ES2338765T3 - Deteccion de inestabilidad de microsatelites y su utilizacion en el diagnostico de tumores. - Google Patents
Deteccion de inestabilidad de microsatelites y su utilizacion en el diagnostico de tumores. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de análisis de loci de microsatélites, que comprende las etapas de: a) proporcionar cebadores para la co-amplificación de un conjunto de al menos nueve loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende BAT-25, BAT-26, MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046, D7S3070, D7S1808 y D10S1426; b) co-amplificar el conjunto de loci de al menos una muestra de ADN genómico de una reacción de amplificación de multiplexado, utilizando los cebadores, produciendo así fragmentos de ADN amplificados; y c) determinar el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados.
Description
Detección de inestabilidad de microsatélites y
su utilización en el diagnóstico de tumores.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la
solicitud de patente US número 09/841,366, presentada el 24 de
abril de 2001, que es una
"continuation-in-part" de la
solicitud de patente US número 09/663,020, presentada el 15 de
septiembre de 2000.
Esta invención se refiere a la detección de
inestabilidad en regiones de ADN genómico que contienen
repeticiones en tándem simples, tales como loci de microsatélites.
La invención se refiere particularmente al análisis múltiple de la
presencia o ausencia de inestabilidad en un conjunto de loci de
microsatélites en ADN genómico de células, tejidos o fluidos
corporales procedentes de un tumor. La invención también se refiere
a la utilización de análisis de la inestabilidad de microsatélites
en la detección y el diagnóstico de cáncer y la predisposición para
el cáncer.
Los loci de microsatélites de ADN genómico se
han analizado para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo
pero no limitado a, prueba de paternidad, trabajo forense, y en la
detección y el diagnóstico del cáncer. El cáncer puede detectarse o
diagnosticarse basándose en la presencia de inestabilidad en loci de
microsatélites particulares que son inestables en uno o más tipos
de células tumorales.
Un locus de microsatélites es una región del ADN
genómico con repeticiones en tándem simples que son unidades
repetitivas de una y cinco pares de bases de longitud. Cientos de
miles de estos loci de microsatélites están dispersos por todo el
genoma humano. Los loci de microsatélites se clasifican en función
de la longitud de la unidad repetitiva más pequeña. Por ejemplo,
los loci con unidades repetitivas de 1 a 5 pares de bases de
longitud se denominan loci repetitivos "mononucleótido",
"dinucleótido", "trinucleótido", "tetranucleótido",
y "pentanucleótido", respectivamente.
Cada locus de microsatélites de ADN genómico
normal de las especies más diploides, tal como ADN genómico de
especies de mamíferos, consiste en dos alelos en cada locus. Los dos
alelos pueden ser iguales o diferentes entre sí en longitud y
pueden variar de un individuo a otro. Los alelos microsatélites
normalmente se mantienen en una longitud constante en un individuo
dado y sus descendientes; pero, se ha observado inestabilidad en la
longitud de los microsatélites en algunos tipos de tumores (Aaltonen
et al., 1993, Science 260:812-815; Thibodeau
et al., 1993 Science 260:816-819; Peltomäki
et al., 1993 Cancer Research 53:5853-5855;
Ionov et al., 1993 Nature 363:558-561). Esta
forma de inestabilidad genómica en los tumores, denominada
inestabilidad de microsatélites (a partir de ahora, "MSI"), es
un sello distintivo molecular del síndrome de cáncer hereditario
heredado de cáncer colorrectal no poliposo (en lo sucesivo,
"HNPCC"). La causa de la MSI en el HNPCC se cree que es un
desajuste disfuncional del sistema de reparación del ADN que no
logra revertir los errores que se producen durante la replicación
del ADN (Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38;
Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner
et al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides
et al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et
al., 1997 Nat Genetics 17:271-2). La inserción
o supresión de una o más unidades repetitivas durante la replicación
del ADN se mantienen sin los genes de reparación y puede detectarse
como polimorfismos de longitud por comparación de los tamaños de
los alelos en los loci de microsatélites amplificados a partir de
muestras de ADN normal y tumoral (Thibodeau et al.,
1993, supra).
La MSI se ha encontrado en más del 90% del HNPCC
y en el 10-20% de los tumores colorrectales
esporádicos (Liu et al., 1996 Nature Med
2:169-174; Thibodeau et al. 1993,
supra; Ionov et al., 1993 Nature
363:558-561; Aaltonen et al., 1993 Science
260: 812-816; Lothe et al., 1993 Cancer Res.
53: 5849-5852). Sin embargo, la MSI no se limita a
los tumores colorrectales. La MSI también ha sido detectada en el
cáncer de páncreas (Han et al., 1993 Cancer Res
53:5087-5089), el cáncer gástrico (Id.;
Peltomäki et al., 1993 Cancer Res
53:5853-5855; Mironov et al., 1994 Cancer
Res. 54:41-44; Rhyu et al., 1994 Oncogene
9:29-32; Chong et al., 1994 Cancer Res
54:4595-4597), el cáncer de próstata (Gao et
al., 1994 Oncogene 9:2999- 3003), el cáncer de endometrio
(Risinger et al., 1993 Cancer Res
53:5100-5103; Peltomäki et al., 1993 Cancer
Res 53:5853-5855), y el cáncer de mama (Patel et
al., 1994 Oncogene 9:3695-3700).
La base genética del HNPCC se cree que es una
mutación de línea germinal en uno de varios genes de reparación de
errores de emparejamiento de ADN (a partir de ahora "MMR")
(Leach et al., 1993 Cell 75:1215-1225;
Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38; Leach
et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et
al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides et
al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et
al., 1997 Nat Genetics 17:271-2; Papadopoulos
et al., 1994 Science 263:1625-1629). Entre
los pacientes del HNPCC, se ha informado que el
50-60% llevan mutaciones heredadas en los genes de
reparación de errores de emparejamiento MSH2 y MLH1 (Kolodner et
al., 1999 Cancer Research 59:5068:5074). Por otra parte, el
70-100% de los casos de HNPCC cuyos tumores
manifiestan un fenotipo de alta frecuencia de MSI (a partir de
ahora "MSI-H") presuntamente tienen mutaciones
de línea germinal en estos dos genes. Pocas mutaciones de línea
germinal en genes MSH6, MSH3, PMS1 y PMS2 han sido detectadas en
pacientes de HNPCC, lo que indica que las mutaciones heredadas en
estos genes de reparación de errores de emparejamiento juegan un
papel menor en el HNPCC (Peltomäki et al., 1997
Gastroenterologly 113:1146-1158; Liu et al.,
1996 Nat Med 2:169-174; Kolodner et al., 1999
Cancer Research 59:5068-5074). Sin proteínas de
reparación funcionales, los errores que producen durante la
replicación no se reparan, provocando altos índices de mutación y
una probabilidad aumentada de desarrollo del tumor.
El ADN repetitivo es particularmente sensible a
los errores en la replicación y, por lo tanto, los sistemas de
reparación de genes disfuncionales dan lugar a alteraciones
generalizadas en las regiones microsatélites. Un estudio de células
de levadura sin sistemas de reparación disfuncional mostró un
aumento de 2800, 284, 52, y 19 veces en los índices de mutación en
repeticiones de mono-, di-, tri-, tetra-, y pentanucleótido,
respectivamente (Sia et al., 1997 Molecular and Cellular
Biology 17:2851-2858). Las mutaciones en los genes
de reparación de errores de emparejamiento no se cree que desempeñan
un papel directo en la génesis de los tumores, sino que actúan
permitiendo que persista la replicación de errores de ADN. La
reparación de los errores de emparejamiento de las células de los
genes que tienen altos índices de mutación, y si estas mutaciones
se producen en los genes implicados en la tumorogénesis, el
resultado puede conducir al desarrollo de cáncer. Los tumores
positivos en MSI se han encontrado que llevan mutaciones de cambio
de estructura somáticas en las repeticiones de mononucleótido en la
región codificante de varios genes implicados en el control del
crecimiento, la apoptosis y la reparación del ADN (por ejemplo,
TGFBRII, BAX, IGFIIR, TCF4, MSH3, MSH6) (Planck, et al.,
2000 Genes, Chromosomes & Cancer 29:33-39;
Yamamoto et al., 1998 Cancer Research
58:997-1003; Grady et al., 1999 Cancer
Research 59:320-324; Markowitz et al., 1995
Science 268:1336-1338; Parsons et al., 1995
Cancer Research 55:5548-5550). El locus más
frecuentemente alterado es TGFBRII, en el que aproximadamente el
90% de los tumores de colon MSI-H se han encontrado
que contienen una mutación en la repetición de poliadenina de base
10 presente en el gen (Markowitz et al., 1995 Science
268:1336-1338).
La MSI se produce en casi todos los tumores
HNPCC independientemente de qué gen de reparación de errores de
emparejamiento está implicado. La MSI también ha sido observada de
forma precoz en la formación de tumores. Estos dos factores
contribuyen a hacer el análisis de la MSI una prueba de diagnóstico
excelente para la detección de HNPCC. Además, el análisis de la MSI
puede servir como una útil prueba previa de detección para
identificar los posibles pacientes de HNPCC para pruebas genéticas
adicionales. El análisis de la MSI de los carcinomas colorrectales
esporádicos también es deseable, ya que la incidencia de la MSI se
correlaciona con un mejor pronóstico (Bertario et al., 1999
International Journal of Cancer 80:83-7).
Un problema de hace mucho tiempo con el
diagnóstico de HNPCC es que la biopsia del tumor de colon de una
persona con HNPCC tiene el mismo aspecto patológico que un tumor de
colon esporádico, haciendo difícil el diagnóstico del síndrome.
Dado que el pronóstico, el tratamiento y el seguimiento serán
diferentes para los pacientes con HNPCC, es importante encontrar
procedimientos de diagnóstico más definitivos. Sin embargo, la
detección de mutaciones en los pacientes con HNPCC sigue siendo
difícil porque hay al menos 5 genes MMR conocidos que son genes sin
grandes focos conocidos de mutaciones. La secuenciación directa de
los genes sigue siendo el procedimiento más preciso de detección de
mutaciones, pero es lento y costoso (Terdiman et al., 1999
The American Journal of Gastroenterology
94:23544-23560). Además, la alta sensibilidad y
especificidad pueden ser difíciles de obtener con la secuencia
solamente, porque muchas mutaciones que se detectan pueden ser
polimorfismos inocuos que no tienen ningún efecto sobre la función
de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento.
El análisis de ADN de los loci de microsatélites
hace teóricamente posible desarrollar una prueba de sangre para su
uso en la detección de determinados tipos de cáncer. Los primeros
estudios han demostrado que el ADN del tumor se libera a la
circulación, y está presente en concentraciones particularmente
elevadas en plasma y suero en una serie de diferentes tipos de
cáncer (León et al., 1977 Cancer Res.
37:646-650; Stroun et al., 1989 Oncology
46:318-322). Desde entonces, el ADN liberado en la
sangre de varios tipos de tumores ha sido detectado mediante el
análisis de ADN de microsatélites utilizando la reacción en cadena
de la polimerasa (a partir de ahora, "PCR") (Hibi et
al., 1998 Cancer Research 58:1405-1407; Chen
et al., 1999 Clinical Cancer Research
5:2297-2303; Kopreski et al., 1999 Clinical
Cancer Research 5:1961-1965; Fujiwara et al.,
1999 Cancer Research 59:1567-1571; Chen et
al., 1996 Nature Medicine, 2:1033-1034; Goessl
et al., 1998 Cancer Research 58:4728-4732;
Miozzo et al., 1996 Cancer Research
56:2285-2288).
Las primeras secuencias de genes específicos de
tumores detectados en la sangre de pacientes con cáncer se mutaron
a genes K-ras (Vasioukhin et al., 1994 fr. J Haematol
86: 774-779; Sorenson et al., 1994 Cancer
Epidemiol. Biomark. Prev. 3:67-71; Sorenson et
al., 2000 Clinical Cancer Research 6:2129-2137;
Anker et al., 1997 Gastroenterology
112:1114-1120). Más recientemente, se ha mostrado la
detección de inestabilidad de microsatélites en el ADN del tumor
soluble de plasma y suero procedente células escamosas de la cabeza
y el cuello (Nawroz et al., 1996 Nature Med
2:1035-1037) y los cánceres de pulmón de células
pequeñas (Chen et al., 1996 Nature Med
2:1033-1035). Estos éxitos han estimulado la
búsqueda de la inestabilidad de microsatélites en ADN tumoral
circulante de muchos otros tipos de cáncer. Hibi et al. Se
utilizaron marcadores de microsatélites para buscar la presencia de
alteraciones genéticas en el ADN de suero de pacientes con cáncer de
colon (Hibi, K. et al., 1998 Cancer Research
58:1405-1407). Hibi et al. también informó de
que el ochenta por ciento de los tumores primarios en los pacientes
de cáncer de colon mostró MSI y/o pérdida de heterocigosidad (a
partir de ahora, "LOH"), otro tipo de mutación descrita a
continuación. No se detectaron mutaciones de microsatélites o LOH
en el ADN de suero pareado. Sin embargo, se encontraron idénticas
mutaciones K-ras en correspondientes ADN de tumor y suero,
lo que indica que el ADN del tumor estaba presente en la sangre.
(Id.)
La detección de células tumorales circulantes y
micrometástasis también puede tener importantes implicaciones
pronósticas y terapéuticas. Como las células tumorales diseminadas
están presentes en cantidades muy pequeñas, no son fácilmente
detectables mediante pruebas convencionales inmunocitológicas, que
solamente pueden detectar una célula tumoral única entre 10.000 y
100.000 células normales (Ghoussein et al., 1999 Clinical
Cancer Research 5:1950-1960). Las técnicas
moleculares más sensibles basadas en la amplificación por PCR de
anormalidades tumorales específicas en ADN o ARN han facilitado
enormemente la detección de células tumorales ocultas (escondidas).
Los ensayos basados en PCR capaces de detectar de manera rutinaria
células tumorales en un millón de células normales se han diseñado
para la identificación de células tumorales circulantes y
micrometástasis en leucemias, linfomas, melanoma, neuroblastoma, y
varios tipos de carcinomas. (Id.)
La mayoría de objetivos para la detección de
células tumorales diseminadas han sido ARNms. Sin embargo, algunos
objetivos de ADN se han utilizado con éxito, incluyendo mutaciones
K-ras en cánceres de colon, tal como se señaló
anteriormente. La presencia de inestabilidad de microsatélites en
algunos tipos de células tumorales plantea la posibilidad de que
estas mutaciones tumorales específicas creadas por la inestabilidad
podrían servir como objetivo para la detección basada en PCR de
células tumorales ocultas.
Ha habido una considerable controversia acerca
de cómo definir con precisión y medir con precisión MSI (Boland,
1998 Cancer Research 58:5248-5257). Informes sobre
la frecuencia de MSI en diversos tumores varía considerablemente.
Por ejemplo, diversos estudios han reportado rangos del 3% al 95% de
MSI para la frecuencia de MSI en el cáncer de vejiga
(González-Zulueta et al., 1993 Cancer
Research 53:28-30; Mao et al., 1996 PNAS
91:9871-9875). Un problema con la definición de MSI
es que depende tanto del tumor específico como del locus (Boland
et al. 1998, supra). Así, la frecuencia observada de
MSI con un tipo de tumor en particular en un solo estudio dependerá
del número de tumores analizados, el número de loci investigados,
cuántos loci deben estar alterados para la puntuación de un tumor
con MSI y qué loci particulares se han incluido en el análisis.
Para ayudar a resolver estos problemas, el National Cancer Institute
patrocinó un taller sobre MSI para revisar y unificar el campo
(Id.). Como resultado del taller se recomendó un panel de
cinco microsatélites como panel de referencia para futuras
investigaciones en el campo. Este panel incluía a dos loci de
mononucleótidos BAT-25, BAT-26, y
tres loci de dinucleótidos D5S346, D2S123, D17S250.
Un problema particular en el análisis de MSI de
muestras de tumor se produce cuando uno de los alelos normales para
un marcador dado falta debido a LOH, y no hay nuevos fragmentos
presentes otras para ese marcador (Id.). No se puede
discernir fácilmente si esto representa LOH o MSI verdaderos, en los
que el alelo cambiado ha co-migrado con el resto de
alelos de tipo salvaje. En casos como este, la recomendación del
taller del NCI sobre MSI fue no llamarlo MSI. Una forma de
minimizar este tipo de problema sería utilizar loci que muestren
una baja frecuencia de LOH en tumores de colon.
Los ensayos clínicos de diagnóstico utilizados
para determinar el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad
requieren que las pruebas sean muy precisas (bajo falsos negativos)
y específicas (bajo índice de falsos positivos). Muchos loci de
microsatélites informativos han sido identificados y recomendados
para las pruebas de MSI (Boland et al. 1998, supra).
Sin embargo, incluso los loci de microsatélites más informativos no
son 100% sensibles y 100% específicos. Para compensar la falta de
sensibilidad usando marcadores individuales, se pueden utilizar
marcadores múltiples para aumentar el poder de detección. El mayor
esfuerzo requerido para analizar múltiples marcadores puede
compensarse mediante multiplexado. El multiplexado permite la
amplificación simultánea y el análisis de un conjunto de loci en un
solo tubo y con frecuencia puede reducir la cantidad total de ADN
necesario para el análisis completo. Para aumentar la especificidad
de una prueba de MSI para un determinado tipo de cáncer, se ha
recomendado que el panel de cinco loci de microsatélites muy
informativos identificados en el taller del National Institute (ver
arriba) se modifiquen para sustituir o añadir otros loci de igual
utilidad (Boland et al. 1998, supra, en p. 5250). El
aumento de la información por la amplificación y el análisis de un
mayor número de resultados de loci se traduce en una mayor confianza
y precisión en la interpretación de los resultados de la
prueba.
El análisis de MSI mediante multiplexado
resuelve los problemas de exactitud y de discriminación de los
fenotipos de MSI, pero la complejidad adicional puede hacer el
análisis más difícil. Por ejemplo, cuando los loci de
microsatélites son co-amplificados y analizados en
un formato múltiple, los factores que afectan a la facilidad y a la
precisión de la interpretación de los datos son mucho más
esenciales. Uno de los principales factores que afectan a la
interpretación precisa de los datos es la cantidad de tartamudeo
que se produce en los loci de microsatélites en la PCR (Bacher y
Schumm, 1998 Profiles in DNA 2:3-6; Perucho, 1999
Cancer Research 59:249-256). Los productos de
tartamudeo son fragmentos menores que se producen mediante el
proceso de PCR que difieren en el tamaño del alelo principal en
múltiplos de la unidad de repetición del núcleo. La cantidad de
tartamudeo observada en los loci de microsatélites tiende a ser
inversamente proporcional a la longitud de la unidad de repetición
del núcleo. Por lo tanto, el tartamudeo se muestra de manera más
severa con loci de repetición de mono- y dinucleótido, y en menor
grado con repeticiones de tri-, tetra- y pentanucleótidos (Bacher y
Schumm, 1998, supra). El uso de loci de bajo tartamudeo en el
multiplexado reduciría en gran medida este problema. Sin embargo,
la selección cuidadosa de los loci sigue siendo necesaria en la
elección de los loci de bajo tartamudeo debido a que el porcentaje
de tartamudeo puede variar considerablemente, incluso dentro de un
tipo de repetición particular (Micka et al., 1999 Journal of
Forensic Sciences 44:1-15).
Los sistemas de multiplexado de microsatélites
se han desarrollado principalmente para su uso en la determinación
del genotipo, estudios de mapeado y aplicaciones de tipificación del
ADN. Estos sistemas de multiplexado están diseñados para permitir
la co-amplificación de múltiples loci de
microsatélites en una sola reacción, seguido por la detección del
tamaño de los alelos amplificados resultantes. Para el análisis de
la tipificación de ADN, el uso de múltiples loci de microsatélites
aumenta drásticamente la probabilidad de coincidencia en un solo
locus. La probabilidad de coincidencia es una estadística común
usada en la tipificación de ADN que define el número de personas
que habría que analizar antes de encontrar el mismo patrón de ADN
que una persona seleccionada al azar. Por ejemplo, un sistema de
multiplexado de cuatro locus (sistema GenePrint^{TM} CTTv
Multiplex, Promega) tiene una probabilidad de coincidencia de 1 en
252,4 en poblaciones afroamericanas, en comparación con un sistema
de multiplexado de ocho locus (sistema GenePrint^{TM}
PowerPlex^{TM} 1.2, Promega), que tiene una probabilidad de
coincidencia de 1 en 2,74 x 10 (Proceedings: American Academy of
Forensic Sciences (febrero 9-14, 1998), Schumm,
James W. et al., P. 53, B88; Id. Gibson, Sandra D. et
al., P. 53, B89; Id., Lazaruk, Katherine, et al., P. 51,
B83; Sparkes, R. et al., 1996 Int J Legal Med
109:186-194). Otros sistemas de multiplexado
disponibles comercialmente para la tipificación de ADN incluyen
AMPF/STR Profiler^{TM} y AmpFISTR COfiler^{TM} (AmpFISTR
Profiler^{TM} PCR Amplification Equipo User's Manual (1997),
i-viii y 1-1 a
1-10, y AmpFISTR COfiler^{TM} PCR Amplification
Equipo User Bulletin (1998), i-iii y
1-1 a 1-10, ambos publicados por
Perkin-Elmer Corp.). Además del multiplexado para la
tipificación de ADN, se han desarrollado algunos sistemas de
multiplexado de microsatélites para la detección de enfermedades,
tal como el cáncer. Uno de estos sistemas ha sido desarrollado por
Roche Diagnostics, el "HNPCC Microsatellite Instability Test",
en el que cinco loci MSI (BAT25, BAT26, D5S436, D17S250 y D2S123)
son co-amplificados y analizados. Sistemas
adicionales son necesarios, en particular sistemas que incluyen loci
adicionales; mostrando una alta sensibilidad a MSI y un bajo
tartamudeo para facilidad y precisión de análisis.
Los materiales y los procedimientos de la
presente invención se han diseñado para su uso en el análisis de
multiplexado de loci de microsatélites particulares de ADN genómico
humano de diversas fuentes, incluyendo varios tipos de tejidos,
células y fluidos corporales. La presente invención representa una
mejora significativa sobre la tecnología existente, proporcionando
una potencia mayor de discriminación, precisión y rendimiento para
el análisis de los loci de MSI y para el diagnóstico de
enfermedades, tal como el cáncer, relacionados con mutaciones en
estos loci.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona procedimientos
y equipos para amplificar y analizar loci de microsatélites o
conjuntos de loci de microsatélites. La presente invención también
proporciona procedimientos y equipos para detectar cáncer en un
individuo mediante la co-amplificación de múltiples
loci de microsatélites de ADN genómico humano procedente de tejido
tumoral o células cancerosas.
En un aspecto, la presente descripción
proporciona un procedimiento de análisis de loci de microsatélites,
que comprende: (a) proporcionar cebadores para la
co-amplificación en un solo tubo de un conjunto de
al menos tres loci de microsatélites de ADN genómico, comprendiendo
por lo menos un locus de repetición de mononucleótido y por lo
menos dos loci de repetición de tetranucleótido, (b)
co-amplificar el conjunto de por lo menos tres loci
de microsatélites en una muestra de ADN genómico en una reacción de
amplificación de multiplexado, usando los cebadores, produciendo
así fragmentos de ADN amplificado, y (c) determinar el tamaño de los
fragmentos de ADN amplificados.
En otro aspecto, la presenta descripción
proporciona un procedimiento de co-amplificación de
un conjunto de por lo menos tres loci de microsatélites de por lo
menos dos muestras diferentes de ADN genómico, una primera muestra
procedente de material biológico normal no canceroso de una persona
y una segunda muestra procedente de un segundo material biológico
de la persona. Las por lo menos dos muestras de ADN genómico humano
son co-amplificadas en reacciones de amplificación
de multiplexado separadas, utilizando cebadores para cada uno de los
loci en el conjunto de por lo menos tres loci de microsatélites. El
tamaño de los fragmentos de ADN amplificados resultantes de las dos
reacciones de multiplexado se comparan entre sí para detectar
inestabilidad en cualquiera de los por lo menos tres loci de
microsatélites de la segunda muestra de ADN genómico humano.
Otra realización de la presente descripción es
un procedimiento de análisis de al menos un locus de repetición de
mononucleótido de ADN genómico humano seleccionado entre el grupo
consistente en MONO-11 y MONO-15.
El procedimiento de análisis del por lo menos un locus de repetición
de mononucleótido seleccionado entre el grupo consistente en
MONO-11 y MONO-15 comprende las
etapas de: (a) proporcionar al menos un cebador de por lo menos un
locus de repetición de mononucleótido; (b) ampliar el al menos un
locus de repetición de mononucleótido de una muestra de ADN
genómico procedente de material biológico de un sujeto humano
individual, usando al menos un cebador, produciendo así un
fragmento de ADN amplificado, y (c) determinar el tamaño de los
fragmentos de ADN amplificados. Los fragmentos de ADN amplificados
se analizan preferentemente para detectar la inestabilidad de
microsatélites en el por lo menos un locus de repetición de
mononucleótido comparando el tamaño de los fragmentos de ADN
amplificados con el tamaño de los alelos más comúnmente observados
en ese locus en una población humana. Alternativamente, el
procedimiento se utiliza para ampliar el al menos un locus de
repetición de mononucleótido de una muestra de ADN genómico de
material biológico normal no canceroso de un individuo, y la
inestabilidad de microsatélites se detecta mediante la comparación
de los fragmentos de ADN amplificados con los obtenidos en la etapa
(b).
Otra realización de la presente descripción es
un equipo para la detección de inestabilidad de microsatélites en
ADN aislado de un sujeto individual, que comprende un único
contenedor con cebadores de oligonucleótidos para la
co-amplificación de un conjunto de al menos tres
loci de microsatélites que comprenden un locus de mononucleótido y
dos loci de tetranucleótido.
Las varias realizaciones del procedimiento y el
equipo de la presente invención, descritas brevemente más arriba,
son particularmente adecuadas para su uso en la detección de MSI en
células tumorales y células cancerosas. Específicamente, el
procedimiento o el equipo de la presente invención pueden utilizarse
para ampliar, al menos, un locus de repetición de mononucleótido
seleccionado entre el grupo consistente en MONO-11
y MONO-15 o el conjunto de al menos tres loci de
microsatélites, que comprenden al menos un locus de repetición de
mononucleótido y al menos dos loci de repetición de tetranucleótido
de al menos una muestra de ADN genómico de material biológico, tal
como tejidos o fluidos corporales, preferiblemente material
biológico que contenga de preferencia o sea sospechoso de contener
ADN de tumores o células cancerosas. Para loci monomórficos o casi
monomórficos, tal como MONO-11 y
MONO-15, uno puede comparar el modelo resultante
producido por el patrón de amplificación de ADN normal de cualquier
persona en una población con un patrón estándar en ese locus. Sin
embargo, es preferible utilizar ADN de tejido normal de la misma
persona de la que se ha obtenido el ADN del tumor, para garantizar
que un resultado positivo no refleja una mutación germinal, en lugar
de MSI.
El procedimiento y el equipo también pueden
utilizarse para comparar los resultados de amplificación de
multiplexado de ADN de tejido normal de un individuo con los
resultados de la amplificación de multiplexado de ADN de otro
material biológico de la misma persona. El uso de esta realización
particular del procedimiento de la presente invención para detectar
MSI en las células tumorales en comparación con las células normales
se muestra en la Figura 1. En concreto, la Figura 1 muestra una
repetición de tetranucleótido (GATA), amplificada por un par de
cebadores ("cebador A" y "cebador B") en una reacción en
cadena de polimerasa ("PCR"), seguida de la separación de
alelos amplificados por tamaño mediante electroforesis capilar, y un
trazado de alelos fraccionados amplificados utilizando el software
GeneScan^{TM}. Nótese que sólo los dos alelos y pequeños picos
tartamudeo aparecen en el trazado de ADN amplificado de ADN normal,
mientras que tres picos MSI aparecen además de los dos picos de
alelos en el trazado de ADN tumoral amplificado.
Las ventajas y una apreciación más completa de
los atributos específicos de la presente invención se obtendrán en
un examen de las siguientes figuras, la descripción detallada de
realizaciones preferidas, y las reivindicaciones adjuntas. Se
entiende expresamente que los dibujos son para propósitos de
ilustración y descripción solamente, y no pretenden ser una
definición de los límites de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Ilustración del análisis de la
inestabilidad de microsatélites. La figura es un diagrama de un par
de cebadores recocidos en un locus de tetranucleótido en dos alelos
del mismo ADN genómico, y los trazados de los resultados de
electroforesis capilar de los productos de amplificación de un locus
de tetranucleótido de ADN procedente de tejido normal frente a
tejido tumoral. Los picos de MSI se indican en el trazado de ADN
amplificado de tejido tumoral.
Figura 2. Ilustración del efecto de la longitud
de la unidad de repetición de microsatélites de la cantidad de
tartamudeo observada. La figura incluye un diagrama de un par de
cebadores recocidos en un locus de repetición de tetranucleótido en
dos alelos diferentes de ADN genómico, y una serie de exploraciones
fluorescentes y trazados de loci de repetición de mono-, di-, tri-,
tetra- y pentanucleótidos de ADN genómico de varias personas,
amplificado y fraccionado mediante gel o mediante electroforesis
capilar.
Figura 3. Demostración de que los loci de
repetición de tetranucleótidos de baja tartamudeo son más fáciles
de interpretar que los loci de repetición de dinucleótidos de alta
tartamudeo. La figura es un trazado de los resultados de la
electroforesis capilar de productos de la amplificación de dos
tetranucleótidos y dos loci de repetición de dinucleótidos de dos
conjuntos diferentes de muestras de ADN procedentes de tejido normal
frente a tejido tumoral.
Figura 4. Ilustración de la variación en la
cantidad de tartamudeo en loci de repetición de tetranucleótidos y
pentanucleótidos seleccionados. La figura es un trazado de la
variabilidad en el porcentaje de tartamudeo observado en 13 loci de
repetición diferentes tetranucleótidos y 5 pentanucleótido
diferentes. Las cajas representan el porcentaje promedio de
tartamudeo y las barras sólidas el intervalo de tartamudeo observado
para cada locus.
Figura 5. Resultados del cribado de marcadores
de repetición de tetranucleótidos para la frecuencia de
inestabilidad de microsatélites. La figura es un trazado del número
de loci de microsatélites, de un total de 273 marcadores, que
muestra un porcentaje de MSI dado. Por ejemplo, aproximadamente 15
loci fueron alterados en 100% de muestras de tumores de
MSI-H evaluados.
Figura 6. Resultados del cribado de marcadores
de repetición de pentanucleótido para la frecuencia de inestabilidad
de microsatélites. La figura es un trazado del porcentaje de MSI
observado en cada uno de los ocho diferentes loci de repetición de
tetranucleótido en un conjunto de nueve MSI-H y un
conjunto de 30 tumores MSS.
Figura 7. Análisis de inestabilidad de
microsatélites mediante marcador MONO-15. La figura
es un trazado de los productos generados por electroforesis capilar
de amplificación de locus MONO-15 de ADN de cuatro
diferentes conjuntos de pares normales y muestras de tumores
procedentes de cuatro personas diferentes.
Figura 8. Porcentaje de MSI en 59 muestras de
cáncer de colon usando un multiplexado de MSI de nueve locus. La
figura es un trazado del porcentaje de MSI observado en 59 muestras
de cáncer de colon (29 MSH y 30 MSI-L o muestras
MSS) usando el multiplexado de MSI de nueve locus descrito en el
Ejemplo 6, a continuación (es decir, D1S518, D3S2432, D7S1808,
D7S3046, D7S9070, D10S1426, BAT-25,
BAT-26, y MONO-15).
Figura 9. Análisis fluorescente de
microsatélites mediante un multiplexado de MSI de nueve locus. La
figura es un trazado generado a partir de electroforesis capilar de
productos de amplificación multiplexado de genómico humano normal
no canceroso, utilizando el multiplexado de MSI de nueve locus
utilizado en la Figura 8.
Figura 10. Detección de inestabilidad de
microsatélites en muestras de cáncer de colon usando un multiplexado
de MSI de nueve locus. La figura es un trazado generado a partir de
electroforesis capilar de productos de amplificación multiplexado
de ADN de muestras de tumor de colon y parejas normales, usando el
multiplexado de MSI de nueve locus utilizados en la Figura 8.
Figura 11. La detección de inestabilidad de
microsatélites en muestras de cáncer de colon mediante multiplexado
de MSI de nueve locus es del mismo tipo de trazado que se muestra en
la Figura 10, generado con una muestra diferente de pares de ADN
normal y cáncer de colon de una persona diferente.
Figura 12. Detección de inestabilidad de
microsatélites en muestras de cáncer de estómago utilizando un
multiplexado de MSI de nueve locus. La figura es un trazado
generado a partir de electroforesis capilar de los productos de
amplificación multiplexado de ADN de pareja normal y muestras de
tumor de cáncer de estómago, con el multiplexado de MSI de nueve
locus descritos en la figura 8.
Figura 13. Análisis de microsatélites de tejido
incrustados en parafina, con un multiplexado de MSI de nueve locus.
La figura es un trazado generado a partir de electroforesis capilar
de los productos de amplificación de multiplexado de ADN de tejido
incrustado en parafina, utilizando el multiplexado de MSI de nueve
locus descrito en la figura 8.
Figura 14. Porcentaje de MSI en muestras de
cáncer de colon en 10 diferentes loci de microsatélites. La figura
es un gráfico de barras del porcentaje de MSI observado en 66
muestras de cáncer de colon (36 MSI-H y 30 MSI
estable o muestras MSI-L) usando nueve loci
contenidos en el multiplexado MSI descrito en el Ejemplo 8 (es
decir, BAT-26, D7S3070, D7S3046,
BAT-40, MONO-15, D7S1808,
BAT-25, D10S1426 y D3S2432) y D1S518.
Figura 15. Análisis fluorescente multiplexado de
microsatélites mediante un multiplexado de MSI de nueve locus. La
figura es un trazado generado a partir de electroforesis capilar de
los productos de amplificación multiplexado de ADN genómico humano
normal no canceroso, utilizando el multiplexado de MSI de nueve
locus descrito en el Ejemplo 8 etiquetados con cebadores marcados
con tintes fluorescentes, como sigue. Los cebadores para
BAT-26, D7S3070, y D7S3046 fueron marcados con
fluoresceína; los cebadores para BAT-40,
MONO-15 y D7S1808 fueron etiquetados con JOE; y los
cebadores para BAT-25, D10S1426 y D3S2432 fueron
etiquetados con TMR.
Figura 16. Detección de inestabilidad de
microsatélites en muestras de cáncer de colon usando un multiplexado
MSI de nueve locus. La figura es un trazado generado a partir de
electroforesis capilar de los productos de amplificación
multiplexado de ADN de parejas normales y muestras de tumores de
colon, utilizando el mismo multiplexado de MSI de nueve locus y los
cebadores etiquetados utilizados en la Figura 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes definiciones están pensadas para
ayudar a proporcionar una comprensión clara y consistente sobre el
alcance y el detalle de los siguientes términos, tal como se
utilizan para describir y definir la presente invención:
"Alelo", tal como se utiliza aquí, se
refiere a una de varias formas alternativas de un gen o secuencia de
ADN en una localización cromosómica específica (locus). En cada
locus autosómico un individuo posee dos alelos, uno heredado del
padre y uno de la madre.
"Amplificar", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un proceso por el cual se hacen varias copias de un locus
particular de un ácido nucleico, tal como ADN genómico. La
amplificación se puede realizar utilizando cualquiera de una serie
de medios conocidos, incluyendo pero no limitado a reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K., et al., 1985
Science 230: 1350-1354), amplificación basada en la
transcripción (Kwoh, D.Y., y Kwoh, T.J., American Biotechnology
Laboratory, Octubre, 1990) y amplificación de desplazamiento de
cadena (SDA) (Walker, G. T., et al., 1992 Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A. 89: 392-396).
"Co-amplificar", tal como
se utiliza aquí, se refiere a un proceso por el cual se hacen varias
copias de dos o más loci en el mismo contenedor, en una única
reacción de amplificación.
"Polimorfismo de ADN", tal como se utiliza
aquí, se refiere a la existencia de dos o más alelos de un locus
dado en la población. "Locus" o "locus genético", tal como
se utiliza aquí, se refiere a una localización cromosómica única
que define la posición de un gen individual o secuencia de ADN.
"Cebadores de locus específico", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un cebador que específicamente se hibrida con una porción
de el locus indicado o su cadena complementaria, al menos para un
alelo del locus, y no se hibrida eficientemente con otras
secuencias de ADN bajo las condiciones utilizadas en el
procedimiento de amplificación.
"Pérdida de heterocigosidad" (en lo
sucesivo, "LOH"), tal como se utiliza aquí, se refiere a la
pérdida de alelos en un cromosoma detectado analizando los
marcadores para los que un individuo es constitucionalmente
heterocigoto. En concreto, LOH se puede observar en la amplificación
de dos muestras diferentes de ADN de un sujeto particular, una
muestra procedente de material biológico normal y otra procedente de
un tumor o tejidos precancerosos. El tumor presenta LOH si el ADN
del material biológico normal produce alelos amplificados de dos
longitudes diferentes y las muestras de tumor producen solamente una
de las dos longitudes de alelos amplificados en el mismo locus.
"Locus de microsatélites", tal como se
utiliza aquí, se refiere a una región del ADN genómico que contiene
cortos elementos de secuencia repetitiva de uno (1) a siete (7), más
preferiblemente de uno (1) a cinco (5), más preferiblemente de uno
(1) a cuatro (4) pares de bases en longitud. Cada secuencia que se
repite al menos una vez en un locus de microsatélites se refiere
aquí como una "unidad de repetición". Cada locus de
microsatélites preferentemente incluye al menos siete unidades de
repetición, más preferiblemente al menos diez unidades de
repetición, y más preferiblemente al menos veinte unidades de
repetición.
"Inestabilidad de microsatélites" (en
adelante, "MSI"), tal como se utiliza aquí, se refiere a una
forma de inestabilidad genética en la que los alelos de ADN
genómico obtenidos de algunos tejidos, células o fluidos corporales
de un sujeto dado cambian de longitud en un locus de microsatélites.
En concreto, MSI se puede observar en la amplificación de dos
muestras diferentes de ADN de un sujeto particular, tal como ADN de
tejidos sanos y cancerosos, en el que la muestra normal produce
alelos amplificados de una o dos longitudes diferentes, y la
muestra del tumor produce alelos amplificados, en el que al menos
uno de los alelos es de una longitud diferente de los alelos
amplificados de la muestra normal de ADN en ese locus. MSI aparece
generalmente como consecuencia de la inserción o supresión de al
menos una unidad de repetición en un locus de microsatélites.
"MSI-H", tal como se
utiliza aquí, es un término que se utiliza para clasificar los
tumores que tienen una alta frecuencia de MSI. Cuando cinco loci de
microsatélites son analizados, tales como los cinco loci de
microsatélites seleccionados por un taller sobre HNPCC en el
National Cancer Institute en 1998 para su uso en la detección de
HNPCC, un tumor se clasifica como MSI-H cuando al
menos dos de los loci muestran inestabilidad (Boland, 1998 Cancer
Research 58: 5248-5257). Cuando se analizan más de
cinco loci de microsatélites, el tumor se clasifica como
MSI-H cuando al menos el 30% de los loci de
microsatélites de ADN genómico procedentes del tumor se encuentran
que son inestables.
"MSI-L", tal como se
utiliza aquí, es un término que se utiliza para clasificar los
tumores que tienen una baja frecuencia de MSI. Cuando cinco loci de
microsatélites son analizados, tales como los cinco loci de
microsatélites seleccionados por un taller sobre HNPCC en el
National Cancer Institute en 1998 para su uso en la detección de
HNPCC, un tumor se clasifica como MSI-L cuando sólo
uno de los loci muestra inestabilidad. Cuando se analizan más de
cinco loci de microsatélites, el tumor se clasifica como
MSI-L cuando menos el 30% de los loci de
microsatélites de ADN genómico procedente del tumor se encuentran
que son inestables. Los tumores MSI-L se cree que
representan un fenotipo mutador distinto con etiología molecular
potencialmente diferente de los tumores MSI-H
(Thibodeau, 1998; Wu et al., 1999, American Journal of Human
Genetics 65:1291-1298). Para distinguir con
precisión los fenotipos de MSI-H y
MSI-L se ha recomendado analizar más de cinco
marcadores de microsatélites (Boland, 1998, supra;
Frazer, et al., 1999 Oncology Research
6:497-505).
"MSS", tal como se utiliza aquí, se refiere
a tumores que son estables a los microsatélites, cuando ningún loci
de microsatélites presenta inestabilidad. La distinción entre
MSI-L y MSS sólo pueden lograrse cuando se utiliza
un número de marcadores significativamente mayor de cinco. El
National Cancer Institute recomienda el uso de un 19 loci de
repetición de mono- y dinucleótidos para este propósito, y para el
propósito de hacer distinciones más claras entre tumores
MSI-H y MSI-L, tal como se describió
anteriormente (Boland, 1998, supra).
"MSI-L/S", tal como se
utiliza aquí, se refiere a todos los clasificados como
MSI-L o MSS.
"Marcador de microsatélites", tal como se
utiliza aquí, se refiere a un fragmento de ADN genómico que incluye
una repetición de microsatélites y secuencias de ácido nucleico que
flanquean la región de repetición.
"Monomorfo", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un locus de ADN genómico donde se ha encontrado solamente
un patrón de alelo que está presente en el ADN genómico normal de
todos los miembros de una población.
"Nucleótido", tal como se utiliza aquí, se
refiere a una unidad básica de una molécula de ADN, que incluye una
unidad de un fosfatidil de médula ósea y una de cuatro bases,
adenina ("A"), timina ("T"), guanina ("G") y
citosina ("C").
"Reacción en cadena de la polimerasa" o
"PCR", tal como se utiliza aquí, se refiere a una técnica en la
que los ciclos de desnaturalización, recocido con cebador y
extensión con polimerasa de ADN se utilizan para amplificar el
número de copias de una secuencia de ADN de objetivo en
aproximadamente unas 10^{6} veces o más. El proceso de reacción
en cadena de la polimerasa para la amplificación de ácido nucleico
está cubierto por las patentes US 4.683.195 y 4.683.202.
"Cebador", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un oligonucleótido de cadena sencilla o fragmento de ADN
que se hibrida con una cadena de un locus de ADN de objetivo de tal
manera que el terminal 3' del cebador puede actuar como sitio de
polimerización usando una enzima de ADN de polimerasa.
"Par de cebadores", tal como se utiliza
aquí, se refiere a un par de cebadores que se hibridan con cadenas
opuestas una molécula de ADN de objetivo, en regiones del ADN
objetivo que flanquean una secuencia de nucleótidos que se
amplifica.
"Sitio cebador", tal como se utiliza aquí,
se refiere a la zona del ADN objetivo en la que se hibrida un
cebador.
"Cuasi-monomórfica", tal
como se utiliza aquí, se refiere a un locus de ADN genómico donde
solamente un patrón de alelo se ha encontrado que está presentes en
el ADN genómico normal de casi todos los miembros de una
población.
"Tartamudeo", tal como se utiliza aquí, se
refiere a un fragmento menor observado después de la amplificación
de un locus de microsatélites, una o más longitudes de unidad de
repetición más pequeñas que el fragmento predominante o alelo. Se
cree que es el resultado de un evento de deslizamiento de la
polimerasa de ADN durante el proceso de amplificación (Levinson y
Gutman, 1987 Molecular Biology Evolution 4:203; Schlotterer y
Tautz, 1992 Nucleic Acids Research 20:211).
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo menos un locus MSI amplificados o
co-amplificado en cada una de las realizaciones de
la presente invención aquí ilustradas y descritas es un locus de
repetición de mononucleótido. Estos loci han demostrado ser muy
sensibles a alteraciones en tumores con sistemas de reparación de
errores de emparejamiento de ADN disfuncionales (Parsons, 1995
supra), haciendo estos loci particularmente útiles para la
detección de cáncer y otras enfermedades asociadas a disfunciones
del sistema de reparación de errores de emparejamiento de ADN
disfuncional. Un grupo de investigadores informó que mediante la
amplificación y el análisis de un solo locus de repetición de
mononucleótido, BAT-26, eran capaces de confirmar
correctamente el estado de MSI-H de 159 de 160
(99,4% de exactitud) de las muestras de tumores (Hoang et
al., 1997 Cancer Research 57:300-303).
Algunos loci de repetición de mononucleótidos,
incluyendo BAT-26, también han sido identificados
como que tienen propiedades cuasi-monomórfico. Las
propiedades monomórficas o cuasi-monomórficas hacen
la comparación de pares normales/tumorales más sencilla, ya que los
productos PCR de muestras normales son generalmente todos del mismo
tamaño y cualquier alteración en muestras de tumores son fácilmente
identificables.
El principal inconveniente de utilizar un locus
de repetición de mononucleótidos en el análisis de ADN genómico es
que la amplificación de cualquier locus resulta en un gran número de
extraños fragmentos amplificados de ADN de diferentes longitudes,
el producto de "tartamudeo" durante la reacción de
amplificación. Estos artefactos están presentes en menor grado en
los productos de amplificación de loci con unidades de repetición
cada vez más largas. Para una ilustración de la relación entre la
longitud de la unidad de repetición y la presencia de extraños
fragmentos amplificados, véase la figura 2. La figura 2 muestra
artefactos de tartamudeo amplificados con una disminución de la
longitud de la unidad de repetición de loci de repetición de
pentanucleótidos a mononucleótidos.
Cuando un locus de mononucleótidos es
monomórfico o cuasi- monomórfico, sin embargo, uno puede detectar
cambios fácilmente en el tamaño de un alelo, indicando MSI, incluso
en presencia de un alto grado de tartamudeo. Cuando un locus es
cuasi-monomórfico, la detección de cambios en el
tamaño se puede hacer mediante la comparación de los alelos
amplificados a partir de ADN genómico de material biológico de un
individuo, tales como el tejido tumoral o fluidos corporales,
sospechoso de exhibir inestabilidad de microsatélites en el tamaño
de alelo más comúnmente observado en ese locus en una población.
Esta característica permite utilizar un único estándar o panel de
patrones de alelo estándar para analizar los resultados
individuales, minimizando la cantidad de muestras que deben tomarse
de un individuo para detectar la inestabilidad de microsatélites en
cierto ADN genómico de los individuos.
Al menos uno de los loci de microsatélites
amplificados en el procedimiento o con el equipo de la presente
invención es preferiblemente un locus de repetición de
mononucleótidos, más preferiblemente un locus de repetición de
mononucleótidos cuasi-monomórfico. El locus de
repetición de mononucleótidos seleccionado para su uso en los
procedimientos y los equipos de la presente invención es
preferentemente inestable en material biológico canceroso, pero no
en material biológico normal. BAT-25,
BAT-26 y BAT-40 han sido
identificados como loci de repetición de mononucleótidos útiles en
la identificación de MSI en tumores colorrectales característicos
de cáncer de colon sin poliposis hereditario (Zhou et al.,
1998 Genes, Chromosomes & Cancer 21:101-107;
Boland et al, 1998 Cancer Research
58:5248-5257, Dietmaier et al., 1997 Cancer
Research 57:4749-4756; Hoang et al., 1997
Cancer Research 57:300-303). Dos loci adicionales,
identificados aquí como MONO-11 y
MONO-15 se identificaron mediante una búsqueda en
una base de datos informatizada pública de información de secuencias
(GenBank), y se constató que tenían las características preferidas
para estos loci, identificados anteriormente. La búsqueda y la
identificación de los loci de repetición de mononucleótidos
adecuados para su uso en la presente invención se muestran en el
Ejemplo 2. Técnicas similares podrían utilizarse para identificar
otros locis de repetición de mononucleótidos adecuados para su uso
en los procedimientos y los equipos de la presente invención.
Los loci de repetición de mononucleótidos
amplificados o co-amplificados de acuerdo con los
procedimientos actuales o utilizando los equipos actuales son
preferiblemente cuasi-monomórficos y exhiben una
inestabilidad en el tipo de tejido de interés para una aplicación
dada. MONO-11 y MONO-15,
BAT-25, y en particular BAT-26 son
cuasi-monomórficos monomórficos y exhiben
inestabilidad en varios tejidos tumorales canceroso. Los cuatro
loci cuasi-monomórficos de repetición de
mononucleótidos se han encontrado que son particularmente útiles en
los procedimientos y los equipos de la presente invención.
BAT-40 también se ha encontrado que es útil en los
procedimientos y los equipos de la presente invención, debido a su
inestabilidad en varios tejidos tumorales cancerosos. Sin embargo,
BAT-40 no es un locus
cuasi-monomórfico. Al menos uno, más preferiblemente
al menos dos loci de microsatélites de repetición de
mononucleótidos se amplifican o co- amplifican en el procedimiento
de la presente invención.
Al menos un locus de repetición de
mononucleótidos y al menos dos loci de repetición de
tetranucleótidos son co-amplificados y analizados
de acuerdo con al menos algunas formas de realización del
procedimiento y los equipos de la presente invención. Los loci de
repetición de tetranucleótidos inherentemente generan muy pocos
artefactos tartamudeo cuando se amplifican, en comparación con los
loci de microsatélites con unidades de repetición más cortas,
especialmente en comparación con los loci de repetición mono- y
dinucleótido. (ver, por ejemplo, la Figura 2). Artefactos de
ese tipo puede ser difíciles de distinguir de MSI si se produce un
alelo cambiado en la posición de tartamudeo del segundo alelo. Por
lo tanto, no están presentes aspectos sobre la interpretación, y
sobre la necesidad de cuasi-monomorfismo con el fin
de hacer posible la interpretación de datos, como lo es para los
loci de repetición de mononucleótidos. De hecho, uno puede incluso
utilizar loci de repetición de tetranucleótidos que son muy
polimórficos en una población, siempre que sea estable, en un
sujeto individual. Estos loci se utilizan comúnmente la tipificación
de ADN.
Como con cualquier loci a amplificar en
cualquier procedimiento o utilizando cualquier equipo de la
presente invención, los loci de repetición de tetranucleótidos son
preferiblemente seleccionados sobre la base de ser estables en el
ADN de un individuo, excepto en el tipo de material biológico de
interés. Loci de repetición de tetranucleótidos preferidos
utilizados en los procedimientos y equipos de la presente invención
son: FGA, DIS518, DIS547, DIS1677, D2S1790, D3S2432, D5S818,
D5S2849, D6S1053, D7S3046, D7S1808, D7S3070, D8S1179, D9S2169,
D10S1426, D10S2470, D12S391, D17S1294, D17S1299, y D18S51.
Loci de mononucleótidos o tetranucleótidos
adicionales con los mismos criterios preferidos descritos
anteriormente son preferentemente co-amplificados
con un conjunto de al menos tres loci de microsatélites descritos
anteriormente. Sin embargo, se contempla que los loci de
microsatélites diferentes de los loci de repetición de
mononucleótidos o tetranucleótidos podrían incluirse en el conjunto
de al menos tres loci de microsatélites
co-amplificados y analizados según el procedimiento
o usando el equipo de la presente invención.
Procedimientos preferidos para la selección de
locis y conjuntos de loci amplificados y analizados según los
procedimientos o usando los equipos de la presente invención se
describen mayor detalle a continuación. Sin embargo, una vez que el
procedimiento y los materiales de esta invención se describen,
procedimientos de selección de loci adicionales, pares de
cebadores, y técnicas de amplificación para su uso en el
procedimiento y el equipo de esta invención es probable que se
puedan proponer a un experto en la materia. Todos estos
procedimientos están pensados para estar en el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el procedimiento o el equipo de la
presente invención se utilizan en ensayos clínicos de diagnóstico
que se utilizarán para determinar el tratamiento y el pronóstico de
la enfermedad, deben diseñarse para producir resultados que sean de
gran precisión (bajo índice de falsos negativos) y específicos (bajo
índice de falsos positivos). Loci de microsatélites informativos se
identifican preferiblemente mediante cribado, más preferiblemente
mediante un cribado muy extensivo (véanse los ejemplos 1 y 2). Sin
embargo, incluso los loci de microsatélites más informativos no son
100% sensibles y 100% específicos.
La potencia de los marcadores individuales en la
detección de la presencia de MSI en el tejido asociado a una
enfermedad concreta, tal como tumores cancerosos, se puede aumentar
enormemente mediante el multiplexado mediante múltiples marcadores.
La información aumentada producto de la amplificación y el análisis
de un mayor número de loci resulta en una mayor confianza y
precisión en la interpretación de los resultados de la prueba. Para
obtener la necesaria sensibilidad en la detección o diagnóstico de
enfermedades tales como el cáncer, se ha recomendado un análisis de
cinco o más loci de microsatélites muy informativos (Boland, 1998
Cancer Research 58: 5248-5257). El multiplexado de
los loci de microsatélites simplifica aún más el análisis de MSI,
permitiendo la amplificación y el análisis simultáneo de todos los
loci múltiples, mientras que reduce la cantidad de ADN a menudo
limitada requerida para la amplificación.
Otro problema común en la determinación de MSI
se refiere a la aparición de un fenotipo MSI intermedio donde sólo
un pequeño porcentaje (<30%) de los marcadores de microsatélites
están alterados en los tumores (Boland, 1998, supra). Estos
tumores de baja MSI se piensa que representan un fenotipo mutador
distinto con etiología molecular potencialmente diferente de los
tumores MSI-H (Thibodeau et al., 1993 Science
260: 816-8; Wu et al., 1999 American Journal
of Human Genetics 65:1291-1298; Kolodner et
al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074; Wijnen
et al., 1999 Nature Genetics 23:142-144). No
está claro, sin embargo, si existe una diferencia real entre
tumores MSI-L y MSS. Para fines de diagnóstico, los
tumores MSI-L y MSS son generalmente considerados
como una clase fenotípica estable. Para distinguir con precisión los
fenotipos MSI-H y MSI-L se ha
recomendado que sean analizados los múltiples marcadores de
microsatélites (Boland, 1998; Frazer, 1999 supra).
Se ha previsto que cuando los loci se
co-amplifican y analizan en una reacción de
amplificación de multiplexado, otros factores se tengan en cuenta,
incluyendo la facilidad y la precisión de la interpretación de los
datos. Uno de los principales factores que afectan a la
interpretación precisa de los datos es la cantidad de tartamudeo
que se produce en los loci de microsatélites en PCR. Fueron
seleccionados loci de repetición de tetranucleótidos para su
inclusión en el MSI multiplexado analizado según el procedimiento y
usando el equipo de la presente invención, ya que muestran un
tartamudeo considerablemente menor que los tipos de repetición más
corta, como dinucleótidos (Figura 2). Sin embargo, la selección
cuidadosa de los loci sigue siendo necesaria en la elección de los
loci de bajo tartamudeo porque el % de tartamudeo puede variar
considerablemente, incluso dentro de un determinado tipo de
repetición (Figura 4). Fueron escogidos loci de repetición de
mononucleótidos para el análisis individual y para la inclusión en
el multiplexado de MSI debido al alto índice de inestabilidad en el
material biológico enfermo de interés.
La incidencia de LOH es otro factor en la
selección de los loci de MSI a amplificar y analizar en los
procedimientos o los equipos de la presente invención. LOH puede dar
lugar a errores de identificación de un alelo normal que falta en
un marcador de microsatélites como indicación de MSI cuando no hay
otros nuevos fragmentos presentes para ese marcador.
Específicamente, no se puede discernir fácilmente si esto representa
LOH o MSI verdaderos en los que el alelo cambiado ha
co-migrado con el resto de los alelos de tipo
salvaje. Para minimizar el problema descrito anteriormente, los
marcadores de microsatélites seleccionados para su utilización en
los actuales procedimientos y equipos preferentemente muestran una
baja frecuencia de LOH, preferentemente no mayor de un 20% LOH, más
preferiblemente no mayor de 14% LOH, aún más preferentemente, no
más de un 3% LOH.
Es un suceso relativamente poco común que un
marcador de microsatélites tenga todas las cualidades necesarias
descritas anteriormente (es decir, alta sensibilidad, alta
especificidad, bajo tartamudeo, bajo LOH). El límite para un
sistema de análisis de MSI para utilizarse en una prueba de
diagnóstico es aún mayor, requiriendo resultados robustos y
reproducibles de múltiples loci en un ensayo utilizando pequeñas
cantidades de ADN de muestras difíciles y ser capaz de distinguir
entre fenotipos MSI-L y MSI-H. Todos
los loci de repetición de tetranucleótidos preferidos específicos
identificados aquí como preferidos para su uso en la presente
invención se demostraron que cumplen cada uno de los criterios para
loci MSI adecuados para su uso en el análisis de diagnóstico, aquí
establecido anteriormente.
Criterios de selección adicionales de loci
particulares a los dos tipos principales de loci MSI amplificados
en los procedimientos de análisis de multiplexado preferidos y
utilizando los equipos de los loci presentes se describen a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan cebadores para uno o más loci de
microsatélites en cada realización del procedimiento y el equipo de
la presente invención. Al menos un cebador se proporciona para cada
locus, más preferiblemente al menos dos cebadores para cada locus,
con al menos dos cebadores siendo en forma de un par de cebadores
que flanquean el locus. Cuando los cebadores se utilizan en una
reacción de amplificación de multiplexado es preferible seleccionar
cebadores y condiciones de amplificación que generen alelos
amplificados a partir de múltiples loci
co-amplificados que no se solapen en tamaño o, si se
solapan en tamaño, que estén etiquetados de una de manera que
permita distinguirlos entre los alelos superpuestos.
Los cebadores adecuados para la amplificación de
loci individuales preferiblemente co-amplificados
de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se
proporcionan en el ejemplo 4, la tabla 9, aquí a continuación. Los
cebadores adecuados para su uso en un multiplexado preferido de
nueve loci (es decir, BAT-25, D10S1426, D3S2432,
BAT-26, D7S3046, D7S3070, MONO-15,
D1S518 y D7S1808) se describen en el Ejemplo 6, tabla 11. Los
cebadores adecuadas para su uso en un multiplexado más preferido de
nueve loci (es decir, BAT-25, D10S1426, D3S2432,
BAT-26, D7S3046, D7S3070, MONO-15,
BAT-40, y D7S1808) se describen en el Ejemplo 8,
Tabla 13. Se proporciona una guía para el diseño de estos y de otros
multiplexados a continuación. Se contempla que otros cebadores
adecuados para amplificar los mismos loci u otros grupos de loci
dentro del alcance de la presente invención podrían determinarse
por parte de un experto en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de análisis de multiplexado de
loci de microsatélites de la presente invención contempla la
selección de un conjunto adecuado de loci, cebadores, y protocolos
de amplificación para generar alelos amplificados a partir de
múltiples loci co-amplificados que preferiblemente
no se solapan en tamaño o, más preferiblemente, que se etiquetan de
una manera que se pueden distinguir entre los alelos de loci
diferentes que se solapan en tamaño. Las combinaciones de loci
pueden rechazarse por cualquiera de estos dos motivos, o porque, en
combinación con uno o más de los loci no producen rendimiento de
producto adecuado, o se producen fragmentos que no representan
auténticos alelos en esta reacción.
Los siguientes factores son preferentemente
tomados en cuenta para decidir sobre qué loci se incluyen en un
multiplexado de la presente invención. Para diseñar eficazmente el
multiplexado de microsatélites, se determinan intervalos de tamaño
de alelos de cada locus. Esta información se utiliza para facilitar
la separación de los alelos entre todos los loci diferentes, ya que
cualquier solapado podría resultar en un alelo de un locus
inadecuadamente identificado como inestable en otro locus.
La cantidad de tartamudeo exhibida por los loci
de repetición de mononucleótidos también se toma preferiblemente en
consideración, ya que la cantidad de tartamudeo exhibida por un
locus puede ser un factor importante en la facilidad y precisión de
la interpretación de los datos. Es preferible llevar a cabo un
estudio poblacional para determinar el nivel de tartamudeo presente
en cada loci de repetición de no mononucleótidos. Tal como se
señaló anteriormente, los marcadores de repetición de
tetranucleótidos muestran un tartamudeo considerablemente menor que
tipos de repetición más cortos, tales como dinucleótidos y, por lo
tanto, puede marcarse con precisión en los análisis de MSI (Figuras
2 y 3) (Bacher y Schumm, 1998 Profiles in DNA
2(2):3-6). Hay que tener en cuenta que
incluso dentro de una clase de loci de microsatélites, tal como loci
de repetición de tetra- y pentanucleótidos, que se sabe que
presentan un bajo tartamudeo, el porcentaje de tartamudeo puede
variar considerablemente en el tipo de repetición (Figura 3; véase
también la Figura 2) (Micka et al. 1999, supra).
Aunque al menos un mononucleótido y al menos dos
loci de repetición de tetranucleótidos se incluyen en el
multiplexado de MSI, se pueden incluir en el multiplexado loci
co-amplificados según el procedimiento o con el
equipo de la presente invención, mononucleótido adicional y/o loci
de repetición de tetranucleótidos. También se contempla que los
loci de multisatélites distintos de los o loci de repetición de
mono-o tetranucleótidos que satisfacen criterios
idénticos o similares a los criterios descritos anteriormente se
incluyan en el multiplexado.
El multiplexado analizado de acuerdo con la
presente invención preferiblemente incluye un conjunto de al menos
tres loci de MSI. Más preferiblemente incluye un conjunto de al
menos cinco loci de MSI, aún más preferiblemente un conjunto de al
menos nueve loci de MSI. Cuando el multiplexado es un conjunto de al
menos nueve loci, es preferible un conjunto de por lo menos los
loci siguientes: BAT-25, D10S1426, D3S2432,
BAT-26, D7S3046, D7S3070, MONO-15,
D1S518, y D7S1808, o más preferentemente un conjunto de al menos los
loci siguientes: BAT-25, D10S1426, D3S2432,
BAT-26, D7S3046, D7S3070, BAT-40,
MONO-15 y D7S1808. Una lista de cebadores adecuados
para su uso en el primer multiplexado se muestra en el Tabla 11 del
ejemplo 6, a continuación. Una lista de cebadores adecuados para su
uso en el segundo multiplexado más preferido se proporciona en la
tabla 13 del Ejemplo 8, a continuación.
También está previsto que otros factores, tales
como combinaciones exitosas de materiales y procedimientos, se
tengan en cuenta en el diseño de un multiplexado de loci de MSI. La
determinación de estos factores adicionales se puede determinar
siguiendo los procedimientos de selección y las directrices aquí
descritas, y mediante el uso de técnicas conocidas para un experto
en la materia de la presente invención. Específicamente, técnicas
iguales o sustancialmente similares pueden utilizarse para
identificar los loci preferidos de MSI y conjuntos de loci de MSI
aquí descritos a continuación para seleccionar secuencias de un
primer par, y para ajustar las concentraciones de cebadores para
identificar un equilibrio en el que todos los loci incluidos pueden
ser amplificados. En otras palabras, una vez que el procedimiento y
los materiales de esta invención se describen, diversos
procedimientos de selección de loci, pares de cebadores, y técnicas
de amplificación para su uso en el procedimiento y el equipo de
esta invención es probable que se propongan por parte de un experto
en la materia. Todos estos procedimientos están pensados para estar
incluidos en el alcance de las presentes reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico amplificado o
co-amplificado de acuerdo con los procedimientos de
la presente invención se origina de material biológico de un sujeto
individual, preferentemente un mamífero, más preferiblemente un
perro, gato, caballo, oveja, ratón, rata, conejo, mono, o humano,
aún más preferiblemente de un humano o un ratón, y más
preferiblemente de un ser humano. El material biológico puede ser de
cualquier tejido, células o fluidos biológicos del sujeto que
contienen el ADN genómico. El material biológico se selecciona
preferentemente del grupo que consiste de tejido tumoral, células
diseminadas, heces, células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero,
ganglios linfáticos, orina y otros fluidos corporales.
El material biológico puede ser en forma de
muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina
(en adelante "PET"). Las muestras de tejido de biopsias se
suelen almacenar en PET para una conservación a largo plazo. La
formalina crea enlaces cruzados en la muestra de tejido que pueden
ser difíciles de romper, a veces resultando en bajos rendimientos
de ADN. Otro problema asociado con las muestras fijadas en formalina
e incrustadas en parafina es que la amplificación de fragmentos más
largos es a menudo problemática. Cuando el ADN de las muestras se
utiliza en las reacciones de amplificación de multiplexado, se
aprecia una disminución significativa en la altura de los picos
cuando aumenta el tamaño del fragmento. El procedimiento de análisis
de microsatélites y el equipo de la presente invención están
preferiblemente diseñados para ampliar y analizar el ADN de
muestras de tejidos de PET. (Véase el ejemplo 7 para un ejemplo de
la amplificación de estas muestras mediante un procedimiento de la
presente invención).
Cuando el procedimiento o el equipo de la
presente invención se utiliza en el análisis o la detección de
tumores, por lo menos una muestra de ADN genómico analizada se
origina en un tumor. Cuando un locus monomórfico o
cuasi-monomórfico, tal como MONO-11
o MONO-15 se amplifica, el tamaño de los alelos
amplificados resultantes puede compararse con el tamaño de los
alelos más comúnmente observados en ese locus en la población
general. El presente procedimiento y el equipo se utilizan
preferentemente para diagnosticar o detectar tumores mediante la
co-amplificación de al menos dos muestras diferentes
de ADN de la misma persona, en el que una de las dos muestras no se
origina de material biológico normal no canceroso.
La presente invención se explica en los
siguientes ejemplos, que no debe ser interpretados a modo de
limitación del alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, los marcadores de
microsatélites en ADN aislado de tumores se compararon con los
marcadores de microsatélites en ADN aislado de células o el tejido
normal con el fin de detectar MSI. En concreto, los loci de
microsatélites fueron amplificados a partir de muestras de ADN
normal/tumoral emparejadas y genotipo. Si uno o más alelos
diferentes están presentes en la muestra de ADN del tumor que no se
encontraron en la muestra normal de la misma persona, entonces se
calificó como MSI positiva. Se analizaron marcadores de
microsatélites de repetición de dinucleótidos, tetranucleótidos y
pentanucleótidos para la frecuencia de alteración para determinar
la sensibilidad relativa de los marcadores particulares de MSI. La
información detallada sobre los procedimientos específicos
utilizados en este ejemplo se proporciona aquí, a continuación.
Tejidos y aislamiento de ADN. Muestras de
tejido normal (sangre) y neoplásico coincidentes de 39 pacientes se
obtuvieron de la Cooperative Human Tissue Network (en lo sucesivo,
"CHTN") (Ohio State University, Columbus, OH). Después de
resección quirúrgica, las muestras de tejido fueron congeladas en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC. Se tomaron muestras de
sangre por punción venosa utilizando tubos de vacío. La extracción
de ADN de la sangre y los tejidos sólidos se llevó a cabo por
procedimiento de fenol/cloroformo (Sambrook et al., 1989
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press,
Cold Springs Harbor, Nueva York) o con el equipo QIAamp Blood and
Tissue (QIAGEN, Santa Clarita, CA) siguiendo el protocolo del
fabricante.
Análisis PCR y de microsatélites. Se
utilizaron cebadores marcados de manera fluorescente de 275 loci de
microsatélites para amplificar el ADN de la plantilla de pares
normal/tumoral de muestras de tumor. Doscientos cuarenta y cinco
marcadores de repetición de tetranucleótidos de Reseach Genetics
CHLC/Weber Human Screening Set Version 9.0 fueron evaluados
(Research Genetics, Huntsville, AL). Conjuntos de cebadores
adicionales para marcadores de repetición de stetranucleótido y
pentanucleótidos fueron obtenidos de Promega Corporation (Madison,
WI) (el sistema PowerPlex^{TM} 16 contiene loci D3S1358, TH01,
D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO,
Penta D, VWA, D8S1179, TPOX, y FGA). Los marcadores de repetición de
pentanucleótidos TP53, Penta A, B Penta, Penta C, Penta D, Penta E,
Penta F y Penta F se sintetizaron de manera personalizada (Promega
Corporation, Madison, WI), utilizando datos de la secuencia de bases
de datos públicas de marcadores de dinucleótidos includos para
propósitos de comparación (D8S254, NM23, D18S35, D5S346,
TP53-di, D2S123, D1S2883, D3S1611, D7S501) se
obtuvieron de PE Biosystems (actualmente conocido en el mercado como
Applied Biosystems Group, Foster City, CA).
Los marcadores de Research Genetics, Human
Screning Set versión 9.0, fueron multiplexados y cribados para
detectar MSI, utilizando 2,5 ng de ADN en 10\mul de reacciones de
PCR que se describen a continuación. Otros loci fueron evaluados
como monoplexados utilizando 1 ng de ADN en 25 \mul de reacciones
de PCR, tal como se describe a continuación. Todos los marcadores
fueron amplificados con PCR bajo las mismas condiciones utilizando
un Perkin-Elmer® GeneAmp PCR System 9600 Thermal
Cycler, salvo que se indique lo contrario a continuación. Los
marcadores de microsatélites de PowerPlex^{TM} 16 System (Manual
Técnico #TMD012, Promega Corporation, Madison, WI) y los marcadores
de repetición de dinucleótido del sistema de ensayo de
microsatélites RER (véase la documentación del producto de PE
Biosystems, biosistemas no aplicados, Foster City, CA) fueron
analizados siguiendo el protocolo del fabricante.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Un microlitro de producto de PCR (marcadores de
Research Genetics fueron diluidos primero 1:4 en tampón PCR 1X
GoldST*R) se combinó con 1 \mul of Internal Lane Standard (Promega
Corporation, Madison, WI) y 24 \mul de formamida desionizada. Las
muestras fueron desnaturalizadas por calentamiento a 95ºC durante 3
minutos y se refrigeraron con hielo durante 3 minutos. La separación
y la detección de los fragmentos amplificados se realizó en un ABI
PRISM® 310 Genetic Analyzer siguiendo el protocolo estándar
recomendado en el Manual del usuario con los siguientes valores: 5
segundos tiempo de inyección, 15 kV tensión de inyección, 15 kV
tensión de ejecución, 60ºC temperatura de ejecución, y 28 minutos
tiempo de ejecución.
Interpretación del ensayo. La
identificación de los tamaños de los alelos normales y tumorales fue
realizada en el electroferograma apropiado del ABI PRISM 310
Genetic Analyzer (Applied Biosystems) y se determinaron los picos
predominantes para cada locus. Uno o dos picos o alelos pueden estar
presentes en cada locus en las muestras normales, dependiendo de si
la persona es homocigótica o heterocigótica para un marcador
particular. Los patrones de alelos de los pares de genotipos
normales y tumorales fueron comparados y se calificaron como MSI
positivo si uno o más alelos diferentes están presentes en las
muestras tumorales de ADN que no fueron encontrados en una muestra
normal de la misma persona.
Una amplia gama en frecuencia de alteración fue
observada entre las muestras y entre los marcadores evaluados. Las
muestras se dividen en dos grupos en función de la frecuencia de la
alteración usando las directrices recomendadas en el taller NCI
sobre MSI (Boland et al. 1998). Las muestras con mayor del
30-40% de marcadores que presentaban alteración en
muestras de tumores fueron clasificados como MSI-H y
<30-40% como MSI-L. Las muestras
sin alteraciones fueron clasificadas como de microsatélites estables
(MSS). Basándose en esta definición de fenotipos de MSI, nueve
muestras fueron clasificadas como MSI-H y las
restantes 30, como MSI-L o MSS.
Los loci de repetición de tetra- y
pentanucleótidos exhibieron la menor cantidad de tartamudeo de los
loci examinados, anteriormente. Ver la Figura 4 para un trazado de
los resultados de % de tartamudeo observado en los loci de
repetición de tetra- y pentanucleótidos. Los marcadores de
repetición de tetranucleótidos también varían en la frecuencia de
la alteración, que van desde el 0 al 100% de MSI en el grupo de
MSI-H (Figura 5). Los marcadores de
pentanucleótidos, en general, muestran bajos niveles de MSI (Figura
6). Los marcadores de microsatélites muestran una alta sensibilidad
a MSI (>88% MSI con muestras de MSI-H) y una alta
especificidad (<8% MSI con muestras e MSI-L y
MSS) con las muestras de CHTN que fueron seleccionadas para la
evaluación adicional con 20 muestras de tumores de cáncer de
colon/normales adicionales de la Mayo Clinic (Rochester, MN) (véase
el ejemplo 5).
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Debido a la naturaleza altamente informativa de
los loci de repetición de mononucleótidos en la determinación de
fenotipo de MSI, también se investigaron las regiones poli (A) del
genoma humano como una nueva fuente de marcadores para los ensayos
de MSI. Para lograr esto, las repeticiones de mononucleótidos fueron
identificadas en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando
BLASTN (Altschul, et al. 1990 J. Mol. Biol.
215:402-410) buscando secuencias
(A)_{30}(N)_{30}. La secuencia
(N)_{30} fue añadida para eliminar frecuentes resultados
de ARNm y para asegurar que la secuencia de flanqueo estaba
disponible para el diseño de cebadores para PCR. A continuación, se
diseñaron cebadores de flanqueo para 33 secuencias de ADN de GenBank
utilizando el software Oligo Primer Analysis versión 6.0 (National
Biosciences, Inc., Plymouth, MN) para amplificar la región que
contiene la repetición poli (A). La Evaluación de los loci se
realizó con 9 muestras de MSI-H y 30 de MSS de
cáncer de colon y las correspondientes muestras de ADN normal. Los
protocolos para PCR, la detección y el análisis se describen en el
Ejemplo 1.
Dos características se cribaron en los nuevos
loci. En primer lugar, los loci se cribaron para que puedan
detectar MSI en el grupo MSI-H y no en el grupo MSS.
En segundo lugar, los loci fueron seleccionados sobre la base de
ser monomórficos o casi monomórficos
(cuasi-monomórficos). La naturaleza monomórfica de
los nuevos loci fue determinada mediante el genotipo de 96 muestras
de 5 grupos raciales (afroamericanos,
asiático-americanos,
caucásico-americanos,
hispano-americanos,
indio-americanos). El cribado de los 33 loci de
repetición de mononucleótidos reveló cuatro nuevos loci de
repetición de mononucleótidos (MONO-3,
MONO-11, MONO-15, y
MONO-19) que muestran una alta sensibilidad a MSI
(Tabla 4 y Figura 7) y eran relativamente homocigóticos y
monomórficos (Tabla 5). El grado de homocigosis y
mono-morfismo detectados en cada locus como se
muestra en la Tabla 5.
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Un estudio de la población se realizó en 93
muestras de individuos afro- americanos fueron genotipadas
utilizando loci de microsatélites preferidos seleccionados como
candidatos para el multiplexado en los estudios en los ejemplos 1 y
2 anteriores. Ver la Tabla 6, a continuación, y la tabla 3, más
arriba, para las condiciones de amplificación utilizadas. Véase la
tabla 7, a continuación, para una lista de los loci amplificados y
analizados en este estudio. Además, una muestra de ADN combinado de
diversidad humana y ADNs CEPH de control 1331-1 y
1331-2 (Coriell Cell Repository, Camden, Nueva
Jersey) fueron incluidos en la población de selección. Se utilizaron
muestras afro-americanas debido a que contienen la
mayor diversidad genética en todos los grupos raciales.
Para facilitar el examen de 96 muestras con 22
marcadores de microsatélites diferentes, los marcadores
seleccionados fueron multiplexados en pequeños grupos de tres. Se
utilizaron conjuntos de cebadores multiplexados para amplificar ADN
de las muestras individuales usando las condiciones descritas a
continuación.
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Los resultados del estudio de población se
resumen en la Tabla 7. Se identificó el tamaño del alelo más pequeño
y más grande para cada locus para determinar el rango de tamaño de
alelos. Para calcular el porcentaje de tartamudeo, la altura del
pico de la banda de tartamudeo fue dividida por la altura de los
picos generados por el alelo verdadero, a continuación, multiplicado
por 100. Los valores mínimo y máximo de tartamudeo se calcularon
para cada locus, así como el porcentaje de tartamudeo promedio
combinado de 20 muestras al azar.
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Para desarrollar un sistema de ensayo de
multiplexado de MSI que sea muy sensible a MSI, con un tartamudeo
mínimo, y una incidencia mínima de LOH, los criterios enumerados en
el tabla 8, a continuación, se utilizaron para identificar loci de
cribado en los ejemplos anteriores como posibles candidatos para su
uso en el análisis de MSI:
Los loci que figuran en la tabla 9, a
continuación, fueron identificados como lugares geométricos que
cumplen las especificaciones que figuran en el tabla 8,
anterior.
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\newpage
Para determinar la causa subyacente de MSI en
muestras de tumores MSI-H utilizadas en el
desarrollo del ensayo de multiplexado de MSI, fueron examinados los
niveles de expresión de proteínas de los genes MLH1 y MSH2. El
análisis inmunohistoquímico de tejidos incrustados en parafina de
ocho muestras de MSI-H se llevó a cabo tal como se
describe en Thibodeau et al. (Cancer Research 58,
1713-1718). La falta de expresión de proteínas en
los genes MLH1 y MSH2 se espera en muestras de tumores con niveles
altos de MSI y es una indicación de desajuste disfuncional del
sistema de reparación.
Los resultados de los ensayos
inmunohistoquímicos en las muestras tumorales de
MSI-H se muestran en la tabla 10. Debe indicarse
que una "ND" en una columna de expresión de proteínas en el
tabla 10 se indica que no se detectó nada.
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Una vez que la mejor localización fue
seleccionada para su uso en el diseño de los multiplexados que se
analizaron de acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, se tuvieron que superar los problemas relacionados con
PCR de multiplexado y la incompatibilidad entre loci. Esto requirió
un diseño de cebadores cuidadoso y un extenso ensayo y error para
encontrar loci que son capaces de amplificación simultánea
utilizando un único conjunto de condiciones de PCR. Los problemas
encontrados fueron: (1) interacciones
cebador-cebador que se produjeron cuando gran
número de oligos fueron combinados en una sola reacción de PCR, (2)
limitaciones de diseño de cebadores debidas a restricciones de
secuencia en un locus particular (por ejemplo, el tamaño mínimo de
amplificación permitido por secuenciado de ADN, % GC sub-óptimo de
cebadores, dificultad para equilibrar Tm para todos los cebadores
bajo condiciones uniformes de PCR, dificultad en la búsqueda de
cebadores con perfiles térmicos deseables para reducir al mínimo la
amplificación no específica, formación de horquillas y auto
dimerización de cebadores, homología a otras secuencias de
repetición en genoma humano), y (3) diseño de multiplexado que
permite la separación de los 9 loci dentro del rango de alcance
limitado de 250 pb.
Basándose en la extensiva evaluación de cerca de
300 marcadores de microsatélites descritos en los Ejemplos 1 a 5,
nueve loci fueron seleccionados para el ensayo preferido de
multiplexado de MSI (Tabla 11). Tres loci son repeticiones
monoplexadas (BAT-25, BAT-26 y
MONO-15) y seis repeticiones de tetranucleótidos
(D1S518, D3S2432, D7S3046, D10S1426, D7S3070, D7S1808). Estos loci
resultaron ser un excelente conjunto de marcadores para la
identificación de MSI en muestras de tumores. Los resultados del
análisis de MSI en 29 muestras de cáncer de colon
MSI-H y 30 MSI-L o MSS usando estos
nueve locus multiplexados se resumen en la Figura 8.
Un ejemplo típico de los resultados producidos
por el uso de los nueve locus MSI multiplexados descritos
anteriormente se muestra en la Figura 9. La imagen fue generada por
la ampliación simultánea de los nueve loci de microsatélites
seleccionados, seguida por separación de los productos de PCR en un
ABI 310 CE. La separación de los nueve loci de microsatélites en un
capilar único (o carril de gel) se logró mediante el diseño de los
multiplexados de manera que los loci no coinciden en el tamaño o
mediante el uso de diferentes tintes fluorescentes. Los rangos de
tamaño de los loci múltiples fueron establecidos por el genotipo de
93 muestras de individuos afro-americanos utilizando
MSI multiplexado descrito siguiendo el protocolo descrito a
continuación. Además, una muestra de ADN de diversidad humana
combinada y ADN de control de CEPH 1331-1 y
1331-2 (Coriell Cell Repository) se incluyeron en la
población de selección. Se utilizaron muestras
afro-americanas debido a que contienen la mayor
cantidad de diversidad genética en todos los grupos raciales.
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Protocolo para ensayo de multiplexado de
MSI. Las plantillas de ADN de tejidos normales y tumorales
obtenidas de un mismo individuo se purificaron utilizando el equipo
QIAamp Blood and Tissue (QIAGEN, Santa Clarita, CA) siguiendo el
protocolo de fabricación. Dos nanogramos de plantilla de ADN en un
volumen de 25 \mul de reacción fueron amplificados con PCR
utilizando el protocolo detallado en la Tabla 12, a continuación,
utilizando el perfil de ciclo descrito en la tabla 3, anterior.
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Un microlitro de producto de PCR se combinó con
1 \mul of Internal Lane Standard (Promega Corporation, Madison,
WI) y 24 \mul de formamida desionizada. Las muestras fueron
desnaturalizadas por calentamiento a 95ºC durante 3 minutos y se
refrigeraron con hielo durante 3 minutos. La separación y detección
de los fragmentos amplificados se realizó en un ABI PRISM 310
Genetic Analyzer siguiendo el protocolo estándar recomendado en el
Manual del Usuario con los siguientes valores:
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La identificación de los alelo tamaños de
amplificación de alelos normales y tumorales fue realizado mediante
el examen del electroferograma apropiado del ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer y determinando los picos predominantes para cada locus.
Uno o dos picos o alelos presentes para cada locus en las muestras
normales, dependiendo de si la persona era homocigota o
heterocigota para un marcador particular. Los patrones de alelos de
los pares de genotipos normales y tumorales fueron comparados y se
calificaron como MSI positivo si uno o más alelos diferentes están
presentes en las muestras tumorales de ADN que no fueron encontrados
en una muestra normal de la misma persona. Ejemplos típicos de los
resultados obtenidos usando multiplexado diseñado para el análisis
de MSI se muestran en las figuras 10 y 11 para cáncer de colon y la
Figura 12 para cáncer de estómago.
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Los loci de microsatélites del multiplexado
identificados en el ejemplo 6, anteriormente, fueron evaluados para
su capacidad para amplificar el ADN de muestras incrustadas en
parafina y fijadas con formalina. El ADN fue extraído de tres
secciones de 10 micrones cortadas de los bloques de PET utilizando
el equipo QIAamp Tissue (Qiagen, Santa Clarita, CA), de acuerdo a
las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones.
Cien microlitros de tampón QIAGEN AE precalentado a 70ºC se
añadieron a la columna, se incubaron durante 5 minutos, se
centrifugaron, a continuación, se volvieron a aplicar a la columna
para una segunda elución. Dos microlitros (de 100 \mul) de
solución de ADN purificado fueron utilizados como plantilla para las
reacciones de PCR. El juego de cebadores multiplexados de nueve
locus se descrito en el ejemplo 6 fue utilizado para amplificar el
ADN de muestras de PET. Los resultados indican que el multiplexado
de MSI es capaz de amplificar el ADN de muestras de PET difíciles y
comúnmente utilizadas (Figura 13).
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Una segunda serie de nueve loci se identificaron
para su análisis en un segundo ensayo de multiplexado de MSI, de
ocho del conjunto de loci más conocidos identificados en el ejemplo
4, anteriormente, para determinar el MSI en muestras de tumores de
colon, y desde un locus de repetición de mononucleótidos
(BAT-40). El diseño de los loci de multiplexado fue
tal que los loci no se solapan en tamaño en un único capilar o
carril de gel o puede etiquetarse usando tintes diferentes cuando
se separan y se produzca la superposición. El uso de determinadas
condiciones experimentales empíricamente óptimas y análisis de
microsatélites de multiplexado se realizó en varios cientos de
individuos sanos.
El conjunto de nueve loci seleccionados para el
ensayo de MSI multiplexado y datos relevantes de identificación para
cada locus se muestran en la Tabla 13, a continuación.
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Cuatro de los loci en el segundo multiplexado de
MSI son repeticiones de mononucleótidos (BAT-25,
BAT-26, BAT-40 y
MONO-15) y cinco son repeticiones de
tetranucleótidos (D3S2432, D7S1808, D7S3046, D7S3070, D10S1426). La
tabla 13 muestra pares de cebadores usados para amplificar cada
locus en el segundo multiplexado de MSI, y rango de tamaño
aproximado de los fragmentos producidos en la amplificación de cada
locus con cada par de cebadores. Las secuencias de cebadores
identificadas en el tabla 13 fueron seleccionadas como
especialmente adecuadas para la amplificación de cada locus en el
segundo multiplexado de MSI.
Los resultados del análisis de MSI en 36
muestras de cáncer de colon MSI-H y 30 MSS usando el
multiplexado de nueve locus y los pares de cebadores descritos en la
Tabla 13 se muestran en la Tabla 14, a continuación, y se ilustran
en la Figura 14. Figura 14 es un gráfico de barras que muestra el
porcentaje de MSI medido en cada locus del multiplexado de cada uno
de los dos tipos de muestras estudiadas (es decir,
MSI-H y MSS). Un locus adicional del multiplexado
identificado en el ejemplo 6, es decir, D1S518, también fue
incluido en este ensayo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados del ensayo, que se resumen en la
Tabla 14 y se ilustran en la Figura 14, mostraron que la
amplificación de BAT-40 resultó en una
discriminación más clara entre las muestras de
MSI-H y MSS que D1S518. Los nueve loci amplificados
mediante usando el segundo sistema de multiplexado de MSI se
detectaron con una eficiencia muy alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Noventa y tres muestras de personas
afro-americanas, una muestra combinada de ADN de
diversidad humana y ADN de control de líneas celulares
1331-1 y 1331-2 (Coriell Cell
Repository, Camden NJ) fueron examinadas utilizando el sistema de
multiplexado de nueve loci descrito en el Ejemplo 8. La
amplificación simultánea de los nueve loci de microsatélites
seleccionados seguida de la separación de los productos en un ABI
310 CE, tal como se ilustra a continuación, produjo todos los
productos esperados.
Protocolo para el ensayo de multiplexado de
MSI. Dos nanogramos de la plantilla normal de ADN fueron
purificados mediante el equipo QIAamp Blood and Tissue (QIAGEN,
Santa Clarita, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN
fue amplificado por PCR en un volumen de 25 \mul de reacción
utilizando el protocolo que se detalla en el tabla 15 y en el Tabla
16, a continuación.
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Un microlitro de producto de PCR se combinó con
1 \mul de Internal Lane Standard (DG2611, Promega Corporation,
Madison, WI) y 24 \mul de formamida desionizada. Las muestras
fueron desnaturalizadas por calentamiento a 95ºC durante 3 minutos
y se refrigeraron con hielo durante 3 minutos. La separación y
detección de los fragmentos amplificados se realizó en un ABI PRISM
310 Genetic Analyzer siguiendo el protocolo estándar recomendado en
el Manual del Usuario con los siguientes valores:
La identificación del tamaño normal de
amplificación de alelos se llevó a cabo mediante el examen del
electroferograma adecuado del ABI PRISM 310 Genetic Analyzer y la
determinación de los picos predominantes en cada locus. Estos
resultados se muestran en la Figura 15. Uno o dos picos o alelos
estaban presentes en cada locus en muestras normales, dependiendo
de si la persona era homocigoto o heterocigoto para un marcador
particular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los patrones de alelos o genotipos para parejas
de los tejidos normales y tumorales de un mismo individuo fueron
examinados utilizando los loci de multiplexado que se describen en
el Ejemplo 8, anterior. La amplificación simultánea de los nueve
loci de microsatélites seleccionados seguida de la separación de los
productos en un ABI 310 CE mostró todos los productos
esperados.
El protocolo para el ensayo de multiplexado de
MSI y el perfil de ciclo de las muestras del paciente se llevaron a
cabo exactamente como en el ejemplo 9, anterior. La identificación
de los tamaños amplificación de los alelos normales y tumorales fue
realizada en el electroferograma del ABI PRISM 310 Genetic Analyzer
y la determinación de los picos predominantes en cada locus.
Los resultados típicos de los ejemplos de
tejidos emparejados se muestran en la Figura 16. Uno o dos alelos
estaban presentes en cada locus en las muestras normales,
dependiendo de si la persona era homocigoto o heterocigoto para un
marcador particular. Los patrones de alelos de los pares de
genotipos normales y tumorales fueron comparados y se calificó como
MSI positivo si uno o más alelos diferentes están presentes en las
muestras tumorales de ADN que no fueron encontrados en una muestra
normal de la misma persona.
Aunque la presente invención ha sido descrita y
ejemplificada con cierta especificidad, los expertos en la materia
apreciarán diversas modificaciones, incluyendo variaciones,
adiciones y omisiones que pueden ser realizadas en lo que se ha
descrito. En consecuencia, se pretende que estas modificaciones
también estén cubiertas por la presente invención y que el alcance
de la presente invención se limite únicamente por la interpretación
más amplia que legalmente se puede conceder según las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Cebador BAT-25
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipaactatggct tctgcatttt c
\hfill21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Cebador BAT-26
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<400> 3
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\hfill21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Cebador BAT-26
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\hskip-.1em\dddseqskipaaccattcaa catttttaac cc
\hfill22
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<223> Cebador MONO-11
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\hfill24
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\hfill24
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<220>
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<223> Cebador MONO-15
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Cebador D1S518
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<220>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D1S547
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<212> AND
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D2S1790
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D3S2432
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<212> AND
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<220>
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D5S818
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DSS2849
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Cebador D6S1053
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D6S1053
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S1808
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S1808
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3046
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3046
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<212> AND
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<213> Homo sapiens
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3070
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<400> 30
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\hskip-.1em\dddseqskipggaagccaaa tgttgaattg
\hfill20
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<210> 31
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<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D8S1179
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcg tcatgtgtac tttttgtatt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D8S1179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttca attagttcat cgtagctata
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D9S2169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcccaaaag ttgccatcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D9S2169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttatgcaag agcccaaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D10S1426
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcctcttt ttggtggtgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D10S1426
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttaactg atttggccga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D1082470
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 37
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\hskip-.1em\dddseqskipcctcaagctt cctcctagct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D1082470
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctgtggt caggacagat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D12S391
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatgcat aacaggatca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D12S391
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcttttag acctggactg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D17S1294
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcatgcaa ttgtagtctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D17S1294
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactaagttga ttctttcctt gaacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D17S1299
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcacttga gcacacatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D17S1299
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcattatg gggaccatta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D18S51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgccactg gagccatgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D18S51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacccgac taccagcaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador FGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaactcaca ccataggttt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador FGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctcagat cctctgacac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D1S518
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttata tgttataaaa gtcaattcct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D1S518
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattggcaact gcattagagt tctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S1808
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggaaaag gaat tcttaaacgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S1808
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattggccttg tacto atgtgtttgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3070
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccccatga catttcttct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3070
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaaggtg atttgacagc cagatg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggagacag ccagggatat a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatct aacctctctc atttctctat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D10S1426
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccttggtg gtgtcatcct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D10S1426
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgccgatc ctgaagcaat agc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D3S2432
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtca attgtttgca tgtgaaacag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAT-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctct ttaactatgg attctgcatt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAT-26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagt tgacttcagc tgactacttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAT-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccaatcaa catttttaac cctt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D3S2432
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacaggtca gtttgcatgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador D7S3046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatct tacctctctc atttctctat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAT-40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgttcct acaaccctgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAT-40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagagcaag accacccttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MONO-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgaattg tgtgaaccac caga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MONO-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttgcagtg gtt agcagagatc
\hfill23
Claims (20)
1. Procedimiento de análisis de loci de
microsatélites, que comprende las etapas de:
a) proporcionar cebadores para la
co-amplificación de un conjunto de al menos nueve
loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende
BAT-25, BAT-26,
MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046,
D7S3070, D7S1808 y D10S1426;
b) co-amplificar el conjunto de
loci de al menos una muestra de ADN genómico de una reacción de
amplificación de multiplexado, utilizando los cebadores,
produciendo así fragmentos de ADN amplificados; y
c) determinar el tamaño de los fragmentos de ADN
amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento de detección de inestabilidad
de microsatélites en ADN genómico, que comprende las etapas de:
a) proporcionar cebadores para la
co-amplificación de un conjunto de al menos nueve
loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende
BAT-25, BAT-26,
MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046,
D7S3070, D7S1808, y D10S1426;
b) co-amplificar el conjunto de
loci de una primera muestra de ADN genómico procedente de material
biológico normal no canceroso de una persona y de una segunda
muestra de ADN genómico procedente de un segundo material biológico
de la persona, en reacciones de amplificación de multiplexado
separadas, utilizando al menos un cebador de oligonucleótido para
cada uno de los loci de microsatélites, produciendo así unos
primeros fragmentos de ADN amplificados a partir de la primera
muestra y unos segundos fragmentos de ADN amplificados a partir de
la segunda muestra; y
c) comparar el tamaño de los primeros fragmentos
de ADN amplificado con el tamaño de los segundos fragmentos de ADN
amplificados para detectar la inestabilidad en cualquiera de los
loci del segundo ADN genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que al menos uno de los cebadores proporcionados en la etapa
(a) tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de
secuencias de cebadores identificadas por: SEQ ID NO: 1 a 68.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el conjunto de loci se co-amplifica
utilizando al menos un cebador para cada locus seleccionado del
grupo que consiste en:
SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 60, cuando el locus es
BAT-25,
SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, cuando el locus
es BAT-26,
SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, cuando el locus
es BAT-40,
SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, cuando el locus
es MONO-15,
SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 59, cuando el locus
es D3S2432,
SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, cuando el locus
es D7S 1808,
SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, cuando el locus
es D7S3070,
SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64, cuando el locus
es D7S3046, y
SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, cuando el locus
es D10S1426.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el conjunto de loci se
co-amplifica en la etapa (b) utilizando al menos un
cebador de oligonucleótido para cada locus que se marca de manera
fluorescente.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el al menos una muestra de ADN genómico
comprende una primera muestra de ADN genómico procedente de material
biológico normal no canceroso de una persona y una segunda muestra
de ADN genómico procedente de un tumor de la persona, comprendiendo
también el procedimiento:
detectar la inestabilidad de microsatélites
mediante la comparación del tamaño de los fragmentos de ADN
amplificados producidos a partir de la
co-amplificación de la primera muestra de ADN
genómico en el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados
producidos a partir de co-amplificación de la
segunda muestra de ADN genómico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se
utilizan en el pronóstico del tumor.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se
utilizan en el diagnóstico de un tumor de predisposición
familiar.
9. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se
utilizan para detectar tumores cancerosos del sistema
gastrointestinal y del endometrio.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que los tumores cancerosos son tumores de un cáncer
colorrectal.
11. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la segunda muestra de material biológico se selecciona del
grupo formado por: tejido tumoral, células diseminadas, heces,
células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero, ganglios linfáticos,
orina y otros fluidos corporales.
12. Equipo para el análisis de loci de
microsatélites de ADN genómico humano, que comprende:
cebadores de oligonucleótido para la
co-amplificación de un conjunto de al menos nueve
loci de microsatélites de ADN genómico humano, comprendiendo el
conjunto BAT-25, BAT-26,
MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046,
D7S3070, D7S1808, y D10S1426.
13. Equipo según la reivindicación 12, en el que
al menos uno de los cebadores de oligonucleótido se selecciona del
grupo que consiste en:
SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 60, cuando el locus es
BAT-25,
SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, cuando el locus
es BAT-26,
SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, cuando el locus
es BAT-40,
SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, cuando el locus
es MONO-15,
SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 59, cuando el locus
es D3S2432,
SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, cuando el locus
es D7S1808,
SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, cuando el locus
es D7S3070,
SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64, cuando el locus
es D7S3046, y
SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, cuando el locus
es D10S1426.
14. Equipo según la reivindicación 12, en el que
al menos un cebador de oligonucleótido para cada uno de los al
menos nueve loci de microsatélites en el conjunto se marca de manera
fluorescente.
15. Equipo según la reivindicación 12, en el que
el equipo comprende además una polimerasa termoestable.
16. Equipo según la reivindicación 12, en el que
el equipo comprende además un primer ADN de control aislado de
material biológico normal no canceroso, y el segundo ADN de control
de material biológico carece de genes de reparación de errores de
emparejamiento.
17. Equipo según la reivindicación 12, en el que
la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites
co-amplificados por los cebadores se puede utilizar
en el diagnóstico de tumor de pronóstico.
18. Equipo según la reivindicación 12, en el que
la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites
co-amplificados por los cebadores se puede utilizar
en el diagnóstico de un tumor de predisposición familiar.
19. Equipo según la reivindicación 12, en el que
la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites
co-amplificados por los cebadores es una indicación
de tumores del sistema gastrointestinal o del endometrio.
20. Equipo según la reivindicación 12, en el que
la inestabilidad de microsatélites es un indicio de cáncer
colorrectal.
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