ES2338443T3 - Plantas resistentes al estres. - Google Patents

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Abstract

Un método para obtener una planta con una resistencia aumentada al estrés, que comprende a. introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente: i. Un promotor expresable en plantas; ii. Una región de ADN que codifica una enzima de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido procedente de una levadura o de hongos, estando seleccionada dicha enzima entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa; iii. Una región del extremo 3'', implicada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación; b. regenerar dichas células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas; c. seleccionar una planta, a partir de dicha población de plantas transgénicas, que exhiba una resistencia aumentada al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar.

Description

Plantas resistentes al estrés.
Se proporcionan unos métodos para aumentar la resistencia al estrés en plantas y células de plantas, con los que las enzimas implicadas en la ruta de síntesis de salvación del NAD (dinucleótido de nicotinamida y adenina) y/o en la ruta de síntesis de novo del NAD son expresadas en plantas.
La tolerancia de ciertas plantas frente a condiciones desfavorables de crecimiento, incluyendo sequía, altas intensidades de luz, altas temperaturas, limitaciones de nutrientes, condiciones salinas de crecimiento y similares, es una propiedad muy deseada para plantas cultivadas, a la vista de la demanda, que nunca termina, de aumentar definitivamente el rendimiento real de estas plantas.
Se han descrito diversas maneras de alcanzar esta meta de mejorar lo que corrientemente se conoce como la resistencia al estrés o la tolerancia al estrés de plantas. Puesto que unas diferentes condiciones de estrés abiótico dan como resultado frecuentemente la generación de perjudiciales especies oxigenadas reactivas ("ROS", acrónimo de Reactive Oxygen Species), tales como superóxidos o peróxidos de hidrógeno, los intentos iniciales de mejorar la resistencia al estrés en plantas se enfocó en la prevención de la generación de las ROS o en la eliminación de las mismas. Ejemplos de estos enfoques son una sobreexpresión de enzimas depuradoras de las ROS tales como catalasas, peroxidasas, superóxido dismutasas, etc., o incluso aumentar la cantidad de moléculas depuradoras de las ROS tales como ácido ascórbico, glutatión, etc. Estos enfoques y otros intentos de tratar por ingeniería genética a plantas tolerantes al estrés, se recopilan, p. ej., en la cita de Wang y colaboradores, 2003, Planta
218:1-14.
Una tolerancia al estrés en las células de plantas y las plantas se puede conseguir también reduciendo la actividad o el nivel de las poli-ADP-ribosa polimerasas (ParP) o de las poli(ADP-ribosa) glicohidrolasas (ParG) endógenas, tal como se describe en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 00/04173 y WO 2004/090140, respectivamente. Se cree que, de esta manera, un agotamiento fatal del NAD y ATP en células de plantas sometidas a unas condiciones de estrés, que dan como resultado una muerte traumática de las células, se puede evitar o posponer de una manera suficiente para que las células estresadas sobrevivan y se aclimaten a las condiciones de
estrés.
Uchimiya y colaboradores (2002) describen el aislamiento de un gen de arroz designado como YK1, así como el uso de un gen YK1 quimérico para aumentar la tolerancia de plantas de arroz transgénicas, que albergan ese gen, al tizón del arroz y a diversos estreses abióticos, tales como NaCl, UV-C, sumergencia y peróxido de hidrógeno. (Uchimiya y colaboradores, 2002, Molecular breeding (crianza molecular) 9: 25-31).
Uchimiya y colaboradores publicaron además un resumen de cartel que describe que una sobreexpresión de un gen de reductasa dependiente del NAD (YK1) en células de arroz también activaba y favorecía el nivel del NAD(P)(H) mediante regulación en sentido ascendente de las actividades del NAD, y sacaron la conclusión de que esta modificación, a su vez, generaba una agrupación de sustancias redox que se necesitan para una resistencia al estrés causado por las ROS (Uchimiya y colaboradores 2003 Keystone symposium on Plant biology: Functions and control of cell death (simposio de Keystone sobre biología vegetal. Funciones y control de la muerte celular), Snowbird Utah 10-15 de Abril, 2003).
Una NAD sintetasa procedente de una levadura ha sido bien caracterizada y es la última enzima tanto en la ruta de síntesis de novo del NAD como en la ruta de salvación del NAD (véase la Figura1). En la ruta de novo, un quinolato es el precursor para la síntesis del NAD y es generado como un producto de degradación del triptófano. En la ruta de salvación, la nicotinamida (que es un producto de degradación del NAD, generado a través de la acción de diversas enzimas tales como las PARP, desacetilasas dependientes del NAD u otras glicohidrolasas del NAD) es la molécula precursora. En una primera operación, la nicotinamida es desamidada mediante una nicotinamidasa para formar ácido nicotínico. El ácido nicotínico es transferido a un 5-fosforribosil-1-pirofosfato por la enzima nicotinato fosforribosiltransferasa para proporcionar un ácido nicotínico mononucleótido. Este compuesto es compartido entre la ruta de novo y la ruta de salvación. Por lo tanto, una conversión ulterior de este compuesto mediante una NAD+ pirofosforilasa y una NAD sintetasa se consigue igual a como en la ruta de novo.
En una levadura, una sobreexpresión de PNC1 (que codifica la nicotinamidasa) ha sido correlacionada con una prolongación de tramos de vida por restricción de calorías y con un estrés de baja intensidad (Anderson y colaboradores, 2003 Nature 423: páginas 181-185; Gallo y colaboradores, 2004, Molecular and Cellular Biology 24: 1301-1312).
Se sabe poco acerca de las respectivas enzimas de las rutas de biosíntesis del NAD en plantas. Hunt y colaboradores, 2004, describen el uso de la información genómica disponible a partir de Arabidopsis con el fin de identificar los homólogos vegetales (en plantas) de estas enzimas (Hunt y colaboradores, 2004, New Phytologist 163(1): 31-44). Las secuencias de DNA identificadas tienen los siguientes números de acceso: para la nicotinamidasa: At5g23220; At5g23230 y At3g16190; para la nicotinato fosforribosiltransferasa: At4g36940, At2g23420, y para la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa: At5g55810 y para la NAD sintetasa: At1g55090.
Se requieren todavía unos métodos alternativos para aumentar la tolerancia al estrés en plantas, y las formas de realización que se describen aquí a continuación, incluyendo a las reivindicaciones, proporcionan tales métodos y medios.
Sumario del invento
En una forma de realización del invento, se proporciona un método para obtener una planta con una aumentada resistencia al estrés, que comprende introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, con lo cual el gen químerico comprende los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
i.
Un promotor expresable en plantas;
ii.
Una región de ADN que codifica una enzima, funcional en plantas, de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido a partir de una levadura o de hongos, que se selecciona entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa;
iii.
Una región en el extremo 3', que está implicada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación,
seguido por regenerar las células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas; y seleccionar una planta, a partir de la población de plantas transgénicas, que exhiba una aumentada resistencia al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar. La región de ADN puede codificar una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.:2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.:6; SEQ ID No.:8, SEQ ID No.:10.
En otra forma de realización, el invento se refiere a los genes quiméricos que se describen aquí, a células de plantas que comprenden estos genes quiméricos, y a plantas que se componen esencialmente de células de plantas que comprenden estos genes quiméricos, y a semillas de dichas plantas. Estas plantas y células de plantas pueden ser caracterizadas porque ellas tienen un más bajo nivel de especies oxigenadas reactivas en condiciones de estrés que una planta similar que no comprende uno de tales genes quiméricos.
En todavía otra forma de realización, el invento se refiere al uso de los genes quiméricos que se han descrito, con el fin de aumentar la resistencia al estrés de una planta o de disminuir el nivel de especies oxigenadas reactivas en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés.
El invento proporciona además el uso de una secuencia de ADN que codifica una enzima, funcional en plantas, de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido, que se selecciona entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa, tal como una secuencia de ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 6; SEQ ID No.:8, SEQ ID No.:10, con el fin de aumentar la resistencia al estrés de una planta o disminuir el nivel de especies oxigenadas reactivas o mantener el nivel de NADH en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación esquemática de la ruta de salvación del NAD y de la ruta de síntesis del NAD de novo, tal como se conocen en una levadura de panadero (Saccharomyces cerevisiae).
Las Figuras 2 hasta 11 son unas representaciones esquemáticas de los diversos vectores de ADN-T (ADN de transferencia) que comprenden unas regiones de ADN que codifican una enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD o de la ruta de síntesis de novo del NAD bajo el control de unos elementos de control expresables en plantas. Las abreviaturas usadas son: RB: borde derecho del ADN-T; 3'35S: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación procedente del transcrito de 35S del CaMV; Cab22L: secuencia delantera no traducida del transcrito de Cab22L; P35S2: promotor 35S del CaMV; 3'g7: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación procedente del gen 7 del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens; bar: región de codificación de fosfinotricina acetil transferasa; pSSUAra promotor del transcrito de la subunidad pequeña de Rubisco procedente de Arabidopsis; LB: borde izquierdo del ADN-T; Sm/Sp: gen de resistencia a espectinomicina y estreptomicina; pVS1ori: origen de VS1 apropiado para una replicación en Agrobacterium; ColE1: origen de replicación; NLS: señal de localización nuclear; PNC1: región de ADN que codifica una nicotinamidasa procedente de Saccharomyces cerevisiae; npt1: la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae; nma1: ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 procedente de Saccharomyces cerevisiae; nma2: ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 procedente de Saccharomyces cerevisiae; qns1: NAD sintetasa (QNS1) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
Descripción detallada
El presente invento se basa en el descubrimiento de que unas secuencias de ADN que codifiquen enzimas funcionales en plantas procedentes de la ruta de salvación del NAD en levaduras, se podrían usar para obtener plantas transgénicas que fuesen más resistentes al estrés, particularmente al estrés abiótico, que unas plantas que no comprendan esta secuencia de ADN. Las plantas transgénicas exhiben también un nivel significativamente reducido de especies oxigenadas reactivas ("ROS") y mantenía un alto nivel del NADH, cuando se pone en condiciones estrés comparado con plantas testigos.
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Por lo tanto, en una forma de realización del invento, se proporciona un método para obtener una planta con una resistencia aumentada al estrés, en que el método comprende las operaciones de:
-
introducir un gen quimérico resistente al estrés, como aquí se describe, dentro de las células de una planta para obtener unas células que comprende el gen quimérico resistente al estrés;
-
regenerar estas células que comprenden el gen quimérico resistente al estrés para obtener una población de plantas que comprenden el gen quimérico resistente al estrés; y
-
seleccionar una planta procedente de la población de estas plantas, que exhiba una resistencia aumentada al estrés y/o un nivel disminuido de ROS en condiciones de estrés y/o mantenga un alto nivel del NADH, cuando se compare con una planta no transgénica similar.
El gen quimérico resistente al estrés comprende por lo tanto un promotor expresable en plantas, enlazado operativamente a una región de ADN que codifica una enzima, funcional en plantas, de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido, seleccionada entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosil-transferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa, y a una región del extremo 3' implicada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación.
Como se usa en el presente contexto, "una enzima, funcional en plantas, de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido" es una enzima que, cuando es introducida en plantas, enlazada a unos apropiados elementos de control, tales como una región de promotor y de terminador expresable en plantas, puede ser transcrita y traducida para proporcionar una enzima de la ruta de síntesis de salvación del NAD, que es funcional en células de plantas. Se describen las enzimas (y los genes de codificación) procedentes de la síntesis de salvación del NAD, que se obtienen a partir de una fuente vegetal, pero también las enzimas obtenidas a partir de una levadura (Saccharomyces cerevisiae) o partir de otras levaduras u otros hongos. Se cree que estas últimas proteínas pueden ser incluso más apropiadas para los métodos de acuerdo con el invento, puesto que éstas son menos susceptibles de estar sujetas a la regulación de retroalimentación enzimática, etc., a las que pueden estar sujetas una similares enzimas derivadas de plantas.
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Las enzimas implicadas en la ruta de síntesis de salvación del NAD comprenden las siguientes:
-
La nicotinamidasa (EC 3.5.1.19) que cataliza la hidrólisis del grupo amido de la nicotinamida; liberando de esta manera un nicotinato y NH_{3}. La enzima es conocida también como nicotinamida desaminasa, nicotinamida amidasa, YNDasa o nicotinamida amidohidrolasa;
-
La nicotinato fosforribosiltransferasa (EC 2.4.2.11), también conocida como niacina ribonucleotidasa, ácido nicotínico mononucleótido glicohidrolasa; ácido nicotínico mononucleótido pirofosforilasa; o ácido nicotínico fosforribosiltransferasa, que cataliza la siguiente reacción
Nicotinato D-ribonucleótido + difosfato = nicotinato + 5-fosfo-\alpha-D-ribosa 1-difosfato
-
La nicotinato nucleótido adenililtransferasa, (EC 2.7.7.18), también conocida como desamido-NAD+ pirofosforilasa; nicotinato mononucleótido adenililtransferasa; desaminonicotinamida adenina dinucleótido pirofosforilasa; NaMTATasa; o ácido nicotínico mononucleótido adenililtransferasa, que cataliza la siguiente reacción
ATP + nicotinato ribonucleótido = difosfato + desamido-NAD^{+}
-
La NAD-sintasa (EC 6.3.1.5), también conocida como NAD sintetasa; NAD^{+} sintasa; nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa; o difosforidina nucleótido sintetasa, que cataliza la siguiente reacción
Desamido-NAD^{+} + ATP + NH_{3} = AMP + difosfato + NAD^{+}
En una forma de realización del invento, las regiones de codificación, que codifican las diferentes enzimas de la ruta de salvación del NAD, comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica unas proteínas con las secuencias de aminoácidos que se exponen en SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8 o 10, tal como las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7 o 9.
Sin embargo, quedará puesto en claro que unas variantes de estas secuencias de nucleótidos, que incluyan inserciones, deleciones y sustituciones de las mismas, se pueden usar también para obtener el mismo efecto. Igualmente, se pueden usar ciertos homólogos de las mencionadas secuencias de nucleótidos procedentes de especies diferentes de Saccharomyces cerevisiae.
Unas variantes de las secuencias de nucleótidos que se han descrito, tendrán una identidad entre secuencias que será preferiblemente de al menos alrededor de 80%, o de 85 o 90% o 95%, con unas secuencias de nucleótidos identificadas que codifican unas enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD, tales como las que se identifican en la lista de secuencias. Preferiblemente, estas variantes codificarán unas proteínas funcionales con la misma actividad enzimática que las enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD. Para la finalidad de este invento, la "identidad entre secuencias" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias, alineadas de una manera óptima, que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones que se han comparado. Un intersticio, es decir una posición en una alineación en la que está presente un residuo, en una secuencia pero no en la otra, es considerado como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias es realizada por el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). La anterior alineación de secuencias asistida por ordenador, se puede realizar convenientemente usando un programa lógico (software) clásico, tal como el GAP que es parte del paquete de Wisconsin Package Versión 10.1 (de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.) usando la matriz de calificación por defecto con una penalización por creación de un intersticio de 50 y una penalización por prolongación de un intersticio
de 3.
Unas secuencias de nucleótidos, que son homólogas con las secuencias de nucleótidos que codifican una enzima procedente de la ruta de salvación del NAD en una levadura, o que codifican una enzima homóloga procedente de un organismo diferente de una levadura, se pueden identificar por medio de un análisis en ordenador (in silico) de datos genómicos, como se ha descrito por Hunt y colaboradores (véase más arriba).
Una secuencia homóloga de nucleótidos se puede identificar y aislar también por una hibridación en condiciones rigurosas, utilizando como sondas unas secuencias de nucleótidos identificadas, que codifican unas enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD, tales como las que se identifican en la lista de secuencias.
"Las condiciones rigurosas de hibridación" como se usan en el presente contexto significan que una hibridación se realizará generalmente si hay una identidad entre secuencias de por lo menos un 95% y preferiblemente de por lo menos un 97% entre la sonda y la secuencia diana. Ejemplos de condiciones rigurosas de hibridación son una incubación durante una noche en una solución que comprende 50% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (de pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, 20 \mug/ml de un ADN portador cortado y desnaturalizado, tal como un ADN de esperma de salmón, seguido por un lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC, preferiblemente dos veces durante alrededor de 10 minutos. Otras condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y se ilustran en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular; un manual de laboratorio]. Segunda edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente en el capítulo 11.
Dichas secuencias variantes se pueden obtener también mediante una amplificación de ADN usando como cebadores unos oligonucleótidos que son específicos para genes que codifican enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD, tales como, pero sin limitarse a, unos oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos seleccionados entre las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 o su complemento.
Los métodos del invento se pueden usar para obtener unas plantas que son tolerantes a diferentes clases de condiciones que inducen un estrés, particularmente condiciones de estrés abiótico, que incluyen sumergencia, condiciones de luz alta, altos niveles de radiación de UV, niveles aumentados de peróxido de hidrógeno, condiciones de sequía, temperaturas altas o bajas, condiciones de salinidad aumentada. Los métodos del invento se pueden usar también para reducir el nivel de las ROS en las células de unas plantas que crecen en condiciones desfavorables, particularmente condiciones de estrés abiótico, que incluyen sumergencia, condiciones de luz alta, altos niveles de radiación de UV, niveles aumentados de peróxido de hidrógeno, condiciones de sequía, temperaturas altas o bajas, condiciones de salinidad aumentada, etc. El nivel de las ROS o el nivel del NADH se puede determinar usando los métodos que son conocidos en la especialidad, incluyendo a los que se describen en el Ejemplo 3.
Usando los métodos que aquí se describen, se pueden obtener unas plantas en las que el nivel de las ROS es igual o más bajo que en plantas testigos en condiciones no estresadas, tales como, pero sin limitarse a, una luz baja. En estas plantas, en condiciones no estresadas, el nivel de las ROS puede fluctuar entre 50% y 100% del nivel de plantas testigo en condiciones de luz baja, más particularmente desde aproximadamente 60% hasta aproximadamente 85%. El nivel de las ROS en estas plantas en condiciones de estrés es de aproximadamente 50% a 80% del nivel de las ROS en plantas testigos en condiciones de estrés, lo que corresponde a aproximadamente 60 hasta 80% del nivel de las ROS en plantas testigos en condiciones no estresadas. Similarmente, el nivel del NADH en estas plantas es igual o más alto que en plantas testigos en condiciones no estresadas, tales como, pero sin limitarse a, una luz baja. En estas plantas, en condiciones no estresadas, el nivel del NADH puede fluctuar entre 100% y 160% del nivel del NADH en plantas testigo en condiciones de luz baja, más particularmente desde alrededor de 120% a alrededor de 140%. El nivel del NADH en estas plantas en condiciones de estrés es de aproximadamente 200 a 300% del nivel del NADH en plantas testigos en condiciones de estrés, lo que corresponde a aproximadamente 100 hasta 160% del nivel de las ROS en plantas testigos en condiciones no estresadas.
Los métodos para obtener plantas transgénicas no son estimados como críticos para el presente invento, y se puede usar cualquier método de transformación y de regeneración que se adecue para una especie particular de plantas. Dichos métodos son bien conocidos en la especialidad e incluyen una transformación mediada por Agrobacterium, un suministro con pistola de partículas, una microinyección, una electroporación de células intactas, una transformación de protoplastos mediada por un poli(etilenglicol), una electroporación de protoplastos, una transformación mediada por liposomas, una transformación mediada por monocristales (whiskers) de silicio, etc. Las células transformadas, que se han obtenido de esta manera, pueden entonces ser regeneradas para dar plantas fértiles
maduras.
La planta transformada, que se ha obtenido, puede usarse en un esquema de crianza convencional para producir más cantidad de plantas transformadas con las mismas características o para introducir el gen quimérico de acuerdo con el invento en otras variedades de la misma especie de plantas o de una especie afín, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas contienen los genes quiméricos del invento como un inserto genómico estable y son abarcadas también por el invento.
Quedará puesto en claro que los diferentes genes quiméricos resistentes al estrés, que aquí se describen, con unas regiones de ADN que codifican diferentes enzimas procedentes de la ruta de salvación del NAD, pueden ser combinados dentro de una célula de planta o dentro de una planta, para aumentar aun más la tolerancia al estrés de las plantas que comprenden los genes quiméricos. Por lo tanto, en una forma de realización del invento, se proporcionan unas células de plantas y unas plantas que comprenden por lo menos dos genes quiméricos resistentes al estrés, cada uno de los cuales comprende una diferente región de codificación.
Las células de plantas transgénicas y los linajes de plantas de acuerdo con el invento pueden comprender además unos genes quiméricos que reducirán la expresión de los genes PARP y/o PARG endógenos, como se describen en los documentos WO 00/04173 y WO 2004/090140.
Estos genes quiméricos adicionales se pueden introducir p.ej. cruzando los linajes de plantas transgénicas del presente invento con unas plantas transgénicas que contienen genes quiméricos que reducen la expresión de los genes PARP y/o PARG. Se pueden obtener también células de plantas o linajes de plantas transgénicas introduciendo o transformando los genes quiméricos del invento dentro de células de plantas transgénicas, que comprenden los genes quiméricos que reducen la expresión de los genes PARP o PARG o viceversa.
Para la finalidad del invento, el promotor es un promotor expresable en plantas. Como se usa en el presente contexto, el concepto "promotor expresable en plantas" significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula de planta. Esto incluye cualquier promotor con origen vegetal, pero también cualquier promotor que no tiene origen vegetal, que es capaz de dirigir una transcripción en una célula de planta, es decir ciertos promotores de origen vírico o bacteriano, tales como el CaMV35S (Harpster y colaboradores, 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190), el promotor del virus del trébol subterráneo nº 4 o nº 7 (documento WO 9606932 o promotores de genes de ADN-T, pero también unos promotores que son específicos para tejidos o específicos para órganos, que incluyen, pero no se limitan a, promotores que son específicos para semillas (p.ej. el documento WO 89/03887), promotores que son específicos para primordios de órganos (An y colaboradores 1996, The Plant Cell 8, 15-30), promotores que son específicos para tallos (Keller y colaboradores 1988, EMBO J. 7, 3625-3633), promotores que son específicos para hojas (Hudspeth y colaboradores 1989, Plant Mol Biol 12, 579-589), promotores que son específicos para mesófilos (tales como los promotores Rubisco inducibles por luz), promotores que son específicos para raíces (Keller y colaboradores, 1989, Genes Devel. 3, 1639-1646), promotores que son específicos para tubérculos (Keil y colaboradores, 1989, EMBO J. 8, 1323-1330), promotores que son específicos para tejidos vasculares (Peleman y colaboradores 1989, Gene 84, 359-369), promotores que son selectivos para estámenes (documentos WO 89/10396, WO 92/13956), promotores que son específicos para zonas con dehiscencia (documento WO 97/13865) y otros similares.
Los genes quiméricos del invento pueden estar equipados con una señal de localización nuclear ("NLS", acrónimo de Nuclear Localization Signal) que es funcional en plantas, enlazada operativamente con la región de ADN que codifica una enzima de la ruta de salvación del NAD, tal como la NLS de SV40.
Habiendo leído este documento, una persona experta en la especialidad comprobará inmediatamente que se pueden obtener unos efectos similares con respecto a una resistencia aumentada al estrés, cuando se obtienen unas variantes naturales de las plantas, en las que los genes endógenos que codifican enzimas de la ruta de salvación del NAD son más activos o son expresados a un nivel más alto. Dichas plantas variantes se pueden obtener sometiendo a una población de plantas a una mutagénesis, tal como, pero sin limitarse, a una mutagénesis con EMS (metano sulfonato de etilo), seguida por un escrutinio en cuanto a una actividad aumentada de una cualquiera de las enzimas de la ruta de salvación del NAD, o una combinación de las mismas.
Quedará también inmediatamente puesto en claro que una población de diferentes variedades, o cultivares, se puede escrutar en cuanto a una tolerancia aumentada a las condiciones de estrés que antes se han mencionado, en general o en particular estreses abióticos seleccionados, seguido por una correlación de la tolerancia aumentada a las condiciones de estrés con la presencia de un alelo particular de uno cualquiera de los genes endógenos que codifican una enzima seleccionada entre las enzimas de la ruta de salvación del NAD. Dichos alelos pueden ser entonces introducidos en una planta que interese por cruce, si las especies son sexualmente compatibles, o pueden ser identificados usando técnicas convencionales como las que aquí se describen (incluyendo una hibridación o una amplificación por PCR (= reacción en cadena de la polimerasa)) y se pueden introducir usando una tecnología de ADN recombinante. La introducción de alelos particularmente deseados usando técnicas de crianza, puede ser vigilada usando unos marcadores moleculares que son específicos para los alelos que interesan.
Los métodos y medios que aquí se describen son considerados como apropiados para todas las células de plantas y todas las plantas, tanto células de plantas como plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, que incluyen pero no se limitan a, algodón, hortalizas del género Brassica, colza de semillas oleaginosas, trigo, maíz o maíz dulce, cebada, girasoles, arroz, avena, caña de azúcar, soja, hortalizas (incluyendo achicoria, lechuga y tomate), tabaco, patata, remolacha azucarera, papaya, piña, mango, Arabidopsis thaliana, pero también plantas usadas en horticultura, floricultura o en el sector forestal.
Tal como se usa aquí, el concepto de "que comprende" ha de interpretarse como que especifica la presencia de las características, integrantes, operaciones o componentes especificados que aquí se refieren, pero no excluyen la presencia o la adición de una o más características, integrantes, operaciones o componentes, o grupos de la/los mismos. Por lo tanto, p.ej. un ácido nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los que se citan realmente, es decir pueden estar embebidos en un ácido nucleico o una proteína de mayor tamaño. Un gen quimérico que comprende una región de ADN que está definida funcional o estructuralmente, puede comprender regiones adicionales de ADN, etc.
Los siguientes Ejemplos no limitativos describen la construcción de genes quiméricos para aumentar la resistencia al estrés en células de plantas y en plantas, y el uso de dichos genes.
A menos que se señale otra cosa distinta en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos clásicos, tal como se describen en la obra de Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: un manual de laboratorio], segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de la obra de Ausubel y colaboradores, (1994) Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], Current Protocols, EE.UU. Materiales y métodos clásicos para un trabajo molecular en plantas se describen en la obra Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicadas conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Otras referencias a técnicas de biología molecular clásicas incluyen las obras de Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (Reino Unido). Materiales y métodos clásicos para reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en las obras de Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual [Cebadores para PCR, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press, y de McPherson y colaboradores (2000) PCR - Basics: From Background to Bench [Nociones básicas: desde los fundamentos a la mesa de trabajo], primera edición, editorial Springer,
Alemania.
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A lo largo de la memoria descriptiva y de los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias;
SEQ ID No. 1:
secuencia de nucleótidos de la nicotinamidasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (PNC1).
SEQ ID No. 2:
secuencia de aminoácidos de la nicotinamidasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (PNC1).
SEQ ID No. 3:
secuencia de nucleótidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (NPT1) (complemento)
SEQ ID No. 4:
secuencia de aminoácidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (NPT1)
SEQ ID No. 5:
secuencia de nucleótidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 (NMA1) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 6:
secuencia de aminoácidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 (NMA1) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 7:
secuencia de nucleótidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 (NMA2) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 8:
secuencia de aminoácidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 (NMA2) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 9:
secuencia de nucleótidos de la NAD sintetasa (QNS1) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 10:
secuencia de aminoácidos de la NAD sintetasa (QNS1) procedente de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 11:
secuencia de nucleótidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 1).
SEQ ID No. 12:
secuencia de aminoácidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 1).
SEQ ID No. 13:
secuencia de nucleótidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 2).
SEQ ID No. 14:
secuencia de aminoácidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 2).
SEQ ID No. 15:
secuencia de nucleótidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 3).
SEQ ID No. 16:
secuencia de aminoácidos de la nicotinamidasa procedente de Arabidopsis thaliana (isofor- ma 3).
SEQ ID No. 17:
secuencia de nucleótidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana (isoforma 1).
SEQ ID No. 18:
secuencia de aminoácidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana (isoforma 1).
SEQ ID No. 19:
secuencia de nucleótidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana (isoforma 2).
SEQ ID No. 20:
secuencia de aminoácidos de la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana (isoforma 2).
SEQ ID No. 21:
secuencia de nucleótidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa procedente de Arabidopsis thaliana.
SEQ ID No. 22:
secuencia de aminoácidos de la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa procedente de Arabidopsis thaliana.
SEQ ID No. 23:
secuencia de nucleótidos de la NAD sintetasa procedente de Arabidopsis thaliana.
SEQ ID No. 24:
secuencia de aminoácidos de la NAD sintetasa procedente de Arabidopsis thaliana.
SEQ ID No. 25:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 467
SEQ ID No. 26:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 468
SEQ ID No. 27:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 469
SEQ ID No. 28:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 470
SEQ ID No. 29:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 496
SEQ ID No. 30:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 497
SEQ ID No. 31:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 500
SEQ ID No. 32:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 501
SEQ ID No. 33:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 502
SEQ ID No. 34:
secuencia de nucleótidos del vector de ADN-T pTVE 503.
\newpage
Ejemplos
Ejemplo 1
Ensamble de genes quiméricos resistentes al estrés y su introducción en plantas
pTVE467
Para aumentar la resistencia al estrés en plantas se construyó, usando técnicas convencionales, un gen quimérico que comprendía los siguientes fragmentos de ADN en orden:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV acrónimo de Cauliflower Mosaic Virus 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 pb (pares de bases), que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la nicotinamidasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO 1);
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S del CaMV (3' 35S).
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T, entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho procedentes del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE467 (SEQ ID 25). El vector de ADN-T pTVE467 se representa esquemáticamente en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de ADN-T pTVE467 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
1 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE468
Se construyó un gen quimérico similar al que está presente en pTVE467, en el que la nicotinamidasa fue equipada con una señal de localización nuclear convencional. El gen quimérico comprende por lo tanto los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 nt, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 20 nt, que codifica un péptido que comprende una señal de localización nuclear (NLS),
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la nicotinamidasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO 1); con lo que la señal de NLS está fusionada dentro de un cuadro;
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T, entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE468 (SEQ ID 26). El vector de ADN-T pTVE468 se representa esquemáticamente en la Figura 3.
El vector de ADN-T pTVE468 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
2 
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pTVE469
Para aumentar la resistencia al estrés en plantas se construyó, usando técnicas convencionales, un gen quimérico, que comprende los siguientes fragmentos de ADN en orden:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S),
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 pb, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (NPT1, SEQ ID NO 3);
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35S de CaMV (3' 35S).
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE469 (SEQ ID 27). El vector de ADN-T pTVE469 se representa esquemáticamente en la Figura 4.
El vector de ADN-T pTVE469 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
3 
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pTVE470
Se construyó un gen quimérico similar al que está presente en pTVE469, en el que la nicotinato fosforribosil transferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae fue equipada con una señal de localización nuclear convencional. El gen quimérico comprende por lo tanto los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 nt, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 20 nt, que codifica un péptido que comprende una señal de localización nuclear (NLSl),
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la nicotinato fosforribosiltransferasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (NPT 1 SEQ ID NO 3); con lo que la señal de NLS está fusionada dentro de un cuadro;
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE470 (SEQ ID 28). El vector de ADN-T pTVE470 se representa esquemáticamente en la Figura 5.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE470 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
4 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE496
Para aumentar la resistencia al estrés en plantas se construyó, usando técnicas convencionales, un gen quimérico, que comprende los siguientes fragmentos de ADN en orden:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S),
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 pb, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 procedente de Saccharomyces cerevisiae (NMA1, SEQ ID NO 5);
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE496 (SEQ ID 29). El vector de ADN-T pTVE496 se representa esquemáticamente en la Figura 6.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE496 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
6 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE497
Se construyó un gen quimérico similar al que está presente en pTVE496, en el que la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 procedente de Saccharomyces cerevisiae fue equipada con una señal de localización nuclear convencional. El gen quimérico comprende por lo tanto los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 nt, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 20 nt, que codifica un péptido que comprende una señal de localización nuclear (NLS);
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 1 procedente de Saccharomyces cerevisiae (NMA 1 SEQ ID NO 5); con lo que la señal de NLS está fusionada dentro de un cuadro;
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T, entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE497 (SEQ ID 30). El vector de ADN-T pTVE497 se representa esquemáticamente en la Figura 7.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE497 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
8 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE500
Para aumentar la resistencia al estrés en plantas se construyó, usando técnicas convencionales, un gen quimérico, que comprende los siguientes fragmentos de ADN en orden:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S),
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 pb, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 procedente de Saccharomyces cerevisiae (NMA2; SEQ ID No. 7);
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE500 (SEQ ID 31). El vector de ADN-T pTVE500 se representa esquemáticamente en la Figura 8.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE500 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
9 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE501
Se construyó un gen quimérico similar al que está presente en pTVE500, en el que la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 procedente de Saccharomyces cerevisiae fue equipada con una señal de localización nuclear convencional. Por lo tanto, el gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 nt, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 20 nt, que codifica un péptido que comprende una señal de localización nuclear (NLS);
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa 2 procedente de Saccharomyces cerevisiae (NMA 2 SEQ ID NO 7); con lo que la señal de NLS está fusionada dentro de un cuadro;
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE501 (SEQ ID 32). El vector de ADN-T pTVE501 se representa esquemáticamente en la Figura 9.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE501 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
10 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE502
Para aumentar la resistencia al estrés en plantas se construyó, usando técnicas convencionales, un gen quimérico, que comprende los siguientes fragmentos de ADN en orden de aparición:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S),
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 pb, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la NAD sintasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (QNS1; SEQ ID No. 9);
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE502 (SEQ ID 33). El vector de ADN-T pTVE502 se representa esquemáticamente en la Figura 10.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE502 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
11 
\vskip1.000000\baselineskip
pTVE503
Se construyó un gen quimérico similar al que está presente en pTVE502, en el que la NAD sintasa procedente de Saccharomyces cerevisiae fue equipada con una señal de localización nuclear convencional. El gen quimérico comprende por lo tanto los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
\bullet
una región de promotor procedente del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S);
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 60 nt, que corresponde a la secuencia delantera no traducida de Cab22L;
\bullet
un fragmento de ADN de aproximadamente 20 nt, que codifica un péptido que comprende una señal de localización nuclear (NLS);
\bullet
un fragmento de ADN que codifica la NAD sintasa procedente de Saccharomyces cerevisiae (QNS1; SEQ ID NO 9); con lo que la señal de NLS está fusionada dentro de un cuadro;
\bullet
un fragmento del extremo no traducido en 3' procedente del transcrito 35 S de CaMV (3' 35S).
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen quimérico se introdujo en un vector de ADN-T, entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la fosfinotricina herbicida, con el fin de proporcionar el pTVE503 (SEQ ID 34). El vector de ADN-T pTVE503 se representa esquemáticamente en la Figura 11.
\newpage
El vector de ADN-T pTVE503 comprende las siguientes características de la molécula:
(C) indica una cadena complementaria.
12 
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de ADN-T se introdujeron en cepas de Agrobacterium que comprenden un plásmido Ti cooperante, usando métodos convencionales. Los genes quiméricos fueron introducidos dentro de plantas de Arabidopsis mediante una transformación mediada por Agrobacterium, tal como se describe en la especialidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Análisis de linajes de Arabidopsis transgénicos que comprenden los genes quiméricos que se describen en el Ejem- plo 1
Semillas de linajes de Arabidopsis transgénicos (generación de T1) que expresan los genes de levadura de la ruta de salvación del NAD, obtenidas como se describe en el Ejemplo 1, se germinaron e hicieron crecer sobre un medio que contenía 15 mg l^{-1} de fosfinotricina (PPT). Se usó el cv (cultivar) Col-0 de Arabidopsis thaliana como un testigo.
Todas las plantas fueron sometidas a un estrés por luz alta. Unas plantas con una edad de dos semanas que habían crecido a 30 \muEinstein m^{-2} s^{-1} se transfirieron a 250 \muEinstein m^{-2} s^{-1} (luz alta) durante 6 horas, seguido por 8 horas en la oscuridad, y nuevamente por 8 horas por luz alta.
Después de este tratamiento, se determinaron los contenidos de NADH y de los radicales de superóxidos para todos los linajes y se compararon con la medición de los mismos compuestos en linajes transgénicos y testigos que se habían hecho crecer en condiciones de luz baja. Los resultados están recopilados en la Tabla 1.
Las plantas transgénicas exhibieron un contenido más alto de NADH con una luz alta que las plantas testigos, y produjeron menos especies oxigenadas reactivas con una luz alta que las plantas testigos. No se observó ninguna diferencia entre unas construcciones artificiales en las que la enzima codificada de la ruta de salvación del NAD estaba equipada o no con una señal de localización.
Unos linajes de plantas transgénicas fueron también calificados fenotípicamente en cuanto a tolerancia a unas condiciones de estrés por luz alta. Con este fin, las plantas se hicieron crecer in vitro en unas condiciones de luz baja (30 \muEinstein m^{-2} s^{-1}) durante dos semanas y se transfirieron durante 3 días a unas condiciones de luz alta (250 \muEinstein m^{-2} s^{-1}; 16 horas de luz - 8 horas de oscuridad). Después del tratamiento con una luz alta, las plantas fueron devueltas a unas condiciones de luz baja y se hicieron crecer durante otros tres días antes de calificar el
fenotipo.
Mientras que las plantas testigos eran pequeñas y habían comenzado a florecer (de un modo inducido por un estrés), las plantas de los linajes transgénicos que comprendían los genes quiméricos que se describen en el Ejemplo 1 eran mayores que las plantas testigo y solamente habían comenzado a producir semillas prematuramente.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Tolerancia a una luz alta de linajes de Arabidopsis transgénicos que sobre-expresan los genes de levadura quiméricos que se han descrito en el Ejemplo 1
13 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Protocolos para la medición del contenido de NADH y del contenido de superóxidos Cuantificación del NAD(P)H intracelular usando una sal de tetrazolio soluble en agua Referencia
Jun Nakamura, Shoji Asakura, Susan D. Hester, Gilbert de Murcia, Keith W. Caldecott y James A. Swenberg (2003). La cuantificación del NAD(P)H intracelular puede vigilar un desequilibrio de la reparación de una rotura de ADN monocatenario en células deficientes en cuanto a reparación de la escisión de bases en tiempo real. Nucleic Acids Research 31 (17), e104.
\vskip1.000000\baselineskip
Material de plantas
Se puede usar la mayor parte del material de plantas:
- vástagos de Arabidopsis que habían crecido in vitro de 14-18 días de edad, pero que NO habían florecido
- explantes de hipocótilos de colza de semilla oleaginosa
\vskip1.000000\baselineskip
Estuche 8 para el recuento de células (CCK = acrónimo de Cell Counting Kit, - 8)
Sopachem n.v./Bélgica
72A, Avenue du Laarbeeklaan - 1090 Bruselas, Bélgica
\vskip1.000000\baselineskip
Contenido:
Frascos con una capacidad de 5 ml que contenían 5 mol/l de WST-8 (sal de tetrazolio), 0,2 mMol/l de 1-metoxi PMS, 150 mMol/l de NaCl
\newpage
\global\parskip0.850000\baselineskip
Solución de reacción:
- 10 ml del tampón de fosfato de K 25 mM de pH 7,4
- 0,5 ml de CCK-8
- 0,1 mM de metil sulfato de 1-metoxi-5-metil fenazinio (= metosulfato de 1- metoxi-fenazina): 1\mul/ml de material original 100 mM (PM (peso molecular) = 336,4; 100 mg en 2.973 ml de agua)
- 1 gota de Tween 20/25ml
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
- se cosecha un material de plantas y se dispone en 25 mM del tampón de fosfato K de pH 7,4, p.ej.: 150 explantes de hipocótilos de colza de semillas oleaginosas 1 g de vástagos de Arabidopsis (sin raíces).
- se reemplaza el tampón por la solución de reacción
15 ml para 1 g de vástagos de Arabidopsis
15 ml para 150 explantes de hipocótilos de colza de semillas oleaginosas.
- se incuba a 26ºC en la oscuridad durante ½ hora (se vigila la reacción)
- se mide la absorbencia de la solución de reacción a 450 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Medición de la producción de superóxidos por cuantificación de la reducción de XTT
Ref.: De Block, M., De Brouwer, D. (2002) A simple and robust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids [Un ensayo in vitro simple y robusto para cuantificar el vigor de linajes y de híbridos de colza de semillas oleaginosas]. Plant Physiol. Biochem. 40, 845-852.
\vskip1.000000\baselineskip
A.Brassica napus Medios y tampones de reacción Medio de siembra (medio 201):
Sales semiconcentradas de Murashige y Skoog
2% de sacarosa
pH 5,8
0,6% de un agar (agar Difco Bacto)
250 mg/l de triacilina
\vskip1.000000\baselineskip
Medio A2S3 que induce callos:
Medio MS, 0,5 g/l de Mes (de pH 5,8), 3% de sacarosa, 40 mg/l de adenina-SO_{4}, 0,5% de agarosa, 1 mg/l de 2,4-D, 0,25 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP, 250 mg/l de triacilina
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de reacción:
25 mM del tampón de fosfato de K, de pH 8
1 mM de 3'-{1-[fenilamino-carbonil]-3,4-tetrazolio}-bis-(4-metoxi-6-nitro) de sodio = XTT (de BioVectra,
Canadá) (PM. 674,53)
Se disuelve el XTT por calentamiento cuidadoso de la solución (a \pm 37ºC) (hay que enfriar hasta la temperatura ambiente antes del uso)
\vskip1.000000\baselineskip
1 gota de Tween 20 para 25 ml de tampón
Esterilización de las semillas - germinación previa de las semillas - crecimiento de las plántulas
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las semillas se empapan en metanol al 70% durante 2 min, luego se esterilizan superficialmente durante 15 min en una solución de hipoclorito de sodio (con aproximadamente 6% de cloro activo) que contiene 0,1% de Tween 20. Finalmente, las semillas se enjuagan con 1 l de agua de grifo estéril. Se incuban las semillas durante por lo menos una hora en agua de grifo estéril (para permitir la difusión desde las semillas de unos componentes que pueden inhibir la germinación).
Las semillas se colocan dentro de unos matraces de Erlenmeyer con una capacidad de 250 ml, que contienen 50 ml de agua de grifo estéril(.+ 250 mg/l de triacilina). Se agita durante aproximadamente 20 horas.
Unas semillas desde las que sobresalen las radículas se colocan en unos recipientes Vitro Vent de Duchefa, que contienen aproximadamente 125 ml del medio de siembra (10 semillas/recipiente, no demasiadas para reducir la pérdida de semillas por contaminación). Las semillas se hacen germinar a \pm24ºC y 10-30 \muEinstein s^{-1} m^{-2} con una duración del día de 16 h.
P.S.: para calcular la cantidad de semillas que han de ser sembradas: 5 segmentos de hipocótilos/plántula
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivación previa de los explantes de hipocótilos e inducción de un estrés
- 12-14 días después de haber sembrado, los hipocótilos se cortan en unos segmentos de aproximadamente 7-10 mm.
- los explantes de hipocótilos (25 hipocótilos/cubeta de Petri Optilux, Falcon S1005, Dinamarca) se cultivan durante 5 días sobre un medio A2S3 a 25ºC
(a 10-30 \muEinstein s^{-1} m^{-2}).
P.S.: se usan 150 explantes de hipocótilos por cada condición.
- inducción de un estrés
Se transfieren explantes de hipocótilos de un medio A2S3 que contiene respectivamente 0, 25 y 50 mg/l de ácido acetilsalicílico.
Se incuba durante aproximadamente 24 horas a 25ºC y 10-30 \muEinstein s^{-1} m^{-2} con una luz diurna de 16 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de XTT
- se transfieren 150 explantes de hipocótilos a un tubo de Falcon con una capacidad de 50 ml
- se lavan con un tampón de reacción (sin XTT)
- se añaden 20 ml del tampón de reacción + XTT
- (los explantes tienen que ser sumergidos, pero no se infiltran en vacío)
- se incuba en la oscuridad a 26ºC
- se vigila la reacción midiendo la absorción del medio de reacción a 470 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
B.Arabidopsis thaliana Medios y tampones de reacción Medio de plantas:
Sales semiconcentradas de Murashige y Skoog
Vitamina B5
1,5% de sacarosa
pH 5,8
0,7% de agar Difco
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de incubación:
Sales concentradas a 1/2 de MS
1% de sacarosa
0,5 g/l de MES de pH 5,9
una gota de Tween 20 para 25 ml del medio
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de reacción:
25 mM del tampón de fosfato de K, de pH 8
1 mM de 3'-{1-[fenilamino-carbonil]-3,4-tetrazolio}-bis-(4-metoxi-6-nitro) de sodio = XTT (BioVectra, Canadá) (P.M. 674,53)
Se disuelve el XTT por calentamiento cuidadoso de la solución (a \pm 37ºC)
(hay que enfriar a la temperatura ambiente antes del uso)
1 gota de Tween 20 para 25 ml de tampón
\vskip1.000000\baselineskip
Plantas de Arabidopsis
- linajes de Arabidopsis: linajes testigos para ensayar (linaje materno a partir del cual se derivaron los linajes ensayados)
- esterilización de semillas de Arabidopsis
durante 2 min con etanol al 70%
blanquear durante 10 min (con cloro activo al 6%) + 1 gota de Tween 20 para 20 ml de solución, lavar 5 veces con agua de grifo estéril
P.S.: la esterilización se lleva a cabo en tubos de Eppendorf con una capacidad de 2 ml, las semillas de Arabidopsis se hunden hasta el fondo del tubo, permitiendo la eliminación de los líquidos por medio de una pipeta Pipetman con una capacidad de 1 ml
- Germinación previa de las semillas
En unas cubetas de Petri Optilux (Petridishes) de 9 cm (de Falcon) que contienen 12ml de agua de grifo estéril.
Luz baja durante la noche hasta 24 horas
- Crecimiento de las plantas de Arabidopsis
Se siembran las semillas en unos discos de cultivo de tejidos Intergrid Tissue Culture de Falcon (nr. 3025) que contienen \pm 125 ml del medio de plantas:
1 semilla/rejilla
Las plantas se hacen crecer a 24ºC
30 \muEinstein s^{-1} m^{-2}
16 horas de luz - 8 horas de oscuridad
durante aproximadamente 18 días (antes de echar raíces)
P.S. 1 g de material de plantas (vástagos sin raíces)/linaje/condición se necesitan para llevar a cabo el ensayo: 1 g de vástagos corresponde a 40-60 plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
Inducción de un estrés
Paraquat
- se cosechan vástagos de Arabidopsis (sin raíces),
- se coloca 1 g de vástagos en un medio de incubación (los vástagos han de ser sumergidos, pero no se infiltran en vacío) que contienen respectivamente 0, 5 y 10 \muM del medio de incubación Paraquat: \pm 150 ml en discos de cultivo de tejidos Intergrid de Falcon (nr. 3025)
- se incuba a 24ºC en la oscuridad durante \pm 24 horas y a 30-50 \muEinstein s^{-1} m^{-2} con una duración del día de 16 h
\vskip1.000000\baselineskip
Luz alta
- se transfiere la mitad de las placas a una luz alta (250 \muEinstein s^{-1} m^{-2}) y se incuba durante 4 a 20 horas
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de XTT
- se cosechan los vástagos (sin raíces) a partir de placas de agar (estrés por luz alta) o a partir de un medio líquido de incubación (estrés por Paraquat) y se colocan éstos en unos tubos de Falcon con una capacidad de 50 ml, que contienen el tampón de reacción (sin XTT)
- se reemplaza el tampón de reacción por un tampón que contiene XTT (15 ml/g)
- los vástagos han de ser sumergidos, pero no se infiltran en vacío
- se incuba en la oscuridad a 26ºC
- se vigila la reacción midiendo la absorción del medio de reacción a 450 nm (durante aproximadamente una hora)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Tolerancia aumentada al ozono de plantas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresan el gen de nicotinamidasa de levadura (Pnc1)
El vector quimérico pTVE467 (Ejemplo 1) se usó para la transformación de A. thaliana, ecotipo Columbia. Los transformantes primarios fueron analizados mediante unos análisis de transferencia de ADN Southern y de ARN Northern. Un linaje transgénico fue identificado por llevar una única copia de la construcción artificial del transgén Pnc1 y por tener un alto nivel de estado permanente del ARNm de Pnc1 de plena longitud transgénico 20 pg/5 \mug de ARN total).
6 Semanas después de la germinación, 100 plantas individuales, cada una del linaje transgénico de una sola copia y de Columbia de tipo salvaje como un testigo, fueron expuestas a ozono en cámaras de fumigación. Durante 2 días consecutivos, las plantas fueron tratadas durante 5 h/día con unas concentraciones de ozono de 250, 350 y 500 ppb (partes por mil millones) respectivamente. Después del tratamiento todas las plantas fueron escrutadas visualmente en cuanto a lesiones causadas por ozono, que se manifiestan como lesiones necróticas. Los resultados están recopilados en la Tabla 2. Con una exposición a 500 ppb de ozono casi todas las plantas mostraron unas lesiones necróticas, mientras que en las 2 concentraciones más bajas de ozono se dañó un porcentaje significativamente más bajo de las plantas transgénicas.
Además, la evolución del índice de rendimiento de vitalidad (PI) se determinó para todas las plantas del linaje transgénico y para las plantas de tipo salvaje bajo una concentración creciente de ozono. El PI se puede calcular mediante la fórmula:
PI = (ABS/CS) x (TR/CS) x (ET/CS). (ABS = flujo de fotones absorbidos por los pigmentos de antena Chl*; CS = sección transversal; TR = energía atrapada por el centro de reacción y convertida en energía redox; ET = flujo de electrones situados más corriente abajo, que conducen a la fijación de CO_{2}). En el linaje transgénico, el índice PI de rendimiento de vitalidad aumentó significativamente con unas concentraciones crecientes de ozono, mientras que este índice permanece constante en unas plantas de tipo salvaje, que han sido tratadas con unas concentraciones crecientes de ozono. Esto puede ser explicado por una respuesta de compensación fisiológica dentro del linaje transgénico para contrarrestar el daño causado por ozono.
TABLA 2 Tolerancia aumentada al ozono de plantas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresan el gen de nicotinamidasa de levadura (Pnc1)
14
Además, unas plantas testigos, unas poblaciones transgénicas homocigóticas de plantas que comprenden el gen Pnc1 quimérico, así como una población transgénica heterocigótica, se sometieron a fumigaciones con ozono y se calificaron en cuanto al daño visible y a diversas respuestas fisiológicas en comparación con plantas no fumigadas. La comprobación incluía una medición de la fluorescencia no modulada, de la fluorescencia modulada, una medición de la clorofila y una determinación del peso en fresco (es decir recientemente recogido).
Basándose en el daño visible y en las respuestas biológicas, se hizo una ordenación por rangos para cada población, que indica el grado del impacto del ozono. Cuanto más negativa es la evaluación, tanto más sensible es la respuesta de la población al ozono.
Mientras que la población no transgénica testigo y la población transgénica heterocigótica tenían una calificación acumulada de -13, las dos poblaciones transgénicas homocigóticas tenían unas calificaciones de -6 y -2 respectivamente. Está por lo tanto puesto en claro que las poblaciones transgénicas homocigóticas se comportaron mejor que las plantas testigos de una manera estadísticamente significativa.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Bayer BioScience N.V.
\hskip1cm
De Block, Marc 
\hskip1cm
Metzlaff, Michael 
\hskip1cm
Gosselé, Veronique 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Plantas resistentes al estrés
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BCS04-2005 WO1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04077624.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-09-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/628826
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-11-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3,0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 651
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
18
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 597
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
27
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 597
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1680
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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34 
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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35
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37 
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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44
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<211> 725
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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46
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<213> Artificial
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<212> ADN
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Claims (12)

1. Un método para obtener una planta con una resistencia aumentada al estrés, que comprende
a. introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:
i.
Un promotor expresable en plantas;
ii.
Una región de ADN que codifica una enzima de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido procedente de una levadura o de hongos, estando seleccionada dicha enzima entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa;
iii.
Una región del extremo 3', implicada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación;
b. regenerar dichas células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas;
c. seleccionar una planta, a partir de dicha población de plantas transgénicas, que exhiba una resistencia aumentada al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región de ADN codifica una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6; SEQ ID No.:8 y SEQ ID No.:10.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región de ADN comprende la secuencia de nucleótidos de: SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:5, SEQ ID No.:7, SEQ ID No. 9 o SEQ ID No.:3.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la operación de cruzar dicha planta con otra planta.
5. Un gen quimérico, como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Una célula de planta, que comprende un gen quimérico como se describe en la reivindicación 5.
7. Una planta, que comprende un gen quimérico como se describe en la reivindicación 5.
8. La planta de la reivindicación 7, que es una planta seleccionada entre algodón, hortalizas del género Brassica, colza de semillas oleaginosas, trigo, maíz o maíz dulce, cebada, girasol, arroz, avena, caña de azúcar, hortalizas, achicoria, lechuga, tomate, tabaco, patata, caña de azúcar, papaya, piña, mango o Arabidopsis thaliana.
9. La planta de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada además porque tiene un nivel más bajo de especies oxigenadas reactivas en condiciones de estrés que una planta similar que no comprende dicho gen quimérico.
10. Una semilla de una planta de acuerdo con la reivindicación 7 o con la reivindicación 8, que comprende un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5.
11. Uso de un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5, para aumentar la resistencia al estrés de una planta.
12. Uso de un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5, para disminuir el nivel de especies oxigenadas reactivas en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés o para mantener el nivel del NAD en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés.
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