ES2340183T3

ES2340183T3 - Plantas con mayor actividad plastidica del enzima r3 fosforilante de almidon.

Info

Publication number: ES2340183T3
Application number: ES05772662T
Authority: ES
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2010-05-31
Anticipated expiration: 2025-08-18
Also published as: DK1786908T3; WO2006018319A1; SI1786908T1; EP1786908A1; EP1786908B1; PT1786908E; ATE459720T1; PL1786908T3; AR050299A1

Abstract

Una célula de planta modificada genéticamente en la que los plástidos presentes en dicha célula de planta comprenden una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, consistiendo la modificación genética en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula de planta, seleccionándose la molécula de ácido nucleico extraña del grupo constituido por a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3, b) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645; c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3; d) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645; e) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en las Nº ID SEC 1 o Nº ID SEQ 2 o una secuencia complementaria; f) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido DSM 16587 o en el plásmido DSM 16645; g) moléculas de ácido nucleico que tienen al menos el 60% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b) e) o f); h) moléculas de ácido nucleico que se hibridan, en condiciones rigurosas con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f); i) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos, como consecuencia de la degeneración del código genético, deriva de la secuencia de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), e) o f); y j) moléculas de ácido nucleico que constituyen fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i) y en la que la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes donde la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con las secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación tiene una secuencia de señal plastídica.

Description

Plantas con mayor actividad plastídica del enzima R3 fosforilante de almidón.

La presente invención se refiere a células de plantas y plantas que están modificadas genéticamente, conduciendo la modificación genética al aumento de la actividad de una proteína R3 fosforilante del almidón en comparación con células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente. Además la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para la generación de tales células de planta y plantas. Tales células de plantas y plantas sintetizan un almidón modificado. También se describe el almidón sintetizado por las células de plantas y plantas de acuerdo con la invención, procedimientos para la producción de este almidón y la producción de derivados de almidón de este almidón modificado, y harinas que comprenden este almidón.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas R3 fosforilantes de almidón y a vectores, células huésped, células de planta y plantas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Además la presente invención se refiere a proteínas R3 que presentan una actividad fosforilante del almidón.

A la vista de la creciente importancia que se relaciona en la actualidad con constituyentes de plantas como materiales de partida renovables, una de las tareas de la investigación biotecnológica es intentar una adaptación de aquellos materiales de partida vegetales a los requerimientos de la industria del procesamiento. Con el fin de hacer posible el uso de materiales de partida renovables en tantos campos de aplicación como sea posible, es adicionalmente necesario llegar a sustancias muy diversas.

El polisacárido almidón está constituido por unidades químicamente uniformes, las moléculas de glucosa, pero constituye una mezcla compleja de diferentes formas de moléculas que difieren en lo que respecta a su grado de polimerización y ramificación y por tanto difieren enormemente en lo relativo a sus propiedades físico-químicas. Se distingue entre almidón de amilosa, un polímero esencialmente no ramificado de unidades de glucosa unidas 1,4-glicosídicamente, y almidón de amilopectina, un polímero ramificado donde los puntos ramificados se generan con la existencia de uniones alfa-1,6-glicosídicas adicionales. Una diferencia esencial más entre amilosa y amilopectina es el peso molecular. Mientras que la amilosa, en función del origen del almidón, presenta un peso molecular de 5 x 10^{5} - 10^{6} Da, el peso molecular de amilopectina se encuentra entre 10^{7} y 10^{8} Da. Las dos macromoléculas se pueden distinguir en base a su peso molecular y sus propiedades físico-químicas diferentes, y el modo más simple de visualizar esto se basa en sus diferentes propiedades de unión a yodo.

A la amilosa se ha referido desde hace tiempo como un polímero lineal constituido por monómeros de alfa-D-glucosa unidos alfa 1,4-glicosídicamente. Estudios más recientes, sin embargo, han revelado la presencia de puntos unidos alfa-1,6-glicísicos (aprox. 0,1%) (Hinzukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-10; Takeda y col., Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92).

Las propiedades funcionales de almidones, tales como, por ejemplo, solubilidad, comportamiento de retrogradación, la capacidad de unión a agua, las propiedades de formación de película, viscosidad, las propiedades de gelatinización, estabilidad frente a congelación-descongelación, la resistencia en gel, el tamaño de gránulo de almidón se ven, entre otros, influenciadas por la relación de amilosa/amilopectina, el peso molecular, el modelo de distribución de cadenas laterales, el contenido iónico, el contenido en lípidos y proteínas, el tamaño de gránulo de almidón medio, la morfología del gránulo de almidón y similares. Las propiedades funcionales de almidón se ven influenciadas también de forma particular por el contenido en fosfato, un componente no carbohidrato del almidón. Aquí se distingue entre fosfato que está unido covalentemente a moléculas de glucosa del almidón en la forma de monoésteres (en lo sucesivo designados como fosfato de almidón) y fosfato en la forma de fosfolípidos asociados con
almidón.

El contenido en fosfato de almidón varía como una función de la variedad de planta. Así pues, por ejemplo, ciertos mutantes de maíz sintetizan un almidón con un mayor contenido de fosfato de almidón (maíz ceroso 0,002% y maíz de alto contenido en amilosa (0,013%), mientras que las variedades de maíz tradicional sólo contienen trazas de fosfato de almidón. Igualmente se han detectado pequeñas cantidades de fosfato de almidón en trigo (0,001%), mientras que no se ha detectado fosfato de almidón en avena y sorgo. Igualmente se ha encontrado menos fosfato de almidón en mutantes de arroz (arroz ceroso 0,003%) que en variedades de arroz tradicionales (0,013%). Se han detectado cantidades significativas de fosfato de almidón en plantas que sintetizan almidón almacenado en tubérculos o raíces, tales como, por ejemplo, tapioca (0,008%), boniato (0,011%), arruruz (0,021%) o patata (0,089%). Los porcentajes citados anteriormente para el contenido en fosfato de almidón se basan en todos los casos en el peso seco del almidón y se han determinado por parte de Jane y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).

El fosfato de almidón puede estar presente en la forma de monoésteres en la posición C-2, C-3 o C-6 de los monómeros de glucosa polimerizados (Takeda y Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23, 267-272). Por lo general se distingue la distribución de fosfato del fosfato en almidón sintetizado en la planta por el hecho de que aproximadamente el 30% a 40% de los residuos de fosfato están unidos covalentemente a la posición C-3 y aproximadamente de 60% a 70% de los residuos de fosfato están unidos covalentemente a la posición C-6 de las moléculas de glucosa (Blennow y col., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow y col. (2000, Carbohidrate Polymers 41, 163-174) determinan un contenido en fosfato de almidón que está unido a la posición C-6 de las moléculas de glucosa para diferentes almidones tales como, por ejemplo, almidón de patata (entre 7,8 y 33,5 mmol por mg de almidón, en función de la variedad), almidón de diferentes especies de Curcuma (entre 1,8 y 63 nmol por mg), almidón de tapioca (2,5 nmol por mg de almidón), almidón de arroz (1,0 nmol por mg de almidón), almidón de frijol de mungo (3,5 nmol por mg de almidón) y almidón de sorgo (0,9 nmol por mg de almidón). No se detectó fosfato de almidón unido a la posición C-6 por parte de estos autores en almidón de cebada y en almidón de diferentes mutantes cerosos de maíz. Hasta la fecha no se ha establecido relación entre el genotipo de una planta y el contenido en fosfato del almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). En la actualidad no es posible influir en el contenido de fosfato del almidón en plantas por procedimientos reproductivos de planta.

Hasta la fecha sólo se ha descrito una proteína que media la introducción de enlaces covalentes de residuos de fosfato en las moléculas de glucosa de almidón. Esta proteína tiene la actividad enzimática de un alfa-glucano, diquinasa de agua (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171), se designa frecuentemente como R1 en la bibliografía científica y está unida a los gránulos de glucosa del almidón de almacenamiento en tubérculos de patata (Lorberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). Debido a que el almidón de almacenamiento se sintetiza en plástidos (amiloplastos) y la proteína R1 está unida a estos gránulos de almidón, pero se codifica con ácido nucleicos localizados en el núcleo, la secuencia de aminoácidos se proporciona con un péptido señal plastídico (transitorio) (Lorberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). En la reacción catalizada por R1 los materiales de partida alfa-1,4-glucano (almidón), adenosintrifosfato (ATP) y agua se transforman en los productos glucanfosfato (fosfato de almidón), monofosfato y adenosinmonofosfato. En este proceso el residuo de gamma-fosfato del ATP se transfiere a agua y el residuo beta-fosfato del ATP al glucano (almidón). El residuo de beta-fosfato se transfiere in vitro por R1 de ATP a las posiciones C-6 y C-3 de las moléculas de glucosa de alfa-1,4-glucanos. La relación de fosfato en C-6 con fosfato en C-3 que se obtiene en la reacción in vitro corresponde a la relación encontrada en almidón aislado de plantas (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171). Debido a que en el almidón de patata se encuentra aproximadamente el 70% del fosfato de almidón en la posición C-6 y aproximadamente el 30% en la posición C-3 de los monómeros de glucosa del almidón esto significa que R1 fosforila preferentemente la posición C-6 de las moléculas de glucosa. Además se ha demostrado para R1, entre otros usando amilopectina de maíz, que es capaz de fosforilar alfa-1,4-glucanos, el cual no comprende fosfato unido covalentemente alguno (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171), es decir, R1 es capaz de introducir fosfato de novo en alfa-1,4-glucanos.

Se han descrito secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos correspondientes que codifican una proteína R1 en diferentes especies tales como, por ejemplo, patata (WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533), trigo (WO 0077229, US 6.462.256, GenBank Acc.: AAN93923, GenBank Acc.: AR236165), arroz (GenBank Acc.: AAR61445, GenBank Acc.: AR400814), maíz (GenBank Acc.: AAR61444, GenBank Acc.: AR400813), soja (GenBank Acc.: AAR61446, GenBank Acc.: AR400815), cítricos (GenBank Acc.: AY094062) y Arabidopsis (GenBank Acc.: AF312027).

Se describen en el documento WO 0234923 plantas de trigo con una mayor actividad de una proteína R1 como consecuencia de la sobreexpresión de un gen R1 de patata. En comparación con las plantas de tipo salvaje correspondientes en las que no se detectó fosfato de almidón, estas plantas sintetizan un almidón con cantidades significativas de fosfato de almidón en la posición C-6 de las moléculas de glucosa.

No se han descrito hasta la fecha proteínas adicionales que catalizan una reacción que introduce grupos fosfato unidos covalentemente en el almidón, ni se conocen enzimas que introduzcan preferiblemente grupos fosfato en la posición C-3 y/o posición C-2 de las moléculas de glucosa del almidón. Esto es porque a parte del aumento del contenido de fosfato de almidón en plantas no se encuentran disponibles medios de influir de una forma específica en la fosforilación del almidón en plantas, de modificar la distribución de fosfato dentro del almidón sintetizado por las plantas y/o de aumentar adicionalmente el contenido en fosfato del almidón.

La presente invención se basa por tanto en el objeto de proporcionar más posibilidades de generar almidones modificados con un mayor contenido en fosfato, y proporcionar células de plantas y/o plantas que sintetizan tal almidón modificado, y procedimientos y medios para generar dichas plantas y/o células de planta.

Este objeto se consigue con el uso de formas designadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la presente invención describe células de plantas modificadas genéticamente y plantas modificadas genéticamente, en las que los plástidos presentes en dicha célula de plata o dichas plantas comprenden una proteína R3.

La presente invención también escribe células de planta y plantas modificadas genéticamente, en las que plástidos presentes en dicha célula de planta o dichas plantas muestran una mayor actividad de al menos una proteína R3 en comparación con plásticos presentes en células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente.

Un primer aspecto de la presente invención describe una célula de planta o planta, que está modificada genéticamente, donde la modificación genética conduce a la presencia de una proteína R3 o a un aumento en la actividad de al menos una proteína R3 en plástidos que están presentes en estas células de planta o plantas en comparación con plástidos presentes en células de plantas de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje no modificadas genética-
mente.

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La invención se refiere a una célula de planta modificada genéticamente en la que los plástidos presentes en dicha célula de planta comprenden una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, en la que la modificación genética consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula de la planta, donde la molécula de ácido nucleico extraño se selecciona del grupo constituido por

a): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3,

b): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645;

c): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3;

d): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645;

e): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en las Nº ID SEC 1 o Nº ID SEQ 2 o una secuencia complementaria;

f): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido DSM 16587 o en el plásmido DSM 16645;

g): moléculas de ácido nucleico que tienen al menos el 60% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b) e) o f);

h): moléculas de ácido nucleico que se hibridan, en condiciones rigurosas con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f);

i): moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos, como consecuencia de la degeneración del código genético, deriva de la secuencia de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), e) o f); y

j): moléculas de ácido nucleico que constituyen fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i)

y en la que la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes donde la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con las secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación tiene una secuencia de señal plastídica.

En el contexto de la presente invención el término "célula de planta de tipo salvaje" significa células de planta que se usaron como material de partida para la generación de las células de planta de acuerdo con la invención, es decir, cuya información genética, a parte de la modificación genética que se ha introducido, corresponde con la de una célula de planta de acuerdo con la invención.

En el contexto de la presente invención el término "planta de tipo salvaje" significa plantas que se usaron como material de partida para la generación de plantas de acuerdo con la invención, es decir, cuya información genética, a parte de la modificación genética que se ha introducido, corresponde con la de una planta de acuerdo con la invención.

En el contexto de la presente invención el término "correspondiente" significa que tras comparación de una pluralidad de objetos, los objetos en cuestión que se comparan entre sí se mantuvieron en condiciones idénticas. En el contexto de la presente invención el término "correspondiente" en el contexto de célula de planta de tipo salvaje o planta de tipo salvaje significa que las células de planta o plantas que se comparan entre sí se cultivaron en condiciones de cultivo idénticas y tienen una edad idéntica (cultivo).

En el contexto de la presente invención, el término "plástido" se entiende que significa orgánulos celulares que se encuentran en células de plantas únicamente y que están rodeados por una bicapa y tienen su propio sistema genético (plastoma, aparato de transcripción y aparato de traducción). Los plástidos que son preferidos en el contexto de la presente invención son cromoplastos y leucoplastos, con especial preferencia cloroplastos y de forma particularmente preferida amiloplastos.

En relación con la presente invención, el término "mayor actividad de al menos una proteína R3" significa un aumento en la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R3 y/o un aumento en la cantidad de proteína R3 en las células y/o un aumento en la actividad enzimática de proteínas R3 en las células.

El aumento en la expresión se puede determinar, por ejemplo, midiendo la cantidad de transcriptos que codifican la proteína R3, por ejemplo, con análisis Northern blot o con RT-PCR. Un aumento en este caso significa preferiblemente un aumento en la cantidad de transcriptos en comparación con células no modificadas genéticamente correspondientes en al menos 50%, de forma particular en al menos 70%, preferiblemente en al menos 85% y con especial preferencia en al menos 100%. Un aumento en la cantidad de transcriptos que codifican la proteína R3 también significa que las plantas o células de planta que les falta cantidades detectables de transcriptos que codifican la proteína R3 comprenden, tras
modificación genética de acuerdo con la invención, cantidades detectables de transcriptos que codifican la región R3.

El aumento en la cantidad de proteína R3 que provoca la mayor actividad de estas proteínas en las células de planta en cuestión se puede determinar, por ejemplo, mediante procedimientos inmunológicos tales como análisis por Western blot, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas) o RIA (radioinmunoensayo). Un aumento en este caso significa preferiblemente un aumento en la cantidad de proteína R3 en comparación con células no modificadas genéticamente correspondientes en al menos 50%, de forma particular en al menos 70%, preferiblemente en al menos 85% y con especial preferencia en al menos 100%. Un aumento en la cantidad de proteína R3 también significa que plantas o células de planta que les falta cantidad detectable de proteína R3 comprenden, tras modificación genética de acuerdo con la invención, una cantidad detectable de una proteína R3.

Son conocidos por los especialistas en la técnica procedimientos para aumentar anticuerpos que reaccionan específicamente con una cierta proteína, es decir, que se unen específicamente a dicha proteína (véase, por ejemplo, Lottspeich y Zorbas (Eds.), 1998 Bioanalytik, editorial Spektrum Akad, Heidelberg, Berlín, ISBN 3-8274-0041-4). Tales anticuerpos son comercializados por algunas compañías (por ejemplo, Eurogentec, Bélgica).

La localización de una proteína R3 en plástidos de plantas genéticamente modificadas se puede detectar por medios de fraccionamiento subcelular de células planta, con lo que se pueden obtener plástidos intactos. Se conocen procedimientos de fraccionamiento de compartimentos subcelulares por parte de los especialistas en la técnica y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, Heldt, 1996, "Pflanzenbiochemie", editorial Spektrum Akad., ISBN 3-8274-0103-8; Plant Biochemistry, 1997, editorial Dey and Harborne, Academic Press, ISBN 0-12-215674-3). El material de partida que se puede usar para el aislamiento de plástidos es cualquier parte de plantas (por ejemplo, hojas) o protoplastos. Si se usan partes de plantas como material de partida se rompen las células cortando primero las partes de plantas en pequeñas secciones y subsiguientemente molerlas en un mezclador. El homogenato celular resultante se somete subsiguientemente a centrifugación.

Un procedimiento adicional para la preparación de un homogenato celular que comprende plástidos intactos es preparar en primer lugar protoplastos que se rompen subsiguientemente. La ruptura tiene lugar mediante la suspensión de protoplastos que se hace pasar a través de una malla cuyo tamaño de malla es inferior al tamaño de los protoplastos. El homogenato celular obtenido se somete subsiguientemente a centrifugación. El procedimiento recién citado es particularmente adecuado para la preparación de homogenatos celulares de plantas de cereales, tales homogenatos comprenden plástidos intactos.

El homogenato celular se puede purificar adicionalmente con uso de centrifugación diferencial o centrifugación por densidad.

En el caso de centrifugación diferencial los homogenatos celulares se centrifugan en un medio cuya densidad es inferior a la de los orgánulos celulares. La velocidad de sedimentación de los orgánulos individuales depende principalmente del tamaño de partícula. Los orgánulos individuales se separan llevando a cabo una pluralidad de centrifugaciones una tras otras, con velocidad creciente. Después de haberse llevado a cabo cada centrifugación los orgánulos en cuestión se encuentran como sedimento.

En el caso de centrifugación de equilibrio los orgánulos se separan de acuerdo con la densidad en un medio de centrifugación constituido por distintos medios de varias densidades que se disponen en capas una sobre otra. La densidad del medio individual se reduce desde abajo hacia arriba. La centrifugación se lleva a cabo hasta que todas las partículas del homogenato celular han alcanzado la zona correspondiente a su densidad.

El aislamiento de amiloplastos intactos se describe, entre otros, para patata (Wischmann y col., 1999, Plant Physiology 119, 455-462), maíz (Echeveria y col., 1988, Plant Physiology 86, 786-792) y trigo (Tetlow y col., 1993, Planta 189, 597-600), guisante (Smith y col., 1990, Planta 180, 517-523).

Para determinar la pureza de una preparación de orgánulo se pueden medir ciertos enzimas líder que son específicos de los orgánulos en cuestión en fracciones de orgánulos individuales. Se conocen enzimas líder para ciertos orgánulos o compartimentos subcelulares por los especialistas en la técnica y se citan, entre otros, en Strasburger, 1999, "Lehrbuch der Botanik" [libro de texto de botánica], 34ª edición, ed. Spectrum Akad., ISBN 3-8274-0779-6.

La fracción de los compartimentos subcelulares que comprende plástidos se puede analizar para la presencia o para una mayor actividad de una proteína R3. Esto se puede realizar, por ejemplo, con procedimientos inmunológicos o detectando la actividad en la fracción de plástido.

Para los fines de la presente invención, el término "proteína R3" se entiende que significa una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón.

Secuencias de aminoácidos que codifican proteínas R3 comprenden un dominio de fosfohistidina. Los dominios de fosfohistidina se describen, por ejemplo, en Tien-Shin Yu y col. (2001, Plant Cell 13, 1907-1918). El dominio de fosfohistidina de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana se muestra en Nº ID SEC 4.

En comparación con una proteína R1, las proteínas R3 no tienen péptido de señal plastídico en las secuencias de aminoácidos que las codifican (de forma natural), es decir, proteínas R3 que son codificadas por ácidos nucleicos endógenos de la planta (ácidos nucleicos que existen de forma natural en el genoma de la planta) se localizan fuera de los plástidos.

La catálisis por una proteína R3 de una reacción de fosforilación de un P-almidón da lugar a una proteína R3 fosforilada como intermedio, en la que un residuo de fosfato del ATP se une de forma covalente a un aminoácido de la proteína R3. El intermedio se forma con la autofosforilación de la proteína R3, es decir, la proteína R3 catalizada por sí misma la reacción que conduce al intermedio. La autofosforilación fosforila preferentemente un residuo de histidina de la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína R3, con especial preferencia un residuo de histidina que es parte de un dominio de fosfohistidina (Tien-Shin Yu y col. 2001, Plant Cell 13, 1907-1918).

Debido a que, a parte de R1, no se han descrito enzimas que fosforilan almidón hasta la fecha, no ha sido posible hasta ahora aumentar el contenido en fosfato de almidón en plantas con la ayuda de otros enzimas. Esto es ahora posible usando una proteína de acuerdo con la invención o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención para la modificación genética de plantas. Procurando que una proteína R3 conduzca a la posibilidad de modificación genética de plantas de modo tal que sinteticen un almidón con propiedades modificadas.

En el contexto de la presente invención el término "fosfato de almidón" se entiende que significa grupos fosfato que están unidos de forma covalente a las moléculas de glucosa del almidón.

La actividad de una proteína R3 se puede identificar, por ejemplo, incubando una proteína R3 in vitro usando nucleósido trifosfatos que comprenden un residuo de fosfato marcado (nucleósido trifosfato marcado). Se usan preferiblemente nucleósido trifosfatos radiomarcados para este fin.

Se pueden identificar residuos de fosfato marcados que se han incorporado en almidón con una proteína R3, por ejemplo, separando el almidón marcado (por ejemplo, mediante centrifugación, precipitación con etanol, filtración, procedimientos cromatográficos y similares) del resto de la mezcla de reacción y subsiguientemente detectar los residuos de fosfato marcados en la fracción de almidón. En este contexto los residuos de fosfato marcados que se unen a la fracción de almidón se pueden identificar, por ejemplo, determinando la cantidad de radioactividad presente en la fracción de almidón (por ejemplo, mediante conteo de centelleos). Los procedimientos de detección posibles de una proteína que requiere almidón como sustrato para una reacción de fosforilación se describen más adelante en la sección de Procedimientos Generales, punto 3.

Las posiciones de los átomos de carbono (C-2, C-3 o C-6) de los monómeros de glucosa en almidón que se fosforilan preferentemente con una proteína R3 se pueden determinar, por ejemplo, analizando los P-almidones que se han fosforilado con una proteína como la descrita en Ritte y col. (2002, PNAS 99, 7166-7171). En este extremo el almidón que se ha fosforilado con una proteína se hidroliza usando ácido y subsiguientemente se analiza por medio de cromatografía de intercambio de iones.

El almidón que se fosforila con una proteína R3 se analiza preferiblemente por medio de RMN ^{31}P o ^{33}P para determinar las posiciones de los átomos de carbono (C-2, C-3 ó C-6) de los monómeros de glucosa en el P-almidón que se fosforilan. Se describe más adelante en la sección Procedimientos Generales, punto 4, un procedimiento especialmente preferido para identificar las posiciones de los átomos de C de una molécula de glucosa de un almidón que se fosforilan con una reacción catalizada por proteína R3.

La secuencia de aminoácidos mostrada en Nº ID SEC 3 codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana, estando la secuencia de aminoácidos mostrada en Nº ID SEC 3 en fusión (transnacional) con un péptido señal plastídico, dando lugar a una secuencia de aminoácidos recombinante que codifica una proteína R3 que, además de su secuencia de aminoácidos de codificación presenta un péptido señal plastídico.

En una realización adicional de la presente invención secuencias de aminoácidos que codifican proteínas R3 tienen al menos 60%, de forma particular al menos 70%, preferiblemente al menos 80% y con especial preferencia al menos 90% y de forma particular preferiblemente al menos 95% de identidad con la secuencia mostrada en la Nº ID
SEC 3.

En una realización adicional de la presente invención, la proteína R3 presenta un dominio de fosfohistidina (Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918). Secuencias de aminoácidos que codifican proteínas R3 que comprende un dominio de fosfohistidina presentan al menos 85%, de forma particular al menos 88%, preferiblemente al menos 91% y con especial preferencia al menos 94% y de forma particularmente preferida al menos 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos del dominio de fosfohistidina de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana mostrada en Nº ID SEC 4.

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La presente invención describe una célula de planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención o una planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención donde la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraño en el genoma de la planta.

En este contexto el término "modificación genética" significa la introducción de moléculas de ácido nucleico extraño homólogo y/o heterólogo en el genoma de una célula de planta o en el genoma de una planta, conduciendo dicha introducción de estas moléculas a un aumento en la actividad de una proteína R3. Debido a la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña las células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención se modifican en lo relativo a su información genética. La presencia o la expresión de la molécula de ácido nucleico extraño conduce a un cambio del fenotipo. Cambio "fenotípico" significa preferiblemente un cambio medible en una o más funciones celulares. Por ejemplo, las células de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención muestran un aumento en la actividad de una proteína R3 como consecuencia de la presencia, o tras expresión, de la molécula de ácido nucleico que se ha introducido.

En el contexto de la presente invención el término "molécula de ácido nucleico extraño" significa una molécula que no se origina de forma natural en células de planta de tipo salvaje correspondientes o que no se origina de forma natural en células de planta de tipo salvaje en disposición espacial específica o que se localiza en un lugar del genoma de la célula de planta de tipo salvaje en el que no se origina de forma natural. Preferiblemente la molécula de ácido nucleico extraño es una molécula recombinante que consiste en diferentes elementos cuya combinación o disposición espacial específica no se presenta de forma natural en células de plantas.

En el contexto de la presente invención el término "genoma" se entiende que significa la totalidad del material hereditario presente en una célula de planta. El especialista en la técnica sabe que sólo el núcleo, pero otros compartimentos también (por ejemplo, plástidos, mitocondria) comprenden material hereditario.

En una realización adicional las células de planta de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención comprenden la molécula de ácido nucleico extraño que codifica una proteína R3, preferiblemente una proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico extraño codifica una proteína R3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3.

Se encuentran disponibles una pluralidad de técnicas para la introducción de ADN en una célula huésped de planta. Estas técnicas comprenden la transformación de células de plantas con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformación, la fusión de protoplastos, inyección, electroporación de ADN, la introducción del ADN por medio del enfoque biolístico y otras posibilidades.

El uso de transformación mediada por agrobacterias de células de plantas se ha estudiado de forma intensiva y se ha descrito suficientemente en el documento EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley y col., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 y en An y col. EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para la transformación de patata, véase, por ejemplo, Rocha-Sosa y col., EMBO J, 8, (1989), 29-33).

Se ha descrito también la transformación de plantas monocotiledóneas por medio de vectores basados en transformación con Agrobacterium (Chan y col., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei y col., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng y col., Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink y col., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May y col., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner y Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie y col., Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). An alternative system for the transformation of monocotyledonous plants is the transformation by means of the biolistic approach (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil y col., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala y col., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer y col., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), the transformation of protoplasts, the electroporation of partially permeabilized cells; the introduction of DNA by means of glass fibers. La transformación de maíz, de forma particular, se describe repetidamente en la bibliografía (cf., por ejemplo, documentos WO95/0612 EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm y col., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm y col., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel y col., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc y col., Theor. Appl. Genet 80, (1990), 721-726).

Se ha descrito también la transformación con éxito de otras especies de cereales, por ejemplo, centeno (Wan y Lemaux, véase anteriormente; Ritala y col., véase anteriormente; Krens y col., Nature 296, (1982), 72-74) y para trigo (Nehra y col., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker y col., 1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos los procedimientos anteriores son adecuados para los fines de la presente invención.

Se pueden distinguir células de plantas y plantas que están modificadas genéticamente con la introducción de una proteína R3 en células de plantas de tipo salvaje, o plantas de tipo salvaje, entre otros por el hecho de que comprenden una molécula de ácido nucleico extraño que no se origina de forma natural en células de planta de tipo salvaje, o plantas de tipo salvaje, o por el hecho de que una molécula de este tipo se integre en un lugar del genoma de la célula de planta de acuerdo con la invención o en el genoma de la planta de acuerdo con la invención en el que no sucede en células de planta de tipo salvaje, o plantas de tipo salvaje, es decir, en un ambiente genómico diferente. Además tales células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención se pueden distinguir de células de planta de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje, respectivamente, por el hecho de que comprenden integrado de forma estable en su genoma al menos una copia de la molécula de ácido nucleico extraño, en su caso además de las copias de una molécula de este tipo que se originan de forma natural en las células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje. Si la(las) molécula(s) de ácido nucleico extraño introducidas en las células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención adquiere(n) la forma de copias adicionales a moléculas que se originan de forma natural en las células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje, las células de planta de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención se pueden distinguir de células de planta de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje respectivamente, por el hecho de que esta copia adicional o estas copias adicionales se localiza(n) en lugares en el genoma en los que no está(n) presente(s) en células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje. Esto se puede verificar, por ejemplo, con la ayuda de un análisis Southern blot.

Además las células de planta de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención se pueden distinguir de células de plantas de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje, respectivamente, preferiblemente mediante al menos uno de los siguientes ensayos: si la molécula de ácido nucleico extraño introducida es heteróloga respecto a la célula de planta o planta; las células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención comprenden transcriptos de las moléculas de ácido nucleico introducidas. Esto se puede verificar, por ejemplo, mediante análisis Northern blot o por RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa). Se pueden detectar células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención que expresan un transcripto antisentido y/o ARNi, por ejemplo, con la ayuda de sondas de ácido nucleico específicos que son complementarias a la codificación de ARN de la proteína (y que se origina de forma natural en la célula de la planta). Preferiblemente las células de plantas de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención comprenden una proteína que es codificada por una molécula de ácido nucleico que se ha introducido. Esto se puede detectar, por ejemplo, con procedimientos inmunológicos, de forma particular con un análisis Western blot.

Si la molécula de ácido nucleico extraño que se ha introducido es homóloga respecto a la célula de planta o planta, las células de planta de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención se pueden distinguir de células de planta de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje, respectivamente, por ejemplo en base a la expresión adicional de las moléculas de ácido nucleico extrañas que se han introducido. Las células de planta de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención comprenden preferiblemente transcriptos de las moléculas de ácido nucleico extraño. Esto se puede detectar, por ejemplo, por análisis Northern blot o con la ayuda de lo que se conoce como PCR cuantitativa.

En una realización adicional, las células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención tienen la forma de células de planta transgénica y plantas transgénicas, respectivamente.

En una realización adicional, la presente invención describe células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención donde la molécula de ácido nucleico extraño se selecciona del grupo constituido por:

b): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido pIR138-210 o por la inserción en plásmido pIR139-210;

d): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos que es codificada por la región de codificación de al inserción en plásmido pIR138-210 o por la inserción en plásmido pIR139-210;

f): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido pIR138-210 o en el plásmido pIR139-210;

La secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3 codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con al invención comparten ciertas características. Estas pueden incluir, por ejemplo, actividad biológica, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación y similares, y propiedades físicas tales como, por ejemplo, el comportamiento de migración en electroforesis en gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima y similares.

El peso molecular de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana deducido de la secuencia de aminoácidos mostrada en Nº ID SEC 2 es aproximadamente 131 kDa. El peso molecular de una proteína de acuerdo con la invención deducido de la secuencia de aminoácidos de codificación se encuentra por tanto preferiblemente en el intervalo de 120 kDa a 145 kDa, preferiblemente de 120 kDa a 140 kDa, con especial preferencia de 125 kDa a 140 kDa, de forma particular preferiblemente de 130 kDa a 135 kDa. La secuencia de aminoácidos mostrada en Nº ID SEC 3 que codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana comprende un dominio de fosfohistidina. Una proteína R3 de acuerdo con la invención comprende por tanto preferiblemente un dominio de fosfohistidina que tiene al menos 85%, preferiblemente al menos 88%, con especial preferencia al menos 91% y de forma particular preferiblemente al menos 95% de identidad con el dominio de fosfohistidina mostrado en la Nº ID SEC 4.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la actividad enzimática de acuerdo con la presente invención de una proteína R3, donde la proteína R3 codificada tiene al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos 90% y de forma particular preferiblemente al menos 95% de identidad con las secuencias de aminoácidos mostradas en la Nº ID SEC 3.

Se ha depositado una cepa de Escherichia coli que comprende el plásmido pIR138-210 que comprende ADNc que codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana que se encuentra en fusión translacional con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania, en concordancia con las estipulaciones del Tratado de Budapest de 21 de Julio de 2004, con el nombre DSM 16587. La secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3 se puede derivar de la región de codificación de la secuencia de ADNc integrada en el plásmido pIR138-210 y codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana que tiene un péptido señal plastídico. La presente invención se refiere también por tanto a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la actividad enzimática de una proteína R3 que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción en plásmido pIR138-210, la proteína codificada que presenta al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos 90% y de forma particular preferiblemente 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se puede reducir de la inserción en pIR138-210.

El plásmido pIR139-210 que comprende un ADNc que codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana se ha depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania, en concordancia con las estipulaciones del Tratado de Budapest de 10 de Agosto de 2004, con el nombre DSM 16645. La presente invención se refiere también por tanto a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la actividad enzimática de una proteína R3 que comprende la secuencia de aminoácidos codificada con la inserción en plásmido pIR138-210, presentando la proteína codifica al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos 90% y de forma particular preferiblemente 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se puede deducir de la inserción en pIR139-210.

La secuencia de ácidos nucleicos mostrados en la secuencia Nº ID SEC 1 es una secuencia de ADNc que comprende la región de codificación de una proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

La presente invención se refiere por tanto también a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína R3 y que comprende la región de codificación de las secuencias de nucleótidos mostradas en Nº ID SEC 1 o secuencias que son complementarias a la misma, moléculas de ácido nucleico que comprenden la región de codificación de la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en plásmido pIR139-210 y moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos 90% y de forma particularmente preferida al menos 95% de identidad con las moléculas de ácido nucleico anteriormente citadas.

La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Nº ID SEC 2 es una secuencia de ADNc que comprende la región de codificación de una proteína R3 de Arabidopsis thaliana que se encuentra en fusión translacional con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa.

La presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína R3 y que comprenden la región de codificación de las secuencias de nucleótidos mostradas en la Nº ID SEC 2 o secuencias complementarias a las mismas, a moléculas de ácido nucleico que comprenden la región de codificación de la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido pIR138-210 y a moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos 90% y de forma particular preferiblemente al menos 95% de identidad con las moléculas de ácido nucleico anteriormente citadas.

El especialista en la técnica puede, con la ayuda de la información de secuencia de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o con la ayuda de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, aislar secuencias homólogas de otras especies de plantas. Esto se puede realizar, por ejemplo, con la ayuda de procedimientos convencionales, tales como rastreo de bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas con sondas de hibridación adecuadas. El especialista en la técnica sabe que se pueden aislar también secuencias homólogas con la ayuda de oligonucleótidos (degenerados) y uso de procedimientos basados en PCR.

Pueden servir también bases de datos de rastreo como se proporcionan, por ejemplo, por EMBL (http://www.ebi.ac.
uk/Tools/index.htm) o NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.govl) para identificar secuencias homólogas que codifican proteína R3.

Aquí, una o más secuencias se introducen como lo que se conoce como consulta. Esta secuencia de consulta se compara luego con secuencias en las bases de datos seleccionadas por medio de programas informáticos estadísticos. Tales consultas de bases de datos (por ejemplo, búsquedas exhaustivas o rápidas) se conocen por parte de los especialistas en la técnica y se pueden llevar a cabo usando diversos suministradores. Si se lleva a cabo una consulta en base de datos, por ejemplo, en NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se deberían usar los ajustes convencionales que se especifican para la búsqueda comparativa respectiva. Para comparaciones de secuencia de proteína (blastp), estos ajustes son como siguen: Límite de entrada = no activado; filtro = baja complejidad activado; valor esperado = 10; tamaño de palabra = 3; matriz = BLOSUM62; costes de Gap: existencia = 11,
extensión = 1. Los siguientes parámetros se tienen que fijar para comparación de secuencia de ácido nucleico (blastn):
Límite de entrada = no activado; filtro = baja complejidad activada; valor esperado = 10; tamaño de palabra = 11.

En el caso de una búsqueda en base de datos de este tipo, por ejemplo, las secuencias descritas en la presente invención se pueden usar como secuencia de consulta con el fin de identificar más moléculas de ácido nucleico y/o proteínas que codifican una proteína R3. Usando los procedimientos anteriormente descritos es también posible identificar y/o aislar moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención que se hibridan con la secuencia mostrada en Nº ID SEC 1 y que codifican una proteína R3.

Para los fines de la presente invención el término "hibridación" significa hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente en condiciones rigurosas como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ª edición (2002), ISBN: 0471250929). Con especial preferencia "hibridación" significa hibridación en las condiciones siguientes:

: Tampón de hibridación:

: 2xSSC; solución de Denhardt 10x (Ficoll 400+PEG+BSA; relación 1:1:1); 0,1% de SDS;

: EDTA 5 mM; Na_{2}HPO_{4} 50 mM; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; 50 \mug/ml de ARNt; o tampón de fosfato de sodio 25 M pH 7,2; EDTA 1 mM; 7% de SDS

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: Temperatura de hibridación:

: T = 65º a 68ºC

: Tampón de lavado: 0,1xSSC; 0,1% de SDS

: Temperatura de lavado: T=65º a 68ºC.

En principio pueden derivarse moléculas de ácido nucleico que se hibridan con moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden de cualquier especie de planta. Se pueden aislar moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de acuerdo con la invención, por ejemplo, de bibliotecas genómicas o de bibliotecas de ADNc. Tales moléculas de ácido nucleico se pueden identificar y aislar usando las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o partes de estas moléculas o los complementos inversos de estas moléculas, por ejemplo, mediante hibridación con procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 5ª edición (2002), ISBN: 0471250929) o con amplificación por medio de PCR.

Ejemplos de sondas de hibridación que se pueden usar son moléculas de ácido nucleico con, precisamente, o esencialmente, la secuencia de nucleótidos establecida en la Nº ID SEC 1, o partes de estas secuencias. Los fragmentos usados como sonda de hibridación también pueden tomar la forma de fragmentos sintéticos u oligonucleótidos que se han generado con la ayuda de técnicas sintéticas personalizadas y cuya secuencia es esencialmente acorde con la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Una vez que se han identificado y aislado los genes que se hibridan con las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, estos se deberían secuenciar y las características de las proteínas codificadas por esta secuencia se deberían analizar para asegurar que se trata de una proteína R3. Procedimientos que son particularmente adecuados son comparaciones de homología al nivel de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos y la determinación de la actividad enzimática. La actividad de una proteína R3 se puede determinar, por ejemplo, como se describe más adelante en Procedimientos Generales, punto 2.

Las moléculas que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprenden en fragmentos determinados, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifican una proteína R3 de plantas, de forma particular una proteína R3 de plantas de Arabidopsis thaliana. En el contexto de la presente invención, el término "derivado" significa que las secuencias de estas moléculas difieren en una o más posiciones de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas y tienen un grado elevado de identificad con estas secuencias. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas pueden haberse originado, por ejemplo, como consecuencia de la deleción, adición, sustitución, inserción o recombinación.

En el contexto de la presente invención el término "identidad" significa una identidad de secuencia en toda la longitud de la región de codificación (secuencia de longitud completa) de al menos 70%, de forma particular una identidad de al menos 80%, preferiblemente de más del 85%, con especial preferencia de más del 90% y de forma particular al menos 95%. En el contexto de la presente invención el término "identidad" se entiende que significa el número de aminoácidos/nucleótidos que concuerdan (identidad) con otras proteínas/ácidos nucleicos, expresados en porcentaje. Preferiblemente la identidad se determina por comparación de la Nº ID SEC 3, en el caso de aminoácidos, o Nº ID SEC 1, en el caso de ácidos nucleicos, con otras proteínas/ácidos nucleicos con la ayuda de programas informáticos. Si secuencias de longitud completa que se comparan con otra difieren en lo relativo a sus longitudes la identidad se tiene que determinar de forma que el número de aminoácidos que comparte la secuencia más corta con la secuencia más larga determina el porcentaje de la identidad. La identidad se determina preferiblemente por medio del programa informático conocido ClustalW que se encuentra disponible para el público (Thompson y col., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW se encuentra disponible para el público por parte de Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) y Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemania. Igualmente ClustalW se puede descargar de diferentes páginas de Internet, entre otras, en IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex, Francia; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) y en el EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) y en todas las páginas de Internet del EBI (European Bioinformatics Institute, Welcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, RU).

Para determinar la identidad entre proteínas de acuerdo con la invención y otras proteínas, se prefiere usar el programa informático ClustalW versión 1.8. Se tienen que regular los siguientes parámetros: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10. GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=
GONNET, ENDGAPS_(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

Para determinar la identidad, por ejemplo, entre la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y la secuencia de nucleótidos de otras moléculas de ácido nucleico, se prefiere usar el programa informático ClustalW versión 1.8. Se tienen que regular los siguientes parámetros: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: no ponderadas.

Identidad significa además que existe equivalencia funcional y/o estructural entre las moléculas de ácido nucleico en cuestión o las proteínas codificadas por las mismas. Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas con las moléculas anteriormente descritas y que son derivados de estas moléculas adquieren la forma en general de variaciones de estas moléculas que son modificaciones que ejercen la misma función biológica. Estas pueden adquirir la forma de variaciones de origen natural, por ejemplo, secuencias de otras especies de plantas, o de mutaciones, siendo posible para estas mutaciones ser de origen natural o haberse introducido con la mutagénesis dirigida al sitio. Además, estas pueden adquirir la forma de secuencias generadas sintéticamente. Las variantes alélicas pueden adquirir la forma de variantes de origen natural, pero también de variantes generadas sintéticamente o variantes producidas por técnicas de ADN recombinante. Una forma específica de derivados son, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que se derivan de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención como consecuencia de la degeneración del código genético.

Las proteínas codificadas por los diferentes derivados de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención comparten ciertas características. Estas pueden incluir, por ejemplo, actividad biológica, especificidad del sustrato, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación y similares, y propiedades físicas tales como, por ejemplo, el comportamiento de migración en electroforesis en gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, óptimo de pH, óptimo de temperatura y similares. Ya se han detallado anteriormente propiedades preferidas de una proteína R3 y se aplican aquí de forma análoga.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden ser cualquier molécula de ácido nucleico, de forma particular moléculas de ADN o ARN particulares, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ARNm y similares. Estas pueden ser moléculas de origen natural o moléculas generadas por procedimientos sintéticos recombinantes o químicos. Estas pueden ser moléculas de hebra simple que comprenden la hebra de codificación o de no codificación, o moléculas de doble hebra.

En el contexto de la presente invención se pueden generar también células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención usando lo que se conoce como mutagénesis de inserción (artículo de revista: Thomeycroft y col., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601). En el contexto de la presente invención se debe entender que mutagénesis por inserción significa en particular la inserción de transposones o lo que se conoce como ADN de transferencia (ADN-T) en un gen o en la vecindad de un gen que codifica una proteína R3, aumentando así la actividad de una proteína R3 en la célula en cuestión. En este contexto los transposones puede adquirir la forma de transposones de origen natural en la célula (transposones endógenos) o aquellos que no son de origen natural en dicha célula pero que se han introducido en la célula por medio de procedimientos recombinantes, tales como, por ejemplo, transformación de la célula (transposones heterólogos). Los especialistas en la técnica están familiarizados con la modificación de la expresión de genes por medio de transposones. Una revisión sobre el uso de transposones endógenos y heterólogos como herramientas en biotecnología de plantas se da en Ramachandran y Sundaresan (2001, Plant Physilology and Biochemistry 39, 234-252). La mutagénesis por inserción de ADN-T se basa en la capacidad de ciertos segmentos (ADN-T) de plámidos Ti de Agrobacterium para integrarse en el genoma de células de planta. El sitio de integración en el cromosoma de la planta no es fijo sino que puede tener cualquier localización. Si el ADN-T se integra en un segmento o en la vecindad de un segmento del cromosoma que constituye una función del gen, esto puede conducir a un aumento en la expresión génica, y por tanto también a una modificación de la actividad de una proteína codificada por el gen en cuestión. En este contexto las secuencias insertadas en el genoma (de forma particular transposones o ADN-T) se distinguen por el hecho de que comprenden secuencias que conducen a una activación de secuencias regulatorias de un gen R3 ("marcaje para activación").

Se pueden generar células de plantas y plantas de acuerdo con la invención con la ayuda de lo que se conoce como marcado de activación (véase, por ejemplo, Walden y col., Plant J. (1991), 281-288; Walden y col., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528). Este procedimiento se basa en la activación de promotores endógenos con secuencias potenciadoras, tales como, por ejemplo, el potenciador del promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, o el potenciador de la octopina sintasa.

En el contexto de la presente invención, el término "marcaje para activación de ADN-T" se entiende que significa un fragmento de ADN-T que comprende secuencias potenciadoras y que, como consecuencia de la integración en el genoma de una célula de planta, conduce a un aumento en la actividad de al menos una proteína de R3.

En el contexto de la presente invención, el término "marcaje para activación de transposón" se entiende que significa un transposón que comprende secuencias potenciadoras y que, como consecuencia de la integración en el genoma de una célula de planta, conduce al aumento en la actividad de al menos una proteína R3.

En una realización adicional, las moléculas de ADN de acuerdo con la invención que codifican una proteína R3 están unidas con secuencias regulatorias que inician la transcripción en células de planta (promotores) y que conducen a un aumento en una actividad de proteína R3 en la célula. En este contexto las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención se encuentran en orientación en sentido respecto a las secuencias regulatorias.

Para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína R3, estas moléculas están unidas preferiblemente con secuencias de ADN regulatorias que aseguran la transcripción en células de planta. Estas incluyen de forma particular promotores. En general cualquier promotor que sea activo en células de planta es adecuado para los fines de expresión.

En este contexto el promotor se puede seleccionar de forma tal que la expresión tenga lugar constitutivamente o sólo en un tejido determinado, en un momento determinado de tiempo de desarrollo de la planta o en un momento de tiempo que vaya determinado por factores externos. El promotor pueden ser homólogo o heterólogo tanto respecto a la planta como respecto a la molécula de ácido nucleico.

Ejemplos de promotores adecuados son el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor de ubiquitina del maíz para expresión constitutiva, el promotor B33 del gen de la patatina (Rocha-Sosa y col., EMBO J. 8 (1989), 23-29) para expresión específica de tubérculos en patatas, o un promotor que asegure expresión en etjidos fotosintéticamente activos únicamente, por ejemplo, el promotor ST-LS1 (Stockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus y col., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o, para expresión específica de endoesperma, el promotor HMG del trigo, el promotor de USP, el protomotor de faseolina, promotores de genes de la zeína del maíz (Pedersen y col., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio y col., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), promotor de glutelina (Leisy y col., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng y col., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara y col., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) o promotor Shrunken-1 (Werr y col., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380). No obstante es también posible usar promotores que son activados sólo en un momento de tiempo que es determinado por efectos externos (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279). Promotores que pueden ser de interés específico en este contexto pueden ser promotores de proteínas de choque térmico que son sencillos de inducir. Además es posible usar promotores específicos de semilla, tales como, por ejemplo, el promotor USP de Vicia faba, que asegura expresión específica de semilla en Vicia faba y otras plantas (Fiedler y col., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein y col., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

Además puede estar presente una secuencia de terminación (señal de poliadenilación) que sirve para añadir una cola de poli-A al transcripto. La cola de poli-A se dice que presenta una función en la estabilización de los transcriptos. Estos elementos se describen en la bibliografía (cf. Gielen y col., EMBO J. 8 (1989), 23-29) y se pueden intercambiar como se desee.

También pueden estar presentes secuencias de intrón entre el promotor y la región de codificación. Tales secuencias de intrón pueden conducir a expresión estable y a una mayor expresión en plantas (Callis y col., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, y Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, y col., 1997; Plant Journal. 12(4):895-899; Rose y Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil y col., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU y col., 2003, Science in China Series C vol. 46 Nº 6, 561-569). Ejemplos de secuencias de intrón adecuadas son el primer intrón del gen sh1 del maíz, el primer intrón del gen 1 de poli-ubiquitina de maíz, el primer intrón del gen EPSPS de arroz o uno de los dos primeros intrones del gen PAT 1 de Arabidopsis. Se conocen secuencias de intrón adecuadas por parte de especialistas en la técnica y se describen de forma extensiva en la bibliografía.

Además se pueden generar células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención mediante lo que se conoce como "activación in situ", donde la modificación genética que se ha introducido conlleva casi una modificación de las secuencias regulatorias de genes R3 endógenos, lo que conduce a una mayor expresión de genes de R3. La activación de un gen R3 se efectúa preferiblemente por mutagénesis "in vivo" de un promotor o de secuencias potenciadoras de un gen de R3 endógeno. En este contexto se puede modificar una secuencia promotora o potenciadora mediante mutagénesis de modo tal que la mutación generada conduce, en células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención, a una mayor expresión de un gen de R3 en comparación con la expresión de un gen de R3 en células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje. La mutación en una secuencia promotora o potenciadora puede conducir también a genes de R3 que se expresan, en células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención, en un momento de tiempo en el que no se expresan en células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje.

En el contexto de la presente invención el término "gen de R3" se entiende que significa una molécula de ácido nucleico (ADNc, ADN) que codifica una proteína R3, preferiblemente una proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

En el curso de lo que se conoce como "mutagénesis in vivo", se introduce un oligonucleótido híbrido de ARN/ADN ("quimeroplasto") en células de planta mediante transformación de células de planta (Kipp, P.B. y col., Poster Session at the "5th International Congress of Plant Molecular Biology", Septiembre 21-27 1997, Singapore; R.A. Dixon y C.J. Amtzen, Meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, EEUU, TIBTECH 15, (1997), 441-447; solicitud de patente internacional WO 9515972; Kren y col., Hepatology 25, (1997), 1462-1468; Cole-Strauss y col., Science 273, (1996), 1386-1389; Beetham y col., 1999, PNAS 96,
8774-8778).

Una parte del componente del oligonucleótido de ARN/ADN es homólogo con una secuencia de ácido nucleico de un gen de R3 endógeno, pero comprende una mutación en comparación con la secuencia de ácido nucleico de un gen de R3 endógeno o comprende una región heteróloga que está rodeada por las regiones homólogas.

Como consecuencia de que las regiones homólogas del oligonucleótido de ARN/ADN y de la molécula de ácido nucleico endógena sufran emparejamiento de bases, seguido de la recombinación homóloga, la mutación, o región heteróloga, presente en el componente de ADN del oligonucleótido de ARN/ADN se puede transferir al genoma de una célula de planta. Esto conduce al aumento en la actividad de una o más proteínas R3.

Todos estos procedimientos se basan en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño en el genoma de una célula de planta o planta y son por tanto, en principio, adecuados para la generación de células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de la presente invención las moléculas de ácido nucleico extraño de acuerdo con la invención adquieren la forma de moléculas de ácido nucleico recombinante en las que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifican una proteína R3 están unidas a un péptido señal de modo tal que la transcripción y traducción de dichas moléculas de ácido nucleico recombinante da lugar a una proteína que presenta un péptido señal plastídico.

Por tanto la presente invención se refiere además a células de planta modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, donde la molécula de ácido nucleico extraño introducida en la célula de planta o planta toma la forma de una molécula de ácido nucleico recombinante, en la que dicha molécula de ácido nucleico extraño es una molécula de ácido nucleico recombinante donde una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína R3 está fusionada con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína R3 que además de su secuencia de aminoácidos de codificación presenta un péptido señal plastídico.

En el contexto de la presente invención el término "molécula de ácido nucleico recombinante" se entiende que significa una molécula de ácido nucleico que, además de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifican una proteína R3, comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención. En este contexto, la adición de secuencias citadas pueden ser cualquier secuencia; preferiblemente, estas toman la forma de secuencias regulatorias (promotores, señales de terminación, potenciadores), con especial preferencia la forma de secuencias regulatorias que son activas en tejido de planta, con especial preferencia en la forma de secuencias regulatorias que son activas en tejido de planta en la que se sintetiza el almidón de almacenamiento. Secuencias adicionales preferidas son aquellas secuencias que codifican péptidos señal (secuencias de señal) que, como resultado de fusión translacional con secuencias que codifican proteína, llevan casi a la translocalización de las proteínas de acuerdo con la invención en compartimentos subcelulares (vacuolas, plástidos, mitocondria, núcleo, retículo endoplasmático, pared celular). Son especialmente importantes en el contexto de la presente invención secuencias de señal que codifican péptidos señal plastídicos. Son conocidos por los especialistas en la técnica procedimientos para generar moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención y comprenden procedimientos recombinantes o de biología molecular tales como, por ejemplo, la unión de moléculas de ácido nucleico mediante ligadura, recombinación genética o la síntesis de novo de moléculas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773,
Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ª edición (2002), ISBN: 0471250929).

En el contexto de la presente invención el término "péptido señal plastídico" se entiende que significa un péptido que porta aproximadamente la translocalización de una proteína en el lumen de plástidos cuando el péptido señal sea parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína.

En lo que respecta a la expresión en plantas de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, es posible, en principio, que la proteína sintetizada se pueda localizar en cualquier compartimento de la célula de la planta. Para alcanzar la localización en un compartimento determinado, la región de codificación debe, en caso apropiado, unirse con secuencias de ADN que aseguren la localización en el compartimento en cuestión. Tales secuencias son conocidas (véase, por ejemplo, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29, Neuhaus y Rodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38: 127-144). Aquí las secuencias de señal están unidas con la región de codificación de la proteína de modo tal que las secuencias de ácidos nucleicos fusionadas del péptido señal y aquellas que codifican la proteína forman, tras transcripción, un marco de lectura abierto compartido (fusión translacional). Por tanto tras la traducción del ARN formado por la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos fusionadas, se forma una proteína que, además de la región de codificación de la proteína, presenta un péptido señal.

En principio se puede usar cualquier secuencia de señal que asegure la importación de proteínas codificadas en el núcleo a plástidos como secuencia de señal plastídica. Es conocido por los especialistas en la técnica la obtención de secuencias de señal plastídicas. Así pues, por ejemplo, es posible usar programas informáticos (1999, Emanuelsson y col., Protein Science 8, 978-984) para analizar secuencias de proteínas de codificación en relación a la presencia de una secuencia de señal plastídica. Se encuentra comercialmente disponibles y disponibles para el público en Internet programas informáticos que llevan a cabo tales análisis (por ejemplo http://www.cbs.dtu.dklservices/ChloroP/). Por ejemplo, es posible usar la secuencia señal plastídica de la ferrodoxina de la espinaca: NADP + oxidoreductasa (FNR). La señal comprende la región no traducida en 5' y el flanqueo de la secuencia de péptido transitoria del ADNc de la proteína plastídica ferredoxina: NADP + oxidoreductasa de la espinaca (nucleótidos -171 a +165; Jansen y col., Current Genetics 13 (1988), 517-522).

Además es posible usar, por ejemplo, el péptido transitorio de la proteína cerosa de maíz más los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klosgen y col., Mol Gen Genet. 217 (1989), 155-161) como secuencia de señal plastídica. Además es posible usar el péptido transitorio de la proteína cerosa del maíz (véase anteriormente) sin los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura.

Es también factible el uso de la secuencias de señal plastídicas siguientes: secuencia de señal de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa (Wolter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764); secuencia de señal de NADP-malato deshidrogenasa (Gallardo y col., Planta 197 (1995), 324-332); secuencia de señal de glutationa reductasa (Creissen y col., Plant J. 8 (1995), 167-175), secuencia señal de EPSPS (documento US 5.188.642). Se prefiere usar la secuencia de señal del gen dul de arroz.

La molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender uno o más, preferiblemente dos, secuencias de señal. Las secuencias de señal pueden estar presentes directamente una tras otra en la dirección de transcripción o estas pueden estar separadas una de otra en cada caso con lo que se conoce como un distanciador. Se describen secuencias de señal plastídicas que comprenden dos secuencias de señal, por ejemplo, en los documentos EP 0508909 y EP 0924299, US 5.510.471).

De forma sorprendente, se ha encontrado que células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón que se encuentra modificado en comparación con el almidón de células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes.

Las células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón modificado cuyas propiedades físico-químicas, de forma particular cuyo contenido en fosfato de almidón, se encuentra modificado en comparación con almidón sintetizado en células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje de modo que es más adecuado para aplicaciones específicas.

Por tanto la presente invención también comprende células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención que sintetizan un almidón que está modificado en comparación respectivamente con células de planta de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje no modificas genéticamente correspondientes.

En el contexto de la presente invención, el término "almidón modificado" significa que el almidón tiene diferentes propiedades físicoquímicas en comparación con almidón no modificado que se puede obtener de células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje correspondientes.

En una realización adicional de la presente invención las células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón cuyo contenido en fosfato de almidón es mayor en comparación respectivamente con almidón aislado de células de planta de tipo salvaje y plantas de tipo salvaje correspon-
dientes.

Se han descrito una variedad de procedimientos para la determinación de la cantidad de fosfato de almidón. Se prefiere usar el procedimiento descrito por Ritte y col. (2000, Starch/Starke 52, 179-185) para determinar la cantidad de fosfato de almidón. La cantidad de fosfato de almidón se determina con especial preferencia mediante RMN ^{31}P usando el procedimientos descrito por Kasemusuwan y Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 702-707).

La invención se refiere además a plantas modificadas genéticamente que comprenden células de planta de acuerdo con la invención. Tales plantas se pueden generar de células de plantas de acuerdo con la invención mediante regeneración.

En principio, las plantas de acuerdo con la invención pueden tomar la forma de plantas de cualquier especie de planta, es decir, tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Estas pueden tomar la forma preferiblemente de plantas útiles, es decir, plantas que son cultivadas por el hombre para los fines de nutrición o para fines técnicos, particularmente industriales.

En una realización adicional, la planta de acuerdo con la invención es una planta que almacena almidón.

En el contexto de la presente invención, el término "plantas que almacenan almidón" significa todas las plantas con partes de planta que comprenden un almidón de almacenamiento tal como, por ejemplo, maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata, sago, frijol mungo, guisante o sorgo.

En el contexto de la presente invención el término "planta de patata" o "patata" significa especies de plantas del genoma Solanum, especialmente especies que producen tubérculos del género Solanum y de forma particular Solanum tuberosum.

En el contexto de la presente invención el término "planta de trigo" significa especies de planta del genoma Triticum o plantas que se han originado de hibridaciones con plantas del género Triticum, especialmente especies de plantas del género Triticum que se cultivan en agricultura para fines comerciales o plantas que se han originado de hibridaciones con plantas del género Triticum, con especial preferencia Triticum aestivum.

En el contexto de la presente invención el término "planta de maíz" significa especies de planta del género Zea, especialmente especies de plantas del género Zea cultivadas en agricultura para fines comerciales, con especial preferencia Zea mais.

En una realización adicional la presente invención se refiere a plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, preferiblemente plantas de patata, con especial preferencia plantas de la familia Poaceae (sistemática). Estas plantas adquieren con especial preferencia la forma de plantas de maíz o trigo.

La presente invención también se refiere a material de reproducción de plantas de acuerdo con la invención que comprenden células de planta de acuerdo con la invención.

En este contexto, el término "material de reproducción" comprende aquellas partes de la planta que son adecuadas para la generación de progenidad mediante la ruta vegetativa o generativa. Aquellas que son adecuadas para propagación vegetativa son esquejes, cultivos de callus, rizomas o tubérculos. Otro material de reproducción comprende, por ejemplo, frutas, semillas, plántulas, protoplastos; cultivos celulares y similares. El material de reproducción adquiere preferiblemente la forma de tubérculos y con especial preferencia granos que comprenden endoesperma.

En una realización adicional la presente invención se refiere a partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención, tales como frutas, depósito y otras raíces, flores, capullos, brotes o tallos, preferiblemente semillas, granos o tubérculos, estas partes cosechables comprenden células de plantas de acuerdo con la invención.

La presente invención describe además un procedimiento para la generación de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en el que

a): se modifica genéticamente una célula de planta, conduciendo la modificación genética a un aumento en la actividad de una proteína R3 en comparación con células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes;

b): se regenera una planta a partir de células de planta de la etapa a); y

c): cuando sea apropiado, se generan más plantas con la ayuda de las plantas de la etapa b).

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La presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de una planta modificada genéticamente, en el que

a): se transforma una célula de planta, conduciendo la transformación a un aumento en la actividad de al menos una proteína que codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón en comparación con células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes y que consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trisfosfato a almidón seleccionada del grupo constituido por I

i): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3,

ii): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en DSM 16587 o por la inserción en DSM 16645;

iii): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3;

iv): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645;

v): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en las Nº ID SEC 1 o Nº ID SEQ 2 o una secuencia complementaria;

vi): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido DSM 16587 o en el plásmido DSM 16645;

vii): moléculas de ácido nucleico que tienen al menos el 70% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en i), ii) v) o vi);

viii): moléculas de ácido nucleico que se hibridan, en condiciones rigurosas con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en i), ii), v) o vi); iix) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos, como consecuencia de la degeneración del código genético, deriva de la secuencia de moléculas de ácido nucleico citadas en i), ii), v) o vi); y

ix): moléculas de ácido nucleico que constituyen fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de moléculas de ácido nucleico citadas en i), ii), iii), iv), v), vi), vii), viii) o iix),

en el genoma de la célula de planta, en el que dicha molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes en los que una secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido se señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación presenta un péptido señal plastídico,

b): se regenera una planta a partir de células de planta de la etapa a); y

En lo relativo a la modificación genética introducida en la célula de planta de acuerdo con la etapa a), esto puede tomar la forma en principio de cualquier tipo de modificación que conduzca a un aumento en la actividad de una proteína R3.

Las plantas se pueden regenerar de acuerdo con la etapa b) mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica (por ejemplo, como se describe en "Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. por R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

La generación de más plantas de acuerdo con la etapa c) del procedimiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, por reproducción vegetativa (por ejemplo, mediante esquejes, tubérculos, o mediante cultivo de callus y regeneración de plantas intactas) o mediante reproducción generativa. En este contexto, la reproducción generativa tiene lugar en general en condiciones controladas, es decir, se hibridan plantas seleccionadas con características específicas entre ellas y se multiplican. La selección tiene lugar preferiblemente de forma tal que las plantas adicionales que se obtienen de acuerdo con la etapa c) comprenden la modificación genética que se ha introducido en la etapa a).

En el procedimiento de acuerdo con la invención para la generación de una planta modificada genéticamente, la modificación genética de una célula de planta en la etapa a) conduce a un aumento en la actividad de una proteína R3 en plástidos de dicha célula de planta en comparación con plástidos de células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes.

En el procedimiento de acuerdo con la invención, la modificación genética consiste en la introducción en el genoma de la célula de planta de una molécula de ácido nucleico extraño de acuerdo con la invención o una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, la presencia o expresión de dicha molécula de ácido nucleico extraño o dicha molécula de ácido nucleico recombinante que conduce a una actividad mayor de una proteína R3 en la célula.

En el procedimiento de acuerdo con la invención la modificación genética consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula de planta, codificando la molécula de ácido nucleico extraño una proteína R3.

En el procedimiento de acuerdo con la invención la modificación genética consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula de planta, siendo dicha molécula de ácido nucleico extraño una molécula de ácido nucleico recombinante donde se fusiona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína R3 con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína R3 que, además de su secuencia de aminoácidos de codificación, presenta un péptido señal plastídico.

En una realización adicional se usa el procedimiento de acuerdo con la invención para la generación de una planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención para la generación de plantas que almacenan almidón.

En una realización adicional el procedimiento de acuerdo con la invención se usa para la generación de plantas de patata, maíz o trigo de acuerdo con la invención.

En el procedimiento de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico extraña se selecciona del grupo constituido por

j): moléculas de ácido nucleico que constituyen fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).

En el procedimiento de acuerdo con la invención la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención es una molécula de ácido nucleico recombinante, siendo dicha molécula de ácido nucleico extraño una molécula de ácido nucleico recombinante en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína R3 se fusiona con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína R3 que además de su secuencia de aminoácido de codificación tiene un péptido señal plastídico.

En una realización adicional la presente invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la invención donde la planta modificada genéticamente sintetiza un almidón que está modificado en comparación con almidón de plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente.

En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón modificado con un contenido en fosfato de almidón elevado en comparación con almidón aislado de plantas de tipo salvaje correspondientes.

La presente invención también se refiere a las plantas que se pueden obtener mediante procedimientos de acuerdo con la invención.

De forma sorprendente, se ha encontrado que almidón aislado de células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención con una mayor actividad de una proteína R3 en los plástidos presentes en ellos sintetizan un almidón modificado.

De forma particular las mayores cantidades de fosfato de almidón de almidones de acuerdo con la invención confieren de forma sorprendente y ventajosa propiedades a los almidones. Como consecuencia de la mayor cantidad de fosfato de almidón, los almidones de acuerdo con la invención partan una mayor cantidad de grupos cargados que tienen un efecto esencial en las propiedades funcionales del almidón. Se puede usar almidón que porta grupos funcionales cargados de forma particular en la industria del papel donde se usa para el recubrimiento de papel. El papel que se recubre con moléculas cargadas que tienen además buenas propiedades adhesivas es particularmente adecuado para la absorción de colores tales como, por ejemplo, tinta, tintas de impresión y similares.

También se describen almidones modificados que se pueden obtener en células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención, de material de reproducción de acuerdo con la invención o de partes de planta cosechables de acuerdo con la invención.

Además se describe almidón modificado de plantas que almacenan almidón, preferiblemente de plantas de patata, con especial preferencia de plantas que almacenan almidón de la familia Poaceae (sistemática), de forma particularmente preferida de plantas de maíz o trigo.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción de un almidón modificado que comprende la etapa de extraer el almidón de una célula de planta de acuerdo con la invención o de una planta de acuerdo con la invención, a partir del material de reproducción de acuerdo con la invención de una planta y/o de partes de planta cosechables de acuerdo con la invención de una planta de este tipo, preferiblemente de partes de almacenamiento de almidón de acuerdo con la invención de una planta de este tipo. Preferiblemente un procedimiento de este tipo comprende también la etapa de cosechar plantas las plantas cultivadas o partes de planta y/o del material de reproducción de estas plantas antes de la extracción del almidón, y con especial preferencia además la etapa de cultivar plantas de acuerdo con la invención antes de la cosecha.

Se conocen por los especialistas en la técnica procedimientos de extracción de almidón de plantas o de partes de plantas que almacenan almidón. Adicionalmente se describen procedimientos de extracción de almidón de diversas plantas que almacenan almidón, por ejemplo, en Starch: Chemistry and Technology (Ed.: Whistler, BeMiller y Paschall (1994), 2ª edición, Academic Press Inc. Londres Ltd; ISBN 0-12-746270-8; véase, por ejemplo, capítulo XII, páginas 412-468: maize and sorghum starches: production; de Watson, Capítulo XIII, páginas 469-479: tapioca, arrowroot and sago starches: production; de Corbishley y Miller, capítulo XIV, páginas 479-490: potato starch: production and uses; de Mitch; Capítulo XV, páginas 491 a 506: wheat starch: production, modification and uses; de Knight and Oson; y Capítulo XVI, páginas 507 a 528: rice starch: production and uses; de Rohmer y Klem; maize starch: Eckhoff y col., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, la extracción de almidón de maíz a una escala industrial se consigue en general con lo que se conoce molienda en húmedo). Dispositivos usados normalmente en procedimientos para la extracción de almidón de material de planta son separadores, decantadores, hidrociclones, secadores por pulverización y secadores de lecho fluidizado.

En el contexto de la presente invención el término "plantas que almacenan almidón" se entiende que significa aquellas partes de una planta en las que se almacena almidón como un depósito para sobrevivir durante periodos prolongados, en contraste con almidón de hoja transitorio. Partes de plantas que almacenan almidón preferidas son, por ejemplo, tubérculos, raíces de almacenamiento y granos, siendo especialmente preferidos granos que comprenden endoesperma, siendo especialmente preferidos granos que comprenden un endoesperma de plantas de maíz o
trigo.

En el contexto de la presente invención el término "almidón nativo" significa que el almidón se aísla de plantas de acuerdo con la invención, partes de planta cosechables de acuerdo con la invención, partes que almacenan almidón de acuerdo con la invención o material de reproducción de planta de acuerdo con la invención mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica.

Otra materia objeto de la presente invención es el uso de células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención para la producción de un almidón modificado.

Los especialistas en la técnica conocen que las propiedades de almidón se pueden modificar, por ejemplo, con derivatización térmica, química, enzimática o mecánica. Los almidones derivatizados son particularmente adecuados para una variedad de aplicaciones en los sectores alimentario y/o no alimentario. Los almidones son más adecuados como material de partida para la producción de almidones derivatizados que los almidones convencionales ya que como resultado de su mayor contenido de fosfato de almidón estos tienen un mayor contenido de grupos funcionales reactivos.

El término "almidón derivatizado" se entiende que significa un almidón modificado cuyas características son modificadas tras su aislamiento de células de plantas por medio de procedimientos químicos, enzimáticos, térmicos o mecánicos.

Los almidones derivatizados pueden ser éteres de almidón, de forma particular alquiléteres de almidón, O-aliléteres, hidroxialquiléteres, O-carboximetiléteres, éteres de almidón que contienen nitrógeno, éteres de almidón que contienen fosfato o éteres de almidón que contienen azufre.

Los almidones derivatizados pueden ser almidones reticulados.

Los almidones derivatizados pueden ser polímeros de injerto de almidón.

Los almidones derivatizados pueden ser almidones oxidados.

Además los almidones derivatizados pueden ser ésteres de almidón, de forma particular ésteres de almidón que se han introducido en el almidón que usa ácidos orgánicos. Estos son preferiblemente almidones de fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato o citrato.

Son adecuados almidones derivatizados para distintas aplicaciones en la industria farmacológica, en los sectores alimentario y/o no alimentario. Se conocen por los especialistas en la técnica procedimientos para la producción de almidones derivatizados y se describen suficientemente en la bibliografía general. Se encuentra una revisión sobre la producción de almidones derivatizados, por ejemplo, en "Com. Chemistry and Technology" (1987, eds. Watson y Ramstad, capítulo 16, 479-499).

Se procesan frecuentemente partes de plantas que almacenan almidón en harinas. Ejemplos de partes de cereales a partir de las cuales se producen harinas son, por ejemplo, tubérculos de plantas de patata y granos de plantas de cereales. Para producir harinas de plantas de cereales se muelen y tamizan los granos que contienen endoesperma de estas plantas. El almidón es un constituyente principal del endoesperma. En el caso de otras plantas que no comprenden un endoesperma, pero otras partes que almacenan almidón tales como, por ejemplo, tubérculos o raíces, se produce frecuentemente harina por trituración, secado y subsiguiente molienda de los órganos de almacenamiento en cuestión. El almidón del endoesperma o presente en partes de plantas que almacenan almidón es un constituyente importante de la harina que se produce a partir de las partes de planta en cuestión. Esto es porque las propiedades de harina se ven afectadas por el almidón presente en la harina en cuestión. Células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón que está modificado en comparación con células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente o plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes. Por tanto harinas producidas de células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de acuerdo con la invención, material de reproducción de acuerdo con la invención o partes cosechables de acuerdo con la invención presentan propiedades modificadas. Las propiedades de harinas se pueden ver influencias por mezcla de almidón con harinas o con mezcla de harinas que tienen diferentes propiedades.

También se describen harinas que son producidas a partir de células de planta de acuerdo con la invención, plantas de acuerdo con la invención, de partes de planta que almacenan almidón de acuerdo con la invención, de material de reproducción de acuerdo con la invención o de partes de planta cosechables de acuerdo con la invención. Partes de planta que almacenan almidón preferidas de acuerdo con la invención son tubérculos, raíces de almacenamiento y granos que contienen endoesperma. Preferiblemente los tubérculos son tubérculos de plantas de patata y granos son granos de plantas de la familia Poaceae (sistemática); con especial preferencia, granos son granos de plantas de maíz y trigo.

En el contexto de la presente invención los términos "harina" se entiende que significa un polvo obtenido por molienda de partes de planta. En caso apropiado las partes de planta se secan antes de la molienda y se trituran y/o tamizan tras molienda.

Como resultado del almidón presente en ellas, que presenta un contenido en fosfato modificado, las harinas de acuerdo con la invención se distinguen de forma particular por su mayor capacidad de unión a agua. Esto se deseable, por ejemplo, para un número de aplicaciones cuando se procesan harinas en la industria alimentaria, de forma particular en la producción de artículos horneados.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción de harinas, que comprende la etapa de moler células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de acuerdo con la invención, partes de plantas de acuerdo con la invención, partes de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, material de reproducción de acuerdo con la invención o material cosechable de acuerdo con la invención.

Se pueden producir harinas mediante molienda de partes de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención. El especialista en la técnica sabe cómo producir harinas. Preferiblemente un procedimiento para la producción de harinas también comprende la etapa de cosechar las plantas cultivadas o partes de planta y/o el material de propagación o las partes que almacenan almidón de estas plantas antes de la molienda y con especial preferencia además la etapa de cultivar la planta de acuerdo con la invención antes de la cosecha.

En el contexto de la presente invención el término "partes de plantas" se entiende que son todas las partes de la planta que, en la totalidad de sus constituyentes, forman una planta completa. Ejemplos de partes de plantas son brotes, hojas, rizomas, raíces, remolacha, tubérculos, vainas, semillas o granos.

En una realización adicional de la presente invención el procedimiento para la producción de harinas comprende el procesamiento de plantas de acuerdo con la invención, de partes de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, de material de reproducción de acuerdo con la invención o de material cosechable de acuerdo con la invención antes de la molienda.

En este contexto el procesamiento puede ser, por ejemplo, un tratamiento térmico y/o secado. El tratamiento térmico seguido de secado del material que se ha sometido a tratamiento térmico se aplica, por ejemplo, a la producción de harinas de raíces de almacenamiento o tubérculos tales como, por ejemplo, tubérculos de patata antes de la molienda. Plantas de acuerdo con la invención, partes de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención, material de reproducción de acuerdo con la invención o material cosechable de acuerdo con la invención antes de la molienda puede constituir igualmente el procesamiento para los fines de la presente invención. La eliminación de tejido de planta tal como, por ejemplo, las cáscaras de los granos, antes de la molienda, es también un procesamiento previo a la molienda para los fines de la presente invención.

En una realización adicional de la presente invención el procedimiento para la producción de harinas tras molienda comprende un procesamiento del material molido.

Por ejemplo, el material molido se puede tamizar tras molienda, por ejemplo, para producir distintos tipos de harinas.

La presente invención se refiere además al uso de células de planta de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención modificadas genéticamente para la producción de harinas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar medios tales como, por ejemplo, moléculas de ADN, para generación de células de planta de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo con la invención que, en comparación con células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente, sintetizan un almidón modificado.

Por tanto, la presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una proteína que transfiere un residuo de fosfato de un nucleósido trifosfato en almidón seleccionado del grupo constituido por

a): una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la secuencia de aminoácido mostrada en la Nº ID SEC 3;

b): una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en Nº ID SEC 3;

c): una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la Nº ID SEC 1 o Nº ID SEC 2 o una secuencia que es complementaria con estas secuencias;

d): una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en a) o c);

e): una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con al menos una hebra de la molécula de ácido nucleico descrita en a) o c);

f): una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos, como consecuencia de la degeneración del código genético, deriva de la secuencia de moléculas de ácido nucleico citadas en a) o c); y

g): una molécula de ácido nucleico que constituye un fragmento, variante alélica y/o derivado de las moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), c), d), e) o f),

y en la que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en ácidos nucleicos recombinantes que codifican una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, está condensada con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden derivarse, en principio, de cualquier planta, preferiblemente de plantas de Arabidopsis.

La presente invención describe además moléculas de ácido nucleico de al menos 21, preferiblemente más de 50 y con especial preferencia más de 200 nucleótidos de longitud, tales moléculas de ácido nucleico se hibridan de forma específica con al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En el presente contexto hibridarse significa de forma específica que estas moléculas se hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de acuerdo con la invención, pero no con moléculas de ácido nucleico que codifican otras proteínas. La invención se refiere en particular a aquellas moléculas de ácido nucleico que se hibridan con transcriptos de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y pueden por tanto evitar la traducción de este último. Tales moléculas de ácido nucleico que se hibridan de forma específica con las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, componentes de construcciones anti-sentido, construcciones de ARN I, construcciones de co-supresión o ribozimas, o se pueden usar como cebadores para amplificación por medio de PCR.

La invención describe moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La presente invención describe una molécula de ácido nucleico recombinante en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína R3 está fusionada con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína R3 que además de su secuencia de aminoácidos de codificación, comprende un péptido señal plastídico.

Una realización adicional de moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, de la presente invención, son vectores, de forma particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores convencionalmente usados en ingeniería genética que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente de acuerdo con la invención.

En una realización adicional las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención que están presentes en los vectores están unidos con secuencias regulatorias que inician la expresión en células procarióticas o eucarióticas. En este contexto el término "expresión" puede significar transcripción o transcripción y traducción. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden estar presentes en orientación en sentido y/o en orientación anti-sentido respecto a las secuencias regulatorias.

Se describen de forma extensiva en la bibliografía secuencias regulatorias para expresión en organismos procarióticos, por ejemplo, E. coli, y en organismos eucarióticos, de forma particular aquellas para expresión en levadura, tales como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. Se puede encontrar una revisión sobre diversos sistemas para la expresión de proteínas en diferentes organismos huésped, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 y en Bitter y col. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).

La presente invención se refiere además a una célula huésped, de forma particular a una célula procariótica o eucariótica, que está modificada genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o con un vector de acuerdo con la invención, y a células que se derivan de tales células huésped y que comprenden la modificación genética de acuerdo con la invención.

Las células huésped pueden ser células bacterianas (por ejemplo, E. coli, bacterias del género Agrobacterium, de forma particular Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) o células de hongos (por ejemplo, levadura, de forma particular S. cerevisiae, Agaricus, de forma particular Agaricus bisporus, Aspergillus, Trichoderma), o células de planta o animal. En el presente contexto el término "transformado" significa que las células de acuerdo con la invención están modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una extensión tal que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención además de su genoma natural. Esta molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede estar presente en la célula en forma libre, en caso apropiado como una molécula auto-replicante, o puede estar integrada de forma estable en el genoma de la célula huésped. Las células huésped son preferiblemente microorganismos. Para los fines de la presente solicitud, esto se entiende que significa todas las bacterias y todos los protistas (por ejemplo, hongos, de forma particular levaduras y algas) como se definen, por ejemplo, en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" [General Microbiology] (editorial Georg Thieme (1985), 1-2).

Las células huésped de acuerdo con la invención son preferiblemente células de planta. En principio estas pueden tomar la forma de células de planta de cualquier especie de planta deseada, es decir, tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Estas adquieren la forma preferiblemente de células de plantas de plantas de cultivo agrícolas, es decir, de plantas que se cultivan por el hombre para los fines de nutrición o técnicos, de forma particular industriales. La invención se refiere preferiblemente a células de plantas y plantas de plantas que almacenan almidón (maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata, sago, frijol mungo, guisante o sorgo), preferiblemente células de planta de plantas de patata, con especial preferencia células de planta de la familia Poacea (sistemática), siendo especialmente preferidas células de planta de plantas de maíz o trigo.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención. Se prefieren composiciones de acuerdo con la invención que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y una célula huésped. La célula huésped toma con especial preferencia la forma de una célula de planta, con especial preferencia la forma de una célula de una planta de maíz o trigo. En estas composiciones, la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención existe fuera de la célula huésped, es decir, se localiza fuera de la parte interior de la célula huésped que está rodeada por una membrana del citoplasma.

Un aspecto adicional de composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones que se pueden usar para la generación de células huésped de acuerdo con la invención, preferiblemente para la generación de células de planta de acuerdo con la invención. Esta toma preferiblemente la forma de una composición que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y un soporte biolístico que es adecuado para introducir una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped. Soportes biolísticos preferidos son partículas hechas de tungsteno, oro o plásticos.

Una realización adicional de composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y una célula de planta y un medio de cultivo sintético. Además de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, las células de planta y medio de cultivo sintético, tales composiciones también comprenden preferiblemente polietilenglicol (PEG). En estas composiciones la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención está presente fuera de la célula planta, es decir, está localizada fuera de la parte interna de la célula de planta que está rodeada por una membrana del citoplasma. Se conocen por los especialistas en la técnica medios de cultivos sintéticos que son adecuados para cultivo y/o para la transformación de células de plantas y se describen, por ejemplo, de forma extensiva en la bibliografía. Se pueden adquirir también comercialmente muchos medios de cultivo sintéticos diferentes en el mercado especializado (por ejemplo, DUCHEFA Biochemie B.V. Bélgica).

Una realización adicional de composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones que se usan para identificar ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Además de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o vector de acuerdo con la invención, tales composiciones comprenden preferiblemente más moléculas de ácido nucleico, de forma particular moléculas de ácido nucleico de origen vegetal, que pueden estar presentes en la forma de ADN genómico, ARNm o como clones en lo que se conocen como bibliotecas de ADN. Se prefieren bibliotecas de ADN que existen como cósmidos, fagemidos, plásmidos, YAC o BAC. Las bibliotecas de ADN pueden comprender tanto ADN genómico como ADNc. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención o vectores de acuerdo con la invención se usan preferiblemente como sondas de hibridación en estas composiciones.

Una materia objeto adicional de la presente invención son proteínas seleccionadas del grupo constituido por

a): proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3;

b): proteínas que se codifican con la región de codificación del ADN insertado en el plásmido pIR 138-210 o en el plásmido pIR139-210; o

c): proteínas que tienen al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos de las proteínas citadas en a) o b).

La presente invención se refiere además a una proteína de acuerdo con la invención que tiene un peso molecular de 120 kDa a 145 kDa, preferiblemente de 120 kDa a 140 kDA, con especial preferencia de 125 kDa a 140 kDa, con especial preferencia de 130 kDa a 135 kDa, derivada de la secuencia de aminoácidos.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención que tiene un dominio de fosfohistidina.

En una realización adicional la presente invención se refiere a proteínas con actividad fosforilante de almidón, donde la proteína codificada tiene al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, de forma particularmente preferida al menos 90% y con especial preferencia al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3 o con la secuencia de aminoácidos de una proteína R3 codificada por la inserción en plásmido pIR138-210 o por la inserción en plásmido pIR139-210.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención en la que la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína presenta un dominio de fosfohistidina. Preferiblemente la proteína de acuerdo con la invención presenta un dominio de fosfohistidina que tiene al menos 85%, especialmente al menos 88%, preferiblemente al menos 91% y de forma particularmente preferida al menos 94% y con especial preferencia al menos 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 4.

Una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención se refiere a proteínas recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica la proteína R3 que está fusionada con secuencias de aminoácidos que codifican un péptido señal plastídico.

En el contexto de la presente invención el término "proteína recombinante" se debe entender que significa una proteína que, junto con las secuencias de aminoácidos que codifican una proteína R3 de acuerdo con la invención, comprende secuencias de aminoácidos adicionales, donde la combinación de secuencias de aminoácidos que codifican la proteína R3 y de dichas secuencias de aminoácidos adicionales no existe de forma natural en la combinación en la que si existe en proteínas recombinantes de acuerdo con la invención. En este contexto, las secuencias de aminoácidos adicionales anteriormente citadas pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, estas toman la forma de secuencias de aminoácidos que codifican péptidos señal que, como consecuencia de la fusión translacional con secuencias de aminoácidos que codifican la proteína R3, portan casi una translocalización de las proteínas recombinantes en cuestión en compartimentos subcelulares (vacuolas, plástidos, mitocondria, núcleo, retículo endoplásmico, pared celular). Especialmente importante en el contexto de la presente invención son secuencias de aminoácidos que codifican péptidos señal plastídicos. Se conocen por los especialistas en la técnica procedimientos para la generación de proteínas recombinantes de acuerdo con la invención y comprenden procedimientos recombinantes tales como, por ejemplo, la transcripción y translación de moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican proteínas recombinantes.

Ya se han citado anteriormente fuentes de secuencias de aminoácidos que codifican péptidos señal plastídicos en el contexto del término "molécula de ácido nucleico recombinante".

En una realización adicional la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, derivándose la proteína de una planta de Arabidopsis.

En una realización adicional, la invención también se refiere a proteínas que son codificadas por moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Descripción de las secuencias

Nº ID SEC 1: secuencia de ácidos nucleicos que comprende la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana. Esta secuencia se inserta en el plásmido pIR139-210.

Nº ID SEC 2: secuencia de ácidos nucleicos que comprende la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana en fusión translacional con la secuencia de señal que codifica el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa. Esta secuencia se inserta en el plásmido pIR138-210.

Nº ID SEC 3: secuencia de aminoácidos que codifica la proteína de fusión constituida por la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana y la secuencia de aminoácidos que codifica el péptido de señal plastídico del gen dul I (TrEMBL nº acceso: Q621 D6) de Oryza sativa. Esta secuencia se puede derivar de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Nº ID SEC: 2

Nº ID SEC 4: secuencia de aminoácidos del dominio de fosfohistidina que está presente en la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Procedimientos generales

El siguiente texto describirá procedimientos que se pueden usar para implementar los procedimientos de acuerdo con la invención. Estos procedimientos son realizaciones específicas de la presente invención, pero no limitan la presente invención a estos procedimientos. Los especialistas en la técnica saben que la invención se puede implementar de la misma forma modificando los procedimientos descritos y/o reemplazando determinadas partes de los procedimientos por partes alternativas de los procedimientos.

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1. Expresión recombinante de una proteína fosforilante de almidón identificada a) Generación de un vector de expresión bacteriano que comprende ADNc que codifica una proteína fosforilante de almidón

El ADNc que codifica una proteína fosforilante de almidón se puede amplificar por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, usando ARNm o poli-A-plus-ARNm de tejidos de planta como templado. A tal fin se usa inicialmente una transcriptasa inversa para la generación de una hebra de ADNc que sea complementaria con el ARNm que codifica una proteína fosforilante del almidón antes de que la hebra de ADNc en cuestión se amplifique por medio de ADN polimerasa. Se encuentran comercialmente disponibles kits que comprenden sustancias, enzimas e instrucciones para llevar a cabo reacciones de PCR (por ejemplo, sistema RT-PCR SuperScript^{TM} de una etapa, Invitrogen, producto nº: 10928-034). El ADNc que se ha amplificado y que codifica una proteína fosforilante de almidón se puede clonar de forma subsiguiente en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo, pest^{TM} 17 (Invitrogen). pDEST^{TM}17 comprende el promotor T7 que se usa para iniciar la transcripción de la T7 ARN polimerasa. Además el vector de expresión pDEST^{TM}17 comprende, en la dirección 5' del promotor T7, una secuencia Shine-Dalgamo seguida de un codón de inicio (ATG) y por lo cual se conoce como un His tag. Este His tag comprende seis codones consecutivos, cada uno codifica el aminoácido histitida, y se localiza en el marco de lectura del codón de inicio anteriormente citado. Un ADNc que codifica una proteína forsforilante de almidón se clona en pDEST^{TM}17 de modo tal que se genera una fusión translacional entre los codones para el codón de inicio, la His tag y el ADNc que codifica una proteína fosforilante de almidón. Tras transcripción, iniciada en el promotor T7, y subsiguiente traducción, se obtiene una proteína fosforilante de almidón que comprende, en su término N, aminoácidos adicionales que incluyen la His tag.

No obstante se pueden usar también otros vectores que son adecuados para expresión en microorganismos para expresar una proteína fosforilante del almidón. Se conocen por los especialistas en la técnica vectores de expresión y cepas de expresión coincidentes y se encuentran también comercialmente disponibles combinaciones adecuadas.

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b) Generación de clones de expresión en Escherichia coli

En primer lugar se transforma una cepa de E. coli que puede sufrir transformación adecuada que codifica cromosomalmente una T7 ARN polimerasa con el plásmido de expresión generado como se describe en la etapa a) y la cepa se incuba subsiguientemente durante la noche a 30ºC en medio nutriente solidificado sobre agar. Son cepas de expresión adecuadas, por ejemplo, cepas BL21 (producto de Invitrogen nºC6010-03 que codifica cromosomalmente una T7 ARN polimerasa bajo el control de un promotor que se puede inducir con IPTG (lacZ).

Se pueden analizar colonias bacterianas que son el resultado de la etapa de transformación mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica en relación a la presencia del plásmido de expresión deseado que comprende un ADNc que codifica la proteína fosforilante de almidón. Esto da clones de expresión.

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c) Expresión de una proteína fosforilante de almidón en Escherichia coli

En primer lugar se prepara un precultivo. En este extremo se inocula un clon de expresión obtenido en la etapa b) en 30 ml de Terrific Broth (medio TB) que comprende un antibiótico para selección para la presencia del plásmido de expresión y se incuba el cultivo durante la noche a 30ºC con agitación (250 rpm).

Luego se prepara un cultivo principal para expresión de una proteína fosforilante de almidón. En este extremo se inoculan en matraces Erlenmeyer de 1 litro que comprenden cada uno 300 ml de medio TB que se ha precalentado a 30ºC y un antibiótico para la selección de la presencia del plásmido de expresión en cada caso con 10 ml de un precultivo adecuado y se incuba a 30ºC con agitación (250 rpm) hasta una densidad óptica de aproximadamente 0,8 (medido a una longitud de onda de 600 nm; DO_{600}).

Si para expresar una proteína fosforilante de almidón se usó un plásmido de expresión en el que la expresión de la proteína fosforilante de almidón se inicia mediante un sistema inducible (por ejemplo, el vector de expresión pDEST^{TM} 17 en cepas BL21 de E. coli, inducibles por IPTG), se añade el inductor en cuestión (por ejemplo, IPTG) una vez se ha alcanzado una DO_{600} de aproximadamente 0,8 al cultivo principal. Tras adición del inductor el cultivo principal se incuba a 30ºC con agitación (250 rpm) hasta que se haya alcanzado una DO_{600} de aproximadamente 1,8. Después de esto se enfría con hielo el cultivo principal durante 30 minutos y se separan luego las células del cultivo principal del medio de cultivo por centrifugación (10 minutos a 4000xg y 4ºC).

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2. Purificación de una proteína fosforilante de almidón a) Ruptura de células que expresan una proteína fosforilante de almidón

Las células obtenidas tras centrifugación en la etapa c), punto 1, Procedimientos Generales, se resuspenden en tampón de lisis, donde se añaden aproximadamente 4 ml de tampón de lisis a aproximadamente 1 g de células. Después de esto, las células resuspendidas se incuban en hielo durante 30 minutos y luego se rompen con la ayuda de un equipo de ultrasonidos (Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin Electronic, Berlín, regulaciones: ciclo 6,70%, 1 minuto) con enfriamiento con hielo continuo. Se debe tener cuidado que la suspensión de células no se caliente de forma indebida durante la exposición a ultrasonidos. La suspensión obtenida tras exposición a ultrasonidos se centrifuga (12 minutos a 20000 x g, 4ºC) y el sobrenadante obtenido tras centrifugación se filtra a través de un filtro con un tamaño de poro de 45 \mum.

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b) Purificación de la proteína fosforilante de almidón

Si la proteína fosforilante de almidón expresada en células de E. coli es una proteína de fusión con una His tag, esta se puede purificar con la ayuda de iones de níquel, a los que se une la His tag con alta afinidad. A tal fin se trata 25 ml del filtrado obtenido en la etapa d) con 1 ml de suspensión de Ni-agarosa (Qiagen, producto nº: 30210) y se incuba la mezcla en hielo durante 1 hora. Después de esto se pasa la mezcla de suspensión de Ni-agarosa y el filtrado por una columna de poliestireno (Pierce, producto nº: 29920). Se desecha el volumen de paso de la columna. Se lava la columna en primer lugar aplicando 8 ml de tampón de lisis, se desecha de nuevo el volumen de paso. Se eluye luego la proteína fosforilante de almidón mediante aplicación fraccional de dos porciones de 1 ml de tampón E1 en cada caso, seguido de una porción de 1 ml de tampón E2 y luego cinco porciones de 1 ml de tampón E3 en cada caso a la columna. Se recoge el volumen de paso obtenido cuando se aplica la fracción individual de los tampones de elución en cuestión (tampones E1, E2 y E3) en fracciones separadas. Se analizan subsiguientemente alícuotas de estas fracciones por medio de electroforesis en gel de SDS-acrilamida desnaturalizante, seguido de tinción con azul Coomassie. Las fracciones que comprenden la proteína fosforilante de almidón en cantidad suficiente y de pureza satisfactoria se combinan y se concentran a 4ºC con la ayuda de filtración a presión. Se puede efectuar la filtración a presión, por ejemplo, con la ayuda de una celda Amicon (Amicon Ultrafiltration Cell, modelo 8010, producto nº: 5121) usando una membrana Diaflo PM30 (Millipore, producto nº: 13212) a 4ºC. Sin embargo se pueden usar también para la etapa de concentración otros procedimientos con los que están familiarizados los especialistas en la técnica.

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c) Composición de tampones usados

1

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3. Procedimiento de detección de actividad fosforilante de almidón de una proteína a) Incubación de proteínas con almidón y/o almidón no fosforilante

Para detectar si una proteína tiene una actividad fosforilante de almidón, se pueden incubar proteínas de ensayo con almidón y con nucleósido trifosfatos radiomarcados. A tal fin, se incuban aproximadamente 5 mg de almidón junto con la proteína de ensayo (0,01 \mug a 5,0 \mug por mg de almidón usado) con agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos a 30 minutos en 500 \mul de tampón de fosforilación. Después de esto se detiene la reacción añadiendo SDS a una concentración de 2% (peso/volumen). Se separan los gránulos de almidón que están presentes en la mezcla de reacción mediante centrifugación (1 minuto, 13000 x g) y se lavan una vez con 900 \mul de solución de SDS de 2% de resistencia y cuatro veces con 900 \mul en cada caso de una solución de nucleósido trifosfato 2 mM. Cada etapa de lavado se lleva a cabo durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de cada etapa de lavado se separan los gránulos de almidón del tampón de lavado en cuestión por centrifugación (1 minuto, 13000xg). Cuando se lleva a cabo un experimento para la detección de actividad de fosforilación de almidón de una proteína se deberían ensayar adicionalmente más mezclas de reacción adicionales que no comprenden proteína, o comprenden proteína inactivada, pero que por lo demás se tratan de la misma forma que las mezclas de reacción descritas, para actuar como lo que se conoce como controles.

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b) Determinación de la cantidad de residuos de fosfato incorporados en el almidón como el resultado de la actividad enzimática

Se pueden ensayar los gránulos de almidón obtenidos en la etapa a) en relación a la presencia de residuos de fosfato radiomarcados. A tal fin el almidón en cuestión se resuspende en cada caso en 100 \mul de agua, se trata en cada caso con 3 ml de cóctel de centelleo (por ejemplo, Ready Safe^{TM}, BECKMANN Coulter) y se analiza subsiguientemente con la ayuda de un contador de centelleos (por ejemplo, contador de centelleos multipropósito LS 6500, BECKMANN COULTER^{TM}).

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d) Composición de tampones usados

3

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4. Identificación de las posiciones del átomo de C de las moléculas de glucosa de un alfa-1,4-glucano, en el que se introducen residuos de fosfato con una proteína fosforilante de almidón

Se pueden detectar las posiciones de átomos de C de las moléculas de glucosa de un alfa-1,4-glucano que se fosforilan con una proteína sometiendo los glucanos obtenidos, que se han fosforilado in vitro con una proteína particular, a hidrólisis, separando subsiguientemente los monómeros de glucosa obtenidos tras la etapa de hidrólisis, seguido de la medida del fosfato que se ha incorporado con una proteína particular en fracciones específicas de las moléculas de glucosa.

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a) Hidrólisis total de los alfa-1,4-glucanos

Se centrifugan suspensiones acuosas que comprenden alfa-1,4-glucano, los agregados sedimentados se resuspenden subsiguientemente en HCl 0,7 M (Baker, calidad analítica) y se incuban durante 2 horas a 95ºC con agitación. Una vez ha finalizado la incubación se enfrían brevemente las muestras y luego se centrifugan (por ejemplo, 2 minutos, 10000 x g). Se transfiere el sobrenadante obtenido a un recipiente de reacción nuevo y se neutraliza añadiendo NaOH 2 M (Baker, calidad analítica). Si persiste un agregado, este se resuspende en 100 \mul de agua, y se determina la cantidad del fosfato marcado en el mismo para fines de control.

Se centrifuga subsiguientemente el sobrenadante neutralizado a través de un filtro de 10 kDa. Con la medida de una alícuota del filtrado obtenido se determina la cantidad de fosfato marcado en el filtrado, por ejemplo, con la ayuda de un contador de centelleos.

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b) Fraccionamiento de los hidrolizados, y determinación de las posiciones de átomos de C fosforilados

Los filtrados hidrolíticos neutralizados obtenidos en la etapa a) (aproximadamente 3000 cpm cuando se usa ATP radiomarcado) se pueden separar con la ayuda de, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico de alta presión (HPAE). Para llevar el filtrado neutralizado hasta un volumen requerido para la HPAE, este se puede diluir con H_{2}O. Además se añaden glucosa-6-fosfato (aproximadamente 0,15 mM) y glucosa 3-fosfato (aproximadamente 0,3 mM) a cada uno de los filtrados en cuestión para actuar como controles internos. La separación por medio de HPAE se puede efectuar, por ejemplo, con la ayuda de un sistema DX 600 Bio Lc de Dionex usando una columna CarboPac 100 (equipado con pre-columna adecuada) y un detector amperométrico pulsado (ED 50). Antes de que se inyecte la muestra se hace fluir la columna en primer lugar durante 10 minutos con 99% de eluyente C y 1% de eluyente D. Después de esto se inyectan en cada caso 60 \mul de volumen de muestra. Se eluye la muestra en las siguientes condiciones:

5

Los hidrolizados eluidos de la columna se recogen en fracciones individuales de 1 ml en cada caso. Debido a que la glucosa 3-fosfato no marcada (Ritte y col. 2002, PNAS 99, 7166-7171) y glucosa 6-fosfato no marcada (Sigma, producto nº: G7879) se ha mezclado con cada una de las muestra de hidrolizado inyectadas como patrones internos, tales fracciones que comprenden bien glucosa 3-fosfato o bien glucosa 6-fosfato se puede determinar por medio de detección amperométrica por pulsos. Midiendo la cantidad de fosfatos marcados en las fracciones individuales y comparando subsiguientemente con las fracciones que comprenden glucosa 3-fosfato o glucosa 6-fosfato, es posible determinar aquellas fracciones en las que está presente glucosa 6-fosfato marcado o glucosa 3-fosfato marcado. Se determinar la cantidad de fosfato marcado en la fracción en cuestión. Ahora es posible determinar la posición del átomo de C que se fosforila preferentemente con un enzima fosforilante de alfa-1,4-glucano en base a las relaciones de las cantidades, medidas para fosfato marcado, de glucosa 3-fosfato frente a glucosa 6-fosfato en los hidrolizados individuales.

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c) Tampones usados

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5. Transformación de plantas de arroz

Se transformaron plantas de arroz con el procedimiento descrito por Hiei y col. (1994, Plant Journal 6(2),
271-282).

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6. Determinación del contenido de fosfato de almidón a) Determinación del contenido en C-6-fosfato (C-6-P)

Se pueden fosforilar en almidón las posiciones C2, C3 y C6 de las unidades de glucosa. Para determinar el contenido C6-P del almidón, se hidrolizan 50 mg de almidón en 500 \mul de HCl 0,7 M durante 4 horas a 95ºC. Después de esto se centrifugan las muestras durante 10 minutos a 15500 x g y se eliminan los sobrenadantes. Se mezclan 7 \mul de los sobrenadantes con 193 \mul de tampón imidazol (imidazol 100 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM y NAD 0,4 mM). Se llevó a cabo la medida en un fotómetro a 340 nm. Después de haberse establecido una absorción básica se inició la reacción del enzima con adición de 2 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenada (de Leuconostoc mesenteorides, Boehringer Mannheim). El cambio en absorción es directamente proporcional a la concentración del contenido de G 6-P del almidón.

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b) Determinación del contenido en fosfato total

Se determinó el contenido en fosfato total con el procedimiento de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1996). 115-118).

Se generan aproximadamente 50 mg de almidón con 30 \mul de solución de nitrato de magnesio etanólico y se calcina durante tres horas a 500ºC en el horno de mufla. Se trata el residuo con 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5 M y se incuba durante 30 minutos a 60ºC. Subsiguientemente se lleva una porción de alícuota hasta 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5 M, y esto se añade a una mezcla de 100 \mul de ácido ascórbico de 10% de concentración y 600 \mul de molibdato de amonio de 0,42% de concentración en ácido sulfúrico 2 M y se incuban durante 20 minutos a 45ºC.

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c) Determinación de los contenidos en C-6-fosfato y C-3-fosfato

Para determinar el contenido de fosfato que se une en la posición C-6 y en la posición C-3 de las moléculas de glucosa de un alfa-1,4-glucano, se pueden someter los glucanos en cuestión a una hidrólisis total y luego separarse por medio de HPAE. Se pueden determinar las cantidades de glucosa 6-fosfato y glucosa 3-fosfato mediante integración de las áreas de pico individuales obtenidas tras separación por HPEA. Comparando las áreas de pico resultantes para glucosa 6-fosfato y glucosa 3-fosfato en muestras desconocidas con las áreas de pico obtenidas con cantidades conocidas de glucosa 6-fosfato y glucosa 3-fosfato tras separación por medio de HPEA, es posible determinar la cantidad de glucosa 6-fosfato y glucosa 3-fosfato en las muestras que se ensayan.

Ejemplos 1. Información en vectores y plásmidos Generación del vector de expresión ME5/6

pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7, que se deriva del vector intermediario pGSV1. pGSV1 es un derivado de pGSC1700, cuya construcción se ha descrito por parte de Comelissen y Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). Se obtuvo pGSV1 de pGSC1700 por deleción del gen de resistencia a la carbenicilina y deleción de las secuencias de ADN-T de la región ADN-TL del plásmido pTiB6S3.

PGSV7 contiene el origen de replicación del plásmido pBR322 (Bolivar y col., Gene 2, (1977), 95-113) y el origen de replicación del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh y col., Plasmid 11, (1984), 206). pGSV7 contiene adicionalmente el gen marcador seleccionable aadA, del transposón Tn 1331 de Klebsiella pneumoniae, que confiere resistencia a los antibióticos espectinomicina y estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990), 218-226; Tolmasky y Crosa, Plasmid 29(1), (1993), 31-40).

Se obtuvo el plásmido pGSV71 mediante clonación de un gen bar quimérico entre las regiones frontera de pGSV7. El gen bar quimérico contiene la secuencia promotora del virus del mosaico de la coliflor para iniciación transcripcional (Odell y col., Nature 313, (1985), 180), el gen bar de Streptomyces hygroscopicus (Thompson y col., Embo J. 6 (1987), 2519-2523) y la región no traducida 3' del gen de nopalina sintasa de ADN-T de pTiT37 para terminación transcripcional y para poliadenilación. El gen bar confiere tolerancia para el herbicida glufosinato-amonio.

El ADN-T contiene la secuencia de frontera derecha del ADN-TL del plásmido pTiB6S3 (Gielen y col., EMBO J. 3, (1984), 835-846) en posición 198-222. Se localiza una secuencia policonectora entre los nucleótidos 223-249. Los nucleótidos 250-1634 contienen la región promotora p35S2 del virus del mosaico de la coliflor (Odell y col., véase anteriormente). La secuencia de codificación del gen de resistencia a la fosfinotricina de Streptomyces hygroscopicus (bar) (Thompson y col. 1987, véase anteriormente) se encuentra dispuesto entre los nucleótidos 1635-2186. Se reemplazaron los dos codones terminarles en el extremo 5' del gen bar de tipo salvaje con los codones ATG y GAC. Se localiza una secuencia policonectora entre los nucleótidos 2187-2205. El fragmento Taql de 260 bp del extremo 3' no traducido del gen de nopalina sintasa (3' nos) del ADN-T del plásmido pTiT37 (Depicker y col., J. Mol. Appl. Genet. 1, (1982), 561-573) se encuentra localizado entre los nucleótidos 2206 y 2465. Los nucleótidos 2466-2519 contienen una secuencia policonectora. Se localiza la secuencia frontera izquierda del ADN-TL de pTiB6S3 (Gielen y col., EMBO J. 3, (1984), 835-846) entre los nucleótidos 2520-2544.

Se cortó luego el vector pGSV71 usando el enzima PstI y haciendo los extremos romos. Se escindió luego el promotor B33 y el casete ocs del vector pB33-Kan en la forma de un fragmento EcoRi-HindIII, se hicieron los extremos romos mediante llenado en los extremos e inserción en el vector pGSV71 que se ha cortado con PstI y se hicieron los extremos romos. El vector resultante (ME4/6) se usó como vector de partida para la construcción de ME5/6: un oligonucleótido que contiene los sitios de escisión EcoRI, PacI, SpeI, SrfI, SpeI, NotI, PadI y se introdujo EcoRI en el sitio de escisión de PstI del vector ME4/6 localizado entre el promotor B33 y el elemento ocs, duplicando el sitio de escisión PstI. El vector de expresión resultante se denominó ME5/6.

Generación del vector de expresión pML80

Se intercambió un fragmento de BamHI de ME5-6 por un producto de PCR que se ha extendido con algunos sitios de escisión, pero que por lo demás era idéntico, dando lugar al plásmido pUL1-17. El promotor B33, que está presente en pUL1-17, se escinde usando los enzimas de restricción HindIII y PstI, y se hicieron romos los extremos del vector y se religaron, dando lugar al vector pML18-56. Este vector se abrió con MunI y PstI, y se insertó un MCS (sitio de clonación múltiple) que tenía extremos adhesivos adecuados y que se han sintetizado por dos oligonucleótidos hibridados (GAG CTC CTA GGC TCG AGT TAA CAC TAG TAA GCT TAA TTA AGA TAT CAT TTA CA y AAT TGT AAA TGA TAT CTT AAT TAA GCT TAC TAG TGT TAA CTC GAG CCT AGG AGC TCT GCA). Se cortó el plásmido pML72-129 resultante con el enzima de restricción Bam HI, los salientes de los sitios de escisión se rellenaron con la ayuda de polimerasa de Klenow, y se ligaron los extremos romos resultantes. Esto da lugar a un sitio de escisión por restricción Cla I. El plásmido resultante se denominó pIR91-123. El promotor de ubiquitina del maíz se escindió de pML8-52 mediante digestión por restricción con los enzimas Sal I y Not I y se hicieron romos los extremos, y se clonó el fragmento resultante en el plásmido cortado Eco RV pIR91 -123. El plásmido resultante se denominó pML80-123.

Generación del vector pML8-52

Se cortó pMCS5 (MobiTec, producto nº: pMCS5) con Bgl II y BamHI y se religó. El plásmido resultante se denominó pML4-52. El terminador nos del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., J. Mol. Appl. Genet. 1, (1982), 561-573), que se había amplificado con la ayuda de oligonucleótidos PML 9 (ACT TCT GCA GCG GCC GCG ATC GTT CAA ACA TTT GGC AAT AAA GTT TC) y PML10 (TCT AAG CTT GGC GCC GCT AGC AGA TCT GAT CTA GTA ACA TAG ATG ACA CC) se clonó en este vector y en los sitios de escisión por restricción Pst I y Hind III. El plásmido resultante se denominó pML4-nos. Se clonó un fragmento Pst I de 1986 pares de bases de longitud y que comprende el promotor del gen de poliutiquitina del maíz (Acceso a banco de genes: 94464, Christensen y col., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689) y el primer intrón del mismo gen que se ha truncado por digestión con Cla I y se clonó la religadura en el vector anteriormente citado. El plásmido resultante se denominó pML8-52.

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2. Aislamiento de secuencias que codifican una proteína R3 de Arabidopsis thaliana

Se aisló por amplificación la secuencia que codifica una proteína R3 de Arabidopsis thaliana, mediante RT-PCR, de una pluralidad de secuencias de solapamiento partiendo del ARNm aislado de hojas de plantas de Arabidopsis thaliana de tres semanas de edad aproximadamente (ecotipo C24) y clonación secuencial subsiguiente de los fragmentos amplificados. Se usaron los siguientes cebadores:

Nombre: Secuencia

F1: AAG CTGCCATGGCAACCTCTAAATC

R2: AAAACTCGAGCTTAAACTTGGGGTCTAGCTTGGA

R4: CTCAGAGCCATTGGAGCACTCA

F4: CATTGCAAACAAAAGCGGTCCTTG

A tal fin se sintetizó una hebra de ADNc por medio del kit Revert Aid Minus First Strand cDNA Synthesis de transcriptasa inversa (Fermentas producto nº: EP045) y se amplificó subsiguientemente usando ADN polimerasa (Platinum Taq ADN Polimerasa de alta fidelidad; Invitrogen producto nº: 11304).

Se amplificó un fragmento de ADN de 3,2 kb aproximadamente usando 300 ng de ARN poli-A-plus con la ayuda de cebadores F1 y R4 en las siguientes condiciones de reacción:

Síntesis de primera hebra

Se usaron las condiciones y tampones especificados por el fabricante. La mezcla de reacción para la síntesis de primera hebra comprendía adicionalmente las siguientes sustancias:

300 ng: ARN poli-A-plus

0,5 \muM: cebador R2

Se llevó la mezcla de reacción hasta un volumen de 12 \mul con agua, se incubó durante 5 minutos a 70ºC y luego se enfrió en hielo.

Después de esto se añadieron 5 veces tampón de reacción (4 \mul), inhibidor de ARNasa (1 \mul) y mezcla de dNTP (2 \mul de 10 mM) y se incubó la mezcla de reacción durante 5 minutos a 37ºC. Tras la adición de transcriptasa inversa (1 \mul) tuvo lugar la síntesis de ADNc durante 60 minutos a 42ºC, antes de que se detuviese la reacción por calentamiento durante 5 minutos a 70ºC.

Condiciones para la amplificación del fragmento R3 de 3,2 kb por medio de PCR

2 \mul: de la mezcla de reacción de síntesis de primera hebra

0,6 \muM: cebador F1

0,6 \muM: cebador R4

0,4 \muM: mezcla dNTP

3 mM: MgSO_{4}

1 x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

7

Se repite 35 veces la etapa 2

Después de esto 4ºC.

Una vez se ha separado la mezcla de reacción de PCR por medio de un gel de TBE-agarosa al 0,8%, se escindió el fragmento obtenido usando una paleta quirúrgica, y se aisló el ADN mediante un kit de extracción con gel (Quiagen: producto nº: 28704). Después de esto el fragmento que se había aislado se cortó con las endonucleasas de restricción Nco I y Eco RI y se clonó en el vector de clonación pMCS5 (MobiTec, producto nº: pMCS5) que se había cortado con las mismas endonucleasas de restricción. El plásmido resultante se denominó pRS79-191. El análisis de secuencia del producto de PCR pRS79-191 que se había clonado en el plásmido RS79-191 reveló que el fragmento contenía una inserción que dio lugar a la interrupción de la secuencia de codificación. Una comparación correspondiente con la secuencia correspondiente de la base de datos NCBI y un análisis de la secuencia insertada sugirió que la inserción podría ser un intrón que no se había escindido. Debido a que no estaba claro si este intrón putativo se puede empalmar en plantas transgénicas, las etapas de clonación subsiguiente implicaron un intercambio en esta región para una secuencia "sin inserción", con lo que se restaura el marco de lectura continuo de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Para complementar la secuencia de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana en pRS79-191 se amplificó la región 3' perdida de la secuencia de codificación anteriormente citada en las condiciones de reacción detalladas más adelante, partiendo de 300 ng de ARN poli-A-plus con la ayuda de los cebadores F4 y R2:

Se sintetizó el ADNc como se describió anteriormente, excepto en que no se usó el cebador R2 pero si un oligo dT (parte del kit RT).

Se llevó a cabo la amplificación en las siguientes condiciones:

2 \mul: de la mezcla de reacción de síntesis de primera hebra

0,3 \muM: cebador F1

0,3 \muM: cebador R4

0,4 \muM: mezcla dNTP

2 mM: MgSO_{4}

1 x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

8

Se repite 40 veces la etapa 2

Después de esto 4ºC.

Después de la separación de la mezcla de PCR por medio de un gel TBE agarosa al 0,8% se escindió el fragmento de 1,7 kb resultante del gel y se aisló el ADN por medio del kit de extracción en gel (Qiagen; producto nº: 28704). Después del tratamiento con las endonucleasas de restricción Xho I y Spe I, se clonó el plásmido en el plásmido pRS79-191, que se había cortado con las mismas endonucleasas de restricción. El plásmido resultante se denominó pRS80-227.

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3. Fusión translacional de secuencias que codifican una proteína R3 con secuencias que codifican un péptido de señal plastídico

En primer lugar se amplificó la secuencia que codifica el péptido de señal plastídico del gen dull-I de Oryza sativa (variedad M202) por medio de PCR usando un clon de ADNc (pRS55-132) como templado usando los cebadores SP-Mac fwd (5'-CGA TAT CTG CAG GTT TTG GCA ATG GAG AT-3') y SP-Mac-rev (5'-CTT CGA ACA ATT CTG CTT CCA G-3') y se clonó en el vector pCR 2.1 (Invitrogen producto nº: K2000-01). El plásmido resultante se denominó pIC328-215. Se aisló el clon de ADNc pRS55-132 hibridando una biblioteca de ADNc de fago, preparada partiendo de ARN Poly-A-plus de Oryza sativa, con una sonda radioactiva que comprende secuencias que codifican una proteína dul I de maíz (acceso EMBL: TO1265; Plant Cell 10; 399-412 (1998)).

Usando el plásmido plC328-215 como templado se amplificó el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa con la ayuda de cebadores Os_dul-I_SP-Pac (5'-GAC CTT AAT TAA GGT TTT GGC AAT GGA GAT G-3') y Os_dul-I_SP__Asu (5'-GCC AGG TTT CGA ACA ATT CTG CTT CGA-3'). El cebador 5' (Os_dul-i_SP-Pac) comprendía un sitio de escisión por restricción Pac I y el cebador 3' (Os_dul-l_SP_Asu) un sitio de escisión por restricción Bst BI.

La amplificación se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 ng: pIC328-215

0,2 \muM: cebador OS_dul1_SP-PAc

0,2 \muM: cebador OS_dul1_SP-Asu

0,4 mM: mezcla dNTP

3 mM: MgSO_{4}

1x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

9

Se repite 40 veces la etapa 2

Después de esto 4ºC.

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Después de la digestión del fragmento de PCR resultante con las endonucleasas de restricción Pac I y Bst BI, se clonó el fragmento de PCR en el vector pMCS5 (MobiTec, producto nº: pMCS5) que se había cortado con las mismas endonucleasas de restricción. El plásmido resultante se denominó pAH41-227.

Después de esto se amplificó la secuencia que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana por medio de PCR usando el plásmido pRS80-191 como templado y, los cebadores At_R3_Asu (5'-AAT TGT TCG AAA CCT GGC AAC CTC TAA ATC CC-3') y R2 (véase anteriormente). Se seleccionó la secuencia del cebador 5' de modo tal que no se encontraba presente el codón de inicio de la secuencia que codifica la proteína R3 en la secuencia amplificada por medio de PCR y se introdujo un sitio de escisión por restricción Bst BI. La secuencia del cebador 3' R2 comprendía un sitio de escisión por restricción Xho I.

\newpage

La amplificación se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

20 ng: pRS80-227

0,3 \muM: cebador At_R3_Asu

0,3 \muM: cebador R2

0,4 mM: mezcla dNTP

3 mM: MgSO_{4}

1x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

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11

Se repite 40 veces la etapa 2

Después de esto 4ºC.

Se cortó el producto de PCR resultante con las endonucleasas de restricción Bst BI y Xho I y se clonó en el plásmido pAH41-227 que se había cortado con Bst BI y SaI I, lo que dio lugar al plásmido AH42-227. Se obtuvo así una secuencia en la que el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa y la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana forman un marco de lectura abierto compartido, de forma que tras transcripción y traducción se obtiene una proteína R3 condensada translacionalmente que presenta un péptido de señal
plastídico.

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4. Generación del vector de expresión de planta pAH43-227

La secuencia que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana que se fusionó con la secuencia que codifica el péptido señal plastídico del gen dul I de Oryza sativa del plásmido pAH42-227 con la ayuda de las endonucleasas de restricción Pac I y Avr II y se clonó en el plásmido pML80-123 que se había cortado con las mismas nucleadas de restricción.

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5. Generación del vector de expresión de planta pIR138-210 en el que se eliminaron las secuencias no codificantes de la región de codificación de la proteína R3

El fragmento que está presente dentro de la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana y que comprende secuencias no codificantes se eliminó del plásmido pAH43-227.

A tal fin se amplificó una secuencia parcial de la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana por medio de RT-PCR partiendo de ARNm aislado de hojas de plantas de Arabidopsis thaliana de aproximadamente tres semanas de edad (ecotipo C24).

Se usaron los siguientes cebadores:

Nombre: Secuencia

F1: AAGCTGCCATGGCAACCTCTAAATC

R5: CCAAGATATTTTGCAGTAGGCTGT

Se llevó a cabo la síntesis de primera hebra como se describe anteriormente (ejemplo, punto 2).

\newpage

Se amplificó el fragmento deseado en las siguientes condiciones:

2 \mul: de la mezcla de reacción de síntesis de primera hebra

0,3 \muM: cebador F1

0,3 \muM: cebador R5

0,4 \muM: mezcla dNTP

3 mM: MgSO_{4}

1 x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

12

Se repite 40 veces la etapa 2.

Después de esto 4ºC.

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Debido a que la inserción presente en los plásmidos pRS79-191, pRS80-227, AH42-227 y AH43-227 (intrón putativo) presenta un sitio de escisión por restricción Ssp I, la secuencia parcial de la región de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana, que se ha amplificado por medio de PCR se digirió en primer lugar con la endonucleasa de restricción Ssp I y se purificaron subsiguientemente fragmentos no digeridos (sin inserción) por medio de un gel de agarosa. Después de esto se cortó el fragmento purificado con las endonucleasas de restricción Bam HI y Spe I y se intercambió para el fragmento Bam HII Spe I correspondiente (que comprende, entre otros las secuencias de no codificación) del plásmido pAH43-227. El plásmido resultante se denominó pIR138-210.

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6. Generación del vector de expresión de planta pIR139-210 en el que la secuencia de codificación de la proteína R3 no tiene péptido señal plastídico

Usando el plásmido pIR138-210 como templado, se amplificó una secuencia parcial que codifica la región 5' de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana por medio de PCR con la ayuda de los cebadores IR138-F1 (5'-AAT TAA CTT AAT TAA TCC ATG GCA ACC TCT AAA TCC CAA CAA T-3') y IR138-R2 (5'-AAT TAC TTG GAT CCC GCA ACT CAA GGA TCA CTA CAT ATG CA-3'). El cebador 5' (IR138-F1) comprendía un sitio de escisión por restricción Pac I y la secuencia del codón de inicio original de la proteína R3. El cebador 3' (IR138-R2) comprendía la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción BamHI.

Se llevó a cabo la amplificación en las siguientes condiciones:

50 ng: plásmido IR138-210

0,5 \muM: cebador IR138-F1

0,5 \muM: cebador IR138-R2

2 mM: MgSO_{4}

0,3 mM: mezcla dNTP

1 x: tampón de reacción

1,25 unidades platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad

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Condiciones de reacción

13

Se repite 30 veces la etapa 2

Después de esto 4ºC.

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El fragmento de 247 bp amplificado se cortó con las endonucleasas de restricción de Pac I y Bam HI y se reemplazó con el fragmento Pac IIBam H I que está presente en el plásmido pIR138-210 y que comprende el péptido señal plastídico del gen dull I de Oryza sativa y parte de la secuencia 5' que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana. El plásmido resultante se denominó pIR139-210. La secuencia de codificación de la proteína R3 de Arabidopsis thaliana comprende el codón de inicio que es originalmente del ADNc, por el contrario a la secuencia que está comprendida en el plásmido pIR138-210 y AH43-227.

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7. Transformación de plantas de arroz

Se transformaron plantas de arroz (variedad M202) con el plásmido pIR138-210 o con el plásmido pIR139-210 por medio de agrobacterias (que comprenden el plásmido pIR138-210 o pIR139-210) usando el procedimiento descrito por Hiei y col. (1994, Plant Journal 6(2), 271-282).

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8. Análisis de las plantas de arroz transgénicas a) Plantas de arroz que se han transformado con el plásmido pIR138-210 y que expresaban una proteína R3 de Arabidopsis thaliana en fusión con un péptido señal plastídico

Se usó análisis por RT-PCR para la identificación de plantas con expresión de ARNm que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Se cultivaron plantas que, en comparación con plantas de tipo salvaje correspondientes, comprenden una cantidad detectable de ARNm que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana en invernadero. Se cosecharon granos de estas plantas. Almidón aislado de estos granos maduros mostraron un mayor contenido en fosfato que se unió de forma covalente con el almidón en cuestión en comparación con almidón aislado de granos de plantas de tipo salvaje correspondientes.

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b) Plantas de arroz que se transformaron con el plásmido pIR139-210 y se expresaron en proteína R3 de Arabidopsis thaliana

Usando análisis por RT-PCR cuantitativo fue posible identificar plantas que expresan ARNm que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Se cultivaron plantas que, en comparación con plantas de tipo salvaje correspondientes, comprenden una cantidad detectable de ARNm que codifica la proteína R3 de Arabidopsis thaliana en invernadero. Se cosecharon granos de estas plantas. Almidón aislado de estos granos maduros mostraron un contenido significativamente mayor en fosfato que se unió de forma covalente con el almidón en cuestión en comparación con almidón aislado de granos de plantas de tipo salvaje correspondientes.

<110> Bayer CropScience GmbH

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<120> Plantas con mayor actividad plastídica de un enzima fosforilante de almidón

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<130> BCS 04-5008-PCT

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<150> EP 04090316.3

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<151> 2001-08-18

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<150> US 60/602.454

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<151> 2004-08-18

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<160> 4

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 3837

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 1

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14

15

16

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<210> 2

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<211> 3987

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que contiene la región de codificación de la secuencia de señal plastídica del gen dul-I de Oryza sativa condensado con el ADNc que codifica el gen R3 de Arabidopsis thaliana

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<220>

<221 > CDS

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<222> (1)..(3984)

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<223> secuencia de codificación de la secuencia artificial

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<220>

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<221> sig_péptido

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<222> (1)..(147)

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<223> secuencia de codificación del péptido de señal plastídico del gen dul-I de Oryza sativa

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<220>

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<221> mat_péptido

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<222> (154)..()

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<223> secuencia de codificación del péptido maduro del gen R3 (GWD-3) de Arabidopsis thaliana que pierde el codón de inicio natural metionina

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<400> 2

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17

18

19

20

21

22

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<210> 3

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<211> 1328

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 3

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23

24

25

26

27

28

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<210> 4

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 4

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\hskip1cm29

Claims

1. Una célula de planta modificada genéticamente en la que los plástidos presentes en dicha célula de planta comprenden una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, consistiendo la modificación genética en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula de planta, seleccionándose la molécula de ácido nucleico extraña del grupo constituido por

2. La célula de planta como se reivindica en la reivindicación 1 que sintetiza un almidón modificado en comparación con células de plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes, en las que el almidón modificado comprende un mayor contenido de fosfato en almidón y/o una distribución de fosfato modificada.

3. Una planta que comprende células de planta modificadas genéticamente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

4. La planta que se reivindica en la reivindicación 3, que es una planta que almacena almidón.

5. Material de reproducción de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4, que comprende una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

6. Una parte de planta cultivable de una planta que se reivindica en las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Un procedimiento de generación de una planta modificada genéticamente, en la que

b): se regenera una planta a partir de células de planta de la etapa a); y

8. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la etapa de extraer el almidón de una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o extraer el almidón de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4.

9. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la etapa de extraer el almidón de partes de plantas cultivables como se reivindica en la reivindicación 6.

10. Un procedimiento para la producción de harinas que comprende la etapa de moler partes de plantas como se reivindican en la reivindicación 3 ó 4 o de material de reproducción como se reivindica en la reivindicación 5 o material cultivable como se reivindica en la reivindicación 6.

11. El uso de un célula de planta modificada genéticamente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4 para la producción de una harina.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, seleccionada del grupo constituido por

d): una molécula de ácido nucleico que presenta al menos 70% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en a) o c);

y en la que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en el ácido nucleico recombinante, donde la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón se condensa con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico.

13. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12.

14. El vector que se reivindica en la reivindicación 13, en el que la molécula de ácido nucleico se une con secuencias regulatorias que inician la transcripción en células procarióticas o eucarióticas.

15. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12, o un vector como se reivindica en la reivindicación 13 ó 14.

16. Una composición que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12, o un vector como se reivindica en la reivindicación 13 ó 14.

17. El uso de una composición como se reivindica en la reivindicación 16 para identificación de células de plantas que, en comparación con células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente muestran una mayor actividad de una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón.

18. Una proteína con actividad fosforilante del almidón seleccionada del grupo constituido por

a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3;

b): una proteína que presenta al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos de las proteínas citadas en a), condensada con secuencias de aminoácidos que codifican un péptido se señal plastídico.

19. Una proteína recombinante que comprende secuencias de aminoácido que codifican una proteína de acuerdo con la reivindicación 18 condensada con secuencias de aminoácido que codifican un péptido señal plastídico.

20. La proteína que se reivindica en la reivindicación 18 ó 19, que tiene un dominio de fosfohistidina.