ES2743420T3 - Plantas de arroz que tienen tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona - Google Patents

Abstract

Un método para la caracterización molecular de una planta de arroz que comprende amplificar, mediante PCR, un gen AHAS de una planta de arroz, en donde la planta de arroz es una planta de arroz de las líneas IMINTA 1, 4 o 5, o una progenie de la misma, y en donde la semilla de la línea de arroz IMINTA 1 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41206, la semilla de la línea de arroz IMINTA 4 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41207 y la semilla de la línea de arroz IMINTA 5 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41208.

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de arroz que tienen tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a un método para la caracterización molecular de plantas de arroz que tienen una tolerancia incrementada frente a los herbicidas de imidazolinona.

Antecedentes de la invención

De acuerdo con una encuesta a los agricultores, las principales limitaciones para la producción de arroz son las malezas (Hidaka et al., Agrochemicals Japan, 2000, 77: 21-29). La siembra directa ha reducido los problemas del trabajo de trasplantar, sin embargo esta tecnología ha ayudado a aumentar el problema de la maleza. El uso de herbicida en los cultivos de arroz es una práctica común en la mayor parte de las regiones arroceras que se dedican a los cultivos de semillas de arroz y/o en países desarrollados que cultivan arroz bajo sistemas de siembra directa o trasplante. Usualmente se aplica una o más veces un herbicida para pasto y para hoja ancha con el fin de controlar las malezas en los cultivos de arroz.

Los pastos, juncos y arroz maleza ("arroz rojo") han sido los principales grupos de especies que son bastante aptos para los mismos entornos en donde se cultiva el arroz. Estas malezas se han llegado a distribuir globalmente y son difíciles de controlar en los cultivos de arroz. El arroz rojo pertenece a la misma especie que el arroz cultivado (Oryza sativa L). La similitud genética del arroz rojo y el arroz comercial ha hecho difícil el control con herbicidas del arroz rojo. Diversas prácticas de cultivo ayudan en el control de las malezas y son convenientes para un mejor cuidado del medio ambiente, tal como la preparación del terreno, la nivelación del terreno, los diques y la profundidad del agua, la rotación de la tierra, la siembra certificada, sistemas vegetales apropiados y las fechas de plantación. Aunque estas prácticas de cultivo pueden ayudar a reducir el banco de semillas de la maleza y el desarrollo de malezas tolerantes al herbicida, estas imponen ciertas restricciones y aumentan el coste del cultivo. A pesar de las muchas recomendaciones para mejorar las prácticas de cultivo, los agricultores aún confían en el uso de herbicidas como una herramienta principal para controlar las malezas. El uso y el abuso de algunos de estos productos químicos ha tenido como resultado el desarrollo de malezas tolerantes como el pasto dentado (Echinochloa crus galli), resistentes a Propanilo y Butaclor. En estos casos, es conveniente tener otros herbicidas con diferentes modos de acción, con capacidad de controlar la mayor parte de esas especies de malezas, de tal manera que su aplicación se puede alternar con los herbicidas comúnmente aplicados.

La acetohidroxiácido sintasa (AHAS; EC 4.1.3.18, acetolactato sintasa (ALS)), codificada por el ácido nucleico de AHAS, es la primera enzima que cataliza la síntesis bioquímica de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh B. K., 1999, Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh B. K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York. Pg 227-247). AHAS es el sitio de acción de cuatro familias de herbicidas estructuralmente diversas que incluyen las sulfonilureas (LaRossa RA and Falco SC, 1984, Trends Biotechnol. 2:158-161), las imidazolinonas (Shaner et al., 1984, Plant Physiol. 76:545-546), las triazolopirimidinas (Subramanian and Gerwick, 1989, Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in (Ed) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D.C. Pg 277-288) y los pirimidiloxibenzoatos (Subramanian et al., 1990, Plant Physiol. 94: 239-244.). Se utilizan ampliamente los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea en la agricultura moderna debido a su efectividad con tasas de aplicación muy bajas y sin toxicidad relativa en los animales. Al inhibir la actividad de AHAS, estas familias de herbicidas evitan un crecimiento y un desarrollo adicional de las plantas susceptibles que incluyen muchas especies de malezas. Diversos ejemplos de herbicidas de imidazolinona comercialmente disponibles son PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin) y ARSENAL® (imazapir). Ejemplos de herbicidas de sulfonilurea son clorsulfurón, metil metsulfurón, metil sulfometurón, etil clorimurón, metil tifensulfurón, metil tribenurón, metil bensulfurón, nicosulfurón, metil etametsulfurón, rimsulfurón, metil triflusulfurón, triasulfurón, metil primisulfurón, cinosulfurón, amidosulfurón, fluzasulfurón, imazosulfurón, etil pirazosulfurón y halosulfurón.

Debido a su alta efectividad y baja toxicidad, los herbicidas de imidazolinona son preferidos para la aplicación por rociado sobre la parte superior de una amplia área de vegetación. La capacidad de rociar un herbicida sobre la parte superior de una amplia gama de vegetaciones reduce los costes asociados con el establecimiento y mantenimiento de la plantación y reduce la necesidad de preparar el sitio antes del uso de tales agentes químicos. El rociado sobre la parte superior de una especie tolerante deseada también tiene como resultado la capacidad de alcanzar un potencial de producción máximo de la especie deseada debido a la ausencia de especies competitivas. Sin embargo, la capacidad para utilizar tales técnicas de rociado depende de la presencia de las especies tolerantes a la imidazolinona de la vegetación deseada en el área del rociado.

Entre los principales cultivos agrícolas, algunas especies de leguminosas tales como la soja son resistentes de forma natural a los herbicidas de imidazolinona, debido a su capacidad para metabolizar rápidamente los compuestos herbicidas (Shaner and Robson, 1985, Weed Sci. 33:469-471). Otros cultivos tales como el maíz (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100: 882-886) y el arroz (Barrett et al., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, pp. 195-220) son susceptibles a los herbicidas de imidazolinona. La sensibilidad diferencial a los herbicidas de imidazolinona depende de la naturaleza química del herbicida particular y del metabolismo diferencial del compuesto de una forma tóxica a no tóxica en cada planta (Shaner et al., 1984, Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al., 1987, Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Otras diferencias fisiológicas vegetales tales como la absorción y la translocación también tienen una función importante en la sensibilidad (Shaner and Robson, 1985, Weed Sci. 33:469-471).

Los cultivos resistentes a las imidazolinonas, las sulfonilureas y las triazolopirimidinas se han producido con éxito utilizando la mutagénesis de semillas, microesporas, polen y callos en Zea mays, Brassica napus, Glycine max y Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989, Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989, Theor. Appl. Genet.

78:525-530; Newhouse et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991, Plant Physiol. 97: 1044­ 1050; Mourand et al., 1993, J. Heredity 84:91-96). En todos los casos, un gen nuclear parcialmente dominante, único, confiere resistencia. También se aislaron previamente cuatro plantas de trigo resistentes a la imidazolinona después de una mutagénesis de semillas de Triticum aestivum L. cv Fidel (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol.

100:882-886). Estudios de la herencia confirmaron que un gen parcialmente dominante, único confería resistencia. Basándose en estudios alélicos, los autores llegaron a la conclusión de que las mutaciones en las cuatro líneas identificadas se ubican en el mismo locus. Uno de los genes de resistencia del cultivar Fidel fue designado FS-4 (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100:882-886).

El modelado informatizado de la conformación tridimensional del complejo de AHAS-inhibidor predice diversos aminoácidos en el bolsillo de unión del inhibidor propuesto, como sitios en donde las mutaciones inducidas conferirán probablemente una resistencia selectiva frente a las imidazolinonas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368). Las plantas del tabaco producidas con algunas de esas mutaciones diseñadas racionalmente en los sitios de unión propuestos de la enzima AHAS, han mostrado de hecho una resistencia específica frente a una clase única de herbicidas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368).

La resistencia de las plantas a los herbicidas de imidazolinona también se ha presentado en una serie de patentes. Los documentos de Patentes estadounidenses n° 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 y 6.222.100 describen de manera general el uso de un ácido nucleico de AHAS alterado para provocar resistencia a los herbicidas en plantas y específicamente describe ciertas líneas de maíz resistentes a la imidazolinona. El documento de Patente estadounidense n° 5.013.659 describe plantas que muestran resistencia a los herbicidas que poseen mutaciones en por lo menos un aminoácido en una o más regiones conservadas. Las mutaciones descritas en ese documento codifican una resistencia cruzada frente a las imidazolinonas y sulfonilureas o una resistencia específica frente a la sulfonilurea, pero no se describe una resistencia específica frente a la imidazolinona. Adicionalmente, los documentos de Patente estadounidense n° 5.731.180 y n° 5.767.361 analizan un gen aislado que tiene una única sustitución de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de AHAS monocotiledónea de tipo silvestre que tiene como resultado la resistencia específica a la imidazolinona.

También se han descrito plantas de arroz resistentes a herbicidas y transgénicas. Se ha descrito un mutante del arroz resistente a un herbicida de sulfonilurea, obtenido por presión selectiva en un cultivo de tejido de callo, cuando la resistencia se atribuía a una enzima AHAS mutante (Terakawa et al., "Rice Mutant Resistant to the Herbicide Bensulfurón Metil (BSM) by in vitro Selection", Japan. J. Breed., 1992 vol. 42:267-275). Se han descrito otras variedades vegetales de arroz resistente a herbicidas en patentes y solicitudes de patente, que incluyen los documentos WO 97/41218, WO 01/85970 y las Patentes estadounidenses n° 5.545.822, 5.736.629, 5.773.704, 5.773.703, 5.952.553 y 6.274.796. El documento de Patente estadounidense n° 5.545.822 describe una línea de plantas de arroz que tiene una resistencia basada en el metabolismo frente a los herbicidas que interfieren con la enzima vegetal acetohidroxiácido sintasa; es decir, la resistencia a los herbicidas de esas plantas de arroz no se debía a una enzima AHAS resistente. El documento WO 97/41218 describe una línea de plantas de arroz que tiene una enzima AHAS variante que es resistente a los herbicidas que interfieren con la enzima acetohidroxiácido sintasa vegetal de tipo silvestre. Esta línea de plantas de arroz se desarrolló al exponer semillas de arroz al éster etílico de ácido metanosulfónico mutágeno (EMS) y escrutar en una descendencia de millones la resistencia al herbicida. Lo que se necesita en la técnica es la identificación de líneas de arroz adicionales que comprenden genes de resistencia a la imidazolinona. También lo que se necesita en la técnica son plantas de arroz que tengan una tolerancia incrementada frente a herbicidas tales como la imidazolinona y que contengan por lo menos un ácido nucleico de AHAS alterado. También se necesitan métodos para controlar el crecimiento de malezas en la proximidad de tales plantas de arroz. Estas composiciones y métodos permitirán el uso de las técnicas de rociado cuando se aplican herbicidas sobre las áreas que contienen plantas de arroz.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un método para la caracterización molecular de una planta de arroz que comprende amplificar, mediante PCR, un gen AHAS de una planta de arroz, en donde la planta de arroz es una planta de arroz de las líneas IMINTA 1, 4 o 5 o una progenie de la misma.

En esta memoria se describen adicionalmente plantas de arroz que comprenden ácidos nucleicos de AHAS variantes, en donde la planta de arroz tiene una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. La planta de arroz puede comprender un ácido nucleico de AHAS variante. Por ejemplo, el ácido nucleico de AHAS variante puede codificar una proteína de AHAS variante que comprende una sustitución de alanina por treonina, en comparación con una proteína de AHAS de tipo silvestre. También se describen en esta memoria partes de plantas y semillas de plantas obtenidas a partir de las plantas de arroz descritas en esta memoria.

Los ácidos nucleicos de AHAS variantes pueden comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en: un polinucleótido tal y como se define en SEQ ID NO: 1; un polinucleótido tal y como se define en SEQ ID NO: 3; un polinucleótido tal y como se define en SEQ ID NO: 5; un polinucleótido tal y como se define en SEQ ID NO: 11; una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido tal y como se define en SEQ ID NO: 2; una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido tal y como se define en SEQ ID NO: 4; una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido tal y como se define en SEQ ID NO: 6; una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido tal y como se define en SEQ ID NO: 12; un polinucleótido que comprende al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente, en donde el ácido nucleico de AHAS variante codifica un polipéptido de AHAS que confiere una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con un polipéptido de AHAS de tipo silvestre.

Las plantas descritas en la presente memoria pueden ser transgénicas o no transgénicas. Ejemplos de plantas de arroz no transgénicas que tienen una tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona incluyen una planta de arroz que tiene el Número de Designación de la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o NCIMB 41208; o un derivado recombinante, mutante o manipulado genéticamente de la planta con el Número de Designación de la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o NCⁱM^b 41208; o cualquier descendiente de la planta con el Número de Designación de la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o N^c IMB 41208; o una planta que es una progenie de cualquiera de estas plantas. Además en esta memoria se describen diversos métodos, incluyendo métodos para modificar la tolerancia de una planta de arroz frente a un herbicida de imidazolinona que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico de AHAS en la planta. También se describen métodos para producir una planta transgénica que tiene una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona que comprende, transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende uno o más ácidos nucleicos de AHAS variantes que codifican una proteína de AHAS variante que comprende una sustitución de alanina por treonina en comparación con una proteína de AHAS de tipo silvestre y generar la planta a partir de la célula vegetal. La descripción incluye adicionalmente un método de control de malezas dentro de la proximidad de una planta de arroz, que comprende aplicar un herbicida de imidazolinona a las malezas y a la planta de arroz, en donde la planta de arroz tiene una tolerancia incrementada frente al herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta de arroz, y en donde la planta comprende uno o más ácidos nucleicos de AHAS que codifican una proteína de AHAS variante que comprende una sustitución de alanina por treonina, en comparación con una proteína de AHAS de tipo silvestre.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-B muestran la secuencia parcial del ADNc del ácido nucleico de AHAS IMINTA 1 (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (SEQ ID NO: 2). Las Figuras 1C-D muestran la secuencia parcial de ADNc del ácido nucleico de AHAS IMINTA 4 (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (SEQ ID NO: 4). Las Figuras 1E-F muestran la secuencia de parcial de ADNc del ácido nucleico de AHAS IMINTA 5 (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (SEQ ID NO: 6). Las Figuras 1G-H muestran la secuencia de parcial de ADNc del ácido nucleico de AHAS IRGA 417 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (SEQ ID NO: 8).

La Figura 2 muestra la alineación de la secuencia de ADNc del gen AHAS amplificado a partir del ADN genómico procedente de la línea IMINTA 1 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 1), el gen AHAS amplificado a partir del ADN genómico procedente de la línea IMINTA 4 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 3), el gen AHAS amplificado a partir del ADN genómico procedente de la línea IMINTA 5 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 5), el gen AHAS amplificado a partir del ^a Dⁿ genómico procedente de la línea de arroz de tipo silvestre IRGA 417 (SEQ ID NO: 7) y una secuencia de consenso del gen AHAs de arroz (SEQ ID NO: 9). El polimorfismo de nucleótidos que confiere tolerancia a la imidazolinona a las líneas IMINTA 1, 4 y 5, se indica en negrita.

La Figura 3 muestra la alineación de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen AHAS de la línea IMINTA 1 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen AHAS de la línea IMINTA 4 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 4), la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen AHAS de la línea IMINTA 5 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 6), la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen AHAS de la línea de arroz de tipo silvestre IRGA 417 (SEQ ID NO: 8) y una secuencia de aminoácidos de consenso de AHAS de arroz (SEQ ID NO: 10). El polimorfismo que confiere tolerancia a la imidazolinona a las líneas IMINTA 1, 4 y 5, se indica en negrita.

La Figura 4A muestra un ejemplo de un ADNc de longitud completa de un ácido nucleico de AHAS variante (SEQ ID NO: 11) y la Figura 4B muestra un ejemplo de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen AHAS mostrado en la Figura 4A (SEQ ID NO: 12), en donde el polipéptido confiere tolerancia a una imidazolinona en comparación con un polipéptido de AHAS de tipo silvestre.

La Figura 5 es una tabla que muestra el diseño de bloques aleatorio para el ensayo de campo de la línea IMINTA 1 y la variedad IRGA 417.

La Figura 6 es una tabla que muestra la respuesta de las líneas IRGA 417 e IMINTA 1 frente a un tratamiento mediante imidazolinona.

La Figura 7 es una tabla que muestra el rendimiento en grano con un 14% de humedad para las líneas IRGA 417 e IMINTA 1 después de un tratamiento con imidazolinona.

La Figura 8 es una tabla que muestra la evaluación de los componentes del rendimiento en las líneas IRGA 417 e IMINTA 1 después de un tratamiento con imidazolinona.

Descripción detallada

La presente descripción incluye plantas de arroz, partes de plantas de arroz y células de plantas de arroz que tienen una tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona. La presente descripción también incluye semillas producidas por las plantas de arroz descritas en esta memoria y métodos para controlar malezas en la proximidad de las plantas de arroz descritas en esta memoria. Se entiende que, tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que por lo menos se puede utilizar una célula.

Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "planta de arroz" se refiere a una planta que es un miembro del género Oryza. Las plantas de arroz de la presente descripción pueden ser miembros de un género Oryza que incluye, pero no se limita a, O. alta, O. australiensis, O. barthii, O. brachyantha, O. eichingeri, O. glaberrima, O. glumaepatula, O. grandigiumis, O. granulata, O. latifolia, O. longiglumis, O. longistaminata, O. meridionalis O. meyeriana, O. minuta, O. nivara, O. officinalis, O. punctata, O. rhizomatis, O. ridleyi, O. ruflpogon, O. sativa y O. schiechteri e híbridos de los mismos. Ejemplos de subespecies de O. sativa incluidas dentro de la presente invención son Japonica e Indica. Un cultivar no limitante de Japonica es Nipponbare y un ejemplo no limitante de Indica es el cultivar 93-11.

La expresión “planta de arroz" se entiende que incluye plantas de arroz en cualquier estadio de madurez o desarrollo, así como cualesquier tejidos u órganos (partes de la planta) tomados u obtenidos a partir de cualquier planta de ese tipo, a menos que se indique claramente de otro modo por el contexto. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, flores, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, cultivos de antera, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos y similares. La presente descripción también incluye semillas producidas por las plantas de arroz descritas en esta memoria. Las semillas pueden ser genéticamente puras para una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta de arroz.

La presente descripción incluye una planta de arroz que comprende por lo menos un ácido nucleico de AHAS variante, en donde la planta de arroz ha aumentado la tolerancia frente a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "locus del gen AHAS" se refiere a la posición de un gen AHAS en un genoma y las expresiones “gen AHAS" y "ácido nucleico de AHAS" se refieren a un ácido nucleico que codifica la enzima AHAS.

Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "ácido nucleico de AHAS variante" se refiere a un ácido nucleico de AHAS que tiene una secuencia que se muta desde un ácido nucleico de AHAS de tipo silvestre y que confiere una tolerancia incrementada frente a la imidazolinona a una planta en la que se expresa. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "alelo de AHAS variante" se refiere a una copia única de un ácido nucleico de AHAS particular.

De acuerdo con lo anterior, la presente descripción incluye una planta de arroz que comprende un ácido nucleico de AHAS variante, en donde la planta de arroz tiene una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta y en donde el ácido nucleico de AHAS variante codifica una proteína de AHAS variante que comprende una mutación de alanina a treonina en comparación con una proteína de AHAS de tipo silvestre. Preferiblemente la mutación de alanina a treonina se corresponde con la posición 96 de la secuencia de aminoácidos de AHAS como se muestra en SEQ ID NO: 12. Preferiblemente el ácido nucleico de AHAS variante se selecciona a partir del grupo que consiste en una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 11; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 2; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 6; y un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 12.

La presente descripción incluye plantas de arroz que comprenden uno o más alelos de AHAS, en donde la planta de arroz ha aumentado la tolerancia frente a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los alelos de AHAS pueden comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5; una secuencia de polinucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 11; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 2; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 12; un polinucleótido que comprende al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente.

La planta de arroz puede comprender dos ácidos nucleicos de AHAS variantes diferentes. Por ejemplo, la planta de arroz comprende un ácido nucleico de AHAS variante, en donde el ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, por lo menos uno de los ácidos nucleicos de AHAS variantes comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3: y SEQ ID NO: 5.

El herbicida de imidazolinona se puede seleccionar a partir de, pero no se limita a, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), un derivado de cualquiera de los herbicidas mencionados anteriormente o una mezcla de dos o más de los herbicidas mencionados anteriormente, por ejemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEY®). Más específicamente, el herbicida de imidazolinona se puede seleccionar a partir de, pero no se limita a, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolincarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico y una mezcla de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metilo y 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metilo. Se prefiere el uso de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico y ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico. Se prefiere particularmente el uso de ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico.

Las plantas de arroz descritas en esta memoria pueden ser plantas de arroz transgénicas o plantas de arroz no transgénicas. Tal y como se utiliza en esta memoria, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal o parte de una planta, que contiene todo o parte de por lo menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra establemente dentro de un cromosoma o un elemento extracromosómico estable, de modo que este pasa a las generaciones sucesivas. Para los fines de la invención, la expresión "polinucleótido recombinante” se refiere a un polinucleótido que se ha alterado, reorganizado o modificado por manipulación genética. Ejemplos incluyen cualquier polinucleótido o polinucleótidos, clonados que se ligan o se unen a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de los polinucleótidos que son el resultado de eventos que ocurren en forma natural, tales como mutaciones espontáneas o de una mutagénesis no espontánea seguida de una siembra selectiva. Las plantas que contienen mutaciones que surgen debido a una mutagénesis no espontánea y una siembra selectiva, se denominan en esta memoria plantas no transgénicas.

Un ejemplo de una línea de plantas de arroz no transgénica que comprende un ácido nucleico de AHAS variante, es la línea vegetal depositada en la NCIMB que tiene el Número de Designación en la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41206, denominada en esta memoria la línea de arroz AHAS IMINTA 1. La secuencia de nucleótidos parcial que corresponde al gen IMINTA 1 AHAS se muestra en SEQ ID NO: 1.

Otro ejemplo de una línea de planta de arroz no transgénica que comprende un ácido nucleico de AHAS es la línea vegetal depositada en la NCIMB que tiene el Número de Designación en la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41207, denominada en esta memoria la línea de arroz AHAS IMINTA 4. La secuencia de nucleótidos parcial que corresponde al gen IMINTA 4 AHAS se muestra en SEQ ID NO: 3.

Otro ejemplo de una línea de planta de arroz no transgénica que comprende un ácido nucleico AHAS es la línea vegetal depositada en la NCIMB que tiene el Número de Designación en la NCIMB para un Depósito de Patente NCIMB 41208, denominada en esta memoria la línea de arroz AHAS IMINTA 5. La secuencia de nucleótidos parcial que corresponde al gen IMINTA 5 AHAS se muestra en SEQ ID NO: 5.

Los distintos depósitos de aproximadamente 2500 semillas cada uno de las líneas de trigo tolerantes a la imidazolinona se realizaron en la NCIMB, Aberdeen, Scotland, Reino Unido, el 22 de Diciembre, 2003. Estos depósitos se realizaron de acuerdo con los términos y disposiciones del Tratado de Budapest relacionados con el depósito de microorganismos Los depósitos se realizaron por un período de al menos treinta años y al menos cinco años después de que la NCIMB reciba la solicitud más reciente para el suministro de una muestra del depósito. Las semillas depositadas recibieron los Números de Designación de Depósito de Patentes NCIMB 41206, NCIMB 41207 y NCIMB 41208.

La presente descripción incluye la planta de arroz que tiene un Número de Designación de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o NCIMB 41208; un mutante, un recombinante o un derivado manipulado genéticamente de la planta, con el Número de Designación de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o NCIMB 41208; cualquier progenie de la planta con el Número de Designación de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 o NCIMB 41208; y una planta que es la progenie de cualquiera de esas plantas. Preferiblemente, la planta de arroz descrita en esta memoria tiene adicionalmente las características de tolerancia frente al herbicida de la planta con el Número de Designación de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207 y NCIMB 41208.

También se describen híbridos de las líneas de plantas de arroz IMINTA 1, 4 y 5 descritas en esta memoria, e híbridos de IMINTA 1, 4 y 5 con otra planta de arroz.

Los términos "cultivar" y "variedad" se refieren a un grupo de plantas dentro de una especie definida mediante el intercambio de un conjunto común de características o caracteres aceptados por aquellos expertos en la técnica como suficientes para distinguir un cultivar o una variedad de otro cultivar o variedad. No existe ninguna implicación en los términos de que todas las plantas de cualquier cultivar o variedad dada sean genéticamente idénticas al gen completo o a nivel molecular o de que cualquier planta dada sea homocigota en todos los loci. Un cultivar o una variedad se considera una "reproducción pura" de un carácter particular, cuando el cultivar o la variedad de reproducción pura se autopoliniza, si toda la progenie contiene el carácter. Las expresiones "línea de reproducción" o "línea" se refieren a un grupo de plantas dentro de un cultivar definido por el intercambio de un conjunto común de características o caracteres aceptados por los expertos en la técnica como suficientes para distinguir una línea de reproducción o una línea de otra línea de reproducción o línea. No existe ninguna implicación en ningún término de que todas las plantas de cualquier línea de reproducción o línea dada sean genéticamente idénticas al gen completo o a nivel molecular o de que cualquier planta dada sea homocigota en todos los loci. Una línea de reproducción o una línea se considera una "reproducción pura" de un carácter particular, cuando la línea de reproducción pura o la línea de reproducción se autopoliniza, si toda la progenie contiene el carácter. En las plantas descritas en esta memoria, el carácter surge de una mutación en un gen AHAS de la planta de arroz o la semilla.

Se entiende que la planta de arroz de la presente descripción puede comprender un ácido nucleico de AHAS de tipo silvestre además de un ácido nucleico de AHAS variante. Como se describe en el Ejemplo 2, se contempla que las líneas de arroz IMINTA 1, 4 y 5 contienen una mutación en solo un alelo de AHAS. Por lo tanto, la presente descripción incluye una planta de arroz que comprende por lo menos un ácido nucleico de AHAS variante además de uno o más ácidos nucleicos de AHAS de tipo silvestre.

Además de las plantas de arroz, la presente descripción incluye proteínas y ácidos nucleicos de AHAS aislados que confieren preferiblemente una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con las proteínas y los ácidos nucleicos de AHAS de tipo silvestre. Preferiblemente los ácidos nucleicos de AHAS aislados codifican una proteína que tiene una mutación de alanina a treonina. Preferiblemente la mutación de alanina a treonina está ubicada en un residuo de aminoácido que corresponde a la posición 96 de SEQ ID NO: 12. Los ácidos nucleicos aislados comprenden un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en un polinucleótido como se define en SEQ ID NO: 1; un polinucleótido como se define en SEQ ID NO: 3; un polinucleótido como se define en SEQ ID NO: 5: un polinucleótido como se define en SEQ ID NO: 11; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 2; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en SEQ iD NO: 12; un polinucleótido que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos mencionados anteriormente. Preferiblemente el ácido nucleico de AHAS aislado comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11.

La expresión "proteína de AHAS" o "polipéptido de AHAS" se refiere a una proteína de la acetohidroxiácido sintasa y las expresiones "proteína de AHAS variante" o "polipéptido de AHAS variante" se refieren a cualquier proteína de AHAS que se ha mutado desde una proteína de AHAS de tipo silvestre y que contiene una tolerancia incrementada frente a imidazolinona a una planta, una célula vegetal, parte de una planta, una semilla vegetal o un tejido vegetal cuando se expresa en los anteriores. Preferiblemente la proteína de AHAS variante comprende un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1, o la proteína de AHAS variante comprende un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3, o la proteína de AHAS variante comprende un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5, o la proteína de AHAs variante comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

También, tal y como se utiliza en esta memoria, las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a un ARN o ADN que es lineal o ramificado, de hebra doble o de hebra sencilla o a un híbrido de los mismos. La expresión también abarca los híbridos de ARN/ADN. Estas expresiones también abarcan la secuencia no traducida localizada en los extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos de la secuencia aguas arriba desde el extremo 5' de la región codificante y por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia aguas abajo desde el extremo 3' de la región codificante del gen. Las bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras también se pueden utilizar para el emparejamiento antisentido, ARNds y ribozimas. Por ejemplo, se ha mostrado que los polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina se unen al ^a Rⁿ con alta afinidad y son inhibidores antisentido potentes de la expresión génica. También se pueden realizar otras modificaciones, tales como la modificación de la estructura principal de fosfodiéster o el 2'-hidroxi en el grupo de azúcar de la ribosa del ARN. Los polinucleótidos y ribozimas antisentido pueden consistir completamente en ribonucleótidos o pueden contener ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos mezclados. Los polinucleótidos descritos en esta memoria se pueden producir por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, RT-PCR y transcripción in vitro o in vivo.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, las secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de algunas de las secuencias que flanquean en forma natural el ácido nucleico (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón presente de forma natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. La molécula de ácido nucleico de AHAS aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se obtiene el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de O. sativa). Un ácido nucleico también se considera aislado si se ha alterado mediante la intervención humana o se coloca en un locus o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce dentro de una célula mediante un método de agroinfección, biolística o cualquier otro método de transformación de vegetales. Más aún, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar exenta de alguno de los otros materiales celulares con los que se asocia de forma natural o el medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetizan químicamente.

Se excluyen específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados": los cromosomas de origen natural (tales como las extensiones de cromosomas), las colecciones de cromosomas artificiales, las colecciones genómicas y las colecciones de ADNc que existen como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de células anfitrionas transfectadas/transformadas, en donde las células anfitrionas son una preparación heterogénea in vitro o se extienden en placas como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las colecciones anteriores en donde un ácido nucleico especificado constituye menos del 5% del número de inserciones de ácido nucleico en las moléculas del vector. Adicionalmente se excluyen específicamente las preparaciones de ADN genómico de células completas o las preparaciones de ARN de células completas (que incluyen preparaciones de células completas que se cortan mecánicamente o se digieren enzimáticamente). Aún más adicionalmente, se excluyen específicamente las preparaciones de células completas que se encuentran como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada mediante electroforesis, en donde el ácido nucleico descrito en esta memoria no se ha separado adicionalmente de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de la electroforesis (por ejemplo, separando adicionalmente mediante una escisión de una banda sencilla a partir de una población de banda heterogénea en un gel de agarosa o una transferencia a membrana de nailon).

Una molécula de ácido nucleico de la presente descripción, p. ej., una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 o una porción de la misma, se puede aislar utilizando técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, el ADNc de AHAS de O. sativa se puede aislar de una colección de O. sativa utilizando toda o una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID N^o : 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11. Más aún, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 se puede aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores de oligonucleótidos diseñados basándose en esta secuencia. Por ejemplo, el ARNm se puede aislar a partir de las células de una planta (por ejemplo, mediante el procedimiento de extracción con guanidinio-tiocianato de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299) y se puede preparar el ADNc utilizando una transcriptasa inversa (por ejemplo, la transcriptasa inversa Moloney MLV, disponible en Gibco/BRL, Bethesda, MD; o la transcriptasa inversa AMV, disponible en Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa se pueden diseñar basándose en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11. Una molécula de ácido nucleico de la descripción se puede amplificar utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación convencionales con PCR. La molécula de ácido nucleico amplificada de ese modo se puede clonar en un vector apropiado y se caracteriza por un análisis de la secuencia del ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de AHAS, se pueden preparar mediante técnicas sintéticas convencionales, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automático.

Los ácidos nucleicos de AHAS de la presente descripción pueden comprender secuencias que codifican una proteína de AHAS (es decir, "regiones codificantes"), así como también secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción pueden comprender solo las regiones codificantes de un gen AHAS o pueden contener fragmentos genómicos completos, aislados a partir del ADN genómico. Una región codificante de estas secuencias se indica como una "posición ORF". Más aún, la molécula de ácido nucleico de la descripción puede comprender una porción de una región codificante de un gen AHAS, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o un cebador. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación de los genes AHAS procedentes de O. sativa permiten la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de homólogos de AHAS en otros tipos de células y organismos, así como también homólogos de AHAS procedentes de otras plantas de arroz y especies relacionadas. La porción de la región codificante también puede codificar un fragmento biológicamente activo de una proteína de AHAS.

Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "porción biológicamente activa de" una proteína de AHAS se entiende que incluye una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, de una proteína de AHAS que cuando se produce en una planta, aumenta la tolerancia de la planta frente a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los métodos para cuantificar una tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona se proporcionan en los Ejemplos a continuación. Las porciones biológicamente activas de una proteína de AHAS incluyen péptidos obtenidos a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12 que incluyen menos aminoácidos que una proteína de AHAS de longitud completa e imparten una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona después de la expresión en una planta. Típicamente, las porciones biológicamente activas (por ejemplo, péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o un motivo con por lo menos una actividad de una proteína de AHAS. Más aún, otras porciones biológicamente activas en las que se eliminan otras regiones del polipéptido, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y se evalúan para una o más de las actividades descritas en esta memoria. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una proteína de AHAS incluyen uno o más dominios conservados seleccionados a partir del grupo que consiste en un Dominio A, un Dominio B, un Dominio C, un Dominio D y un Dominio E, en donde el dominio conservado contiene una mutación.

La descripción también incluye polipéptidos de fusión o quiméricos de AHAS. Tal y como se utiliza en esta memoria, un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" de AHAS comprende un polipéptido de AHAS ligado funcionalmente a un polipéptido que no es AHAS. Un "polipéptido que no es AHAS" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que no es sustancialmente idéntica a un polipéptido de AHAS, por ejemplo, un polipéptido que no es una isoenzima de AHAS, cuyo péptido realiza una función diferente que un polipéptido de AHAS. Tal y como se utiliza en esta memoria con respecto al polipéptido de fusión, la expresión "ligado funcionalmente" está destinada a indicar que el polipéptido de AHAS y el polipéptido que no es AHAS se fusionan entre sí de modo que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es AHAS se puede fusionar al extremo terminal N o al extremo terminal C del polipéptido de AHA^s . Por ejemplo, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión GST-AHAS en el que la secuencia de AHAS se fusiona con el extremo terminal C de la secuencia GST. Tales polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de los polipéptidos de AHAS recombinantes. El polipéptido de fusión puede ser un polipéptido de AHAS que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo terminal N. En ciertas células anfitrionas (por ejemplo, células anfitrionas de mamífero), la expresión y/o secreción de un polipéptido de AHAS se puede aumentar a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de AHAS que tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO: 2, ^s E^q ID NO: 4, S^eQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12, se puede crear al introducir una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos dentro de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11, de tal manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen dentro del polipéptido codificado. Las mutaciones se pueden introducir dentro de una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ^s E^q ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos.

Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácidos tienen cadenas laterales similares que se han definido en la técnica. Esas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de un aminoácido no esencial previsto en un polipéptido de AHAS, se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente se pueden introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de AHAS, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden escrutar para estudiar una actividad de AHAS descrita en esta memoria para identificar los mutantes que conservan la actividad de AHAS. Después de la mutagénesis de la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11, el polipéptido codificado se puede expresar recombinantemente y la actividad del polipéptido se puede determinar al analizar la tolerancia frente a la imidazolinona de una planta que expresa el polipéptido como se describe en los Ejemplos más adelante.

Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de las dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para fines de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de un polipéptido para una alineación óptima con el otro polipéptido). Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El mismo tipo de comparación se puede hacer entre dos secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). Para los fines de la presente descripción, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina utilizando el paquete de programas informáticos Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Se usa una penalización por apertura de hueco de 15 y una penalización por extensión de hueco de 6,66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos. Una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,1 se utilizan para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Todos los demás parámetros se establecen en las configuraciones predeterminadas.

Se entiende que para los fines de determinar la identidad de secuencia, cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo. Preferiblemente, los polipéptidos de AHAS aislados descritos en esta memoria son por lo menos aproximadamente 50-60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% o 90-95% y lo más preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa mostrada en SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.

Adicionalmente, se pueden crear ácidos nucleicos de AHAS optimizados. Preferiblemente, un ácido nucleico de AHAS optimizado codifica un polipéptido de AHAS que modula la tolerancia de la planta frente a los herbicidas de imidazolinona y más preferiblemente aumenta la tolerancia de la planta frente a un herbicida de imidazolinona después de su sobreexpresión en la planta. Tal y como se utiliza en esta memoria, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico que se modifica genéticamente para aumentar su expresión en una planta o un animal dado. Para proporcionar ácidos nucleicos de AHAS optimizados vegetales, la secuencia de ADN del gen se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes vegetales altamente expresados; 2) tener un contenido en A+T en una composición de bases de nucleótidos que se encuentra sustancialmente en las plantas; 3) formar una secuencia de inicio vegetal, 4) eliminar las secuencias que provocan desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación del ARN o que forman estructuras secundarias de horquilla o sitios de corte y empalme del ARN. Una expresión aumentada de los ácidos nucleicos de AHAS en las plantas se puede lograr utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en las plantas en general o en una planta particular. Los métodos para optimizar la expresión del ácido nucleico en las plantas se pueden encontrar en los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; Solicitud de PCT n° WO 91/16432; Patente de los Estados Unidos n° 5.380.831; Patente de los Estados Unidos n° 5.436.391; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; y Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Tal y como se utiliza en esta memoria, "frecuencia de uso de codones preferida" se refiere a la preferencia mostrada por una célula anfitriona específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, el número de apariciones de ese codón en el gen se divide por el número total de apariciones de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. De forma similar, la frecuencia de uso de codones preferido mostrada por una célula anfitriona se puede calcular al promediar la frecuencia del uso de codón preferida en una gran cantidad de genes expresados por la célula anfitriona. Se prefiere que este análisis se limite a los genes que se expresan altamente por la célula anfitriona. El porcentaje de desviación de la frecuencia del uso de codones preferida para un gen sintético de la frecuencia empleada por una célula anfitriona, se calcula primero determinando el porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un codón único de la de la célula anfitriona y luego obteniendo la desviación promedio de todos los codones. Tal y como se define en esta memoria, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación promedio total del uso de codones de un gen optimizado del de una célula anfitriona se calcula utilizando la ecuación 1A = n = 1 Z Xn - YnXn multiplicado por 100 Z, en donde Xn = frecuencia de uso del codón n en la célula anfitriona; Yn = frecuencia de uso del codón n en el gen sintético, n representa un codón individual que especifica un aminoácido y el número total de codones es Z. La desviación total de la frecuencia de uso de codones, A, para todos los aminoácidos, preferiblemente debe ser menor de aproximadamente el 25% y más preferiblemente menor de aproximadamente el 10%.

Por lo tanto, se puede optimizar un ácido nucleico de AHAS de tal manera que su frecuencia de distribución del uso de codones se desvía, preferiblemente, no más del 25% de la de los genes de la planta altamente expresados y, más preferiblemente, no más de aproximadamente el 10%. Adicionalmente, se considera el porcentaje del contenido en G+C de la tercera base degenerada (las monocotiledóneas parecen favorecer G+C en esa posición, mientras que las dicotiledóneas no). También se reconoce que el nucleótido XCG (en donde X es A, T, C o G) es el codón menos preferido en dicotiledóneas, mientras que el codón XTA se evita en las monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos de AHAS optimizados de esta invención también tienen preferiblemente índices de evitación del doblete CG y TA que se aproximan mucho a los de la planta anfitriona seleccionada (es decir, Oryza sativa). Más preferiblemente eso índices se desvían del anfitrión en no más de aproximadamente el 10-15%.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de AHAS descritos anteriormente, en esta memoria se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido de las mismas. Se cree que los polinucleótidos antisentido inhiben la expresión génica de un polinucleótido diana al unirse específicamente al polinucleótido diana e interferir con la transcripción, el corte y empalme, el transporte, la traducción y/o la estabilidad del polinucleótido diana. Los métodos se describen en la técnica anterior para dirigir el polinucleótido antisentido al ADN cromosómico, a un transcrito de ARN primario o a un ARNm procesado. Preferiblemente, las regiones diana incluyen los sitios de corte y empalme, codones de inicio de la traducción, codones de terminación de la traducción y otras secuencias dentro del marco de lectura abierta.

El término "antisentido", para los fines de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que es suficientemente complementario a todo o a una porción de un gen, transcrito primario o ARNm procesado, con el fin de interferir en la expresión del gen endógeno. Polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de emparejar pares de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad convencionales de Watson-Crick. Específicamente, las purinas se emparejarán con las pirimidinas para formar una combinación de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con timidina (A:T) en el caso de ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que los dos polinucleótidos de pueden hibridar entre sí, incluso si no son completamente complementarios entre sí, dado que cada uno tiene por lo menos una región que es sustancialmente complementaria a la otra. La expresión “ácido nucleico antisentido" incluye ARN de hebra sencilla así como también casetes de expresión de ADN de hebra doble que se pueden transcribir para producir un ARN antisentido. Los ácidos nucleicos antisentido "activos" son moléculas de ARN antisentido que son capaces de hibridarse selectivamente con un transcrito primario o ARNm que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia del polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.

Además de los ácidos nucleicos de AHAS y los polipéptidos descritos anteriormente, esos ácidos nucleicos y polipéptidos fijados a un resto se describen en esta memoria. Esos restos incluyen, pero no se limitan a, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de entrega, restos de reacción, restos de unión y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos que tienen restos fijados son las sondas y los cebadores. Las sondas y los cebadores comprenden típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones restrictivas con por lo menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de una hebra codificante de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11, una secuencia antisentido de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 o mutantes que ocurren de forma natural de los mismos. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 se pueden utilizar en reacciones PCR para clonar homólogos de AHAS. Las sondas basadas en la secuencia de nucleótidos de AHAS se pueden utilizar para detectar transcritos o secuencias genómicas que las codifican o polipéptidos homólogos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador fijado a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas se pueden utilizar como una parte de un kit de prueba de marcador genómico para identificar células que expresan un polipéptido de AHAS, tal como midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica AHAS en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de AHAS o determinando si un gen AHAS genómico ha mutado o se ha delecionado.

Adicionalmente, en esta memoria se describe un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de AHAS como se ha descrito anteriormente, en donde la expresión del vector en una célula anfitriona tiene como resultado una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula anfitriona. Tal y como se utiliza en esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido," que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar dentro del genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran dentro del genoma de la célula anfitriona después de la introducción dentro de la célula anfitriona y por lo tanto se replican junto con el genoma del anfitrión. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados funcionalmente. Tales vectores se denominan en esta memoria "vectores de expresión." En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la descripción se entiende que incluye esas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante descritos en esta memoria comprenden un ácido nucleico de la presente descripción en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células anfitrionas que se van a utilizar para la expresión, los cuales se ligan funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Con respecto a un vector de expresión recombinante, "ligado funcionalmente" se entiende que la secuencia de nucleótidos de interés se liga a la o las secuencias reguladoras, de forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula anfitriona cuando el vector se introduce dentro de la célula anfitriona). La expresión "secuencia reguladora" se entiende que incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C^a (1990) y Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick y Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluyendo sus referencias. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células anfitrionas y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células anfitrionas o bajo ciertas condiciones. Los expertos en la técnica apreciarán que el que diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en esta memoria se pueden introducir dentro de las células anfitrionas para producir de este modo polipéptidos o péptidos que incluyen polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal y como se describen en esta memoria (por ejemplo, polipéptidos de AHAS, polipéptidos de fusión, etc.).

Preferiblemente los polipéptidos de AHAS se expresan en plantas y células vegetales tales como células de plantas unicelulares (tales como algas) (véase Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y sus referencias) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, espermatofitos, tales como plantas de cultivo). Un polinucleótido de AHAS se puede "introducir" dentro de una célula vegetal por cualquier medio, que incluye transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, biolística y similares.

Los métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas que incluyen células vegetales se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como la tolerancia incrementada frente a los herbicidas de imidazolinona es un carácter general que se desea heredar en una amplia variedad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, mandioca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanáceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arborícolas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (aceite de palma, de coco), hierbas perennes y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo también son plantas diana preferidas para una modificación genética, como se describe en esta memoria. Preferiblemente la planta es una planta de arroz. Los cultivos forrajeros incluyen, pero no se limitan a, pasto de trigo, alpiste, cebadilla criolla, césped de centeno silvestre, poa, pasto ovillo, alfalfa, salfoín, loto, trébol híbrido, trébol rojo y trébol de olor.

La transfección de un polinucleótido de AHAS dentro de una planta se puede lograr mediante la transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Un método de transformación conocido por los expertos en la técnica es la inmersión de una planta florecida dentro de una solución de Agrobacteria, en donde la Agrobacteria contiene el ácido nucleico de AHAS, seguido por la siembra de los gametos transformados. La transformación de plantas mediada por Agrobacterium se puede realizar utilizando, por ejemplo, la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación se puede realizar mediante técnicas de transformación y regeneración convencionales (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res.13: 4777-4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. -Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. y Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza se puede transformar por medio de una transformación del cotiledón o el hipocotilo. (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91: 694-701). El uso de antibióticos para Agrobacterium y una selección de plantas dependen del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de semillas de colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador vegetal seleccionable. Se puede realizar una transferencia génica mediada por Agrobacterium al lino utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja se puede realizar utilizando, por ejemplo, una técnica descrita en los documentos de Patente europea n° 0424 047, Patente estadounidense n° 5.322.783, Patente europea n° 0397 687, Patente estadounidense No. 5.376.543 o Patente estadounidense n° 5.169.770. La transformación del maíz se puede lograr mediante el bombardeo de partículas, la captura de ADN mediada por polietilenglicol o por medio de la técnica de fibra de carburo de sílice. (Véase, por ejemplo, Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de la transformación del maíz se encuentra en el documento de Patente estadounidense n° 5.990.387 y un ejemplo específico de la transformación del trigo se puede encontrar en el documento de Solicitud PCT n° WO 93/07256.

El polinucleótido de AHAS introducido se puede conservar en la célula vegetal de forma estable si se incorpora dentro de un replicón autónomo no cromosómico o se integra en los cromosomas de la planta. Alternativamente, el polinucleótido de AHAS introducido puede estar presente en un vector no replicante extracromosómico y se puede expresar transitoriamente o estar activo de forma transitoria. Se puede crear un microorganismo recombinante homólogo en donde el polinucleótido de AHAS se integra dentro de un cromosoma, se prepara un vector que contiene por lo menos una porción de un gen AHAS en el que se ha introducido una deleción, una adición o una sustitución para alterar de ese modo, por ejemplo, interrumpir funcionalmente, el gen AHAS endógeno y para crear un gen AHAs . Para crear una mutación puntual por medio de recombinación homóloga, se pueden utilizar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Otros procedimientos de recombinación homóloga en las especies de Oryza también se conocen bien en la técnica y se contemplan para el uso en esta memoria.

En el vector de recombinación homóloga, el gen AHAS puede estar flanqueado en sus extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen AHAS para permitir que tenga lugar una recombinación homóloga entre el gen AHAS exógeno transportado por el vector y un gen AHAS endógeno, en un microorganismo o una planta. La molécula adicional de ácido nucleico de AHAS flanqueante tiene una longitud suficiente para una recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como 3') se incluyen en el vector (véase, por ejemplo, Thomas, K. R., and Capecchi, M. R., 1987, Cell 51: 503 para una descripción de los vectores de recombinación homóloga o Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8): 4368-4373 para la recombinación basada en el ADNc en Physcomitrella patens). Sin embargo, debido a que el gen AHAS difiere normalmente del gen AHAS en muy pocos aminoácidos, una secuencia flanqueante no siempre es necesaria. El vector de recombinación homóloga se introduce dentro de un microorganismo o una célula vegetal (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilenglicol) y las células en las que el gen AHAS introducido se ha recombinado homólogamente con el gen AHAS endógeno, se seleccionan utilizando métodos conocidos en la técnica.

Se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten una expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen AHAS en un vector puesto bajo el control del operón lac, permite la expresión del gen AHAS solo en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

Ya sea presente en un vector no replicante extracromosómico o en un vector que se integra dentro de un cromosoma, el polinucleótido de AHAS reside preferiblemente en un casete de expresión vegetal. Un casete de expresión vegetal contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en células vegetales que están ligadas funcionalmente, de modo que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción mediante señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas originadas a partir del t-ADN de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTIACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de los mismos, pero también son adecuados todos los demás terminadores funcionalmente activos en las plantas. Como la expresión de un gen vegetal no se limita muy frecuentemente a niveles transcripcionales, un casete de expresión vegetal contiene preferiblemente otras secuencias ligadas funcionalmente como potenciadores traduccionales tales como la secuencia “overdrive” que contiene la secuencia líder 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco que mejora la relación de polipéptido frente al ARN (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen aquellos detallados en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; and Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

La expresión de un gen vegetal se debe ligar funcionalmente a un promotor apropiado que confiere una expresión génica en un momento oportuno, una forma preferida para el tipo celular o para el tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión descritos en esta memoria incluyen cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a aquellos que se pueden obtener a partir de plantas, virus vegetales y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium.

El promotor puede ser constitutivo, inducible, preferido para un estadio de desarrollo, preferido para un tipo celular, preferido para un tejido o preferido para un órgano. Los promotores constitutivos son activos en la mayoría de las condiciones. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores CaMV 19S y 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302) el promotor Sep1, el promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Molec. Biol. 2:163-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor de ubicuitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, el promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), el promotor GRP1-8, el promotor de la deshidrogenasa de alcohol cinnamílico (documento de Patente estadounidense n° 5.683.439), los promotores procedentes del T-ADN de Agrobacterium, tales como manopina sintasa, nopalina sintasa y octopina sintasa, la subunidad pequeña del promotor de la ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRU-BISCO) y similares.

Los promotores inducibles son activos en ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de agentes patógenos, condiciones anaerobias y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica se induce por choque térmico; el promotor PPDK se induce con luz; el promotor ^p R-1 del tabaco, Arabidopsis y maíz es inducible mediante infección con un agente patógeno; y el promotor Adh1 se induce por hipoxia y estrés por frío. La expresión de un gen vegetal también se puede facilitar por medio de un promotor inducible (para una revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.

48:89-108). Los promotores inducibles químicamente son especialmente adecuados si se desea una expresión génica específica de un momento. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible con ácido salicílico (documento de solicitud PCT n° WO 95/19443), un promotor inducible con tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J.

2:397-404) y un promotor inducible con etanol (documento de solicitud PCT n° WO 93/21334).

Los promotores preferidos para un estadio de desarrollo se expresan preferiblemente en ciertos estadios del desarrollo. Los promotores preferidos para un tejido y órgano incluyen aquellos que se expresan preferiblemente en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas o xilema. Ejemplos de promotores preferidos para un órgano y para un tejido incluyen, pero no se limitan a promotores preferidos para el fruto, preferidos para el óvulo, preferidos para el tejido masculino, preferidos para la semilla, preferidos para el tegumento, preferidos para el tubérculo, preferidos para el pedúnculo, preferidos para el pericarpio y preferidos para la hoja, preferidos para el estigma, preferidos para el polen, preferidos para la antera, preferidos para el pétalo, preferidos para el sépalo, preferidos para el pedicelo, preferidos para la silicua, preferidos para el tallo, preferidos para la raíz y similares. Los promotores preferidos para la semilla se expresan preferiblemente durante el desarrollo de la semilla y/o su germinación. Por ejemplo, los promotores preferidos para la semilla pueden ser preferidos para el embrión, preferidos para el endospermo y preferidos para la cubierta de la semilla. Véase Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108: Ejemplos de promotores preferidos para la semilla incluyen, pero no se limitan a la celulosa sintasa (celA), Cim1, gama-zeína, globulina-1, maíz 19 kD zeína (cZ19B1) y similares.

Otros promotores adecuados preferidos para un tejido o preferidos para un órgano incluyen el promotor del gen napina de la colza (documento de Patente estadounidense n° 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet 225(3):459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento de solicitud PCT n° WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (documento de Patente estadounidense n° 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (documento de solicitud PCT n° WO 91/13980) o el promotor de la legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), así como también promotores que confieren una expresión específica para la semilla en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados a tener en cuenta son el promotor del gen Ipt2 o Ipt1 de la cebada (documentos de solicitud PCT n° WO 95/15389 y solicitud PCT n° WO 95/23230) o aquellos descritos en el documento de solicitud PCT n° WO 99/16890 (promotores procedentes del gen de la hordeína de la cebada, gen de la glutelina del arroz, gen de la orizina del arroz, gen de la prolamina del arroz, gen de la gliadina del trigo, gen de la glutelina del trigo, gen de la glutelina de la avena, gen de la kasirina del sorgo y gen de la secalina del centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión descritos en esta memoria incluyen, pero no se limitan a, el promotor de la proteína principal de unión a clorofila a/b, promotores de histonas, el promotor Ap3, el promotor de pconglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de soja, el promotor de zeína 15kD de maíz, el promotor de zeína 22kD, el promotor de zeína 27kD, el promotor de g-zeína, los promotores cerosos, reducido 1, reducido 2 y bronce, el promotor Zm13 (documento de Patente estadounidense n° 5.086.169), los promotores de la poligalacturonasa de maíz (PG) (documentos de Patente estadounidense n° 5.412.085 y 5.545.546) y el promotor SGB6 (documento de Patente estadounidense n° 5.470.359), así como también promotores sintéticos u otros promotores naturales.

La flexibilidad adicional para controlar la expresión de un gen heterólogo en las plantas se puede obtener al utilizar dominios de unión de ADN y elementos de respuesta procedentes de fuentes heterólogas (es decir, dominios de unión a ADN procedentes de fuentes no vegetales). Un ejemplo de un dominio de ese tipo de unión a ADN heterólogo, es el dominio de unión a ADN LexA (Brent and Ptashne, 1985, Cell 43:729-736).

Adicionalmente, en esta memoria se describen células anfitrionas en las que un vector de expresión recombinante de la presente descripción se ha introducido tal y como se describe en esta memoria. Las expresiones "célula anfitriona" y "célula anfitriona recombinante” se utilizan indistintamente en esta memoria. Se entiende que tales términos no se refieren solo a la célula objeto particular, sino que también se aplican a la progenie o la progenie potencial de esa célula. Debido a que pueden tener lugar ciertas modificaciones en las generaciones futuras debido a una mutación o a influencias ambientales, esa progenie de hecho, puede que no sea idéntica a la célula progenitora, pero todavía se incluye dentro del alcance del término tal y como se utiliza en esta memoria. Una célula anfitriona puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polinucleótido de AHAS se puede expresar en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, callos de plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células anfitrionas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

Una célula anfitriona descrita en esta memoria, tal como una célula anfitriona procariótica o eucariótica en cultivo, se puede utilizar para producir (es decir, expresar) un polinucleótido de AHAS. De acuerdo con lo anterior, la descripción también proporciona métodos para producir polipéptidos de AHAS utilizando las células anfitrionas descritas en esta memoria. El método puede comprender cultivar la célula anfitriona descrita en esta memoria (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de AHAS o en la que se ha introducido el genoma de un gen que codifica el polipéptido de tipo silvestre o de AHAS) en un medio adecuado hasta que se produce el polipéptido de AHAS. El método puede comprender adicionalmente aislar los polipéptidos de AHAs del medio o de la célula anfitriona. Además, en esta memoria se describen polipéptidos de AHAS aislados adicionales y porciones biológicamente activas de los mismos. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o una porción biológicamente activa del mismo está exenta de cualquier material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinante o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetizan químicamente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de polipéptido de AHAS en las que se separa el polipéptido de algunos de los componentes celulares de las células en las que se produce de forma natural o recombinantemente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" puede incluir preparaciones de un polipéptido de AHAS que tienen menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de material que no es AHAS (también denominado en esta memoria "polipéptidos contaminantes"). Más preferiblemente menos de aproximadamente un 20% de material que no es AHAS, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% de material que no es AHAS y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% de material que no es AHAS.

Cuando el polipéptido de AHAS o la porción biológicamente activa del mismo, se produce recombinantemente, también está de forma preferible sustancialmente exento de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% del volumen de la preparación de polipéptido. La expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido de AHAS en las que se separa el polipéptido de los precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. La expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" puede incluir preparaciones de un polipéptido de AHAS que tiene menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son AHAS, más preferiblemente menos de aproximadamente un 20% de precursores químicos o productos químicos que no son AHAS, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% de precursores químicos o productos químicos que no son AHAS y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% de precursores químicos o productos químicos que no son AHAS. Preferiblemente, los polipéptidos aislados o las porciones biológicamente activas de los mismos, carecen de polipéptidos contaminantes del mismo organismo a partir del cual se obtiene el polipéptido de AHAS. Típicamente, tales polipéptidos se producen mediante una expresión recombinante de, por ejemplo, un polipéptido de AHAS de Oryza sativa en plantas diferentes a Oryza sativa o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

El polinucleótido de AHAS y las secuencias de polipéptido descritas en esta memoria tienen una variedad de usos. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácido descritos en esta memoria se pueden utilizar para transformar plantas, modulando de este modo la tolerancia de la planta frente a los herbicidas de imidazolinona. De acuerdo con lo anterior, se describe en esta memoria un método para producir una planta transgénica que tiene una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona que comprende, (a) transformar una célula vegetal con uno o más vectores de expresión que comprenden uno o más ácidos nucleicos de AHAS variantes y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una tolerancia incrementada frente a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. El ácido nucleico de AHAS variante puede codificar un polipéptido de AHAS variante que comprende una mutación de alanina a treonina, en comparación con un polipéptido de AHAS de tipo silvestre.

Adicionalmente, se describen en esta memoria métodos para modificar la tolerancia de una planta frente a un herbicida de imidazolinona que comprenden modificar la expresión de uno o más ácidos nucleicos de AHAS variantes. La tolerancia de la planta frente al herbicida de imidazolinona se puede aumentar o reducir tal como se logra al aumentar o reducir la expresión de un polinucleótido de AHAS, respectivamente. Preferiblemente, la tolerancia de la planta frente al herbicida de imidazolinona se incrementa al aumentar la expresión de un polinucleótido de AHAS. El ácido nucleico de AHAS variante puede codificar un polipéptido de AHAS variante que comprende una mutación de alanina a treonina, en comparación con un polipéptido de AHAS de tipo silvestre. La expresión de un polinucleótido de AHAS se puede modificar mediante cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. Se pueden utilizar métodos para aumentar la expresión de los polinucleótidos de AHAS en donde la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en los que la planta es transgénica, la planta se puede transformar con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican AHAS descritos anteriormente, o la planta se puede transformar con un promotor que dirige la expresión de los polinucleótidos de AHAS endógenos en la planta, por ejemplo. Un promotor de ese tipo puede ser específico para un tejido o estar regulado por el desarrollo. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener una expresión modificada del polinucleótido de AHAS endógeno mediante la inducción de un promotor natural. La expresión de los polinucleótidos que comprenden una secuencia de polinucleótidos tal y como se define en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 en las plantas diana, se puede llevar a cabo, pero no se limita a, mediante uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducido por una sustancia química y (c) sobreexpresión de un promotor modificado genéticamente, por ejemplo, con factores de transcripción derivados del dedo de zinc (Greisman & Pabo,1997, Science 275:657).

Preferiblemente, la transcripción del polinucleótido de AHAS se puede modular utilizando factores de transcripción derivados del dedo de zinc (ZFPs), tal y como se describe en Greisman and Pabo, 1997, Science 275:657 y producidos por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFPs comprenden un dominio de reconocimiento del ADN y un dominio funcional que provoca una activación o represión de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de AHAS. Por lo tanto, se pueden crear ZFPs activantes y de represión que reconocen específicamente los promotores del polinucleótido de AHAS descritos anteriormente y se utilizan para aumentar o reducir la expresión del polinucleótido de AHAS en una planta, modulando por lo tanto la tolerancia frente al herbicida de la planta.

Como se ha descrito con más detalle anteriormente, las plantas producidas por los métodos de la presente descripción pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas. Las plantas se pueden seleccionar a partir de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, aceite de palma, coco, pastos perennes y cultivos forrajeros, por ejemplo. Preferiblemente, la planta es una planta de arroz. Los cultivos forrajeros incluyen, pero no se limitan a, pasto de trigo, alpiste, cebadilla criolla, césped de centeno silvestre, poa, pasto ovillo, alfalfa, salfoín, loto, trébol híbrido, trébol rojo y trébol de olor. En cada uno de los métodos descritos anteriormente, la célula vegetal incluye, pero no se limita a, un protoplasto, una célula productora de gametos y una célula que se regenera en una planta completa. Tal y como se utiliza en esta memoria, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal o parte de una planta que contiene todo o parte de por lo menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra establemente dentro de un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que se transmite a las generaciones sucesivas.

El cultivo tisular de diversos tejidos de arroz y la regeneración de plantas a partir de los mismos son bien conocidos y se han publicado ampliamente. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Chu, Q. R., et al., (1999) "Use of bridging parents with high anther culturability to improve plant regeneration and breeding value in rice", Rice Biotechnology Quarterly 38: 25-26; Chu, Q. R., et al., (1998), "A novel plant regeneration medium for rice anther culture of Southern U.S. crosses", Rice Biotechnology Quarterly 35:15-16; Chu, Q. R., et al., (1997), "A novel basal medium for embryogenic callus induction of Souther US crosses", Rice Biotechnology Quarterly 32:19-20; y Oono, K, "Broadening the Genetic Variability By Tissue Culture Methods', Jap. J. Breed. 33 (Suppl.2), 306-307, illus. 1983. La presente descripción muestra composiciones y métodos para aumentar la tolerancia frente a la imidazolinona de una planta de arroz o una semilla, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta o la semilla. Preferiblemente la tolerancia frente a la imidazolinona de una planta de arroz o una semilla aumenta de tal manera que la planta o la semilla puede resistir la aplicación de un herbicida de imidazolinona de preferiblemente aproximadamente 10-400 g ai ha-1, más preferiblemente 20-160 g ai ha_1 y lo más preferiblemente 40-80 g ai ha_1. Tal y como se utiliza en esta memoria, "resistir" la aplicación de un herbicida de imidazolinona significa que la planta no muere ni se lesiona mediante esa aplicación.

Adicionalmente, en esta memoria se describe un método para controlar malezas en la proximidad de una planta de arroz, que comprende aplicar un herbicida de imidazolinona a las malezas y a la planta de arroz, en donde la planta de arroz ha aumentado la tolerancia frente al herbicida imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta de arroz, y en donde la planta de arroz tolerante a la imidazolinona comprende por lo menos un ácido nucleico de AHAS variante. El ácido nucleico de AHAS variante puede codificar un polipéptido de AHAS variante que comprende una mutación de alanina a treonina en comparación con un polipéptido de AHAS de tipo silvestre. Preferiblemente, la mutación está en un residuo de aminoácido que corresponde a la posición 96 de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12. Al proporcionar plantas de arroz que tienen una tolerancia incrementada frente a la imidazolinona, se puede emplear una amplia variedad de formulaciones para proteger las plantas de arroz de las malezas, con el fin de mejorar el crecimiento de la planta y reducir la competencia por los nutrientes. Un herbicida de imidazolinona se puede utilizar por sí mismo para un control de malezas pro-emergencia, post­ emergencia, pre-plantación y en el momento de la plantación, en áreas que rodean las plantas de arroz descritas en esta memoria, o se puede utilizar una formulación del herbicida de imidazolinona que contiene otros aditivos. También se puede utilizar el herbicida de imidazolinona como un tratamiento de las semillas. Los aditivos encontrados en una formulación del herbicida de imidazolinona incluyen otros herbicidas, adyuvantes, agentes de propagación, agentes adhesivos, agentes estabilizantes o similares. La formulación del herbicida de imidazolinona puede ser una preparación húmeda o seca o y puede incluir, pero no se limita a, polvos fluidos, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida de imidazolinona y las formulaciones de herbicida se pueden aplicar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante rociado, irrigación, pulverización o similares. La invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como que imponen limitaciones sobre el alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1

Mutagénesis y selección de líneas de arroz tolerantes a la imidazolinona

Se trataron dos muestras de semillas (600 g de cada una) del cultivar de arroz IRGA 417 con una solución acuosa de azida de sodio 0,001 M a pH 3 (tampón fosfato 0,067 M) para producir la semilla M1. Este tratamiento se aplicó remojando cada muestra de semilla en un Erlenmeyer de dos litros que contenía un litro de solución de azida de sodio, con agitación constante, durante 18 horas, a temperatura ambiente. Después del tratamiento, las semillas se enjuagaron en agua potable y, luego, las semillas se secaron al aire parcialmente sobre hojas de papel secante con el fin de extraer la humedad de la superficie de las semillas. Después de esto, las semillas tratadas se sembraron directamente en el vivero.

Las semillas M1 se plantaron en el vivero con una sembradora experimental Wintersteiger con una tasa de 50 plantas por metro cuadrado. Las líneas de verificación de una variedad de tipo silvestre IRGA 417 se plantaron con una sembradora de tipo empuje. Las líneas se cultivaron en condiciones de inundación hasta la madurez (26% de humedad de grano) y se cosecharon a granel. La semilla recolectada (M2) se secó en un secador por convección durante 14 horas a 45°C. Las semillas M2 se mantuvieron en un almacenamiento cerrado hasta la siguiente temporada.

La semilla procedente de las plantas M1 (semilla M2) se plantó con un sembrador experimental para grandes áreas (AVEC) con una tasa de 50 kg/ha. Finalmente se estableció una estimación de 3 ha que comprendía una población de 6x106 plantas. Las líneas de verificación de una variedad de tipo silvestre IRGA 417 se plantaron con una sembradora de tipo empuje. El área completa se sometió a una presión de selección con una mezcla de dos herbicidas de imidazolinona. Se realizaron tres aplicaciones separadas de los herbicidas de imidazolinona con un rociador comercial en diferentes direcciones para evitar cualquier escape y tener como resultado un tratamiento 3X. Se roció un volumen total de 222 l/ha a 3,45 bar (50 psi), con boquillas Teejets 8002, en cada aplicación de herbicidas de imidazolinona.

La tasa del tratamiento 1X era una mezcla de Arsenal (imazapir 75 g a.i/ha) y Cadre (imazapic 24,85 g a.i/ha) en una solución acuosa con un tensioactivo no iónico (Citowet) con una tasa del 0,25% (v/v). Las aplicaciones se realizaron en es estadio de cuatro hojas de las plantas de arroz. No se registraron precipitaciones durante los 7 días después de los tratamientos.

Se realizaron observaciones en horarios regulares para supervisar el área completa. Después de 90 días, los individuos que sobrevivieron se marcaron y se trasplantaron al invernadero para una multiplicación asexual y un aumento de la producción de semillas. Se cultivó un total de 10 plantas individuales y la semilla se cosechó y se secó en una incubadora de semillas durante 7 días a 50°C. No sobrevivió ninguna planta de las líneas de verificación después del tratamiento con herbicida.

Se sembraron semillas de plantas M2 seleccionadas en recipientes individuales en condiciones de invernadero. Se aplicó un tratamiento 2X con un rociador portátil R&D en mochila, dividido en dos aplicaciones de tasa 1X de Arsenal (Imazapir 75 g a.i/ha) y Cadre (Imazapic 24,85 g a.i/ha) en una solución acuosa con un tensioactivo no iónico (Citowet) con una tasa del 0,25% (v/v). Las plantas se cultivaron hasta la madurez (26% de humedad del grano) y se cosecharon manualmente. La semilla recolectada se sometió a un tratamiento de interrupción del reposo de 7 días a 50°C y se preparó para una siembra tardía en la región norte.

Las semillas de las poblaciones de tres plantas tolerantes seleccionadas, que crecían en invernadero se plantaron en el campo en Las Palmas Chaco para incrementar las semillas. Las tres poblaciones identificadas como tolerantes a los herbicidas de imidazolinona se denominaron IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5. Estas se sembraron con una sembradora de arroz comercial con una tasa de 50 kg/ha. Se aplicó un tratamiento de 2X herbicidas de imidazolinona, Arsenal (Imazapir 75 g a.i/ha) y Cadre (Imazapic 24 g a.i/ha) en una solución acuosa con un tensioactivo no iónico (Citowet) a una tasa del 0,25% (v/v) en el estadio de cuatro a cinco hojas de las plantas de arroz. No se observaron síntomas fitotóxicos en ninguna de las tres poblaciones. Las tres poblaciones produjeron la parcela de control tratada con un herbicida para pasto regular. No se observaron segregantes y se produjo una población altamente homogénea en caracteres agronómicos y de tolerancia.

Ejemplo 2

Caracterización molecular de IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5

Se extrajo ADN genómico de las hojas de plántulas que crecían en invernadero de líneas de arroz IMINTA 1, IMINTA 4, e IMINTA 5 de tipo silvestre y variante, y el gen AHAS se amplifica mediante PCR. El producto de la PCR se secuenció utilizando protocolos convencionales. Un análisis de la secuencia reveló un solo cambio de pares de bases en la región codificante del gen AHAS que provocaba un cambio de aminoácidos de Alanina en el aminoácido 96 en la línea de tipo silvestre a Treonina 96 en las líneas mutantes. Esta mutación se corresponde con un cambio de aminoácido en Alanina 122 en la secuencia de AHAS de Arabidopsis a Treonina 122. La secuencia de nucleótidos de AHAS para IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5 se muestra en las Figuras 1A, C y E, respectivamente como SEQ ID NOs: 1, 3 y 5; y las secuencias de aminoácidos de AHAS deducidas de IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5 se muestran en las Figuras 1B, D y F como SEQ ID NOs: 2, 4 y 6, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de AHA^s procedentes de la cepa de arroz de tipo silvestre IRGA 417, se muestran en las Figuras 1G y H, respectivamente, como SEQ ID NOs: 7 y 8. Las alineaciones de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de AHAS para IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5 se muestran en las Figuras 2 y las Figuras 3,

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la caracterización molecular de una planta de arroz que comprende amplificar, mediante PCR, un gen AHAS de una planta de arroz, en donde la planta de arroz es una planta de arroz de las líneas IMINTA 1, 4 o 5, o una progenie de la misma, y en donde la semilla de la línea de arroz IMINTA 1 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41206, la semilla de la línea de arroz IMINTA 4 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41207 y la semilla de la línea de arroz IMINTA 5 se deposita en la NCIMB con el número de designación de un depósito de patente NCIMB 41208.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende además analizar la secuencia de un producto de la PCR obtenido a partir de dicha etapa de amplificación.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el gen AHAS se obtiene a partir de una muestra de hoja.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el gen AHAS se obtiene a partir de una plántula.