ES2249762T3 - Factor de crecimiento del endotelio vascular 2. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO HUMANO VEGF2 Y UN ADN(ARN) QUE CODIFICA DICHOS POLIPEPTIDOS VEGF2. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR DICHO POLIPEPTIDO POR TECNICAS RECOMBINANTES Y ANTICUERPOS Y ANTAGONISTAS CONTRA DICHO POLIPEPTIDO. DICHOS POLIPEPTIDOS PUEDEN SER COMBINADOS CON UN PORTADOR O DILUENTE FARMACEUTICO ADECUADO PARA PROPORCIONAR DIAGNOSTICO, TERAPIA Y/O EFECTOS PROFILACTICOS CONTRA VARIOS TRASTORNOS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS DE USO DE LOS ANTICUERPOS Y ANTAGONISTAS PARA INHIBIR LA ACCION DE VEGF2 PARA PROPOSITOS TERAPEUTICOS.

Description

Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.

Esta invención se refiere a polinucleótidos identificados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, la utilización de dichos polinucleótidos y polipéptidos, así como la producción de dichos polinucleótidos y polipéptidos. Más especialmente, el polipéptido de la presente invención es un factor de crecimiento del endotelio vascular humano 2 (VEGF2). La invención también se refiere a la inhibición de la acción de dicho polipéptido.

La formación de vasos sanguíneos nuevos, o angiogénesis, es esencial para el desarrollo embrionario, crecimiento posterior, y reparación tisular. La angiogénesis es una parte esencial del crecimiento del cáncer sólido humano, y la angiogénesis anormal está asociada con otras enfermedades tales como artritis reumatoide, psoriasis, y retinopatía diabética (Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science 235:442-447, (1987)).

En la angiogénesis están implicados muchos factores. Tanto las moléculas de factor de crecimiento de fibroblastos ácidas como básicas que son mitógenos para las células endoteliales y otros tipos celulares. La angiotropina y angiogenina pueden inducir angiogénesis, aunque sus funciones no están claras (Folkman, J., 1993, Cancer Medicine pp. 153-170, Lea y Febiger Press). Un mitógeno muy selectivo para las células endoteliales es el factor de crecimiento del endotelio vascular o VEGF (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 13:19-32, (1992)). El factor de crecimiento del endotelio vascular es un mitógeno angiogénico que se secreta cuya especificidad en cuanto a célula diana parece estar restringida a las células del endotelio vascular. El gen murino de VEGF se ha caracterizado y se ha analizado su patrón de expresión en la embriogénesis. Se observó una expresión persistente de VEGF en células epiteliales adyacentes al endotelio fenestrado, por ejemplo, en el plexo coroide y en glomérulos renales. Los datos fueron consistentes con el papel de VEGF como un regulador multifuncional del crecimiento y diferenciación de las células endoteliales. Breier, G. et al. Development, 114:521-532 (1992).

VEGF puede estimular la angiogénesis. VEGF comparte homología de secuencia con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano, PDGF\alpha y PDGF\beta (Leung, D.W., et al., Science, 1036-1309, (1989)). El grado de homología es aproximadamente 21% y 24% respectivamente. Ocho restos de cisteína se conservan entre los tres miembros. Aunque son similares, existen diferencias específicas entre VEGF y PDGF. Mientras PDGF es un factor de crecimiento principal para el tejido conectivo, VEGF es altamente específico para las células endoteliales. VEGF también se conoce como factor de permeabilidad vascular (VPM) y factor de crecimiento derivado de los folículos estrellados. Es un polipéptido dimérico que une heparina.

VEGF tiene cuatro formas diferentes de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos debido a corte y empalme alternativo. VEGF121 y VEGF165 son solubles y son capaces de estimular la angiogénesis, mientras que VEGF189 y VEGF206 están unidos a proteoglicanos que contienen heparina en la superficie celular. La expresión temporal y espacial de VEGF se ha correlacionado con la proliferación fisiológica de los vasos sanguíneos (Gajdusek, C.M., y Carbon, S.J., Cell Physiol., 139:570-579, (1989)); McNeil, P.L., Muthukrishnan, L., Warder, E., D'Amore, P.A., J. Cell. Biol., 109:811-822, (1989)). Sus sitios de unión de alta afinidad están localizados sólo en las células endoteliales en secciones tisulares (Jakeman, L.B., et al., Clin. Invest. 89:244-253, (1989)). El factor puede aislarse a partir de células de la pituitaria y de diferentes líneas celulares tumorales, y se ha implicado en algunos gliomas humanos (Plate, K.H. Nature 359:845-848, (1992)). Interesantemente, la expresión de VEGF121 o VEGF165 confiere a las células de ovario de hámster Chino la capacidad de formar tumores en ratones desnudos (Ferrara, N., et al., J. Clin. Invest. 91:160-170, (1993)). Finalmente, se ha visto que la inhibición de la función de VEGF mediante anticuerpos monoclonales anti-VEGF inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes (Kim, K.J., Nature 362:841-844, (1993)).

También se ha visto que el factor de permeabilidad vascular, también conocido como VEGF, es responsable de la hiperpermeabilidad microvascular persistente a proteínas plasmáticas incluso después del cese del daño, que es una propiedad característica de la cicatrización normal de las heridas. Esto sugiere que VPF (o VEGF) es un factor importante en la cicatrización de las heridas. Brown, L.F., et al., J. Exp. Med., 176:1375-9 (1992)).

La Patente de EEUU No. 5.073.492, expedida el 17 de diciembre, 1991, de Chen et al., describe un método para incrementar de manera sinérgica el crecimiento de las células endoteliales en un medio adecuado que comprende añadir al medio, VEGF, efectores y factor derivado del suero. También se ha preparado el ADN de la subunidad C del factor de crecimiento de las células endoteliales mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa. El ADN codifica una proteína que puede existir como heterodímero o como homodímero. La proteína es un mitógeno de células del endotelio vascular de mamíferos y, como tal, es útil para la estimulación del desarrollo y reparación vascular, como se describe en la Solicitud de Patente Europea No. 92302750,2, publicada el 30 de septiembre, 1992.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido maduro nuevo que es un VEGF2 así como fragmentos de éste. El VEGF2 de la presente invención tiene origen humano.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos (ADN o ARN) que codifican dichos polipéptidos.

Según otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para producir dicho polipéptido mediante técnicas recombinantes.

Según otro aspecto adicional de la presente invención, dicho polipéptido, o polinucleótido que codifica dicho polipéptido, son útiles para fines terapéuticos, por ejemplo, como un agente cicatrizante de heridas, para estimular el crecimiento de hueso y tejido dañados y estimular la endotelización así como para el diagnóstico de tumores, terapia en cáncer y para identificar y aislar receptores de VEGF2 desconocidos.

Según otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una anticuerpo frente a VEGF2 y un proceso para producir dicho anticuerpo.

Según otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan antagonistas/inhibidores de VEGF2, que pueden utilizarse para inhibir la acción de dicho polipéptido, por ejemplo, para prevenir la angiogénesis tumoral. Estos antagonistas/inhibidores son anticuerpos o moléculas antisentido como se definen en las reivindicaciones.

Éstos y otros aspectos de la presente invención resultarán claros para los expertos en la técnica a partir de las indicaciones de la presente memoria.

Los dibujos siguientes son ilustrativos de las realizaciones de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención que está abarcado por las reivindicaciones.

La Fig. 1 muestra la secuencia del polinucleótido que codifica VEGF2, y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente del polipéptido VEGF2 de longitud completa que comprende 350 restos de aminoácidos de los que aproximadamente los primeros 24 aminoácidos representan la secuencia líder. La abreviatura estándar de tres letras se utiliza para mostrar la secuencia de aminoácidos.

La Fig. 2 muestra la homología entre los factores de crecimiento PDGF\alpha, PDGF\beta, VEGF y VEGF2 a nivel de aminoácidos.

La Fig. 3 muestra, en forma de tabla, el porcentaje de homología entre PDGF\alpha, PDGF\beta, VEGF y VEGF2.

La Fig. 4 muestra la presencia de ARNm para VEGF2 en líneas de tumor de mama.

La Fig. 5 muestra los resultados de un análisis de transferencia Northern de VEGF2 en tejidos de seres humanos adultos.

La Fig. 6 muestra los resultados de correr VEGF2 y el gel de SDS-PAGE después de la transcripción/traducción in vitro. Los ADNc de VEGF2 de longitud completa y parcial se transcribieron y tradujeron en una reacción acoplada en presencia de ^{35}S-metionina. Los productos de la traducción se analizaron mediante SDS PAGE con un gradiente 4-20% y se expusieron a película de rayos X.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o el polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon depositado como Depósito ATCC No. 75698.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede obtenerse a partir de osteoclastomas de embriones humanos en una etapa temprana de desarrollo (semana 8 a 9), corazón adulto o diferentes líneas celulares de cáncer de mama. El polinucleótido de esta invención se descubrió en una biblioteca de ADNc obtenida a partir de embriones humanos en una etapa temprana del desarrollo, semana 9. Está relacionado estructuralmente con la familia VEGF/PDGF. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de aproximadamente 350 restos de aminoácidos de los que probablemente aproximadamente los primeros 24 restos de aminoácidos son la secuencia líder de manera que la proteína madura comprende 326 aminoácidos y dicha proteína presenta la homología más alta con el factor de crecimiento del endotelio vascular (identidad del 30%), seguido de PDGF\alpha (23%) y PDGF\beta (22%), (véase la Figura 3). Es especialmente importante que los ocho restos de cisteínas están conservados en los cuatro miembros de la familia (véanse las áreas enmarcadas de la Figura 2). Además, la identificación de la familia PDGF/VEGF, PXCVXXXRCXGCCN, está conservada en VEGF2 (véase la Figura 2). La homología entre VEGF2, VEGF y los dos PDGF es a nivel de la secuencia de la proteína. No puede detectarse homología en la secuencia de nucleótidos y, por lo tanto, será difícil aislar VEGF2 mediante técnicas sencillas como hibridación con baja astringencia.

El polinucleótido de la presente invención puede estar en la forma de ARN o en la forma de ADN, ADN que incluye ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificadora o no codificadora (anti-sentido). La secuencia codificadora que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora que se muestra en la Figura 1 o la del clon depositado o puede ser una secuencia codificadora diferente, secuencia codificadora, que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 o el ADNc depositado.

El polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la Figura 1 o el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado puede incluir: sólo la secuencia codificadora del polipéptido maduro; la secuencia codificadora del polipéptido maduro y secuencias codificadoras adicionales tales como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia codificadora del polipéptido maduro (y, opcionalmente, una secuencia codificadora adicional) y secuencias no codificadoras, tales como intrones o secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia codificadora del polipéptido maduro.

Por lo tanto, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" engloba un polinucleótido que incluye sólo la secuencia codificadora del polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencias adicionales codificadoras y/o no codificadoras.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos más arriba en la presente memoria que codifican fragmentos del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o del polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica natural del polinucleótido o una variante no natural del polinucleótido.

Por lo tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que se muestra en la Figura 1 o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon depositado así como variantes de dichos polinucleótidos, variantes que codifican un fragmento del polipéptido de la Figura 1 o del polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado. Dichas variantes de nucleótidos incluyen variantes por deleción, variantes por sustitución y variantes por adición o inserción.

Como se ha indicado más arriba en la presente memoria, el polinucleótido puede tener una secuencia codificadora que sea una variante alélica natural de la secuencia codificadora que se muestra en la Figura 1 o de la secuencia codificadora del clon depositado. Como es conocido en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que tiene una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no alteran de manera sustancial la función del polipéptido codificado.

La presente invención también incluye polinucleótidos, en los que la secuencia codificadora del polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula anfitriona, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia de secreción para controlar el transporte de un polipéptido de la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula anfitriona puede degradar la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más restos de aminoácidos adicionales en el extremo 5'. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Después de que la prosecuencia se degrada se obtiene una proteína madura activa.

Por lo tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o una proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en marco con una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina proporcionada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido fusionado con el marcador en el caso de un anfitrión bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se utiliza un anfitrión mamífero, por ejemplo células COS-7. La etiqueta HA corresponde a un epítopo obtenido a partir de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).

La presente invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan con las secuencias descritas más arriba en la presente memoria si existe al menos una identidad del 70% entre las secuencias. La presente invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones astringentes con los polinucleótidos descritos más arriba en la presente memoria. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "condiciones astringentes" significa que la hibridación sólo se producirá si existe una identidad de al menos 95% y preferiblemente de al menos 97% entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridan con los polinucleótidos descritos más arriba en la presente memoria en una realización preferida codifican polipéptidos que retienen de manera sustancial la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la Figura 1 o el ADNc depositado.

El depósito al que se refiere la presente memoria se mantendrá bajo el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Estos depósitos se proporcionan únicamente como conveniencia. La secuencia de los polinucleótidos que están contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de los aminoácidos de los polipéptidos codificados por ellos, se incorporan en la presente memoria por referencia y son dominantes en el caso de cualquier conflicto con la descripción de las secuencias de la presente memoria. Puede requerirse una licencia para preparar, utilizar o vender los materiales depositados, y dicha licencia no se concede por la presente memoria.

La presente memoria se refiere además a un polipéptido VEGF2 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como fragmentos de dicho polipéptido.

El término "fragmento", cuando se refiere al polipéptido de la Figura 1 o al codificado por el ADNc depositado, significa un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho polipéptido. Las proproteínas pueden activarse mediante la eliminación de la parte de proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.

El polipéptido de la presente invención puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados con el polipéptido maduro, como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se utiliza para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente se purifican a homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es natural). Por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido puede ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido puede formar parte de una composición, y aún así estar aislado ya que dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células anfitrionas que se obtienen por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células anfitrionas se obtienen por ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células anfitrionas obtenidas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según resulte apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes VEGF2. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son las utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada para la expresión, y resultarán claras para el experto en la técnica.

El polinucleótido de la presente invención puede utilizarse para producir un polipéptido mediante técnicas recombinantes. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia del polinucleótido puede incluirse en uno cualquiera de diferentes vehículos de expresión, en especial vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmido bacterianos; ADN de fago; plásmidos de levadura; vectores obtenidos a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico como vaccinia, adenovirus, virus de la peste aviar, y pseudorrabia. sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que se pueda replicar y sea viable en el anfitrión.

Como se ha descrito más arriba en la presente memoria, la secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante diferentes procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio apropiado de una endonucleasa de restricción mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que dichos procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida de manera operativa a una o unas secuencias de control de la expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse: promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor del fago lambda P_{L} y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente un gen para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células anfitrionas transformadas como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina en el caso de un cultivo de células eucariotas, o como resistencia a tetraciclina o ampicilina en el caso de E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito más arriba en la presente memoria, puede utilizarse para transformar un anfitrión apropiado para permitir al anfitrión expresar la proteína. Como ejemplos representativos de anfitriones apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; células fúngicas, como levaduras; células de insecto, tales como Drosophila y Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; células de plantas, etc. La selección de un anfitrión apropiado se considera que está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las indicaciones de la presente memoria.

Más especialmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias descritas de manera extensa más arriba. Las construcciones comprenden un vector, como un plásmido o un vector vírico, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido a la secuencia de manera operativa. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados y están disponibles comercialmente. Los vectores siguientes se proporcionan como ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE-9 (Qiagen), pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que puedan replicar y sean viables en el anfitrión.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores que se puedan seleccionar. Los vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particulares mencionados incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a células anfitrionas que contienen la construcción descrita más arriba. La célula anfitriona puede ser una célula eucariota superior, como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula anfitriona puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula anfitriona puede realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Las construcciones en las células anfitrionas pueden utilizarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamíferos, levaduras, bacterias, u otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden utilizarse sistemas de traducción sin células para producir dichas proteínas utilizando ARN obtenidos a partir de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para utilizarse con anfitriones procariotas y eucariotas están descritos por Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia.

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa mediante la inserción de una secuencia amplificadora en el vector. Los amplificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el amplificador de SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (pb 100 a 270), un amplificador del promotor temprano del citomegalovirus, un amplificador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación, y amplificadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores que se pueden seleccionar lo que permite transformar en la célula anfitriona, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor obtenido a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural situada más abajo. Dichos promotores pueden obtenerse a partir de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de estrés, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se une en una fase apropiada respecto a las secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, respecto a una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína resultante de la traducción al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación en el extremo N terminal que proporcione las características deseadas, por ejemplo, estabilización o simplificación de la purificación del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para utilizarse en bacterias se construyen insertando una secuencia estructural de ADN que codifica una proteína deseada junto a señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en una fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos que se pueden seleccionar y un origen de la replicación para asegurar la permanencia del vector y, si se desea, paara proporcionar amplificación en el anfitrión. Los anfitriones procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diferentes especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque también pueden utilizarse otros si se desea.

Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para utilizarse en bacterias pueden comprender un marcador que se pueda seleccionar y un origen de replicación bacteriano obtenido a partir de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Estas secciones "centrales" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural que se quiere expresar.

Después de la transformación de una cepa de anfitrión adecuada y del crecimiento de la cepa de anfitrión hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se desreprime mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio en la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un tiempo adicional.

Las células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se conserva para una purificación adicional.

Las células microbianas utilizadas en la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o utilización de agentes lisantes de células.

También pueden utilizarse diferentes sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de la replicación, un promotor y amplificador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitios de corte y empalme del donante y aceptor, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias que flanquean el extremo 5' que no se transcriben. Pueden utilizarse las secuencias de ADN obtenidas a partir del genoma vírico de SV40, por ejemplo, el origen, promotor temprano, amplificador, corte y empalme y sitios de poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos requeridos que no se transcriben.

VEGF2 se recupera y purifica a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos utilizados hasta este momento, incluyendo precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatito y cromatografía de lectinas. Se prefiere tener concentraciones bajas (aproximadamente 0,1-5 mM) de iones calcio presentes durante la purificación (Price, et al., J. Biol. Chem. 244:917 (1969)). Se pueden utilizar etapas de replegamiento de las proteínas, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede utilizarse cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto natural purificado, o un producto de procesos de síntesis química, o producido mediante técnicas recombinantes a partir de un anfitrión procariota o eucariota (por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del anfitrión utilizado en un proceso de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados con carbohidratos de mamíferos o de otros eucariotas o pueden no estar glicosilados.

VEGF2 es útil como agente cicatrizante de heridas, especialmente cuando resulta necesario re-vascularizar tejidos dañados, o cuando es importante una angiogénesis capilar nueva. Por lo tanto, puede utilizarse para el tratamiento de heridas de espesor completo tales como úlceras dérmicas, incluyendo llagas de presión, úlceras venosas, y úlceras diabéticas. Además, puede utilizarse en el tratamiento de quemaduras y daños de espesor completo en el que la angiogénesis es deseable para preparar la quemadura en los sitios dañados para un injerto y colgajo cutáneo. En este caso, debe aplicarse directamente en los sitios. De manera similar, VEGF2 puede utilizarse en la cirugía plástica cuando se requiera una reconstrucción después de una quemadura, otro trauma, o incluso para fines cosméticos.

VEGF2 también puede utilizarse para inducir el crecimiento de tejido óseo, tejido de periodontio o tejido de ligamento dañado. Puede utilizarse en enfermedades periodontales en las que VEGF2 se aplica en un gel de metilcelulosa en las raíces de los dientes enfermos, pudiendo dar lugar el tratamiento a la formación de hueso y cemento nuevos con crecimiento de las fibras de colágeno. Puede utilizarse para regenerar los tejidos de soporte de los dientes, incluyendo hueso alveolar, cemento y ligamento periodontal, que han resultado dañados por enfermedad y trauma.

Debido a que la angiogénesis es importante para mantener las heridas limpias y sin infección, VEGF2 puede utilizarse junto a la cirugía y después de la reparación de los cortes. Debería ser especialmente útil en el tratamiento de heridas abdominales en las que existe un riesgo de infección alto.

VEGF2 puede utilizarse para la estimulación de la endotelización en la cirugía de injertos vasculares. En el caso de injertos vasculares que utilizan bien material transplantado o sintético, VEGF2 puede aplicarse en la superficie del injerto o en la unión para estimular el crecimiento de las células del endotelio vascular. Una derivación de esto es que VEGF2 puede utilizarse para reparar el daño del infarto de miocardio y otros casos en los que se necesita la cirugía de bypass coronario mediante la estimulación del crecimiento del tejido transplantado. En relación a esto está la utilización de VEGF2 para reparar el sistema vascular cardíaco después de una isquemia.

La identificación de VEGF2 puede utilizarse para la generación de determinados inhibidores del factor de crecimiento del endotelio vascular. Debido a que la angiogénesis y la neovascularización son etapas esenciales en el crecimiento de los tumores sólidos, la inhibición de la actividad angiogénica del factor de crecimiento del endotelio vascular es muy útil para prevenir el crecimiento adicional, para retrasar o incluso producir la regresión de los tumores sólidos. Aunque el nivel de expresión de VEGF2 es extremadamente bajo en los tejidos normales incluyendo la mama, puede verse expresión a niveles moderados en al menos dos líneas celulares de tumor de mama que se obtienen a partir de tumores malignos. Por lo tanto, es posible que VEGF2 esté implicado en la angiogénesis y crecimiento de tumores.

VEGF2 puede utilizarse para el cultivo in vitro de células del endotelio vascular, pudiendo añadirse al medio condicionado a una concentración de 10 pg/ml hasta 10 ng/ml.

El polipéptido de la presente invención también puede utilizarse según la presente invención mediante la expresión de dicho polipéptido in vivo, referido habitualmente como "terapia génica".

Por lo tanto, por ejemplo, mediante ingeniería se pueden modificar células, como células de la médula ósea, con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica el polipéptido ex vivo, proporcionándose después las células modificadas mediante ingeniería a un paciente que va a ser tratado con el polipéptido. Dichos métodos son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden modificarse mediante ingeniería mediante procesos conocidos en la técnica mediante la utilización de una partícula retrovírica que contiene ARN que codifica el polipéptido de la presente invención.

De manera similar, las células pueden modificarse mediante ingeniería in vivo para la expresión del polipéptido in vivo, por ejemplo, mediante procesos conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, una célula productora para producir una partícula retrovírica que contiene ARN que codifica el polipéptido de la presente invención puede administrarse a un paciente para modificar células mediante ingeniería in vivo y para la expresión del polipéptido in vivo. Éstos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención mediante dichos métodos resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las indicaciones de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para modificar las células mediante ingeniería puede ser distinto de una partícula retrovírica, por ejemplo, un adenovirus, que puede utilizarse para modificar las células mediante ingeniería in vivo después de combinarse con un vehículo de administración adecuado.

El polipéptido de la presente invención puede utilizarse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Dichas composiciones comprenden una cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico de la proteína, y un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Dicho vehículo incluye pero no está limitado a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de éstos. La formulación debe ajustarse a la vía de administración.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Junto a dichos recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, utilización o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, utilización o venta para la administración a seres humanos. Además, el polipéptido de la presente invención puede utilizarse junto a otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de una manera conveniente, como por vía oral, e intravenosa, y se administra preferiblemente por vía tópica. Las cantidades y regímenes de dosificación de VEGF2 administrado a un sujeto dependerán de diferentes factores, tales como la vía de administración, la naturaleza y condición que va a tratarse, el peso corporal del sujeto que se va a tratar y el criterio del médico que lo prescribe. En términos generales, se administra, por ejemplo, en dosis eficaces desde un punto de vista terapéutico de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y, en la mayoría de los casos, se administrará en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día y preferiblemente la dosificación es de aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal por día, teniendo en cuenta las vías de administración, síntomas, etc.

Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está específicamente dirigida a y puede hibridar con una posición particular de un cromosoma humano determinado. Más aún, existe una necesidad actual de identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente hay pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos reales de secuencias (polimorfismos repetidos) disponibles para marcar posiciones cromosómicas. El mapeo de los ADN a nivel de cromosomas según la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con genes asociados a enfermedades.

Brevemente, las secuencias pueden mapearse a nivel de cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente 15-25 pb) a partir de ADNc. El análisis por ordenador del ADNc se utiliza para seleccionar rápidamente cebadores que no se extienden más de un exón en el ADN genómico, lo que complicaría el proceso de amplificación. Estos cebadores se utilizan para el rastreo mediante PCR de híbridos de células somáticas que contienen determinados cromosomas humanos. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador rendirán un fragmento amplificado.

El mapeo mediante PCR de los híbridos de células somáticas es un proceso rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótidos, puede conseguirse la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas o depósitos específicos de clones genómicos grandes de manera análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden utilizarse de manera similar para mapear a nivel de cromosoma incluyen hibridación in situ, prerrastreo con cromosomas marcados separados por flujo y preselección mediante hibridación para construir bibliotecas de cromosomas específicos-ADNc.

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de un clon de ADNc con una extensión de cromosomas en metafase puede utilizarse para proporcionar una localización precisa en una etapa. Esta técnica puede utilizarse con ADNc tan corto como 500 ó 600 bases; sin embargo, los clones mayores de 2.000 pb tienen una probabilidad más alta de unirse a una única localización cromosómica con una intensidad de la señal suficiente como para una detección sencilla. FISH requiere la utilización del clon a partir del que se obtuvo EST, y cuanto más largo mejor. Por ejemplo, 2.000 pb es bueno, 4.000 pb es mejor, y más de 4.000 no es probablemente necesario para obtener buenos resultados en un porcentaje de veces razonable. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques. Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que se ha mapeado la secuencia a nivel de una posición cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con datos del mapa genético. (Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que han sido mapeados a nivel de la misma región cromosómica se identifica mediante análisis de ligamiento (co-herencia de genes adyacentes físicamente).

Después, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, la mutación es probablemente el agente causal de la enfermedad.

Con la resolución actual de las técnicas de mapeo físico y de mapeo genético, un ADNc localizado exactamente en una región cromosómica asociada con la enfermedad puede tener entre 50 y 500 genes causales potenciales. (Esto asume una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).

La comparación entre individuos afectados y no afectados implica generalmente en primer lugar buscar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones que son visibles a partir de extensiones cromosómicas o detectables utilizando PCR en base a esa secuencia de ADNc. Por último, se requiere la secuenciación completa de los genes de diferentes individuos para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos.

La presente invención se dirige además a inhibir VEGF2 in vivo mediante la utilización de tecnología antisentido. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica mediante la formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, estando basados ambos métodos en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificadora del extremo 5' de la secuencia del polinucleótido maduro, que codifica el polipéptido de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN complementario a una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice - véanse Lee et al., Nucl. Acid Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251:1360 (1991), que impide por lo tanto la transcripción y la producción de VEGF2. El oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de una molécula de ARNm en VEGF2 (antisentido - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).

Alternativamente, los oligonucleótidos descritos más arriba pueden administrarse a las células mediante procesos de la técnica de manera que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción de VEGF2 de la manera descrita más arriba.

Por lo tanto, las construcciones antisentido frente a VEGF2 pueden inhibir la actividad angiogénica de VEGF2 y prevenir el crecimiento adicional o incluso revertir los tumores sólidos, ya que la angiogénesis y la neovascularización son etapas esenciales en el crecimiento de los tumores sólidos. Estas construcciones antisentido también pueden utilizarse para tratar artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética que están caracterizadas por una angiogénesis anormal.

Los polipéptidos, sus fragmentos, o las células que los expresan pueden utilizarse como inmunógenos para producir anticuerpos frente a ellos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena única y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión Fab. Pueden utilizarse diferentes procesos conocidos en la técnica para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados frente al polipéptido que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse mediante inyección directa del polipéptido en un animal o mediante la administración del polipéptido a un animal, preferiblemente un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá al polipéptido. De esta manera, puede utilizarse incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que se unen al polipéptido nativo completo. Dichos anticuerpos pueden utilizarse para aislar el polipéptido a partir de tejidos que expresan ese polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de EEUU 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena única frente a los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención.

Los anticuerpos neutralizantes pueden identificarse y aplicarse para enmascarar el factor de crecimiento del endotelio vascular, y esto se ha visto en sistemas modelo de ratón frente a VEGF. VEGF2 también puede inactivarse mediante determinados mutantes negativos dominantes en el gen mismo. Se sabe que tanto PDGF\alpha como \beta forman heterodímeros u homodímeros, y que VEGF forma homodímeros. Puede esperarse una interacción similar entre VEGF2. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden utilizarse para bloquear la actividad angiogénica de VEGF2 y para retrasar el crecimiento de los tumores sólidos. Estos anticuerpos también pueden utilizarse para tratar la inflamación producida por la permeabilidad vascular incrementada que resulta de la presencia de VEGF2.

Estos anticuerpos pueden utilizarse además en un inmunoensayo para detectar la presencia de tumores en determinados individuos. Los inmunoensayos enzimáticos pueden llevarse a cabo en la muestra de sangre de un individuo. Unos niveles elevados de VEGF2 pueden considerarse como diagnóstico de cáncer.

La presente invención también está dirigida a los antagonistas/inhibidores de los polipéptidos de la presente invención. Los antagonistas/inhibidores son aquellos que inhiben o eliminan la función del polipéptido, como se define en las reivindicaciones.

Por lo tanto, por ejemplo, los antagonistas se unen a un polipéptido de la presente invención e inhiben o eliminan su función. El antagonista, por ejemplo, puede ser un anticuerpo frente al polipéptido que se une al polipéptido o, en algunos casos, un oligonucleótido.

También pueden producirse versiones truncadas de VEGF2 que son capaces de interaccionar con el tipo salvaje de VEGF2 para formar dímeros que no activan el crecimiento de las células endoteliales y, por lo tanto, para inactivar el VEGF2 endógeno. O, formas mutantes de VEGF2 forman dímeros por sí mismas y ocupan el dominio de unión al ligando de los receptores tirosina quinasa apropiados en la superficie de la célula diana, pero no activan el crecimiento celular.

Los antagonistas/inhibidores de la presente invención pueden utilizarse para prevenir la inflamación debida a la acción de VEGF2 que incrementa la permeabilidad vascular. Los antagonistas/inhibidores también pueden utilizarse para tratar el crecimiento de los tumores sólidos, retinopatía diabética, psoriasis y artritis reumatoide.

Los antagonistas/inhibidores de la presente invención pueden utilizarse en una composición con un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, por ejemplo, como se ha descrito más arriba en la presente memoria.

La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes; sin embargo, debe entenderse que la presente invención no está limitada a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a no ser que se especifique otra cosa, son por peso.

Con el fin de facilitar la comprensión de los ejemplos siguientes, se describirán determinados métodos y/o términos que aparecen frecuentemente.

Los "plásmidos" se designan mediante una letra p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente memoria están disponibles comercialmente, disponibles al público sin restricción, o pueden construirse a partir de plásmidos que están disponibles según procesos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

La "digestión" del ADN se refiere a la degradación catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en determinadas secuencias del ADN. Las diferentes enzimas de restricción utilizadas en la presente memoria están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se utilizaron como es conocido para los expertos en la técnica. Para fines analíticos, se utiliza típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de disolución de tampón. Para el fin de aislar los fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, se digieren típicamente 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones y cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción particulares están especificados por el fabricante. Se utilizan habitualmente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar según las instrucciones del distribuidor. Después de la digestión, la reacción se somete directamente a electroforesis en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación en función del tamaño de los fragmentos degradados se lleva a cabo utilizando un gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere bien a un polidesoxinucleótido de cadena única o a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido que pueden sintetizarse químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos no tienen 5' fosfato y, por lo tanto, no se ligarán a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no haya sido desfosforilado.

"Ligación" se refiere a un proceso para formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A no ser que se proporcione otra cosa, la ligación puede conseguirse utilizando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ligasa T4 de ADN ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se quieren ligar.

A no ser que se indique otra cosa, la transformación se llevó a cabo como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Patrón de expresión de VEGF2 en tejidos humanos y en líneas celulares de cáncer de mama

Se llevaron a cabo análisis por transferencia Northern para examinar los niveles de expresión de VEGF2 en tejidos humanos y en líneas celulares de cáncer de mama en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol™ B (Biotecx Laboratories, Inc.). Aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado a partir de cada tejido de mama y línea celular especificados se separaron en gel de agarosa al 1% y se transfirieron a un filtro de nilón, (Molecular Cloning, Sambrook Fritsch, y Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989). La reacción de marcaje se realizó según el kit Prime-It de Stratagene con 50 ng de fragmento de ADN. El ADN marcado se purificó con una columna Select-G-50 de 5' Prime - 3 Prime, Inc. Después, el filtro se hibridó con el gen de VEGF2 de longitud completa marcado radiactivamente a 1.000.000 cpm/ml en 0,5 M NaPO_{4} y 7% de SDS durante toda la noche a 65ºC. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC, 0,1% SDS, los filtros se expusieron a -70ºC durante toda la noche con una pantalla amplificadora. Se observó una banda de 1,6 Kd en 2 líneas celulares de cáncer de mama. El carril #4 representa una línea celular muy tumorigénica que es independiente de estrógeno para su crecimiento. Véase la Figura 4. También se separaron 10 \mug de ARN total de 10 tejidos humanos adultos en un gel de agarosa y se transfirieron a un filtro de nilón. Después, el filtro se hibridó con sonda VEGF2 marcada radiactivamente en 7% SDS, 0,5 M NaPO_{4}, pH 7,2; 1% BSA durante toda la noche a 65ºC. Después de lavar en 0,2 x SSC a 65ºC, el filtro se expuso a una película durante 24 días a -70ºC con pantalla amplificadora. Véase la Figura 5.

Ejemplo 2 Expresión de VEGF2 mediante transcripción y traducción in vitro

El ADNc de VEGF2 se transcribió y tradujo in vitro para determinar el tamaño del polipéptido traducido codificado por el ADNc de VEGF2 de longitud completa y parcial. Los insertos de ADNc de VEGF2 de longitud completa y parcial en el vector pBluescript SK se amplificaron mediante PCR con tres pares de cebadores, 1) cebadores M13 reversos y directos; 2) cebador M13 reverso y cebador F4 de VEGF; 3) cebador M13 reverso y cebador F5 de VEGF. Las secuencias de estos cebadores son como sigue:

Cebador M13-2 reverso:

5'-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3'

Esta secuencia está localizada por encima del extremo 5' del inserto de ADNc de VEGF2 en el vector pBluescript y está en orientación antisentido respecto al ADNc. Una secuencia del promotor T3 está localizada entre este cebador y el ADNc de VEGF2.

Cebador M13-2 directo:

5'-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'

Esta secuencia está localizada por debajo del extremo 3' del inserto de ADNc de VEGF2 en el vector pBluescript y está en orientación antisentido respecto al inserto de ADNc.

Cebador F4 de VEGF:

5'-CCACATGGTTCAGGAAAGACA-3'

Esta secuencia está localizada en el ADNc de VEGF2 en una orientación antisentido de 1259 a 1239 pb, alejada aproximadamente 169 pb del extremo 3' del codón de terminación y aproximadamente 266 pb antes del último nucleótido del ADNc.

La reacción de PCR con los tres pares de cebadores produce productos amplificados con la secuencia del promotor T3 al principio del inserto de ADNc. El primer y tercer par de cebadores producen productos de PCR que codifican el polipéptido de VEGF2 completo. El segundo par de cebadores produce un producto de PCR que carece de 36 aminoácidos de la secuencia codificadora en el extremo C-terminal del polipéptido VEGF2.

Para la transcripción/traducción in vitro se utilizaron aproximadamente 0,5 \mug del producto de PCR del primer par de cebadores, 1 \mug del segundo par de cebadores, 1 \mug del tercer par de cebadores. La reacción de transcripción/traducción in vitro se llevó a cabo en un volumen de 25 \mul, utilizando el T_{N}T™ Coupled Reticulocyte Lysate Systems (promega, CAT# L4950). Específicamente, la reacción contiene 12,5 \mul de lisado de reticulocitos de conejo T_{N}T, 2 \mul de tampón de reacción T_{N}T, 1 \mul de polimerasa T3, 1 \mul de 1 mM de mezcla de aminoácidos (excepto metionina), 4 \mul de ^{35}S-metionina (>1.000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1 \mul de 40 U/\mul; inhibidor de ribonucleasa RNasin, 0,5 ó 1 \mug de productos de PCR. Se añadió H_{2}O sin nucleasa para llevar la mezcla a 25 \mul. La reacción se incubó a 30ºC durante 2 horas. Se analizaron cinco microlitros del producto de reacción en un gel SDS-PAGE con un gradiente 4-20%. Después de fijar en 25% de isopropanol y 10% de ácido acético, el gel se secó y se expuso a una película de rayos X durante toda la noche a 70ºC.

Como se muestra en la Fig. 6, los productos de PCR que contienen el ADNc de VEGF2 de longitud completa y el ADNc que carece de 266 pb en la región 3' que no se traduce (3'-UTR) produjeron productos traducidos de la misma longitud, cuyos pesos moleculares se estiman que son 38-40 kd (carriles 1 y 3). La traducción del ADNc que carece de toda la 3'UTR y que carece de la secuencia que codifica los 36 aminoácidos del extremo C-terminal dio lugar a un polipéptido con un peso molecular estimado de 36-38 kd (carril 2).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: HU, ET AL.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular 2

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(IV)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART Y OLSTEIN

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(B)

CALLE: 6 BECKER FARM ROAD

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(C)

CIUDAD: ROSELAND

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(D)

ESTADO: NUEVA JERSEY

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(E)

PAÍS: EEUU

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07068

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(v)

FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO DE 8,9 CENTÍMETROS

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(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

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(D)

PROGRAMA DE ORDENADOR: WORD PERFECT 5.1

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/207.550

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 DE MARZO 1994

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.134

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 325800-14B

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(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 201-994-1700

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(B)

TELEFAX: 201-994-1744

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 1.525 PARES DE BASES

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(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(C)

CADENA: ÚNICA

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 AMINOÁCIDOS

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(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

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(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

2

3

Claims (62)

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2;

(b)

secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos +1 hasta +326 de la SEQ ID NO:2;

(c)

secuencias de nucleótidos que codifican un fragmento de la SEQ ID NO:2, en el que dicho fragmento tiene actividad angiogénica y/o estimula la endotelización;

(d)

secuencias de nucleótidos que codifican un fragmento del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698, en el que dicho fragmento tiene actividad angiogénica y/o estimula la endotelización;

(e)

secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido codificado por el ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698; y

(f)

secuencias de nucleótidos que son idénticas al menos en un 70% al polinucleótido de (a) hasta (e), en el que dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad angiogénica y/o estimula la endotelización.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia codificadora de la SEQ ID NO:1.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia codificadora del ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos de la parte (f) son idénticas al menos en un 95% a las secuencias de nucleótidos de (a) hasta (e) de la reivindicación 1.

5. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos de la parte (f) son idénticas al menos en un 97% a las secuencias de nucleótidos de (a) hasta (e) de la reivindicación 1.

6. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos +1 hasta +326 de la SEQ ID NO:2;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido codificado por el ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698 que corresponde a los aminoácidos +1 hasta +326 de la SEQ ID NO:2; y

(c)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 70% a la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad angiogénica y/o estimula la endotelización;

en el que dicha secuencia de nucleótidos está fusionada en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde una célula anfitriona.

7. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 que codifica los aminoácidos +1 hasta +326 de la SEQ ID NO:2.

8. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que la secuencia de nucleótidos de (b) es la secuencia de nucleótidos del ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698 que codifica los aminoácidos +1 hasta +326 de la SEQ ID NO:2.

9. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que la secuencia de nucleótidos de (c) es idéntica al menos en un 95% a la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

10. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que la secuencia de nucleótidos de (c) es idéntica al menos en un 97% a la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

11. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la célula anfitriona mencionada es una célula eucariota.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que dicha célula anfitriona es una célula de mamífero.

13. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende al menos una secuencia de nucleótidos codificadora y/o no codificadora adicional.

14. El polinucleótido de la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de nucleótidos codificadora adicional codifica un polipéptido.

15. El polinucleótido de la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de nucleótidos codificadora adicional codifica un polipéptido que facilita la purificación del polipéptido de fusión resultante.

16. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el polinucleótido es ADN.

17. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el polinucleótido es ARN.

18. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. El vector de la reivindicación 18, en el que el polinucleótido está unido a secuencias de control de la expresión lo que permite la expresión en células anfitrionas procariotas o eucariotas.

20. Un método para producir una célula anfitriona que comprende modificar células genéticamente con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19.

21. Una célula anfitriona producida mediante el método de la reivindicación 20.

22. Una célula anfitriona modificada genéticamente con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

23. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el polinucleótido está unido a secuencias de control de la expresión lo que permite la expresión en dicha célula anfitriona.

24. Una célula anfitriona que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19.

25. La célula anfitriona de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y en el que la secuencia de aminoácidos líder codificada por dicho polinucleótido es funcional como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde dicha célula anfitriona.

26. La célula anfitriona de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en la que la célula anfitriona es una célula eucariota, una célula fúngica, una célula de plantas, una célula animal, una célula de insecto, una célula de mamífero, una célula COS o una célula CHO.

27. La célula anfitriona de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en la que dicha célula anfitriona es una célula procariota o una célula de E. coli.

28. Un método para producir un polipéptido, que comprende:

(a)

cultivar la célula anfitriona de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27 en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el polinucleótido mencionado; y

(b)

recuperar el polipéptido.

29. Un método para producir un polipéptido, que comprende expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y recuperar dicho polipéptido.

30. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para producir un polipéptido mediante la realización de traducción sin células del ARN que tiene una secuencia de nucleótidos como se ha definido para dicho polinucleótido.

31. Un polipéptido que se puede obtener mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29 o mediante la realización de traducción sin células como se ha definido en la reivindicación 30.

32. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

33. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, que forma parte de un homodímero o un heterodímero.

34. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, que está glicosilado.

35. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, que ha sido sintetizado químicamente.

36. Un anticuerpo que reconoce un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos como se ha definido en la reivindicación 1 (a) hasta (e).

37. El anticuerpo de la reivindicación 36, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

un fragmento Fab;

(b)

un anticuerpo de cadena única;

(c)

un anticuerpo producido por una biblioteca de expresión Fab;

(d)

un anticuerpo policlonal;

(e)

un anticuerpo monoclonal;

(f)

un anticuerpo quimérico; y

(g)

un anticuerpo humanizado.

38. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, en el que dicho anticuerpo es un antagonista.

39. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de neutralización.

40. Un antagonista/inhibidor del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en el que dicho antagonista/inhibidor es una molécula antisentido de 10 a 40 nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos como se ha definido en la SEQ ID NO:1 y que por lo tanto inhibe la expresión de dicha secuencia de nucleótidos.

41. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o el antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 y opcionalmente un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

42. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la inflamación.

43. Utilización del anticuerpo de la reivindicación 38 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de artritis reumatoide, psoriasis o retinopatía diabética o para la prevención de la inflamación.

44. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores.

45. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención del crecimiento o para el retraso o regresión de los tumores sólidos.

46. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de angiogénesis tumoral.

47. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la endotelización en un paciente.

48. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la proliferación de las células del endotelio vascular en un paciente.

49. Utilización del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 o del antagonista/inhibidor de la reivindicación 40 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la angiogénesis en un paciente.

50. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 y, opcionalmente, un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

51. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la proliferación de las células del endotelio vascular en un paciente que necesita dicha terapia.

52. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la angiogénesis en un paciente que necesita dicha terapia.

53. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la endotelización en cirugía de injertos vasculares en un paciente.

54. La utilización según la reivindicación 53, en la que dicha endotelización estimula la vascularización.

55. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una composición farmacéutica para terapia génica en un paciente que necesita estimular la endotelización.

56. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización de heridas, para estimular el crecimiento de huesos dañados, para estimular el crecimiento de tejidos dañados o para estimular la endotelización.

57. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 53, 55 y 56, en la que dicha endotelización da lugar a angiogénesis.

58. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente con necesidad de ésta, en la que dicho paciente tiene isquemia, ha tenido un infarto de miocardio, ha sido sometido a cirugía de bypass coronario o requiere la revascularización de tejidos dañados.

59. Utilización del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente, en la que dicho paciente requiere el crecimiento del tejido óseo, peridontio y/o de ligamentos.

60. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 y 57 a 59, en la que dicho paciente es un ser humano.

61. Una composición para diagnóstico que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39 y/o un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35.

62. Un método para detectar la presencia de un tumor en un individuo que comprende la etapa de detectar el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 mediante un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39 en una muestra de sangre de dicho individuo.