ES2338767T3 - Variantes de lipoxigenasa y su uso. - Google Patents

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Akiko Sugio
Shinobu Takagi
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Abstract

Una 9-lipoxigenasa que es: a) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139, b) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos como péptido maduro mostrada en la SEC ID NO:1, c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que: i)tiene al menos 85% homología con dicho polipéptido, ii)es una variante alélica de dicho polipéptido, o d) un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con una cadena complementaria de i)la secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositada como DSM 14139 o ii)la secuencia de ADN de SEC ID NO:1 codificante del polipéptido maduro.

Description

Variantes de lipoxigenasa y su uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una lipoxigenasa y a un polinucleótido que la codifica.
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Antecedentes de la invención
La lipoxigenasa (EC 1.13.11.12) es una enzima que cataliza la oxigenación de ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido linoleico, ácido linolénico y ácido araquidónico, que contiene una unidad cis,cis-1,4-pentadieno y produce hidroperóxidos de estos ácidos grasos. La enzima es distribuida en gran parte en plantas y animales. Un número de genes de la lipoxigenasa han sido aislados a partir de varias fuentes vegetales y mamíferas.
Por otra parte, sólo un número limitado de lipoxigenasas microbianas son conocidas, y ningún gen de lipoxigenasa de origen microbiano ha sido descrito. Su and Oliw, J. Biological Chemistry, 273 (21), 13072-79 (1998) describen una lipoxigenasa de Gaeumannomyces graminis.
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Resumen de la invención
Los inventores han descubierto una nueva lipoxigenasa fúngica y han determinado su secuencia, la cual puede ser usada para la producción de la enzima a escala industrial. Estos han clonado el gen en E. coli y depositado el clon.
Por consiguiente, la invención provee una lipoxigenasa que es:
a)
un polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139,
b)
un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro expuesto en la SEC ID N: 1,
c)
un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que:
i)
tiene al menos 85% de homología con dicho polipéptido,
ii)
es una variante alélica de dicho polipéptido, o
d)
un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con una cadena complementaria de
i)
la secuencia de ADN clonada en un plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139 o
ii)
la secuencia de ADN de SEC ID N: 1 de codificación del polipéptido maduro.
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La invención provee también un polinucleótido que comprende:
a)
la secuencia de ADN parcial codificante de una lipoxigenasa madura clonada en un plásmido presente en Escherichia coli DSM 14139,
b)
la secuencia de ADN parcial codificante de una lipoxigenasa madura mostrada en la SEC ID N: 1,
c)
un análogo de la secuencia definida en a) o b) que codifica una lipoxigenasa y
i)
que tiene al menos 85% de homología con dicha secuencia de ADN, o
ii)
se hibridiza en astringencia alta con una cadena complementaria de dicha secuencia de ADN,
iii)
es una variante alélica de la misma, o
d)
una cadena complementaria de a), b) o c).
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Otros aspectos de la invención proveen un constructo de ácido nucléico y un vector de expresión recombinante comprendiendo el polinucleótido, una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo o el vector, y un método para producir una lipoxigenasa mediante el cultivo de la célula. Además, la invención provee un método de selección de una librería eucariótica para obtener una lipoxigenasa y una sonda de oligonucleótidos útil para la selección. Finalmente, la invención provee el uso de la lipoxigenasa en productos de cocción y en un detergente.
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Descripción detallada de la invención Fuente de ADN genómico
Un gen de lipoxigenasa de la invención puede ser derivado de un hongo filamentoso, por ejemplo un Ascomicota, particularmente Magnaporthaceae, tal como una cepa de Magnaporthe, particularmente Magnaporthe salvinii Cattaneo (Mycologia 64 (1),110 (1972)). La especie es también conocida con los sinónimos Curvularia sigmoidea, Helminthosporium sigmoideum, Leptosphaeria salvinii, Nakataea sigmoidea, Sclerotium oryzae y Vakrabeeja sigmoidea. Un ejemplo es la cepa M. salvinii IFO 6642.
De forma alternativa, el gen puede ser aislado a partir de Pyricularia, por ejemplo P. oryzae o P. grísea, por ejemplo P. oryzae IFO 30517. Las cepas IFO son distribuidas comercialmente por el Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japón.
El gen de lipoxigenasa puede ser aislado a partir de estos organismos usando unas sondas diseñadas en base a las secuencias de ADN en esta especificación.
Una cepa de Escherichia coli conteniendo un gen de lipoxigenasa a partir de M. salvinii IFO 6642 fue depositada por los inventores según las condiciones del Tratado de Budapest con Deutsche Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig DE, Alemania. La fecha de depósito fue el 28 de febrero de 2001, y el número de acceso era DSM 14139.
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Producción de lipoxigenasa por cultivo de transformante
La lipoxigenasa de la invención puede ser producida por transformación de una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN codificante de la lipoxigenasa, cultivo del organismo transformado en condiciones que permiten la producción de la enzima, y por recuperación de la enzima del cultivo.
El organismo huésped puede ser una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa, por ejemplo una cepa de Aspergillus, Fusarium, Trichoderma o saccharomyces, particularmente A. Niger, A. oryzae, F. graminearum, F. samb?cinum, F. cerealis o S. cerevisiae. La producción de la lipoxigenasa en estos organismos huéspedes puede ser realizada por los métodos generales descritos en EP 238,023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko).
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Propiedades de LOX
La lipoxigenasa de la invención es capaz de oxidar una gama amplia de sustratos que contienen una fracción cis-cis-pentadienilo. De esta manera, actúa sobre los ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido linoleico (18 átomos de carbono, 2 enlaces dobles), ácido linolénico (18:3), ácido araquidónico (20:4), ácido eicosapentanoico (AEP, 20:5) y ácido docosahexaenoico (ADH, 22:6). También actúa sobre ácidos grasos otros que los sustratos, tales como el linoleato de metilo y probablemente también triglicéridos. La enzima presenta una constante de Michaelis muy baja (K_{M}) con respecto al ácido linoleico y una alta especificidad (V_{max}/K_{M}) hacia este sustrato.
La lipoxigenasa de M. salvinii es una 9-lipoxigenasa, es decir que oxida el enlace doble entre los átomos de carbono 9 y 10 en ácido linoleico y ácido linolénico.
La lipoxigenasa de M. salvinii presenta una actividad óptima alrededor de pH7, y es altamente activa por encima de una gama de pH amplia de 3-12, con más de 50% de actividad óptima en la gama de pH 6-11. Esta es estable después de toda una noche de incubación en pH 5-11.
La lipoxigenasa nativa de M. salvinii presenta una actividad óptima a 50-60ºC. Es bastante activa a 40-60ºC, y la actividad empieza a descender a 70ºC. La lipoxigenasa es estable después de 30 minutos de incubación con un pH 7 a temperaturas hasta 50ºC.
La velocidad de reacción para la lipoxigenasa recombinante (expresada en A. oryzae) aumenta casi diez veces a la temperatura óptima para una catálisis en comparación con el nivel obtenido a temperatura ambiente. La velocidad de reacción máxima es obtenida a 67.5ºC. Una reducción excesiva de la constante de nivel es detectada por encima de la temperatura óptima. Se cree que la glicosilación vuelve la enzima recombinante más estable con respecto al calor que la enzima de tipo salvaje.
La lipoxigenasa recombinante es bastante estable a temperaturas hasta 50ºC durante al menos una hora. La actividad cae en una forma lineal a temperaturas superiores entre 50-60ºC, y ninguna actividad es detectada después de incubaciones superiores a 60ºC durante una hora. Ninguna pérdida de actividad es detectada durante la incubación a temperaturas inferiores a 45ºC.
Soluciones congeladas de lipoxigenasa pierden un poco de actividad durante el almacenamiento. Con la adición de 10% de glicerol no hay ninguna pérdida de actividad perceptible después de dos semanas de almacenamiento a -20ºC, y los enzimas sobreviven a ciclos repetidos de descongelación-congelación sin pérdida de actividad.
La lipoxigenasa de la invención tiene una buena estabilidad en presencia de agentes tensioactivos aniónicos. Por consiguiente, la lipoxigenasa de M. salvinii es estable en presencia de 400 ppm de LAS (sulfonato de alquilbenceno lineal).
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Uso de lipoxigenasa
La lipoxigenasa puede ser usada para una síntesis de aromas de toque verde, por ejemplo nonenal a partir de 9-hidoperoxida de ácido linolénico. La síntesis puede ser realizada en analogía con Whitehead et al. 1995, Cereal foods world 40(4), 193-197 y la patente estadounidense 4769243.
La lipoxigenasa también puede ser usada para la síntesis de hormonas vegetales tal como se describe en JP H11-29410.
Además la lipoxigenasa es un buen oxidante de carotenoides, por lo que puede ser usada para el blanqueo de productos alimentarios como la harina, aceite o alimentos marinos incluyendo carotenoides o pigmentos de tipo carotenoides.
La actividad oxidante puede ser utilizada para una reticulación de proteína, aceite, almidón, fibra y mezcla de éstos. La reticulación de compuestos químicos puede ser utilizada para la síntesis de polímero para producir fibra plástica o resina plástica. Se puede usar para el blanqueo en forma de detergente para manchas fenólicas, carotenoides o de grasa o la decoloración. O puede ser usada para el blanqueo de aguas residuales o de colorante textil.
La lipoxigenasa puede ser usada para el blanqueo de materias vegetales o de alimentos marinos conteniendo carotenoides. Se podría usar así para el blanqueo de harina para el pan, fideos o pasta, o blanqueo de carne de pescado o de aceite de pescado conteniendo astaxantina.
También se puede usar para la reticulación de proteínas, aceite, almidón, fibra vegetal o mezcla de éstos en presencia de ácidos grasos, aceite o grasas. Es útil cambiar la textura o propiedades físicas de los productos alimentarios o controlar el aroma de grasas y aceites, o para producir polímeros hechos de materias naturales además de un uso alimentario. Los compuestos reticulados pueden ser compuestos químicos, por ejemplo, compuestos fenólicos, carbonilos, carboxilos o amidas o una mezcla de estos. Esta puede ser usada para la síntesis de fibra plástica o de resina.
Otros usos de lipoxigenasa pueden ser la síntesis de un compuesto aromático como el hexanal o hexenal junto, como efecto de sinergia de liasa de hidroperóxido. O en el caso en el que el material vegetal sea usado como la fuente de más de dos enzimas, la lipoxigenasa puede ser añadida a éste para mejorar el rendimiento del compuesto de sabor. Algo similar puede realizarse para la síntesis de hormonas vegetales o animales.
Finalmente ésta puede ser usada como blanqueador. Puede ser usada en detergentes para el lavado de manchas fenólicas, carotenoides, grasas o la decoloración de la ropa. O puede ser usada para el lavado de un colorante textil o colorante para la industria de pasta en aguas residuales o en el cambio de textura colorante.
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Vector de expresión recombinante
El vector de expresión de la invención incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, un operador, un sitio de unión de ribosomas, una señal de inicio de translación, y opcionalmente, un marcador seleccionable, un terminador de transcripción, un gen represor o diferentes genes activadores. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, o puede ser integrado en el genoma de la célula huésped.
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Producción por cultivo de transformante
La lipoxigenasa de la invención puede ser producida por transformación de una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica la lipoxigenasa, por cultivo del organismo transformado en condiciones que permiten la producción de la enzima, y por recuperación de la enzima del cultivo.
El organismo huésped puede ser una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa, por ejemplo una cepa de Aspergillus, Fusaríum, Trichoderma o Saccharomyces, particularmente A. Niger, A. oryzae, F. graminearum, F. sambucinum, F. cerealis o S. cerevisiae. La producción de la lipoxigenasa en tales organismos huéspedes puede ser realizada según los métodos generales descritos en EP 238,023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko).
La enzima puede ser purificada en una etapa por cromatografía de intercambio de cationes hasta la homogeneidad.
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Hibridación
Se usa la hibridación para indicar que una secuencia de ADN provista es análoga a una sonda de nucleótidos correspondiente a una secuencia de ADN de la invención. La hibridación puede ser realizada en astringencia alta. Un ejemplo de las condiciones de hibridación está descrita más detalladamente a continuación.
Condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y un ADN homólogo o secuencia de ARN, implica el preremojo del filtro que contiene los fragmentos de ADN o el ARN en 5 X SSC (citrato de solución salina estándar) durante 10 minutos, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5% SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón ultrasonicado desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguido de una hibridación en la misma solución conteniendo una sonda de cebado aleatorio (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), ^{32}P-dCTP-marcado (actividad específica > 1 X 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es lavado posteriormente dos veces durante 30 minutos en 2 X SSC, 0.5% SDS a una temperatura de al menos 55ºC, particularmente al menos 60ºC, más particularmente al menos 65ºC, por ejemplo al menos 70ºC, o al menos 75ºC.
Unas moléculas con las que la sonda de oligonucleótidos se hibridiza en estas condiciones son detectadas usando una película de rayos x.
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Alineación y homología
La lipoxigenasa y la secuencia de nucleótidos de la invención pueden tener homologías con respecto a las secuencias descritas de al menos 85%, particularmente al menos 90% o al menos 95%, por ejemplo al menos 98%.
Para los objetivos de la presente invención, alineamientos de secuencias y cálculo de resultados de homología fueron realizados usando una alineación de Needleman-Wunsch (es decir, alineación global), útil para ambos alineamientos de proteínas y de ADN. Las matrices de resultados por defecto BLOSUM50 y la matriz de identidad son usadas para alineamientos de proteínas y de ADN respectivamente. La penalización para el primer residuo en un espacio es de -12 para las proteínas y de -16 para el ADN, mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es de -2 para las proteínas y de -4 para el ADN. La alineación procede de la versión de paquete FASTA v20u6 (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis" PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990), "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Methods in Enzymology, 183:63-98).
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Ejemplos Materiales y métodos
Unas técnicas de clonación molecular son descritas en Sambrook et al. (1989).
Los siguientes plásmidos comerciales y cepas de E. coli fueron usados para una subclonación y construcción de biblioteca de ADN:
pT7Blue (Novagen)
pUC19 (TOYOBO, Japón)
E. coli MI 09 (TOYOBO, Japón)
E. coli DH12S (GIBCO BRL, Life Technologies, EEUU)
El marcado y la detección de sonda de hibridación se realizaron usando un marcado DIG y un kit de detección (Boehringer Manheim). Una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham, Inglaterra) fue usada para la transferencia de ADN para la hibridación de colonias.
La lipoxigenasa de soja (tipo l-B) (cat.# L7315) y astaxantina (cat.# A-9335) fue suministrada por Sigma. El beta-caroteno (cat.# 031-05533) fue suministrado por Wako.
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Medios y solución de tampón
COVE-ar: por litro 342.3 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acrilamida, 15 mM de CsCl_{2}, 30 g de agar noble (Difco)
COVE2-ar: por litro 30 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acrilamida, 30 g de agar noble (Difco)
Solución salina COVE: por litro 26 g de KCl, 26 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 76 g KH_{2}PO_{4}, 50 ml de metales traza COVE.
Metales traza COVE: por litro 0.04 g de NaB_{4}O_{7}-10H_{2}O, 0.4 g de CuSO_{4}-5H_{2}O, 1.2 g de FeSO_{4}-7H_{2}O, 0.7 g de MnSO_{4}-H_{2}O, 0.7 g de Na_{2}MoO_{2}-2H_{2}O, 0.7 g ZnSO_{4}-7H_{2}O.
Metales traza AMG: por litro 14.3 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O, 2.5 g de CuSO_{4}-5H_{2}O, 0.5 g de NiCl_{2}, 13. 8 g de FeSO_{4}, 8.5 g de MnSO_{4}, 3.0 g de ácido cítrico.
YPG: por litro 4 g de extracto de levadura, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 15 g de glucosa, pH 6.0.
STC: 0.8 m de sorbitol, 25 mM de tris pH 8, 25 mM de CaCl_{2}.
STPC: 40% de PEG4000 en tampón STC.
Agarosa superior COVE: por litro 342.3 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acetamida, 10 g de agarosa de baja fusión.
MS-9: por litro 30 g de polvo de soja, 20 g de glicerol, pH 6.0.
MDU-2Bp: por litro 45 g de maltosa-1H_{2}O, 7 g de extracto de levadura, 12 g de KH_{2}PO_{4}, 1 g de MgSPO_{4}-7H_{2}O, 2 g de K_{2}SO_{4}, 5 g de urea, 1 g de NaCl, 0.5 ml de solución de metal traza AMG pH 5.0.
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Organismo huésped
El Aspergillus oryzae BECh2 está descrito en WO 00/39322. Es un mutante de JaL228 (descrito en WO98/123000), el cual es un mutante de IF04177.
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Transformación de A. oryzae
Una cepa de Aspergillus oryzae BECh2 fue inoculada en 100 ml de medio YPG e incubada a 32ºC durante 16 horas con una agitación a 80 r.p.m. El micelio crecido fue recogido por filtración seguido de un lavado con 0.6 M de KCl y resuspendido en 30 ml de 0.6 M de KCl conteniendo Glucanex® (Novozymes) en la concentración de 30 \mul/ml. La mezcla fue incubada a 32ºC con la agitación a 60 r.p.m. hasta formar los protoplastos. Después de la filtración para eliminar el micelio mantenido, los protoplastos fueron recogidos por centrifugado y lavados dos veces con un tampón STC. Los protoplastos fueron contados con un hemacitometro y resuspendidos en una solución de STC:STPC:DMSO (8:2:0.1) en una concentración final de 1.2 X 107 proloplaslos/ml. Aproximadamente 4 \mug de ADN fueron añadidos a 100 \mul de solución de protoplastos, se mezclaron ligeramente y fueron incubados en hielo durante 30 minutos. 1 \mul de tampón STPC fue añadido a la mezcla e incubado a 37ºC durante oíros 30 minutos. Después de la adición de 10 ml de agarosa superior Cove precalentados a 50ºC, la mezcla de reacción fue vertida en placas de agar COVE-ar. Las placas fueron incubadas a 32ºC durante 5 días.
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SDS-PAGE
Una electroforesis en poliacrilamida SDS fue efectuada usando el gel comercializado PAGEL AE6000 NPU-7.5L (7.5T%) con el aparato AE-6400 (Atto, Japón) siguiendo el protocolo provisto. 15 \mul de muestra fueron suspendidos en 15 \mul de 2x concentrado de tampón de carga de muestra (100 mM tris-HCl (pH 6.8), 200 mM ditiotreitol, 4% SDS, 0.2% azul de bromofenol y 20% glicerol) y hervidos durante 5 minutos. 20 \mul de solución de muestra fueron aplicados en un gel de poliacrilamida, y sometidos a una electroforesis en el tampón usado (25 mM Tris, 0.1% SDS, 192 mM glicina) a 20 mA por gel. El gel obtenido fue teñido con naranja SYPRO y detectado por Molecular Imager FX (BIO-RAD).
\newpage
Ensayos para determinar la actividad de la lipoxigenasa Ensayo espectrofotométrico
La actividad de lipoxigenasa fue determinada espectrofotométricamente a 25ºC siguiendo la formación de hidroperóxidos con la absorbencia a 234 nm. En 0.98 ml del tampón (50 mM KH_{2}PO_{4}/NaHPO_{4}, pH 7.0), 10 \mul de solución de sustrato (10 mM de ácido linolénico dispersos con 0.2% Tween 20) fueron añadidos y la reacción se inició mediante la adición de 10 \mul de solución enzimática. Una unidad produce un aumento de la absorbencia a 234 nm de 0.001/min.
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Ensayo FOX
El ensayo se inició mediante la adición de 20 \mul de solución enzimática a 80 \mul de 50 mM de cada tampón conteniendo 0.7 mM de ácido linolénico dispersos con 0.02% de Tween 20 usando Hiscotron, e incubados durante 10 min. El ensayo se terminó mediante la adición de 900 \mul de reactivo FOX: ácido sulfúrico (25 mM), naranja de xilenol (100 \muM), sulfato de hierro (II) (100 \muM), hidroxitolueno butilado (4 mM) en metanol:agua (9:1). Unas muestras en blanco contenían sólo una solución de sustrato durante la incubación, pero una solución enzimática fue añadida después de la adición del reactivo FOX. El color amarillo de naranja de xilenol acidificado se convirtió en un color azul debido a la oxidación mediada por hidroperóxido de lípidos de iones Fe^{2+} con el colorante. La absorbencia del complejo Fe^{3+} a 620 nm fue medida 1 hora después de la adición de reactivo FOX.
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Ensayo de blanqueo
El efecto blanqueador por lipoxigenasa fue examinado espectrofotométricamente a 25ºC siguiendo la absorbencia a 470 nm. La solución de pigmento fue preparada de la siguiente manera. 150 ul de solución de pigmento de reserva (1 mg de cada pigmento en 1 ml de cloroformo) fueron evaporados para ser secados. Después 30 ml del tampón (50 mM KH_{2}PO_{4}/NaHPO_{4}, pH 7.0) fueron añadidos lentamente con 0.3% de Tween 20 y el pigmento fue disuelto. Se añadió 10 \mul de solución de sustrato (10 mM ácido linolénico disperso con 0.2% de Tween 20) a 0.98 ml de solución de pigmento, y la reacción comenzó por la adición de 10 \mul de solución enzimática.
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Ejemplo 1 Clonación de gen LOX genómico de M. salvinii
El ADN genómico de Magnaporthe salvinii fue digerido con SacI y separado en 1.0% de gel de agarosa. Aproximadamente 2.5 kbp de digestión de ADN fueron recuperados a partir del gel y ligados con pUC19 tratado con BAP linealizado por SacI. Una mezcla de ligadura fue transformada en E. coli DH12S para construir una biblioteca genómica parcial. Esta fue seleccionada, y una colonia E. coli positiva de lipoxigenasa fue aislada y el plásmido, denominado pSG28, fue recuperado. El plásmido pSG28 contenía un fragmento genómico SacI de 2.5 kbp que contenía la presunta secuencia homologa LOX. La secuencia de 1973 pb externa a 2.5 kpb está mostrada como SEC. ID 1.
Unos intrones fueron identificados y están indicados en la SEC ID nº: 1. Los sitios de unión fueron previstos tal y como se describe en S.M. Hebsgaard et al., Nucleic Acids Research, 1996, vol. 24, nº. 17, 3439-3452.
El presunto marco de lectura abierto consistía en 1851 pb, y la secuencia de aminoácidos deducida correspondía a 617 aminoácidos, expuesta como SEC ID nº: 2. La masa molecular fue estimada a 67500 Da.
El E. coli DH12S conteniendo el plásmido pSG28 fue depositado en DSMZ como DSM 14139 con la fecha de accesión de 28-02-2001.
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Ejemplo 2 Expresión de M. salvinii LOX en A. oryzae Construcción de plásmido de expresión
La secuencia genómica parcial de gen genómico de M. salvinii fue amplificada por PCR mediante el uso de pSG28 en forma de patrón. Los cebadores 3 e 4 (SEC ID nº: 3 y 4) fueron diseñados para formar sitios BamHI y XhoI en ambas extremidades del producto de PCR (nucleótidos 4-9 de cebador 3 y 5-10 de cebador 4, respectivamente). La mezcla de reacción de PCR comprendía 2.5 mM de dNTP, 30 pmol de cada uno de los cebadores 3 y 4, 5 unidades de Taq polimerasa LA (Takara) y proporcionaba el tampón GC I.
La condición de reacción fue mostrada más abajo. La Taq polimerasa LA fue añadida a la mezcla reactiva después de la fase 1.
1 
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El fragmento de 1.9 kb amplificado por PCR fue aislado y clonado en pT7Blue produciendo pSG29.
El plásmido pSG29 fue digerido por BamHII y XhoI y 1.9 kb de fragmento que contenía el gen LOX fue ligado con pMT2188 digerido con BamHI y XhoI. El plásmido pMT2188 tiene un promotor de amilasa neutral de Aspergillus niger modificado, una secuencia guía TPI de Aspergillus nidulans, un terminador de glucoamilasa de Aspergillus niger, un gen amdS de Aspergillus nidulans como marcador para una transformación fúngica y ura3 de S. cerevisiae como marcador para la transformación de E. coli. La transformación se realizó con E. coli DB6507 donde el gen pyrF es deficiente y puede recibir un suplemento de Ura3 de S. cerevisiae. El plásmido resultante fue denominado pSG30.
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Expresión de M. salvinii LOX en A. oryzae
El BECh2 de A. oryzae fue transformado con el plásmido pSG30 y los transformantes positivos de selección fueron aislados. Los transformantes fueron dispuestos en crecimiento en COVE 2-ar a 32ºC durante 5 días e inoculados en 100 ml de MS-9 en matraz de agitación. Después del cultivo en agitación vigorosa a 32ºC durante 1 día, 3 ml de cada cultivo fueron transferidos a 100 ml de MDU-2Bp en un matraz de agitación para un cultivo a 32ºC durante 3 días. El caldo de cultivo fue centrifugado a 3500 r.p.m. durante 10 minutos y el sobrenadante fue recogido.
Las actividades de la lipoxigenasa del sobrenadante fueron determinadas espectrofotométricamente tal y como se describió anteriormente.
Los transformantes positivos expusieron aproximadamente 100,000U/ml de caldo de cultivo mientras que la BECh2 de A. oryzae no transformada no expuso ninguna actividad. El sobrenadante de cultivo también fue expuesto a un análisis de SDS-PAGE. Unos transformantes positivos expusieron una banda continua de 80-100 kDa que indicaba que la proteína era glicosilada en exceso. La BECh2 de A. oryzae no transformada no expuso ninguna banda significante.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Ejemplo 3 Especificidad de sustrato de lipoxigenasa
Unos parámetros cinéticos para varios sustratos fueron determinados por métodos estándar para la lipoxigenasa de M. salvinii.
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2 
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En forma de comparación, un sustrato también fue probado con lipoxigenasa de soja.
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3 
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Ejemplo 3 Dependencia de pH de actividad de la lipoxigenasa
La actividad relativa de la lipoxigenasa M. salvinii en diferentes valores de pH fue determinada por el ensayo FOX descrito anteriormente, usando los tampones siguientes: 50 mM de ácido cítrico/citrato de sodio (pH 2,21-3,73), KH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (pH 5,30, 6,17), Tris/HCl (pH 7,01,8,02), NaCl/NaOH de glicilglicina (pH 9,33-11,0).
4 
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Ejemplo 4 Dependencia de temperatura de la actividad de la lipoxigenasa
El efecto de temperatura en la lipoxigenasa M. salvinii fue estudiado por incubación de 10 minutos a pH 7.0.
5 
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Ejemplo 5 Efecto blanqueador de las lipoxigenasas
Se examinó el efecto blanqueador de M. salvinii LOX. La soja L1 fue incluida para realizar una comparación. El \beta-caroteno y la astaxantina fueron usados como pigmentos.
6 
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7
Los resultados muestran que la LOX de M. salvinii blanquea las soluciones de pigmento. La LOX de soja expone un pequeño efecto de blanqueamiento.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
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<110> Novozymes A/S
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<120> Lipoxigenasa
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<130> 10148-WO
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<160> 4
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<170> Versión de patente 3.1
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<210> 1
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<211> 1973
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<212> ADN
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<213> Magnaporthe saivinii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(381)
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<223>
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<220>
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<221> péptido maduro
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<222> (52)..()
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<223>
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<220>
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<221> CDS
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<222> (501)..(1970)
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<223>
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<400> 1
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8
9
10 
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<210> 2
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<211> 617
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<212> PRT
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<213> Magnaporte salvinii 
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<400> 2
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11
12
13 
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<210> 3
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> Característica de mezcla
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<223> Artificial
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<220>
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<221> Característica de mezcla
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<223> Cebador 3
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcca tgcgcatcgg actcttggc 
\hfill
29 
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<210> 4
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> Característica de mezcla
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<223> Artificial
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<220>
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<221> Característica de mezcla
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<223> Cebador 4
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccgctcgag ctagatgctc aggaaaaacg g 
\hfill
31

Claims (15)

1. Una 9-lipoxigenasa que es:
a)
un polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139,
b)
un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos como péptido maduro mostrada en la SEC ID NO:1,
c)
un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que:
i)
tiene al menos 85% homología con dicho polipéptido,
ii)
es una variante alélica de dicho polipéptido, o
d)
un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con una cadena complementaria de
i)
la secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositada como DSM 14139 o
ii)
la secuencia de ADN de SEC ID NO:1 codificante del polipéptido maduro.
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2. Lipoxigenasa según la reivindicación 1 que es derivada de un hongo filamentoso, por ejemplo un Ascomycota, tal como una cepa de Magnaporthe, particularmente M. salvinii.
3. Lipoxigenasa según la reivindicación 1 o 2, que tiene al menos 90% de homología, preferiblemente al menos 95% de homología, con el péptido maduro expuesto en la SEC ID NO:1 o con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139.
4. ADN comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Polinucleótido que comprende:
a)
la secuencia de ADN parcial codificante de una lipoxigenasa madura clonada en un plásmido presente en Escherichia coli DSM 14139,
b)
la secuencia de ADN parcial codificante de una lipoxigenasa madura expuesta en la SEC ID NO:1,
c)
un análogo de la secuencia definida en a) o b) que codifica una lipoxigenasa y
i)
tiene al menos 85% de homología con dicha secuencia de ADN, o
ii)
se hibridiza en una astringencia alta con una cadena complementaria de dicha secuencia de ADN,
iii)
es una variante alélica de la misma, o
d)
una cadena complementaria de a), b) o c).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Constructo de ácido nucleico comprendiendo la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4 o 5 enlazado operativamente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la lipoxigenasa en un huésped de expresión adecuado.
7. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, un promotor, y señales de parada transcripcionales y translacionales.
8. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.
9. Método para la producción de una lipoxigenasa comprendiendo el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones que llevan a la producción de la lipoxigenasa, y la recuperación de la lipoxigenasa.
\newpage
10. Método de preparación de una masa o de un producto horneado hecho a partir de una masa, comprendiendo la adición de la lipoxigenasa a la masa según cualquiera de reivindicaciones 1-3.
11. Composición de la masa comprendiendo la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
12. Composición detergente comprendiendo un agente tensioactivo y la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
13. Composición detergente de la reivindicación anterior donde el agente tensioactivo es aniónico.
14. Proceso para la oxidación de un ácido graso poliinsaturado comprendiendo la puesta en contacto del ácido con la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en presencia del aire.
15. Uso del proceso de la reivindicación anterior para la síntesis de aromas con un toque verde o síntesis de hormonas vegetales.
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