ES2338242T3 - Plantas con mayor actividad de multiples enzimas fosforiladoras de almidon. - Google Patents
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Abstract
Célula vegetal genéticamente modificada, que se caracteriza porque tiene una mayor actividad de al menos una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y al menos una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que todavía no se han modificado genéticamente, en la que la célula vegetal contiene una primera molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa y una segunda molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa en el genoma de la célula vegetal.
Description
Plantas con mayor actividad de múltiples enzimas
fosforiladoras de almidón.
La presente invención se refiere a células
vegetales y plantas, que están genéticamente modificadas, en las
que la modificación genética conduce a un incremento en la actividad
de una proteína OK1 de fosforilación de almidón y una proteína R1
de fosforilación de almidón en comparación con las correspondientes
células vegetales salvajes o plantas salvajes que no se han
modificado genéticamente. Además, la presente invención se refiere
a medios y procedimientos para la fabricación de tales células
vegetales y plantas. Las células vegetales y plantas de este tipo
sintetizan un almidón modificado. Por tanto, la presente invención
también se refiere al almidón sintetizado por las células vegetales
y plantas de acuerdo con la invención, a procedimientos para la
fabricación de este almidón y a la fabricación de derivados de
almidón de este almidón modificado, así como a harinas que
contienen almidones de acuerdo con la invención.
Además, la presente invención se refiere a
moléculas de ácido nucleico y vectores que contienen secuencias que
codifican una proteína OK1 y una proteína R1, así como a células
huésped que contienen estas moléculas de ácido nucleico.
Con respecto a la creciente importancia que en
la actualidad se atribuye a los constituyentes de las plantas como
fuentes de materia prima renovables, una de las tareas de la
investigación biotecnológica es intentar adaptar estas materias
primas vegetales para cumplir los requisitos de la industria del
procesamiento. Además, con el fin de permitir que las materias
primas regenerantes se usen en la mayor cantidad de áreas de
aplicación que sea posible, es necesario conseguir una gran
variedad de materiales.
El almidón polisacárido está constituido por
componentes de base químicamente uniforme, las moléculas de glucosa,
pero constituye una compleja mezcla de diferentes formas
moleculares que exhiben diferencias con respecto al grado de
polimerización y ramificación, y, por tanto, difieren
considerablemente entre sí en sus características fisicoquímicas.
Se discrimina entre el almidón de amilasa, un polímero esencialmente
no ramificado formado por unidades de glucosa unidas por enlaces
alfa-1,4-glicosídicos, y el almidón
de amilopectina, un polímero ramificado en el que las ramas se
producen por la aparición de enlaces
alfa-1,6-glicosídicos adicionales.
Otra diferencia esencial entre la amilasa y la amilopectina reside
en el peso molecular. Mientras que la amilasa, en función del
origen del almidón, tiene un peso molecular de
5x10^{5}-10^{6} Da, el de la amilopectina
reside entre 10^{7} y 10^{8} Da. Las dos macromoléculas se
pueden diferenciar por su peso molecular y sus diferentes
características fisicoquímicas, que se pueden hacer más fácilmente
visibles por sus diferentes características de enlaces yoduro.
La amilasa siempre se ha visto como un polímero
lineal, compuesto por monómeros de
alfa-D-glucosa unidos por enlaces
alfa-1,4-glicosídicos. No obstante,
en los estudios más recientes se ha mostrado la presencia de puntos
de ramificación alfa-1,6-glicosídico
(aprox. 0,1%) (Hizukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984),
1-10; Takeda y col. Carbohydr. Res. 132, (1984),
83-92).
Las características funcionales del almidón, tal
como, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de
retrogradación, la capacidad de unión al agua, las características
de formación de película, la viscosidad, las características de
adhesividad, la estabilidad a la
congelación-descongelación, la estabilidad al ácido,
la fuerza de gelificación, el tamaño del gránulo de almidón de los
almidones y otras se ven afectadas por la proporción
amilasa/amilopectina, el peso molecular, el patrón de la
distribución de las cadenas laterales, la concentración de iones, el
contenido de lípidos y proteínas, el tamaño medio del gránulo de
almidón del almidón, la morfología del gránulo de almidón etc. Las
características funcionales del almidón también se ven afectadas por
el contenido en fosfato, un componente que no es carbono del
almidón. Se discrimina entre el fosfato que está covalentemente
unido a las moléculas de glucosa en forma de monoésteres (designado
más adelante como fosfato de almidón) y el fosfato en forma de
fosfolípidos con el almidón asociado.
La concentración del fosfato del almidón varía
en función del tipo de planta. Por tanto, ciertos mutantes de maíz
sintetizan un almidón con una concentración mayor de fosfato de
almidón (maíz céreo 0,002% y maíz rico en amilasa 0,013%), mientras
que las especies convencionales de maíz sólo tienen trazas de
fosfato de almidón. Asimismo se encuentran cantidades pequeñas de
fosfato de almidón en trigo (0,001%), mientras que no se ha
mostrado la presencia de fosfato de almidón en avena y sorgo.
Asimos, se encuentra menos fosfato de almidón en mutantes de arroz
que en las especies de arroz convencionales (0,013%). Se han
mostrado cantidades significativas de fosfato de almidón en bulbos
o en plantas que sintetizan almidón de almacenamiento en la raíz,
tales como tapioca (0,008%), batata (0,011%), arruruz (0,021%) o
patata (0,089%). Los valores en porcentaje citados en lo que
antecede para el contenido en fosfato de almidón se refieren a los
respectivos pesos secos del almidón y han sido determinados por
Jane y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11),
827-832).
El fosfato de almidón puede existir en forma de
monoésteres en la posición C-2, C3 o C6 de los
monómeros de glucosa polimerizados (Takeda y Hizukuri, 1971,
Starch/Stärke 23, 267-272). La distribución del
fosfato del fosfato del almidón sintetizado por plantas normalmente
muestra que aproximadamente del 30% al 40% de los residuos de
fosfato están unidos covalentemente en la posición
C-3 y aproximadamente del 60% al 70% de los
residuos de fosfato están covalentemente unidos en la posición
C-6 de las moléculas de glucosa (Blennow y col.,
Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211 218). Blennow y col.
2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174)
determinaron una concentración de fosfato de almidón que está unido
en la posición C-6 de las moléculas de glucosa para
varios almidones, tal como almidón de patata (entre 7,8 y 33,5 nMol
por mg de almidón, según la especie), almidón de varias especies de
Curcuma (entre 1,8 y 63 nMol por mg de almidón), almidón de
tapioca (2,5 nMol por mg de almidón), almidón de arroz (1,0 nMol
por mg de almidón), almidón de fríjol (3,5 nMol por mg de almidón y
almidón de sorgo (0,9 nMol por mg de almidón). Estos autores no
pudieron detectar fosfato de almidón unido en la posición
C-6 en almidón de cebada y almidón de varias
mutantes céreos del maíz. Todavía no se ha establecido ninguna
conexión entre el genotipo de una planta y la concentración de
fosfato de almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11),
827-832). Por tanto, actualmente no es posible
afectar a la concentración de fosfato de almidón en plantas a
través de medidas
de cultivo.
de cultivo.
Anteriormente sólo se ha descrito una proteína
que produce la introducción de enlaces covalentes de residuos de
fosfato en las moléculas de glucosa del almidón. Esta proteína tiene
la actividad enzimática de una alfa-glucano
hidro-discinasa (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte y col.,
2002, PNAS 99, 7166-7171), a menudo se designa como
R1 en la literatura científica y está unida a los gránulos de
almidón del almidón para almacenamiento en tubérculos de patata
(Loberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16,
473-477). En la reacción catalizada por R1, los
eductos alfa-1,4-glucano (almidón),
adenosinatrifosfato (ATP) y agua se convierten en los productos
glucanofosfato (fosfato de almidón), monofosfato y
adenosinamonofosfato. Al mismo tiempo, el residuo de
gamma-fosfato del ATP se transfiere al agua y el
residuo de beta-fosfato del ATP se transfiere al
glucano (almidón). El R1 transfiere el residuo
beta-fosfato in vitro desde el ATP a la
posición C-6 y C-3 de las moléculas
de glucosa de alfa-1,4-glucanos. La
proporción entre fosfato en C-6 fosfato y el fosfato
en C-3 que se obtiene mediante la reacción in
vitro corresponde a la proporción que existe en almidón aislado
en plantas (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171).
Dado que aproximadamente el 70% del fosfato de almidón presente en
el almidón de patata está unido a los monómeros de glucosa del
almidón en la posición C-6 y aproximadamente el 30%
en la posición C-3, esto significa que R1
fosforila, preferentemente, la posición C-6 de las
moléculas de glucosa. Además, se ha mostrado que, entre otras
cosas, mediante el uso de la amilopectina del maíz, la R1 puede
fosforilar los alfa-1,4-glucanos,
que todavía no contienen fosfato covalentemente unido (Ritte y
col., 2002, PNAS 99, 7166-7171), es decir, la R1
puede introducir fosfato de novo en
alfa-1,4-glucanos.
En el documento WO 02 34923 se describen plantas
de trigo que tienen una mayor actividad de una proteína R1 a través
de la sobreexpresión de un gen R1 de las patatas. Estas plantas
sintetizan un almidón con cantidades significativas de fosfato de
almidón en la posición C-6 de las moléculas de
glucosa en comparación con las correspondientes plantas salvajes en
las que no se pudo detectar fosfato de almidón.
Anteriormente no se han descrito otras
proteínas, que catalizan una reacción, que introducen en el almidón
grupos fosfato unidos covalentemente. Asimismo se desconocen las
enzimas que introducen, preferentemente, grupos fosfato en la
posición C-3 y/o la posición C-2 de
las moléculas de glucosa del almidón. Por tanto, aparte del
incremento del contenido en fosfato de almidón en las plantas,
tampoco se dispone de modos de influir específicamente sobre la
fosforilación del almidón en las plantas, de modificar la
distribución del fosfato dentro del almidón sintetizado por las
plantas y/o de incrementar más el contenido en fosfato de
almidón.
Por tanto, el objeto de la presente invención se
basa en proporcionar almidones modificados con mayor contenido en
fosfato y/o una distribución modificada del fosfato, así como
células de plantas y/o plantas que sintetizan tal almidón
modificado, además de procedimientos y medios para la producción de
dichas plantas y/o células vegetales.
Este problema se resuelve mediante las formas de
realización descritas en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a una célula
vegetal genéticamente modificada o una planta genéticamente
modificada, que se caracteriza porque tiene una mayor
actividad de al menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
y al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes
o plantas salvajes que todavía no se han modificado genéticamente,
en la que la célula vegetal o la planta contiene una primera
molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma
natural en la correspondiente célula vegetal salvaje o planta
salvaje que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
y una segunda molécula de ácido nucleico extraña que no se produce
de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje o
planta salvaje que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
en el genoma de la célula vegetal.
La presente invención describe células vegetales
y plantas genéticamente modificadas, que se caracteriza
porque tienen una mayor actividad de al menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en comparación con las correspondientes células
vegetales salvajes o plantas salvajes que no se han modificado
genéticamente.
La presente invención describe una célula
vegetal o planta que está genéticamente modificada, en la que la
modificación genética conduce a un incremento de la actividad de al
menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y, de forma simultánea, al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en comparación con las correspondientes células
vegetales salvajes o plantas salvajes que no se han modificado
genéticamente.
En la presente invención, la expresión "célula
vegetal salvaje" significa que las células vegetales afectadas
se usaron como material de partida para la fabricación de las
células vegetales de acuerdo con la invención, es decir su
información genética, aparte de la modificación genética
introducida, corresponde a la de una célula vegetal de acuerdo con
la invención.
En la presente invención, el término "planta
salvaje" significa que las plantas objeto de interés se usaron
como material de partida para la fabricación de las plantas de
acuerdo con la invención, es decir su información genética, aparte
de la modificación genética introducida, corresponde a la de una
planta de acuerdo con la invención.
En la presente invención, el término
"correspondiente" significa que, en la comparación de varios
objetos, los objetos a los que atañe que se comparan entre sí se
han conservado en las mismas condiciones. En la presente invención,
el término "correspondiente" junto con célula vegetal salvaje o
planta salvaje en comparación con las células vegetales o plantas
genéticamente modificadas significa que las células vegetales o las
plantas, que se comparan entre sí, se han cultivado en las mismas
condiciones de cultivo y que tienen la misma edad (cultivo).
En el presente documento, dentro de la
estructura de la presente invención, el término "mayor actividad
de al menos una proteína OK1" significa un incremento en la
expresión de genes endógenos, que codifican proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) y/o un incremento en la cantidad de la(s)
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) en las células y/o un incremento en la actividad
enzimática de la(s) proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) en las células.
En el presente documento, dentro de la
estructura de la presente invención, el término "mayor actividad
de al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1)" significa un incremento en la expresión de genes
endógenos, que codifican proteínas R1 y/o un incremento en la
cantidad de la(s) proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en las células y/o un incremento en la actividad
enzimática de la(s) proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1) en las células.
El incremento en la expresión puede determinarse
mediante, por ejemplo la medición de la cantidad de transcritos que
codifican proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) o proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1).
Esto puede realizarse mediante análisis de
transferencia de tipo Northern o RT-PCR. En el
presente documento, un incremento significa, preferentemente, un
incremento en la cantidad de transcritos en comparación con las
células correspondientes que no se han modificado genéticamente en
al menos un 50%, en particular en al menos un 70%, preferentemente
en al menos un 85% y, particularmente preferentemente, en al menos
un 100%. Un incremento en la cantidad de transcritos que codifican
una proteína
[P-glucan]hidro-discinasa
(proteína OK1) también significa que las plantas o las células
vegetales que no presentan cantidades detectables de transcritos que
codifican una proteína(s)
[P-glucan]hidro-discinasa
(proteína OK1) tienen cantidades detectables que codifican una
proteína(s)
[P-glucan]hidro-discinasa
(proteína OK1) tras la modificación genética de acuerdo con la
invención.
Un incremento en la cantidad de transcritos que
codifican una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) también significa que las plantas o las células
vegetales que no presentan cantidades detectables de transcritos
que codifican una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]hidro-discinasa
(proteína R1) tienen cantidades detectables de transcritos que
codifican una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]hidro-discinasa
(proteína R1) tras la modificación genética de acuerdo con la
invención.
El incremento en la cantidad de proteína de una
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]hidro-discinasa
(proteína R1), que tiene como resultado un incremento de la
actividad de estas proteínas en las células vegetales objeto de
interés puede determinarse mediante, por ejemplo, procedimientos
inmunológicos tales como análisis de transferencia de tipo Western,
ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) o RIA
(radioinmunoensayo). En el presente documento, un incremento
significa, preferentemente, un incremento en la cantidad de
proteína en comparación con las células correspondientes que no se
han modificado genéticamente en al menos un 50%, en particular en
al menos un 70%, preferentemente en al menos un 85% y,
particularmente preferentemente, en al menos un 100%. Un incremento
en la cantidad de una proteína OK1 también significa que las
plantas o células vegetales que no tienen actividad detectable de
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) tienen una cantidad detectable de una
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) tras la modificación genética de acuerdo con la
invención. Un incremento en la cantidad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) también significa que las plantas o las células
vegetales que no presentan actividad detectable de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) tiene una cantidad detectable de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) tras la modificación genética de acuerdo con la
invención.
El experto en la técnica conoce procedimientos
para la fabricación de anticuerpos que reaccionan específicamente
con una proteína diseñada, es decir que se une específicamente a
dicha proteína (véase, por ejemplo, Lottspeich y Zorbas (Eds.),
1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlín, ISBN
3-8274-0041-4).
Varias empresas (por ejemplo Eurogentec, Bélgica) ofrece como
servicio contractual la fabricación de dichos anticuerpos. Además,
más adelante (véase el ejemplo 10) se describe una posibilidad para
la fabricación de anticuerpos que reaccionan específicamente con
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1). Lorberth y col. (1998, Nature Biotechnology 16,
473-477) y Ritte y col. (2000, Plant Journal 21,
387-391) describen un anticuerpo con el que se
puede determinar un incremento en la cantidad de proteína R1 por
medio de procedimientos inmunológicos.
Dentro de la estructura de la presente
invención, debe entenderse que el término
"[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1)" significa una proteína que transfiere un residuo
de fosfato desde el ATP al almidón que ya está fosforilado
(Almidón-P). Los almidones aislados de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana no
tienen una cantidad detectable de residuos de fosfato covalentemente
unidos y no son fosforilados por una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1), es decir una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de acuerdo con la invención requiere el almidón que
ya está fosforilado como sustrato para la transferencia de residuos
de fosfato
adicionales.
adicionales.
Preferentemente, el residuo de
beta-fosfato del ATP se transfiere de una proteína
OK1 al almidón y el residuo de gamma-fosfato del
ATP se transfiere al agua. Como producto de reacción adicional se
forma AMP (adenosinamonofosfato) durante una reacción de
fosforilación de Almidón-P llevada a cabo por una
proteína OK1. Por tanto, una proteína OK1 se designa como
alfa-glucan-fosforilada]-hidro-discinasa
([P-glucan]-hidro-discinasa)
o como [almidón
fosforilado]-hidro-discinasa.
Por tanto, las proteínas
[P-glucan]-hidro-discinasas
(proteínas OK1) catalizan una reacción de acuerdo con la fórmula
siguiente:
P-glucan + ATP +
H_{2}O \rightarrow
P-glucan-P + AMP +
Pi
Preferentemente, un enlace monoéster fosfato en
la posición C-6 y/o en la posición
C-3 de una molécula de glucosa del
Almidón-P se forma en el Almidón-P
fosforilado por una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1). En particular, preferentemente, se forman varios
enlaces monoéster fosfato adicionales en la posición
C-3 durante la fosforilación de
Almidón-P catalizado por una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) en comparación con enlaces monoéster fosfato en la
posición C-6 de las moléculas de glucosa del
Almidón-P correspondiente.
Las secuencias de aminoácidos que codifican
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) contienen un dominio de fosfohistidina. Los
dominios fosfohistidina se describen en, por ejemplo,
Tien-Shin Yu y col. (2001, Plant Cell 13,
1907-1918). Los dominios fosfohistidina de
la(s) proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) que codifican secuencias de aminoácido contienen,
preferentemente, dos histidinas.
Durante la catálisis de una reacción de
fosforilación de Almidón-P mediante una
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) se forma una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
fosforilada (proteína OK1) como producto intermedio a través del
cual un residuo de fosfato del ATP se une covalentemente a un
aminoácido de la pro-
teína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1). El producto intermedio se forma mediante autofosforilación de la(s) proteína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1), es decir la propia proteína OK1 cataliza la reacción que conduce al producto intermedio. Preferentemente, un residuo de histidina de la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1) se fosforila mediante la autofosforilación, en particular preferentemente un residuo de histidina que es parte de un dominio de fosfohistidina.
teína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1). El producto intermedio se forma mediante autofosforilación de la(s) proteína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1), es decir la propia proteína OK1 cataliza la reacción que conduce al producto intermedio. Preferentemente, un residuo de histidina de la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína(s) [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1) se fosforila mediante la autofosforilación, en particular preferentemente un residuo de histidina que es parte de un dominio de fosfohistidina.
Además, la(s) proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) de acuerdo con la invención tienen una mayor
actividad de unión al Almidón-P en comparación con
el almidón no fosforilado.
Dado que todavía no se han descrito enzimas que
requieran Almidón-P como sustrato con el fin de
fosforilarlas más, hasta ahora no ha sido posible aumentar la
concentración del fosfato de almidón del almidón que ya está
fosforilado en las plantas más allá de una cierta cantidad. Esto
sólo es posible mediante el uso de una proteína de acuerdo con la
invención o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención para la modificación genética de plantas. La aclaración
de la función de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y con ella la preparación de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) significa que sólo las plantas que sintetizan un
almidón con características modificadas pueden modificarse
genéticamente a tal efecto. La modificación de la distribución de
fosfato en el almidón sintetizado por plantas no ha sido posible
hasta ahora por la falta de medios disponibles. Mediante la
preparación de proteínas de acuerdo con la invención y de ácidos
nucleicos mediante la presente invención, ahora también es posible
una modificación de la proporción de fosfato en almidones nativos.
Otra ventaja de la presente invención es que, para una cooperación
simultánea de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) con una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), en el almidón se incorporan mayores cantidades de
fosfato que cuando las respectivas proteínas separadas unas de
otras en el espacio o el tiempo fosforilan el almidón y el
Almidón-P, respectivamente.
Dentro de la estructura de la presente
invención, debe entenderse que el término
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) significa una proteína que transfiere un residuo de
fosfato desde el ATP al almidón. Los almidones aislados de hojas de
un mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana no
tienen una cantidad detectable de residuos de fosfato
covalentemente unidos pero se fosforilan de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1). Esto significa que el almidón no fosforilado, por
ejemplo aislado de hojas de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana, se usa como sustrato en una reacción
de fosforilación catalizada por una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Preferentemente, el residuo de
beta-fosfato del ATP se transfiere desde una
proteína R1 al almidón y el residuo de
gamma-fosfato del ATP se transfiere al agua. Como
producto adicional de la reacción se produce AMP
(adenosinamonofosfato). Por tanto, una proteína R1 se designa como
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
o como almidón-hidro-discinasa
(E.C.: 2.7.9.4; Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171).
Durante la fosforilación del almidón catalizada
por una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), tiene como resultado más enlaces monoéster fosfato
adicionales en la posición C-6 de las moléculas de
glucosa en comparación con los enlaces monoéster fosfato en la
posición C-3 de las moléculas de glucosa del
almidón correspondiente. Mediante una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), aproximadamente el 60% al 70% del residuo fosfato se
introduce en la posición C-6 de las moléculas de
glucosa del almidón y aproximadamente del 30% al 40% del residuo
fosfato se introduce en la posición C-3 de las
moléculas de glucosa del almidón (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171).
Durante la catálisis de una reacción de
fosforilación de almidón mediante una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se forma una proteína R1 fosforilada como producto
intermedio a través del cual un residuo de fosfato del ATP se une
covalentemente a un aminoácido de la proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171). El producto intermedio es resultado de
la autofosforilación de la proteína R1, es decir la propia proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) cataliza la reacción que conduce al producto
intermedio. Las secuencias de aminoácidos que codifican
proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1) contienen un dominio de fosfohistidina. Los dominios
fosfohistidina se describen en, por ejemplo,
Tien-Shin Yu y col. (2001, Plant Cell 13,
1907-1918). Los dominios fosfohistidina de
la(s) proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1) que codifican secuencias de aminoácido contienen,
preferentemente, una histidina. Mediante la autofosforilación de
una(s) proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), se fosforila un residuo de histidina en el dominio
de fosfohistidina de la secuencia de aminoácidos que codifica
una(s) proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) (Mikkelsen y col., 2003, Biochemical Journal
Intermediate Publication). Publicado en octubre de 2003 como
manuscrito BJ20030999; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal
377, 525-532).
Secuencias de ácidos nucleicos y las
correspondientes secuencias de aminoácidos que codifican una
proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se describen en diferentes especies, tales como la
patata (documento WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533),
trigo (documento WO 00 77229, documento US 6,462,256, GenBank Acc.:
AAN93923, GenBank Acc.: AR236165), arroz (GenBank Acc.: AAR61445,
GenBank Acc.: AR400814), maíz (GenBank Acc.: AAR61444, GenBank Acc.:
AR400813), soja (Gen-Bank Acc.: AAR61446, GenBank
Acc.: AR400815), cítrico (GenBank Acc.: AY094062) y
Arabidopsis (GenBank Acc.:AF312027). Las secuencias de
ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos identificadas que
codifican proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]hidro-discinasa
(proteínas R1) se publican en NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/), entre otros, y
explícitamente están incluidas en la descripción de la presente
solicitud por mención de las referencias.
En la presente invención, el término "mayor
actividad de unión" debe entenderse como una mayor afinidad de
una proteína por un primer sustrato en comparación con un segundo
sustrato. Es decir, la cantidad de proteína que, en las mismas
condiciones de incubación, se une a un primer sustrato en mayor
medida en comparación con un segundo sustrato, exhibe mayor
actividad de unión al primer sustrato.
En la presente invención, el término "fosfato
de almidón" debe entenderse como grupos fosfato unidos
covalentemente a las moléculas de glucosa del almidón.
En la presente invención, el término "almidón
no fosforilado" debe entenderse como un almidón que no contienen
cantidad detectable de fosfato de almidón. Se han descrito varios
procedimientos para la determinación de la cantidad de fosfato de
almidón. Preferentemente, los procedimientos descritos por Ritte y
col. (2000, Starch/Stärke 52, 179-185) se pueden
usar para la determinación de la cantidad de fosfato de almidón. En
particular, preferentemente, la determinación de la cantidad de
fosfato de almidón se lleva a cano por medio de
RMN-^{31}P de acuerdo con los procedimientos
descritos por Kasemusuwan y Jane (1996, Cereal Chemistry 73,
702-707).
En la presente invención, el término "almidón
fosforilado" o "Almidón-P" debe entenderse
como un almidón que contiene fosfato de almidón.
La actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se puede mostrar mediante, por ejemplo, incubación
in vitro de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) usando ATP que contiene un residuo de fosfato
marcado (ATP marcado) en la posición beta. Se prefiere el ATP para
el cual el residuo fosfato está específicamente marcado en la
posición beta, es decir para el cual sólo el residuo fosfato en la
posición beta porta un marcador. Preferentemente se usa ATP marcado
radiactivamente. En particular, se prefiere el uso de ATP para el
cual el residuo fosfato está específicamente marcado radiactivamente
y, especialmente se prefiere el uso de ATP para el cual el residuo
fosfato está específicamente marcado con ^{33}P en la posición
beta. Si se incuba una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) con ATP marcado y almidones que no están
fosforilados, no se transfiere fosfato mediante la
[P-glucan]-hidro-discinasa
(OK1) al almidón. Preferentemente se usa un almidón de la hoja del
mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana
(Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13,
1907-1918).
No obstante, si se incuba una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) con Almidón-P en presencia de ATP
marcado, posteriormente se puede mostrar el fosfato marcado unido
covalentemente al Almidón-P. Preferentemente se usa
almidón de hojas de Arabidopsis thaliana, particularmente
preferido por medio de un almidón enzimáticamente fosforilado de
una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) del mutante sex1-3 de Arabidopsis
thaliana (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171).
Se pueden mostrar residuos de fosfato marcados
unidos mediante una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) en Almidón-P mediante, por ejemplo,
separación del Almidón-P marcado (por ejemplo
mediante precipitación por medio de etanol, filtración,
procedimientos cromatográficos, etc.) desde el residuo de la mezcla
de reacción y la posterior detección del residuo fosfato marcado en
la fracción del Almidón-P. Al mismo tiempo, los
residuos de fosfato marcados unidos en la fracción de
Almidón-P se pueden mostrar mediante, por ejemplo,
determinación de la cantidad de la radioactividad existente en la
fracción de Almidón-P (por ejemplo, por medio de un
contador de centelleo). Posibles procedimientos para la detección
de una proteína, que hace necesario Almidón-P como
sustrato para una reacción de fosforilación, se describe con más
detalle a continuación en el Apartado 11 Procedimientos Generales y
en el ejemplo 6.
La actividad de una proteína
[alpha-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se puede mostrar cono se ha descrito en la
literatura, por ejemplo Mikkelsen y col., 2003, Biochemical Journal
Intermediate Publication. Publicado en octubre de 2003 como
manuscrito BJ20030999; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal
377, 525-532, Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171).
Las posiciones de los átomos de carbono
(C-2, C-3 o C-6) de
los monómeros de glucosa en el Almidón-P son
fosforiladas, preferentemente, por una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se pueden determinar mediante, por ejemplo, análisis
de los P-almidones fosforilados por una proteína,
tal como han descrito Ritte y col. (2002, PNAS 99,
7166-7171). Para este fin, un
Almidón-P fosforilado por una proteína se hidroliza
usando un ácido y después se analiza por medio de cromatografía de
intercambio aniónico.
Preferentemente, el Almidón-P
fosforilado por una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se analiza por medio de RMN con el fin de establecer
qué posiciones de los átomos de carbono C-2,
C-3 o C-6) de los monómeros de
glucosa en el Almidón-P se fosforilan. Un
procedimiento particularmente preferido para identificar las
posiciones de los átomos de C de una molécula de glucosa de un
almidón, que se fosforilan mediante una reacción catalizada por una
proteína -glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se describe más adelante en el Apartado 13,
Procedimientos Generales.
Las posiciones de los átomos de carbono
(C-2, C-3 o C-6) de
los monómeros de glucosa en el Almidón son fosforiladas,
preferentemente, por una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se pueden determinar mediante, por ejemplo, análisis
de los almidones fosforilados por una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), tal como han descrito Ritte y col. (2002, PNAS 99,
7166-7171). Para este fin, un almidón fosforilado
por una proteína se hidroliza usando un ácido y después se analiza
por medio de cromatografía de intercambio
aniónico.
aniónico.
Preferentemente, el Almidón-P
fosforilado por una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o el almidón fosforilado por una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se analiza por medio de RMN con el fin de establecer
qué posiciones de los átomos de carbono C-2,
C-3 o C-6) de los monómeros de
glucosa en el Almidón-P o el almidón se fosforilan.
Un procedimiento particularmente preferido para identificar las
posiciones de los átomos de C de una molécula de glucosa de un
almidón, que se fosforilan mediante una reacción catalizada por una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se describe más adelante en el Apartado 13,
Procedimientos Generales.
Una proteína fosforilada, que se produce como
producto intermedio en la fosforilación del
Almidón-P facilitada por una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se puede demostrar para una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) tal como se han descrito en, por ejemplo, Ritte y
col. (2002, PNAS 99, 7166-7171) o Mikkelsen y col.
(2003, Biochemical Journal Intermediate Publication. Publicado en
octubre de 2003 como manuscrito BJ20030999; Mikkelsen y col., 2004,
Biochemical Journal 377, 525-532).
Para demostrar la presencia de un producto
intermedio autofosforilado, primero se incuba una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) en ausencia de almidón con ATP marcado,
preferentemente con ATP específicamente marcado en la posición beta
fosfato, particularmente preferentemente con ATP específicamente
marcado con ^{33}P en la posición beta fosfato. En paralelo con
esto, no obstante, una preparación de reacción 2, que en lugar de
ATP marcado contiene las correspondientes cantidades de ATP no
marcado, se incuba en condiciones por otro lado idénticas.
Posteriormente, el ATP no marcado se añade a la mezcla de reacción 1
en exceso y una mezcla de ATP no marcado y ATP marcado (la misma
cantidad de ATP marcado que se ha usado anteriormente en la mezcla
de reacción 1 y la misma cantidad de ATP no marcado que se ha
añadido a la mezcla de reacción 1 en exceso) se añade a la mezcla
de reacción 2 y después se incuba antes de añadir
Almidón-P a una parte A de la mezcla de reacción 1
(Parte 1A) o a una parte A de la mezcla de reacción 2 (Parte 2A),
respectivamente. La reacción en el resto de la Parte 1B y la parte
2B de la mezcla de reacción se detiene mediante desnaturalización de
la proteína. La parte B de la mezcla de reacción se puede detener
mediante los procedimientos conocidos para el experto en la
técnica, que conducen a la desnaturalización de proteínas,
preferentemente añadiendo laurilsulfato sódico (SDS). La parte 1A y
la parte 2A de la mezcla de reacción de la mezcla de reacción se
incuban durante al menos otros 10 minutos antes de que estas
reacciones también se detengan. El almidón presente en la parte A y
la parte B de la respectiva mezcla de reacción se separa del resto
de la mezcla de reacción. Si el almidón respectivo se separa
mediante, por ejemplo, centrifugación, al completar la
centrifugación, el almidón de la respectiva parte A o parte B de la
mezcla de reacción se va a encontrar en el precipitado sedimentado y
las proteínas en la respectiva mezcla de reacción se van a
encontrar en el sobrenadante de la respectiva centrifugación. El
sobrenadante de la parte 1A o 2A, respectivamente, y la parte 1B o
2B respectivamente de la mezcla de reacción puede analizarse
después mediante electroforesis desnaturalizante en gel de
acrilamida, seguido por autorradiografía del gel de acrilamida
obtenido. Para cuantificar la cantidad de proteínas marcadas
radiactivamente, que se han separado por medio de electroforesis en
gel de acrilamida, se puede usar, por ejemplo, el procedimiento
denominado "fosfo-imagen", conocido para el
experto en la técnica. Si la autorradiografía o el análisis por
medio de la "fosfo-imagen" de las proteínas en
el sobrenadante de centrifugación de la parte B de la mezcla de
reacción 1 muestra un incremento significativo de la señal en
comparación con el sobrenadante de centrifugación de la parte A de
la mezcla de reacción 1, esto muestra que una proteína que facilita
una fosforilación de almidón se produce como producto intermedio
autofosforilado. Las parte A y B de la mezcla de reacción 2 sirven
como control y, por tanto, no deberían exhibir un incremento
significativo de la señal en el sobrenadante de la centrifugación
en la autorradiografía o en el análisis por medio de la
"fosfo-imagen".
Además, el almidón de la respectiva parte A de
las mezclas de reacción 1 y 2 que quedan en el respectivo
precipitado sedimentado se puede investigar, en caso necesario,
tras el posterior lavado de los respectivos almidones para detectar
la presencia de fosfato de almidón, que tiene una marca
correspondiente al ATP marcado usado. Si los almidones de la parte
A de la mezcla de reacción 1 contienen residuos de fosfato marcados
y si la autorradiografía del sobrenadante de la centrifugación de
la parte B de la mezcla de reacción 1 muestra un incremento
significativo de la señal en la autorradiografía en comparación con
el sobrenadante de la centrifugación de la parte A de la mezcla de
reacción 1, esto muestra que una fosforilación de la proteína
facilitadora de almidón está presente como un producto intermedio
autofosforilado. Las partes A y B de la mezcla de reacción 2 sirven
como control y, por tanto, no deberían exhibir un incremento
significativo de la señal para detectar
alfa-1,4-glucanos marcados con, por
ejemplo, ^{33}P en el precipitado sedimentado que contiene
alfa-1,4-glucanos. Posibles
procedimientos para demostrar una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
fosforilada (proteína OK1) como producto intermedio se describen
más adelante en el apartado 12, Procedimientos generales, y en el
ejemplo 7.
El hecho de que una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) tenga una mayor actividad de unión a un
Almidón-P en comparación con un almidón no
fosforilado se puede demostrar mediante la incubación de la
proteína OK1 con Almidón-P y almidón no fosforilado
en preparaciones distintas.
Todos los almidones no fosforilados son
básicamente adecuados para incubar la proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
fosforilada (proteínas OK1) con almidón no fosforilado.
Preferentemente se usa un almidón vegetal no fosforilado,
particularmente preferido almidón de trigo, y especialmente
preferido almidón de hoja granular de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana.
El experto en la técnica conoce procedimientos
para aislar almidón de, por ejemplo, plantas. Todos los
procedimientos conocidos por el experto en la técnica son
básicamente adecuados para aislar almidón no fosforilado de las
especies vegetales adecuadas. Preferentemente se usan los
procedimientos para aislar almidón no fosforilado que se describen
más adelante (véase el apartado 2, Procedimientos generales).
Todos los almidones fosfato de almidón son
básicamente adecuados para incubar proteínas
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) con Almidón-P. Para este fin
también se pueden usar almidones químicamente fosforilados.
Preferentemente se usan P-almidones para la
incubación con proteínas
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1), particularmente preferida es un almidón vegetal
fosforilado retrospectivamente enzimáticamente, especialmente
preferido es un almidón vegetal fosforilado retrospectivamente
enzimáticamente, que se ha aislado de un mutante
sex-1 de Arabidopsis thaliana.
Para demostrar un incremento en la actividad de
unión de las proteínas
[P-glucan]hidro-discinasa
(proteínas OK1) al Almidón-P en comparación con el
almidón no fosforilado, las proteínas
[P-glucan]hidro-discinasa
(proteínas OK1) se incuban en preparaciones aparte con
Almidón-P (Preparación A) y con almidón no
fosforilado (Preparación B). Al finalizar la incubación, las
proteínas, que no están unidas a los almidones relacionados de las
preparaciones A y B, se separan de los almidones y de las proteínas
unidas a ellos. El enlace entre las proteínas y el
Almidón-P en la preparación A y el enlace entre las
proteínas y el almidón no fosforilado en la preparación B se
eliminan después, es decir, las respectivas proteínas se disuelven.
Las proteínas disueltas de la preparación a y la preparación B se
pueden separar después de los almidones objeto de interés, que están
presentes en las respectivas preparaciones. Tras esto, las
proteínas de unión a Almidón-P aisladas de la
preparación A y las proteínas de unión a almidón no fosforilado
aisladas de la preparación B se pueden separar con la ayuda de
procedimientos conocidos para el experto en la técnica, tal como,
por ejemplo, filtración en gel, métodos cromatográficos,
electroforesis, electroforesis en gel de acrilamida SDS etc.
Comparando las cantidades de proteínas separadas de la preparación
A como las cantidades de las correspondientes proteínas separadas de
la preparación B, se puede determinar si una proteína tiene una
mayor actividad de unión con respecto al Almidón-P
en comparación con el almidón no fosforilado. Procedimientos que se
pueden usar para demostrar una unión preferida de proteínas a
Almidón-P en comparación con almidón no fosforilado
se describen más adelante en el ejemplo 8.
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC
ID Nº 2 codifica una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Arabidopsis thaliana y la secuencia de
aminoácidos que se muestra bajo el SEC ID Nº 4 codifica una
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Oryza sativa.
En otra forma de realización de la presente
invención, las secuencias de aminoácidos que codifican una
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) tienen una identidad de al menos 60% con la secuencia
especificada en la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4, en particular de
al menos 70%, preferentemente de al menos 80% y, particularmente
preferentemente de al menos 90%, y especialmente preferentemente de
al menos 95%.
En otra forma de realización de la presente
invención, la proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) tiene un dominio de fosfohistidina. Las secuencias
de aminoácidos que codifican proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) contienen un dominio de fosfohistidina que tiene
una identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos
del dominio de fosfohistidina de la proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Arabidopsis thaliana especificada en la
SEC ID Nº 5, en particular de al menos un 70%, preferentemente de
al menos un 80% y particularmente preferentemente de al menos un 90%
y especialmente preferentemente de al menos un 95%.
La presente invención se refiere a una célula
vegetal genéticamente modificada de acuerdo con la invención o a
una planta genéticamente modificada de acuerdo con la invención
donde la modificación genética consiste en la introducción de al
menos una molécula de ácido nucléico extraña en el interior del
genoma de la célula vegetal o en el interior del genoma de la
planta.
En este contexto, el término "modificación
genética" significa la introducción de moléculas de ácido
nucleico extrañas homólogas y/o heterólogas en el genoma de una
célula vegetal o en el genoma de una planta, en la que dicha
introducción de estas moléculas conduce a un incremento en la
actividad de una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y al incremento de la actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Las células vegetales de acuerdo con la
invención o las plantas de acuerdo con la invención se modifican con
respecto a su información genética mediante la introducción de una
molécula de ácido nucleico extraña. La presencia o la expresión de
una molécula de ácido nucleico extraña conducen a un cambio
fenotípico. En este documento, cambio "fenotípico" quiere
decir, preferentemente, un cambio mensurable de uno o más funciones
de las células. Por ejemplo, las células vegetales genéticamente
modificadas de acuerdo con la invención y las plantas genéticamente
modificadas de acuerdo con la invención exhiben un incremento de la
actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y un incremento de la actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) debido a la presencia o sobre la expresión de la
molécula de ácido nucleico introducida.
En la presente invención, se entiende que el
término "molécula de ácido nucleico extraña" significa una
molécula tal que no se produce de forma natural en las células
vegetales salvajes correspondientes o que no se produce de forma
natural en la organización espacial concreta en las células
vegetales salvajes o que está localizada en un lugar del genoma de
la célula vegetal salvaje en la que no se produce de forma natural.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico extraña es una
molécula recombinante que consta de diferentes elementos, cuya
combinación u organización espacial específica no se produce de
forma natural en las células vegetales.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "genoma" significa la totalidad del material genético
presente en una célula vegetal. El experto en la técnica sable que,
además del núcleo celular, otros compartimentos (p. ej.,
plastidios, mitocondrias) también contienen material genético.
En otra forma de realización, las células
vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención se caracterizan porque una molécula de ácido
nucleico extraña codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1), preferentemente una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Arabidopsis thaliana o una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Oryza sativa.
En otra forma de realización, la molécula de
ácido nucleico extraña codifica una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) con la secuencia especificada en las SEC ID Nº 2 o
la SEC ID Nº 4.
En otra forma de realización, las células
vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención se caracterizan porque una molécula de ácido
nucleico extraña codifica una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), preferentemente una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) de patata o una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Oryza sativa.
En otra forma de realización, la molécula de
ácido nucleico extraña codifica una proteína R1 de la patata con la
secuencia de aminoácidos especificada en GenBank Acc.: Y09533
(22-JUL-2003 Rel. 76, última
actualización, versión 2). Las moléculas de ácido nucleico y las
secuencias de aminoácidos que codifican una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) de patata (GenBank Acc.: Y09533) están explícitamente
incluidas en la descripción de la presente solicitud por mención de
las referencias.
En otra forma de realización, las células
vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención se caracterizan porque una primera molécula de
ácido nucleico extraña codifica una proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), y una segunda molécula de ácido nucleico extraña
codifica una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1).
Las moléculas de ácido nucleico extrañas
ensambladas para la modificación genética en la célula vegetal o
planta pueden ser una única molécula de ácido nucleico o múltiples
moléculas de ácido nucleico. Por tanto, pueden ser moléculas de
ácido nucleico que contienen secuencias de ácido nucleico que
codifican proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) y secuencias de ácido nucleico que codifican
proteína(s)
alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), así como moléculas de ácido nucleico para las que
las secuencias de ácido nucleico que codifican proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas OK1) y las secuencias de ácido nucleico que codifican
proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1) se encuentran en varias moléculas de ácido nucleico.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y las secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) pueden estar contenidas simultáneamente en, por
ejemplo, un vector, plásmido o molécula de ácido nucleico lineal o,
sin embargo, ser constituyentes de dos vectores, plásmidos o
moléculas de ácido nucleico lineal respectivamente separadas unas
de otras.
Si las secuencias de ácido nucleico que codifica
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y las secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se encuentran en dos moléculas de ácido nucleico
separadas una de otra, se pueden introducir simultáneamente
("co-transformación") o de forma sucesiva, es
decir consecutivamente ("supertransformación") en el genoma de
las células vegetales o plantas. Las moléculas de ácido nucleico
separadas una de otra también se pueden introducir en varias
células vegetales individuales so plantas de una especie. De este
modo se pueden producir células vegetales o plantas en las que se
ha aumentado la actividad de al menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1). Dichas plantas se pueden producir mediante el cruce
posterior de las plantas en las que se ha aumentado la actividad de
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) con plantas en las que se ha aumentado la actividad
de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Además, se puede usar una célula mutante o un
mutante que se caracteriza porque ya tiene una mayor
actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una mayor actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en lugar de una célula vegetal salvaje o una planta
salvaje para introducir una molécula de ácido nucleico extraña. Los
mutantes pueden ser mutantes espontáneos (naturales), así como los
que se producen a través del uso dirigido de mutágenos (tales como,
por ejemplo, agentes químicos, radiación ionizante) o
procedimientos de ingeniería genética (por ejemplo, marca de
activación de T-ADN, marca activación de
transposones, activación in situ, mutagénesis in
vivo).
Por tanto, las células vegetales de acuerdo con
la invención y las plantas de acuerdo con la invención también se
pueden producir mediante la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraña que conduce al incremento de al actividad de una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en una célula mutante o en un mutante que tiene una
mayor actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1). Las células vegetales de acuerdo con la invención y
las plantas de acuerdo con la invención también se pueden producir
mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña
que conduce al incremento de al actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) en una célula mutante o en un mutante que tiene una
mayor actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Las células vegetales de acuerdo con la
invención o las plantas de acuerdo con la invención también se
pueden producir en las que un mutante en el que la actividad de una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) está aumentada se cruza con una planta que tiene una
mayor actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) debido a la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraña. Asimismo, es posible producir células vegetales
de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención en
las que un mutante en el que la actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) está aumentada se cruza con una planta que tiene una
mayor actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) debido a la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraña.
Se dispone un gran número de técnicas para la
introducción de ADN en una célula huésped vegetal. Estas técnicas
incluyen la transformación de células vegetales con
T-ADN usando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogen como medio de transformación, la
fusión de protoplastos, inyección, electroporación de ADN,
introducción de ADN por medio de un enfoque biolístico, además de
otras posibilidades.
El uso de transformación mediada por
agrobacterias de las células vegetales se ha investigado ampliamente
y descrito adecuadamente en el documento EP 120516; Hoekema, IN:
The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V.,
Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley y col., Crit. Rev. Plant
Sci. 4, 1-46 y por An y col. EMBO J. 4, (1985),
277-287. Para la transformación de la patata, véase
Rocha-Sosa y col., EMBO J. 8, (1989),
29-33, por ejemplo.
También se ha descrito la transformación de
plantas monocotiledóneas por medio de vectores basados en la
transformación con Agrobacterium (Chan y col., Plant Mol.
Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei y col., Plant J. 6,
(1994) 271-282; Deng y col., Science in China 33,
(1990), 28-34; Wilmink y col., Plant Cell Reports
11, (1992), 76-80; May y col., Bio/Technology 13,
(1995), 486-492; Conner y Domisse, Int. J. Plant
Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie y col.,
Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Un sistema
alternativo a la transformación de plantas monocotiledóneas es la
transformación por medio del enfoque biolístico (Wan y Lemaux, Plant
Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil y col.,
Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala y col.,
Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer y
col., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631),
transformación de protoplastos, electroporación de células
parcialmente permeabilizadas y la introducción de ADN por medio de
fibras de vidrio. En particular, la transformación del maíz se ha
descrito en la literatura muchas veces (cf., por ejemplo en el
documento WO95/06128, el documento EP0513849, el documento
EP0465875, el documento EP0292435; Fromm y col., Biotechnology 8,
(1990), 833-844; Gordon-Kamm y
col., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel y col.,
Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc y col.,
Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726). También ya
se ha descrito el éxito de la transformación de otros tipos de
cereales, por ejemplo para cebada (Wan y Lemaux, véase en lo que
antecede; Ritala y col., véase en lo que antecede; Krens y col.,
Nature 296, (1982), 72-74) y para trigo (Nehra y
col., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker y col.,
1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos los
procedimientos anteriores son adecuados dentro de la estructura de
la presente invención.
Entre otras cosas, las células vegetales y las
plantas que se han modificado genéticamente mediante la introducción
de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se pueden diferenciar de las células vegetales
salvajes y las plantas salvajes respectivamente en que contienen
una molécula de ácido nucleico extraña, que no se produce de forma
natural en células vegetales salvajes o plantas salvajes, o en que
dicha molécula está presente integrada en un lugar del genoma de la
célula vegetal de acuerdo con la invención o en el genoma de la
planta de acuerdo con la invención en la que no se produce en
células vegetales salvajes o plantas salvajes, es decir en un
ambiente genómico diferente.
Además, las células vegetales de acuerdo con la
invención y las plantas de acuerdo con la invención de este tipo
difieren de las células vegetales salvajes y las plantas salvajes,
respectivamente, en que contienen al menos una copia de la molécula
de ácido nucleico extraña integrada de forma estable en su genoma,
posiblemente además de las copias naturales de tal molécula en las
células vegetales salvajes o las plantas salvajes. Si la(s)
molécula(s) de ácido nucleico extraña(s) introducida
en las células vegetales de acuerdo con la invención o en las
plantas de acuerdo con la invención es(son) copias
adicionales de moléculas que ya se producen de forma natural en las
células vegetales salvajes o las plantas salvajes, respectivamente,
las células vegetales de acuerdo con la invención y plantas de
acuerdo con la invención se pueden diferenciar de las células
vegetales salvajes o las plantas salvajes, respectivamente en
particular, en que esta copia adicional o estas copias adicionales
se localiza (localizan) en lugares del genoma en los que no se
produce (o producen) de las células vegetales salvajes o las
plantas salvajes. Esto se puede verificar, por ejemplo, con la ayuda
de un análisis de transferencia de tipo southern.
Además, las células vegetales de acuerdo con la
invención y las plantas de acuerdo con la invención,
preferentemente, pueden diferenciarse de las células vegetales
salvajes o las plantas salvajes respectivamente mediante al menos
una de las características siguientes: Si una molécula de ácido
nucleico extraña que se ha introducido es heteróloga con respecto a
la célula vegetal o la planta, las células vegetales de acuerdo con
la invención o las plantas de acuerdo con la invención tienen
transcritos de las moléculas de ácido nucleico extrañas. Éstas se
pueden verificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de
tipo Northern o mediante RT-PCR (reacción en cadena
de la polimerasa con transcripción inversa). Las células vegetales
de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la
invención, que expresan un tránscrito antisentido y/o de ARNi se
pueden verificar con la ayuda de, por ejemplo, sondas específicas
de ácido nucleico, que son complementarias al ARN (que se produce
de forma natural en la célula vegetal), que codifica la proteína.
Preferentemente, las células vegetales de acuerdo con la invención
y las plantas de acuerdo con la invención contienen una proteína,
codificada por una molécula de ácido nucleico introducida. Esto se
puede demostrar por procedimientos inmunológicos, por ejemplo, en
particular, mediante un análisis de transferencia de tipo
Western.
Si la molécula de ácido nucleico extraña que se
ha introducido es homóloga con respecto a la célula vegetal o la
planta, las células vegetales de acuerdo con la invención o las
plantas de acuerdo con la invención se pueden diferenciar de las
células vegetales salvajes o las plantas salvajes, respectivamente,
debido a, por ejemplo, la expresión adicional de la molécula de
ácido nucleico extraña introducida. Las células vegetales de
acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención
contienen, preferentemente, transcritos de las moléculas de ácido
nucleico extrañas. Esto se puede demostrar mediante, por ejemplo,
análisis de transferencia de tipo Northern o con la ayuda de la
denominada PCR cuantitativa.
En otra forma de realización, las células
vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención son células vegetales transgénicas o plantas
transgénicas, respectivamente.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a células vegetales de acuerdo con la invención
y a plantas de acuerdo con la invención, en las que la molécula de
ácido nucleico extraña que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) se escoge del grupo constituido por:
- a)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos dada como SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 4;
- b)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, que incluye la secuencia de aminoácidos, que se codifica mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o la inserción en el plásmido pMI50;
- c)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos dada en la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4;
- d)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos, que se codifica en la región codificadora de la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o por la región codificadora de la inserción en el plásmido pMI50;
- e)
- Moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 3 o una secuencia complementaria;
- f)
- Moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o el plásmido pMI50;
- g)
- Moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos un 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b), e) o e);
- h)
- Moléculas de ácido nucleico que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f) en condiciones estrictas;
- i)
- Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la decencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), e) o f) debido a la degeneración del código genético; y
- j)
- Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).
La secuencia de ácido nucleico mostrada en la
SEC ID N1 1 es una secuencia de ADNc, que incluye la región
codificadora de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Arabidopsis thaliana y la secuencia de
ácido nucleico que se muestra en la SEC ID Nº 3 es una secuencia de
ADNc, que incluye la región codificadora de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Oryza sativa.
Un plásmido (A.t.-OK1-pGEM) que
contiene un ADNc que codifica una proteína de acuerdo con la
invención (A.t.-OK1) de Arabidopsis thaliana se depositó el
8 de marzo de 2004 con el número DSM16264 y un plásmido (pM150) que
contiene un ADNc que codifica otra proteína de acuerdo con la
invención (O.s.-OK1) de Oryza sativa se depositó el 24 de
marzo de 2004 con el número DSM16302 según el Tratado de Budapest en
la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH,
Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania.
La secuencia de aminoácidos mostrado en la SEC
ID Nº 2 puede derivar de la región codificadora de la secuencia de
ADNc integrada en el plásmido A.t.-OK1-pGEM y
codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Arabidopsis thaliana. La secuencia de
aminoácidos mostrado en la SEC ID Nº 4 puede derivar de la región
codificadora de la secuencia de ADNc integrada en el plásmido pM150
y codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de Oryza sativa. Por tanto, la presente
invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico, que
codifican una proteína con la actividad enzimática de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1), que incluye la secuencia de aminoácidos, codificada
por la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o
mediante la inserción en el plásmido pM150, en el que la proteína
codificada tiene una identidad de al menos un 70%, preferentemente
de al menos un 80%, particularmente preferentemente de al menos un
90% y especialmente preferentemente de 95%, con la secuencia de
aminoácidos que se puede derivar de la inserción en
A.t.-OK1-pGEM o pM150.
La presente invención también se refiere a
moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) e incluyen la región codificadora de las secuencias
de nucleótidos mostrados en SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 3, o secuencias
complementarias de las mismas, moléculas de ácido nucleico, que
incluyen la región codificadora de la secuencia de nucleótidos de
la inserción contenida en el plásmido A.t.-OK1-pGEM
o en el plásmido pMI50 y moléculas de ácido nucleico, que tienen
una identidad de al menos un 70%, preferentemente de al menos un
80%, particularmente preferentemente de al menos un 90% y
especialmente preferentemente de al menos un 95% con dichas
moléculas de ácido nucleico.
Con la ayuda de la información de la secuencia
de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o
con la ayuda de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención, ahora es posible para el experto en la técnica aislar
secuencias homólogas de otras especies de plantas, preferentemente
de plantas que almacenan almidón, preferentemente de especies de
plantas del género Oryza, en particular Oryza sativa o
de Arabidopsis thaliana. Esto se puede llevar a ACNO con,
por ejemplo, la ayuda de procedimientos convencionales tales como
análisis del ADNc o de bibliotecas genómicas con muestras de
hibridación adecuadas. El experto en la técnica sabe que se pueden
aislar secuencias homólogas con la ayuda de oligonucleótidos
(degenerados) y el uso de procedimientos basados en PCR.
El análisis de bases de datos, tales como las
disponibles, por ejemplo mediante EMBL (http://www.ebi.ac.uk/
Tools/index.htm) o NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), también se puede usar para identificar secuencias homólogas, que codifican una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1). En este caso se especifican una o más secuencias como una secuencia denominada solicitada. Esta secuencia solicitada se compara después por medio de programas informáticos estadísticos con secuencias que se encuentran en las bases de datos seleccionadas. Tales solicitudes a la base de datos (por ejemplo búsquedas blast o Fasta) son conocidas para el experto en la técnica y pueden realizaras varios proveedores.
Tools/index.htm) o NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), también se puede usar para identificar secuencias homólogas, que codifican una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteínas OK1). En este caso se especifican una o más secuencias como una secuencia denominada solicitada. Esta secuencia solicitada se compara después por medio de programas informáticos estadísticos con secuencias que se encuentran en las bases de datos seleccionadas. Tales solicitudes a la base de datos (por ejemplo búsquedas blast o Fasta) son conocidas para el experto en la técnica y pueden realizaras varios proveedores.
Si se lleva a cabo tal solicitud en la base de
datos, por ejemplo en el NCBI (National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), se deberán usar los
parámetros estándar, que se especifican para la concreta
investigación de comparación.
Para las comparaciones de las secuencias de
proteínas (blastp), estos son los siguientes parámetros: Limit
entrez = no activado; Filter = activado con baja complejidad; Valor
previsto = 10; tamaño de texto = 3; Matrix = BLOSUM62; Costes de
distancia: Existencia = 11, Extensión = 1.Para las comparaciones de
secuencias de ácidos nucleicos (blasón), deben establecerse los
parámetros siguientes: Limit entrez = no activado; Filtro = activado
con baja complejidad; Valor previsto = 10; tamaño de texto =
11.
Con tal búsqueda en base de datos, se pueden
usar las secuencias descritas en la presente invención como una
secuencia solicitada con el fin de identificar moléculas de ácido
nucleico y/o proteínas, que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1).
Con la ayuda de los procedimientos descritos,
también es posible identificar y/o aislar moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención, que hibridan con la secuencia
especificada como SEC ID Nº 1 o como SEC ID Nº 3 y que codifican
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1). Dentro de la estructura de la presente invención,
el término "hibridar" significa hibridación en condiciones de
hibridación convencionales, preferentemente en condiciones
estrictas tales como, por ejemplo, las que se describen en Sambrock
y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Particularmente preferido, "hibridar" significa hibridación en
las condiciones siguientes:
Tampón de hibridación:
2xSSC; solución 10x Denhardt (Ficoll
400+PEG+BSA; Proporción 1:1:1); 0,1% de SDS; EDTA 5 mM; Na2HPO4 50
mM; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; 50 \mug/ml de
ARNt; o
Tampón fosfato sódico 25M a pH 7,2; EDTA 1 mM;
7% de SDS
Temperatura de hibridación:
T = 65 a 68ºC
Tampón de lavado: 0,1 x SSC; 0,1% de SDS
Temperatura de lavado: T = 65 a 68ºC
En principio, las moléculas de ácido nucleico,
que hibridan con las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la
invención, pueden originarse a partir de cualquier especie de
planta, que codifica una proteína adecuada; preferentemente se
originan a partir de plantas de almacenamiento de almidón,
preferentemente de especies de la familia (sistemática) Poacea,
particularmente preferentemente de especies del género Oryza.
Las moléculas de ácido nucleico, que hibridan con las moléculas de
acuerdo con la invención, pueden, por ejemplo, aislarse de
bibliotecas genómicas o de ADNc. La identificación y el aislamiento
de moléculas de ácido nucleico de este tipo pueden llevarse a cabo
usando las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o
partes de estas moléculas o los complementarios inversos de estas
moléculas mediante, por ejemplo, medios d hibridación de acuerdo
con procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook y col.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o mediante
amplificación con PCR.
Las moléculas de ácido nucleico, que tienen
exactamente o esencialmente la secuencia de nucleótidos especificada
en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 3 o partes de estas secuencias.
Los fragmentos usados como muestras de hibridación también pueden
ser fragmentos u oligonucleótidos sintéticos, que se han fabricado
usando técnicas de síntesis establecidas y cuya secuencia
corresponde esencialmente a la de una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la invención. Si se ha identificado y aislado a los
genes que hibridan con las secuencias de ácido nucleico de acuerdo
con la invención, se deberá llevar a cabo una determinación de esta
secuencia y un análisis de las características de las proteínas
codificadas por esta secuencia con el fin de establecer si está
implicada una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1). Para este fin son particularmente adecuadas las
comparaciones de la homología sobre el nivel de la secuencia de
ácido nucleico o de aminoácido y una determinación de la actividad
enzimática. La actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) puede tener lugar, por ejemplo, como se ha descrito
en lo que antecede en el apartado 11 en Procedimientos Generales. Se
puede demostrar una afinidad de unión preferida al
Almidón-P en comparación con almidón no fosforilado
y autofosforilación de una
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) usando los procedimientos ya descritos en lo que
antecede y en los Apartados 8 y 12 Procedimientos Generales.
Las moléculas que hibridan con las moléculas de
ácido nucleico de acuerdo con la invención incluyen,
particularmente, fragmentos, derivados y variantes alélicas de las
moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que
codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de plantas, preferentemente de plantas que almacenan
almidón, preferentemente de especies de plantas de la familia
(sistemática) Poacea, particularmente preferentemente de especies
del género Oryza. En la presente invención, el término
"derivado" significa que las secuencias de estas moléculas
difieren en una o más posiciones de las secuencias de las moléculas
de ácido nucleico descritas en lo que antecede y tienen un alto
grado de identidad con estas secuencias. En el presente documento,
la desviación de las moléculas de ácido nucleico descritas en lo que
antecede puede haberse producido, por ejemplo, por deleción,
adición, sustitución, inserción o recombinación.
En la presente invención, el término
"identidad" significa una identidad de secuencia en la
totalidad de la longitud de la región codificadora de al menos un
60%, en particular una identidad de al menos un 80%, preferentemente
superior al 80%, particularmente preferentemente superior a un 90%
y especialmente de al menos un 95%. En la presente invención, debe
entenderse que el término "identidad" significa el número de
aminoácidos/nucleótidos (identidad) correspondiente a otras
proteínas/ácidos nucleicos, expresado en forma de un porcentaje. La
identidad se determina, preferentemente, mediante comparación con
otras proteínas/ácidos nucleicos la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4
para los aminoácidos o la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 3 para ácidos
nucleicos con la ayuda de programas informáticos. Su las secuencias
que se comparan entre sí tienen diferentes longitudes, la identidad
debe determinarse de tal modo que el número de aminoácidos, que
tienen la secuencia más corta en común con la secuencia más larga,
determina el cociente porcentual de la identidad. Preferentemente,
la identidad se determina por medio del programa informático
ClustalW, que es bien conocido y que está disponible para el
público (Thompson y col., Nucleic Acids Research 22 (1994),
4673-4680). Julie Thompson
(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) y Toby Gibson
(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular
Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemania,
han puesto a disposición del público el sistema ClustalW. El
ClustalW también se puede descargar de diferentes sitios de
internet, incluidos IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie
Moléculaire et Cellulaire, B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex, Francia;
ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) y
EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/), sí como de todos los
sitios de internet imagen del EBI (European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10
1SD, Reino Unido).
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, se usa la versión 1,8 del
programa informático ClustalW para determinar la identidad entre
las proteínas de acuerdo con la invención y otras proteínas. Al
hacerlo se deben establecer los parámetros siguientes:
KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW= 5, PAIRGAP=3,
GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET,
ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, se usa la versión 1.8 del
programa informático ClustalW para determinar la identidad entre la
secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de
acuerdo con la invención, por ejemplo, y la secuencia de
nucleótidos de otras moléculas de ácido nucleico. Al hacerlo se
deben establecer los parámetros siguientes:
KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB,
GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40,
TRANSITIONS: sin ponderar.
TRANSITIONS: sin ponderar.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, la identidad significa que existe una
equivalencia funcional y/o estructural entre las moléculas de ácido
nucleico objeto de interés o las proteínas codificadas por ellas.
Las moléculas de ácido nucleico, que son homólogas a las moléculas
descritas en lo que antecede y constituyen derivados de estas
moléculas, generalmente son variaciones de estas moléculas, que
constituyen modificaciones, que ejecutan la misma función biológica.
Al mismo tiempo, las variaciones se pueden producir de forma
natural, por ejemplo pueden ser secuencias de otras especies de
plantas, o pueden ser mutantes, en los que estos mutantes pueden
haberse producido de forma natural o haber sido introducidos
mediante mutagénesis objetiva. Asimismo, las variaciones pueden ser
secuencias fabricadas de forma sintética. Las variantes alélicas
pueden ser variantes naturales y también variantes fabricadas de
forma sintética o variantes producidas mediante técnicas de ADN
recombinante. Las moléculas de ácido nucleico, que se desvían de
moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención debido a la
degeneración del código genético, constituyen una forma especial de
derivados.
Las proteínas codificadas a partir de los
diferentes derivados de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con
la invención tienen ciertas características comunes. Éstas pueden
incluir, por ejemplo, la actividad biológica, la especificidad de
sustrato, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la
conformación etc., así como características físicas tales como, por
ejemplo, el comportamiento en la carrera en la electroforesis en
gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de
sedimentación, la solubilidad, las características espectroscópicas,
la estabilidad; el pH óptimo, la temperatura óptima etc. Las
características preferidas de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1)ya se han descrito con detalle en lo que
antecede y deben aplicarse en el presente documento en
consecuencia.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con
la invención pueden ser cualquier molécula de ácido nucleico, en
particular moléculas de ADN o de ARN, por ejemplo ADNc, ADN
genómico, ARNm etc. Pueden ser moléculas naturales o moléculas
fabricadas por procedimientos de ingeniería genética o síntesis
química. Pueden ser moléculas monocatenarias, que contienen la
hebra codificadora o no codificadora, o moléculas bicatenarias.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a células vegetales de acuerdo con la invención
y a plantas de acuerdo con la invención, en las que la molécula de
ácido nucleico extraña que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se escoge del grupo constituido por:
- a)
- Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 9, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 15 o SEC ID Nº 17,
- b)
- Moléculas de ácido nucleico, que incluye la secuencias de nucleótidos mostrada por las SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14 o SEC ID Nº 16, o una secuencia complementaria;
- c)
- Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la decencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a) o b), debido a la degeneración del código genético;
- d)
- Moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos un 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en a) o b) y;
- e)
- Moléculas de ácido nucleico que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a) o b) en condiciones estrictas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a células vegetales de acuerdo con la invención
y a plantas de acuerdo con la invención, en las que la molécula de
ácido nucleico extraña se escoge del grupo constituido por:
- a)
- Moléculas de ADN, que codifican una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1) y/o una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa (proteína R1) y que están unidas a secuencias reguladoras, que garantizan la transcripción en células vegetales y conducen a un incremento de la actividad de una proteína OK1 y/o de una proteína R1 en la célula.
En una forma de realización adicional, las
moléculas de ADN de acuerdo con la invención, que codifican una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), están unidas a secuencias reguladoras, que inician
la transcripción en células vegetales y conducen a un incremento de
la actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en la célula. En este caso, las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención están presentes en orientación
de "sentido" con respecto a las secuencias reguladoras.
Para expresar moléculas de ácido nucleico de
acuerdo con la invención, que codifican una
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), éstas están preferentemente unidas con las
secuencias reguladoras de ADN, loo que garantiza la transcripción en
células vegetales. En particular, estas incluyen promotores. En
general, cualquier promotor que esté activo en las células vegetales
es elegible para la expresión.
Al mismo tiempo, el promotor se puede escoger de
modo que la expresión tenga lugar de forma constitutiva i sólo en
un cierto tejido, en una cierta etapa del desarrollo de la planta o
en un momento determinado por influencias externas. El promotor
puede ser homólogo o heterólogo, ambos con respecto a la planta y
con respecto a la molécula de ácido nucleico.
Promotores adecuados son, por ejemplo, el
promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor y el
promotor de ubiquitina del maíz para la expresión constitutiva, el
promotor de patatin B33 (Rocha-Sosa et al.,
EMBO J. 8 (1989), 23-29) para la expresión
específica en tubérculos en patatas o un promotor, que sólo asegura
la expresión en tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo el
promotor ST-LS1 (Stockhaus y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus y
col., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o, para la
expresión específica en endospermos del promotor HMG del trigo, el
promotor USP, el promotor de faseolina, los promotores de los genes
zein del maíz (Pedersen y col., Cell 29 (1982),
1015-1026; Quatroccio y col., Plant Mol. Biol. 15
(1990), 81-93), el promotor de glutelina (Leisy y
col., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng y
col., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara y col.,
FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) o el promotor
shrunken-1 (Werr y col., EMBO J. 4 (1985),
1373-1380). No obstante, también se pueden usar
promotores que sólo se activen en un momento determinado por
influencias externas (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279).
Los promotores de las proteínas del shock térmico, que permiten una
inducción sencilla, pueden ser de particular interés en el presente
documento. Además, se pueden usar promotores específicos de
semillas, tales como el promotor USP de Vicia faba, que
garantiza la expresión específica de semilla en Vicia faba y
en otras plantas (Fiedler y col., Plant Mol. Biol. 22 (1993),
669-679; Bäumlein y col., Mol. Gen. Genet. 225
(1991), 459-467).
Además, puede estar presente una secuencia de
terminación (señal de poliadenilación), que se usa para añadir una
cola de poliA al tránscrito. Una función en la estabilización de los
transcritos se atribuye a la cola de poli-A.
Elementos de este tipo se describen en la literatura (cf. Gielen y
col., EMBO J. 8 (1989), 23-29) y pueden
intercambiarse a voluntad.
Las secuencias intrón también pueden estar
presentes entre el promotor y la región codificadora. Dichas
secuencias intrón pueden conducir a la estabilidad de la expresión
y a un incremento de la expresión en plantas (Callis y col., 1987,
Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, y Walbot, 1991,
Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, y col.,
1997; Plant Journal. 12(4):895-899; Rose y
Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542;
Vasil y col., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579;
XU y col., 2003, Science in China Series C Vol. 46 No. 6,
561-569). Secuencias intrón adecuadas son, por
ejemplo, el primer intrón del gen sh1 del maíz, el primer intrón del
gen de poliubiquitina del maíz, el primer intrón del gen EPSPS del
arroz o uno de los dos primeros intrones del gen PAT1 de
Arabidopsis.
En la presente invención, debe entenderse que el
término gen de
[P-glucan]-hidro-discinasa
"(gen OK1") significa una molécula de ácido nucleico (ADNc,
ADN) que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1), preferentemente una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) de plantas que almacenan almidón, particularmente
preferentemente de Arabidopsis thaliana, especialmente
preferentemente de arroz.
En la presente invención, debe entenderse que el
término gen de
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
"(gen R1") significa una molécula de ácido nucleico (ADNc,
ADN) que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1), preferentemente una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) de plantas que almacenan almidón, particularmente
preferentemente de Arabidopsis thaliana, especialmente
preferentemente de arroz.
Todos estos procedimientos se basan en la
introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma
de una célula vegetal o planta y, por tanto, son básicamente
adecuados para la fabricación de células vegetales de acuerdo con
la invención y de plantas de acuerdo con la invención.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las
células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de
acuerdo con la invención sintetizan un almidón modificado en
comparación con almidón de las correspondientes células vegetales
salvajes o plantas salvajes que no se han modificado
genéticamente.
Las células vegetales de acuerdo con la
invención y las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un
almidón modificado, que en sus características fisicoquímicas, en
particular el contenido en fosfato de almidón y/o la distribución
de fosfato, están modificadas en comparación con el almidón
sintetizado en las células vegetales salvajes o las plantas
salvajes, de modo que es más adecuado para aplicaciones
especiales.
Dado que no se han descrito todavía enzimas que
fosforilan exclusivamente Almidón-P, tampoco ha sido
posible anteriormente incrementar más una cierta cantidad de
concentración de fosfato de almidón del almidón que ya está
fosforilado en las plantas. Esto sólo es posible usando una enzima
con la función de una proteína(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o mediante la preparación de una molécula de ácido
nucleico que codifica una(s)
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) para la modificación genética de plantas.
La distribución del fosfato del almidón
sintetizado por plantas tampoco fue posible anteriormente debido a
la falta de medios disponibles. Un cambio en la proporción de
fosfato de almidón nativo es ahora posible de acuerdo con la
presente invención mediante la preparación de enzimas con función
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y mediante la preparación de moléculas de ácido
nucleico que codifica una
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1).
Por tanto, la presente invención también incluye
células vegetales de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo
con la invención que sintetizan un almidón modificado en comparación
con las correspondientes células vegetales salvajes o plantas
salvajes que no se han modificado genéticamente.
En la presente invención, el término "almidón
modificado" significa que el almidón tiene características
fisicoquímicas modificadas en comparación con el almidón no
modificado obtenible de las correspondientes células vegetales
salvajes o plantas salvajes.
En otra forma de realización de la presente
invención, las células vegetales de acuerdo con la invención o las
plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón, que tiene
una mayor concentración de fosfato de almidón y/o una distribución
de almidón modificada en comparación con el almidón aislado de las
correspondientes células vegetales salvajes o plantas salvajes.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "distribución de fosfato" significa la proporción del
fosfato de almidón unido a una molécula de glucosa en la posición
C-2, la posición C-3 o la posición
C-6 en términos de la concentración total de
fosfato de almidón del almidón.
En otra forma de realización de la presente
invención, las células vegetales de acuerdo con la invención o las
plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón, que tiene
una mayor concentración de fosfato de almidón y/o una proporción
modificada de fosfato en C3 a fosfato en C-6 en
comparación con el almidón de plantas salvajes que no se han
modificado genéticamente. En el presente documento se prefieren
almidones que tienen una mayor proporción de fosfato de almidón
unido en la posición C-3 en comparación con el
fosfato de almidón unido en la posición C-6 en
comparación con los almidones de células vegetales salvajes que no
se han modificado genéticamente o de plantas salvajes que no se han
modificado genéticamente.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "proporción entre fosfato en C-3 y fosfato
en C-6" significa la proporción de fosfato de
almidón para la cual el fosfato de almidón de un almidón unido en la
posición C-3 o la posición C-6
respectivamente se añade al total del fosfato de almidón del almidón
objeto de interés que está unido en la posición C-3
y en la posición C-6 (posición C-3 +
posición C-6).
Se han descrito varios procedimientos para la
determinación de la cantidad de fosfato de almidón. Preferentemente,
los procedimientos descritos por Ritte y col. (2000, Starch/Stärke
52, 179-185) se pueden usar para la determinación
de la cantidad de fosfato de almidón. En particular,
preferentemente, la determinación de la cantidad de fosfato de
almidón se lleva a cano por medio de RMN-^{31}P de
acuerdo con los procedimientos descritos por Kasemusuwan y Jane
(1996, Cereal Chemistry 73, 702-707).
Además, las plantas modificadas genéticamente,
que contienen las células vegetales de acuerdo con la invención,
son también materia sujeto de la invención. Las plantas de este tipo
se pueden producir a partir de células vegetales de acuerdo con la
invención mediante regeneración.
En principio, las plantas de acuerdo con la
invención pueden ser plantas de cualquier especie de planta, es
decir plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.
Preferentemente son plantas útiles, es decir plantas que son
cultivadas por las personas con fines alimentarios o técnicos, en
particular industriales.
En otra forma de realización, la planta de
acuerdo con la invención es una planta que almacena almidón.
En la presente invención, el término "plantas
que almacenan almidón" significa todas las plantas con partes de
planta que contienen un almidón de almacenamiento, tales como, por
ejemplo, maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca,
patata, sago, fríjol, guisante o sorgo.
En la presente invención, el término "planta
de patata" o "patata" significa una especie de planta del
género Solanum, en particular una especie productora de
tubérculo del género Solanum y, especialmente, Solanum
tuberosum.
En la presente invención, el término "planta
de trigo" significa una especie de planta del género
Triticum o plantas resultantes de cruces con plantas del
género Triticum, particularmente especies de planta del
género Triticum o plantas resultantes de cruces con plantas
del género Triticum, que se usan en la agricultura con fines
comerciales, y, particularmente preferentemente Triticum
aestivum.
En la presente invención, el término "planta
de maíz" significa una especie de planta del género Zea,
particularmente especies de plantas del género Zea, que se
usan en la agricultura con fines comerciales, particularmente
preferentemente Zea mays. En otra forma de realización, la
presente invención se refiere a plantas que almacenan almidón de la
familia (sistemática) Poaceae de acuerdo con la invención.
Preferentemente, éstas son plantas de maíz o de trigo en el
presente documento.
La presente invención también se refiere a
material de propagación de plantas de acuerdo con la invención que
contienen una célula vegetal de acuerdo con la invención.
En el presente documento, el término "material
de propagación" incluye los constituyentes de la planta que son
adecuados para producir descendencia por medio vegetativo o sexual.
Para la propagación de la planta son adecuados los esquejes, los
cultivos de callos, los rizomas o los tubérculos. Otro material de
propagación incluye, por ejemplo, frutos, semillas, plántulas,
protoplastos, cultivos celulares etc. Preferentemente, el material
de propagación es tubérculo y, particularmente preferentemente
granos que contienen endospermos.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a partes de plantas cosechables de plantas de
acuerdo con la invención, tales como frutos, raíces de reserva,
raíces, flores, yemas, brotes o tallos, preferentemente semillas,
granos o tubérculos, en los que las partes cosechables contienen
células vegetales de acuerdo con la invención.
Además, la presente invención también se refiere
a un procedimiento para la fabricación de una planta modificada
genéticamente de acuerdo con la invención, en el que
- a)
- una célula vegetal se modifica genéticamente, en la que la modificación genética conduce a un incremento de la actividad enzimática de una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1) y una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa (proteína R1) en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no se han modificado genéticamente.
- b)
- una planta se regenera a partir de las células vegetales de la etapa a);
- c)
- y, en caso necesario, se producen otras plantas con la ayuda de las plantas de acuerdo con la etapa b).
La modificación genética introducida en la
célula vegetal de acuerdo con la etapa a) puede ser, básicamente,
cualquier tipo de modificación genética, que conduce al incremento
de la actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1). La regeneración de las plantas de acuerdo con la
etapa (b) se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos
para el experto en la técnica (p. ej., los descritos en "Plant
Cell Culture Protocols", 1999, edt. por R.D. Hall, Humana Press,
ISBN 0-89603-
549-2).
549-2).
La producción de otras plantas de acuerdo con la
etapa (c) del procedimiento de acuerdo con la invención se puede
llevar a cabo mediante, por ejemplo, propagación vegetativa (por
ejemplo usando esquejes, tubérculos o por medio de cultivo del
callo y regeneración de toda la planta) o mediante propagación
sexual. En el presente documento, la propagación sexual tiene
lugar, preferentemente, en condiciones controladas, es decir plantas
seleccionadas con características concretas se cruzan y propagan
entre sí. En este caso, la selección se lleva a cabo,
preferentemente, de un modo tal que otras plantas, que se producen
de acuerdo con la etapa c), exhiben la modificación, que se
introdujo en la etapa a).
Las modificaciones genéticas para la producción
de las células vegetales de acuerdo con la invención pueden tener
lugar simultáneamente o en etapas sucesivas. Al mismo tiempo, la
modificación genética puede ser cualquier modificación genética que
conduzca al incremento de la actividad de al menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1). Puede proceder de plantas salvajes así como de
células vegetales salvajes, en las que todavía no ha tenido lugar
ninguna modificación genética previa para la reducción de la
actividad de al menos una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), o de células vegetales o plantas que ya están
modificadas genéticamente, en las que la actividad de al menos una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) ya se ha incrementado mediante una modificación
genética. Es irrelevante si se usa el mismo procedimiento para la
modificación genética que conduce a un incremento de la actividad
de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) que para la modificación genética que conduce a un
incremento de la actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) siempre que ambas modificaciones genéticas juntas
conduzcan a un incremento de la actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en la misma célula vegetal.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
modificada genéticamente de acuerdo con la invención, la
modificación genética consiste en la introducción de a menos una
molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula
vegetal, en la que la disponibilidad o la expresión de la(s)
molécula(s) de ácido nucleico extraña(s)
conduce(n) a un incremento de la actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en la célula.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
modificada genéticamente de acuerdo con la invención, la
modificación genética consiste en la introducción de a menos una
molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula
vegetal, en la que la disponibilidad o la expresión de la(s)
molécula(s) de ácido nucleico extraña(s)
contiene(n) una secuencia que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y/o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Como ya se ha descrito en lo que antecede para
moléculas de ácido nucleico extrañas organizadas para la
modificación genética en la célula vegetal o la planta, la etapa a)
del procedimiento de acuerdo con la invención para la fabricación
de una planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención
puede implicar una única molécula de ácido nucleico o múltiples
moléculas de ácido nucleico. Las formas de realización
proporcionadas en lo que antecede se deben aplicar de forma
correspondiente para el procedimiento de acuerdo con la invención
descrito en el presente documento.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
modificada genéticamente de acuerdo con la invención, la
modificación genética en la etapa a) del procedimiento consiste en
la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña que
contiene al menos una secuencia que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) y al menos una secuencia que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1).
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
modificada genéticamente de acuerdo con la invención, la
modificación genética en la etapa a) del procedimiento consiste en
la introducción de múltiples moléculas de ácido nucleico extrañas,
en el que al menos una primera molécula de ácido nucleico contiene
una secuencia que codifica una proteína
[alfa1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) y al menos una segunda molécula de ácido nucleico
contiene una secuencia que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1).
Además, en lugar de una célula vegetal salvaje o
una planta salvaje, se puede usar una célula mutante o un mutante
que se caracteriza porque ya tiene una mayor actividad de una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una mayor actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) para introducir una molécula de ácido nucleico
extraña para la implementación del procedimiento de acuerdo con la
invención. La información adicional proporcionada en lo que antecede
para el uso de mutantes para la fabricación de células vegetales de
acuerdo con la invención o la planta se debe aplicar en el presente
documento de forma correspondiente.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
genéticamente modificada de acuerdo con la invención, al menos una
molécula de ácido nucleico extraña se selecciona del grupo
constituido por
- a)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos dada como SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 4;
- b)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, que incluye la secuencia de aminoácidos, que se codifica mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o la inserción en el plásmido pMI50;
- c)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos dada en la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4;
- d)
- Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos un 60% con la secuencia de aminoácidos, que se codifica mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o mediante la inserción en el plásmido pMI50;
- e)
- Moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 3 o una secuencia complementaria;
- f)
- Moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o el plásmido pMI50;
- g)
- Moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos un 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f);
- h)
- Moléculas de ácido nucleico que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f) en condiciones estrictas;
- i)
- Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la decencia de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), e) o f) debido a la degeneración del código genético; y
- j)
- Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para la fabricación de una planta
genéticamente modificada de acuerdo con la invención, una
proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) de patata, trigo, arroz, maíz, soja, cítricos o
Arabidopsis codifica al menos una molécula de ácido nucleico
extraña. Las referencias para las secuencias de ácido nucleico
identificadas que codifican proteína(s)
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteínas R1) de las plantas identificadas ya se han especificado
más en lo que antecede.
Otra forma de realización de la presente
invención también se refiere a un procedimiento para la fabricación
de una planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención,
en el que
- a)
- una célula vegetal se modifica genéticamente, en la que la modificación genética conduce a un incremento de la actividad enzimática de una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1) en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no se han modificado genéticamente.
- b)
- una planta se regenera a partir de las células vegetales de la etapa a);
- c)
- en caso necesario, se producen otras plantas con la ayuda de las plantas de acuerdo con la etapa b) y
- d)
- plantas obtenidas de acuerdo con la etapa b) o c) se cruzan con una planta, que tiene un mayor nivel de actividad enzimática de una proteína(s) [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa (proteína R1), en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no se han modificado genéticamente.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de una
planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención, en el
que
- a)
- una célula vegetal se modifica genéticamente, en la que la modificación genética conduce a un incremento de la actividad enzimática de una proteína(s) [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa (proteína R1) en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no se han modificado genéticamente;
- b)
- una planta se regenera a partir de las células vegetales de la etapa a);
- c)
- en caso necesario, se producen otras plantas con la ayuda de las plantas de acuerdo con la etapa b) y
- d)
- plantas obtenidas de acuerdo con la etapa b) o c) se cruzan con una planta, que tiene un mayor nivel de actividad enzimática de una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa (proteína OK1), en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no se han modificado genéticamente.
Al mismo tiempo, las plantas de acuerdo con la
etapa a) pueden modificarse genéticamente como ya se ha descrito en
lo que antecede. La regeneración de plantas de acuerdo con la etapa
b) y la producción de plantas adicionales de acuerdo con la etapa c)
también se han presentado con detalle en lo que antecede.
Una planta que se cruza con plantas o
descendencia de plantas obtenidas en las etapas b) o c) de acuerdo
con la etapa d) de las dos formas de realización más recientemente
identificadas, puede ser cualquier planta que tiene una mayor
actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) en comparación con las correspondientes plantas
salvajes. El incremento de la actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) se puede producir a través de cualquier modificación
que conduzca a un incremento de la actividad de la proteína
relacionada en las plantas correspondientes. Estas plantas pueden
ser mutantes o plantas modificadas por medio de procedimientos de
ingeniería genética. Los mutantes pueden ser mutantes espontáneos
(naturales), así como los que se producen a través del uso dirigido
de mutágenos (tales como, por ejemplo, agentes químicos, radiación
ionizante) o procedimientos de ingeniería genética (por ejemplo,
marca de activación de transposones, marca de activación de
T-ADN, mutagénesis in vivo). Preferentemente,
las plantas producidas mediante procedimientos de ingeniería
genética son mutantes fabricados por medio de mutagénesis de
inserción, particularmente preferidas plantas genéticamente
modificadas que expresan una molécula de ácido nucleico extraña,
especialmente preferentemente plantas modificadas genéticamente en
las que la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) o una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
En otra forma de realización, el procedimiento
de acuerdo con la invención se usa para fabricar una planta
modificada genéticamente de acuerdo con la invención para producir
plantas que almacenan almidón. En otra forma de realización, el
procedimiento de acuerdo con la invención se usa para fabricar una
planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención para
producir plantas de maíz o de trigo de acuerdo con la invención.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la invención
para fabricar una planta modificada genéticamente de acuerdo con la
invención, en el que la planta modificada genéticamente sintetiza
un almidón modificado en comparación con plantas salvajes que no se
han modificado genéticamente.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para fabricar una planta genéticamente
modificada, las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un
almidón modificado, que tiene una mayor concentración de fosfato de
almidón y/o una distribución de fosfato de almidón modificada en
comparación con el almidón aislado de las correspondientes plantas
salvajes.
En otra forma de realización del procedimiento
de acuerdo con la invención para fabricar una planta genéticamente
modificada, las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un
almidón modificado, que tiene una proporción entre fosfato en
C-3 y fosfato en C6 modificada, en comparación con
el almidón de plantas salvajes que no se ha modificado
genéticamente. En el presente documento se prefieren almidones que
tienen una mayor proporción de fosfato de almidón unido en la
posición C-3 en comparación con el fosfato de
almidón unido en la posición C-6 en comparación con
los almidones de células vegetales salvajes que no se han modificado
genéticamente o de plantas salvajes que no se han modificado
genéticamente.
La presente invención también se refiere a
plantas obtenibles mediante los procedimientos de acuerdo con la
invención.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el
almidón aislado de células vegetales de acuerdo con la invención y
de plantas de acuerdo con la invención, que tienen una mayor
actividad de una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una mayor actividad de una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) sintetizan un almidón modificado.
En particular, la mayor cantidad de fosfato de
almidón en los almidones de acuerdo con la invención proporciona a
los almidones sorprendentes y ventajosas características. Por medio
de la mayor proporción de fosfato de almidón, los almidones de
acuerdo con la invención soportan una mayor proporción de grupos
cargados que afectan de forma significativa a las características
funcionales del almidón. El almidón que soporta los grupos
funcionales cargados es particularmente aplicable en la industria
del papel, en la que se usa para recubrir el papel. El papel que,
de otro modo, tiene buenas características adhesivas con moléculas
cargadas es particularmente adecuado para la absorción de
pigmentos, tales como tinta, colores para impresión etc., cuando
están recubiertas.
La presente invención también se refiere a
almidones modificados obtenibles de células vegetales de acuerdo
con la invención o de plantas de acuerdo con la invención, de
material de propagación de acuerdo con la invención o de partes
cosechables de plantas de acuerdo con la invención.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a almidón modificado de acuerdo con la
invención procedente de plantas que almacenan almidón,
preferentemente de plantas que almacenan almidón de la familia
(sistemática) Poaceae, particularmente preferentemente de
plantas de maíz o de trigo.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la fabricación de un almidón modificado,
incluida la etapa de extraer el almidón de una célula vegetal de
acuerdo con la invención o de una planta de acuerdo con la
invención, del material de propagación de acuerdo con la invención
de tal planta y/o de partes cosechables de la planta de acuerdo con
la invención de tal planta, preferentemente de partes que almacenan
almidón de acuerdo con la invención de tal planta. Preferentemente,
tal procedimiento también incluye la etapa de cosechar las plantas
o las partes de las plantas cultivadas y/o el material de
propagación de estas plantas antes de la extracción del almidón y,
además, particularmente preferentemente la etapa de cultivar plantas
de acuerdo con la invención antes de
cosechar.
cosechar.
El experto en la técnica conoce procedimientos
para extraer almidones de plantas o de partes de plantas que
almacenan almidón. Además, procedimientos para extraer almidón de
diferentes plantas que almacenan almidón se describen en, por
ejemplo, Starch: Chemistry and Technology (Editor: Whistler,
BeMiller y Paschall (1994), 2ª Edición, Academic Press Inc. London
Ltd; ISBN
0-12-746270-8;
véase, por ejemplo, el Capítulo XII, Página
412-468: Maize and Sorghum Starches: Manufacture; de
Watson; Capítulo XIII, Página 469-479: Tapioca,
Arrowroot and Sago Starches: Manufacture; de Corbishley y Miller;
Capítulo XIV, Página 479-490: Potato starch:
Manufacture and Uses; by Mitch; Capítulo XV, Página 491 a 506:
Wheat starch: Manufacture, Modification and Uses; de Knight y Oson;
y Capítulo XVI, Página 507 a 528: Rice starch: Manufacture and Uses;
de Rohmer y Klem; Maize starch: Eckhoff y col., Cereal Chem. 73
(1996), 54-57, la extracción del almidón de maíz a
escala industrial normalmente se consigue mediante la denominada
"molturación en húmedo".). Dispositivos que son de uso común en
los procedimientos para extraer almidón de materiales vegetales son
los separadores, decantadores, hidrociclones, secadores por
nebulización y secadores de lecho fluido.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "partes que almacenan almidón" quiere decir las partes
de una planta en las que, al contrario que el almidón de hoja
transitoria, el almidón se almacena como depósito para sobrevivir
durante periodos prolongados. Las partes de la planta que almacenan
almidón preferidas son, por ejemplo, tubérculos, raíces y granos de
almacenamiento, particularmente preferidos son los granos que
contienen una endospermo, especialmente particularmente preferidos
son los granos que contienen endospermo de plantas de maíz o de
trigo.
El almidón modificado obtenible mediante un
procedimiento de acuerdo con la invención para fabricar almidón
modificado también es la materia sujeto de la presente
invención.
En otra forma de realización de la presente
invención, el almidón modificado de acuerdo con la invención es
almidón nativo. En la presente invención, el término "almidón
nativo" quiere decir que el almidón se aísla de plantas de
acuerdo con la invención, partes de planta cosechables de acuerdo
con la invención, partes que almacenan almidón de acuerdo con la
invención o material de propagación de plantas de acuerdo con la
invención mediante procedimientos conocidos para el experto en la
técnica.
Además, el uso de células vegetales de acuerdo
con la invención o de plantas de acuerdo con la invención para
fabricar un almidón modificado son la materia sujeto de la presente
invención.
El experto en la técnica sabe que las
características del almidón pueden modificarse mediante, por
ejemplo, derivación térmica, química, enzimática o mecánica. Los
almidones derivados son particularmente adecuados para diferentes
aplicaciones en el sector alimentaria y/o no alimentario. Los
almidones de acuerdo con la invención están mejor adaptados como
sustancia de partida para la fabricación de almidones derivados que
los almidones convencionales, ya que tienen una mayor proporción de
grupos funcionales reactivos debido al mayor contenido en fosfato
de almidón.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a la fabricación de un almidón derivado, en el que el
almidón modificado de acuerdo con la invención se deriva
retrospectivamente.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "almidón derivado" significa un almidón modificado de
acuerdo con la invención, cuyas características se han modificado
tras su aislamiento de células vegetales con la ayuda de
procedimientos químicos, enzimáticos, térmicos o mecánicos.
En otra forma de realización de la presente
invención, el almidón derivado de acuerdo con la invención es
almidón que se ha tratado con calor y/o ácido.
En otra forma de realización, los almidones
derivados son éteres de almidón, en particular éteres de
alquilalmidón, éteres de O-alilo,
hidroxialquiléteres, éteres de O-carboximetilo,
éteres de almidón que contienen nitrógeno, éteres de almidón que
contienen fosfato o éteres de almidón que contienen azufre.
En otra forma de realización, los almidones
derivados son almidones reticulados.
En otra forma de realización, los almidones
derivados son polímeros de almidón injertado.
En otra forma de realización, los almidones
derivados son almidones oxidados.
En otra forma de realización, los almidones
derivados son ésteres de almidón, en particular ésteres de almidón
que han sido introducidos en el almidón usando ácidos orgánicos.
Particularmente preferidos son almidones de fosfato, nitrato,
sulfato, xantato, acetato o citrato.
Los almidones derivados de acuerdo con la
invención son adecuados para diferentes aplicaciones en la industria
farmacéutica y en el sector de alimentos y/o no alimentario. El
experto en la técnica conoce procedimientos para fabricar almidones
derivados de acuerdo con la invención y se describen adecuadamente
en la literatura general. Se puede encontrar una revisión de la
fabricación de almidones derivados en, por ejemplo, Orthoefer (en
Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson und Ramstad,
Capítulo 16,479-499).
El almidón derivado obtenible mediante el
procedimiento de acuerdo con la invención para fabricar un almidón
derivado también es la materia sujeto de la presente invención.
Además, el uso de almidones modificados de
acuerdo con la invención para fabricar un almidón derivado también
es la materia sujeto de la presente invención.
Las partes de las plantas que almacenan almidón
a menudo se procesan y convierten en harinas. Ejemplos de partes de
plantas a partir de las que se fabrican harinas son, por ejemplo,
tubérculos de plantas de patata y granos de plantas de cereales.
Los granos de estas plantas que contienen endospermos se muelen y
pulverizan para la fabricación de harinas a partir de plantas de
cereales. El almidón es un componente principal del endospermo.
Para otras plantas que no contienen endospermo sino otras partes que
almacenan almidón, tales como tubérculos o raíces, la harina
normalmente se fabrica reduciendo, secando y, después, moliendo los
órganos de almacenamiento objeto de interés. El almidón del
endospermo o contenido en las partes que almacenan almidón de las
plantas es una parte importante de la harina, que se fabrica a
partir de las partes de la planta objeto de interés. Por tanto, las
características de las harinas también se ven afectadas por el
almidón presente en la harina objeto de interés. Las células
vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención sintetizan un almidón modificado en comparación con las
correspondientes células vegetales salvajes que no se han
modificado genéticamente o las plantas salvajes que no se han
modificado genéticamente. Por tanto, las harinas fabricadas a
partir de células vegetales acuerdo con la invención, plantas de
acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención o partes cosechables de acuerdo con la invención
presentan características modificadas. Las características de las
harinas también se pueden ver afectadas por la mezcla de almidón
con harinas o por la mezcla de harinas con características
diferentes.
Por tanto, otro objeto de la presente invención
se refiere a harinas que contienen un almidón de acuerdo con la
invención.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a harinas que se fabrican a partir de células vegetales de acuerdo
con la invención, plantas de acuerdo con la invención, partes de
plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, de
material de propagación de acuerdo con la invención y de partes
cosechables de plantas de acuerdo con la invención. Partes
preferidas de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la
invención son tubérculos, raíces de almacenamiento y un grano, que
contiene endospermo. Preferentemente, los tubérculos de plantas de
patata y de granos se originan en plantas de la familia
(sistemática) Poaceae; los granos particularmente preferidos
se originan de plantas de maíz o de trigo.
En la presente invención, el término
"harina" quiere decir un polvo obtenido mediante molturación de
las partes de las plantas. En caso necesario, las partes de la
planta se secan antes de moler y se reducen y/o pulverizan tras la
molturación.
Las harinas de acuerdo con la invención se
distinguen particularmente por su mayor capacidad de unión al agua
debido al almidón presente en ellas que tiene un contenido de
fosfato modificado y/o una distribución de fosfato modificada. Esto
se desea para, por ejemplo, el procesamiento de harinas en la
industria de la alimentación para muchas aplicaciones, en
particular en la fabricación de productos de panadería.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento para la fabricación de harinas, incluida la etapa de
moler las células vegetales de acuerdo con la invención, plantas de
acuerdo con la invención, de partes de plantas de acuerdo con la
invención, partes de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la
invención, material de propagación de acuerdo con la invención o
material cosechable de acuerdo con la invención.
Las harinas se pueden fabricar a través de la
molturación de partes que almacenan almidón de acuerdo con la
invención. El experto en la técnica conoce cómo fabricar harinas.
Preferentemente, un procedimiento para la fabricación de harinas
también incluye la etapa de cosechar las plantas o las partes de las
plantas cultivadas y/o el material de propagación o las partes que
almacenan almidón de estas plantas antes de la molturación y,
particularmente preferentemente, además, la etapa de cultivar
plantas de acuerdo con la invención antes de cosechar.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "partes de plantas" significa todas las partes de una
planta que representan una parte completa como constituyentes de su
totalidad Partes de plantas son, pro ejemplo, brotes, hojas,
rizomas, raíces, remolachas tubérculos, vainas, semillas o
granos.
Otro objeto de la presente invención incluye el
procedimiento para la fabricación de harinas, de un procesamiento
de plantas de acuerdo con la invención, de partes de plantas que
almacenan almidón de acuerdo con la invención, de material de
propagación de acuerdo con la invención o de material de acuerdo con
la invención cosechable antes de la molturación.
Al mismo tiempo, el procesamiento puede ser, por
ejemplo, un tratamiento de calentamiento y/o un secado. El
tratamiento de calentamiento seguido por secado del material tratado
con calor se usa, por ejemplo, para la fabricación de harinas de
raíces de almacenamiento o tubérculos, tales como, por ejemplo,
tubérculos de patata, antes de los cual tiene lugar la molturación.
La reducción de plantas de acuerdo con la invención, las partes de
plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, de
material de propagación de acuerdo con la invención o de material
de acuerdo con la invención cosechable antes de la molturación
puede, asimismo, representar un procesamiento en términos de la
presente invención. La eliminación de tejido vegetal tal como, por
ejemplo, de las cáscaras de los granos, antes de la molturación,
también representa un procesamiento antes de la molturación en
términos de la presente invención.
Otra forma de realización de la presente
invención incluye el procedimiento para la fabricación de harinas
después de la molturación de un producto del procesamiento de la
molienda. Al mismo tiempo, la molienda puede ser, por ejemplo,
pulverizada después de la molturación con el fin de fabricar, por
ejemplo, varios tipos de harinas.
Otro objeto de la presente invención es el uso
de células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con la
invención, plantas de acuerdo con la invención, de partes de plantas
de acuerdo con la invención, partes de plantas que almacenan
almidón de acuerdo con la invención, material de propagación de
acuerdo con la invención o material cosechable de acuerdo con la
invención, para la fabricación de harinas.
Es también un objeto de la presente invención
proporcionar medios tales como moléculas de ADN para, por ejemplo,
la producción de células vegetales de acuerdo con la invención y
plantas de acuerdo con la invención, que sintetizan un almidón
modificado en comparación con células vegetales salvajes modificadas
o plantas salvajes que no se han modificado genéticamente. Las
moléculas de ADN proporcionadas contienen secuencias de ácido
nucleico que codifican una proteína OK1. El experto en la técnica no
conocía anteriormente una proteína con la actividad enzimática de
una proteína OK1. Asimismo, por tanto, no se pueden proporcionar
moléculas de ADN, lo que permite producir células vegetales de
acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención y el
almidón sintetizado a partir de ellas y las harinas extraídas de
ellas.
En consecuencia, la presente invención también
se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que
contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
En la presente invención, debe entenderse que el
término "molécula de ácido nucleico recombinante" quiere decir
una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias de ácido
nucleico que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) y en la que las secuencias ácido nucleico que
codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) están presentes en una organización en la que no
están presentes de forma natural en el genoma de un organismo.
Además de las secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y las secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), la molécula de ácido nucleico recombinante puede
todavía contener secuencias adicionales, que no están presentes de
forma natural en una organización tal, ya que están presentes en
las moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la
invención. Al mismo tiempo, dichas secuencias adicionales pueden ser
cualquier secuencia, preferentemente secuencias reguladoras
(promotores, señales de terminación, potenciadores), particularmente
preferentemente secuencias reguladoras, que son activas en tejido
vegetal, particularmente preferentemente secuencias reguladoras,
que son activas en tejido vegetal de almacenamiento de almidón. El
experto en la técnica conoce procedimientos para producir moléculas
de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención e
incluyen procedimientos de ingeniería genética tales como, por
ejemplo, la unión de moléculas de ácido nucleico mediante ligadura,
recombinación genética o la resíntesis de moléculas de ácido
nucleico (véase, por ejemplo, Sambrok y col., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory
Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel y col.,
Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ª
edición (2002), ISBN: 0471250929).
Otra forma de realización de la presente
invención de moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo
con la invención comprende vectores, en particular plásmidos,
cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la
ingeniería genética, que contienen las moléculas de ácido nucleico
de acuerdo con la invención descritas en lo que antecede.
En otra forma de realización, las moléculas de
ácido nucleico de acuerdo con la invención contenidas en los
vectores están ligadas con secuencias reguladoras, que inician la
expresión en células procariotas o eucariotas. Al mismo tiempo, el
término "expresión" puede significar transcripción, además de
transcripción y traducción. En este caso, las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención pueden estar presentes en
orientación de "sentido" y/o en orientación "antisentido"
con respecto a las secuencias reguladoras. Al mismo tiempo, las
moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención
pueden permanecer de forma colectiva bajo el control de un único
elemento regulador o pueden tener cada una su propio respectivo
elemento regulador individual.
Las secuencias reguladoras para la expresión en
organismos procariotas, por ejemplo E. coli, y en organismos
eucariotas se describen adecuadamente en la literatura, en
particular aquéllas para la expresión en levaduras, tales como, por
ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. Una revisión de los
diferentes sistemas de expresión para proteínas y diferentes
organismos huésped se puede encontrar en, por ejemplo, Methods in
Enzymology 153 (1987), 383-516 y en Bitter y col.
(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).
Otro objeto de la presente invención es una
célula huésped, en particular una célula procariotas o eucariotas,
que está modificada genéticamente con una molécula de ácido nucleico
recombinante de acuerdo con la invención y/o con un vector de
acuerdo con la invención, así como células, que se originan de
células huésped de este tipo y que contienen la modificación
genética de acuerdo con la invención.
En otra forma de realización, la invención se
refiere a células huésped, particularmente células procariotas o
eucariotas, que se transformaron con una molécula de ácido nucleico
de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la
invención, así como células huésped, que se originan de células
huésped de este tipo y que contienen las moléculas de ácido
nucleico descritas de acuerdo con la invención o vectores.
Las células huésped pueden ser bacterias (p.
ej., E. coli, bacterias del género Agrobacterium en
particular Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes) o células fúngicas (p. ej., levaduras, en particular
S. cerevisiae, Agaricus, en particular Agaricus
bisporus, Aspergillus, Trichoderma), así como
células vegetales o animales. En el presente documento, el término
"transformado" significa que las células de acuerdo con la
invención están modificadas genéticamente con una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la invención ya que contienen al menos una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención además de su
genoma natural. Ésta puede estar presente libremente en la célula
posiblemente como molécula autorreplicante, o puede integrase de
forma estable en el genoma de la célula huésped.
Preferentemente, las células huésped son
microorganismos. Dentro de la estructura de la presente solicitud,
se entiende que éstos quieren decir todas las bacterias y todos los
protistas (p. ej., hongos, en particular levaduras y algas), tal
como se define en, por ejemplo, Schlegel "Allgemeine
Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag (1985),
1-2).
Se prefiere si las células huésped de acuerdo
con la invención son células vegetales. En principio estas pueden
ser células vegetales de cualquier especie de planta, es decir de
plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Preferentemente
éstas serán células vegetales de plantas útiles para agricultura, es
decir plantas que son cultivadas por las personas con fines
alimentarios o técnicos, en particular industriales.
Preferentemente, la invención se refiere a células vegetales y
plantas de plantas que almacenan almidón (maíz, arroz, trigo,
centeno, avena, cebada, mandioca, patata, sago, fríjol, guisante o
sorgo), preferentemente células vegetales de plantas de la familia
(sistemática) Poacea, especialmente particularmente
preferidas son las células vegetales de plantas de maíz o de
trigo.
Asimismo, los objetos de la presente invención
son composiciones que contienen una molécula de ácido nucleico
recombinante de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con
la invención. Se prefieren las composiciones de acuerdo con la
invención que contienen una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención
y una célula huésped. Particularmente se prefiere si la célula
huésped es una célula vegetal y especialmente preferido si es una
célula de una planta de maíz o de trigo.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a una composición que contiene una secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1).
Al mismo tiempo, las secuencias de ácido
nucleico que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y que codifican una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1) pueden existir juntas en una única molécula de ácido
nucleico o en moléculas de ácido nucleico separadas unas de
otras.
Otro aspecto de las composiciones de acuerdo con
la invención se refiere a composiciones que se pueden usar para
producir células huésped de acuerdo con la invención,
preferentemente para producir células vegetales de acuerdo con la
invención. Preferentemente, esto atañe a una composición que
contiene secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), una molécula de ácido nucleico recombinante de
acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y
un portador biolístico, que es adecuado para la introducción de
moléculas de ácido nucleico en una célula huésped. Portadores
biolísticos preferidos son partículas de tungsteno, oro o de
materiales sintéticos.
Otra forma de realización de las composiciones
de acuerdo con la invención se refiere a composiciones que
contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
(proteína OK1) y secuencias de ácido nucleico que codifican una
proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
(proteína R1), una molécula de ácido nucleico recombinante de
acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y
una célula vegetal y un medio de cultivo sintético. Preferentemente,
dichas composiciones también contienen polietilenglicol (PEG)
además de las células vegetales y el medio de cultivo sintético. Con
estas composiciones, la molécula de ácido nucleico recombinante
existe fuera de la célula vegetal, es decir, se localiza fuera del
interior celular de la célula vegetal, que está rodeada por una
membrana citoplásmica. El experto en la técnica conoce medios de
cultivo sintético adecuados para el cultivo y/o transformación de
células vegetales y se describen adecuadamente, por ejemplo, en la
literatura. También existen disponibles muchos diferentes medios de
cultivo sintéticos para su adquisición en la marca especializada (p.
ej., DUCHEFA Biochemie B.V., Bélgica).
Además, la presente invención se refiere al uso
de composiciones de acuerdo con la invención para la transformación
de células vegetales.
- SEC ID Nº 1:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína A.t.-OK1 de Arabidopsis thaliana. Esta secuencia se inserta en los vectores OK1-pGEM-T y OK1-pDEST^{TM} 17.
- SEC ID Nº 2:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína A.t.-OK1 de Arabidopsis thaliana. Esta secuencia puede derivar de la secuencia de ácido nucleico mostrada como SEC ID Nº 1.
- SEC ID Nº 3:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína O.s.-OK1 de Oryza sativa. La secuencia se inserta en el vector pMI50.
- SEC ID Nº 4:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína O.s.-OK1 de Oryza sativa. Esta secuencia puede derivar de la secuencia de ácido nucleico mostrada como SEC ID Nº 3.
- SEC ID Nº 5:
- Secuencia peptídica que codifica el dominio de fosfohistidina de las proteínas OK1 de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa.
- SEC ID Nº 6:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína C.r.-R1 de Citrus reticulata.
- SEC ID Nº 7:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína C.r.-R1 de Citrus reticulata.
- SEC ID Nº 8:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína A.t.-R1 de Arabidopsis thaliana.
- SEC ID Nº 9:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína A.t.-R1 de Arabidopsis thaliana.
- SEC ID Nº 10:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína S.t.-R1 de Solanum tuberosum.
- SEC ID Nº 11:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-R1 de Solanum tuberosum.
- SEC ID Nº 12:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína O.s.-R1 de Oryza sativa.
- SEC ID Nº 13:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína O.s.-R1 de Oryza sativa.
- SEC ID Nº 14:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene la región codificadora de una proteína G.m.-R1 de Glycine max.
- SEC ID Nº 15:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-R1 de Glycine max.
- SEC ID Nº 16:
- Secuencia de ácido nucleico que contiene una región codificadora de una proteína Z.m.-R1 de Zea mays.
- SEC ID Nº 17:
- Secuencia de aminoácidos que codifica una proteína Z.m.-R1 de Zea mays.
Fig. 1: Gel desnaturalizante de acrilamida para
identificar proteínas de Arabidopsis thaliana, que se unen,
preferentemente, al almidón no fosforilado en comparación con el
almidón fosforilado. El marcador estándar del peso molecular de la
proteína se muestra en la marca "M". Las proteínas obtenidas
tras la incubación de la preparación control C del ejemplo 1 d) se
muestra en la marca "-". Los extractos proteicos de
Arabidopsis thaliana, obtenidos tras la incubación con
almidón no fosforilado, aislados de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana
(preparación B, ejemplo 1 d), se muestran en la marca "K". Los
extractos proteicos de Arabidopsis thaliana, obtenidos tras
la incubación con almidón no fosforilado, aislados de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis
thaliana, que se fosforiló de forma retrospectiva in
vitro con una proteína R1 (preparación A, ejemplo 1 d), se
muestran en la marca "P". Al finalizar la electroforesis, el
gel de acrilamida se marcó con azul de Coomassie.
Fig. 2: Demostración de la autofosforilación de
la proteína OK1. La figura 2A) muestra un gel desnaturalizante de
acrilamida (SDS) tras la finalización de le electroforesis con
tinción de azul de Coomassie. La figura 2B) muestra la
autorradiografía de un gel desnaturalizante de acrilamida (SDS). A
cada uno de los dos geles se aplicaron las mismas cantidades de las
mismas muestras. M: Marcador estándar del peso molecular de la
proteína; R1: Muestra del vaso de reacción 1 de acuerdo con el
ejemplo 7 (después de incubar una proteína OK1 con ATP); R2:
Muestra del vaso de reacción 2 de acuerdo con el ejemplo 7 (después
de incubar una proteína OK1 con ATP la proteína se calentó hasta
95ºC); R3: Muestra del vaso de reacción 3 de acuerdo con el ejemplo
7 (después de incubar una proteína OK1 con ATP la proteína se
incubó en HCl 0,5M); R4: Muestra del vaso de reacción 4 de acuerdo
con el ejemplo 7 (después de incubar una proteína OK1 con ATP la
proteína se incubó en NaOH 0,5M).
Fig. 3: Demostración de la actividad
fosforiladora de almidón de una proteína OK1 (véase el ejemplo 6).
La proteína OK1 se incubó con almidón no fosforilado aislado de
hojas de un mutante sex1-3 de Arabidopsis
thaliana (Preparación A) y almidón aislado de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis
thaliana, que se fosforiló de forma retrospectiva in
vitro con una proteína R1 (Preparación B). La Preparación c es
la misma que la Preparación B, a excepción de que esta Preparación
C se incubó sin proteína OK1. Para cada preparación (A, B, C) se
llevaron a cabo dos pruebas independientes (Prueba 1 y Prueba 2).
Las respectivas cantidades se muestran gráficamente, se miden en cpm
(cuentas por minuto), en fosfato marcado ^{33}P, que se introdujo
en el almidón no fosforilado (Preparación A) y en el almidón
fosforilado (Preparación B) de la proteína OK1.
Fig. 4: Comparación de las posiciones de los
átomos de C de las moléculas de glucosa del almidón, que se
fosforiló a partir de una proteína R1 y una proteína OK1,
respectivamente (véase el ejemplo 9). La proteína OK1 (Preparación
A) se incubó en presencia de ATP marcado con ^{33}P con almidón
aislado de hojas de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana, que se fosforiló de forma retrospectiva
in vitro con una proteína R1).). La proteína R1 (Preparación
B) se incubó en presencia de ATP marcado con ^{33}P con almidón
aislado de hojas de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana. Al finalizar la incubación se llevó a
cabo una hidrólisis total del almidón y los productos de la
hidrólisis obtenidos se separaron por medio de cromatográfica HPAE.
Como patrón, a los productos de la hidrólisis se añadieron
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato antes de la
separación. Los productos de hidrólisis separados por medio de
cromatográfica HPAE se recogieron en fracciones individuales. La
glucosa-6-fosfato eluyó con la
fracción 15 y la glucosa-3-fosfato
añadida eluyó con la fracción 17. Las fracciones obtenidas se
investigaron posteriormente para detectar la presencia de fosfato
marcado radiactivamente. La cantidad de fosfato marcado ^{33}P
medido en las fracciones individuales, medido en cpm (cuentas por
minuto), que se introdujo en los productos de hidrólisis del almidón
fosforilado por la proteína OK1 o la proteína R1, se muestra
gráficamente.
Fig. 5 Demostración de la autofosforilación de
la proteína OK1. La figura 5 A) muestra una transferencia de tipo
Western. La figura 5 B) muestra la autorradiografía de un gel
desnaturalizante de acrilamida (SDS). A cada uno de los dos geles
se aplicaron las mismas cantidades de las mismas muestras. La
proteína OK1 se incubó con ATP marcado radiactivamente aleatorizado
o con ATP específicamente marcado radiactivamente en la posición
gamma. Al finalizar la incubación, las proteínas se incubaron hasta
30ºC o 95ºC o se incubaron en NaOH 0,5M o HCl 0,5M,
respectivamente.
Fig. 6 Demostración de la transferencia del
residuo beta-fosfato del ATP al almidón en una
reacción catalizada por una proteína OK1. Para fosforilar el
almidón, que se había fosforilado in vitro por medio de una
proteína R1 y aislado de hojas de un mutante
sex-13 de Arabidopsis thaliana, se usó
ATP específicamente marcado con ^{33}P en la posición gamma o ATP
^{33}P aleatorizado por medio de una proteína OK1. No se añadió
proteína OK1 en ninguno de los experimentos designados como
"control". Cada preparación de prueba se analizó dos veces con
independencia una de otra. Se muestran los resultados de ambas
pruebas.
Fig. 7 Demostración del incremento de la
actividad de fosforilación en las reacciones de fosforilación cuando
las proteínas R1 y las proteínas OK1 están implicadas de forma
simultánea en la reacción. Se presenta la incorporación de fosfato,
a partir de ATP marcado radiactivamente
(ATP-^{33}P aleatorizado) en los almidones objeto
de interés midiendo la radiactividad (cpm) en los diferentes
almidones. Para este fin, se incubó almidón de trigo en forma
nativa con la proteína R1 (Preparación 1-2,
Preparación 1-2) o con la proteína OK1 (Preparación
2), o en forma de almidón de trigo fosforilado in vitro con
proteína OK1 (Preparación 3). La preparación 4 contenía almidón de
trigo nativo que se incubó simultáneamente con proteína R1 y
proteína OK1. Cada preparación se llevó a cabo por triplicado. El
total de las respectivas preparaciones 1-2 y
preparaciones 3 se presenta por comparación.
Fig. 8 Demostración del incremento de actividad
a través de la cooperación de una proteína R1 y una proteína OK1.
Por medio de una proteína R1, se incubó almidón de trigo fosforilado
in vitro durante 10 minutos o 30 minutos, respectivamente
con proteína R1 purificada (preparación 1) o proteína OK1 purificada
(preparación 2) en preparaciones de la reacción distintas usando
\Box/\Box-ATP-^{33}P
aleatorizado. En una preparación paralela, el mismo almidón de
trigo fosforilado se incubó de forma simultánea con una proteína R1
y una proteína OK1 (preparación 3). Para todas las preparaciones de
la reacción se determinó la cantidad de fosfato unido al almidón en
las respectivas preparaciones de la reacción después de la
finalización de la incubación por medio de determinación en el
contador de centelleo. En la figura también se presenta el total
para las preparaciones de la reacción para lo cual sólo se
introdujo una de las enzimas, respectivamente para la reacción de
fosforilación.
A continuación se describen procedimientos que
se pueden usar para llevar a cabo la invención. Estos procedimientos
constituyen formas de realización específicas de la presente
invención, pero no restringen la presente invención a estos
procedimientos. El experto en la técnica sabe que puede implementar
la invención del mismo modo mediante modificación de los
procedimientos descritos y/o sustituyendo partes individuales los
procedimientos por partes alternativas de los procedimientos.
El material de las hojas se congela en nitrógeno
líquido inmediatamente después de recolectar y, después, se
homogeneiza en el mortero en nitrógeno líquido. El material de las
hojas reducido se mezcla con aproximadamente 3,5 veces el volumen
(respecto al peso del material de hoja usado) de tampón de unión
frío (4ºC) y se degrada durante 2 x 10 segundos con un Ultraturrax
(velocidad máxima). Después del primer tratamiento con un
Ultraturrax, el material de las hojas reducido se enfría en hielo
antes de llevar a cabo el segundo tratamiento. El material de hojas
tratado se pasa después a través de una malla de nylon de 100 \mum
y se centrifuga durante 20 minutos (vaso de centrífuga de 50 ml,
20.000 g, 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante obtenido tras la centrifugación
de acuerdo con la etapa a) se retira y se determina su volumen.
Para precipitar las proteínas se añade al sobrenadante sulfato
amónico de forma continua durante un periodo de 30 minutos en
agitación en hielo hasta una concentración final del 75%
(peso/volumen). El sobrenadante se incuba después durante otra hora
en hielo y en agitación. Las proteínas precipitadas en el
sobrenadante se precipitan a 20.000 g y a 4ºC durante 10 minutos y
el sedimento se absorbe después en 5 ml de tampón de unión, es
decir, las proteínas presentes en el sedimento se disuelven.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eliminan las sales de las proteínas disueltas
por medio de una columna PD10 llena con Sephadex G25 (Amersham
Bioscience, Freiburg, Prod. Nº de columnas:
17-0851-01, Prod. No. Sephadex
G25-M: 17-0033-01) a
una temperatura de 4ºC, es decir el sulfato amónico usado en la
etapa b) para la precipitación también se separa de la proteína
disuelta. La columna PD10 se equilibra con tampón de unión antes de
aplicar las proteínas disueltas de acuerdo con la etapa b). Para
este fin se extienden 5 ml de tampón de unión sobre la columna cinco
veces en cada caso. Posteriormente, a cada columna se añaden 2,5 ml
de la solución de proteínas obtenida de acuerdo con la etapa b)
antes de que las proteínas eluyan de la columna con 3,5 ml de tampón
de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de proteína se determina con un
ensayo de Bradford (Biorad, Munich, Prod. No.
500-0006, Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72,
248-254).
\vskip1.000000\baselineskip
El material de hoja se congela inmediatamente
después de recolectarlo en nitrógeno líquido. El material de hoja
se homogeneiza en porciones en el mortero en nitrógeno líquido y se
absorbe en un total de aproximadamente 2,5 veces el volumen
(peso/volumen) de tampón de almidón. Además, esta suspensión se
homogeneiza de nuevo en el mezclador Waring durante 20 segundos a
velocidad máxima. El homogenizado se pasa a través de una malla de
nylon (malla de anchura de 100 \mum) y se centrifuga durante 5
minutos a 1.000 g. Se desecha el sobrenadante con las proteínas
solubles.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el material verde que se
encuentra encima del almidón mediante lavado del material verde con
tampón de almidón, el sedimento que contiene el almidón obtenido en
la etapa a) se absorbe en tampón de almidón y después se pasa a
través de mallas de nylon con diferentes anchuras de malla (del
orden de 60 \mum, 30 \mum, 20 \mum). El filtrado se
centrifuga usando un cojín de Percoll de 10 ml (95% v/v) (Pharmacia,
Uppsala, Suecia), 5% (v/v), HEPES-KOH 0,5M a pH
7,2) (tubo Correx, 15 min, 2.000 g). El sedimento obtenido después
de esta centrifugación se resuspende una vez en tampón de almidón y
se centrifuga de nuevo (5 min, 1.000 g).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la etapa b) se obtienen gránulos de
almidón, que contienen proteínas unidas al almidón. Las proteínas
unidas a la superficie de los gránulos de almidón se eliminan
mediante incubación cuatro veces con 0,5% de SDS (laurilsulfato
sódico) durante 10-15 minutos en cada caso, a
temperatura ambiente y en agitación. A cada etapa de lavado, le
sigue una centrifugación (5 minutos, 5.000 g) con el fin de separar
los gránulos de almidón del respectivo tampón de lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón obtenido de la etapa c), que ha sido
liberado de las proteínas unidas a su superficie, se elimina
después mediante incubación cuatro veces con tampón de lavado
durante 10-15 minutos en cada caso, a temperatura
ambiente y en agitación. A cada etapa de lavado, le sigue una
centrifugación (5 minutos, 1.000 g) con el fin de separar los
gránulos de almidón del respectivo tampón de lavado. Estas etapas de
purificación sirven principalmente para eliminar el SDS usado en
las incubaciones de la etapa c).
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad del almidón aislado en la etapa d)
se determina fotométricamente. Tras la dilución adecuada, la
densidad óptica de la suspensión de almidón se mide contra una curva
de calibración a una longitud de onda de 600 nm. El intervalo
lineal de la curva de calibración se localiza entre 0 y 0,3 unidades
de extinción.
Para producir las curvas de calibración, el
almidón, por ejemplo el aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana se
seca al vacío, se pesa y se absorbe en un volumen definido de agua.
La suspensión obtenida de este modo se diluye con agua en varias
etapas a una proporción de 1:1 en cada caso hasta obtener una
suspensión de aproximadamente 5 \mug de almidón por ml de agua.
Las suspensiones obtenidas mediante las etapas de dilución
individuales se miden en el fotómetro a una longitud de onda de 600
nm. Los valores de absorción obtenidos para cada suspensión se
representan contra la concentración del almidón en la respectiva
suspensión. La curva de calibración obtenida debería seguir una
función matemática lineal en el intervalo de 0 \mug de almidón
por ml de agua a 0,3 \mug de almidón por ml de agua.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón puede usarse directamente sin
posterior almacenamiento para pruebas adicionales o almacenarse en
alícuotas en vasos Eppendorf de 1,5 ml a -20ºC. Si se requiere, se
pueden usar tanto el almidón congelado cono el almidón recién
aislado no almacenado, para los procedimientos descritos en la
presente invención relacionados, por ejemplo, con la fosforilación
in vitro y/o la prueba de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que codifica una proteína de
fosforilación de almidón se puede amplificar, por ejemplo, usando
ARNm o poli-A más ARNm de tejidos vegetales como
"molde" por medio de una reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Para este fin, primer se usa una transcriptasa inversa para
la fabricación de una hebra de ADNc, que es complementaria a un
ARNm, que codifica una proteína de fosforilación de almidón antes de
amplificar la hebra de ADNc objeto de interés por medio de una ADN
polimerasa. Los denominados "kit" que contienen sustancias,
enzimas e instrucciones para llevar a cabo las reacciones de PCR
están disponibles para su adquisición (p. ej., SuperScript^{TM}
One-Step
RT-PCR System, Invitrogen, Prod. Nº: 10928-034). El ADNc amplificado que codifica una proteína de fosforilación de almidón puede clonarse después en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo pDEST^{TM}17 (Invitrogen). El pDEST^{TM}17 contiene el promotor T7, que se usa para iniciar la transcripción de la T7-ARN polimerasa. Además, el vector de expresión pDEST^{TM}17 contiene una secuencia de Shine Dalgarno en la dirección 5' del promotor T7, seguida por un codón de iniciación (ATG) y por una denominada cola de His. Esta cola de His consta de seis codones seguidos directamente unos de otros, de los que cada uno codifica el aminoácido histidina y se localizan en el marco de lectura de dicho codón de iniciación. La clonación de un ADNc que codifica una proteína de fosforilación de almidón en pDEST^{TM}17 se lleva a cabo de tal manera que se produce una fusión traduccional entre los codones para el codón de iniciación, la cola de His y el ADNc que codifica la proteína de fosforilación de almidón. Como resultado de esto, tras la transcripción iniciada en el promotor T7, y la posterior traducción, se obtiene una proteína de fosforilación de almidón, que contiene aminoácidos adicionales que contienen la cola de His en su extremo N.
RT-PCR System, Invitrogen, Prod. Nº: 10928-034). El ADNc amplificado que codifica una proteína de fosforilación de almidón puede clonarse después en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo pDEST^{TM}17 (Invitrogen). El pDEST^{TM}17 contiene el promotor T7, que se usa para iniciar la transcripción de la T7-ARN polimerasa. Además, el vector de expresión pDEST^{TM}17 contiene una secuencia de Shine Dalgarno en la dirección 5' del promotor T7, seguida por un codón de iniciación (ATG) y por una denominada cola de His. Esta cola de His consta de seis codones seguidos directamente unos de otros, de los que cada uno codifica el aminoácido histidina y se localizan en el marco de lectura de dicho codón de iniciación. La clonación de un ADNc que codifica una proteína de fosforilación de almidón en pDEST^{TM}17 se lleva a cabo de tal manera que se produce una fusión traduccional entre los codones para el codón de iniciación, la cola de His y el ADNc que codifica la proteína de fosforilación de almidón. Como resultado de esto, tras la transcripción iniciada en el promotor T7, y la posterior traducción, se obtiene una proteína de fosforilación de almidón, que contiene aminoácidos adicionales que contienen la cola de His en su extremo N.
No obstante, para la expresión de una proteína
de fosforilación de almidón también se pueden usar otros vectores,
adecuados para la expresión en microorganismos. El experto en la
técnica conoce vectores de expresión y cepas de expresión asociadas
y también están disponibles para su adquisición en el comerciante
adecuado en combinaciones adecuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, una cepa de E. coli
competente para transformación, que cromosómicamente codifica una
T7-ARN polimerasa, se transforma con el plásmido de
expresión fabricado en la etapa a) y, después, se incuba durante la
noche a 30ºC en medio de cultivo solidificado con agar. Cepas de
expresión adecuadas son, por ejemplo, cepas BL21 (Invitrogen Prod.
Nº: C6010-03, que cromosómicamente codifican una
T7-ARN polimerasa bajo el control de un promotor
inducible por IPTG (lacZ)).
Las colonias de bacterias resultantes de la
transformación se pueden investigar usando procedimientos conocidos
para el experto en la técnica para ver si contienen el plásmido de
expresión requerido que contiene un ADNc que codifica la proteína
de fosforilación de almidón. Al mismo tiempo se obtienen clones de
expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se produce un cultivo
preliminar. Para ello, un clon de expresión obtenido de acuerdo con
la etapa b) se siembra en 30 ml de caldo Terrific (medio TB) que
contiene un antibiótico para la selección de la presencia del
plásmido de expresión y se incuba durante la noche a 30ºC en
agitación (250 rpm).
Después se produce un cultivo principal para la
expresión de una proteína de fosforilación de almidón. Para ello,
en cada caso, matraces Erlenmeyer de 1 litro, cada uno con 300 ml de
medio TB pre-calentado hasta 30ºC y un antibiótico
para la selección de la presencia del plásmido de expresión se
siembran con 10 ml de un pre-cultivo adecuado y se
incuban a 30ºC en agitación (250 rpm) hasta alcanzar una densidad
óptima (medida a una longitud de onda de 600 nm; DO_{600}) de
aproximadamente 0,8. Si para la expresión de una proteína de
fosforilación de almidón se usa un plásmido de expresión en el que
la expresión de la proteína de fosforilación de almidón se inicia
por medio de un sistema inducible (p. ej., el vector de expresión
pDEST^{TM}17 en cepas de E. coli BL21, inducible por medio
de IPTG), al alcanzar una DO_{600} de aproximadamente 0,8, el
inductor objeto de interés (p. ej., IPTG) se añade al cultivo
principal. Después de añadir el inductor, el cultivo principal se
incuba a 30ºC en agitación (250 rpm) hasta alcanzar una DO_{600}
de aproximadamente 1,8. Después, el cultivo principal se enfría
durante 30 minutos en hielo antes de separar las células del cultivo
principal del medio de cultivo mediante centrifugación (10 minutos
a 4.000 g y 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células obtenidas tras centrifugación en la
etapa c), apartado 3 Procedimientos generales, se resuspenden en
tampón de lisis. Al hacerlo, a aproximadamente 1 g de células se
añaden aproximadamente 4 ml de tampón de lisis. Después, las
células resuspendidas se incuban durante 30 minutos en hielo antes
de degradarse con la ayuda de una sonda ultrasónica (Baudelin
Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlín, parámetros: ciclo 6,
70%, 1 minuto) en enfriamiento continuo por medio de hielo. Se deben
tomar precauciones en esta etapa para asegurarse de que la
suspensión celular no se calienta demasiado durante el tratamiento
ultrasónico. La suspensión obtenida tras el Tratamiento ultrasónico
se centrifuga (12 minutos a 20.000 g, 4ºC) y el sobrenadante
obtenido tras la centrifugación se filtra usando un filtro con un
tamaño de poro de 45 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Si la proteína de fosforilación de almidón
expresada en las células de E. coli es una proteína de fusión
con una cola de His, después puede tener lugar la purificación con
la ayuda de iones de níquel, a los que la cola de His se une con
mayor afinidad. Para ello, 25 ml del filtrado obtenido en la etapa
d) se mezcla con 1 ml de suspensión espesa de
Ni-agarosa (Qiagen, Prod. Nº: 30210) y se incuba
durante 1 hora en hielo. La mezcla de suspensión espesa de
Ni-agarosa y el filtrado se extiende después en una
columna de poliestireno (Pierce, Prod. Nº: 29920). El producto, que
atraviesa la columna, se desecha. Después, la columna se lava
mediante la adición de 8 ml de tampón de lisis, mientras que el
producto, que atraviesa la columna, se desecha de nuevo. A
continuación tiene lugar la elución de la proteína de fosforilación
de almidón mediante adicción fraccionada a la columna de 1 ml de
tampón E1 dos veces, seguido por 1 ml de tampón E2 una vez y,
después, 1 ml de tampón E3 cinco veces. El producto, que atraviesa
la columna, que se produce mediante la adición de la fracción
individual del tampón de elución adecuado (tampón E1, E2, E3), se
recoge en fracciones separadas. Posteriormente, las alícuotas de
estas fracciones se analizan por medio de electroforesis
desnaturalizante en gel de acrilamida, seguido por tinción con azul
de Coomassie. Las fracciones, que contienen la proteína de
fosforilación de almidón en cantidad suficiente y pureza
satisfactoria, se purifican y concentran con la ayuda de filtración
presurizada a 4ºC. La filtración presurizada se puede llevar a
cabo, por ejemplo, con la ayuda de una célula Amicon (Amicon
Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. Nº: 5121) usando una
membrana Diaflo PM30 (Millipore, Prod. Nº: 13212) a 4ºC. No
obstante, para la concentración también se pueden usar otros
procedimientos conocidos para el experto en la técnica.
La expresión recombinante de una proteína R1 se
describe en la literatura (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical
Journal 377, 525-532), pero también se puede llevar
a cabo de acuerdo con los procedimientos relacionados con la
expresión recombinante de una expresión de almidón de una proteína
de fosforilación de almidón descrita en lo que antecede en el
apartado 3, Procedimientos generales.
La purificación de una proteína R1 se describe
en la literatura (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical
Journal 377, 525-532), pero también se puede llevar
a cabo de acuerdo con los procedimientos relacionados con la
purificación de una proteína de fosforilación de almidón descrita en
lo que antecede en el apartado 4, Procedimientos generales, cuando
una proteína de fusión R1, que contiene una cola de His, se produce
mediante expresión de R1 en células de E. coli.
El almidón, que no contiene fosfato de almidón
(p. ej., aislado de endospermo de plantas de maíz o de trigo,
respectivamente, o de hojas de mutantes
sex1-3 de Arabidopsis thaliana con la
ayuda de los procedimientos descritos en lo que antecede en el
apartado 2, Procedimientos generales) se mezcla con tampón R1 y con
proteína R1 purificada (aproximadamente 0,25 \mug de proteína R1
por mg de almidón) con el fin de producir un contenido de almidón
de 25 mg por ml. Esta preparación de reacción se incuba durante la
noche (aproximadamente 15 horas) a temperatura ambiente en
agitación. La R1 unida al almidón presente en la preparación de la
reacción se elimina tras la finalización de la reacción lavando
cuatro veces con aproximadamente 800 \mul de 0,5% de SDS en cada
caso. Posteriormente, el SDS todavía presente en el almidón
fosforilado in vitro se elimina lavando cinco veces con 1 ml
de tampón de lavado en cada caso. Todas las etapas de lavado se
llevan a cabo a temperatura ambiente durante de 10 a 15 minutos en
agitación. A cada etapa de lavado, le sigue una centrifugación (2
minutos, 10.000 g) con el fin de separar los gránulos de almidón
del respectivo tampón SDS.
Aproximadamente 50 mg de
Almidón-P o aproximadamente 50 mg de almidón no
fosforilado, respectivamente, se resuspenden en preparaciones
distintas en aproximadamente 800 \mul de extracto de proteínas en
cada caso. La concentración proteica de los extractos de proteínas
debería ser aproximadamente 4 mg a 5 mg por ml en cada caso. La
incubación del Almidón-P o del almidón no
fosforilado con los extractos de proteínas se lleva a cabo a
temperatura ambiente durante 15 minutos a 4ºC en agitación. Al
finalizar la incubación, las preparaciones de reacción se
centrifugan usando un cojín de Percoll (4 ml) (15 minutos, 3500 rpm,
4ºC). Tras la centrifugación, las proteínas que no están unidas al
almidón fosforilado o al Almidón-P se encontrarán en
el sobrenadante y se pueden retirar con una pipeta Pasteur. El
sobrenadante se desecha. El precipitado sedimentado que contiene
Almidón-P y almidón no fosforilado, incluidas las
proteínas unidas a los respectivos almidones (complejos de
proteína-Almidón-P o complejos de
proteína-almidón no fosforilado, respectivamente),
obtenido tras la centrifugación se lava dos veces con 1 ml de
tampón de lavado en cada caso (véase en lo que antecede,
Procedimientos generales del apartado 7.b) mediante incubación
durante 3 minutos a 4ºC en cada caso y en agitación. A cada etapa
de lavado le sigue una centrifugación (5 minutos, 800 rpm, 4ºC en
una centrífuga de mesa, Hettich EBA 12R) con el fin de separar el
Almidón-P o el almidón no fosforilado,
respectivamente, del tampón de lavado.
Los complejos de
proteína-Almidón-P o los complejos
de proteína-almidón no fosforilado, respectivamente,
obtenidos en la etapa a) se resuspenden en aproximadamente 150
\mul de tampón de prueba con SDS y se incuban a temperatura
ambiente durante 15 minutos en agitación. El
almidón-P o el almidón no fosforilado,
respectivamente, se retira después de las proteínas disueltas
mediante centrifugación (1 minuto, 13.000 rpm, temperatura ambiente,
centrífuga de mesa Eppendorf). El sobrenadante obtenido tras la
centrifugación se centrifuga de nuevo con el fin de eliminar todos
los residuos de Almidón-P o de almidón no
fosforilado, respectivamente (1 minuto, 13.000 rpm, temperatura
ambiente, centrífuga de mesa Eppendorf) y se elimina. Como resultado
se obtienen las proteínas disueltas, que se unen al
Almidón-P o al almidón no fosforilado,
respectivamente.
Las proteínas disueltas obtenidas en la etapa c)
en el apartado 8. Procedimientos generales relacionado con la unión
de proteínas a Almidón-P o almidón no fosforilado,
respectivamente, se incuban durante 5 minutos a 95ºC en cada caso
y, después, se separan con la ayuda de electroforesis
desnaturalizante en gel de poliacrilamida. Al hacerlo, en cada caso
se aplica un volumen igual al gel de acrilamida para las proteínas
disueltas obtenidas mediante unión al Almidón-P y
para las obtenidas mediante la unión a almidón no fosforilado. El
gel obtenido al finalizar la electroforesis se tiñe al menos
durante la noche con azul de Coomassie coloidal (Roth, Karlsruhe,
Roti-Blue Rod Nº: A152.1) y, después, se destiñe en
30% de metanol, 5% de ácido acético o en 25% de metanol.
Las proteínas, que, tras la separación por medio
de electroforesis en gel de acrilamida y la posterior visualización
mediante coloración (véase en lo que antecede, Apartado 9.
Procedimientos generales), exhiben una mayor señal tras la unión a
Almidón-P en comparación con una señal
correspondiente tras la unión a almidón no fosforilado, tienen
mayor actividad de unión con respecto al Almidón-P
en comparación con el almidón no fosforilado. Por este medio, es
posible identificar proteínas que tengan mayor actividad de unión
con respecto al Almidón-P en comparación con el
almidón no fosforilado. Las proteínas que tienen mayor actividad de
unión con respecto al Almidón-P en comparación con
el almidón no fosforilado se escinden del gel de acrilamida.
Las proteínas identificadas de acuerdo con la
etapa a) se digieren con tripsina y los péptidos obtenidos se
analizan por medio de MALDI-TOF para determinar las
masas de los péptidos obtenidos. La tripsina es una proteasa
específica de secuencia, es decir, la tripsina solo rompe las
proteínas en una posición especificada, cuando las proteínas objeto
de interés contienen ciertas secuencias de aminoácidos. La tripsina
siempre rompe los enlaces peptídicos cuando los aminoácidos
arginina y lisina van seguidos desde el extremo N. De este modo,
teóricamente es posible determinar todos los péptidos que se
producirían tras la digestión con tripsina de una secuencia de
aminoácidos. A partir del conocimiento de los aminoácidos que
codifican los péptidos determinados teóricamente, también se pueden
determinar las masas de los péptidos, que se obtienen tras la
digestión teórica con tripsina. Por tanto, las bases de datos (p.
ej., NCBlnr http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm;
Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/MassSearch.html), que
contienen información concerniente a las masas de los péptidos tras
la digestión teórica con tripsina pueden compararse con las masas
reales de los péptidos de proteínas desconocidas obtenidas con
MALDI-TOF-MS. Las secuencias de
aminoácidos, que tienen las mismas masas peptídicas tras la
digestión teórica y/o real con tripsina, deben verse como idénticas.
Las bases de datos objeto de interés contienen tanto masas
peptídicas de proteínas, cuya función ya se ha mostrado, como masas
peptídicas de proteínas, que hasta ahora solo existen
hipotéticamente por derivación de las secuencias de aminoácidos
procedentes de las secuencias de ácido nucleico en los proyectos de
secuenciación. Por tanto, la existencia real y la función de dichas
proteínas hipotéticas apenas se han mostrado y, si existe una
función, ésta normalmente se basa únicamente en predicciones y no
en una demostración real de la función.
Las bandas que contienen proteínas identificadas
de acuerdo con la etapa a) se escinden del gel de acrilamida; la
pieza de acrilamida escindida se reduce y destiñe mediante
incubación durante aproximadamente media hora a 37ºC en
aproximadamente 1 ml de NH_{4}HCO_{3} 50 mM al 60%, 40% de
acetonitrilo. La solución decolorante se elimina posteriormente y
el gel restante se seca al vacío (p. ej., Speedvac). Después de
secar, se añade la solución de tripsina para digerir las proteínas
contenidas en la pieza de gel objeto de interés. La digestión tiene
lugar durante la noche a 37ºC. Tras la digestión se añade un poco de
acetonitrilo (hasta que el gel de acrilamida se tiñe de blanco) y
la preparación se seca al vacío (p. ej., Speedvac). Cuando el secado
se ha completado, se añade suficiente ácido fórmico al 5% para
cubrir los constituyentes secos y se incuban durante unos pocos
minutos a 37ºC. Posteriormente, los constituyentes secos se absorben
en TFA al 0,1% (ácido trifluoroacético, 5 \mul a 10 \mul) y se
introduce a través de gotas en un portador en porciones de
aproximadamente 0,5 \mul. Asimismo, al portador se aplican
cantidades iguales de matriz (ácido
\varepsilon-ciano-4-hidroxi-cinnámico).
Después de cristalizar en la matriz, las masas de péptidos se
determinan por medio de
MALDI-TOF-MS-MS (p.
ej., Burker Reflex^{TM} II, Bruker Daltonic, Bremen). Con las
masas obtenidas, se realiza una búsqueda en las bases de datos para
detectar secuencias de aminoácidos, que dan las mismas masas tras la
digestión teórica con tripsina. De este modo, se pueden identificar
secuencias de aminoácidos, que codifican proteínas que se unen
preferentemente a alfa-1,4-glucanos
fosforilados y/o que necesitan
P-alfa-1,4-glucanos
como sustrato.
Con el fin de demostrar si una proteína tiene
actividad de fosforilación de almidón, las proteínas que se van a
investigar se pueden incubar con almidón y ATP marcado
radiactivamente. Para ello, se incuban aproximadamente 5 mg de
Almidón-P o aproximadamente 5 mg de almidón no
fosforilado con la proteína que se va a investigar (0,01 \mug a
5,0 \mug por mg de almidón añadido) en 500 \mul de tampón de
fosforilación durante 10 minutos a 30 minutos a temperatura
ambiente en agitación. Posteriormente, la reacción se detiene
mediante la adición de SDS hasta una concentración de 2%
(peso/volumen). Los gránulos de almidón en la respectiva mezcla de
reacción se centrifugan (1 minuto, 13.000 g) y se lavan una vez con
900 \mul de una solución de SDS al 2% y cuatro veces cada uno con
900 \mul de una solución de ATP 2 mM. Cada etapa de lavado se
lleva a cabo durante 15 minutos a temperatura ambiente en
agitación. Después de cada etapa de lavado, los gránulos de almidón
se separan del respectivo tampón de lavado mediante centrifugación
(1 min, 13.000 g). Además, al llevar a cabo un experimento para
demostrar la actividad de fosforilación de almidón de una proteína,
otras preparaciones de reacción, que no contienen proteína o que
contienen proteína inactivada, pero que por otro lado se tratan del
mismo modo que las preparaciones de reacción descritas, se
procesarán como los denominados controles.
Los gránulos de almidón obtenidos de acuerdo con
la etapa a) se pueden investigar para detectar la presencia de
residuos fosfato marcados radiactivamente. Para ello, el almidón
respectivo se resuspende en 100 \mul de agua y se mezclan con 3
ml de cóctel de centelleo en cada caso (p. ej., Ready Safe^{TM},
BECKMANN Coulter) y posteriormente se analiza con la ayuda de un
contador de centelleo (p. ej., LS 6500 Multi-Purpose
Scintillation Counter, BECKMANN COULTER^{TM}).
Si una proteína se incuba en preparaciones
separadas, una vez con Almidón-P y una vez con
almidón no fosforilado, de acuerdo con el procedimiento descrito en
a), mediante comparación de los valores para determinar la presencia
de fosfato de almidón obtenido de acuerdo con la etapa b, se puede
determinar si la proteína objeto de interés tiene incorporado más
fosfato en Almidón-P en comparación con almidón no
fosforilado. De este modo, también se pueden identificar proteínas
que pueden introducir fosfato en Almidón-P pero no
en el almidón no fosforilado. Esto significa que se puede
identificar proteínas que ya requieren almidón fosforilado como
sustrato para una posterior reacción de fosforilación.
En la presente invención, debe entenderse que el
término "ATP aleatorizado" significa ATP que contiene residuos
de fosfato marcados en la posición gamma además de en la posición
beta (Ritte y col. 2002, PNAS 99, 7166-7171). El
ATP aleatorizado también se describe en la literatura científica
como ATP beta/gamma. A continuación se describe un procedimiento
para fabricar ATP aleatorizado.
El procedimiento descrito en el presente
documento para fabricar ATP aleatorizado con la ayuda de reacciones
catalizadas por enzimas se basa en los siguientes mecanismos de
reacción:
1ª etapa de reacción:
- ^{33}P-ATP + AMP + miocinasa \rightarrow^{33}P-ADP + ADP
- (Adenosina-P-P-^{33}P + Adenosina-P \rightarrow Adenosina-P-P + Adenosina-P-^{33}P)
2ª etapa de reacción:
- ^{33}P-ADP + ADP + 2 PEP + Piruvato cinasa \rightarrow^{33}P-ATP + ATP + 2 Piruvato
- (Adenosina-P-P + Adenosina-P-^{33}P + 2 PEP \rightarrow Adenosina-P-P-P + Adenosina-P-^{33}P-P + 2 Piruvato)
El equilibrio de la reacción reside en el lado
del producto pero, a pesar de ello, esta reacción produce una
mezcla compuesta principalmente por ^{33}P-ATP y
algo de ^{33}P-ATP
El ATP (100 \muCi, 3000 Ci por mmol), que
contiene un residuo de fosfato marcado con ^{33}P en la posición
gamma (Hartmann Analytic, 10 \muCi/\mul), se incuba con 2 \mul
de miocinasa (AMP-fosfotransferasa, de músculo de
conejo; SIGMA, Prod. Nº: M3003 3,8 mg/ml, 1.626 unidades/mg) en 90
\mul de tampón de aleatorización durante 1 hora a 37ºC.
Posteriormente, la reacción se detiene incubando durante 12 minutos
a 95ºC antes de que la preparación de reacción se purifique por
medio de filtración centrífuga usando un filtro Microcon YM 10
(Amicon, Millipore Prod. Nº 42407) a 14.000 g durante al menos 10
minutos.
Al filtrado obtenido en la etapa ii) se añaden
dos \mul de piruvato cinasa (véase más adelante para la
fabricación de una solución adecuada) y 3 \mul de PEP
(fosfoenolpiruvato) 50 mM. Esta mezcla de reacción se incuba durante
45 minutos a 30ºC antes de detener la reacción mediante incubación
a 95ºC durante 12 minutos. Posteriormente, la mezcla de reacción se
centrifuga (2 minutos, 12.000 rpm en una centrífuga de mesa
Eppendorf). El sobrenadante que contiene ATP aleatorizado obtenido
después de la centrifugación se elimina, alicuota y se puede
almacenar a -20ºC.
Quince \mul de piruvato cinasa (de músculo de
conejo, Roche, Prod. Nº 12815), 10 mg/ml, 200 unidades/mg a 25ºC se
centrifugan, el sobrenadante se desecha y el sedimento absorbido en
27 \mul de tampón de piruvato cinasa.
Con el fin de demostrar si una proteína tiene
actividad de autofosforilación, las proteínas que se van a
investigar se pueden incubar con almidón y ATP marcado
radiactivamente. Para ello, las proteínas que se van a investigar
(50 \mug a 100 \mug) se incuban en 220 \mul de tampón de
fosforilación (véase en lo que antecede, el Apartado 12d),
Procedimientos generales, durante 30 minutos a 90 minutos a
temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, la reacción se
detiene mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de
0,11M. Aproximadamente 2 \mug a 4 \mug de proteína se separan
con la ayuda de electroforesis desnaturalizante en gel de
poliacrilamida (7,5% de gel de acrilamida). El gel obtenido tras la
electroforesis en gel de poliacrilamida se somete a
autorradiografía. Las proteínas que exhiben una señal en la
autorradiografía portan un residuo de fosfato radiactivo.
Qué posiciones de átomos de C de las moléculas
de glucosa de un alfa-1,4-glucanos
son fosforiladas por una proteína se puede demostrar de forma
controlada mediante hidrólisis de los glucanos fosforilados
obtenidos por medio de una proteína adecuada in vitro, la
posterior separación de los monómeros de glucosa obtenidos tras la
hidrólisis, seguido por la medición del fosfato incorporado por una
proteína adecuada en ciertas fracciones de las moléculas de
glucosa.
Las suspensiones de agua que contienen
alfa-1,4-glucano se centrifugan, el
precipitado sedimentado se resuspende después en HCl 0,7M (Baker,
para análisis) y se incuban durante 2 horas a 95ºC en agitación. Al
finalizar la incubación, las muestras se enfrían brevemente y se
centrifugan (p. ej., 2 minutos, 10.000 g). El sobrenadante obtenido
se transfiere a un nuevo vaso de reacción y se neutraliza mediante
la adición de NaOH 2M (Baker, para análisis). Si permanece un
sedimento, se resuspende en 100 \mul de agua y la cantidad de
fosfato marcado presente en él se determina como control.
Posteriormente, el sobrenadante neutralizado se centrifuga sobre un
filtro de 10 kDa. Mediante la medición de una alícuota del filtrado
obtenido, la cantidad de fosfato marcado en el filtrado se
determina, por ejemplo, con la ayuda de un contador de
centelleo.
Los filtrados neutralizados de los productos de
la hidrólisis obtenidos mediante la etapa a) se pueden separar
(cuando se usa ATP marcado radiactivamente aproximadamente 3.000
cpm) con la ayuda de, por ejemplo, cromatografía de intercambio
aniónico de presión alta (HPAE). El filtrado neutralizado se puede
diluir con H_{2}O para obtener el volumen requerido para HPAE.
Además, a los filtrados adecuados se añaden glucosa
6-fosfato (aproximadamente 0,15 mM) y
glucosa-3-fosfato (aproximadamente
0,3 mM) en cada caso como control interno. La separación mediante
HPAE se puede llevar a cabo, por ejemplo, con la ayuda de un sistema
Dionex DX 600 Bio Lc usando una columna CarboPac PA 100 (con la
adecuada pre-columna) y un detector amperiométrico
pulsado (ED 50). Al hacerlo, antes de inyectar la muestra, la
columna se aclara primero durante 10 minutos con 99% del eluyente C
y 1% del eluyente D. Después se inyecta un volumen de la muestra de
60 \mul.
La elución de la muestra tiene lugar en las
condiciones siguientes:
Los productos de la hidrólisis eluidos de la
columna se recogen en fracciones individuales de 1 ml cada una.
Como, en cada caso, a las muestras inyectadas de los productos de
hidrólisis se han añadido
glucosa-3-fosfato no marcada (Ritte
y col. 2002, PNAS 99, 7166-7171) y
glucosa-6-fosfato no marcada (Sigma,
Prod. No.: G7879) como patrones internos, las fracciones, que
contienen glucosa-3-fosfato o
glucosa-6-fosfato, se pueden
determinar por medio de detección amperiométrica pulsada. Mediante
la medición de la cantidad de fosfatos marcados en las fracciones
individuales y, posteriormente, la comparación con las fracciones
que contienen glucosa-3-fosfato o
glucosa-6-fosfato, esto se puede
usar para determinar dichas fracciones, que contienen
glucosa-6-fosfato marcada o
glucosa-3-fosfato marcada. Se
determina la cantidad de fosfato marcado en la fracción objeto de
interés. A partir de las proporciones de las cantidades de
glucosa-3-fosfato y
glucosa-6-fosfato medidas para el
fosfato marcado en los productos de hidrólisis individuales, se
puede determinar qué posición de átomo de Carbono está fosforilada
preferentemente por una enzima fosforilante
alfa-1,4-glucano.
Las plantas de arroz se transformaron de acuerdo
con los procedimientos descritos por Hiei y col. (1994, Plant
Journal 6 (2), 271-282).
Las plantas de trigo se transformaron de acuerdo
con los procedimientos descritos por Becker y col. (1994, Plant
Journal 5, 299-307).
Embriones inmaduros de plantas de maíz de la
línea A188 se transformaron de acuerdo con los procedimientos
descritos por Ishida y col. (1996, Nature Biotechnology 14,
745-750).
Las posiciones C2, C3 y C6 de las unidades de
glucosa pueden estar fosforiladas en el almidón. Para determinar el
contenido C6-P del almidón se hidrolizan 50 mg de
almidón en 500 \mul de HCl 0,7M durante 4 horas a 95ºC.
Posteriormente, las preparaciones se centrifugan durante 10 minutos
a 15.500 g y se retiran los sobrenadantes. Siete \mul de los
sobrenadantes se mezclan con 193 \mul de tampón de imidazol
(imidazol 100 MM, pH 7,4; MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM y NAD 0,4 mM).
La medición se lleva a cabo en el fotómetro a 340 nm. Después de
establecer una absorción base, se inició la reacción enzimática
mediante la adición de 2 unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (de
Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim). El cambio en la
absorción es directamente proporcional a la concentración del
contenido de G-6-P del almidón.
La determinación del contenido total de fosfato
tiene lugar de acuerdo con el método de Ames (Methods in Enzymology
VIII, (1996), 115-118).
Aproximadamente 50 mg de almidón se mezclan con
30 \mul de solución de nitrato de magnesio etanólico y se
incineran durante tres horas a 500ºC en el horno de mufla. El
residuo se mezcla con 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5M y se
incuba durante 30 minutos a 60ºC. Posteriormente se rellena una
alícuota de 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5M, se añade a una
mezcla de 100 \mul de ácido ascórbico al 10% y 600 \mul de
molibdato amónico al 0,42% en ácido sulfúrico 2M y se incuba
durante 20 minutos a 45ºC.
Para determinar el contenido en fosfato que está
unido en la posición C-6 y en la posición
C-3 de las moléculas de glucosa de un
alfa-1,4-glucano, los glucanos
objeto de interés se pueden separar por medio de HPAE tras la
hidrólisis total de acuerdo con el procedimiento presentado en
Procedimientos generales 13. Mediante la comparación de las áreas
pico obtenidas para
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato en muestras
desconocidas con las áreas pico que se obtienen con cantidades
conocidas de glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato se pueden
determinar la cantidad de
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato en la muestra que
se va a investigar.
Se fabricaron extractos de proteínas a partir de
aproximadamente 7 g de hojas (peso fresco) de Arabidopsis
thaliana (Ecotype Columbia, Col-O) de acuerdo
con el procedimiento descrito en el Apartado 1, Procedimientos
generales.
Los gránulos de almidón se aislaron a partir de
aproximadamente 20 g (preso fresco) de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana de acuerdo con
el procedimiento descrito en el Apartado 2, Procedimientos
generales.
Aproximadamente 30 mg de almidón no fosforilado
aislado de una mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana se fosforiló de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Apartado 7, Procedimientos generales,
por medio de una proteína R1 expresada de forma recombinante en
E. coli y purificada. El procedimiento descrito por Ritte y
col. (2002, PNAS 99, 7166-7171) se usó para
expresar la proteína R1 en E. Coli y, después, para su
purificación.
Los extractos de proteínas de Arabidopsis
thaliana, obtenidos de acuerdo con la etapa a) se incubaron y
lavaron en la preparación A con 50 mg del almidón fosforilado in
vitro fabricado de acuerdo con la etapa c) usando el
procedimiento descrito en el Apartado 8a), Procedimientos
generales.
Los extractos de proteínas de Arabidopsis
thaliana, obtenidos de acuerdo con la etapa a) se incubaron y
lavaron en una segunda preparación B con 50 mg del almidón no
fosforilado fabricado de acuerdo con la etapa b) usando el
procedimiento descrito en el Apartado 8a), Procedimientos
generales.
Posteriormente, las proteínas unidas al
Almidón-P de la preparación A y al almidón no
fosforilado de la preparación B se disolvieron de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Apartado 8b), Procedimientos
generales.
En una tercera preparación C, 50 mg del almidón
fosforilado in vitro fabricado de acuerdo con la etapa c) se
incubaron y lavaron usando el procedimiento descrito en el Apartado
8b), Procedimientos generales. No obstante, la preparación C no
contenía extractos proteicos.
Las proteínas de las preparaciones A, B y C
obtenidas en la etapa d) se separaron por medio de un gel de
acrilamida al 9% en condiciones desnaturalizantes (SDS) usando el
procedimiento descrito en el Apartado 9, Procedimientos generales
y, posteriormente, se tiñeron con azul de Coomassie. El gel teñido
se muestra en la figura 1, Se puede observar claramente que una
proteína, que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kDa en
el gel desnaturalizante de acrilamida, referida a un marcador
proteico patrón (Marca M), se une, preferentemente, al almidón
fosforilado (Marca P) en comparación con el almidón no fosforilado
(K).
La banda de la proteína con un peso molecular de
aproximadamente 130 kDa identificada en la etapa e) se escindió del
gel. Posteriormente, la proteína se liberó de la acrilamida tal como
se describe en Procedimientos generales 10b), se digirió con
tripsina y las masas peptídicas obtenidas se determinaron por medio
de MALD-TOF-MS. La denominada
"huella" obtenida mediante
MALD-TOF-MS se comparó con las
huellas de moléculas de ácido nucleico teóricamente digeridas de
las bases de datos (Mascot:
http//www.matrixscience.com/search__form__select.html; ProFound:
http:l/129.85.19.192/profound__bin/WebPro-Found.exe;
PepSea: http://195.41.108.38/PepSealntro.html). Dado que dicha
huella es muy específica de una proteína, fue posible identificar
una molécula de aminoácido. Con la ayuda de la secuencia de esta
molécula de aminoácido, fue posible aislar una secuencia de ácido
nucleico de Arabidopsis thaliana que codifica una proteína
OK1. La proteína identificada con este procedimiento se designó
A.t.-OK1. El análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína
OK1 de Arabidopsis thaliana mostró que se desviaba de la
secuencia que estaba presente en la base de datos (NP 198009, NCBI).
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2 codifica la
proteína A.t.-OK1. La SEC ID Nº 2 contiene desviaciones cuando se
compara con la secuencia en la base de datos (Acc: NP 198009.1,
NCBI). Los aminoácidos 519 a523 (WRLCE) y 762 a 766 (VRARQ)
contenidos en la SEC ID Nº 2 no están en la secuencia que está
presente en la base de datos (ACC.: NP 198009.1). En comparación
con la versión 2 de la secuencia de la base de datos (Acc.: NP
198009.2), la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2
también contiene los aminoácidos adicionales 519 a 523
(WRLCE).
(WRLCE).
El ADNc de A.t.-OK1 se aisló con la ayuda de PCR
inversa usando ARNm aislado de hojas de Arabidopsis thaliana.
Para ello, se sintetizó una hebra de ADNc por medio de
transcriptasa inversa (SuperScript^{TM}
First-Strand Synthesis System for RT PCR,
Invitrogen Prod. Nº: 11904-018), que después se
amplificó usando ADN polimerasa (Expand High Fidelity PCR Systems,
producto de Roche Nº: 1732641). El producto amplificado obtenido de
esta reacción de PCR se clonó en el vector pGEM®-T (Invitrogen
Prod. Nº: A3600). El plásmido obtenido se designa
A.t.-OK1-pGEM, se determinó la secuencia de ADNc que
codifica la proteína A.t.-OK1 y se muestra como SEC ID Nº 1:
La secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 no es la
misma que la secuencia contenida en la base de datos. Esto ya se ha
tratado para la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
A.t.-OKA.t.-OK1. Condiciones usadas para la amplificación del ADNc
que codifica la proteína A.t.-OK1
Se usaron las condiciones y el tampón
especificados por el fabricante. Además, la preparación de la
reacción para la síntesis de la primera hebra contenía las
sustancias siguientes:
- 3 \mug
- ARN total
- 5 \muM
- 3'-Cebador (OK1 rev1: 5'-GACTCAACCACATAACACACAAAGATC)
- 0,83 \muM
- mezcla de dNTP
La preparación de reacción se incubó durante 5
minutos a 75ºC y, posteriormente, se enfrió hasta la temperatura
ambiente.
Después, se añadieron el tampón de la 1ª hebra,
el inhibidor de ARNasa y DTT, y se incubaron durante 2 minutos a
42ºC antes de añadir 1 \mul de RT-ADN polimerasa
Superscript y la preparación de reacción se incubó durante 50
minutos a 42ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la amplificación de la primera
hebra por medio de PCR:
- 1 \mul
- de la preparación de reacción de la síntesis de la primera hebra
- 0,25 \muM
- 3'Cebador (OK1 rev2: 5'-TGGTAACGAGGCAAATGCAGA)
- 0,25 \muM
- 5'Cebador (OK1 fwd2: 5'-ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de la reacción:
Etapa 195ºC 2
min
Etapa 294ºC 20
s
Etapa 362ºC 30
s
Etapa 468ºC 4
min
Etapa 594ºC 20
s
Etapa 656ºC 30
s
Etapa 768ºC 4
min
Etapa 868ºC 10
min
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se llevó a cabo primero de acuerdo
con las etapas 1 a 4. Entre la etapa 4 y la etapa 2 se llevaron a
cabo diez repeticiones (ciclos), la temperatura de la etapa 3 se
redujo en 0,67ºC después de cada ciclo. A esto le siguió después la
reacción de acuerdo con las condiciones especificadas en las etapas
5 a 8. Se llevaron a cabo veinticinco repeticiones (ciclos) entre
la etapa 7 y la etapa 5, incrementándose el tiempo de la etapa 7 en
5 segundos en cada ciclo. Al finalizar la reacción, la reacción se
enfrió hasta 4ºC.
Tras la amplificación mediante PCR usando el
plásmido A.t.-OK1-pGEM como molde con la tecnología
Gateway Technology (Invitrogen), después se clonó la secuencia que
codifica la proteína OK1 de Arabidopsis thaliana en el
vector pDONOR^{TM} 201 (Invitrogen Prod. Nº:
11798-014). Posteriormente, la región codificadora
de la proteína OK1 del vector obtenido se clonó mediante
recombinación específica de secuencia en el vector de expresión
pDEST17^{TM} (Invitrogen Prod. Nº: 11803-014). El
vector de expresión obtenido se designó
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17. La clonación tuvo como
resultado una fusión traduccional del ADNc que codifica la proteína
A.t-OK1 con los nucleótidos presentes en el vector
de expresión pDEST^{TM}17. Los nucleótidos que se original del
vector pDEST^{TM}17, que están condensados tradicionalmente con el
ADNc codificador de la proteína A.t.-OK1, codifican 21 aminoácidos.
Estos 21 aminoácidos incluyen, entre otros, el codón de iniciación
(ATG) y una denominada cola de His (6 residuos de histidina
directamente uno detrás de otro). Después de la traducción de estas
secuencias condensadas tradicionalmente, esto tienen como resultado
una proteína A.t.-OK1 que tiene los 21 aminoácidos adicionales
codificados por los nucleótidos que se originan del vector en su
extremo N. La proteína A.t.-OK1 recombinante resultante de este
vector contiene 21 aminoácidos adicionales que se originan del
vector pDEST^{TM}17 en su extremo N.
El vector de expresión
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17 obtenido de acuerdo con el
ejemplo 3 se transformó en la cepa de E. coli
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17. En lo que antecede ya se ha
facilitado una descripción de este sistema de expresión (véase el
Apartado 3, Procedimientos generales). A continuación se usaron
clones de bacterias que contienen el vector
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17, resultante de la
transformación para fabricar un cultivo preliminar, que después se
usó para inocular un cultivo principal (véase el Apartado 3c,
Procedimientos generales). El cultivo preliminar y el cultivo
principal se incubaron, cada uno, a 30ºC en agitación (250 rpm).
Cuando el cultivo principal alcanzó una DO_{600} de
aproximadamente 0,8, la expresión de la proteína A.t.-OK1
recombinante se indujo mediante la adición de IPTG
(isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido)
hasta alcanzar una concentración final de 1 mM. Tras la adición de
IPTG, el cultivo principal se incuba a 30ºC en agitación (250 rpm)
hasta alcanzar una DO_{600} de aproximadamente 1,8.Después, el
cultivo principal se enfrió durante 30 minutos en hielo antes de
separar las células del cultivo principal del medio de cultivo
mediante centrifugación (10 minutos a 4.000 g y 4ºC).
La purificación y concentración de la proteína
A.t.-OK1 de las células obtenidas de acuerdo con el ejemplo 4 se
llevó a cabo usando el procedimiento descrito en el apartado 4,
Procedimientos generales.
La actividad de fosforilación de almidón de la
proteína A.t.-OK1 se demostró de acuerdo con el procedimiento
descrito en el apartado 11, Procedimientos generales. Al hacerlo, en
cada caso, 5 \mug de la proteína A.t.-OK1 purificada de acuerdo
con el ejemplo 5 se incubaron en una preparación A con 5 mg de
almidón aislado de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana de acuerdo con el ejemplo 1b) y en una
preparación B con 5 mg de almidón obtenido mediante fosforilación
enzimática de acuerdo con el ejemplo 1c), en cada caso en 500 \mul
de tampón de fosforilación que contiene ATP aleatorizado marcado
radiactivamente (^{33}P) 0,05 Mm (en total, 1.130,00 cpm,
aproximadamente 0,55 \muCi) durante 30 minutos a temperatura
ambiente en agitación. La preparación C se usó como control, que
era el mismo que la preparación B, excepto porque no contenía
proteína OK1, pero, por otro lado, se trató del mismo modo que las
preparaciones A y B. Para todas las preparaciones (A, B, C) se
llevaron a cabo dos pruebas que eran independientes una de otra.
Usando un contador de centelleo, se analizaron
los almidones de las preparaciones A, B y C para detectar la
presencia de fosfato marcado radiactivamente (véase el apartado
11b), Procedimientos generales). Los resultados se muestran en la
tabla 1 y en la figura 3.
A partir de los resultados obtenidos se puede
ver que la proteína OK1 no transfiere grupos fosfato desde el ATP
al almidón cuando no se proporciona almidón no fosforilado como
sustrato, ya que la cuota de grupos fosfato transferidos al almidón
no fosforilado por medio de una proteína OK1, medido en cpm, no
excede la cuota de grupos fosfato marcados radiactivamente en la
preparación C (control). Si, por otro lado, se proporciona
almidón-P como sustrato, la cuota de grupos fosfato
radiactivos, medida en cpm, que se transfieren desde el ATP al
almidón-P, es significativamente mayor. A partir de
esto, se puede ver que la proteína OK1 requiere
almidón-P como sustrato y que el almidón no
fosforilado no es aceptado como sustrato por la proteína OK1.
Si la prueba descrita en lo que antecede se
lleva a cabo con ATP específicamente marcado en la posición gamma
con ^{33}P, no es posible establecer una incorporación de fosfato
marcado radiactivamente en el almidón. A partir de esto se puede
ver que el residuo de beta fosfato del ATP se transfiere de una
proteína OK1 al almidón. Los resultados de dicha prueba se muestran
en la figura 6.
La autofosforilación de la proteína A.t.-OK1 se
demostró por medio de los procedimientos descritos en lo que
antecede (véase el apartado 12, Procedimientos generales). En este
documento, se incubaron 50 \mug de proteína A.t.-OK1 purificada
con ATP aleatorizado marcado radiactivamente en 220 \mul de tampón
de fosforilación (véase en lo que antecede, apartado 12d),
Procedimientos generales) a temperatura ambiente durante 60 minutos
en agitación. Posteriormente, en cada caso se extrajeron 100 \mul
de las preparaciones de incubación y se transfirieron a cuatro
vasos de reacción frescos. En el vaso de reacción 1, la reacción se
detuvo mediante la adición de 40 \mul de EDTA 0,11 M. El vaso de
reacción 2 se incubó a 95ºC durante 5 minutos. Al vaso de reacción
3 se añadió HCl hasta una concentración final de 0,5M y al vaso de
reacción 4 se añadió NaOH hasta una concentración final de 0,5M.
Los vasos de reacción 3 y 4 se incubaron, cada uno, durante 25
minutos a 30ºC. Posteriormente, en cada caso se extrajeron 50
\mul de los vasos de reacción 1, 2, 3 y 4, se mezclaron con
tampón de ensayo SDS y se separaron por medio de electroforesis en
gel de acrilamida SDS (gel de acrilamida al 7,5%). Para este fin,
las muestras de los vasos de reacción se aplicaron a cada uno de los
dos geles de acrilamida idénticos. Uno de los geles obtenidos al
finalizar la electroforesis se sometió a autorradiografía, mientras
que el Segundo gel se tiñó con azul de Coomassie.
En el gel teñido con azul de Coomassie (véase la
figura 2A)), claramente se puede ver que el tratamiento con NaOH
0,5M conduce a una degradación de la proteína OK1. Por tanto, la
proteína OK1 debe describirse como inestable en comparación con
NaOH. Las incubaciones a 30ºC, 95ºC y con HCl 0,5M muestran que la
proteína OK1 es relativamente estable en las condiciones de
incubación indicadas. Esto se puede concluir del hecho de que, en
estas condiciones de incubación, en cada caso se pueden demostrar
aproximadamente las mismas cantidades de proteína OK1 en el gel
objeto de interés tras la tinción con azul de Coomassie.
En la autorradiografía (véase la figura 2B)), se
puede observar, por comparación con la proteína OK1 fosforilada
incubada a 30ºC, que una incubación de la proteína OK1 fosforilada a
95ºC conduce a una reducción significativa del fosfato, que estaba
unido a la proteína OK1. Por tanto, el enlace entre el residuo
fosfato y un aminoácido de la proteína OK1 debe describirse como
inestable al calor.
Además, también se puede ver una ligera
reducción del fosfato unido a la proteína OK1 para la incubación con
HCl 0,5M y NaOH 0,5M en comparación con la proteína OK1 fosforilada
incubada a 30ºC. Si se tiene en cuenta el hecho de que la cantidad
de proteína OK1 en la autorradiografía tras el Tratamiento con NaOH
0,5M es significativamente menor que en las muestras tratadas con
calor y ácido a cuenta de la inestabilidad de la proteína OK1 en
comparación con el NaOH, se puede concluir que el enlace entre el
residuo de fosfato y un aminoácido de la proteína OK1 será
relativamente estable con respecto a las bases. Dado que la muestra
tratada con ácido contiene aproximadamente las mismas cantidades de
proteína que la muestra incubada a 30ºC y a 95ºC, y todavía tiene
una señal significativamente menor en la autorradiografía que la
muestra tratada a 30ºC, debe asumirse que la incubación en
condiciones ácida también rompe en cierta medida el enlace entre un
residuo de fosfato y un aminoácido de la proteína OK1. Por tanto,
también se pudo establecer una inestabilidad en el enlace entre un
residuo de fosfato y un aminoácido de la proteína OK1 en las
pruebas llevadas a cabo. Al mismo tiempo, la inestabilidad con
respecto a los ácidos está significativamente menos marcada que la
inestabilidad con respecto al calor. Los enlaces entre los
aminoácidos histidinas y el fosfato son inestables al calor,
inestables al ácido pero estables a las bases (Rosenberg, 1996,
Protein Analysis and Purification, Birkhäuser, Boston,
242-244). Por tanto, los resultados descritos en lo
que antecede son una indicación de que mediante la autofosforilación
de una proteína OK1 se produce una fosfohistidina.
Si la proteína OK1 expresada de forma
recombinante, como se ha descrito en lo que antecede, se incuba con
ATP marcado específicamente con 33P en la posición gamma, no se
puede detectar ninguna autofosforilación. La figura 5A) muestra la
cantidad de proteína en la respectiva preparación de reacción que
puede seguir demostrándose por medio de análisis de transferencia
de tipo Western tras las etapas de incubación adecuadas. La figura
5B) muestra una autorradiografía de proteína de las preparaciones de
reacción individuales. Se puede observar que, cuando se usa ATP
marcado específicamente en la posición gamma, no tiene lugar ninguna
autofosforilación de la proteína OK1, mientras que cuando se usa
ATP aleatorizado se puede demostrar autofosforilación. Esto
significa que cuando se autofosforila una proteína OK1, el residuo
de fosfato de la posición beta del ATP está covalentemente unido a
un aminoácido de la proteína OK1.
El almidón fosforilado se fabricó de acuerdo con
el apartado 7, Procedimientos generales. Para ello, se usaron 5 mg
de almidón no fosforilado, aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana en una
preparación A con 25 \mug de proteína A.t.-OK1 purificada, en una
segunda preparación B se usaron 5 mg de almidón fosforilado in
vitro aislado originalmente de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana con 5 \mug
de proteína R1 purificada. La reacción se llevó a cabo en 500
\mul de tampón de fosforilación en cada caso, que, en cada caso
contenía ATP marcado con ^{33}P (aproximadamente 2,5 x 10^{6}
cpm), mediante incubación a temperatura ambiente durante 1 hora en
agitación. 2.5 x 106 cpm). Además se usó una preparación control que
contenía 5 mg de almidón aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana y dicho tampón
de fosforilación, pero sin proteína. La preparación control se
trató exactamente del mismo modo que las preparaciones A y B. Las
reacciones individuales se detuvieron mediante la adición de 125
\mul de 10% SDS en cada caso y se lavaron con 900 \mul en cada
caso, una vez con 2% de SDS, cinco veces con ATP 2 mM y dos veces
con H_{2}O. Se llevó a cabo una centrifugación después de cada
etapa de lavado (2 minutos en una centrífuga de mesa Eppendorf a
13.000 rpm en cada caso). Los sedimentos de almidón obtenidos se
resuspendieron en 1 ml de H_{2}O en cada caso y 100 \mul de
cada preparación se mezclaron tras la adición de 3 ml de cóctel de
centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN) y posteriormente se
midieron con la ayuda de un contador de centelleo (LS 6500
Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN
COULTER^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
La medición dio los resultados siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de las preparaciones A, B y C
obtenidas de acuerdo con la etapa a) se centrifugaron de Nuevo (5
minutos en una centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm), los
sedimentos obtenidos se resuspendieron en 90 \mul de HCl 0,7 m
(Baker, para análisis) y posteriormente se incubaron durante 2 horas
a 95ºC. Las preparaciones A, B y C se centrifugaron de nuevo (5
minutos en una centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm) y el
sobrenadante se transfirió a un Nuevo vaso de reacción. Los
residuos sedimentados de las preparaciones se resuspendieron en 100
ml de H_{2}O en cada caso y tras la adición de 3 ml de cóctel de
centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN) se midieron con la ayuda de
un contador de centelleo (LS 6500 Multi-Purpose
Scintillation Counter, BECKMANN COULTER^{TM}). No se pudo
demostrar la presencia de cantidades significativas en ninguno de
los residuos, lo que significa que todos los productos de
hidrólisis marcados con fosfato radiactivo estaban localizados en
el sobrenadante.
A esto le siguió la neutralización de los
sobrenadantes individuales que contienen los productos de hidrólisis
mediante la adición, en cada caso, de 30 \mul de NaOH 2M (la
cantidad de NaOH requerida para la neutralización se analizó con
antelación en muestras enmascaradas). Los productos de hidrólisis
neutralizados se introdujeron sobre un filtro Microcon de 10 kDa,
que previamente se habían aclarado dos veces con 200 \mul de
H_{2}O en cada caso y se centrifugaron durante aproximadamente 25
minutos a 12.000 rpm en una centrífuga de mesa Eppendorf.
\vskip1.000000\baselineskip
Del filtrado obtenido se tomaron diez \mul
(aproximadamente 120 \mul en cada caso) y, después de la adición
de 3 ml de cóctel de centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN), se
midieron con la ayuda de un contador de centelleo (LS 6500
Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN
COULTER^{TM}). La determinación de la actividad presente en las
preparaciones individuales dio los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de hidrólisis obtenidos de acuerdo
con la etapa b) se separaron por medio de HPAE usando un sistema
Dionex en las condiciones indicadas en lo que antecede (véase el
apartado 13c) Procedimientos generales). Las muestras para separar
los sobrenadantes filtrados de las preparaciones A y B obtenidos de
acuerdo con la etapa b)) estaban compuestas del siguiente modo:
- Preparación A (OK1):
- 43 \mul del sobrenadante de la preparación A obtenida de acuerdo con la etapa b) (equivalente a aproximadamente 4.000 cpm), 32 \mul de H_{2}O, 2,5 \mul de glucosa-6-fosfato 2,5 mM y 2,5 \mul de glucosa 3-fosfato 5 mM (Volumen = 80 \mul).
- Preparación B (R1):
- 16 \mul del sobrenadante de la preparación B obtenida de acuerdo con la etapa b) (equivalente a aproximadamente 4.000 cpm), 59 \mul de H_{2}O, 2,5 \mul de glucosa-6-fosfato 2,5 mM y 2,5 \mul de glucosa 3-fosfato 5 mM (Volumen = 80 \mul).
\newpage
En cada caso, se inyectaron 60 \mul, que
contienen aproximadamente 3.000 cpm, de las muestras adecuadas para
su separación por medio de HPAE. La HPAE se llevó a cabo de acuerdo
con las condiciones especificadas en el apartado 13c,
Procedimientos generales. Después de pasar por la columna HPAE, el
tampón de elución se recogió en fracciones, cada una de 1 ml. La
recogida de fracciones comenzó 10 minutos después de inyectar la
muestra. Según la señal recibida del detector PAD usado, la elución
de glucosa-6-fosfato se asignó a la
fracción 15 y la elución de
glucosa-3-fosfato a la fracción 17.
En cada caso se mezclaron 500 \mul de las fracciones individuales
con 3 ml de cóctel de centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN) y
posteriormente se midieron con la ayuda de un contador de centelleo
(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter,
BECKMANN COULTER^{TM}). Se obtuvieron las mediciones siguientes
par alas fracciones individuales:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados también se muestran gráficamente
en la figura 5.
Después de la fosforilación del almidón
catalizada por la proteína R1, aproximadamente el 66% del fosfato
marcado radiactivamente, en términos del fosfato radiactivo total
medido en las fracciones analizadas, eluyó tras la hidrólisis del
almidón con la fracción, que contenía
glucosa-6-fosfato como patrón y
aproximadamente el 27% con la fracción que contenía
glucosa-3-fosfato como patrón.
Después de la fosforilación del almidón catalizada por la proteína
OK1, aproximadamente el 67% del fosfato marcado radiactivamente, en
términos del fosfato radiactivo total medido en las fracciones
analizadas, eluyó tras la hidrólisis del almidón con la fracción,
que contenía glucosa-6-fosfato como
patrón y aproximadamente el 8% con la fracción que contenía
glucosa-3-fosfato como patrón. A
partir de esto se puede concluir que las moléculas de glucosa se
fosforilan, preferentemente, en la posición C6 por las proteínas
R1, mientras que las moléculas de glucosa se fosforilan,
preferentemente, en la posición C-3 por proteínas
OK1.
De acuerdo con el procedimiento descrito en el
apartado 7, Procedimientos generales, se fosforilaron in
vitro 35 mg de almidón de trigo (Sigma, prod. Nº
S-5127) por ml de preparación de reacción. Para este
fin se usó proteína R1 purificada en una concentración de 0,23
\mug por mg de almidón y ATP en una concentración de 25 \muM.
El tiempo de reacción ascendió a 1 hora a temperatura ambiente. En
una preparación de reacción paralela que contenía
ATP-^{33}P aleatorizado en lugar de ATP se
determinó la cantidad del fosfato incorporado en el almidón (0,0054
nmol por mg de almidón) y la actividad específica de la proteína R1
usada (0,41 nmol por (mg de proteína x minuto). Para esta
determinación no se consideró el uso de ATP aleatorizado. Por tanto,
los valores obtenidos son inferiores a los valores existentes
reales, porque el ATP aleatorizado también contiene residuos de
fosfato marcados en la posición gamma así como residuos de fosfato
marcados en la posición beta.
15 mg de almidón de trigo (Sigma, prod. Nº
S-5127 o almidón de trigo fosforilado in
vitro de acuerdo con el procedimiento descrito en a)) se
incubaron con enzimas de almidón fosforilado purificadas en 430
\mul del tampón que contiene 11 nmol de ATP-33P
aleatorizado (aproximadamente 1,5 x 106 cpm) descrito en el apartado
11, Procedimientos generales, durante una hora en agitación a
temperatura ambiente. Las preparaciones de reacción individuales
contenían las siguientes proteínas y sustratos:
Cada una de las preparaciones se llevó a cabo
por triplicado en cada caso.
El Tratamiento de las preparaciones de reacción
individuales tras una hora de tiempo de reacción y la determinación
de la cantidad incorporada de fosfato en el sustrato objeto de
interés se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos
en el apartado 11, Procedimientos generales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los resultados siguientes:
A partir de la tabla queda claro que el almidón
de trigo nativo (Sigma, proc. Nº: S-5127) no forma
ningún sustrato para la proteína OK1, mientras que el almidón de
trigo fosforilado in vitro puede estar fosforilado a partir
de proteínas OK1. Además, se puede ver que la actividad es
significativamente mayor que el total de las actividades
individuales correspondientes cuando una proteína R1 y una proteína
OK1 están presentes de forma simultánea en la mezcla de
reacción.
El almidón de trigo fosforilado se fabricó de
acuerdo con el procedimiento descrito en a). La cantidad de fosfato
unido al almidón ascendió a 0,0048 mg de fosfato por mg de almidón.
Para esta determinación no se consideró el uso de ATP aleatorizado,
como también se describe en a).
15 mg de almidón de trigo fosforilado in
vitro se incubaron con enzimas fosforiladoras de almidón de
acuerdo con los procedimientos descritos en b). Las preparaciones
de reacción individuales contenían las siguientes proteínas y
sustratos:
Cada una de las preparaciones se llevó a cabo
por duplicado en cada caso.
Una muestra se detuvo tras 0, 10 y 30 minutos de
tiempo de incubación para cada preparación de reacción y se
determinó la cantidad de fosfato incorporado en las respectivas
condiciones de reacción de acuerdo con el procedimiento descrito en
el apartado 11, Procedimientos generales.
Como control, el almidón de trigo nativo se
incubó con proteína R1 en presencia de ATP no marcado
radiactivamente. Posteriormente, la mezcla de reacción se añadió a
ATP-^{33}P aleatorizado y el tampón antes de
detener la reacción.
Se obtuvieron los resultados siguientes:
Usando los procedimientos descritos en los
apartados 1 a 13, Procedimientos generales, también fue posible
identificar una proteína de Oryza sativa (variedad M202), que
transfiere un residuo de fosfato desde el ATP al
almidón-P. La proteína se designó O.s.-OK1. La
proteína O.s.-OK1 no usa almidón no fosforilado como sustrato, es
decir, la proteína O.s.-OK1 tampoco necesita
almidón-P como sustrato. La secuencia de ácido
nucleico que define la proteína O.s.-OK1 identificada se muestra en
la SEC ID Nº 3 y la secuencia de aminoácidos que codifica la
proteína O.s.-OK1 se muestra en la SEC ID Nº 4. la secuencia de
aminoácidos que codifica la proteína O.s.-OK1 mostrada en la SEC ID
Nº 4 tiene una identidad del 57% con la secuencia de aminoácidos que
codifica la proteína A.t.-OK1 mostrada en la SEC ID Nº 2. la
secuencia de aminoácidos que codifica la proteína O.s.-OK1 mostrada
en la SEC ID Nº 3 tiene una identidad del 61% con la secuencia de
aminoácidos que codifica la proteína A.t.-OK1 mostrada en la SEC ID
Nº 1.
La fabricación del plásmido pMI50 que contiene
la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína OK1 de
Oryza sativa. El vector pMI50 contiene un fragmento de AND,
que codifica la proteína OK1 completa de arroz de la variedad M202.
La amplificación del ADN de arroz se llevó a cabo en cinco
subetapas.
- 1.
- La parte del marco de lectura abierto de la posición 11 a la posición 288 de la secuencia especificada en la SEC ID Nº 3 se amplificó con la ayuda de la transcriptasa inversa y la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos Os_ok1-R9 (GGAACCGATAATGCCTACATGCTC) y Os_ok1-F6 (AAAACTCGAGGAGGATCAATGACGTCGCTGCGGCCCCTC) como cebador en el ARN de las semillas inmaduras de arroz. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pML123.
- 2.
- La parte del marco de lectura abierto de la posición 250 a la posición 949 de la secuencia especificada en la SEC ID Nº 3 se amplificó con la ayuda de la transcriptasa inversa y la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos Os_ok1-F4 (CCAGGTTAAGTTTGGTGAGCA) y Os_ok1-R6 (CAAAGCACGATATCTGACCTGT) como cebador en el ARN de las semillas inmaduras de arroz. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pML120.
- 3.
- La parte del marco de lectura abierto de la posición 839 a la posición 1761 de la secuencia especificada en la SEC ID Nº 3 se amplificó con la ayuda de la transcriptasa inversa y la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos Os_ok1-F7 (TTGTTCGCGGGATATTGTCAGA) y Os_ok1-R7 (GACAAGGGCATCAAGAGTAGTATC) como cebador en el ARN de las semillas inmaduras de arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN amplificado se clonó en el
vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo
K2020-20). El plásmido obtenido se denominó
pML121.
- 4.
- La parte del marco de lectura abierto de la posición 1571 a la posición 3241 de la secuencia especificada en la SEC ID Nº 3 se amplificó con la ayuda de la transcriptasa inversa y la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos Os_ok1-F8 (ATGATGCGCCTGATAATGCT) y Os_ok1-R4 (GGCAAACAGTATGAAGCACGA) como cebador en el ARN de las semillas inmaduras de arroz. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pML119.
- 5.
- La parte del marco de lectura abierto de la posición 2777 a la posición 3621 se amplificó con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos Os_ok1-F3 (CATTTG GATCAATGGAGGATG) y Os_ok1-R2 (CTATGGCTGTGGCCTG CTTTGCA) como cebador en el ADN genómico de arroz. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pML122.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación de todas las subpartes del marco de
lectura abierto de OK1 se llevó a cabo del siguiente modo.
Un fragmento ApaI de una longitud de 700 pares
de bases del pML120, que contiene parte del marco de lectura
abierto de OK1, se clonó en el sitio ApaI del pML121. El
plásmido obtenido se denominó pM147.
Un fragmento de 960 pares de bases de longitud,
que contiene las áreas de los vectores del pML120 y pML123 que
codifica OK1 se amplificó por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa. Al hacerlo, se usaron los cebadores
Os_ok1-F4 (véase lo que antecede) y
Os_ok1-R9 (véase lo que antecede), cada uno en una
concentración de 50 nm, y los cebadores Os_ok1-F6 y
Os_ok1-R6, cada uno en una concentración de 500 nm.
El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1
(Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El
plásmido obtenido se denominó pM144.
Un fragmento de 845 pares de bases de longitud
del pML122 se reamplificó para introducir un sitio Xhol tras el
codón de iniciación con los cebadores Os_ok1-F3
(véase lo que antecede) y Os_ok1-R2Xho
(AAAACTCGAGC
TATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) y se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pMI45.
TATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) y se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido obtenido se denominó pMI45.
Un fragmento de 1671 pares de bases de longitud
que contiene parte del marco de lectura abierto de OK1 se obtuvo
del Pml119 mediante la digestión con las enzimas de restricción
SpeI y PstI. El fragmento se clonó en el plásmido
pBluescript II SK+ (Genbank Acc.: X52328). El plásmido obtenido se
denominó pMI46.
Un fragmento de 1706 pares de bases de longitud
que contiene parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción SpeI y XhoI del
plásmido pMI46 y se clonó en el vector pMI45, que se había
escindido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido
obtenido se denominó pMI476.
Un fragmento de 146 pares de bases de longitud
que contiene parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción AflII/NotI del plásmido
pMI43 y se clonó en el vector pMI44, que se había escindido con las
mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido se denominó
pMI46.
Un fragmento de 1657 pares de bases de longitud
que contiene parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción NotI y NarI del vector
pMI49 y se clonó en el vector pMI47, que se había escindido con las
mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido se denominó
pMI50 y contiene toda la región codificadora de la proteína OK1
identificada en el arroz.
Como antígeno, aproximadamente 100 \mug de
proteína A.t.-OK1 purificada se separó por medio de electroforesis
en gel de SDS, las bandas proteica que contenían la proteína
A.t.-OK1 se escindieron y se enviaron a la empresa EUROGENTEC S.A.
(Bélgica), que llevó a cabo la fabricación del anticuerpo
contratado. Después, los sueros preinmunes de conejos se
investigaron para comprobar si ya detectarían una proteína en un
extracto total de A.t. antes de la inmunización con OK1
recombinante. En los sueros preinmunes de dos conejos no se
detectaron proteínas en el intervalo de 100-150 kDa
y, por tanto, se escogieron para la inmunización. A cada conejo se
administraron 4 inyecciones de 100 \mug de proteína (día 0, 14,
28, 56). De cada conejo se extrajeron 4 muestras de sangre: (día
38, día 66, día 87 y una extracción de sangre final). El suero
obtenido tras la primera extracción ya mostró una reacción
específica con antígeno OK1 en transferencia de tipo Western. No
obstante, en todas las pruebas adicionales se usó la última
extracción de un conejo.
El plásmido pMZ12 se usó como plásmido de
partida para la fabricación de un plásmido, que se usó para la
transformación de plantas de maíz. Este plásmido contiene el origen
ColE1 del plásmido BR322) Bolivar y col, 1977, Gene 2,
95-113) y un marcador de selección bacteriana que
facilita una resistencia contra el antibiótico gentamicina
(Wohlleben y col., 1989 MGG 217, 202-208). Además, este plásmido contiene una secuencia límite derecha e izquierda de T-ADN. Entre estas dos secuencias límite de T-AND, el plásmido contiene un gen bar de Streptomyces hygroscopicus (White y col., 1990, NAR 18, 1062; EMBL Acc.:X17220), que facilita la resistencia contra el herbicida glufosinato. La expresión del gen bar se inicia a través del promotor del gen actin del arroz (McElroy y col., 1990, Plant Cell 2, 163.171).
(Wohlleben y col., 1989 MGG 217, 202-208). Además, este plásmido contiene una secuencia límite derecha e izquierda de T-ADN. Entre estas dos secuencias límite de T-AND, el plásmido contiene un gen bar de Streptomyces hygroscopicus (White y col., 1990, NAR 18, 1062; EMBL Acc.:X17220), que facilita la resistencia contra el herbicida glufosinato. La expresión del gen bar se inicia a través del promotor del gen actin del arroz (McElroy y col., 1990, Plant Cell 2, 163.171).
Para estabilizar la expresión del gen bar, el
primer intrón del gen actin del arroz se inserta entre el
promotor de actin y la secuencia que codifica la proteína
bar (McElroy y col., 1990, Plant Cell 2, 163.171). La señal de
poliadenilación del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium
tumefaciens sigue a la secuencia que codifica la proteína bar
(Depicker y col., 1982 J Mol. Appl. Gent. 1,
561-573).
El promotor de ubiquitina de Zea mays se
insertó en el plásmido pMZ12 entre las secuencias límite derecha e
izquierda del T-ADN (Christensen y col., 1992, Plant
Mol. Bio 18, 675-689), seguido por el primer intrón
del gen de ubiquitina de Zea mays (Christensen y col., 1992,
Plant Mol. Bio 18, 675-689), seguido por la
secuencia codificadora del gen R1 de Solanum tuberosum
(véase la SEC ID Nº 10), seguido por la señal de poliadenilación
del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens
(Depicker y col., 1982, J Mol. Appl. Gent. 1,
561-573). El plásmido obtenido se denominó
pH3-146.
Embriones prematuros de plantas de maíz se
aislaron diez días después de la polinización y se transformaron
con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens que contiene el
plásmido pHN3-146 como cointegrado de acuerdo con
los procedimientos descritos por Ishida y col. (1996, Nature
Biotechnology 14, 745-750). Las denominadas plantas
T0 resultantes de esta transformación se cultivaron en el
invernadero.
Mediante análisis con RT-PCR,
fue posible identificar plantas que tenían una expresión del ARNm
codificador de la proteína S.t.-R1 proteína.
Primero, se fabricó el plásmido pIR96. El
plásmido pIR96 se obtuvo mediante clonación de una pieza sintética
de AND compuesta por los dos oligonucleótidos X1
(TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAG
TAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC) y X2 (AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCG
AGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA) en el vector pGSV71 escindido con SdaI y MunI. El plásmido obtenido se escindió con SdaI y los extremos protuyente en 3' se suavizaron con la T4 ADN polimerasa. El plásmido obtenido se escindió con SdaI, los extremos protuyentes en 3' se suavizaron con la T4 ADN polimerasa y se insertó un fragmento suavizado digerido con HindIII/SphI de (Höfgen y Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230) con un tamaño de 197 pares de bases, que contiene la señal de terminación del gen la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido obtenido se denominó pIR96. El pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7, que deriva del vector intermedio pGSV1. El pGSV1 constituye un derivado de pGSC1700, cuya construcción han descrito Cornelissen y Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). El pGSV1 se obtuvo de pGSC1700 mediante deleción del gen de resistencia a carbenicilina y la deleción de las secuencias de T-ADN de la región TL-ADN del plásmido pTiB6S3.
TAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC) y X2 (AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCG
AGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA) en el vector pGSV71 escindido con SdaI y MunI. El plásmido obtenido se escindió con SdaI y los extremos protuyente en 3' se suavizaron con la T4 ADN polimerasa. El plásmido obtenido se escindió con SdaI, los extremos protuyentes en 3' se suavizaron con la T4 ADN polimerasa y se insertó un fragmento suavizado digerido con HindIII/SphI de (Höfgen y Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230) con un tamaño de 197 pares de bases, que contiene la señal de terminación del gen la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido obtenido se denominó pIR96. El pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7, que deriva del vector intermedio pGSV1. El pGSV1 constituye un derivado de pGSC1700, cuya construcción han descrito Cornelissen y Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). El pGSV1 se obtuvo de pGSC1700 mediante deleción del gen de resistencia a carbenicilina y la deleción de las secuencias de T-ADN de la región TL-ADN del plásmido pTiB6S3.
El pGSV7 contiene el origen de replicación del
plásmido pBR322 (Bolivar y col., Gene 2, (1977),
95-113), así como el origen de replicación del
plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh y col., Plasmid 11, (1984), 206).
El pGSV7 también contiene el gen del marcador seleccionable aadA,
del transposón Tn1331 de Klebsiella pneumoniae, que
proporciona resistencia contra los antibióticos espectinomicina y
estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 244 (3), (1990),
218-226; Tolmasky y Crosa, Plasmid 29 (1), (1993),
31-40).
El plásmido pGSV71 se obtuvo mediante clonación
de un gen bar quimérico entre las regiones límite de pGSV7. El gen
bar quimérico contiene la secuencia promotora del virus del mosaico
de la coliflor para iniciar la transcripción (Odell y col., Nature
313, (1985), 180), el gen bar de Streptomyces hygroscopicus
(Thompson y col., 1987, EMBO J. 6, 2519-2523) y el
área 3'- sin traducir del gen de la nopalina sintasa del
T-ADN de pTiT37 para terminar la transcripción y la
poliadenilación. El gen bar proporciona tolerancia al herbicida
glufosinato amónico.
Un fragmento de 1986 pares de bases de longitud
que contenía el promotor del gen de la poliubiquitina del maíz
((EMBLK Acc.: 94464, Christensen y col., 1992, Plant Mol. Biol.
18:675-689) se clonó como fragmento Pstl en el
plásmido pBluescript II SK+. El plásmido obtenido se denominó
pSK-ubq.
El plásmido A.t.-OK1-pGEM se
escindió con las enzimas de restricción Bsp1201, se suavizó
con la T4-ADN-polimerasa y se
escindió con SacI. El fragmento de ADN que codifica la proteína OK1
de Arabidopsis thaliana se clonó en el plásmido
pSK-ubq, que se escindió con SmaI y
SacI. El plásmido obtenido se denominó
pSK-ubq-ok1. Un fragmento que
contenía el promotor de ubiquitina del maíz y el marco de lectura
abierto completo para la proteína A.t.-OK1 de Arabidopsis
thaliana se aisló del plásmido
pSK-ubq-ok1. Para ello, el plásmido
se escindió con la enzima de restricción Asp78I, los
extremos se llenaron con la T4 ADN polimerasa y se escindió con
Sdal. El fragmento con un tamaño de 5799 pares de bases que se
obtuvo, se clonó en el plásmido pIR96 escindido con EcoRV y
PstI El plásmido obtenido de esta clonación se denominó
pUbi-A.t.-OK1.
Embriones prematuros de plantas de maíz se
aislaron diez días después de la polinización y se transformaron
con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens que contiene el
plásmido pUbi-A.t.-OK1 como cointegrado de acuerdo
con los procedimientos descritos por Ishida y col. (1996, Nature
Biotechnology 14, 745-750). Las denominadas plantas
T0 resultantes de esta transformación se cultivaron en el
invernadero.
Mediante análisis con RT-PCR
cuantitativa, fue posible identificar plantas que tenían una
expresión del ARNm codificador de la proteína A.t.-OK1
proteína.
Para las plantas T1 que tienen una expresión de
la proteína S.t.-R1 o de la proteína A.t.-OK1, se recolectaron
semillas de las plantas individuales y, en cada caso, se
distribuyeron de nuevo aproximadamente 30 semillas por planta y se
cultivaron en el invernadero. Las plantas de esta generación T1
fueron rociadas en la etapa de tres hojas con una solución que
contenía 0,5% de Basta®. Sólo se realizó un seguimiento de los
grupos de plantas de T1 para los que aproximadamente el 25% de las
30 plantas cultivadas en cada caso murió después de la
pulverización con la solución Basta®, ya que estas plantas son
aquéllas para las que la integración del T-ADN
relacionado del plásmido pHN3-146 o
pUbi-A.t.-OK1 está presente en un locus en el
genoma. Se aisló el ADN genómico del material de hoja de
aproximadamente el 75% de las plantas que sobrevivieron a la
pulverización con la solución Basta® y se investigó, en cada caso,
el número de copias presente en el caso por medio de tecnología
Invader® (Pielberg y col. 2003, Genome Res.; 13,
2171-2177).
Las plantas T1 dentro de un grupo de
descendencia de una planta T0 que mostró una señal aproximadamente
el doble de fuerte que el resto de la descendencia de la misma
planta T0 en un análisis mediante tecnología Invader® son
homocigóticas con respecto al locus en el que se ha integrado el
T-ADN del plásmido relacionado. Si aproximadamente
el 30% de la descendencia de una planta T0 que sobrevivió al
Tratamiento con solución Basta® muestra una señal aproximadamente
el doble de fuerte en el análisis por medio de tecnología Invader,
en comparación con aproximadamente el 70% restante de la
descendencia de la misma planta T0, es una indicación adicional de
que la integración del T-ADN está en un único
locus.
Las plantas T1 que tienen una mayor expresión de
una proteína S.t.-R1 y que son homocigóticas con respecto a la
integración del T-ADN del plásmido
pH3-146 de acuerdo con el análisis descrito en g) y
en las que la integración se encuentra en un locus en el genoma de
la planta se cruzan con plantas T1 que tienen una mayor expresión
de una proteína A.t.-OK1 y que son homocigóticas con respecto a la
integración del T-ADN del plásmido
pUbi-A.t.-OK1 y en las que la integración se
encuentra en un locus en el genoma de la planta. La descendencia de
estos cruces tiene tanto una expresión mayor de la proteína S.t.-R1
como una expresión mayor de la proteína A.t.-OK1.
Se aislaron almidones de los granos de las
plantas de maíz resultantes de los cruces descritos en h). El
almidón de los granos que tienen una mayor expresión de la proteína
S.t.-R1 y una mayor expresión de la proteína A.t.-OK1 contiene más
fosfato unido covalentemente al almidón que el almidón aislado de
plantas salvajes no transformadas.
El almidón aislado de granos que tienen una
mayor expresión de la proteína S.t.-R1 y una mayor expresión de la
proteína A.t.-OK1 también contiene más fosfato unido covalentemente
al almidón que el almidón aislado de plantas que sólo tienen una
mayor expresión de la proteína S.t.-R1 o solo una mayor expresión de
la proteína A.t.-OK1.
La fabricación de plantas de trigo que tienen
una mayor expresión de la proteína R1 de la patata se describió en
el documento WO 02 34923. Las plantas descritas en dicho documento
se usaron parcialmente como material de partida para la fabricación
de plantas que tienen una mayor expresión de una proteína OK1 y una
proteína R1.
El pMCS5 (Mobitec, www.mobitec.de) se digirió
con BglII y BamHI y se volvió a ligar. El plásmido
obtenido se denominó pML4.
El terminador nos de Agrobacterium
tumefaciens (Depicker y col., 1982, Journal of Molecular and
Applied Genetics 1: 561-573) se amplificó con los
cebadores P9 (ACTTCTgCAgCggCCgCgATCgTTCAAACATTTggCAA
TAAAgTTTC) y P10 (TCTAAgCTTggCgCCgCTAgCAgATCTgATCTAgTAACATAgATgACACC) (25 ciclos, 30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC, 30 s a 72ºC), se digirió con HindIII y PstI, y se clonó en el plásmido pML4 escindido con la misma enzima. El plásmido obtenido se denominó pML4-nos. Se clonó un fragmento de 1986 pares de bases de longitud que contenía el promotor del gen de la poliubiquitina del maíz (Genbank Acc.:94464, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689) y el primer intrón del mismo gen acortado mediante digestión con ClaI y religado. El plásmido obtenido se denominó pML8. El marco de lectura abierto complete de OK1 de Arabidopsis thaliana se clonó en el plásmido pML8. Para este fin, el fragmento correspondiente se escindió con Bsp120/NotI de A.t.-OK10pGEM y se ligó en la orientación sentido en el sitio NotI.
TAAAgTTTC) y P10 (TCTAAgCTTggCgCCgCTAgCAgATCTgATCTAgTAACATAgATgACACC) (25 ciclos, 30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC, 30 s a 72ºC), se digirió con HindIII y PstI, y se clonó en el plásmido pML4 escindido con la misma enzima. El plásmido obtenido se denominó pML4-nos. Se clonó un fragmento de 1986 pares de bases de longitud que contenía el promotor del gen de la poliubiquitina del maíz (Genbank Acc.:94464, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689) y el primer intrón del mismo gen acortado mediante digestión con ClaI y religado. El plásmido obtenido se denominó pML8. El marco de lectura abierto complete de OK1 de Arabidopsis thaliana se clonó en el plásmido pML8. Para este fin, el fragmento correspondiente se escindió con Bsp120/NotI de A.t.-OK10pGEM y se ligó en la orientación sentido en el sitio NotI.
Con las enzimas de restricción AvrII y
SwaI se puede escindir un fragmento para la transformación de
plantas de trigo del vector obtenido pMLB-A.t.-OK1,
que contiene el promotor del gen de la poliubiquitina del maíz, el
marco de lectura abierto completo de OK1 de Arabidopsis
thaliana y el terminador nos de Agrobacterium
tumefaciens.
Se fabricó un plásmido en el que el fragmento de
ADN, que codificada la proteína R1 completa de la patata, se
encuentra entre dos sitios de detección para la enzima de
restricción de PacI. Para este fin, se amplificó el Sitio
de Clonación Múltiple del plásmido pBluescript II SK+ con la
ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa y los
oligonucleótidos MCS1-1
(TTTTTGCGCGCGTTAATTAACGACTCACTATAGGGCGA) y MCS1-2
(TTTTTGCGCGCT
TAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG), se escindió con la enzima de restricción BssHII y se clonó en el vector desfosforilado pBluescript II SK+ (Invitrogen) escindido con BssHII. El plásmido obtenido se denominó pSK-Pac.
TAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG), se escindió con la enzima de restricción BssHII y se clonó en el vector desfosforilado pBluescript II SK+ (Invitrogen) escindido con BssHII. El plásmido obtenido se denominó pSK-Pac.
En el vector pSK-Pac que se
obtuvo del clon pRL2 (documento WO 9711188) se clonó un fragmento
NotI El fragmento NotI contiene el marco de lectura
abierto completo de la proteína R1 de la patata. El plásmido
obtenido se denominó pIR1.
Un fragmento, que contenía el promotor de
ubiquitina y el primer intrón acortado, y clonado en el sitio
EcoRV del plásmido, se escindió con las enzimas de
restricción EcoRV y SmaI de pSK-ubq
(véase lo que antecede). En el plásmido obtenido, un fragmento
PacI se clonó de pIR1 en orientación sentido con respecto al
promotor, que contiene el marco de lectura abierto completo que
codifica la proteína R1 de la patata. El plásmido obtenido se
denominó pML82.
Plantas de trigo de la variedad Florida se
transformaron por medio de un procedimiento biolístico de acuerdo
con el procedimiento descrito por Becker y col. (1994, Plant Journal
5, 299-307) con un fragmento escindido de un gel de
agarosa, que se escindió con las enzimas de restricción AvrII
y SwaI del plásmido pML8-A.t.-OK1 y que
contenía el promotor del gen de la poliubiquitina del maíz, el marco
de lectura abierto completo de OK1 de Arabidopsis thaliana y
el terminador nos de Agrobacterium tumefaciens junto con el
plásmido pGSV71. Las plantas obtenidas se denominaron
TA-OK1.
Plantas de trigo de la variedad Florida se
transformaron con en plásmido pML82 por medio de un procedimiento
biolístico de acuerdo con el procedimiento descrito por Becker y
col. (1994, Plant Journal 5, 299-307). Las plantas
obtenidas se denominaron TA-R1.
Plantas de trigo de la variedad Florida se
transformaron por medio de un procedimiento biolístico de acuerdo
con el procedimiento descrito por Becker y col. (1994, Plant Journal
5, 299-307) con una mezcla de ADN que contiene el
plásmido pML82 y un fragmento purificado mediante HPLC, que se
escindió del plásmido pML8-A.t.-OK1 con las enzimas
de restricción AvrII y SwaI y que contiene el promotor
del gen de la poliubiquitina del maíz, el marco de lectura abierto
completo de OK1 de Arabidopsis thaliana y el terminador nos
de Agrobacterium tumefaciens. Con la ayuda de
RT-PCR, se identificaron las plantas que tienen una
expresión de la proteína A.t.-Ok1 así como una expresión de la
proteína S.t.-R1. Las plantas obtenidas se denominaron
TA-R1-OK1.
Plantas T1 de las líneas TA-R1 y
TA-OK1 se cultivaron en el invernadero y se rociaron
con Basta® (solución al 0,5%) antes de la floración. Las plantas
que no expresaron el gen de resistencia a Basta® mediada
murieron.
Las plantas que sobrevivieron al tratamiento con
Basta® se cruzaron o con plantas TAR1 que sobrevivieron al
tratamiento con Basta® o con plantas homocigóticas de la línea
40A-11-8 descritas en el documento
WO 02 034923. La descendencia obtenida se denominó
TA-Ok1xTA-R1 o
TA-OK1 x40A-11-8
respectivamente.
Se aisló el almidón y se determinó el contenido
de fosfato unido covalentemente al almidón para los granos
resultantes del cruzamiento de las líneas TA-Ok1 y
TA-R1 o TA-OK1 y
40A-11-8 respectivamente. El
contenido en fosfato del almidón aislado de los granos obtenidos de
los cruces TA-Ok1 y TA-R1 o
TA-OK1 y 40A-11-8
fue significativamente mayor para algunas plantas que para el
almidón aislado de granos de las correspondientes plantas salvajes
o de las plantas de la línea
40A-11-8.
Los granos de las respectivas plantas se
recolectaron para el análisis del almidón de varias líneas
TA-R1-OK1 y se analizó el contenido
en fosfato en C-6 y el contenido en fosfato en
C-3 del almidón aislado. Fue posible identificar
algunas plantas para las que el contenido en fosfato en
C-6 más el contenido en fosfato en
C-3 era claramente mayor en comparación con el
contenido en fosfato en C-6 más el contenido en
fosfato en C-3 del almidón aislado de los granos de
las líneas TA-R1 o
40A-11-8.
El plásmido pIR94 se obtuvo mediante
amplificación del promotor del gen de la globulina del arroz por
medio de una reacción en cadena de la polimerasa (30 x 20 s a 94ºC,
20 s a 62ºC, 1 min a 68ºC, Mg2SO4 4 mM) con los cebadores
glb1-F2 (AAAACAATTGGCGCCTGGAGGGAGGAGA) y
glb1-R1 (AAAACAATTGATGATCAATCA
GACAATCACTAGAA) en el ADN genómico del arroz de la variedad M202 con polimerasa Taq de alta fidelidad (Invitrogen, número de catálogo 11304-011) y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido pIR115 se obtuvo mediante clonación de una pieza sintética de AND compuesta por los dos oligonucleótidos X1 (TG
CAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC) y X2 (AATTG
TAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA) en el vector
pGSV71 escindido con SdaI y MunI.
GACAATCACTAGAA) en el ADN genómico del arroz de la variedad M202 con polimerasa Taq de alta fidelidad (Invitrogen, número de catálogo 11304-011) y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, número de catálogo K2020-20). El plásmido pIR115 se obtuvo mediante clonación de una pieza sintética de AND compuesta por los dos oligonucleótidos X1 (TG
CAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC) y X2 (AATTG
TAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA) en el vector
pGSV71 escindido con SdaI y MunI.
El plásmido pIR115 obtenido se escindió con
SdaI, los extremos protuyentes en 3' se suavizaron con la T4
ADN polimerasa y se insertó un fragmento suavizado digerido con
HindIII/SphI de (Höfgen y Willmitzer, 1990, Plant Science 66,
221-230) con un tamaño de 197 pares de bases,
suavizado por medio de la T4 ADN polimerasa y que contiene la señal
de terminación del gen la octopina sintasa de Agrobacterium
tumefaciens. El plásmido obtenido se denominó Pir96. El
plásmido pIR103 obtenido en el que el fragmento de ADN clonado de
pIR94 con una longitud de 986 pares de bases que contienen el
promotor del gen de la globulina del arroz se clonó en el plásmido
pIR96. El pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7, que deriva del
vector intermedio pGSV1. El pGSV1 constituye un derivado de
pGSC1700, cuya construcción han descrito Cornelissen y Vanderwiele
(Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). El pGSV1
se obtuvo de pGSC1700 mediante deleción del gen de resistencia a
carbenicilina y la deleción de las secuencias de
T-ADN de la región TL-ADN del
plásmido pTiB6S3. El pGSV7 contiene el origen de replicación del
plásmido pBR322 (Bolivar y col., Gene 2, (1977),
95-113), así como el origen de replicación del
plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh y col., Plasmid 11, (1984), 206).
El pGSV7 también contiene el gen del marcador seleccionable aadA,
del transposón Tn1331 de Klebsiella pneumoniae, que
proporciona resistencia contra los antibióticos espectinomicina y
estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990),
218-226; Tolmasky y Crosa, Plasmid 29 (1), (1993),
31-40).
El plásmido pGSV71 se obtuvo mediante clonación
de un gen bar quimérico entre las regiones límite de pGSV7. El gen
bar quimérico contiene la secuencia promotora del virus del mosaico
de la coliflor para iniciar la transcripción (Odell y col., Nature
313, (1985), 180), el gen bar de Streptomyces hygroscopicus
(Thompson y col., 1987, EMBO J. 6, (1987),
2519-2523) y el área 3'-sin traducir
del gen de la nopalina sintasa del T-ADN de pTiT37
para terminar la transcripción y la poliadenilación. El gen bar
proporciona tolerancia al herbicida glufosinato amónico.
Un fragmento de ADN que contiene la secuencia
del marco de lectura abierto completo de la proteína OK1 de
Arabidopsis se escindió del vector
A.t.-OK1-pGEM y se clonó en el vector pIR103. Para
este fin, el plásmido A.t.-OK1-pGEM se escindió con
las enzimas de restricción Bsp1201, con los extremos
suavizados con la T4-ADN-polimerasa
y se escindió con SacI. El fragmento de ADN que codifica la
proteína OK1 de Arabidopsis thaliana se clonó en el vector
pIR103 escindido con Ecl136II y XhoI. El plásmido
obtenido se denominó pGlo-A.t.-OK1.
Plantas de arroz (variedad M202) se
transformaron por medio de Agrobacterium (que contiene el
plásmido pGlo-A.t.-OK1) usando el procedimiento
descrito por Hiei y col. (1994, Plant Journal 6(2),
271-282).
Mediante análisis con RT-PCR
cuantitativa, fue posible identificar plantas que tenían una
expresión del ARNm codificador de la proteína A.t.-OK1 proteína.
Las plantas homocigóticas de la generación T1 se identificaron tal
como se ha descrito en lo que antecede en el ejemplo 11 g) por medio
de plantas de maíz. Las plantas obtenidas se denominaron
OS-OK1.
Plantas de arroz (variedad M202) se
transformaron por medio de Agrobacterium (que contiene el
plásmido pML82) usando el procedimiento descrito por Hiei y col.
(1994, Plant Journal 6(2), 271-282).
Mediante análisis con RT-PCR,
fue posible identificar plantas que tenían una expresión del ARNm
codificador de la proteína S.t.-R1 proteína. Las plantas
homocigóticas de la generación T1 se identificaron tal como se ha
descrito en lo que antecede en el ejemplo 11 g) por medio de plantas
de maíz. Las plantas obtenidas se denominaron
OS-R1.
Las plantas homocigóticas OS-OK1
se cruzaron con plantas OS-R1 homocigóticas. El
plásmido obtenido se denominó
OS-Ok1xOS-R1.
Se aisló el almidón y se determinó el contenido
de fosfato unido covalentemente al almidón para los granos
resultantes de los cruces de
OS-Ok1xOS-R1. El contenido en
fosfato en la posición C-6 y en la posición
C-3 de las moléculas de glucosa del almidón aislado
de los granos obtenidos de los cruces de las líneas
OS-Ok1 y OS-R1 fue claramente mayor
para algunas líneas que para el almidón aislado de granos de las
correspondientes plantas salvajes o de las plantas de la línea
OS-R1.
<110> Bayer CropScience GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Plantas con mayor actividad de
múltiples enzimas fosforiladoras de almidón
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BCS
04-5003-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04090089.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/550,021
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04090284.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-07-21
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04090121.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-29
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(3633)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana,
Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citrus reticulata
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (257)..(4684)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> EMBL/AY094062
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2003-05-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citrus reticulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> EMBL/AF312027
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2001-01-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (105)..(4499)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> EMBL/Y09533
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1998-07-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza Sativa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(4393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> NCBI/AR400814
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2003-12-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1457
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4745
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (103)..(4482)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> NCBI/AR400815
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2003-12-18
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4846
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (158)..(4567)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> NCBI/AR400813
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2003-12-18
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<400> 16
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Célula vegetal genéticamente modificada, que
se caracteriza porque tiene una mayor actividad de al menos
una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
y al menos una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes
que todavía no se han modificado genéticamente, en la que la célula
vegetal contiene una primera molécula de ácido nucleico extraña que
no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal
salvaje que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
y una segunda molécula de ácido nucleico extraña que no se produce
de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que
codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
en el genoma de la célula vegetal.
2. Célula vegetal genéticamente modificada de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido
nucleico extraña que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa
de patata, trigo, maíz, arroz, soja, cítricos o
Arabidopsis.
3. Célula vegetal genéticamente modificada de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, que sintetiza un
almidón modificado en comparación con las correspondientes células
vegetales salvajes que no han sido modificadas genéticamente.
4. Célula vegetal genéticamente modificada de
acuerdo con la reivindicación 3, en la que el almidón modificado se
caracteriza porque tiene una mayor concentración de fosfato
de almidón y/o una distribución del fosfato modificada en
comparación con el almidón aislado de las correspondientes células
vegetales salvajes que no han sido modificadas genéticamente.
5. Célula vegetal genéticamente modificada de
acuerdo con la reivindicación 4, en la que el almidón modificado se
caracteriza porque tiene una proporción modificada entre el
fosfato en C-3 y el fosfato en
C-6.
6. Planta que contiene células vegetales
genéticamente modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones
1 a 5.
7. Planta de acuerdo con la reivindicación 6,
que es una planta que almacena almidón.
8. Planta de acuerdo con la reivindicación 7,
que es una planta de maíz o una planta de trigo.
9. Material de propagación de plantas de acuerdo
con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8, que contienen células
vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5.
10. Partes de plantas cosechables de plantas de
acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8, que contienen
células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 5.
11. Procedimiento para la fabricación de una
planta genéticamente modificada de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6, 7 u 8, en el que
- a)
- una célula vegetal genéticamente modificada, en la que la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula vegetal, en la que la(s) molécula(s) de ácido nucleico extraña(s) contiene(n) una secuencia que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa;
- b)
- una planta se regenera a partir de las células vegetales de la etapa a); y
- c)
- en caso necesario, se producen otras plantas con la ayuda de las plantas de acuerdo con la etapa b).
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la planta genéticamente modificada
sintetiza un almidón modificado en comparación con las
correspondientes plantas salvajes que no han sido modificadas
genéticamente.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el almidón modificado se caracteriza
porque tiene una mayor concentración de fosfato covalentemente
unido al almidón.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 12 ó 13, en el que el almidón modificado se
caracteriza porque tiene una proporción modificada entre el
fosfato en C-3 y el fosfato en
C-6.
15. Procedimiento para la fabricación de un
almidón modificado que incluye la etapa de extraer el almidón de una
célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5.
16. Procedimiento para la fabricación de un
almidón modificado que incluye la etapa de extraer el almidón de
una planta genéticamente modificada de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6, 7 u 8.
17. Uso de plantas de cuerdo con una de las
reivindicaciones 6, 7 u 8 para la fabricación de un almidón
modificado.
18. Procedimiento para la fabricación de harinas
que incluye la etapa de molturación de las partes de plantas de las
plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8 o de
material de reproducción de acuerdo con la reivindicación 9 o
material cosechable de acuerdo con la reivindicación 10.
19. Uso de células vegetales genéticamente
modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o de
plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8 para la
fabricación de harinas.
20. Molécula de ácido nucleico recombinante que
contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
y una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa.
21. Vector que contiene una molécula de ácido
nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20.
22. Vector de acuerdo con la reivindicación 21,
en el que las moléculas de ácido nucleico recombinante están unidas
a secuencias reguladoras que inician la transcripción en células
procariotas o eucariotas.
23. Célula huésped que está genéticamente
modificada en cuanto a que contiene al menos una molécula de ácido
nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20 o un
vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 ó 22 además de
su genoma natural, en el que la célula huésped es una bacteria, una
célula fúngica o una célula vegetal.
24. Composición que contiene una molécula de
ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20 o
un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 ó 22.
25. Composición que contiene una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína
[P-glucan]-hidro-discinasa
y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
[alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa.
26. Uso de una composición de acuerdo con una de
las reivindicaciones 24 ó 25 para la transformación de células
vegetales.
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