Konfino et
al.). La cantidad de tiempo necesaria para la reacción varía,
por ejemplo, entre 10 y 50 horas. (Patente de los Estados Unidos No.
5,800,808, emitida el 1 de septiembre de 1998 a Konfino et
al.). Además, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,981,589,
6,048,898, 6,054,430, 6,342,476, 6,362,161, y 6,620,847 también se
relacionan con composiciones y métodos para la manufactura de
mezclas de polipéptidos, incluyendo GA.
La invención proporciona un proceso de
manufactura mejorado.
La invención presente proporciona un proceso
para obtener glatiramer, una mezcla de polipéptidos de
trifluoroacetilo que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido
glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio y donde durante el proceso se desprotege
una mezcla de polipéptidos, cada una de las cuales consiste de
alanina, glutamato de \gamma-bencilo, tirosina y
trifluoroacetil lisina, con una solución de ácido bromhídrico en
ácido acético, comprendiendo la mejora el uso de una solución de
ácido bromhídrico en ácido acético, solución que comprende menos de
0.5% de bromo libre.
La invención presente también proporciona un
proceso para obtener la mezcla anterior de polipéptidos de
trifluoroacetilo que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido
glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio deseado y donde durante el proceso se
desprotege una mezcla de polipéptidos, cada una de las cuales
consiste de alanina, glutamato de \gamma-bencilo,
tirosina y trifluoroacetilo, con una solución de ácido bromhídrico
en ácido acético, comprendiendo la mejora el uso de una solución de
ácido bromhídrico en ácido acético, solución que comprende menos de
1000 ppm de impurezas de iones metálicos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La invención presente proporciona adicionalmente
un proceso para producir la mezcla de polipéptidos de
trifluoroacetilo que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido
glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio deseado que comprende desproteger una
mezcla de polipéptidos que consisten cada uno de alanina, glutamato
de \gamma-bencilo, tirosina y trifluoroacetil
lisina con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético,
solución que comprende menos de 0.5% de bromo libre y menos de 1000
ppm de impurezas de iones metálicos.
La presente invención también proporciona una
composición que comprende el producto de trifluoroacetilo producido
por uno cualquiera de los procesos de la invención presente, y un
portador.
La presente invención proporciona adicionalmente
la mezcla anterior de polipéptidos de trifluoroacetilo que no
tienen todos la misma secuencia de aminoácidos, donde cada
polipéptido consiste de alanina, ácido glutámico, tirosina y
trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene un peso molecular
promedio deseado, no más de 0.1% de tirosina bromada y menos de
1000 ppm de impurezas de iones metálicos. La invención presente
también proporciona una composición que comprende la mezcla de
polipéptidos de trifluoroacetilo y un portador.
La presente invención también proporciona un
proceso para obtener una composición farmacéutica la mezcla anterior
de polipéptidos que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido
glutámico, tirosina y lisina, y donde la mezcla tiene un peso
molecular promedio deseado, que comprende
- a)
- polimerizar N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y N-trifluoroacetil lisina para formar una mezcla de polipéptidos protegidos.
- b)
- desproteger los polipéptidos con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, comprendiendo la solución menos de 0.5% de bromo libre y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos, para formar una mezcla de polipéptidos de trifluoroacetilo;
- c)
- hacer reaccionar la mezcla de polipéptidos de trifluoroacetilo con piperidina acuosa para formar una solución de mezcla acuosa de polipéptidos, cada uno de los cuales consiste de alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina; y
- d)
- purificar la mezcla de polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona adicionalmente
un proceso para producir acetato de glatiramer que comprende las
etapas de:
- a)
- polimerizar N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y N-trifluoroacetil lisina para formar acetato de glatiramer protegido;
- b)
- desproteger acetato de glatiramer protegido con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, comprendiendo la solución menos de 0.5% de bromo libre y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos, para formar acetato de trifluoroacetil glatiramer;
- c)
- hacer reaccionar acetato de trifluoroacetil glatiramer con piperidina acuosa para formar una solución de acetato de glatiramer; y
- d)
- purificar el acetato de glatiramer.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona adicionalmente
un método para analizar el porcentaje de tirosina bromada en una
muestra de acetato de glatiramer que comprende las etapas de:
- a)
- hidrolizar el acetato de glatiramer para obtener un hidrolizado;
- b)
- eluir el hidrolizado a través de una columna cromatográfica;
- c)
- medir el nivel de bromotirosina en el hidrolizado;
- d)
- preparar soluciones de muestra de los componentes aminoácidos del acetato de glatiramer y de la bromotirosina;
- e)
- eluir las soluciones de muestra a través de la columna de la etapa b); y
- f)
- calcular el porcentaje de tirosina bromada en el acetato de glatiramer.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
proceso para preparar una composición farmacéutica que comprende
una mezcla de polipéptidos que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de ácido glutámico,
alanina, tirosina y lisina, donde la mezcla tiene un porcentaje
predeterminado de tirosina bromada aceptable para su inclusión en
una composición farmacéutica, que comprende obtener un lote de una
mezcla de polipéptidos que tiene secuencias de aminoácidos no
uniformes, donde cada polipéptido consiste de ácido glutámico,
alanina, tirosina y lisina; midiendo el porcentaje de tirosina
bromada del lote por un proceso que comprende
- a)
- hidrolizar el lote para obtener un hidrolizado;
- b)
- eluir el hidrolizado a través de una columna cromatográfica;
- c)
- medir el nivel de bromotirosina en el hidrolizado;
- d)
- preparar soluciones de muestra de los componentes aminoácidos del lote y de bromotirosina;
- e)
- eluir las soluciones de muestra a través de la columna de la etapa b); y
- f)
- calcular el porcentaje de tirosina bromada en el lote; y
incluir en la composición farmacéutica un lote
solamente si su porcentaje de tirosina bromada así medido es menor
de 0.3%.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención presente proporciona un proceso
para obtener glatiramer, una mezcla de polipéptidos de
trifluoroacetilo que no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido
glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio deseado y donde durante el proceso se
desprotege una mezcla de polipéptidos, cada uno de los cuales
consiste de alanina, glutamato de \gamma-bencilo,
tirosina y trifluoroacetil lisina, con una solución de ácido
bromhídrico en ácido acético, comprendiendo la mejora el uso de una
solución de ácido bromhídrico en ácido acético, solución que
comprende menos de 0.5% de bromo libre.
En una realización, la mejora comprende
adicionalmente el uso de una solución de ácido bromhídrico en ácido
acético que comprende menos de 1000 ppm de impurezas de iones
metálicos.
La presente invención también proporciona un
proceso para obtener la mezcla anterior de polipéptidos de
trifluoroacetilo que no tienen la misma secuencia de aminoácidos,
donde cada polipéptido consiste de alanina, ácido glutámico,
tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene un peso
molecular promedio deseado y donde durante el proceso se desprotege
un lote de una mezcla de polipéptidos, que consiste cada uno de
alanina, glutamato de \gamma-bencilo, tirosina y
trifluoroacetil lisina, con una solución de ácido bromhídrico en
ácido acético, comprendiendo la mejora el uso de una solución de
ácido bromhídrico en ácido acético, solución que comprende menos de
1000 ppm de impurezas de iones metálicos.
La invención presente proporciona aún
adicionalmente un proceso para producir la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo que no tienen todos la misma
secuencia de aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de
alanina, ácido glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde
la mezcla tiene un peso molecular promedio deseado que comprende la
desprotección de polipéptidos consistiendo cada uno de alanina,
glutamato de \gamma-bencilo, tirosina y
trifluoroacetil lisina con una solución de ácido bromhídrico en
ácido acético, solución que comprende menos de 0.5% del bromo libre
y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos.
En una realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 0.1% de bromo
libre.
En otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 0.5% de bromo
libre.
En una realización adicional, la solución de
ácido bromhídrico en ácido acético comprende menos de 0.01% de
bromo libre.
Aún otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 0.001% de bromo
libre.
En una realización adicional, la solución de
ácido bromhídrico en ácido acético está libre de bromo libre.
En otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 1000 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En aún otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 500 ppm de impurezas
de iones metálicos.
En una realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 100 ppm de impurezas
de iones metálicos.
En aún otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 30 ppm de impurezas
de iones metálicos.
En aún otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético comprende menos de 20 ppm de impurezas
de iones metálicos.
En una realización adicional, la solución de
ácido bromhídrico en ácido acético comprende menos de 10 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En otra realización, la solución de ácido
bromhídrico en ácido acético está libre de impurezas de iones
metálicos.
En aún otra realización, la mezcla de
polipéptidos de trifluoroacetilo es acetato de trifluoroacetil
glatiramer ("TFA GA.").
En una realización, el ácido bromhídrico en la
solución de ácido acético es de 10% a 36% de ácido bromhídrico en
ácido acético. En otra realización, el ácido bromhídrico en ácido
acético es de 16% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; de
18% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; de 20% a 37% de
ácido bromhídrico en ácido acético; de 20% a 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético; de 22% a 33% de ácido bromhídrico en
ácido acético; de 24% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético;
de 25% a 35% de ácido bromhídrico en ácido acético; de 26% a 33% de
ácido bromhídrico en ácido acético; de 28% a 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético; de 30% a 34% de ácido bromhídrico en
ácido acético; de 30% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; o
32% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético. En una realización
adicional, la solución es 33% de ácido bromhídrico en ácido
acético. En otra realización, la solución es 16% de ácido
bromhídrico en ácido acético.
En otra realización, la solución es pretratada
con un consumidor de bromo con el fin de eliminar el bromo
libre.
En otra realización, el consumidor de bromo es
fenol.
En una realización adicional, la solución es
producida en un reactor no metálico.
En otra realización, la solución es preparada en
un reactor recubierto con vidrio o recubierto con Teflón.
En aún otra realización, el color del ácido
bromhídrico en la solución de ácido acético es menor de 2000
APHA.
En una realización adicional, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 1000 APHA.
En otra realización, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 700 APHA. En
aún otra realización adicional, el color del ácido bromhídrico en
solución de ácido acético es menor de 500 APHA.
La presente invención también proporciona un
producto de trifluoroacetilo producido por uno cualquiera de los
procesos descritos.
La presente invención proporciona adicionalmente
una composición que comprende el producto de trifluoroacetilo
producido por uno cualquiera de los procesos descritos, y un
portador.
La presente invención aún proporciona
adicionalmente la mezcla anterior de polipéptidos de
trifluoroacetilo los cuales no tienen todos la misma secuencia de
aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de alaniana, ácido
glutámico, tirosina y trifluoroacetil lisina, donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio deseado, no más de 0.1% de tirosina
bromada y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos.
En una realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 2000 daltons a 40,000 daltons.
En otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 4000 daltons a 18,000 daltons.
En una realización adicional, la mezcla anterior
de polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular
promedio de 4000 daltons a 13,000 daltons.
En otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 13,000 daltons a 19,000 daltons.
En aún otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 13,500 daltons a 18,500 daltons.
En otra realización, la anterior mezcla de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 7,000 \pm 2,000 daltons.
En aún una realización adicional, la mezcla
anterior de polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular
promedio de 7,000 daltons.
En otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 14,000 daltons.
En aún otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo tiene un peso molecular promedio
de 4,700-11,000 daltons.
En una realización adicional, la mezcla anterior
de polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 1000 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En aún otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 500 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En una realización adicional, la mezcla anterior
de polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 100 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 30 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En una realización adicional, la mezcla anterior
de polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 20 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo comprende menos de 10 ppm de
impurezas de iones metálicos.
En aún otra realización, la mezcla anterior de
polipéptidos de trifluoroacetilo está libre de impurezas de iones
metálicos.
La presente invención también proporciona una
composición que comprende la mezcla anterior de polipéptidos de
trifluoroacetilo y un portador.
La presente invención proporciona adicionalmente
un método para obtener una composición farmacéutica que contiene la
mezcla anterior de polipéptidos los cuales no tienen todos la misma
secuencia de aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de
alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina, y donde la mezcla tiene
un peso molecular promedio deseado, que comprende,
- a)
- polimerizar N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y N-trifluoroacetil lisina para formar una mezcla acuosa de polipéptidos protegidos;
- b)
- desproteger los polipéptidos protegidos con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, solución que comprende menos de 0.5% de bromo libre y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos, para formar una mezcla acuosa de polipéptidos de triofluoroacetilo;
- c)
- hacer reaccionar la mezcla acuosa de polipéptidos de trifluoroacetilo con piperidina acuosa para formar una solución de mezcla acuosa de polipéptidos, cada una de los cuales consiste de alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina; y
- d)
- purificar la mezcla acuosa de polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la fracción molar promedio
en la mezcla es ácido glutámico 0.129-0.159; alanina
0.392-0.462; tirosina 0.086-0.100;
y lisina 0.300-0.374. En una realización específica,
la fracción molar promedio en la mezcla de ácido glutámico es
0.141, de alanina es 0.427, de tirosina es 0.093 y de lisina es
0.0337.
La presente invención también proporciona un
método para producir acetato de glatiramer que comprende las etapas
de:
- a)
- polimerizar N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y N-trifluoroacetil lisina para formar acetato de glatiramer protegido;
- b)
- desproteger el acetato de glatiramer protegido con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, comprendiendo la solución menos de 0.5% de bromo libre y menos de 1000 ppm de impurezas de iones metálicos, para formar acetato de trifluoroacetil glatiramer;
- c)
- hacer reaccionar acetato de trifluoroacetil glatiramer con piperidina acuosa para formar una solución de acetato de glatiramer; y
- d)
- purificar el acetato de glatiramer.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el producto de la etapa d)
es sometido adicionalmente a otra filtración para retirar especies
de polipéptidos con pesos moleculares menores de 5000 daltons.
En una realización, el ácido bromhídrico en
solución de ácido acético es de 10% a 36% de ácido bromhídrico en
ácido acético. En otra realización, el ácido bromhídrico en ácido
acético es de 16% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; de
18% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; de 20% a 37% de
ácido bromhídrico en ácido acético; de 20% a 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético; de 22% a 33% de ácido bromhídrico en
ácido acético; de 24% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético;
de 25% a 35% de ácido bromhídrico en ácido acético; de 26% a 33% de
ácido bromhídrico en ácido acético; de 28% a 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético; de 30% a 34% de ácido bromhídrico en
ácido acético; de 30% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético; o
de 32% a 33% de ácido bromhídrico en ácido acético. En una
realización adicional, la solución es 33% de ácido bromhídrico en
ácido acético. En otra realización, la solución es 16% de ácido
bromhídrico en ácido acético.
En otra realización, el ácido bromhídrico en
solución de ácido acético es pretratado con un consumidor de bromo
con el fin de eliminar bromo libre.
En aún otra realización, el consumidor de bromo
es fenol.
En una realización adicional, el ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es producido en un reactor
no metálico; en otra realización, el ácido bromhídrico en solución
de ácido acético es preparado en un reactor recubierto de vidrio o
recubierto con Teflón.
En una realización, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 2000 APHA.
En otra realización, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 1000 APHA.
En aún otra realización, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 700 APHA.
En una realización adicional, el color del ácido
bromhídrico en solución de ácido acético es menor de 500 APHA.
La presente invención proporciona además un
método para analizar el porcentaje de tirosina bromada en una
muestra de acetato de glatiramer que comprende las etapas de:
- a)
- hidrolizar el acetato de glatiramer para obtener un hidrolizado;
- b)
- eluir el hidrolizado a través de una columna cromatográfica;
- c)
- medir el nivel de bromotirosina en el hidrolizado;
- d)
- preparar soluciones de muestra de los componentes aminoácidos del acetato de glatiramer y de bromotirosina;
- e)
- eluir las soluciones de muestra a través de la etapa b); y
- f)
- calcular el porcentaje de tirosina bromada en el acetato de glatiramer.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
proceso para preparar una composición farmacéutica que contiene
glatiramer, una mezcla de polipéptidos que no tienen todos la misma
secuencia de aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de ácido
glutámico, alanina, tirosina y lisina donde la mezcla tiene un
porcentaje predeterminado de tirosina bromada aceptable para su
inclusión en una composición farmacéutica, que comprende obtener un
lote de una mezcla de polipéptidos que tienen secuencias no
uniformes de aminoácidos, donde cada polipéptido consiste de ácido
glutámico, alanina, tirosina y lisina; medir el porcentaje de
tirosina bromada del lote mediante un proceso que comprende
- a)
- hidrolizar el lote para obtener un hidrolizado;
- b)
- eluir el hidrolizado a través de una columna cromatográfica;
- c)
- medir el nivel de bromotirosina en el hidrolizado;
- d)
- preparar soluciones de muestra de los componentes aminoácidos del lote y de bromotirosina;
- e)
- eluir las soluciones de muestra a través de la etapa b); y
- f)
- calcular el porcentaje de tirosina bromada en el lote; y
- g)
- incluir en la composición farmacéutica un lote solamente si su porcentaje de tirosina bromada así medido es menor de 0.3%.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el lote es aceptable para
inclusión en la composición farmacéutica solamente si su porcentaje
de tirosina bromada así medido es menor de 0.2%.
En otra realización, el lote es aceptable para
inclusión en la composición farmacéutica solamente si su porcentaje
de tirosina bromada así medido es menor de 0.1%.
En una realización adicional, la mezcla de
polipéptidos es acetato de glatiramer ("GA").
El término "peso molecular promedio" tal
como se usa en esta solicitud significa el peso molecular de las
especies de polipéptidos presentes en la mezcla en la proporción
relativa más alta (esto es el pico máximo) cuando la mezcla es
sometida a separación por peso molecular en una columna de
permeación por gel de HPLC. Este valor puede ser obtenido de
diversas maneras, por ejemplo a partir del tiempo de retención sobre
una columna calibrada; o a partir de una correlación entre la
localización de pico y la localización de los marcadores
copoliméricos cocromatografiados de secuencia y peso molecular
definido. Otros métodos para determinar un peso molecular promedio
tales como medición de luz dispersa pueden ser empleados y
sustancialmente corresponderán con el valor obtenido del pico
máximo.
Una mezcla de polipéptido de acuerdo con esta
invención que se cita como ejemplo es la sal de acetato de
polipéptidos sintéticos preparados haciendo reaccionar químicamente
cuatro derivados de aminoácidos activados (dos de ellos ácido
L-Glutámico y L-lisina protegida):
ácido L-Glutámico (L-Glu),
L-alanina (L-Ala),
L-tirosina (L-Tyr) y
L-lisina (L-Lys) (dos de ellos
protegidos, esto es, derivado 5Bz-Glutamato y
derivado 6N-TFA-Lisina) en una
proporción especificada. El término "mezcla" tal como se usa en
este documento se refiere en general a la "mezcla de polipéptidos
de la invención" que comprende ácido L-glutámico,
L-alanina, L-tirosina y
L-lisina, y ambos términos pretenden incluir las
impurezas residuales del proceso de manufactura.
El rango de fracción molar de cada residuo de
aminoácido es L-Glu 0.129-0.153,
L-Ala 0.392-0.462,
L-Tyr 0.086-0.100 y
L-Lys 0.300-0.374.
Puesto que ninguna reacción llega a su
terminación al 100% y aunque prácticamente todas las impurezas son
eliminadas, pueden permanecer pequeñas cantidades. Tales impurezas
pueden ser de los siguientes tres tipos:
\bullet Sustancias relacionadas con la
estructura, que son residuos de aminoácido protegidos tales como
5-BZ-L-glutamil y/o
N6-TFA-L-Lisil como
residuos, que se origina a partir de la eliminación incompleta de
los grupos protectores. Además, la mezcla de polipéptidos de las
moléculas de la invención pueden contener residuos bromados de
L-tirosil, formados durante la producción debido a
la presencia de bromo libre en el reactivo HBR/ácido acético.
Las estructuras moleculares de las impurezas
relacionadas con la estructura identificada pueden ser derivadas a
partir de los monómeros participantes, esto es, los materiales de
partida.
Estas impurezas identificadas son cuantificadas
(después de conversión química) por comparación con los Estándares
de Referencia, los cuales son bien derivados o parte de las
impurezas mismas:
- -
- Compuestos de trifluoroacetilo residuales (expresados como fluoruro)
- -
- Residuos de glutamil bencilado residuales (expresados como bromuro de bencilo)
- -
- Residuos de tirosilo bromado residual (expresados como bromotirosina).
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Sustancias relacionadas no
identificadas (determinadas por RP-HPLC): estos son
polipéptidos de pequeño tamaño molecular del mismo origen con
estructuras similares. Estas sustancias probablemente tienen
similares factores de respuesta y la concentración (%) de cada
impureza puede calcularse como el porcentaje de área de pico con
respecto a la mezcla de polipéptidos del área de pico de la
invención. La caracterización de las impurezas se basa en su tiempo
de retención por cromatografía relativo (RRT) con respecto al
estándar de L-Triptófano.
\bullet Los solventes residuales e impurezas
inorgánicas cubiertas en la especificación tales como el solvente
residual 1,4 dioxano, piperidina residual y metales pesados.
En el proceso de manufactura de mezclas de
polipéptidos tales como GA, se utiliza ácido bromhídrico al 33% en
ácido acético para desproteger el GA protegido. Por ejemplo, durante
el desarrollo del proceso de producción para GA se encontró que
algunos de los residuos de tirosina en trifuoroacetil GA (TFA GA) y
en GA estaban bromados. Esta impureza fue aislada e identificada
utilizando un procedimiento analítico que se describe en detalle en
los ejemplos. Se encontró que el residuo de tirosina reaccionaba con
el bromo para formar una unidad estructural de
mono-bromotirosina que comprende bien sea
2-bromotirosina o
3-bromotirosina.
Después de mucha investigación los
investigadores descubrieron que la impureza de tirosina bromada fue
introducida en el GA a través del bromo en HBr/ácido acético. El
bromo libre estaba presente en el HBr/ácido acético al 33% comprado
de un proveedor y se utilizó en el proceso de producción.
Se tomaron medidas con el fin de disminuir el
nivel de bromo libre en HBr/ácido acético al 33%. Por ejemplo, el
pretratamiento del HBr/ácido acético con un consumidor de bromo fue
efectivo para eliminar una parte del bromo libre de la solución de
HBr/ácido acético.
Uno de los consumidores de bromo utilizados en
el proceso de purificación del HBr fue fenol. Además del fenol,
pueden utilizarse otros agentes reductores tales como bisulfito de
sodio. El fenol fue escogido como un consumidor de bromo porque él
y su producto de reacción con el bromo (bromofenoles) son
esencialmente no reactivos con los polipéptidos protegidos, tales
como GA protegido, polipéptidos TFA, tales como TFA GA y
polipéptidos tales como GA, y son fáciles de eliminar de la
solución de GA durante el proceso de purificación. De la misma
forma, puede utilizarse cualquier agente consumidor de bromo,
asumiendo que él y su producto de reacción con bromo no son
reactivos con polipéptidos protegidos tales como GA protegido,
polipéptidos TFA, tales TFA GA y polipéptidos tales como GA, y que
es fácilmente eliminable durante el proceso de purificación
final.
El GA es comercializado en dos formas de
dosificación farmacéutica, polvo liofilizado y jeringas
prerrellenas. Las jeringas, comercializadas bajo el nombre
comercial Copaxone® Injection, contienen en general una solución
clara. Las instrucciones de almacenamiento eran mantener las
jeringas refrigeradas. Sin embargo, se detectó un color rojo en
soluciones acuosa de soluciones prerrellenas de Copaxone®. La fuente
del color en las soluciones era desconocida.
El color apareció cuando las soluciones fueron
mantenidas a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas.
Se determinó que la producción de HBr en
aparatos metálicos llevó a impurezas de iones metálicos en trazas
en el HBr. Cuando se mezcló más tarde el HBr con el GA protegido,
las impurezas de iones metálicos en el HBr fueron quelatadas por
TFA GA y GA. Estos complejos TFA GA y GA/metal contribuyeron a la
coloración. Como resultado, se tomó otra medida para asegurar la
pureza, por ejemplo en el producto GA, el cual fue el uso de un
reactor no metálico para la producción de la solución HBr/ácido
acético al 33%. El reactor utilizado para la producción de la
solución HBr/ácido acético fue recubierto en vidrio con el fin de
evitar la formación de impurezas que podrían afectar más adelante
la pureza de, por ejemplo, el GA. Con el fin de evitar el contacto
de la solución de HBr con el metal, las partes de la tubería
utilizada estaban recubiertas con Teflón. De la misma forma, pueden
utilizarse otros tipos de aparatos no reactivos, no metálicos
resistentes a los ácidos para evitar la formación de iones
metálicos traza en la solución HBr/ácido acético. El uso de un
aparato no metálico para la producción de la solución Hbr/ácido
acético fue exitoso en la eliminación del color rojo del GA. Cuando
el aparato no metálico fue utilizado para la producción de la
solución Hbr/ácido acético, el resultado fue que la solución estaba
esencialmente libre de iones metálicos y no se formó el GA rojo.
Además, el color de cada lote de HBr/ácido
acético se mide para determinar el nivel de impurezas antes de ser
utilizado para desproteger el GA protegido. Se encontró que los
niveles de impurezas de iones metálicos en la solución de HBr
podría ser determinado mediante análisis visual. La solución de HBr
con un color por debajo de 2000 APHA mostró producir acetato de
glatiramer sin color rojo.
La invención será ejemplificada pero no limitada
por los siguientes ejemplos.
Con el fin de determinar el efecto del bromo
libre en ácido bromhídrico/ácido acético sobre el nivel de impureza
de la unidad estructural tirosina bromada en TFA-GA
y GA, se contaminó el ácido bromhídrico en ácido acético con
diversas cantidades de bromo. En el experimento, el HBr que no
estaba pretratado con el consumidor de bromo fue utilizado en el
proceso de manufactura. Se añadieron varios niveles de impureza de
bromo (medida como porcentaje de la solución HBr/ácido acético). El
nivel de impureza de unidad estructural de tirosina bromada en TFA
GA y en GA se midió hidrolizando TFA GA y GA a sus componentes
aminoácidos, y utilizando luego HPLC para determinar la cantidad de
bromotirosina en relación con TFA GA y GA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las soluciones estándar que contenían 2
\mug/ml de bromotirosina fueron preparadas utilizando agua
destilada. Se preparó una solución de reserva estándar de
aminoácidos utilizando los siguientes aminoácidos:
Los aminoácidos fueron disueltos en agua. Se
añadieron unas pocas gotas de NaOH 5 N a un volumen final de
25 mL.
25 mL.
\vskip1.000000\baselineskip
10 mg de acetato de glatiramer y 10 mg de TFA GA
fueron pesados cada uno independientemente en viales de hidrólisis
de 5 mL. Se preparó un vial de control negativo añadiendo 0.5 mL de
la solución de reserva estándar de aminoácidos a un vial de
hidrólisis de 5 mL. Se añadieron 0.5 mL de agua y 0.5 mL de HCl
concentrado que contenían 1% de fenol a cada uno de los viales. Los
viales fueron calentados a 110ºC durante 24 horas, bajo atmósfera de
N_{2}. Las muestras fueron entonces enfriadas a temperatura
ambiente. Cada uno de los hidrolizados fue transferido a matraces
volumétricos de 5 mL y llevados a volumen con agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
El estándar de bromotirosina, y cada uno de los
hidrolizados, fueron eluidos independientemente a través de una
columna de HPLC utilizando un eluyente acetonitrilo: agua: ácido
acético en una proporción de 4 : 95 : 1. La columna fue equipada
con un detector UV y un sistema de registro de datos. El estándar de
aminoácidos es utilizado como un control negativo para determinar
cual de los picos en el hidrolizado de acetato de glatiramer
corresponde a bromotirosina.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de la unidad estructural de
tirosina bromada en cada muestra de TFA GA y GA se calculó como
sigue:
P = pureza del estándar de bromotirosina (en
porcentaje)
AS = área del pico estándar de bromotirosina
AP = área del pico de bromotirosina en cada
muestra
CS = concentración del estándar de bromotirosina
(\mug/mL)
CP= concentración de estrato de glatiramer (o
de TFA GA)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La Tabla 1 muestra el efecto de bromo libre
sobre el nivel de la unidad estructural de tirosina bromada en TFA
acetato de glatiramer y en acetato de glatiramer
\vskip1.000000\baselineskip
Del anterior ejemplo puede verse que la
contaminación de HBr con bromo lleva a niveles más altos de la
unidad de tirosina bromada en TFA GA y en GA, con respecto a la
reacción estándar en la cual no se añade bromo. Cuando no se añade
bromo, puesto que el HBr no ha sido tratado con un consumidor de
bromo, algo del bromo libre estaba aún disponible y la
contaminación de la unidad de tirosina bromada de GA y TFA GA era
aún evidente.
Con el fin de producir GA con la impureza de la
unidad de tirosina bromada a un nivel de menos de 0.2%, el nivel de
bromo en HBr debe ser disminuido mediante la adición de un
consumidor de bromo.
\vskip1.000000\baselineskip
El reactor recubierto con vidrio es enjuagado
con ácido acético, y luego vaciado. Se añadieron 1013 kg de ácido
acético al reactor. El ácido acético se mantiene a una temperatura
de 10-20ºC. Se introdujeron 552 kg de gas HBr en el
reactor a la vez que se mezclaba la solución. Después de la
introducción del gas, la solución es mezclada durante 30 minutos
adicionales. La solución se prueba para determinar si el contenido
de HBr es 33%.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del 33% de HBr en ácido acético fue
vertida sobre un reactor recubierto en vidrio. Se pesó y añadió
fenol a la solución de HBr en una proporción en peso de 1 a 100. La
solución luego fue agitada durante 12 a 24 horas. La solución de
HBr purificada se añade luego a acetato de glatiramer protegido. La
reacción del HBr con el GA protegido forma TFA GA. El TFA GA se
hace reaccionar con piperidina para formar GA.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de la unidad de tirosina bromada en
diversos lotes de acetato glatiramer fue medida utilizando el
método descrito en el ejemplo 1
El HBr producido utilizando el nuevo método,
como se describe en el ejemplo 2 y tratado con fenol como en el
ejemplo 3, está libre de bromo e impurezas metálicas. Por lo tanto
el acetato de glatiramer que fue producido estaba sustancialmente
libre de la estructura de tirosina bromada.
El HBr que había sido comprado de proveedores
externos (método antiguo) tenía impurezas, y por lo tanto el
acetato de glatiramer producido usándolo tenía también impurezas de
estructura de tirosina bromada, aunque se utilizó el fenol como un
consumidor de tirosina.
\vskip1.000000\baselineskip
El color de la solución HBr/ácido acético fue
determinado utilizando técnicas de determinación de color visuales
estándar.
El índice de color de la American Public Health
Association (APHA) es un índice de número sencillo del
amarillamiento donde cada unidad APHA está basada en una elución de
la solución estándar de 500 ppm de platino-cobalto
(PtCo) (HunterLab, APHA Background Applications Note, Insight on
Color November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16.
disponible en
http://www.hunterlab.com/app-notes/an11 96br2.pdf.).
La medición de APHA se determina por comparación visual y la
solución con estándares de PtCo que contienen cantidades controladas
de cloroplatinato de potasio y cloruro de cobalto. Cada unidad de
número es el equivalente a 1 mg de platino por litro de solución
(ppm). Los estándares y mediciones correspondientes se designan de
acuerdo con su medición en ppm, esto es, el APHA No. 20 estándar
contiene 20 ppm de platino. American Chemical Society, General
Directions and Procedures: Measurement of Physical Properties
disponible en http://pubs.acs.org/reagent demo/sec
b002.html.), agua destilada tiene un valor APHA de 0, y la
solución de reserva tiene un valor APHA de 500 ppm. (HunterLab, APHA
Background, Applications Not, Insight on Color November
16-30, 1996, Vol. 8, No 16. disponible en
http://www.hunterlab.com/appnotes/an11 96br2.pdf). La medición de
APHA puede hacerse mediante diversos instrumentos bien conocidos en
la técnica.
Se prepararon estándar de color APHA "500"
y estándar de color APHA "1000". El estándar de color APHA
"500" fue preparado disolviendo 1.246 g de Cloroplatinato de
Potasio, K_{2}PtCl_{6} (equivalente a 50 mg de Platino
metálico) y 1.0 g de cloruro de Cobalto Cristalizado,
CoCl_{2}-6H_{2}O (equivalente a aproximadamente
2.50 mg de Cobalto metálico) en agua destilada con 100 ml de HCl
concentrado y se diluyó hasta 1000 mL con agua destilada.
El estándar de color APHA "1000" fue
preparado disolviendo 2.492 g de Cloroplatinato de Potasio K_{2}
PtCl_{6} y 2.00 g de Cloruro de Cobalto cristalizado
CoCl_{2}-6H_{2}O en agua destilada con 200 mL de
HCl concentrado y se diluyó hasta 1000 mL con agua destilada.
Se produjeron los siguientes lotes utilizando
aparatos no metálicos como se describió previamente. Estas muestras
fueron probadas en cuanto a color visualmente contra los estándares
de color observando tubos de Nessler de 100 mL contra un fondo
blanco.
El color de estos lotes de HBr/ácido acético
indicó que estaban esencialmente libres de bromo e impurezas de
iones metálicos. Debido a que el color era menos de 2000 APHA, estos
lotes fueron considerados esencialmente libres de impurezas de
iones metálicos.
Claims (17)
1. En un proceso para obtener acetato de
trifluroacetil glatiramer, donde durante el proceso se desprotege
un lote de una mezcla de polipéptidos, cada uno de los cuales
consiste esencialmente de alanina, glutamato de
gama-bencilo, tirosina y trifluoroacetil lisina con
una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, comprende la
mejora
una etapa de pretratamiento de la solución con
ácido bromhídrico con un consumidor de bromo con el fin de remover
el bromo libre.
2. Un proceso para obtener una composición
farmacéutica que contiene acetato de glatiramer, que comprende
- a)
- polimerizar N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, glutamato de \gamma-bencilo y trifluroacétil lisina para formar acetato de glatiramer protegido;
- b)
- desproteger el acetato de glatiramer protegido con una solución de ácido bromhídrico en ácido acético, solución que ha sido pretratada con un consumidor de bromo con el fin de eliminar el bromo libre, para formar acetato de trifluoroacetil glatiramer;
- c)
- hacer reaccionar el acetato de trifluoroacetil glatiramer, con piperidina acuosa para formar una solución de acetato de glatiramer acuosa; y
- d)
- purificar el acetato de glatiramer.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El proceso de la reivindicación 2, que
comprende adicionalmente someter el producto a la etapa d) a
ultrafiltración para retirar especies polipeptídicas con pesos
moleculares menores de 5000 daltons.
4. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde el ácido bromhídrico en
solución en ácido acético es 10%-36% de ácido bromhídrico en ácido
acético.
5. El proceso de la reivindicación 4, donde el
ácido bromhídrico en solución en ácido acético es 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético.
6. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde el consumidor de bromo
es fenol.
7. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el color del ácido bromhídrico en
solución en ácido acético es menor de 2000 APHA.
8. Un proceso para preparar una composición
farmacéutica que contiene acetato de glatiramer, donde el acetato
de glatiramer tiene un porcentaje predeterminado de tirosina bromada
aceptable para su inclusión en una composición farmacéutica, que
comprende
obtener un lote de acetato de glatiramer;
medir el porcentaje de tirosina bromada del lote
mediante un proceso que comprende
- a)
- hidrolizar el lote para obtener un hidrolizado;
- b)
- eluir el hidrolizado a través de una columna cromatográfica;
- c)
- medir el nivel de bromotirosina en el hidrolizado;
- d)
- preparar soluciones de muestra de los componentes aminoácidos del lote y de bromotirosina;
- e)
- eluir las soluciones de muestra a través de la columna de la etapa b); y
- f)
- calcular el porcentaje de tirosina bromada en el lote; y
incluir en la composición farmacéutica un lote
solamente si su porcentaje de tirosina bromada así medido es menor
de 0.3%.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El proceso de la reivindicación 8, donde el
lote es aceptable para su inclusión en la composición farmacéutica
solamente si su porcentaje de tirosina bromada así medido es menor
de 0.2%.
10. El proceso de la reivindicación 9, donde el
lote es aceptable para su inclusión en la composición farmacéutica
solamente si su porcentaje de tirosina bromada así medida es menor
de 0.1%.
11. Acetato de glatiramer que tiene no más de
0.1% de tirosina bromada y menos de 1000 ppm de impurezas de iones
metálicos.
12. El acetato de glatiramer de la
reivindicación 11, que tiene un peso molecular promedio de 4,700
daltons a 11,000 daltons.
13. En un proceso para producir acetato de
glatiramer que comprende la etapa de desproteger el acetato de
glatiramer protegido con una solución de ácido bromhídrico en ácido
acético, comprendiendo la mejora:
pretratar la solución de ácido bromhídrico en
ácido acético con un consumidor de bromo antes del uso de la
solución para desproteger el acetato de glatiramer protegido.
14. El proceso de la reivindicación 13, donde el
ácido bromhídrico en solución de ácido acético es de 10% a 36% de
ácido bromhídrico en ácido acético.
15. El proceso de la reivindicación 13, donde el
ácido bromhídrico en solución de ácido acético es 33% de ácido
bromhídrico en ácido acético.
16. Acetato de trifluoroacetil glatiramer que
tiene no más de 0.1% de tirosina bromada y menos de 1000 ppm de
impurezas de iones metálicos.
17. El acetato de trifluoroacetil glatiramer de
la reivindicación 16, que tiene un peso molecular promedio de 4,700
daltons a 11,000 daltons.
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|---|---|---|---|
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