ES2339366T3

ES2339366T3 - Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.

Info

Publication number: ES2339366T3
Application number: ES05806365T
Authority: ES
Inventors: Luis Alvarez Vallina; Victor Javier Sanchez-Arevalo Lobo; Angel Cuesta Martinez; Laura Sanz Alcober; Juan VARGAS NUÑEZ; Marta Compte Grau
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2025-10-31
Also published as: EP1814993A1; ES2325344A1; ES2325344B1; CN101065486A; JP2008527974A; ATE454454T1; US20070253952A1; EP1814993B1; PT1814993E; AU2005300737B2; BRPI0517928A; CN101065486B; AU2005300737A1; DE602005018812D1; WO2006048252A1; RU2398878C2; RU2007120521A; CA2585282A1

Abstract

Una proteína oligomérica que comprende 2, 3, ó 4 proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión comprende: c) un polipéptido (A'') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y d) un polipéptido (B'') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibi- dor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicho péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis.

Description

Inhibidores de angiogénesis multifuncionales y multivalentes.

Campo de la invención

La invención se relaciona con proteínas de fusión útiles como inhibidores de angiogénesis multifuncionales y multivalentes que comprenden un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis y un polipéptido que comprende un dominio de oligomerización y una región funcionalmente activa, inhibidora o moduladora del proceso de angiogénesis, separados por una región sensible a proteinasas. La invención también se refiere a las construcciones génicas y vectores útiles para la producción de dichas proteínas de fusión.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es el proceso biológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes en un órgano o tejido. La angiogénesis comienza con la descomposición de la membrana basal debido a la acción de las proteinasas secretadas por las células endoteliales, continúa con la migración y proliferación de dichas células endoteliales, para finalizar con la formación del lumen, la membrana basal y el envolvimiento con células periféricas.

En condiciones fisiológicas normales en un adulto sano, no hay angiogénesis con la excepción de los fenómenos asociados con el ciclo menstrual femenino y la cicatrización de heridas. Sin embargo, un desequilibrio en el proceso de la angiogénesis contribuye al desarrollo de desórdenes patológicos, tales como la artritis reumática, retinopatía diabética, psoriasis, bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados, hemorragias y neovascularización ocular (uno de los casos más frecuentes de ceguera), la retinopatía diabética, la retinopatía del prematuro, la degeneración macular, el glaucoma neovascular, la oclusión de las venas de la retina, la oclusión arterial de la retina, el pterigium, la rubeosis, la neovasculatura corneal, los tumores sólidos, la hemangioma y la proliferación y metástasis de los tumores, entre otros.

La angiogénesis juega, además, un papel importante en el crecimiento progresivo y dispersión metastásica de los tumores. Un tumor tiene que estimular continuamente el desarrollo de nuevos capilares para poder crecer. Los nuevos vasos generados en el tumor proporcionan a las células malignas una vía por donde pueden entrar en la circulación y establecer metástasis en lugares distantes. Si esta actividad angiogénica pudiera reprimirse o eliminarse, entonces el tumor, aunque presente, no podría desarrollarse.

Por este motivo, diversos grupos de investigadores están trabajando en la búsqueda de compuestos que ejerzan una acción inhibitoria de la angiogénesis (inhibidores de la angiogénesis o agentes antiangiogénicos) útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el desarrollo de angiogénesis.

En relación con los tumores, se acepta que los tumores no pueden crecer o metastatizar a otro órgano sin la génesis de nuevos vasos sanguíneos, constituyendo el cambio ("switch") angiogénico un acontecimiento temprano en la progresión tumoral. Se han descrito diversas estrategias anti-angiogénicas que interfieren en diferentes niveles de la vía angiogénica: bloqueando la actividad del factor de crecimiento; inhibiendo las proteinasas de la matriz extracelular (MEC); dirigiéndose directamente a las células endoteliales (CE); regulando por exceso los inhibidores endógenos, etc. Los inhibidores endógenos de la angiogénesis han recibido una especial atención en la terapia del cáncer, dado que parece que son agentes no tóxicos y no inmunogénicos. Se han identificado, al menos, 10 inhibidores angiogénicos endógenos [O'Reilly, M.S. et al., Cell, 88: 277-285, 1997], de los cuales, los que mejor se conocen son la angiostatina y la endostatina.

Las endostatinas (ES) son inhibidores de la migración de células endoteliales y de la angiogénesis y se ha demostrado que reducen el crecimiento tumoral en modelos animales. Los mecanismos implicados en dichos efectos no están claro, aunque se ha propuesto que está implicada la unión a los receptores de la superficie celular (integrinas y heparán sulfatos, VEGFR-2), las metaloproteinasas y los componentes de la MEC. Las ES derivan del dominio NC1 de los colágenos XV y XVIII, de donde se liberan proteolíticamente en forma trimérica y además se convierten en endostatinas monoméricas de aproximadamente 20 kDa. En el extremo N-terminal de NC1, hay un dominio de trimerización de aproximadamente 60 residuos conectado con el módulo de ES de 180 residuos aproximadamente mediante una región bisagra flexible que contiene diversos sitios sensibles a proteinasa que liberan endostatina después de la escisión proteolítica.

Boehm et al. [Nature, 390:404 (1997)] describen el empleo, como modelo experimental, de ratones a los que se les habían implantado diversos tumores (carcinoma pulmonar de Lewis, fibrosarcoma y melanoma). En los ratones no tratados con ES, dichos tumores crecieron rápidamente, provocando la muerte del animal. En cambio, los ratones tratados con ES después del desarrollo de tumores, se observó una reducción del volumen tumoral hasta alcanzar un tamaño casi microscópico. El tratamiento cíclico con ES de ratones portadores de tumor produjo una regresión completa de los tumores en modelos animales. Sin embargo, ensayos clínicos que se están llevando a cabo con ES no han reportado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observado regresión tumoral. Desgraciadamente, este no es un ejemplo aislado y otros ensayos clínicos que incluyen diferentes moléculas anti-angiogénicas también son decepcionantes, a pesar de lo notables que fueron los efectos antitumorales en los modelos animales. En este contexto, parece lógico combinar varios inhibidores de la angiogénesis para el tratamiento de cánceres humanos. Alternativamente, la actividad biológica potenciada (ES + angiostatina) y la acción dirigida hacia el tumor [ES + RGD (arginina-glicina-ácido aspártico)] pueden mejorar potencialmente la inhibición del crecimiento tumoral.

Por otra parte, se ha demostrado el potencial terapéutico de un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo anti-laminina (L36) con actividad anti-angiogénica tanto in vivo como in vitro. Los resultados pusieron de manifiesto que la alteración del potencial morfogenético de las matrices asociadas a las células es una forma eficaz de impedir in vivo la formación de vasos sanguíneos asociada al tumor.

A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, sigue existiendo la necesidad de desarrollar compuestos inhibidores de la angiogénesis útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el desarrollo de angiogénesis.

Compendio de la invención

La invención se enfrenta con el problema de proporcionar compuestos con actividad antiangiogénica potencialmente útiles como agentes terapéuticos para la prevención y/o el tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis, por ejemplo, psoriasis, artritis reumática, retinopatías, cáncer, etc.

La solución proporcionada por esta invención se basa en unas proteínas de fusión, potencialmente útiles como inhibidores de angiogénesis multifuncionales y multivalentes, que comprenden un (a) polipéptido que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis y (b) un polipéptido que comprende un dominio de oligomerización y una región funcionalmente activa, inhibidora o moduladora del proceso de angiogénesis, separados por una región sensible a proteinasas.

La invención se ilustra mediante la construcción de varias quimeras proteicas. Una de las proteínas de fusión (véase el Ejemplo) comprende el fragmento Fv de cadena única del anticuerpo (scFv) monoclonal L36 anti-laminina y el dominio NC1 de colágeno XVIII que comprende un dominio de trimerización y un dominio de endostatina (ES) unidos por un péptido bisagra que contiene sitios sensibles a proteinasas que liberan ES monomérica tras la escisión proteolítica. Los niveles de proteinasas están aumentados en el microentorno tumoral, por lo que dicha proteína de fusión libera in situ tanto monómeros de ES como trímeros de scFv. Dicha proteína de fusión fue secretada por las células humanas genéticamente modificadas en una forma funcionalmente activa. La forma intacta tiene una masa molecular de 210 kDa aproximadamente, lo que indica que, en condiciones fisiológicas, subunidades individuales se asocian de manera no covalente para producir una estructura trimérica. Dicha proteína de fusión trimérica inhibió de manera considerable la capacidad de las células endoteliales para migrar en respuesta a factores de crecimiento y para desarrollarse en túbulos tipo capilares cuando crecían sobre sustratos de Matrigel. Asimismo, dicha proteína de fusión se trató con varias proteinasas distintas. Los datos muestran que la catepsina L, la elastasa pancreática y diversas metaloproteinasas de la matriz (MMP) generan tanto monómeros tipo ES como fragmento de anticuerpo (scFv) trimérico. Además, las proteínas de fusión se procesaron correctamente cuando fueron producidas por células tumorales productoras MMP genéticamente modificadas, pero no cuando fueron producidas por células genéticamente modificadas, que no producían MMPs. Estos resultados abren la vía para una nueva estrategia de terapia génica contra el cáncer utilizando ese tipo de proteínas de fusión, las cuales forman parte de una nueva generación de inhibidores de la angiogénesis útiles como agentes terapéuticos para tratar enfermedades asociadas a desequilibrios en dicha angiogénesis.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende, operativamente unidas, al menos una secuencia de ácido nucleico (A), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y una secuencia de ácido nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico (B).

En otro aspecto, la invención se relaciona con un cassette de expresión que comprende dicha construcción génica, operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector recombinante que comprende dicha construcción génica o dicho cassette de expresión.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende dicha construcción génica, o dicho cassette de expresión, o dicho vector recombinante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en dicha construcción génica. Dicha proteína de fusión, típicamente, comprende un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende bien dicha proteína de fusión junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable, o bien un vector que comprende una construcción génica de la invención, o un cassette de expresión de la invención, y, opcionalmente, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha proteína de fusión, o de dicha construcción génica o de dicho cassette de expresión o de dicho vector recombinante, en la elaboración de una composición farmacéutica para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de angiogénesis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha proteína de fusión, o de dicha construcción génica o de dicho cassette de expresión o de dicho vector recombinante, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de patologías que cursan con angiogénesis.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación cartográfica en donde se muestra el efecto sobre la morfogénesis capilar del tratamiento individual y combinado con diferentes concentraciones de un anticuerpo monoclonal recombinante con formato scFv (L36) [fragmento Fv de cadena única del anticuerpo monoclonal anti-laminina L36] y de una proteína de fusión dimérica Fc-ES (proteína de fusión entre el dominio ES y el fragmento Fc de una inmunoglobulina).

La Figura 2 ilustra la producción de una proteína de fusión proporcionada por esta invención y su procesamiento proteolítico. La Figura 2A muestra esquemáticamente el gen \alpha1 (colágeno XVIII) y la secuencia codificante del dominio NC1. La Figura 2B muestra esquemáticamente dicho dominio NC1 que comprende un péptido conector, el dominio de trimerización, el péptido bisagra y el dominio de ES. La Figura 2C muestra esquemáticamente una quimera o proteína de fusión formado por un anticuerpo monoclonal recombinante con formato scFv y el dominio NC1 de colágeno XVIII (L36). La Figura 2D muestra el resultado del procesamiento proteolítico de dicha proteína de fusión observándose la formación de un anticuerpo trimérico y ES monomérica.

La Figura 3A muestra esquemáticamente la estructura génica de un anticuerpo en formato scFv y diversas construcciones génicas que contienen (o no) la secuencia codificante del dominio de la ES. La Figura 3B muestra los resultados de un análisis por western blot de las proteínas de fusión purificadas; la inmunotransferencia se reveló con un anticuerpo monoclonal (AcM) anti-myc y/o con un AcM anti-ES [carril 1: L36 scFv, carril 2: L36 scFv-NC1^{ES-}, carril 3: L36 scFv-NC1^{ES+}, carril 4: NC1 y carril 5: ES].

La Figura 4A muestra un gradiente de equilibrio de sedimentación del dominio scFv-NC1^{ES-} (1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) a 11.000 rpm y 20ºC. Los círculos abiertos representan datos, las tres líneas sólidas representan los gradientes teóricos de un monómero (37.148 Da), un dímero (74.296 Da) y un trímero (111.444 Da) de scFv. En el recuadro superior de dicha Figura 4A, se muestra la distribución de la velocidad de sedimentación de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} (1 mg/ml en tampón PBS) a 42.000 rpm y 20ºC. La Figura 4B es una gráfica que muestra la afinidad de unión a laminina inmovilizada en un soporte plástico [mayor en el caso de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} (trimérica) que en el caso de L36 scFv (monomérico)]. La Figura 4C es una gráfica que muestra la modulación dependiente de dosis de la diferenciación de células endoteliales (en respuesta a diferentes concentraciones de scFv o de L36 scFv-NC1^{ES-}) en un ensayo habitual en Matrigel. Cada punto representa la media de dos pocillos más menos la desviación estándar. La Figura 4D muestra los resultados de someter a la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} a la acción de diversas proteinasas (MMPs, elastasa pancreática porcina y catepsina L).

La Figura 5 muestra la distribución de la velocidad de sedimentación de L36 scFv-NC1^{ES+} (Figura 5A) y de NC1 (Figura 5B). La Figura 5C muestra las curvas de saturación obtenidas con las concentraciones indicadas de L36 scFv-NC1^{ES+} y NC1. La Figura 5D es una gráfica que representa la modulación dependiente de dosis de la diferenciación de células endoteliales (en respuesta a diferentes concentraciones de L36 scFv, L36 scFv-NC1^{ES+}, NC1 o Fc-ES) en un ensayo habitual en Matrigel. Cada punto representa la media de dos pocillos más menos la desviación estándar. La Figura 5E es un diagrama de barras que muestra la modulación en un ensayo de migración de células endoteliales HUVEC mediante L36 scFv (L36), NC1, L36 scFv-NC1^{ES+} o Fc-ES (ES) [como control se utilizó PBS].

La Figura 6A muestra el resultado del tratamiento de L36 scFv-NC1^{ES+} condiferentes proteinasas (MMPs, elastasa pancreática porcina y catepsina L), mientras que la Figura 6B muestra los resultados del mismo tratamiento para NC1. Las proteínas purificadas se incubaron durante los tiempos indicados con las distintas proteinasas tal como se menciona en el Ejemplo (véase el apartado de Material y Métodos) y las mezclas de reacción fueron analizadas mediante SDS-PAGE (Figura 6C) o mediante western blot con un AcM anti-endostatina. Las distancias de migración de los marcadores de peso molecular y NC1 están indicadas en la izquierda de dichas figuras. Las puntas de flecha vacías en las Figuras 6A y 6B indican los productos proteolíticos.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica, en adelante construcción génica de la invención, que comprende, operativamente unidas, al menos:

a): una primera secuencia de ácido nucleico (A), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y

b): una segunda secuencia de ácido nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis,

en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico (B).

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La secuencia de ácido nucleico (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis. Ejemplos ilustrativos de moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis incluyen proteínas de la matriz extracelular (MEC), factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Entre las proteínas de la MEC se encuentran el colágeno, los proteoglicanos, la fibronectina, la laminina, la tenascina, la entactina y la trombospondina. En una realización particular, dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es una laminina, tal como una laminina de mamífero, por ejemplo, una laminina de rata, ratón o ser humano. Entre los factores angiogénicos se encuentra la familia de los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF, vascular endotelial growth factor), etc. Asimismo, entre los receptores de membrana celular implicados en la angiogénesis se pueden citar los receptores de dichos factores angiogénicos, por ejemplo, el receptor 2 de VEFG (VEFGR-2), integrinas, etc.

Prácticamente cualquier polipéptido que comprenda una región que reconozca y bloquee una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis puede ser utilizado en esta invención, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal, que reconozca una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, o un fragmento recombinante del mismo que contenga la región que reconoce a dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis, por ejemplo, en su formato recombinante de cadena única (fragmento Fv de cadena única o scFv), bifuncional (diabody), completo (Fab + Fc), etc.; no obstante, en una realización particular, la secuencia de ácido nucleico (A) codifica un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) recombinante derivado del AcM L36 anti-laminina (Ejemplo 1) que contiene la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal L36 fusionada, a través de un linker, tal como un péptido que comprende la secuencia G_{4}S, a la región variable de la cadena ligera (VL) del AcM L36 (Figura 2C), y cuya secuencia ha sido descrita por Sanz L et al. [Cancer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557-65], en donde el extremo 3' de la secuencia codificante de VL está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de dicho linker y el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos codificante de dicho linker está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de
VL.

El AcM L36 reconoce lamininas de diferentes especies de animales, por ejemplo, de ratón, rata, humanos, etc., ya que interacciona con una región que está muy conservada entre diferentes especies de animales [Sanz L et al. EMBO J 2003, Vol. 22(7):1508-1517].

Debido a sus propiedades, dicho polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, tal como un anticuerpo, en cualquiera de sus formatos (scFv, bifuncional o completo) puede reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, y puede dirigir a un péptido antiangiogénico fusionado a dicho polipéptido hacia las moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis, por ejemplo, proteínas de la MEC, factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc., y bloquear regiones funcionalmente activas de dichas moléculas.

La secuencia de ácido nucleico (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización (i) y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis (ii).

El dominio de oligomerización es un dominio que permite la formación de oligómeros (e.g., dímeros, trímeros, tetrámeros, etc., de péptidos o proteínas). Para la puesta en práctica de la invención puede utilizarse virtualmente cualquier dominio de oligomerización, por ejemplo, un dominio de dimerización, trimerización, tetramerización, etc., presente en distintas proteínas, tanto de origen eucariótico como procariótico, susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligómero proteico de la proteína que lo comprende. En una realización particular, dicho dominio de oligomerización es un dominio de trimerización, tal como el dominio de trimerización del dominio NC1 de colágeno XVIII o del colágeno XV.

La región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis comprende cualquier péptido o proteína funcionalmente activo en el proceso de angiogénesis, tal como un péptido o proteína inhibidor o modulador del proceso de angiogénesis. Prácticamente cualquier péptido o proteína funcionalmente activo en el proceso de angiogénesis puede ser utilizado en la presente invención; no obstante, en una realización particular, dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis comprende una endostatina (ES) de mamífero, tal como la ES presente en el dominio NC1 de colágeno XV o de colágeno XVIII.

La región sensible a proteinasas está situada entre dicho dominio de oligomerización (i) y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis (ii), y comprende una secuencia peptídica susceptible a la acción de proteinasas. Aunque podría utilizarse en la invención cualquier secuencia peptídica susceptible a la acción de cualquier proteinasa, en la práctica resulta ventajoso que dicha proteinasa sea una proteinasa que solo se expresa en el entorno tumoral con lo que la proteína de fusión de la invención será "procesada" originando monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos en el proceso de angiogénesis y moléculas triméricas de polipéptido capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis. Por tanto, en una realización particular, dicha región sensible a proteinasas comprende la región bisagra presente en el dominio NC1 de colágeno XV ó XVIII de mamífero, entre el dominio de trimerización y el dominio o región de la ES de dicho dominio NC1, ya que dicha región es sensible a la acción de proteinasas que solo se expresan en el entorno tumoral.

Por tanto, en una realización particular y preferida, la secuencia de ácido nucleico (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero o para el dominio NC1 del colágeno XV de mamífero. Como es conocido, dicho dominio NC1 del colágeno XVIII (y del colágeno XV) comprende un dominio de trimerización y un dominio de ES unidos por un péptido bisagra (Figura 2B). Las secuencias de dichos dominios NC1 de colágeno XV y XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio NC1 del colágeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56]. En el Ejemplo 1 se describe la obtención de la secuencia de nucleótidos que comprende la región que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de ratón.

Cualquier otro dominio similar al dominio NC1 de colágeno XVIII que comprenda (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, ventajosamente, una región sensible a proteinasas que se expresan en el entorno tumoral, puede ser utilizada en la puesta en práctica de la presente invención.

En general, la secuencia de ácido nucleico (A) no se fusiona directamente a la secuencia de ácido nucleico (B) sino que resulta ventajoso introducir un péptido de unión flexible (o péptido espaciador) entre los polipéptidos codificados por dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B). Por tanto, si se desea, la construcción génica de la invención también puede contener, además, una tercera secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de unión flexible situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). Ventajosamente, dicho péptido espaciador (C) es un péptido con flexibilidad estructural. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de restos de Gly y Ser o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada. Prácticamente cualquier secuencia peptídica que defina un péptido de unión flexible puede ser utilizada en la presente invención. Ejemplos ilustrativos de péptidos de unión flexibles incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly (GSPG) o la secuencia (Gly-Ser)_{4}. No obstante, en una realización particular, dicho péptido de unión flexible comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Por tanto, en una realización particular, la construcción génica de la invención comprende, además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B) una tercera secuencia de ácido nucleico (C) que comprende la secuencia de nucleótidos
que codifica el péptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.

Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificación de la proteína de fusión obtenida mediante la presente invención, la construcción génica de la invención puede contener, si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación de la proteína de fusión. Por tanto, en una realización particular, la construcción génica de la invención incluye, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (D) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación, conocido como péptido etiqueta o tag. Dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada en cualquier posición que no altere la funcionalidad de ninguno de los polipéptidos expresados por dichas secuencias de ácidos nucleicos (A) y (B). A modo ilustrativo, dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada aguas abajo del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación de la proteína de fusión puede ser utilizado, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptídicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos que pueden servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, tales como péptidos etiqueta, etc., por ejemplo, epítopos derivados de de la hemaglutinina del virus de la gripe o epítopo C-myc, etc.

La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. Dicha construcción génica de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico (A) y (B), constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico (A) y (B), y, en su caso (C), son expresados en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un cassette de expresión que comprende la construcción génica de la invención operativamente unida a una secuencia de control de expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión proporcionada por esta invención que comprende (a) un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, y (b) un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de dicha proteína de fusión, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamífero, etc. Ejemplos ilustrativos de promotores que pueden estar presentes en el cassette de expresión proporcionado por esta invención incluyen el promotor de citomegalovirus humano (hCMV), etc.

Ventajosamente, dicho cassette de expresión comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicho cassette de expresión. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en el cassette de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas transformadas genéticamente.

La construcción génica de la invención, o el cassette de expresión proporcionado por esta invención, pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha construcción de génica de la invención o dicho cassette de expresión. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ácido nucleico puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar células animales.

Dicho vector puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora transformada, transfectada o infectada con un vector proporcionado por esta invención. Dicha célula transformada, transfectada o infectada comprende, por tanto, una construcción génica de la invención, o bien dicho cassette de expresión o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal transformada, transfectada o infectada con un vector apropiado, siendo dicha célula animal transformada, transfectada o infectada capaz de expresar la proteína de fusión proporcionada por esta invención, por lo que dichos vectores pueden utilizarse para la expresión en células animales de la proteína de fusión proporcionada por esta invención.

La construcción génica de la invención puede ser utilizada para producir proteínas de fusión que comprenden (a) un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y (b) un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir dicha proteína de fusión proporcionada por esta invención que comprende crecer una célula u organismo proporcionado por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína de fusión. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula u organismo dependerán de la célula u organismo utilizado. Si se desea, el método para producir un producto de interés proporcionado por esta invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicha proteína de fusión.

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En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenida por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en la construcción génica de la invención. De modo más concreto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende:

(a): un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y

(b): un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis.

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Ejemplos ilustrativos de moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis incluyen proteínas de la MEC, factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Entre las proteínas de la MEC se encuentran el colágeno, los proteoglicanos, la fibronectina, la laminina, la tenasina, la entactina y la trombospondina. En una realización particular, dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es una laminina, tal como una laminina de mamífero, por ejemplo, una laminina de rata, ratón o ser humano.

Prácticamente cualquier polipéptido que comprenda una región que reconozca y bloquee una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis puede ser utilizado en esta invención, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que reconoce una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, o un fragmento recombinante del mismo que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis, por ejemplo, un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un anticuerpo biespecífico o diabody que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis o bien en su formato recombinante completo (Fab + Fc); no obstante, en una realización particular, dicho polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis es un scFv recombinante derivado del AcM L36 anti-laminina (Ejemplo 1) que contiene la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal L36 fusionada, a través de un linker, tal como un péptido que comprende la secuencia G_{4}S, a la región variable de la cadena ligera (VL) del AcM L36 (Figura 2C), y cuya secuencia ha sido descrita por Sanz L et al. [Cancer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557-65], en donde el extremo 3' de la secuencia codificante de VL está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de dicho linker y el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos codificante de dicho linker está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de VL. Como es conocido, el AcM L36 reconoce lamininas de diferentes especies de animales, por ejemplo, de ratón, rata, humanos, etc., ya que interacciona con una región que está muy conservada entre diferentes especies de animales [Sanz L et al. EMBO J 2003, Vol. 22(7):1508-1517].

Dicho polipéptido (A') puede reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, y puede dirigir a un péptido anti-angiogénico fusionado a dicho polipéptido hacia las moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis, por ejemplo, proteínas de la MEC, factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc., y bloquear regiones funcionalmente activas de dichas moléculas.

El polipéptido (B') comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis. Como se ha mencionado previamente, dicho dominio de oligomerización puede ser prácticamente cualquier dominio que permite la formación de oligómeros, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc., de péptidos o proteínas, susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligómero proteico de la proteína que lo comprende. No obstante, en una realización particular, dicho dominio de oligomerización es un dominio de trimerización, tal como el dominio de trimerización del dominio NC1 de colágeno XVIII o del colágeno XV de mamífero.

La región sensible a proteinasas está situada entre dicho dominio de oligomerización (i) y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis (ii), y comprende una secuencia peptídica susceptible a la acción de proteinasas. Aunque prácticamente cualquier secuencia peptídica susceptible a la acción de cualquier proteinasa puede ser utilizada en la presente invención, ventajosamente, dicha proteinasa será una proteinasa que solo se expresa en el entorno tumoral con lo que la proteína de fusión de la invención será "procesada" originando monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos en el proceso de angiogénesis (e.g., ES) y moléculas triméricas de polipéptido capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis (e.g., scFv). Por tanto, en una realización particular, dicha región sensible a proteinasas comprende la región bisagra presente en el dominio NC1 de colágeno XV ó XVIII de mamífero, entre el dominio de trimerización y el dominio o región de la ES de dicho dominio NC1, ya que dicha región es sensible a la acción de proteinasas que solo se expresan en el entorno tumoral.

Como es conocido, dicho dominio NC1 del colágeno XVIII (y del colágeno XV) comprende un dominio de trimerización y un dominio de ES unidos por unos péptidos bisagra (Figura 2B). Por tanto, en una realización particular, la proteína de fusión de la invención comprende un polipéptido (B') que comprende el dominio NC1 del colágeno XV o el dominio NC1 del colágeno XVIII que contiene los dominios de trimerización y ES de dichos dominios NC1 unidos a través de los péptidos bisagra de dichos dominios NC1. Las secuencias de dichos dominios NC1 de colágeno XV y de colágeno XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio NC1 del colágeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56].

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Por tanto, a modo ilustrativo, en una realización particular, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende:

(i): un polipéptido seleccionado del grupo formado por el AcM L36 completo, el AcM L36 en formato bifuncional y un scFv recombinante que contiene la región variable de la cadena pesada (VH) del AcM L36 fusionada, a través de un péptido flexible, a la región variable de la cadena ligera (VL) del AcM L36; y

(ii): un polipéptido (B') que comprende el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero.

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No obstante, cualquier otro dominio similar al dominio NC1 de colágeno XVIII que comprenda (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, ventajosamente, una región sensible a proteinasas que se expresan en el entorno tumoral, puede ser utilizada en la puesta en práctica de la presente invención, con el fin de obtener inhibidores de la angiogénesis multivalentes y multifuncionales.

La proteína de fusión proporcionada por esta invención puede contener, además, si se desea, un tercer polipéptido (C') que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de unión flexible entre dichos polipéptidos (A') y (B') y/o (b) un péptido (D') para facilitar el aislamiento o purificación de la proteína de fusión.

Como se ha mencionado previamente, dicho polipéptido (C') puede comprender prácticamente cualquier secuencia peptídica que defina un péptido de unión flexible. Ejemplos ilustrativos de péptidos de unión flexibles incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly o la secuencia (Gly-Ser)_{4}. No obstante, en una realización particular, dicho péptido de unión flexible comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.

Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificación de la proteína de fusión de la invención, dicha proteína de fusión puede contener, si se desea, un péptido (D') susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación de la proteína de fusión, tal como un péptido etiqueta o tag. Dicho péptido (D') puede estar situado en cualquier posición de la proteína de fusión que no altere la funcionalidad de ninguno de los polipéptidos (A') y (B'), por ejemplo, dicho péptido (D') puede estar situado a continuación del polipéptido (B'). Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación de la proteína de fusión puede ser utilizado, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptídicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos que pueden servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, tales como péptidos etiqueta, etc., por ejemplo, epítopos derivados de de la hemaglutinina del virus de la gripe o epítopo C-myc, etc.

La proteína de fusión proporcionada por esta invención comprende un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis. Como consecuencia de esta fusión y debido a la acción de determinadas proteinasas que solo se expresan en el entorno tumoral la proteína de fusión es "procesada" originando monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos en el proceso de angiogénesis (e.g., ES) y moléculas triméricas de polipéptido capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis (e.g., scFv). De este modo, la invención proporciona unos compuestos inhibidores de la angiogénesis multivalentes y multifuncionales ya que se ataca al proceso de la angiogénesis por diferentes vías y de forma conjunta.

Consecuentemente, la proteína de fusión de la invención, debido a sus características propias, puede ser utilizada en el tratamiento y/o prevención de desarrollo de procesos de angiogénesis y, por tanto, en el tratamiento y/o prevención de patologías que cursan con procesos de angiogénesis.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende bien una proteína de fusión proporcionada por esta invención junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable, o bien un vector que comprende una construcción génica de la invención, o un cassette de expresión de la invención, y, opcionalmente, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, una proteína de fusión proporcionada por esta invención en una cantidad terapéuticamente eficaz. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de proteína de fusión de invención calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de proteína de fusión y el efecto terapéutico a conseguir.

En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, proporcionado por esta invención que comprende una construcción génica de la invención o un cassette de expresión de la invención. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen la construcción génica de la invención o dicho cassette de expresión pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado.

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral o parenteral. Los excipientes que pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.

Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una proteína de fusión proporcionada por esta invención, o de una construcción génica de la invención o de un cassette de expresión proporcionado por esta invención o de un vector recombinante proporcionado por esta invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de angiogénesis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una proteína de fusión proporcionada por esta invención, o de una construcción génica de la invención o de un cassette de expresión proporcionado por esta invención o de un vector recombinante proporcionado por esta invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de patologías que cursan con angiogénesis. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de patologías que cursan con angiogénesis incluyen cáncer, hemangioma, artritis reumática, psoriasis, bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados, hemorragias, neovascularización ocular (uno de los casos más frecuentes de ceguera), retinopatías (diabética, del prematuro, etc.), degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión de las venas de la retina, oclusión arterial de la retina, pterigium, rubeosis, o neovascularización corneal. En una realización particular, la proteína de fusión de la invención, la construcción génica de la invención, el cassette de expresión proporcionado por esta invención o el vector recombinante proporcionado por esta invención, es particularmente útil para el tratamiento del cáncer, incluyendo el tratamiento de tumores sólidos, la proliferación y metástasis de los tumores.

El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.

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Ejemplo 1 Diseño y expresión de un inhibidor de angiogénesis constituido por un fragmento de anticuerpo y oligómeros de colágeno XVIII

Se han generado diversas construcciones génicas (Figura 3A) capaces de expresar los siguientes productos:

- el fragmento Fv de cadena única (scFv) del anticuerpo monoclonal L36 anti-laminina (L36 scFv),

- la proteína de fusión identificada como L36 scFv-NC1^{ES-} compuesta por L36 scFv fusionado al dominio de trimerización presente en el dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a 60) a través de un péptido conector flexible (linker),

- la proteína de fusión identificada como L36 scFv-NC1^{ES+} compuesta por L36 scFv fusionado al dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a 325) a través de dicho linker,

- el dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a 315) (NC1), y

- la endostatina (ES) procedente del dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 130 a 315), que se libera proteolíticamente en forma trimérica y posteriormente se convierte en ES monomérica de aproximadamente 20 kDa (Figuras 2A y 2B).

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Con el fin de facilitar la inmunodetección de las proteínas, las construcciones génicas preparadas contenían, además, una secuencia codificante de una etiqueta (tag), en concreto, la secuencia codificante de his6myc, de manera que dicha etiqueta estaba unida al extremo C-terminal de las distintas proteínas.

Dichas construcciones génicas se clonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (hCMV) que contenía la secuencia señal de la oncostatina M humana [Sanz L et al Gene Therapy (2002) 15:1049]. Los vectores de expresión para ES (posiciones 130-315) y NC1 (1-315) de ratón se utilizaron como controles.

Dichas proteínas recombinantes fueron utilizadas en ensayos de formación de estructuras capilares en Matrigel así como en ensayos de migración celular con el fin de evaluar su potencial como agente antiangiogénico.

I. Materiales y métodos Células y condiciones de cultivo

En un medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con el 10% de suero bovino fetal (SBF) (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) se cultivaron células HEK-293 (epitelios de riñón humano; ATCC CRL-1573), células HT-1080 (fibrosarcoma humano; ATCC CCL-121) y células B16-F10 (melanoma de ratón; ATCC CRL-6475).

Las células endoteliales primarias de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) fueron cedidas por el Dr. B. Giménez (Instituto de Investigaciones Biomédicas, Madrid, España) y se cultivaron en medio F12K de Ham (Life Technologies) con 10% de SBF, 50 \mug/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS, del inglés "endothelial cell growth supplement") procedente de pituitaria bovina y 100 \mug/ml de heparina (Sigma Biosciences, St. Louis, MO, EE.UU.).

La línea celular endotelial microvascular humana HMEC-1 (Ades EW et al., 1992, Journal of Investigative Dermatology, 99:683-690) fue suministrada por el Dr. E. W. Ades (Center for Disease Control, Atlanta, GA, EE.UU.) y se cultivó en medio MCBD 131 (Life Technologies) enriquecido con el 10% de SBF, 10 ng/ml de EGF (factor de crecimiento epidérmico) y 1 mg/ml de hidrocortisona (Sigma Biosciences).

Construcción de los vectores de expresión

La secuencia del dominio NC1, conteniendo la región codificante del péptido conector, el dominio de trimerización, el péptido bisagra y el dominio de ES (Figura 2B), se amplificó, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir del clon mc3b de \alpha1 (colágeno XVIII) procedente de ratón [Oh et al. Genomics. 1994 Feb; 19(3):494-9] suministrado por el Dr. B. Olsen (Harvard Medical School, Boston, MA, EE.UU.), con el par de cebadores 1 y 2 (véase la Tabla 1, que contiene las secuencias de los diferentes iniciadores utilizados para la construcción de los vectores y la verificación posterior de las secuencias de los vectores).

TABLA 1 Secuencias de oligonucleótidos

1

El producto de la PCR se volvió a amplificar con el par de cebadores 2 y 3 (Tabla 1) y, el producto resultante de la PCR, escindido con NotI, se ligó al sitio NotI del plásmido pCR3.1-L36 [Sanz L et al Gene Therapy (2002) 15:1049], para obtener el plásmido pCR3.1-L36-NC1. La secuencia se comprobó usando los cebadores 4 y 5 (Tabla 1).

Para la generación de la construcción génica identificada como L36 scFv-NC1^{ES+} (Figura 3A) se reemplazó el "péptido conector" que conecta la triple hélice de colágeno con el dominio de trimerización de NC1, responsable de la liberación del dominio NC1 procedente del colágeno XVIII parental, por un "péptido conector flexible" ("linker flexible") Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser [LEGAGGSGGSSGSD
GASGS] (Figuras 2B y 2C), con el fin de evitar una posible escisión del dominio NC1 del extremo amino del L36 scFv dado que dicho "conector peptídico" es sensible a la acción de diferentes metaloproteinasas (MMPs). Para ello, un par de oligonucleótidos (cebadores 6 y 7) (Tabla 1) que contenía la secuencia codificante de dicho "péptido conector flexible" ("linker flexible") se ligó al sitio EcoRI-BglII de pCR3.1-L36-NC1, dando como resultado el plásmido pCR3.1-L36-linker-NC1.

El plásmido pCR3.1-NC1 se construyó eliminando el fragmento ClaI-BglII del plásmido pCR3.1-L36-conector-NC1 (que contiene todo el L36 scFv) e insertando un par de oligonucleótidos (cebadores 8 y 9) (Tabla 1) que contenían un sitio NruI.

Para construir el plásmido pCR3.1-ES, el módulo de la endostatina (ES) murina (residuos 130 a 315 del domino NC1) [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56] se amplificó a partir del plásmido pCR3.1-NC1 con el par de cebadores 2 y 10 (Tabla 1). El fragmento de PCR escindido por BglII/NotI se ligó en el plásmido pCR3.1-NC1 digerido por BglII/NotI. La secuencia se comprobó usando el cebador 4 (Tabla 1).

El dominio de trimerización presente en el dominio NC1 [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56] se amplificó a partir del plásmido pCR3.1-NC1 con los pares de cebadores 11 y 12 (Tabla 1). El fragmento de PCR digerido con NotI se ligó al plásmido pCR3.1-L36 digerido con NotI, para obtener el plásmido pCR3.1-L36-Trimer. La secuencia se comprobó usando el cebador 4 (Tabla 1).

Transfecciones celulares

Las células HEK-293, HT-1080 y B16-F10 se transfectaron con los vectores de expresión adecuados (pCR3.1, pCR3.1-L36, pCR3.1-L36-Trimer, pCR3.1-ES, pCR3.1-NC1 o pCR3.1-L36-linker-NC1) usando el sistema basado en la lipofectamina (Life Technologies). Para generar líneas celulares estables, las células transfectadas HEK-293, HT-1080 y B16-F10 se seleccionaron en DMEM con 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml ó 3 mg/ml de G-418 (Life Technologies). La proliferación de células tumorales parentales y transducidas por los distintos vectores se analizó diariamente durante 4 días consecutivos en ensayos con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazoilo (MTT, Promega). Los sobrenadantes de poblaciones celulares transfectadas transitorias y estables se analizaron para determinar la expresión proteica mediante SDS-PAGE [Sanz L et al. Gene Therapy (2002) 15:1049], ELISA [Sanz L. et al Gene Therapy (2002) 15:1049] y western blotting (inmunotransferencia) [Blanco et al. J. Immunol (2003) 171:1070] usando AcM (anticuerpos monoclonales) anti-myc (Life Technologies) o anti-endostatina (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EE.UU.).

Expresión y purificación de proteínas recombinantes

Se usaron células HEK-293 transfectadas estables para cultivar medios condicionados sin suero. Se añadió una combinación ("cocktail") de inhibidores de proteinasas (aprotinina, bestatina, leupeptina, pepstatina A y E-64) (Sigma Biosciences) al medio para reducir la proteolisis. El medio (aproximadamente 1 l) se concentró (x10) con un filtro Vivaflow 50 de 10.000 MWCO (Vivascience AG, Alemania), se dializó frente a PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,4 y se cargó sobre una columna HisTrap HP de 1 ml (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Las proteínas que contenían ES se purificaron adicionalmente sobre una columna HiTrap Heparin HP de 1 ml (Amersham Biosciences). La elución se realizó con un gradiente lineal de 0,1-2,0 de NaCl. Las proteínas purificadas se dializaron frente a PBS y se almacenaron a -20ºC. La proteína de fusión purificada Fc-dominio de ES (Fc-ES) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001 152:1233] fue suministrada por el Dr. K. Javaherian (Hospital Infantil de Boston "Children's Hospital Boston", Boston, MA, EE.UU.). Dicha proteína de fusión Fc-ES es una proteína de fusión (entre el dominio ES y el fragmento Fc de una inmunoglobulina) dimérica y bloquea la morfogénesis capilar.

Centrifugación analítica

Los experimentos de centrifugación se realizaron a 20ºC en una ultracentrífuga analítica Optima XL-A (Beckman-Coulter Inc.) equipada con óptica UV-visible, usando un rotor An50Ti,con ejes de sector doble de 3 mm decarbón vegetal de Epon. El equilibrio de sedimentación a baja velocidad se ensayó en una columna corta (23 \mul) a tres velocidades sucesivas (5.000, 6.000 y 11.000 rpm), y se tomaron imágenes del equilibrio (después de 20 h) a una longitud de onda de 280 nm. Se prestó atención a la conservación de la masa proteica en forma soluble durante el experimento. Los experimentos de control de velocidad de sedimentación no pusieron de manifiesto ninguna agregación en un intervalo de tiempo de 45 h. La señal de referencia se midió después de centrifugación a alta velocidad (5 h a 42.000 rpm). El peso molecular promedio en peso aparente de las células completas se obtuvo usando el programa EQASSOC [Minton, A. P. (1994) in Modern Analytical Ultracentrifugation (Schuster, T., and Laue, T., eds), pp. 81-93, Birkhauser Boston, Inc., Cambridge, MA]. El experimento de velocidad de sedimentación se llevó a cabo a 42.000 rpm y las imágenes de absorbancia se tomaron a 280 nm. Se calcularon los coeficientes de sedimentación mediante el modelo de la ecuación de Lamm de distribución continua c(s) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606-1619] tal como se implementa en el programa SEDFIT. Estos valores de sedimentación experimental se corrigieron para las condiciones habituales para obtener los valores s_{20,w} correspondientes usando el programa SEDNTERP [T.M. Laue, B.D. Shah, T.M. Ridgeway and S.L. Pelletier, Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins. In: S.E. Harding, A.J. Rowe and J.C. Horton, Editors, Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (1992), pp. 90-125]. Se realizó un análisis hidrodinámico adicional (es decir, cálculo de la razón de coeficiente friccional) con el programa SEDFIT para obtener la distribución c(M) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606-1619].

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Cromatografía de filtración en gel analítico

Estos experimentos se realizaron a temperatura ambiente con un sistema ÄKTA FPLC usando una columna Superdex 200 10/300GL. Se inyectaron en la columna muestras de 0,1 ml de las diferentes proteínas recombinantes (L36 scFv, L36 scFv-NC1^{ES-}, L36 scFv-NC1^{ES+} y NC1) en PBS a una concentración de 0,5-1,0 mg/ml y se separaron a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. La columna se calibró con marcadores de peso molecular alto y bajo (Amersham). Las razones de los volúmenes de elución con respecto al volumen de exclusión y los pesos moleculares de los marcadores se ajustaron a una curva exponencial, que se usó para calcular el peso molecular de las muestras.

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Proteinasas

Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) MMP-1 y MMP-9 humanas fueron adquiridas a Oncogene Research Products (San Diego, CA, EE.UU.), mientras que las MMPs MMP-3, MMP-8 y MMP-14 (MT1-MMP) humanas fueron adquiridas a Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). La catepsina L humana y la elastasa pancreática porcina fueron también adquiridas a Calbiochem.

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Procesamiento proteolítico

Las proteínas recombinantes L36 scFv-NC1^{ES-}, L36 scFv-NC1^{ES+} y NC1 se incubaron a una concentración de 0,6 \muM, a 37ºC durante 10 minutos con:

- catepsina L humana 10 nM en acetato de sodio 50 mM, pH 5,5, ditiotreitol (DTT) 2 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM (para el tratamiento con catepsina L humana);

- elastasa porcina 25 nM en acetato de sodio 50 mM, pH 6,0 (para el tratamiento con elastasa porcina); y

- metaloproteinasas 25 nM en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM, NaCl 150 mM, el 0,05% de Brij-35, ZnSO_{4} 50 \muM (para el tratamiento con las metaloproteinasas utilizadas).

A continuación, se sometieron alícuotas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% bajo condiciones reductoras en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Los geles se tiñeron con nitrato de plata (Sigma BioScience) o se sometieron a Western blot, usando un AcM anti-ES de ratón.

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Ensayo de formación de tubos en Matrigel

Para los ensayos de formación de estructura de tipo capilar (CLS, del inglés "capillary-like structure"), se preparó una matriz de membrana base de Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA, EE.UU.) en una placa Terasaki precongelada de 72 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), con 2 \mul/pocillo y después se dejó que solidificara a 37ºC durante 30 minutos. Se sembraron 3 x 10^{3} CEs (HMEC-1 o HUVEC) en 10 \mul de medio adecuado enriquecido con SBF al 0,5% sobre la matriz gelificada. El volumen total de medio en el pocillo se ajustó hasta 25 \mul al mismo tiempo que se preparaban las células, y se incubaron durante 16 horas a 37ºC en atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. El efecto inhibidor de formación de tubo de las proteínas recombinantes ensayadas (L36 scFv, L36 scFv-NC1^{ES-}, L36 scFv-NC1^{ES+}, NC1 y ES) se determinó mediante la adición de 15 \mul de proteína recombinante purificada, diluida en el medio adecuado en función de la línea celular empleada (HMEC-1 o HUVEC) a concentraciones diferentes (Figura 5D), a las placas recubiertas con Matrigel en el momento de plaquear las células. Los experimentos se realizaron por triplicado.

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Análisis de las imágenes digitales

Las imágenes digitales de cada pocillo se obtuvieron a partir de un microscopio Axiovert 100 (Carl Zeiss, Alemania), usando una cámara SPOT (Diagnostics Instruments, Inc.) y se almacenaron como archivos BMP de 328x256 píxeles y escala de grises de 8 bits. Las imágenes se trataron usando el nuevo software AD basado en Matlab 5.3 [Sanz, L. et al. Microvasc Res. 2002 May; 63(3):335].

Ensayo de migración celular

Para los estudios de migración de CEs, insertos de filtro de tereftalato de polietileno con un tamaño de poro de 3,0 \mum y un diámetro de 6,5 mm (Becton Dickinson) se recubrieron con Matrigel a una concentración de 1,25 \mug/ml en medio sin suero a 4ºC durante la noche. Las células HUVEC (1,5 x 10^{5}) se preincubaron en medio sin suero durante 30 minutos a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada en presencia de 20 \mug/ml de proteína purificada (L36 scFv, L36 scFv-NC1^{ES-}, ES, NC1 y L36 scFv-NC1^{ES+}) y después, se transfirieron al compartimento superior. Se añadieron 600 \mul de medio que contenía suero al compartimento inferior. Después de 16 horas, las células se fijaron con glutaraldehído al 1% en PBS, se tiñeron con cristal de violeta al 0,1% y se examinaron al microscopio.

II. Resultados Efecto combinado de endostatina y un scFv de un anticuerpo anti-laminina (L36) en el ensayo de formación de tubo endotelial

Se ha demostrado que la ES oligomérica modula la morfogenia dependiente de la matriz extracelular (MEC) de las células epiteliales (CE) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001 152:1233]. El tratamiento con ES dimérica, en forma de Fc-ES, en el momento de plaquear las células sobre Matrigel, inhibe significativamente el ensamblaje en estructuras tubulares, manteniendo las CE dispersas y mostrando una morfología que se parecía a la de las células sobre plástico. Estos cambios morfológicos son similares a los observados cuando los cultivos de CE se tratan con L36 scFv (Figura 1).

Diseño y expresión de proteínas de fusión L36 scFv-ES

La ES deriva del dominio NC1 del colágeno XVIII, que se libera proteolíticamente en forma trimérica y posteriormente se convierte en ES monomérica de aproximadamente 20 kDa (Figuras 2A y 2B). Se han construido diversos genes quiméricos que expresan distintas proteínas.

En una realización particular, se construyó el gen quimérico denominado L36 scFv-NC1^{ES+} compuesto por el scFv del AcM anti-laminina L36 fusionado al dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a 315) (Figuras 2C y 3A). En el extremo N-terminal de NC1 del colágeno XVIII hay un dominio de trimerización de unos 60 residuos de aminoácidos aproximadamente conectado con el módulo de la ES, de unos 180 residuos de aminoácidos, mediante una región bisagra flexible de unos 70 residuos de aminoácidos aproximadamente, que contiene diversos sitios sensibles a las proteinasas que liberan la ES monomérica después de la escisión proteolítica (Figura 2B). El "péptido conector" que conecta la triple hélice de colágeno con el dominio de trimerización de NC1, responsable de la liberación del dominio NC1 procedente del colágeno XVIII parental, es sensible a la acción de diferentes MMPs. Por tanto, para evitar una posible escisión del dominio NC1 del extremo amino del L36, dicho "péptido conector" fue reemplazado por un "linker flexible" de 17 aminoácidos (Figuras 2B y 2C).

Asimismo, en otra realización particular, se construyó el gen quimérico denominado L36 scFv-NC1^{ES-}, más corto que el anterior, que contenía las secuencias codificantes para el L36 scFv, dicho linker flexible y el dominio de trimerización de NC1 únicamente (Figura 3A).

La etiqueta his6myc tag se unió al extremo C-terminal de las proteínas de fusión para facilitar la inmunodetección.

Las construcciones genéticas se clonaron en los vectores de expresión de mamífero apropiados, bajo el control del promotor de hCMV, que contenía la secuencia principal de la oncostatina M humana. Como control, se obtuvieron vectores de expresión para ES (posiciones 130-315) y NC1 (1-315) de ratón (Figura 3A).

Se generaron líneas celulares estables en células HEK 293 y se purificaron las proteínas de fusión del medio condicionado. El análisis mediante western blot demostró que el patrón de migración de las proteínas purificadas era coherente con el peso molecular pronosticado (Figura 3B) [carril 1: L36 scFv, carril 2: L36 scFv-NC1^{ES-}, carril 3: L36 scFv-NC1^{ES+}, carril 4: NC1, y carril 5: ES].

En condiciones reductoras, el AcM 9E10 anti-myc reveló bandas únicas con un peso molecular (PM) aparente de 26, 36, 67,5 y 22 kDa (Figura 3B), que correspondían al PM calculado de 28,8, 37,6, 65,6 y 23,8 kDa para L36 scFv monomérico, L36 scFv trimérico, L36 scFv-NC1 y ES monomérica, respectivamente. En los análisis mediante western blot con proteínas que contienen el dominio NC1, el AcM 9E10 reconoce una banda única de aproximadamente 24 kDa que corresponde a la ES monomérica y una banda de un doblete de 39-44 kDa que corresponde a la proteína no procesada (Figura 3B). Ambas bandas dentro del doblete eran positivas en los western blot con un AcM anti-ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). El doblete podría ser debido a una modificación tras la traducción o a efectos de plegamiento interno.

El AcM anti-ES también reveló la banda de 24 kDa y una banda adicional con un PM aparente de aproximadamente 23 kDa que podía corresponder a monómeros de tipo ES no marcados (Figura 3B). Mediante el análisis de western blot con proteínas L36 scFv -NC1^{ES+}, el AcM anti-ES reconoce la fusión no procesada de 67,5 kDa y una banda de 24 kDa no detectada mediante el AcM 9E10, que corresponde al dominio de la ES procesado (Figura 3B). La ES purificada aparece como un doblete de 22-23 kDa cuando se revela con el AcM anti-ES (Figura 3B).

Caracterización de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-}

El estado de oligomerización de las diferentes proteínas de fusión se valoró mediante cromatografía analítica con filtración en gel y mediante experimentos de centrifugación analítica con muestras idénticas. La proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} purificada mediante IMAC (cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados) eluyó de la columna de filtración en gel esencialmente como un pico único (90% del área total) a un volumen que correspondía a un peso molecular de 109 kDa, lo que indica que la proteína es un trímero. La velocidad de sedimentación también mostró un pico principal único con una masa de 112 kDa y el experimento de equilibrio de sedimentación dio como resultado una distribución de masas que podría ajustarse a especies triméricas y no a un monómero o un dímero (Figura 4A). En su conjunto, todos estos resultados demuestran la naturaleza trimérica de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-}, una característica conferida por el dominio de trimerización de NC1, ya que L36 scFv es monomérico en las mismas condiciones tal como se muestra en los experimentos de filtración en gel y de velocidad de sedimentación (datos no mostrados). El L36 scFv trimérico (L36 scFv-NC1^{ES-}) mostró mayor afinidad de unión a laminina inmovilizada en plástico y era mucho más eficaz que el monómero en el bloqueo de la diferenciación de CE sobre sustratos de matrigel (Figuras 4B y 4C).

Para fines experimentales es esencial que la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} permanezca estable y funcional en presencia de proteinasas. Por tanto, se determinó su funcionalidad tras la incubación con una amplia variedad de proteinasas a concentraciones molares conocidas de enzima activa. Las proteinasas incluyeron representantes de diversas clases de proteinasas, es decir, catepsina L de la familia de las cisteín proteinasas; MMP-1, MMP-3; MMP-8; MMP-9, MMP-14 de la familia de las metaloproteinasas; y elastasa pancreática de la familia de las serín proteinasas. Tal como se muestra en la Figura 4D, el L36 scFv trimérico (L36 scFv-NC1^{ES-}) no se escindió en presencia de la mayoría de las proteinasas probadas. MMP-14 procesó parcialmente el trímero (L36 scFv-NC1^{ES-}) pero incluso después de 4 h de reacción, se detectó anticuerpo funcionalmente activo mediante ELISA. Sólo la catepsina L degradó completamente la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-}.

Caracterización de la proteína de fusión L36 scFV-NC1^{ES+}

La cromatografía por exclusión de tamaños mostró que la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} purificada eluye como un pico principal con un peso molecular aproximado de 210 kDa, coherente con un trímero, y otro pico con un peso molecular aparente de 117 kDa, que podría corresponder a un fragmento que carece de la parte de la ES (Figura 5A). La velocidad de sedimentación también identifica a dos especies con pesos de 181 kDa y 83 kDa.

La proteína recombinante NC1 eluyó como pico principal con un peso molecular aproximado de 123 kDa, que se corresponde con una especie trimérica, y otros picos menores, uno de ellos con un peso de 19 kDa que se corresponde con monómeros de ES (Figura 5B). Mediante experimentos de velocidad de sedimentación se identificó una especie principal con un peso molecular de 116 kDa. Estos datos indicaron que la proteína recombinante NC1 es principalmente trimérica pero heterogénea, posiblemente debido a la degradación, lo que está en consonancia con los resultados obtenidos por otros investigadores que han observado una heterogeneidad similar en proteínas NC1 recombinantes [Sasaki T. et al. EMBO J. 1998 17:4249-56].

Tal como se esperaba, la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} mostró una afinidad por la unión a la laminina inmovilizada en plástico algo mayor que la de la proteína NC1 recombinante (Figura 5C). Del mismo modo, dicha proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} (bi-específica) resultó ser mucho más eficaz que la proteína NC1 recombinante (monoespecífica) en el bloqueo de la diferenciación de las CEs sobre sustratos de Matrigel (Figura 5D).

La Figura 5E recoge los resultados del ensayo de migración de CEs y pone de manifiesto que la migración de células HUVEC en presencia de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} es inferior a la alcanzada en presencia de otras proteínas recombinantes ensayadas (L36 scFv y NC1) y del mismo orden de magnitud que la alcanzada con la ES recombinante.

Procesamiento proteolítico de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}. Generación de ES monomérica y scFv multimérico

Para estudiar la generación de ES mediante diversas proteinasas, se incubó la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} y se analizó la mezcla de reacción mediante western blot usando un AcM anti-ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). La proteína de fusión se trató con las cinco MMPs ensayadas (MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9 y MMP-14), observándose diferencias significativas en la eficacia de procesamiento de la proteína L36 scFv-NC1^{ES+} entre dichas MMPs, siendo MMP-3 y MMP-14 las más eficaces. El procesamiento completo de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+} se observó en 4 horas. Los principales productos de acumulación fueron polipéptidos con pesos moleculares comprendidos entre 20 y 25 kDa (Figura 6A). Las MMP-3, MMP-8, MMP-9 y MMP-14 produjeron fragmentos de ES que se acumularon después de 4 h, lo que sugiere que dichas MMPs no pueden degradarlos. Tal como se muestra en la Figura 6A, la elastasa y la catepsina L no sólo generaron fragmentos de tipo ES a partir de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}, sino que también lo degradaron rápidamente quedando tan solo pequeñas cantidades de ES después de 4 h de incubación. Este patrón de procesamiento proteolítico fue casi idéntico al observado con la proteína NC1 murina nativa sin modificar (Figura 6B). Los resultados indican que la adición al extremo N-terminal de un fragmento de un anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento de un epítopo, tal como un scFv, al dominio NC1
no interfiere con el procesamiento proteolítico de la proteína de fusión por las proteinasas ni con la generación de ES.

Con el fin de investigar la eficacia de las proteinasas para generar fragmentos de anticuerpo (L36 scFv), las mezclas de reacción se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras y se tiñeron con nitrato de plata. Tal como se muestra en la Figura 6C, la proteinasa más eficaz para generar ES fue la MMP-14, que también generó L36 scFv. Los L36 scFv y las ES generados eran estables y se acumulaban después de 4 h, lo que indicaba que en esas condiciones experimentales, la proteinasa no podía degradarlos. La relación entre la intensidad del L36 scFv trimérico y la intensidad de las ES sugiere un procesamiento equilibrado de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}. Se han observado resultados similares con otras MMP (datos no mostrados).

Claims

1. Una proteína oligomérica que comprende 2, 3, ó 4 proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión comprende:

c): un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y

d): un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibi- dor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicho péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis.

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2. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es una proteína de la matriz extracelular (MEC), un factor angiogénico o un receptor de membrana celular.

3. Proteína oligomérica según la reivindicación 2, en la que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es colágeno, un proteoglicano, fibronectina, laminina, tenascina, entactina, trombospondina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor 2 de VEFG (VEFGR-2) o una integrina.

4. Proteína oligomérica según la reivindicación 3, en la que dicha laminina es una laminina de mamífero, preferentemente de rata, ratón o ser humano.

5. Proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polipéptido (A') es un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un diabody que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis.

6. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido (B') comprende el dominio NC1 de colágeno XV de mamífero o el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero.

7. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, que comprende, entre dichos polipéptidos (A') y (B'), un tercer polipéptido (C') que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de unión flexible.

8. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, siendo dicha proteína oligomérica un trímero constituido por 3 proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión comprende:

a): un polipéptido (A'), dicho polipéptido (A') siendo un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce una laminina; y

b): un polipéptido (B'), comprendiendo dicho polipéptido (B') el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero.

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9. Una composición farmacéutica que comprende una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Empleo de una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la elaboración de una composición farmacéutica para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de angiogénesis.

11. Empleo de una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de patologías que cursan con angiogénesis.

12. Empleo según la reivindicación 11, en la que dicha patología que cursa con angiogénesis comprende cáncer, hemangioma, artritis reumática, psoriasis, bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados, hemorragias, neovascularización ocular, retinopatías, degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión de las venas de la retina, oclusión arterial de la retina, pterigium, rubeosis, o neovascularización corneal.

13. Un cassette de expresión que comprende, operativamente unido a una secuencia de control de expresión, una construcción génica que comprende, operativamente unidas, al menos:

a): una primera secuencia de ácido nucleico (A), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y

b): una segunda secuencia de ácido nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis,

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14. Cassette de expresión según la reivindicación 13, en el que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es una proteína de la matriz extracelular (MEC), un factor angiogénico o un receptor de membrana celular.

15. Cassette de expresión según la reivindicación 14, en el que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis es colágeno, un proteoglicano, fibronectina, laminina, tenascina, entactina, trombospondina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, receptor 2 de VEFG (VEFGR-2), una integrina.

16. Cassette de expresión según la reivindicación 15, en el que dicha laminina es una laminina de mamífero, preferentemente de rata, ratón o ser humano.

17. Cassette de expresión según la reivindicación 13, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un diabody que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis.

18. Cassette de expresión según la reivindicación 13, en el que dicha segunda secuencia de ácido nucleico (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XV de mamífero o la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero, que contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a los dominios de trimerización y endostatina (ES) de dichos dominios NC1, y la secuencia de nucleótidos que codifica los péptidos bisagra de dichos dominios NC1.

19. Cassette de expresión según la reivindicación 13, que comprende, además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), una tercera secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de unión flexible, en donde el extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico (A).

20. Cassette de expresión según la reivindicación 13, en la que dicha primera secuencia de ácido nucleico (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce una laminina y dicha segunda secuencia de ácido nucleico (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero, que contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente al dominio de trimerización y endostatina (ES) de dicho dominio NC1.

21. Un vector recombinante que comprende un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.

22. Una célula hospedadora que comprende un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, o un vector recombinante según la reivindicación 21.

23. Una proteína oligomérica obtenida por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.

24. Un procedimiento para obtener una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende crecer una célula según la reivindicación 22 bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína oligomérica y, si se desea, aislar y purificar dicha proteína oligomérica.

25. Una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

26. Empleo de un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, o de un vector según la reivindicación 21, en la elaboración de una composición farmacéutica para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de angiogénesis.

27. Empleo de un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, o de un vector según la reivindicación 21, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de patologías que cursan con angiogénesis.

28. Empleo según la reivindicación 27, en el que dicha patología que cursa con angiogénesis comprende cáncer, hemangioma, artritis reumática, psoriasis, bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados, hemorragias, neovascularización ocular, retinopatías, degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión de las venas de la retina, oclusión arterial de la retina, pterigium, rubeosis, o neovascularización corneal.