ES2338665T3 - Polimeros sensibles a la temperatura. - Google Patents
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Abstract
Polímero sensible a temperatura que tiene una temperatura de solución crítica inferior que cambia durante la incubación en una solución o medio acuoso, donde el polímero es un homopolímero de una hidroxialquil(met)acrilamida hidrófobamente modificada o un interpolímero de una hidroxialquil(met)acrilamida hidrófobamente modificada y hasta 50% mol de comonómeros seleccionados entre acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, N-vinil-pirrolidona, vinil-lactatos y viniléteres.
Description
Polímeros sensibles a la temperatura.
El uso de polímeros LCST como sistemas de
liberación controlada se conoce, por ejemplo, a partir del documento
US-A-5,720,976. En esta publicación,
se describen sistemas de liberación en los que un ingrediente activo
está encapsulado en liposomas. Los polímeros LCST son injertados a
la superficie de los liposomas. Al elegir la relación de los
respectivos monómeros en los polímeros LCST, el valor de la LCST de
los polímeros se puede ajustar.
Asimismo, el documento
WO-A-92/07881 describe que la
solubilidad de la poliacrilamida cambia como consecuencia de la
presencia de grupos amida, donde los grupos tienen un efecto tampón.
Esto corresponde a la solubilidad por sí misma, no a la LCST, que no
se menciona en esta publicación.
Además, en los documentos
EP-A-0 693 508 y
DE-A-4 023 578, se describe que se
puede influenciar la sensibilidad de la temperatura de ciertos
polímeros variando la relación de los comonómeros presentes en estos
polímeros.
Ninguno de estos documentos de la técnica
anterior enseña o sugiere, no obstante, que los sistemas de
polímeros LCST se pueden modificar, como se hace de acuerdo con la
presente invención, en un modo tal que el valor LCST de los
polímeros cambia durante la incubación y como consecuencia de la
incubación, mediante lo cual se pueden obtener las ventajas
anteriormente mencionadas de la presente invención.
En el documento WO 01/09198, se describe que un
polímero sensible a temperatura se puede obtener eligiendo un
monómero adecuado para la aplicación contemplada, p. ej., un
monómero que forma un polímero farmacéuticamente aceptable. Los
monómeros adecuados son monómeros seleccionados del grupo que
comprende etilenglicol, ácido láctico, acrilamida, metacrilamida,
ácido acrílico y derivados y sus especies sustituidas. Estos
monómeros y/u otros monómeros se hacen reaccionar luego bajo
condiciones adecuadas para formar homopolímeros de uno de estos
monómeros o copolímeros, terpolímeros u otros polímeros de dos o más
monómeros.
En una realización preferida de la invención
descrita en el documento WO 01/09198, el cambio de características
de solubilidad se efectúa por hidrólisis de un grupo, como un
lactato, presente en por lo menos uno de los monómeros que forman el
polímero.
En caso de una aplicación in vivo, dicho
grupo puede ventajosamente ser un grupo hidrolizable enzimática o
químicamente.
Los grupos éster se introducen en el polímero
eligiendo monómeros adecuados como material de inicio. Los monómeros
se pueden proporcionar con grupos éster por técnicas conocidas por
el experto en la técnica.
En el documento WO 01/09198, la realización
preferida se basa en
poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), que
tiene su CP (punto de opacidad) (en agua) en alrededor de 32ºC. Es
el polímero termosensible más ampliamente estudiado y se utiliza
para diseñar sistemas de administración de fármacos termosensibles
tales como micelas poliméricas e hidrogeles. Este polímero también
se ha utilizado para modificar las propiedades de superficie de los
liposomas. El CP de la PNIPAAm se puede modular copolimerizando con
comonómeros hidrófobos o hidrófilos: los comonómeros hidrófobos
disminuyen el CP mientras que los comonómeros hidrófilos tiene el
efecto opuesto.
Los polímeros termosensibles más preferidos del
documento WO 01/09198 son copolímeros termosensibles de NIPAAm y
lactato de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
(poli(NIPAAm-co-HPMAm-lactato))
y sus copolímeros en bloque con poli(etilenglicol)
(poli(NIPAAm-co-HPMAm-lactato)-b-PEG).
Cuando \geq 35% mol de HPMAm-lactato se
copolimerizó con PNIPAAM, estos polímeros tuvieron su CP debajo de
la temperatura corporal, mientras que después de la hidrólisis de la
cadena lateral del lactato el CP aumentó por encima de 37ºC. Como
consecuencia, las micelas poliméricas formadas con
poli(NIPAAm-co-HPMAm-lactato)-b-PEG
demostraron inestabilidad controlada a temperatura corporal.
La invención se refiere a un polímero sensible a
temperatura que tiene una temperatura de solución crítica inferior o
LCST que cambia durante la incubación en una solución o medio
acuoso, donde el polímero es un homopolímero de una
hidroxialquil(met)acrilamida hidrófobamente modificada
o un interpolímero de una hidroxialquil(met)acrilamida
hidrófobamente modificada y hasta 50% mol de comonómeros
seleccionados entre acrilatos, metacrilatos, acrilamidas,
metacrilamidas,
N-vinil-pirrolidona,
vinil-lactatos y viniléteres. La modificación
hidrófoba puede, en particular, efectuarse mediante una unidad
hidrófoba, unida a la hidroxialquil(met)acrilamida
mediante un enlace degradable (como un lactato éster).
Tal como se emplea en este documento, la
expresión "hidrófobamente modificado" en un polímero de acuerdo
con la invención significa que el coeficiente de distribución P del
polímero hidrófobamente modificado es inferior a aquel del mismo
polímero sin la modificación. P se puede determinar mezclando una
cantidad del polímero en un sistema bifásico de cantidades
equivalentes de agua y octanol, dejando que la fase del sistema se
separe, midiendo las concentraciones de equilibrio del polímero en
el agua y el octanol, y dividiendo la concentración en agua por la
concentración en octanol.
Preferiblemente, el log P se reduce en por lo
menos 0,1. Más en particular, la modificación hidrófoba produce una
reducción del punto de opacidad del polímero, en comparación con la
hidroxialquil(met)acrilamida no modificada, hasta un
punto de opacidad de 37ºC o menos.
Las unidades hidrófobas adecuadas incluyen
lactatos, grupos alquilo y grupos arilo.
El alquilo puede ser alquilo lineal, ramificado
o cíclico. Puede tener entre 1 y 40 átomos de carbono, en particular
entre 2 y 18 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo
incluyen residuos de éster de ácido graso.
Los grupos arilo adecuados incluyen grupos arilo
que tienen 4-40 átomos de carbono, en particular
entre 6 y 18 átomos de carbono.
El lactato puede ser un monolactato o un
oligolactato. El término oligolactato en particular abarca
oligómeros de ácido láctico que comprenden 2-10
residuos de ácido láctico.
El alquilo en la
hidroxialquil(met)acrilamida preferiblemente se
selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, butilo,
pentilo y hexilo. Estos alquilos incluyen todos los isómeros
constitucionales de dichos alquilos (como el
n-alquilo y el isoalquilo).
Un alquilo relativamente pequeño, como metilo o
etilo, es en particular considerado adecuado para impartir una
hidrofobicidad relativamente baja del polímero, y/o un punto de
opacidad (CP) relativamente alto (comparado con el propilo),
mientras que un alquilo relativamente grande (como butilo, pentilo o
hexilo) puede tener el efecto opuesto.
El hidroxialquilo puede ser un hidroxialquilo
primario, un hidroxialquilo secundario o un hidroxialquilo
terciario. Un polímero hidrófobamente modificado del hidroxialquilo
primario usualmente tiene un índice de hidrólisis mayor que un
polímero comparable de un hidroxialquilo secundario, que a su vez
usualmente tiene un índice de hidrólisis mayor que un polímero
comparable de un hidroxialquilo terciario. Por lo tanto, dependiendo
del índice de hidrólisis deseada, se puede preferir un polímero
derivado de un hidroxialquilo primario, secundario o
terciario,
respectivamente.
respectivamente.
Preferiblemente, el polímero es un homo o
interpolímero de una
N-(2-hidroxialquil)(met)acrilamida modificada
con una unidad hidrófoba, como un lactato, un alquilo o un
arilo.
Más preferiblemente, dicho polímero se
selecciona del grupo que consiste en homopolímeros e interpolímeros
de (N-(2-hidroxietil)metacrilamida
hidrófobamente modificada),
(N-(2-hidroxietil)acrilamida),
(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
hidrófobamente modificada) y
(N-(2-hidroxipropil)acrilamida hidrófobamente
modificada).
En una realización, el polímero es
hidrófobamente modificado por un monolactato, un dilactato, un
trilactato o un tetralactato, preferiblemente un monolactato o un
dilactato de dichas hidroxialquil(met)acrilamidas. El
polímero puede ser un copolímero o una mezcla de diferentes
polímeros de hidroxialquil(met)acrilamida
hidrófobabamente modificada.
En una realización, la mezcla o copolímero es
una mezcla de copolímero respectivamente de por lo menos dos
polímeros respectivamente químicamente unidos a unidades de polímero
de acuerdo con la invención que tienen un número diferente de restos
lactato.
La presencia de un polímero de lactato distinto
de monolactato y dilactato (es decir, la presencia de trilactato,
tetralactato o superior) puede en particular ser útil para
proporcionar un polímero (mezcla) con un punto de opacidad (CP)
relativamente bajo, en particular un CP inferior a 20ºC,
proporcionando así una mezcla o copolímero (agregado) con mejor
estabilidad bajo condiciones ambiente. Para dicho propósito, un
polímero de tetralactato de acuerdo con la invención se considera
particularmente adecuado. La cantidad de lactatos superiores puede
seleccionarse dentro de limites amplios. Se han logrado buenos
resultados con un copolímero, en particular un
pHEMAM-dilactato, donde por lo menos 5% de los
monómeros son distintos de mono y dilactato. Para buena solubilidad
en agua, no más de 22% de los monómeros son distintos de mono y
dilactato. Además, se ha descubierto que un polímero de acuerdo con
la invención con una o más cadenas laterales de lactato de por lo
menos tres unidades de ácido láctico (trilactato), en particular de
por lo menos cuatro unidades de ácido láctico (tetralactato) es
adecuado para proveer micelas del polímero con mejor estabilidad, en
comparación con el polímero análogo que comprende solamente unidades
de mono o dilactato. Cabe destacar que esto es particularmente
cierto para polímeros que además comprenden un grupo hidrófilo (p.
ej., PEG) como se analizará en detalle a continuación.
Un polímero de acuerdo con la invención
preferiblemente tiene una temperatura de solución crítica inferior
antes de la incubación debajo de la temperatura corporal de un
mamífero (p. ej., central), más preferiblemente debajo de
temperatura ambiente (en particular debajo de 20ºC.), Además, la
temperatura de solución crítica inferior después de la incubación
está preferiblemente por encima de la temperatura corporal de un
mamífero (es decir, la temperatura central). En una realización
preferida, la temperatura corporal del mamífero es la temperatura
corporal humana, es decir, superior a aproximadamente 37ºC.
Además, la invención se refiere a una mezcla de
polímeros que comprende uno o más polímeros de acuerdo con la
invención. Particularmente, las mezclas adecuadas incluyen mezclas
de un lactato de hidroxietil(met)acrilamida y por lo
menos algún otro lactato de
hidroxialquil(met)acrilamida, respectivamente una
mezcla de lactato de hidroxipropil(met)acrilamida y
por lo menos algún otro lactato de
hidroxialquil(met)acrilamida. Preferiblemente, los
restos hidroxietilo/propilo y/o alquilo son
N-(2-hidroxietilo),
N-(2-hidroxipropilo), respectivamente
N-(2-hidroxialquilo).
La invención provee además un sistema de
liberación controlada que comprende un polímero sensible a
temperatura según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes
y un ingrediente activo, como un fármaco. Particularmente, los
fármacos adecuados incluyen fármacos hidrófobos con una baja
solubilidad en agua. Dichos fármacos incluyen paclitaxel y otros
citostáticos, anfoteracina, corticosteroides y
fotosensibilizantes.
En una realización preferida, el sistema de
liberación controlada comprende el polímero de acuerdo con la
invención en la forma de una micela polimérica. En dicha
realización, el polímero usualmente comprende un bloque hidrófilo
que preferiblemente comprende un polialquilenglicol, más
preferiblemente un poli(etilenglicol). El peso molecular
promedio en número del bloque hidrófilo o peso del bloque hidrófilo
(según lo determinado por cromatografía de exclusión de tamaño) está
preferiblemente en el intervalo de 500-10000 g/mol.
El polímero capaz de formar la micela puede ser del tipo AB, ABA o
BAB (donde A y B son respectivamente el bloque hidrófilo e
hidrófobo).
hidrófobo).
En una realización, el sistema de liberación
controlada es en la forma de un hidrogel. En particular, en dicha
realización, el polímero de acuerdo con la invención es un
copolímero en bloque ABA o un copolímero en bloque BAB, en el que el
bloque A es la poli(hidroxialquil (met)acrilamida)
hidrófobamente modificada sensible a temperatura definida en este
documento y B es un polímero hidrófilo, preferiblemente un
polialquilenglicol, más preferiblemente un
poli(etilenglicol). El peso molecular promedio en número del
bloque hidrófilo (según lo determinado por cromatografía de
exclusión de tamaño) está preferiblemente en el intervalo de
500-10000 g/mol.
La invención también se refiere a una
composición de fármaco diana, que comprende un fármaco y partículas
de un sistema de liberación controlada de acuerdo con la invención,
cuyas partículas preferiblemente tienen un diámetro de peso promedio
inferior a 200 nm, más preferiblemente en el intervalo de 10 a 100
nm (según lo determinado por la dispersión de luz dinámica).
En una realización, la composición de fármaco
diana comprende un dispositivo de retorno.
La Fig. 1 muestra una curva de dispersión de
luz, en la que están marcados tanto la temperatura en el punto de
inflexión como el inicio de la temperatura.
La Fig. 2 proporciona la estructura del
poli(HPMAm-monolactato) (n=0),
poli(HPMAm-dilactato) (m = 0) y
poli(HPMAm-monolactato-co-HPMAm-dilactato)
(m, n \neq 0).
La Fig. 3 muestra una curva de temperatura de
intensidad de dispersión de luz para
poli(HPMAm-monolactato-co-HPMAm-dilactato)
en tampón de acetato de amonio 120 mM isotónico (pH = 5,0) a 5
mg/ml. La relación molar de HPMAm-monolactato a
HPMAm-dilactato es 51:49 (mol/mol).
La Fig. 4 muestra un punto de opacidad (CP) del
poli(HPMAm-monolactato-co-HPMAm-dilactato)
como una función del % mol de HPMAm-monolactato en
el copolímero. \medbullet es 1 mg/mL de solución en agua;
\blacksquare es 1 mg/mL de solución en tampón de acetato de amonio
120 mM isotónico (pH = 5,0).
La Fig. 5 muestra el CP de poli
(HPIv1Am-monolactato-co-HPMAm-dilactato
51/49) en tampón de acetato de amonio 120 mM isotónico (pH = 5,0)
como una función de la concentración de polímero.
La Fig. 6 expone los datos de estabilidad en
poli(HPMAm-dilactato)-b-PEG
(M_{n}-'s respectivamente 13600/5000) micelas a 37ºC y a pH = 5,0
(superior) y pH = 9,0 (inferior).
La Fig. 7 muestra el CP de un copolímero de la
invención (pHEMAm-lactato) como una función del
contenido de tetralactato en el polímero.
La Fig. 8 muestra una imagen CryoTEM de una
solución micelar de un polímero de acuerdo con la invención.
La Fig. 9 muestra un trazado para determinar la
cmc de un polímero de acuerdo con la invención.
La Fig. 10 muestra el efecto de la concentración
del polímero de acuerdo con la invención sobre el tamaño de
partícula de las micelas.
La Fig. 11 muestra la estabilidad del tamaño de
partícula de
PEG-b-p(HEMAm-dilactato)
frente al tiempo.
La Fig. 12 muestra la estabilidad del tamaño de
partícula de otro polímero de acuerdo con la invención.
Los sistemas de administración de fármacos
basados en polímeros LCST se pueden preparar convenientemente por
introducción del fármaco (como una proteína, un fármaco de bajo peso
molecular u otro agente biológicamente activo) a la matriz
polimérica. Esto se obtiene mezclando el fármaco con el polímero,
que se encuentra disuelto, por ejemplo debido a que está por debajo
de su LCST. Posteriormente, la mezcla se lleva a un estado en el que
el polímero precipita, por ejemplo llevándola por encima de su LCST,
mediante cuyo procedimiento el fármaco de proteína es capturado
dentro de la matriz polimérica precipitante, produciendo así un
sistema de administración del fármaco.
Para el uso en sistemas de administración de
fármacos, es esencial que el polímero LCST que se va a aplicar esté
encima de su temperatura de solubilidad crítica. La aplicación
eficaz como sistema de liberación controlada solamente se puede
lograr cuando la temperatura in vivo está por encima de la
temperatura de solución crítica. Si bien se conoce en la técnica -
véanse, p. ej., las publicaciones anteriormente comentadas - que los
polímeros LCST pueden modificarse cambiando su composición, es claro
que se debe optar con respecto a la LCST antes de la administración.
Una vez que se elige un polímero determinado, se fija su LCST. Las
variaciones de las temperaturas de aplicación, como puede ocurrir
fácilmente, por ejemplo, como consecuencia de diferencias o
variaciones en la temperatura corporal, puede conducir en
consecuencia a perfiles de liberación diferentes y no graduales.
En otros términos, para aplicaciones biomédicas
y farmacéuticas de polímeros termosensibles, es importante tener
posibilidades de controlar el CP alrededor de la temperatura
corporal. Además, los polímeros cuyos CP aumentan con el tiempo
desde una temperatura inferior a la temperatura corporal hasta por
encima de ésta son materiales muy atractivos, dado que, p. ej., la
liberación controlada de los fármacos sin tratamiento térmico es
factible usando dichos polímeros.
La presente invención proporciona un polímero
que es adecuado para uso en un sistema de liberación controlada. En
consecuencia, este polímero puede aplicarse como sistema de
liberación controlada que tiene todas las ventajas anteriormente
mencionadas.
Los presentes inventores han descubierto que
cuando ciertos polímeros solubles en agua se modifican químicamente,
su temperatura de solución crítica varia in situ, a saber,
tras la aplicación in vivo o in vitro en un entorno
acuoso. Estos cambios dependen del tiempo. En esta descripción y en
las reivindicaciones anejas, la aplicación en un entorno acuoso,
bajo condiciones que permiten las reacciones que resultan en el
cambio de temperatura critico, por ejemplo como consecuencia de
hidrólisis, se denomina incubación. Es también posible que la
incubación sea efectuada por las enzimas presentes en el entorno
acuoso.
El polímero de la presente invención comprende
monómeros que tienen funcionalidad modificable. La funcionalidad de
los monómeros puede, por ejemplo, modificarse por la presencia de
grupos hidrolizables. La modificación se efectúa mediante la
incubación, conduciendo a un cambio de las características de
solubilidad en agua del polímero.
Cuando se hace referencia a un polímero en esta
descripción, se entiende también homopolímeros, copolímeros,
terpolímeros, polímeros de injerto, polímeros (altamente)
ramificados y otros interpolímeros. De hecho, los copolímeros y
terpolímeros tienen la ventaja adicional de que proporcionan un
parámetro extra que afecta el resultado final, ya que los diferentes
monómeros, que tienen distintas características de solubilidad,
pueden incorporarse en un polímero, como para ajustar las
características de solubilidad (tales como la solubilidad
propiamente dicha o la dependencia de la temperatura de la
solubilidad) del copolímero resultante. Los copolímeros y
terpolímeros forman así una realización preferida de la presente
invención.
El polímero de acuerdo con la presente invención
se obtiene adecuadamente seleccionando las propiedades de los
monómeros, tal como que tras la incubación la funcionalidad de los
monómeros cambia y, como consecuencia, la solubilidad y/o la
dependencia de temperatura de la solubilidad de todo el polímero
cambia.
En una realización particular, los monómeros se
seleccionan de modo que su hidrofilicidad cambia tras la incubación.
En consecuencia, la hidrofilicidad de todo el polímero cambia tras
la incubación. Esto conduce a un polímero con una solubilidad y/o
dependencia de temperatura de la solubilidad diferente.
Como se indicó anteriormente,
poli(NIPMm-co-HPMAm-lactato)-b-PEGm,
como se describe en el documento WO 01/09198, puede exhibir
inestabilidad controlada a temperatura corporal. Después de una
investigación más exhaustiva, los presentes inventores se han dado
cuenta que debería mejorarse la biodegradabilidad de PNIPAAm. A su
vez, se desconocen actualmente la biocompatibilidad y los posibles
efectos colaterales tóxicos de PNIPAAm. En sus investigaciones, los
presentes inventores han descubierto que un sistema favorable puede
basarse en polímeros a base de HPMAm y/u otra hidroxialquil
(met)acrilamida que sean hidrófobamente modificados por un
grupo hidrolizable.
El grupo hidrolizable puede, por ejemplo, estar
unido a un enlace seleccionado entre ésteres, ortoésteres, amidas,
carbonatos, carbamatos, anhídridos, cetales y acetales,
preferiblemente mediante un enlace éster.
La presente invención se refiere, por lo tanto,
en particular, a una nueva clase de dichos polímeros termosensibles
y biodegradables que pueden describirse como
poli(hidroxialquil(met)acrilamida lactato),
donde el número de lactatos por
hidroxialquil(met)acrilamida es en general 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Dicho polímero puede representarse por la
siguiente fórmula de las unidades monoméricas que constituyen el
polímero:
donde R es el alquilo (que puede
ser lineal o ramificado) y n el número de restos lactato. El resto
éster puede estar acoplado al R en cualquier posición de la cadena
de alquilo. Por lo tanto, la posición del éster relativa a la amida
puede ser una posición \alpha, \beta, \gamma, \delta,
\varepsilon o
\omega.
Los ejemplos adecuados particulares de acuerdo
con la invención son (homo)polímeros de un lactato de
(N-2-hidroxipropil)lactato de
metacrilamida,
(N-2-hidroxietil)metacrilamida,
lactato de (N-hidroximetil)metacrilamida,
(N-2-hidroxibutil)metacrilamida,
lactato de
(N-2-hidroxipentil)metacrilamida
o lactato de
(N-2-hidroxihexil)metacrilamida.
Se prefieren especialmente
poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
mono/di lactato) (poli(HPMAm-mono/di
lactato)),
poli(N-(2-hidroxietil)metacrilamida
mono/di lactato) (poli(HEMAm-mono/di
lactato)), poli(N-(hidroximetil)metacrilamida mono/di
lactato) (poli(HMMAm-mono/di lactato)),
poli(N-2-hidroxibutil)metacrilamida
mono/di lactato) (poli(HBMAm-mono/di
lactato)),
poli(N-(2-hidroxipentil)metacrilamida
mono/di lactato) (poli(HPeMAm-mono/di
lactato)) respectivamente
poli(N-(2-hidroxihexil)metacrilamida
mono/di lactato) (poli(HHMAm-mono/di
lactato)).
En la presente descripción y en las
reivindicaciones anejas, el término "interpolímero" se refiere
a un polímero que comprende por lo menos dos tipos de monómeros, y
en consecuencia abarca copolímeros y terpolímeros.
Preferiblemente, la invención se refiere a
homopolímeros de HPMAm-dilactato,
HEMAm-dilactato y otros monómeros hidrófilos tales
como HEMAm-monolactato,
HPMAm-monolactato, HEMAm-(lactato)_{n},
HPMAm-(lactato)_{n}, en los que n es un número entero entre
3 y 10, en particular entre 3 y 5; HPMAm; o hidroxi (alquil
C_{1-6})metacrilato. También son adecuados
para usar los terpolímeros de
poli(hidroxialquil(met)acrilamida-mono/dilactato),
tales como poli(HPMAm-mono/dilactato) o
poli(HEMAm-mono/dilactato) y otros monómeros
hidrófilos.
Los puntos de opacidad (CP) de un poli
(HPMAm-monolactato) y
poli(HPMAm-dilactato) en agua fueron 65ºC y
13ºC, respectivamente. El CP inferior para
poli(HPMAm-dilactato) probablemente se deba
a la mayor hidrofobicidad del grupo lateral en comparación con el
grupo lateral monolactato. El CP de
poli(HPMAm-monolactato-co-HPMAm-dilactato)
aumentó linealmente con el porcentaje en mol de
HPMA-monolactato, que demuestra que el CP es
sintonizable por la composición del copolímero. Asimismo, el CP de
poli(HEMAm-dilactato-co-HEMAm-tetralactato)
disminuyó linealmente con el porcentaje en mol del
HEMAm-tetralactato más hidrófobo.
En consecuencia, en un aspecto, la presente
invención se refiere a un polímero sensible a temperatura que tiene
una temperatura de solución crítica inferior que cambia durante la
incubación en una solución o medio acuoso, donde el polímero es un
homo o interpolímero de un (N-(hidroxialquil)metacrilamida
lactato). En una realización preferida, dicho
N-(hidroxialquil)metacrilamida lactato es el mono o
dilactato, más preferiblemente el dilactato. El alquilo es
preferiblemente propilo o etilo.
La expresión "mono/dilactato" significa que
parte de los monómeros utilizados en los polímeros de la invención
es en la forma de monolactato, y parte o todos los monómeros
utilizados en los polímeros de la invención son en la forma de
dilactato.
Debido a los grupos laterales de ácido láctico
hidrolizables, el CP aumenta con el transcurso del tiempo con ácido
láctico, un compuesto endógeno, y la
poli(hidroxialquil(met)acrilamida) soluble en
agua (como pHPMAm, pHEMAm) como productos de degradación, en
particular, pHPMAm es un vehículo macromolecular no tóxico conocido
que, entre otros, se utiliza para el desarrollo de profármacos
poliméricos de agentes citostáticos. Se espera una buena
biocompatibilidad de un polímero de acuerdo con la invención, en
particular para poli(HPMAm-lactato),
especialmente porque los sistemas pHPMAm han ingresado recientemente
a los ensayos clínicos.
El polímero puede sintetizarse comenzando a
partir de una mezcla de los monómeros y llevando a cabo la reacción
de polimerización. Es también posible producir primero el polímero y
posteriormente funcionalizarlo acoplando los grupos adecuados. Las
composiciones de acuerdo con la presente invención comprenden
copolímeros o terpolímeros en bloque, copolímeros o terpolímeros
aleatorios, redes de copolímeros y polímeros aleatorias donde los
polímeros pueden estar injertados, y sus mezclas.
Las características de solubilidad de las
composiciones de acuerdo con la presente invención cambian tras la
incubación, por ejemplo, cuando entran en contacto con medios
acuosos, como es el caso en aplicaciones in vivo.
Para aplicación en mamíferos, los polímeros de
acuerdo con la presente invención tienen una temperatura crítica
para la composición según se sintetiza, que está debajo de la
temperatura corporal y preferiblemente debajo de la temperatura
ambiente, a saber. entre 0 y 36ºC, preferiblemente entre 0 y 20ºC, y
lo más preferiblemente entre 5 y 10ºC. No obstante, más
preferiblemente el valor de la LCST atraviesa la temperatura
corporal normal (que típicamente es 37ºC) tras la incubación, de
manera que la LCST antes de la incubación es inferior a 37ºC,
preferiblemente inferior a 20ºC, y la LCST después de la incubación
es superior a 37ºC, preferiblemente superior a 38ºC.
Una realización preferida de la presente
invención es el uso del polímero sensible a temperatura en o como un
sistema de liberación controlada que además comprende un ingrediente
activo. Dichos sistemas son adecuados, por ejemplo, para la
administración controlada de fármacos, como fármacos de
proteínas.
El sistema de liberación controlada de la
presente invención se puede utilizar para la liberación de
compuestos biológicamente activos, como compuestos farmacéuticos, p.
ej., péptidos y proteínas farmacéuticamente activos, material
genético, p. ej., nucleótidos, ARN y ADN, ADN plasmídico,
oligonucleótidos antisentido, si-ARN, nutrientes,
fármacos de bajo peso molecular, agentes de formación de imágenes.
Como se mencionó anteriormente, los hidrogeles son especialmente
adecuados para la liberación de proteínas y compuestos similares,
mientras que los sistemas micelares son vehículos para fármacos de
bajo peso molecular.
Cuando el sistema se utiliza para la
administración de material genético, p. ej., la administración de
ADN plasmídico, oligonucleótidos antisentido o
si-ARN, el polímero LCST de la invención
preferiblemente comprende grupos catiónicos, como DMAEMA (= dimetil
amino etil metacrilato).
También es posible elaborar los sistemas de
liberación controlada que pueden obtenerse mediante la presente
invención en la forma de micelas poliméricas. Las micelas
poliméricas se pueden formar por la síntesis de copolímeros en
bloque anfofílicos, p. ej., copolímeros en bloque AB de un
polialquilenglicol, como PEG, y un bloque hidrófobo o termosensible.
En disoluciones acuosas, estos polímeros forman micelas con un
tamaño de aproximadamente 20-100 nm similares a
aquellas del método de G.S. Kwon, et al. Langmuir, 9 (1993),
945-949). El núcleo hidrófobo de estas micelas puede
cargarse con fármacos, p. ej., un agente anticancerígeno, tales como
adriamicina o paclitaxel). Después de la administración in
vivo de estos sistemas, las micelas cargadas con adriamicina se
acumulan selectivamente en ciertos tumores, liberando
simultáneamente el fármaco, lo que genera la destrucción de las
células tumorales (cfr. M. Yokoyama, et al. Journal of
Controlled Release, 50 (1998) 79-92).
Los polímeros con una LCST también se han
aplicado al diseño de micelas poliméricas. Debajo de la LCST, el
polímero termosensible actúa como parte hidrófila del sistema (p.
ej.,. en copolímeros en bloque AB de NIPAA y estireno; cfr. S.
Cammas, et al. Journal of Controlled Release, 48 (1997)
157-164).
A su vez, se han descrito sistemas en los que
PNIPAA forma la parte hidrófoba de la micela polimérica (en
copolímeros en bloque de poli(etilenglicol) y
poli(N-isopropilacrilamida); M.D.C. Topp,
et al. Macromolecules, 30 (1997) 8518-8520).
Después de la administración de estos sistemas PNIPAA cargados con
fármaco y el arribo al sitio diana, la liberación del fármaco puede
entonces activarse mediante hipotermia local. La hipotermia, no
obstante, no ocurre fácilmente ni es técnicamente factible para
todos los tejidos y órganos, lo que limita la aplicabilidad de estos
sistemas.
Estas desventajas pueden superarse usando
polímeros compuestos por un bloque hidrófilo covalentemente unido a
un bloque compuesto por polímero termosensible con grupos laterales
hidrolizables. Dicho bloque hidrófilo preferiblemente comprende un
polialquilenglicol, en particular un poli(etilenglicol)
(PEG). Cuando la LCST del bloque termosensible está inicialmente
debajo de la temperatura corporal, las micelas poliméricas se forman
a 37ºC. Debido a la hidrólisis de los grupos laterales presentes en
el bloque termosensible del sistema, la LCST aumenta, provocando la
desestabilización de la micela cuando la LCST supera 37ºC. Cuando se
incorpora un fármaco al núcleo hidrófobo, su liberación se ve
afectada por este procedimiento. Estos sistemas pueden aplicarse
favorablemente, p. ej., en el tratamiento del cáncer, tratamiento de
reumatismo, artritis, infecciones y/u otras inflamaciones.
Como se mencionó previamente, los polímeros de
la presente invención comprenden todas las arquitecturas poliméricas
posibles, tales como copolímeros en (multi-bloque
(como AB, ABA, ABAB), o copolímeros de injerto, copolímeros o
terpolímeros aleatorios o redes poliméricas; todos ellos pueden
estar injertados.
Los copolímeros en bloque AB con un bloque
termosensible (es decir, el bloque del polímero hidroxialquil
(met)acrilamida) hidrófobamente modificado de la invención) y
un bloque B soluble en agua (p. ej., PEG o pHPMAm) que forma micelas
cuando se supera la LCST, pueden obtenerse mediante cualquier
técnica conocida en el campo para elaborar copolímeros en bloque AB.
Convenientemente, estos polímeros se preparan usando un llamado
macroiniciador.
Un macroiniciador es un iniciador macromolecular
que se forma, por ejemplo, acoplando un iniciador de bajo peso
molecular, como 4,4'-azobis(ácido
4-cianopentanoico),
(HO-CO-CH_{2}-CH_{2}-C(CH_{3})(CN)-N=)_{2}
(ABCPA), a través de sus grupos carboxilo hacia el grupo OH terminal
de un compuesto tal como PEG metoxilado (es decir,
CH_{3}-O-PEG-OH).
De esta manera, se forma un compuesto de fórmula
(CH_{3}-O-PEG)_{2}-ABCPA.
Típicamente, PEG con un Mw (peso molecular) de
500-10000 g/mol, en particular de
1500-10000 g/mol, se utiliza para este propósito.
Preferiblemente, se utiliza PEG con un Mw de aproximadamente 5000
g/mol (PEG 5000) para formar un macroiniciador
(PEG 5000)_{2}-ABCPA. Cuando este iniciador se descompone por calor, se forma una cadena PEG con un radical. Este radical inicia subsiguientemente la polimerización de monómeros (tales como HPMAm-mono y dilactato, como se describe a continuación), mediante la cual se forma un copolímero en bloque AB. En solución acuosa, dichos polímeros forman una estructura micelar cuando la temperatura se eleva por encima de su LCST. Estas micelas se desestabilizan cuando la hidrólisis resulta en un bloque A con una mayor LCST (encima de la temperatura en la que se aplican las micelas, preferiblemente temperatura corporal). Alternativamente, los copolímeros en bloque se pueden preparar por técnicas de polimerización de radicales controlada, tales como polimerización de radicales de transferencia (ATRP) o transferencia de cadena de fragmentación-adición reversible (RAFT), usando macroiniciadores, agentes macro-RAFT o adición secuencial de monómeros.
(PEG 5000)_{2}-ABCPA. Cuando este iniciador se descompone por calor, se forma una cadena PEG con un radical. Este radical inicia subsiguientemente la polimerización de monómeros (tales como HPMAm-mono y dilactato, como se describe a continuación), mediante la cual se forma un copolímero en bloque AB. En solución acuosa, dichos polímeros forman una estructura micelar cuando la temperatura se eleva por encima de su LCST. Estas micelas se desestabilizan cuando la hidrólisis resulta en un bloque A con una mayor LCST (encima de la temperatura en la que se aplican las micelas, preferiblemente temperatura corporal). Alternativamente, los copolímeros en bloque se pueden preparar por técnicas de polimerización de radicales controlada, tales como polimerización de radicales de transferencia (ATRP) o transferencia de cadena de fragmentación-adición reversible (RAFT), usando macroiniciadores, agentes macro-RAFT o adición secuencial de monómeros.
Los copolímeros en bloque ABA pueden
sintetizarse mediante cualquiera de las técnicas anteriormente
mencionadas, p. ej., la ruta del macroiniciador, usando en lugar de
un PEG monofuncional (es decir, \alpha-metoxi) o
su equivalente, un macroiniciador derivado de
\alpha-\omega-hidroxilo, a
saber, un macroiniciador de poliéster en el que los grupos ABCPA se
alternan co los grupos PEG. Cuando este iniciador se descompone por
calor, se forman las cadenas PEG con dos radicales. Estos radicales
luego inician la polimerización de monómeros (tales como
HPMAm-mono y dilactato), mediante la cual se forma
un copolímero en bloque ABA. Los copolímeros en bloque ABA formados
mediante esta ruta son solubles en agua debajo de la LCST. Cuando la
temperatura se eleva por encima de la LCST del bloque A, se forma un
sistema separado por fases, en el que como consecuencia de la opción
de la arquitectura del copolímero en bloque, se obtiene un hidrogel.
Este hidrogel se disuelve gradualmente cuando la LCST del bloque A
aumenta por encima de 37ºC, debido a la hidrólisis de los grupos
presentes en los monómeros de este bloque. Estos sistemas son
especialmente adecuados para inmovilizar células, que se pueden
emplear en biotecnología e ingeniería de tejidos. Como los otros
sistemas ya mencionados, estos sistemas de hidrogel pueden también
utilizarse como matriz para liberación controlada de los
ingredientes activos, en particular proteínas farmacéuticas.
Se ha de observar, no obstante, que también los
copolímeros en bloque ABA - como los copolímeros en bloque AB -
pueden además prepararse por otras rutas de síntesis convencionales,
como se indicó precedentemente (p. ej., por polimerización
RAFT).
En los Ejemplos 3 y 4 de este documento, se
ilustra la síntesis de los copolímeros en bloque AB y ABA.
El sistema de liberación controlada de la
presente invención puede ser en la forma de un hidrogel. El hidrogel
puede comprender un copolímero en bloque ABA en el que el bloque A
es un polímero sensible a temperatura de acuerdo con la invención y
B es un polímero hidrófilo y preferiblemente es PEG. Dichos
copolímeros en bloque ABA e hidrogeles tienen las ventajas
anteriormente descritas.
Cuando los polímeros de la presente invención se
utilizan para los propósitos de direccionar un fármaco, el sistema
de liberación está compuesto por partículas, donde las partículas
tienen un diámetro promedio inferior a 1 \mum, preferiblemente
inferior a 100 nm. Para tener un valor práctico, estas partículas
usualmente tendrán que ser mayores que varios nm, p. ej., mayores
que 10 nm según lo determinado por dispersión de luz.
La relación de diferentes monómeros, y
especialmente la relación mono/dilactato que constituye el
interpolímero de la invención influencia la LCST y su desarrollo
tras la incubación. En general, para aplicación práctica, p. ej.,
aplicación en mamíferos, es conveniente elegir relaciones tales que
la LCST antes de la incubación sea inferior a la temperatura
corporal y después de la incubación superior a la temperatura
corporal. La relación óptima de cada uno de los monómeros dependerá,
en consecuencia, en gran medida de los materiales empleados y de la
aplicación contemplada. Los valores óptimos se pueden determinar
experimentalmente, como se ilustra en los Ejemplos que siguen.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso de grupos químicos hidrolizables en un polímero sensible a
temperatura con el fin de cambiar dichas características de solución
de los polímeros, específicamente su temperatura de solución
crítica, más específicamente su temperatura de solución crítica
(LCST).
Se ha de entender que aparte de cambiar la
solubilidad de los polímeros que tienen una temperatura de solución
crítica inferior, esto puede también aplicarse a polímeros que
tienen una temperatura de solución crítica superior, a saber,
polímeros que se disuelven a temperaturas superiores a su
temperatura crítica, y precipitan a temperaturas inferiores a esta
temperatura crítica.
El efecto de la incubación puede aumentar, como
también disminuir la temperatura crítica tras la incubación.
Los sistemas de liberación controlada de la
presente invención se pueden preparar por la síntesis de un polímero
soluble en agua. Esto se realiza, p. ej., a) funcionalizando un
monómero con grupos hidrolizables, b) opcionalmente mezclando dicho
monómero con por lo menos un monómero de un tipo diferente en una
relación adecuada, usando un disolvente adecuado en presencia de un
iniciador y/o un catalizador para formar dicho polímero c)
eliminando dicho disolvente y disolviendo el polímero, y d)
opcionalmente purificando dicho polímero, como por precipitación; en
cuyo procedimiento la funcionalización de los monómeros de la etapa
a) opcionalmente se lleva a cabo después de la etapa b) en los
monómeros a medida que están presentes en el polímero; y
posteriormente mezclando dicho polímero soluble en agua con un
compuesto liberable.
Los iniciadores y catalizadores adecuados se
conocen en la técnica. Un ejemplo de un iniciador adecuado para la
etapa b) e \alpha,\alpha'-azoisobutironitrilo
(AIBN). Un ejemplo de un catalizador adecuado para la etapa a), (p.
ej., el injerto de HPMAm o HEMam con láctido), es octoato de estaño
(SnOct_{2}).
El polímero de la presente invención comprende
uno o más de los monómeros de hidroxialquil metacrilamida
hidrófobamente modificada. En particular, los monómeros se pueden
seleccionar entre monolactato, dilactato o ésteres de lactato
superior de dichos monómeros. Con respecto al lactato superior, éste
usualmente se selecciona en el intervalo de 3 (trilactatos) a 10
(decalactato). La hidroxialquil metacrilamida (tal como HPMAm,
HEMAm) se puede sintetizar en base a la tecnología descrita por D.
Oupicky et al. (Complejos de ADN con polímeros en bloque y de
injerto de
N-2-hidroxipropil)metacrilamida
y 2-(trimetilamonio)etil metacrilato. J. Biomater. Sci.
Polymer Ed., Vol. 10, No. 5, pp. 573-590 (1999).
La hidroxialquil metacrilamida (tal como HPMAm,
HEMAm) puede posteriormente esterificarse a mono, dilactato y
lactato superior con láctido en base a la metodología descrita por
Neradovic. D, et al. (Degradation mechanism and kinetics of
thermosensitive polyacrylamides containing lactic acid side chains.
Macromolecules 36, 7491-7498, (2003)).
En principio, también pueden estar presentes
otros monómeros. Son adecuados todos los monómeros que se
copolimerizan con hidroxialquil metacrilamida hidrófobamente
modificada (como HPMAm-lactato,
HFIWAm-lactato). Los ejemplos de estos son
acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas,
N-vinil-pirrolidona,
vinil-lactatos, viniléteres. La cantidad de estos
comonómeros que puede estar presente varía dependiendo de los
monómeros específicos en cuestión y está entre 0-50%
mol, preferiblemente entre 1-60% mol. La cuestión
crítica es la conducta de la LCST, que debe mantenerse.
Una reacción de polimerización específica que
proporciona los polímeros de la invención se describe a continuación
en el Ejemplo 1.
Aparte de la aplicación como agente de
liberación controlada, los polímeros de la presente invención se
pueden aplicar como sistemas de liberación para una diversidad de
compuestos en diferentes aplicaciones, como enzimas, colorantes u
otros aditivos en aplicaciones de lavandería, adhesivos en
pegamentos, insecticidas o nutrientes en aplicaciones para
agricultura. También es posible el uso para el atrapamiento de
células vivas, p. ej., ingeniería de tejidos (véase, en este
sentido, Lee K.Y. Mooney, D.J. Hydrogels for tissue engineering,
Chemical Reviews 2001:101, 1869-1879). Otras
aplicaciones posibles incluyen los polímeros de administración
tópica de la presente invención cargados con ingredientes activos,
p. ej., para el tratamiento de heridas y úlceras por quemaduras. Los
polímeros de la invención también se pueden utilizar para la
administración de material genético (administración de ADN).
La presente invención se ilustrará ahora en los
siguientes Ejemplos, que ilustran la invención y no la limitan.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se disolvieron HPMAm-monolactato
y HPMAm-dilactato (sintetizados como lo describen
Neradovic et al, Thermoresponsive polymeric micelles with
controlled instability based on hydrolytically sensitive
N-isopropylacrylamide copolymers. Macromolecules 34,
7589-7591, 2001) a una concentración de 0,1 g/mL en
1,4-dioxano. Las relaciones
HPMAm-monolactato/HPMAm-dilactato
fueron 100/0, 75/25, 50/50, 25/75, 0/100 (mol/mol). Se añadió
\alpha,\alpha'-azoisobutironitrilo (AIBN)
(cantidad total de monómeros/AtBN alrededor de 40/1 (mol/mol)) como
iniciador de radicales y se llevó a cabo la polimerización a 70ºC
durante 24 h en una atmósfera de nitrógeno. Los polímeros se
recogieron por centrifugación después de la precipitación en éter
dietílico. Los polímeros se purificaron adicionalmente
disolviéndolos en agua fría, seguida de filtración en un filtro de
0,22 \mum. Después de liofilizar, los productos se caracterizaron
por ^{1}H NMR (disolvente: CDCl_{3}) y cromatografía de
permeación en gel (GPC). La GPC se realizó usando columnas Plgel 3
\mum MIXED-D + Plgel 3 \mum
MIXED-E (Polymer Laboratories) y estándares de poli
(etilenglicol). El eluyente fue DMF que contenía LICl 10 mM, el
Índice de elución fue 0,7 mL/min. y la temperatura fue 40ºC. La
composición de copolímero de los polímeros se determinó por ^{1}H
NMR a partir de la relación de la integral del pico a 5,0 ppm
(l_{50}, protones de metino 1 y 2, Figura 2) a la integral del
pico a 4,3 ppm (l_{4.3}, protones de metino 3, Figura 2) mediante
la siguiente fórmula: I_{5,0}/I_{4,3} = 1 + x, donde x
representa la fracción molar de HPMAm- dilactato en el
copolímero.
El CP de los polímeros se determinó con
dispersión de luz estática (SLS) utilizando un fluorómetro Horiba
Fluorolog® (650 nm, a un ángulo de 90º). Los polímeros se
disolvieron en agua o en un tampón de acetato de amonio 120 mM
isotónico (pH = 5,0) a 0ºC. La concentración polimérica varió entre
0,1 mg/mL y 5 mg/mL. La intensidad de la dispersión se midió cada
0,2ºC durante el calentamiento y el enfriamiento (el Indice de
calentamiento/enfriamiento fue aproximadamente 1ºC/min). Los inicios
en el eje X, obtenidos por extrapolación de las curvas de intensidad
y temperatura durante el calentamiento a intensidad cero, se
consideraron el CP. Las determinaciones del CP se realizaron por lo
menos dos veces y las desviaciones fueron inferiores a 0,5ºC.
Los resultados del Ejemplo se analizan a
continuación en este documento. Se sintetizaron
poli(HPMAm-monolactato),
poli(HPMAm-dilactato), como también sus
copolímeros (Figura 2) por polimerización de radicales. Se
obtuvieron cinco polímeros con diferentes composiciones de monómeros
con un rendimiento entre 50 y 70% (véase
Tabla 1).
Tabla 1).
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\vskip1.000000\baselineskip
Para los copolímeros, la composición estuvo
cercana a la relación de alimentación de los monómeros. Se
realizaron las mediciones de dispersión de luz estática de estos
polímeros en agua y en tampón de acetato de amonio 120 mM isotónico
(pH = 5,0, para minimizar la hidrólisis del grupo lateral éster de
lactato). Cabe destacar que todos los polímeros de la Tabla 1
demostraron la conducta de la LCST. La Figura 3 muestra una curva de
intensidad y temperatura de dispersión de luz típica para
poli(HPMAm-monolactato-co-HPMAm-dilactato)
en tampón de acetato de amonio 120 mM isotónico (pH = 5,0). El
poli(HPMAm-monolactato) tiene un CP bastante
superior (65ºC en agua, Tabla 1) mientras que el
poli(HPMAm-dilactato) tiene un CP
relativamente bajo (13ºC en agua, Tabla 1). Esto se puede explicar
por la mayor hidrofobicidad del grupo lateral de dilactato comparado
con el grupo lateral de monolactato, a saber, el CP de los
copolímeros aumentó linealmente con el % en mol del monómero de
HPMA-monolactato (Figura 4), lo que significa que el
CP de los copolímeros puede ser adaptado por la composición de
copolímero.
Si bien el peso molecular de los polímeros
disminuyó a medida que aumentaba la relación de
HPMAm-dilactato (Tabla 1), la disminución de peso
molecular no es la razón para la disminución del CP. Se preparó
poli(HPMAm-monolactato) con peso molecular
inferior y se observó que el CP aumentaba levemente con la
disminución de peso molecular.
Los CP en tampón de acetato de amonio 120 mM
isotónico (pH = 5,0) fueron aproximadamente 2,5ºC menores que
aquellos en agua (Tabla 1). Esto puede atribuirse a un efecto de
salificación de los iones presentes en la solución tampón. La Figura
3 muestra que la termosistéresis de aproximadamente 5ºC se observa
entre la curva de calentamiento y enfriamiento. Se ha informado que
PNIPAAm no muestra la histéresis de LCST. En cambio, la
poli(N-isopropilmetacrilamida) muestra la
histéresis, que se atribuye al grupo \alpha-metilo
en la estructura polimérica que resulta en una flexibilidad de
cadena disminuida.
Ya que los polímeros de la Tabla 1 también
contienen grupos \alpha-metilo en la estructura
polimérica, la histéresis probablemente se debe al mismo
fenómeno.
La Figura 5 muestra el efecto de la
concentración de polímero en el CP. El CP disminuyó aproximadamente
3ºC, mientras que la concentración aumentó 10 veces. El CP de
PNIPAAm se ve apenas afectado por su concentración, mientras que
otros polímeros termosensibles también muestran un incremento del CP
con una disminución en la concentración.
Los polímeros termosensibles y biodegradables de
la invención tienen características atractivas, especialmente como
materiales para administración de fármacos y aplicaciones
biomédicas. Primero, el CP del polímero puede ser adaptado entre
10ºC y 65ºC por la composición de copolímero. En segundo lugar, los
grupos laterales de ácido láctico son eliminados mediante hidrólisis
con el transcurso del tiempo. Esto significa que el polímero se
vuelve más hidrófilo con el tiempo, lo que se asocia con un
incremento del CP. Por lo tanto, se pueden designar polímeros que
estén inicialmente en su forma precipitada pero que se tornen
solubles con el paso del tiempo. Además, se espera que los polímeros
posean una buena biocompatibilidad.
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Ejemplo
2
En este ejemplo, se estudió la carga de
Paclitaxel (PTX) a las micelas de copolímeros en bloque
PEG5000-b-p(HPMAm-dilactato)
13600. La preparación de los copolímeros en bloque se describe en
el ejemplo 3 a continuación.
Primero, el polímero se disolvió a una
concentración de 10 mg en 1 ml de tampón de acetato de amonio 120 mM
isotónico con un pH de 5,0. La temperatura se mantuvo a 0ºC por
enfriamiento con hielo.
Se enfriaron con hielo 1,8 ml de esta solución
de polímero o del tampón como referencia. Luego se añadió una
solución de 0,2 ml de PTX en etanol mientras se agitaba y se
enfriaba con hielo la solución. A la muestra A y la muestra B se le
añadieron 10 mg/ml de solución PTX y a la muestra C 20 mg/ml. La
relación de volumen de solución PTX a solución de polímero es 1:9.
Por lo tanto, está presente 10% de etanol (v/v) en la mezcla.
Inmediatamente después de mezclar las
disoluciones de fármaco y polímero, la mezcla se vertió en un baño
de agua de 50ºC durante 1 minuto para formar micelas. Luego la
solución se dejó a temperatura ambiente durante 1 minuto y
posteriormente se filtró con un filtro de 0,45 \mum para eliminar
el PTX precipitado.
La DLS del filtrado se midieron a 25ºC y la
cantidad de PTX por HPLC. Los resultados se exponen en la siguiente
Tabla 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la Tabla 2, es claro que la cantidad
de PTX cargado aumenta drásticamente y prácticamente en forma lineal
con la cantidad de polímero utilizada. Asimismo, se indica que el
tamaño de partícula promedio Z está muy por debajo de 100 nm; para
la muestra B 59 nm y para la muestra C 66 nm, respectivamente.
\newpage
Ejemplo
3
Se sintetizaron los copolímeros en bloque
p(HPMAm-dilactato)-b-PEG
(pHPMAmDL-b-PEG) por polimerización
de radicales, usando HPMAm-dilactato como monómero y
PEG_{2}-ABCPA como macroiniciador, esencialmente
como se describió previamente para la síntesis de copolímeros en
bloque de PEG 5000 y NIPAAm o NIPAAm-HPMAm(-lactato)
(Neradovic D, Van Nostrum CF, y Hennink WE. Thermoresponsive
polymeric micelles with controlled instability based on
hydrolytically sensitive N-isopropylacrylamide
copolymers. Macromolecules 34, 7589-7591, 2001) y se
muestra esquemáticamente en el esquema 1.
Esquema
1
Síntesis de la ruta y la
estructura del copolímero en bloque
pHPMAmDL-6-PEG
El macroiniciador (PEG
5000)_{2}-ABCPA se sintetizó de la
siguiente manera. Se cargó un matraz con fondo redondo de 50 mL con
2 g (0,4 mmol) de polietilenglicol 5000 monometiléter (PEG 5000),
0,056 g (0,2 mmol) ácido 4,4-azobis
(4-cianopentanoico) (ABCPA), 0,0189 g (0,06 mmol)
4-(dimetilamino)-piridinio-4-toluenosulfonato
(DPTS) y 0,125 g (0,6 mmol) de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). El matraz se
vació y se llenó con nitrógeno. Luego se añadieron 3 mL de una
mezcla 1:1 de diclorometano (estabilizada con amileno) y se añadió
DMF seca, usando una jeringa. La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 24 horas. Después la mezcla de reacción se filtró,
el sólido se lavó con diclorometano y las disoluciones orgánicas
reunidas se evaporaron.
Luego el producto se disolvió en tolueno, se
eliminaron las sustancias insolubles restantes por filtración, y se
evaporó el disolvente. El producto seco obtenido se extrajo con éter
dietílico para eliminar rastros de diciclohexil urea (DCU). El
producto obtenido se disolvió en agua y la solución se filtró para
eliminar el sólido remanente. El producto se recogió después de
liofilizar (rendimiento 80%). Este macroiniciador se utilizó para la
síntesis de copolímeros en bloque de
p(HPMAm-dilactato)-b-PEG
(pHPMAmDL-b-PEG). En detalle: se
disolvieron HPMAm-dilactato y
PEG2-ABCPA a una concentración total de 0,3 g/mL en
acetonitrilo. Para obtener copolímeros en bloque con longitudes de
bloques pHPMAmDL diferentes, la relación de monómero a
macroiniciador varió entre 35/1 a 140/1 (mol/mol).
La polimerización se llevó a cabo a 70ºC durante
24 horas en una atmósfera de nitrógeno. Los polímeros se recogieron
por centrifugación después de la precipitación en éter dietílico.
Los polímeros se purificaron adicionalmente disolviendo en agua
fría, seguida de filtración con un filtro de 0,22 \mum y
liofilización. Los productos se caracterizaron por ^{1}H NMR
(disolvente: CDCl_{3}) con un espectrómetro Gemini 300 MHz (Varían
Associates Inc. NMR Instruments, Palo Alto, CA) y cromatografía de
permeación en gel (GPC). La GPC se llevó a cabo usando columnas
Plgel 3 \mum MIXED-D + Plgel 3 \mum
MIXED-E (Polymer Laboratories) y estándares de
poli(etilenglicol). El eluyente fue DMF que contenía LiCl 10
mM; el índice de elución fue 0,7 mL/min; y la temperatura fue
40ºC.
^{1}H NMR (disolvente: CDCl_{3}) (todos los
protones son a partir del bloque pHPMAmDL excepto los protones de
metileno a partir de PEG.): \delta = 6,5 (b,
CO-NH-CH_{2}), 5,0 (b,
NH-CH_{2}-CH(CH_{3})-O
y CO-CH(CH_{3})-O), 4,4 (b,
CO-CH(CH_{3})-OH), 3,6 (b,
protones de metileno PEG,
O-CH_{2}-CH_{2}), 3,4 (b,
NH-CH_{2}-CH(CH_{3})),
2,0-0,6 (el resto de los protones a partir del
bloque pHPMAmDL).
El peso molecular promedio en número (M_{n})
del bloque pHPMAmDL se determinó por ^{1}H-NMR de
la siguiente manera: a) el valor de la integral de los protones PEG
dividido por 454 (número promedio de protones por una cadena de PEG
5000) proporcionó el valor integral para un protón PEG y b) el
número de unidades HPMAmDL en los polímeros se determinó a partir de
la relación de la integral del protón de
metino(CO-CH(CH_{3})-OH)
de HPMAmDL a la integral de un protón PEG. El peso molecular
promedio en número del bloque pHPMAmDL se calculó a partir del
número resultante de unidades.
La CMT de la solución del polímero en bloque se
determinó por dispersión de luz estática, usando un fluorómetro
Horiba Fluorolog (650 nm, a un ángulo de 90º). Los polímeros se
disolvieron a una concentración de 10 mg/mL en tampón de acetato de
amonio 120 mM isotónico (pH = 5,0) a 0ºC. La intensidad de la
dispersión se midió cada 0,2ºC durante el calentamiento y el
enfriamiento (el Indice de calentamiento/enfriamiento fue
aproximadamente 1ºC/min). Los inicios en el eje X, obtenidos por
extrapolación de las curvas de intensidad y temperatura durante el
calentamiento a intensidad cero, se consideraron la CMT. Las
determinaciones de la CMT se realizaron por lo menos dos veces y las
desviaciones fueron menores que 0,5ºC.
Las micelas de los copolímeros en bloque se
formaron calentando rápidamente una solución de polímero acuosa
desde debajo hasta encima de la CMT. Los polímeros se disolvieron a
una concentración entre 0,1 y 20 mg/mL en tampón de acetato de
amonio 120 mM isotónico (pH =5,0) a 0ºC en viales de vidrio.
Después, la solución de polímero se llevó rápidamente entre 0ºC y
50ºC y se dejó a 50ºC durante 1 minuto. Antes de las mediciones de
dispersión de luz dinámica, la solución micelar se incubó a
37ºC.
Las mediciones de dispersión de luz dinámica
(DLS) se realizaron para determinar el tamaño de las micelas, usando
el sistema Malvern 4700 (Reino Unido) que consiste en un
espectrómetro Autosizer 4700, una unidad de bomba/filtro, un láser
iónico Argón enfriador de aire Modelo 2013 (75 mW, 488 nm, equipado
con un controlador de interfaz remoto modelo 2500, Uniphase) y un
ordenador con el software de DLS (PCS, versión 3.15, Malvern). La
temperatura de la medición fue 37ºC y el ángulo de medición fue 90º.
El cambio en la viscosidad de disolvente con temperatura se corrigió
con el software.
La concentración de micelas crítica (cmc) de los
diferentes copolímeros en bloque se determinó usando pireno como
sonda de fluorescencia. Las micelas de los copolímeros en bloque se
formaron como se describió anteriormente, en tampón de acetato de
amonio 120 mM isotónico (pH - 5,0) a una concentración de 2 mg/mL.
Las disoluciones de micelas con diferentes concentraciones
poliméricas en el intervalo de 0,00001 mg/mL a 1,0 mg/ml se
obtuvieron diluyendo la solución de polímero con el mismo tampón a
temperatura ambiente. Se disolvió pireno en acetona a 1,8 x
10^{-4} M y se añadieron 15 \muL de esta solución a 4,5 mL de
solución de micelas, lo que proporcionó 6,0 x 10^{-7} M de pireno
en la mezcla. Las disoluciones de micelas con pireno se equilibraron
a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 horas para
permitir la evaporación de acetona. Los espectros de excitación de
fluorescencia del pireno se obtuvieron usando un fluorómetro Horiba
Fluorolog (en un ángulo de 90º). Los espectros de excitación se
registraron a 37ºC entre 300 y 600 nm con la longitud de onda de
emisión a 390 nm. Las hendiduras de las bandas de excitación y
emisión fueron 4 nm y 2 nm, respectivamente. La relación de
intensidad de I_{338}/I_{333} se trazó contra la concentración
de polímero para determinar la CMC.
La desestabilización de las micelas se vigiló a
dos pH diferentes (5,0 y 9,0). Para pH 5,0, las micelas de los
copolímeros en bloque se formaron como se describió anteriormente en
tampón de acetato de amonio 120 mM isotónico (pH =5,0) a una
concentración de 2 mg/mL. Para pH 9,0, las muestras se prepararon de
la siguiente manera. Primero, los polímeros se disolvieron en agua a
20 mg/mL y luego se diluyeron 10 veces con tampón NaHCO_{3} 300 mM
(pH = 9,0). Las micelas se formaron de la misma manera como se
describe. Para ambas muestras, el cambio de tamaño de las micelas y
el cambio de intensidad de dispersión en tiempo se midieron por
dispersión de luz dinámica a 37ºC. Los resultados se muestran en la
figura 1. Esta figura muestra que bajo las condiciones en las que la
hidrólisis de los grupos laterales de ácido láctico se minimiza (pH
= 5), las micelas fueron estables durante el tiempo de las
mediciones (60 horas). En contraste, a pH 9 se observa una
desestabilización rápida de las micelas.
Esta desestabilización se debe a la hidrólisis
de los grupos laterales de ácido láctico. Esta hidrólisis se asocia
con un incremento en la hidrofilicidad del bloque termosensible. Una
vez que la hidrólisis ha procedido a dicho grado en que la LCST de
este bloque supera 37ºC, las micelas comienzan a disolverse. Esto
sucede alrededor de 3-4 horas de la incubación a
37ºC y pH 9,0. Ya que la hidrólisis de los grupos laterales de ácido
láctico es de primer orden en la concentración iónica de hidroxilo,
se puede esperar un tiempo de desestabilización de
120-160 horas a pH 7,4.
La Tabla 3 resume las características de los
diferentes copolímeros en bloque sintetizados.
Ejemplo
4
Los copolímeros en bloque ABA que forman el
hidrogel de p(HPMAm-dilactato) (bloque A) y
PEG (bloque b) se obtuvieron usando la misma estrategia sintética
para la síntesis del copolímero en bloque AB (esquema 1). No
obstante, en lugar del macroiniciador (PEG
5000)_{2}-ABCPA se utilizó otro tipo de
macroiniciador. Este iniciador se sintetizó por reacción de PEG
normal (en lugar de monometoxi PEG) con ABCAPA. En detalle: se
disolvieron 1 mmol de 4,4-azobis-(ácido
4-cianopentanoico) (ABCPA), 3 mmol de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 0,3 mmol de
4-(dimetil-amino)piridinio-4-toluenosulfonato
(DPTS) en una mezcla 1:1 de tetrahidrofurano (THF) seco y
diclorometano. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10
a 20 minutos. Después, se añadió 1 mmol de poli(etilenglicol)
(PEG, masa molar promedio en número 2000 ó 4000). Esta mezcla total
se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. Posteriormente, la
mezcla se filtró y el disolvente se evaporó. Después de la
evaporación, el producto se disolvió en agua y se agitó durante un
par de horas y se filtró para eliminar DCU. El filtrado se liofilizó
para proporcionar PEG-ABCPA. Los tricopolímeros en
bloque ABA de p(HPMAm-dilactato) (bloque A)
y PEG (bloque B) se obtuvieron como se describió para los
copolímeros en bloque AB formadores de micelas (copolímeros en
bloque
p(HPMAm-dilactato)-b-PEG).
Las propiedades formadoras de hidrogel de los
diferentes copolímeros en bloque ABA se estudiaron usando análisis
reológico. En detalle: se disolvieron 300 mg de polímero en 700
\mul de tampón de acetato de amonio 100 mM a pH 5 a 0ºC durante 24
h. Después, se aplicaron 60 \mul de esta solución de polímero al
reómetro (AR1000N, Ta instruments) equipado con una geometría de
cono/placa con un radio de Icm y un ángulo de 1º. La temperatura se
aumentó gradualmente de 0ºC a 50ºC a una rampa de 2ºC/min. Las
características reológicas de la muestra se monitorearon usando una
frecuencia de 1 Hz y una tensión de 1%. Para mayores detalles
experimentales: véase De Jong S.J. et al. Novel
self-assembled hydrogels by stereocomplex formation
in aqueous solution of enatiomeric lactic acid oligomers grafted to
dextran. Macromolecules 33,3680-3686, 2000.
La Tabla 4 resume los resultados.
Ejemplo
5
Las micelas poliméricas termosensibles
rápidamente degradables a base de
PEG-bloque-poli(2-hidroxietil
metacrilamida-lactato) se elaboraron de acuerdo con
la misma metodología descrita precedentemente.
Los oligolactato ésteres de
2-hidroxietil metacrilamida
(HEMAm-oligolactato) se obtuvieron por
oligomerización con apertura de anillo del
L-láctido, usando HEMAm como el iniciador y octoato
de estaño como catalizador, esencialmente como lo describen Van Dijk
et al. [Polymer 38 (1997), 6235-62421. En
síntesis, el L-láctido (33,5 g; 0,233 mol) y HEMAm
(20 g; 0,155 mol) se agitaron a 110ºC hasta que se trituró el
láctido. Se añadió 4-metoxifenol (-0,1 mol% relativo
a HEMAm) como oxidante de radicales. Luego se añadió una cantidad
catalítica de SnOct2 (630 mg; 1% mol con respecto a HEMAm). La
mezcla resultante se agitó durante 2 horas y se dejó enfriar hasta
temperatura ambiente. Después de la solución del producto en 250 ml
de agua-acetonitrilo (50:50), el
HEMAm-oligolactato se fraccionó con cromatografía
preparativa esencialmente como lo describen Neradovic et al.
[Macromolecules 36 (2003), 7491-7498]. La identidad
de HEMAm mono, di, tri y tetralactato (abreviado también como
HEMAm-Lac_{1}, HEMAm-Lac_{2},
HEMAm-Lac_{3} y HEMAm-Lac_{4})
se confirmó por NMR; la pureza por HPLC (sistema descrito a
continuación).
Los estudios de la cinética de degradación de
HEMAm-oligolactatos se realizaron como lo describen
Neradovic et al [Macromolecules; 2003; 36(20);
7491-7498]. En síntesis, se diluyó una solución 10
mM de HEMAm-oligolactato en DMSO 10 veces con PBS
100 mM (pH 7,4) en un vial de vidrio y se ajustó el pH hasta pH 7,4
con HCl 4 M. Las disoluciones resultantes de
HEMAm-monolactato, dilactato, trilactato y
tetralactato se incubaron en un baño de agua con agitación a 37ºC. A
intervalos de tiempo regulares, las muestras de 300 \mul se
retiraron y se añadieron 700 \mul de tampón de acetato de sodio 1
M (pH 3,8) para prevenir más hidrólisis. Las muestras se conservaron
a 4ºC antes del análisis HPLC. La hidrólisis de
HEMAm-trilactato y tetralactato también se investigó
en una mezcla de acetonitrilo-PBS pH7,2 (50:50 p/p)
de constante dieléctrica inferior para demorar el Índice de
hidrólisis. El análisis HPLC se llevó a cabo en un sistema Waters
(Waters Associates Inc., Milford, MA, EE. UU.). Éste consistió en
una bomba Modelo 600, un autoinyector Modelo 717, un detector de
absorbancia de longitud de onda variable Modelo 996 y una columna
analítica de fase inversa LiChrosphere 100 RP-18 (5
\mum, 125X4 mm i.d.) con una columna de protección
RP-18 (4x4 mm) (Merck). El volumen de inyección fue
50 \mul y la longitud de onda de detección fue 254 nm. Después de
5 minutos de flujo de agua isocrático/acetonitrilo = 95:5 (p/p),
(eluyente A), se ejecutó un gradiente usando el eluyente A y
acetonitrilo/agua = 95:5 (p/p), (eluyente B). Este gradiente se
ejecutó entre 100% A y 100% B en 30 minutos con un caudal de 1,0
ml/min. Los cromatogramas se analizaron con el software Empower
Versión 1154 (Waters Associates Inc.). Se generaron las curvas de
calibración para cada monómero y sus productos de degradación con
disoluciones estándar recientemente preparadas en DMSO/PBS pH 7,2
(100 mM)/tampón de acetato de sodio pH 3,8 (1 M) (3:27:70) y fueron
por lo menos lineales entre 0,07 y 15 \muM.
Los resultados demostraron
HEMAm-oligolactatos monodispersos hidrolizados al
HEMAm no sustituido y ácido láctico cuando se incubaron en pH 7,4 a
37ºC. El equilibrio de masa general demostró que el enlace amida en
HEMAm(lactatos) fue estable bajo las condiciones
seleccionadas. Las concentraciones de
HEMAm-Lac_{1} a HEMAm-Lac_{4}
se determinaron por el método HPLC anteriormente descrito. A partir
de la concentración frente a los trazados de tiempo, se determinaron
las semividas (%). Las disoluciones stock en DMSO se diluyeron diez
veces en tampón PBS para solubilizar los oligolactatos. Por lo
tanto, se espera que los tiempos de semivida descritos sean
aproximadamente el doble de altos en 100% agua, como lo analizan
Neradovic et al. [Macromolecules 36 (2003),
7491-7498].
Los tiempos de semivida de
HEMAm-Lac_{1} y HEMAm-Lac_{2}
preparados son 58 y 5,6 horas respectivamente. Bajo condiciones
similares (pH 7,5, 10% DMSO), la semivida del análogo de metacrilato
de los HEMAm-lactatos, es decir,
N-(2-hidroxietil)metacrilato (HEMA) mono y
dilactato fueron 31 horas y 3 horas respectivamente (Neradovic et
al, Macromolecules 36 (2003), 7491-7498) Los
tiempos de semivida de HPMAm-monolactato y
HPMAm-dilactato son respectivamente 87,5 y 15,4
horas. Por ende, el HEMAm-lactato ofrece la
posibilidad de proveer micelas con una semivida más corta que el
HPMAm-lactato análogo, pero una semivida mayor que
el HEMA-lactato análogo. Por lo tanto, se anticipa
que el perfil de degradación de los correspondientes
(co)polímeros puede sintonizarse para convertirse en adecuado
como sistema de administración de un compuesto activo.
Los derivados de HEMAm con tres y cuatro
unidades de ácido láctico (HEMAm-Lac_{3} y
HEMAm-Lac_{4}) exhiben una cinética de hidrólisis
incluso más rápida que
HEMAm-Lac_{1-2}. Con el fin de
comparar nuestros resultados con los tiempos de semivida obtenidos
para los HPMAm-oligolactatos previamente descritos
con 7 y 12 unidades de lactato [Van Nostrum et al, Polymer 45
(2004), 6779-6787], también llevamos a cabo los
experimentos de degradación en 50% ACN - PBS 7,2. Las semividas de
los oligolactatos HPMAm (7 y 12 unidades de lactato) bajo estas
condiciones fueron 3,1 horas, lo que es solamente levemente menos
que aquellas de HEMAm-Lac_{3} y
HEMAm-Lac_{4}. En consecuencia, una longitud de
cadena de lactato en aumento incrementa los Indices de hidrólisis de
los oligolactatos hasta que se equipara entre 4 y 7 unidades de
lactato por cadena de oligolactato. Se contempla que los lactatos
superiores (en particular el polímero de trilactato y tetralactato)
son en particular útiles para usar en una mezcla o copolímero con
otro polímero de acuerdo con la invención, con el fin de modificar
la semivida y la estabilidad de un sistema de administración que
comprende dicha mezcla.
Los (co)polímeros se sintetizaron
mediante la polimerización de radicales libres en viales de vidrio
con tapa a rosca sellados. Se añadió AIBN disuelto en
1,4-dioxano (relación de monómeros/iniciador =
100:1 y 150:1 mol/mol) a una solución de monómero de 200 mg/ml
(volumen total de aproximadamente 1 ml de dioxano). Ambos
homopolímeros (HEMAm, HEMAm-lac_{n}) y copolímeros
(elaborados a partir de mezclas de HEMAm-Lac_{2} y
HEMAm-Lac_{4}) se sintetizaron.
Se llevó un flujo de nitrógeno a través de la
solución durante por lo menos 10 minutos. La polimerización se
realizó a 70ºC durante 24 horas mientras se agitaba la solución.
Luego los polímeros precipitaron por adición gota a gota de la
solución a un exceso de éter dietílico. Después de la
centrifugación, el residuo se secó durante una noche en una estufa
de vacío a 40ºC. XH-NMR (DMSO, d_{6}): \delta =
7,5 (b, CO-NH-CH2), 5,5 (b,
CH-OH), 5,0 (b,
CO-CH(CH3)-O), 4,1 (b,
CO-CH-(CH3)-OH), 4,0 (b,
CH2-CH2-0), 1,4, (b,
CO-CH-CH3), 1,3 (b,
HO-CH-CH_{3}),
1,0-0,6 (protones de cadena principal de
polímeros).
La relación de comonómero
HEMAm-Lac_{2}/HEMAm-Lac_{4}
(mol/mol) en el copolímero se determinó por ^{1}H NMR a partir de
la relación de la integral de los protones de metino (\delta = 5,0
ppm) al protón alcohólico (\delta = 5,5 ppm). Se utilizó la
siguiente ecuación:
(1)%
HEMAm-Lac_{4} = (I_{5,0} - I_{5,5})/2 *
100%
Para el análisis GPC de los pesos moleculares y
su distribución de los diferentes polímeros, se utilizó una columna
Plgel 3 \mum MIXED-D (Polymer Laboratories) en un
sistema Waters (Waters Associates Inc., Milford, MA, EE. UU.) con un
refractómetro diferencial 410. Se utilizó poli (etilenglicol) de
pesos moleculares definidos como estándares. El eluyente fue DMF que
contenía LiCl 10 mM. Las muestras se disolvieron durante la noche a
una concentración de 5 mg/ml en el eluyente y antes del análisis se
filtraron con un filtro de 0,45 \mum. El índice de elución fue 0,7
ml/min y la temperatura fue 40ºC. La GPC acuosa se efectuó en el
mismo sistema con tampón de acetato de amonio 5 mM (pH 5,5), columna
PL 8 \mum aquagel OH (Polymer Laboratories) y estándares de
dextrano. Las áreas pico se determinaron con el software Empower
Versión 1154 (Waters Associates Inc).
La siguiente Tabla 5 resume los resultados de
todas las homopolimerizaciones.
HEMAm se convirtió casi cuantitativamente. La
solución de DMF para el análisis GPC, no obstante, estuvo levemente
turbia y la filtración con un filtro de 0,45 \mum fue difícil. No
obstante, el producto se disolvió totalmente en agua y, por lo
tanto, se analizó por GPC acuosa. Este análisis proporcionó una
distribución monomodal con un peso molecular promedio de 194000
g/mol y una polidispersidad de 22. Los
pHEMAm-oligolactatos se obtuvieron con un alto
rendimiento constante (aproximadamente 80%).
Las propiedades termosensibles de los polímeros
se investigaron por dispersión estática de luz. Para prevenir la
hidrólisis, se utilizó un tampón de pH 5.
pHEMAm-Lac_{3} y pHEMAm-Lac_{4}
no se disolvieron después de una noche de incubación a 0º,
sugiriendo un punto de opacidad debajo de 0ºC.
Los homopolímeros de HEMAm y su derivado de
monolactato no demostraron ninguna dispersión hasta 75ºC. El
homopolímero de pHEMAm-Lac_{2} exhibió su CP a
21,7ºC.
Los copolímeros de
HEMAm-Lac_{2} y HEMAm-Lac_{4} se
sintetizaron con monómero a una relación AIBN de 100:1. La Tabla 6
resume sus características.
Los rendimientos y pesos moleculares fueron
comparables con los homopolímeros. La composición de copolímero se
corresponde con la relación de alimentación. La conducta del CP de
estos copolímeros (figura 7) demostró que la cantidad de
HEMAm-Lac_{4} hidrófobo incorporada linealmente
influenció el CP. A partir de esta curva, se pronosticó que un
copolímero con 22% HEMAm-Lac_{4} o más no se
disolvería a 0º. Esto se confirmó experimentalmente
(Tabla 6).
(Tabla 6).
Los copolímeros en bloque con
HEMAm-Lac_{n} como bloque termosensible y PEG como
bloque hidrófilo se prepararon mediante la ruta macroiniciadora como
lo describen Neradovic et al. [Macromolecules, 2001, 34;
7589-7591]. Se eligió
poli(etileneglicol)(PEG)_{5000} como la parte
hidrófila del copolímero en bloque, ya que este polímero favorece un
tiempo de circulación más prolongado de los vehículos de fármacos
nanoparticulados y menor absorción por parte de RES.
En síntesis, los copolímeros en bloque se
prepararon por polimerización de radicales, usando
PEG_{2}-ABCPA como el iniciador (relación de
monómero/iniciador = 150:1 mol/mol). La concentración del material
de partida fue 300 mg/ml en acetonitrilo en viales de vidrio
sellados. Se pasó un flujo de nitrógeno por la solución durante por
lo menos 10 minutos.
La polimerización se realizó a 70ºC durante 24
horas. Después, mediante la adición gota a gota de la solución a un
exceso de éter dietílico, los polímeros precipitaron. Después de la
centrifugación, el residuo se secó durante la noche en una estufa de
vacío a 40ºC. ^{1}H-NMR (DMSO, d_{6}) (véase
figura 2): \delta = 7,5 (b,
CO-NH-CH2), 5,5 (b,
CH-OH), 5,0 (b, CO-CH
(CH3)-O), 4,1 (b,
CO-CH-(CH_{3})-OH), 4,0 (b,
CH2-CH2-O), 3,6 (b, protones de PEG
metileno, O-CH2-CH2), 1,4, (b,
CO-CH-CH3), 1,3 (b,
HO-CH-CH3), 1,0-0,6
(protones de cadena principal de
pHEMAm-Lac_{n}).
El peso molecular promedio en número (M_{n})
del bloque termosensible se determinó por
^{1}H-NMR de la siguiente manera
(en la situación de copolímeros, se utilizó un
peso molecular promedio de los monómeros M):
(2)M_{n} =
M_{ave} (HEMAm-Lac_{n}) x
I_{HEMAm-Lac_{n}}/(I_{PEG}/454)
I_{HEMAm-Lac_{n}} es el valor
de la integral del protón hidroxilo del
HEMAm-Lac_{n} (H_{oh} \delta = 5,5 ppm);
I_{PEG} es el valor de la integral de los protones PEG y se divide
por el número promedio de protones por una cadena PEG_{5000}
(=454).
Se sintetizaron un copolímero en bloque de PEG y
HEMAm-Lac_{2} como también los copolímeros en
bloque con veinte por ciento de HEMAm-Lac_{4} y
ochenta por ciento de HEMAm-Lac_{2} con relaciones
variables de monómero a iniciador. Estos últimos polímeros contenían
HEMAm-Lac_{4} para obtener un polímero con un CP
justo encima de 0ºC. La Tabla 7 resume las características de los
copolímeros en bloque obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó ^{1}H NMR para calcular los pesos
moleculares promedio en número del bloque termosensible. Éstos
fueron significativamente inferiores a los resultados de la GPC.
No obstante, la GPC se calibró con estándares
angostos de poli(etilenglicol) y el M_{n} no es, por lo
tanto, el peso molecular absoluto del polímero. El copolímero en
bloque
PEG-b-(80%HEMAm-Lac_{2}-20%HEMAm-Lac_{4})
tiene un punto de opacidad de 5,9ºC, lo cual es levemente superior
al CP del copolímero de 82%
HEMAm-Lac_{2}-18%
HEMAm-Lac_{4} (tabla 6, 5,0ºC). A partir de este
resultado, se concluye que un bloque PEG aumenta levemente el
CP.
\vskip1.000000\baselineskip
Las micelas se formaron a través del
procedimiento de calentamiento rápido de las disoluciones
poliméricas acuosas, como se describió en el ejemplo 3. El tamaño de
partícula y las distribuciones del tamaño de partícula se exponen en
la Tabla 7. La incorporación de 20% HEMAm-Lac_{4}
en el bloque termosensible causó una disminución significativa del
tamaño de partícula. Esto parece ser relativamente independiente de
la longitud del bloque termosensible. La presencia de cadenas
laterales de lactato hidrófobo más largas aumenta las interacciones
hidrófobas y crea un núcleo micelar más compacto.
La morfología de la micela se estudió con
CryoTEM. La Figura 8 muestra una microfotografía representativa y la
forma esférica de las micelas, como también su distribución estrecha
del tamaño de partícula.
La concentración de micelas crítica (cmc) se
determinó con pireno como sonda fluorescente [véase ejemplo 3]. La
cmc se determinó a partir del trazado de la relación de intensidad
I_{338}/I_{333} como una función de la concentración del
copolímero en bloque (figura 9). Para el copolímero en bloque
PEG-b-(80%HEMA-Lac_{2}-20%HEMAm-Lac_{4}),
la cmc se determinó en 0,08 mg/ml, que es lo suficientemente baja
para administración sistémica in vivo. Los tamaños de
partícula de las micelas preparadas a partir de disoluciones
poliméricas a distintas concentraciones encima de la cmc (0,2 - 20
mg/ml) se muestran en la figura 10.
Se forman micelas relativamente grandes y
polidispersas a concentraciones inferiores a 0,5 mg/ml, lo que es
cercanas a la cmc. En el intervalo de concentración de 0,5 - 10
mg/ml, el tamaño de partícula fue relativamente pequeño (70 nm) con
una baja polidispersidad. Se emplearon 2 mg/ml de disoluciones
poliméricas para mediciones adicionales, ya que esto produjo la PD
más baja.
Las micelas de
PEG-b-pHPMAm-dilactato
(véase ejemplo 3) se disolvieron después de aproximadamente una
semana de incubación en condiciones fisiológicas (tampón acuoso pH
7,4, 37ºC). La estabilidad de las micelas de
PEG-b-pHEMAm-lac_{2}
fue seguida por las mediciones de DLS durante la incubación en
tampón de pH 5 a 37ºC para demorar la hidrólisis. Bajo estas
condiciones, el tamaño de partícula micelar aumentó gradualmente con
el tiempo (figura 11).
En oposición a
PEG-b-HEMAm-Lac_{2},
la incorporación de 20% HEMAm-Lac_{4} incrementó
la hidrofobicidad del bloque termosensible, lo que resultó no
solamente en un tamaño de partícula inferior (Tabla 7) sino también
en una estabilidad superior de las micelas a pH 5 (figura 12). Para
PEG-b-(80%
HEMAm-Lac_{2}-20%
HEMAm-Lac_{4}) a pH 5, se observó un tamaño de
partícula constante durante por lo menos 18 horas. A pH 7,4 y 37ºC,
el tamaño de partícula apenas cambió durante las primeras tres
horas, seguido de una fase de expansión hasta 8 horas. Transcurrido
ese periodo, las micelas comenzaron a disolverse, como se observa
por la intensidad de dispersión medida que cayó a cero.
Los (co)polímeros en bloque
termosensibles de HEMAm-oligolactatos fueron
sintetizados con altos rendimientos por la polimerización de
radicales libres. Es posible adaptar precisamente el punto de
opacidad ajustando la composición del copolímero de los poli
(HEMAm-oligolactatos). El aumento en la
hidrofobicidad del bloque termosensible
(poli(HEMAm-Lac_{2})) influenció no
solamente el CP sino también el tamaño de partícula y la estabilidad
de las micelas. Veinte por ciento de HEMAm-Lac_{4}
fue suficiente para aumentar la hidrofobicidad para producir
suficientemente micelas altamente estables. Una cuestión importante
que determina la eficacia del vehículo de fármaco micelar es la
capacidad de controlar el tiempo durante el cual tiene lugar la
liberación de fármaco, lo que puede efectuarse mediante un sistema
de liberación de fármaco (micelar) de acuerdo con la invención. Esto
es ventajoso en comparación con los sistemas micelares no
degradables descritos en la técnica anterior (p. ej.,
PEG-poli(ácido glutámico) [Kataoka J Contr Release
2005, p 223]. En este documento, la liberación de fármaco está
solamente mediada por la difusión, que es un proceso lento y difícil
de controlar. Las micelas poliméricas termosensibles descritas aquí
tienen la ventaja sobre las micelas o liposomas no degradables de
poder desestabilizarse después de un periodo de inducción que puede
adaptarse seleccionando el bloque de construcción del polímero
cuantitativa y/o cualitativamente. Por ejemplo, el polímero
HEMAm-lactato es capaz de proporcionar un sistema
micelar estable durante aproximadamente 3 horas y controlar así la
liberación de fármacos encapsulados. Asimismo, se espera que los
productos de degradación sean biorreabsorbibles, es decir
degradables con la eliminación del cuerpo humano. Después de la
desestabilización de las micelas, se contempla que los polímeros
restantes (Mw<50000) por lo general no exhiben la toxicidad
causada por la acumulación a largo plazo, ya que se excretan por
filtración glomerular [Delgado C, Francis GE, Fisher D1992, The uses
and properties of PEG-linked proteins. Crit Rev Ther
Carrier Syst 9:249-304]. El exclusivo perfil de la
desestabilización de las micelas puede ser ventajoso para uso in
vivo porque el periodo de inducción observado es lo
suficientemente largo como para permitir la acumulación de micelas
en el sitio de, p. ej., un tumor.
Claims (16)
1. Polímero sensible a temperatura que tiene una
temperatura de solución crítica inferior que cambia durante la
incubación en una solución o medio acuoso, donde el polímero es un
homopolímero de una hidroxialquil(met)acrilamida
hidrófobamente modificada o un interpolímero de una
hidroxialquil(met)acrilamida hidrófobamente modificada
y hasta 50% mol de comonómeros seleccionados entre acrilatos,
metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas,
N-vinil-pirrolidona,
vinil-lactatos y viniléteres.
2. Polímero según la reivindicación 1, en el que
el polímero comprende un grupo hidrófobo que está unido a la
hidroxialquil (met)acrilamida por un enlace hidrolizable,
preferiblemente por un enlace seleccionado entre ésteres,
ortoésteres, amidas, carbonatos, carbamatos, anhídridos, cetales y
acetales, más preferiblemente por un enlace éster.
3. Polímero según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el grupo hidrófobo se selecciona entre alquilos, arilos, ácido
láctico y oligómeros de ácido láctico, preferiblemente entre ácido
láctico y oligómeros de ácido láctico.
4. Polímero según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el alquilo se selecciona del
grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, butilo, ventilo y
hexilo.
5. Polímero según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polímero es un homo o
interpolímero de un
(N-(2-hidroxi-alquil)(met)acrilamida
lactato).
6. Polímero según la reivindicación 5, en el que
el polímero se selecciona del grupo que consiste en homopolímeros e
interpolímeros de
(N-(2-hidroxietil)metacrilamida lactatos) y
(N-(2-hidroxietil) acrilamida lactatos).
7. Polímero según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polímero comprende por lo
menos un componente seleccionado entre monoiactatos, dilactatos,
trilactatos y tetralactatos, preferiblemente por lo menos uno de los
grupos monolactato y grupos dilactato.
8. Polímero según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polímero es un copolímero
de (a) por lo menos un hidroxialquil (met)acrilamida
(lactato)n, donde n representa el número de unidades de
lactato, siendo n por lo menos 3, preferiblemente un número entero
entre 3 y 10, más preferiblemente entre 3 y 4, y (b) por lo menos un
hidroxialquil(met)acrilamida (lactato)_{n},
donde n es 0, 1 ó 2, preferiblemente 1 ó 2.
9. Polímero según la reivindicación 8, en el que
la relación molar de (a) se selecciona en el intervalo de 0,1 a 99%,
preferiblemente en el intervalo de 1 a 50%, más preferiblemente en
el intervalo de 5 a 25%.
10. Polímero según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que tiene una temperatura de solución
crítica inferior antes de la incubación debajo de la temperatura
corporal de un mamífero y una temperatura de solución crítica
inferior después de la incubación por encima de la temperatura
corporal de un mamífero, y donde la temperatura corporal del
mamífero preferiblemente es la temperatura corporal humana.
11. Un sistema de liberación controlada que
comprende un polímero sensible a temperatura según una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes y un ingrediente activo.
12. Sistema de liberación controlada según la
reivindicación 11, en el que el polímero es en la forma de una
micela polimérica en la que está presente un bloque hidrófilo, donde
el bloque hidrófilo preferiblemente comprende un polialquilenglicol,
más preferiblemente un poli(etilenglicol).
13. Sistema de liberación controlada según la
reivindicación 11 ó 12, en el que el sistema es en la forma de un
hidrogel.
14. Sistema de liberación controlada según la
reivindicación 13, en el que el hidrogel es un copolímero en bloque
ABA, donde el bloque A es un polímero sensible a temperatura según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y B es
un polímero hidrófilo, preferiblemente un polialquilenglicol, más
preferiblemente un poli(etilenglicol).
15. Composición de fármaco diana, que comprende
un fármaco y partículas de un sistema de liberación controlada según
una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde
las partículas preferiblemente tienen un diámetro promedio inferior
a 200 nm, más preferiblemente en el intervalo de 10 a 100 nm.
16. Composición de fármaco diana según la
reivindicación 15, que comprende un dispositivo de retorno.
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