ES2339430T3 - Agentes antitumorales y procedimiento de produccion de los mismos. - Google Patents

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Abstract

Agente anticanceroso que comprende como ingrediente activo una derivado de metaloporfirina inhibidor de la hemooxigenasa que contiene un átomo de metal quelado con la porfirina y que está modificado con un polímero, que se caracteriza porque el polímero modificador es un copolímero de estireno-ácido maleico.

Description

Agentes antitumorales y procedimiento de producción de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a agentes anticancerosos con pocos efectos secundarios y excelente acumulación tumoral, de modo que exhiban un efecto anticanceroso muy potente y al procedimiento de preparación de los mismos. Más exactamente se refiere a agentes anticancerosos que contienen como ingrediente activo derivados de la metaloporfirina inhibidores de la hemooxigenasa que están conjugados con polímeros antipáticos o hidrosolubles y a un procedimiento para prepararlos con eficiencia elevada.
Antecedentes de la tecnología
Los inventores de la presente invención han investigador la relación entre el crecimiento del cáncer o su supresión y la actividad de la hemooxigenasa, y han encontrado que la hemooxigenasa está muy expresada en los tejidos tumorales. La hemooxigenasa, degrada el grupo hemo y produce biliverdina, monóxido de carbono y hierro libre en los tejidos tumorales o normales.
La biliverdina se convierte fácilmente en bilirrubina en las células y esta bilirrubina es un antioxidante muy potente. De este modo, la bilirrubina puede ser una molécula de defensa contra el oxígeno activo, tal como peróxido, H_{2}O_{2} u óxido nítrico etc., que se generan en los leucocitos de los huéspedes (pacientes de cáncer). A saber, la bilirrubina generada de este modo anulará la potencia de defensa oxidativa tóxica contra las células cancerosas o los microbios infecciosos del huésped. Por tanto, si se bloquea la hemooxigenasa, no habrá bilirrubina disponible y las moléculas oxidativas generadas por los leucocitos como resultado de un estado de defensa innata matarán las células tumorales.
Los inventores han intentado ver el efecto antitumoral de la protoporfirina de cinc (ZnPP), un inhibidor de la hemooxigenasa, administrado en la arteria que alimenta al tumor en ratas portadoras de tumores, de este modo se dirige al inhibidor en los loci tumorales de forma selectiva y, de hecho, confirmaron el efecto antitumoral en ratas (K. Doi y col. Br. J. Cancer 80, 1945-54, 1999).
En Chemical Abstracts, Vol. 124, 1996, nº de resumen 219685 Q, se desvela que la protoprofirina se modificaba con polietilenglicol y algunos metales, como el Zn, se introdujeron en su centro activo. Los derivados de protoporfirina inhibieron el crecimiento celular de las líneas de células metastásicas de pulmón en el melanoma murino.
El documento WO 91/18006 A describe una porfirina fluorescente usada como un componente marcador en el tratamiento tumoral. A este respecto también se mencionan restos solubilizantes unidos a la estructura del fluoróforo. Ejemplos de dichos restos solubilizantes son polietilenglicol y sus derivados.
A partir del documento DE 2645079 se conocen complejos metálicos poliméricos solubles con un ion metálico en su centro, siendo el metal, por ejemplo, hierro, cobalto, manganeso y cobre. Como ejemplo de la estructura básica del complejo se mencionan las porfirinas. La porfirina se puede combinar con polímeros hidrosolubles como polietilenglicol.
En el British Journal of Cancer, Vol. 80, Nº 12 (1999), páginas 1945 a 1954, se describe el efecto de un tratamiento inhibidor de la hemooxigenasa sobre el crecimiento tumoral mediante el uso de protoprofirina.
El documento WO 91/14456 A desvela composiciones para terapia fotodinámica de células cancerosas. Se usan fotosensibilizadores de tipo porfirina con polímeros hidrófilos. Un polímero particularmente hidrófilo es el alcohol polivinílico, opcionalmente como copolímero con polietilenglicol.
El documento EP 0232857 A2 desvela una hemina modificada unida a éter monometílico de polietilenglicol a través de un enlace de amida ácida.
El documento EP 052723 A2 describe tetraazaporfirinas hidrosolubles en las que el átomo metálico central es, por ejemplo, cinc. Los compuestos pueden también contener, por ejemplo, residuos de polietilenglicol, poliéter, poliamina o polialcohol.
El documento EP 0641796 A1 se refiere a hidromonobenzoporfirinas citotóxicas a usar para tratar células de tumores no sólidos. Los compuestos pueden contener restos de polímeros, como poliaminas, poliéteres y alcoholes de poliamina, así como iones metálicos en forma de complejo, como iones de cinc.
No obstante, hay varios problemas derivados del uso de ZnPP por sí mismo como agente antitumoral. En primer lugar, es caso insoluble en agua por sí solo, por tanto, se debe usar una formulación oleosa para solubilizar el ZnPP y tal agente oleoso formulado sólo se puede inyectar a través de la arteria que alimenta al tumor, y esto es demasiado trabajoso y se requiere gran experiencia para realizar este procedimiento en comparación con las inyecciones habituales intravenosas o subcutáneas. En segundo lugar, el ZnPP nativo u original no garantiza la acumulación selectiva de ZnPP en los tejidos cancerosos y que ejerza un efecto anticanceroso selectivo, mientras que el fármaco se distribuirá ampliamente por todo el cuerpo además de en el tumor. Por tanto, es preocupante la aparición de efectos secundarios inesperados.
Por el contrario, los inventores son expertos en biología tumoral, en particular han estudiado la permeabilidad vascular de los tejidos de tumores sólidos y saben que las terapéuticas macromoleculares atravesarían de un modo más selectivo en el tejido tumoral en virtud del carácter anatómico único y del efecto de múltiples factores de permeabilidad vascular; y, además, dichas macromoléculas quedan retenidas en los tejidos tumorales durante periodos prolon-
gados.
Por tanto, este fenómeno se acuñó como "efecto de permeabilidad y retención potenciadas (EPR)" (Y. Matsumura, H. Maeda: Cancer Res. 47: 6387-92, 1986; H. Maeda: En Advances in Enzyme Regulation (de G. Weber ed), Elsevier Scientific Ltd., Amsterdam, 41, 189-207, 2001).
De acuerdo con el efecto EPR, los fármacos con un tamaño molecular superior a 40.000 exhiben una elevada concentración plasmática durante un tiempo prolongado, por ejemplo de varias horas a días tras la inyección intravenosa, mientras que una concentración intratumoral tendrá como resultado un tiempo múltiple, más precisamente en 24-48 horas. Esto significa que, el incremento del tamaño aparente del fármaco a más de 40.000 posibilitaría dirigir de forma selectiva dichos fármacos macromoleculares a los tumores.
Entretanto se estudiaron varios derivados de porfirina metálica que tienen actividad inhibidora contra la hemooxigenasa y mejores procedimientos de su administración como un todo. El resultado es que un polímero antipático o hidrosoluble conjugado con las protoporfirinas metálicas hace posible proporcionar derivados hidrosolubles de porfirina metálica y se pueden administrar no sólo por vía arterial sino también por vía intravenosa, que tiene usos clínicos más versátiles y fáciles. Exhiben un efecto de EPR mediante conjugación polimérica, lo que da una acumulación altamente eficiente en los tumores y se conserva una actividad inhibidora enzimática contra la hemooxigenasa durante periodos prolongados. Como resultado, sólo de 2 a 3 veces las inyecciones hace posible suprimir el crecimiento tumoral completamente en ratones, lo que es un resultado notable.
Anteriormente, los derivados de porfirina metálica que poseen actividad inhibidora de la hemooxigenasa con una conjugación polimérica antipática o hidrosoluble no se comunicaron nunca, ni lo fue el procedimiento de su preparación antes. Los inventores han desarrollado el procedimiento para la síntesis de una cierta conjugación de polímero anfipático o hidrosoluble de metaloporfirina mediante un enlace amida tal como se especifica en las reivindicaciones. Los derivados de metaloporfirina conjugados con polímero resultantes son compuestos nuevos y no se han comunicado anteriormente.
Divulgación de la invención
La presente invención está dirigida a agentes anticancerosos que contienen como ingrediente activo derivados de metaloporfirina que tienen una actividad inhibidora contra la hemooxigenasa, especialmente Zn-protoporfirina (ZnPP) conjugada con polímeros antipáticos que son hidrosolubles y liposolubles o polímeros hidrosolubles tal como se especifica en las reivindicaciones.
La presente invención también está dirigida a una serie de nuevos compuestos útiles como ingredientes de agentes anticancerosos en los que los polímeros antipáticos o hidrosolubles y derivados de metaloporfirina inhibidores de la hemooxigenasa están conjugados mediante enlaces amida y a un procedimiento de preparación de los compuestos tal como se especifica en las reivindicaciones.
Breves explicaciones de las figuras
La figura 1 muestra la cromatografía de filtración en gel de diaminoetano acoplado con protoporfirina y protoporfirina conjugada con PEG.
La figura 2 muestra un gráfico de Lineweaver-Burk de perfil inhibidor de PEG-ZnPP contra la hemooxigenasa.
La figura 3 muestra datos de análisis por citometría de flujo en los que las células cancerosas cultivadas tratadas con PEG-ZnPP exhiben un perfil de exposición más oxidante.
La figura 4 muestra un efecto antitumoral de PDG-ZnPP en un modelo de ratón con un tumor sólido.
La figura 5 muestra el perfil de cambio del peso corporal durante o después de la administración intravenosa de PEG-ZnPP.
Forma de realización más preferible para llevar a cabo la invención
Entre los polímeros antipáticos o hidrosolubles a conjugar se incluyen polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG), polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico (PVA), varias gelatinas y sus derivados tales como formas succiniladas, ácidos poliamino (p. ej., ácido aspártico polimerizado, ácido glutámico, lisina, alanina, glicina, prolina, tirosina etc.), hidroxipropilo y otros polímeros de acrilato de alquilo, copolímeros de ácido maleico estireno (SMA) y sus derivados. Entre estos polímeros con características antipáticas e hidrosolubles, el PEG y el SMA son más preferibles. Preferentemente se usa PEG con peso molecular de 2000-5000.
El SMA es un copolímero de estireno y ácido maleico en el orden alternativo en el que el grupo carboxilo del ácido maleico se puede utilizar para conjugar con metaloporfirina directa o indirectamente. El SMA se puede usar como tal o como sus derivados en los que el ácido maleico está parcialmente esterificado.
El derivado de porfirina metálica es un compuesto de porfirina complejo, en el que el metal está quelado en coordinación estable con el anillo de porfirina y, preferentemente, se usa la protoporfirina por su fácil disponibilidad entre los compuestos de porfirina.
Entre los metales que se han de coordinar, no se puede usar hierro que no proporciona acción inhibidora de la hemooxigenasa, mercurio con una naturaleza tóxica y metales monovalentes que no forman una quelación coordinada. No obstante, se pueden usar varios metales distintos a los anteriores, tal como cinc, estaño, cobalto y cobre. Entre ellos son más preferidos los complejos de estaño y de cinc. No obstante, se sabe que el estaño es también tóxico. Por tanto, es más preferible en ZnPP y su estructura química se muestra en la fórmula B.
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Los agentes anticancerosos de la presente invención son cualquier compuesto macromolecular obtenido mediante conjugación de una porfirina metálica con polímeros antipáticos o hidrosolubles tal como se especifica en las reivindicaciones. No obstante, los inventores han encontrado que es difícil realizar la conjugación de los polímeros con la porfirina metálica directamente porque un derivado de porfirina metálica es insoluble en agua. Para llevar a cano esta conjugación química es preferible conjugar los polímeros con la porfirina antes de la coordinación del metal y, después, coordinar el metal.
La conjugación de la porfirina con el polímero se puede facilitar mediante la introducción de un grupo espaciador funcional deseado.
Por ejemplo, en la síntesis de ZnPP, el polímero se puede conjugar directamente con los dos grupos carboxilo en la protoporfirina, pero este procedimiento de conjugación directa no es ventajoso por la mala actividad de dichos grupos carboxilo para esta reacción. Los inventores de la presente invención estudiaron procedimientos de síntesis efectivos de ZnPP conjugado con PEG y tuvieron éxito en la síntesis de ZnPP conjugado con PEG mediante un enlace amida (fórmula A).
2 
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Aquí, R significa un polímero anfipático o hidrosoluble, y Me es un metal.
El polímero conjugado con ZnPP B puede sintetizarse mediante una reacción sucesiva del siguiente modo:
(1)
Introducción del grupo amino con la protoporfirina IX;
(2)
Conjugación del polímero, y, por último,
(3)
Coordinación de Zn en el anillo de porfirina.
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Por ejemplo, el esquema de la síntesis de ZnPP conjugado con PEG se muestra en un diagrama mediante reacciones escalonadas del siguiente modo.
[Reacción (a)] La protoporfirina IX (compuesto (1)) se activa con cloroformiato de etilo en tetrahidrofurano (compuesto (2)).
[Reacción (b)] La protoporfirina con el grupo diamino (compuesto (3)) se puede obtener mediante la adición de etilendiamina.
[Reacción (c)] Se introduce PEG en el anillo de protoporfirina mediante la adición de PEG activado (compuesto (4)).
[Reacción (d)]. Por último, se obtiene PEG-ZnPP (compuesto (5)) mediante la adición de acetato de cinc al producto de reacción de la Reacción (dd). Se puede sustituir Zn por estaño (Sn) y obtener PEG-Sn-PP mediante la adición de acetato de estaño.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Otros compuestos distintos al PEG, con polímeros antipáticos o hidrosolubles, tales como SMA, se pueden fijar a la protoporfirina de un modo similar mediante reacción de condensación del compuesto (3) y SMA.
La metaloprotoporfirina inhibidora de la hemooxigenasa, que está conjugada con polímeros antipáticos o hidrosolubles que se muestran en la fórmula A, se acumula de forma selectiva en los tumores sólidos y exhibe una actividad antitumoral excelente. Por tanto, es una nueva y útil sustancia antitumoral. El compuesto (5), que es un ejemplo típico del compuesto A, en el que el metal es cinc y R es PEG, se sintetizó mediante el esquema (a) a (d). La estructura química del producto de reacción se confirmó mediante el análisis siguiente.
En primer lugar, la evidencia del grupo amino de la etilendiamina que se introdujo en la protoporfirina (compuesto (3)) se confirma mediante:
(1)
El espectro infrarrojo con absorbancia a 1641 cm^{-1} y 1552 cm^{-1} mostró una formación nueva del enlace amida e el compuesto (estructura del compuesto (3)).
(2)
La determinación del peso molecular del compuesto mediante espectroscopia de masas (EM) mostró 646, idéntico al valor calculado por la fórmula basada en el compuesto (3)).
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Después, se acopló el PEG (PM de aproximadamente 5000) al grupo amino introducido en la protoporfirina (compuesto (3)) y se quela el cinc. La estructura del ZnPP obtenido de este modo se identificó mediante la determinación del peso molecular y los espectros de absorción (UV/Vis).
La determinación del peso molecular mostró una masa de casi 11.000 Da mediante TOF/EM (tiempo de vuelo-espectroscopia de masas). La absorción en UV mostró un pico máximo en 425, 543 y 583, que en la fórmula (5) se indica que es PEG-ZnPP.
El esquema de la síntesis de PEG-ZnPP usando protoporfirina IX como material de partida mediante las etapas de reacción [a]-[d] es un nuevo procedimiento de fabricación.
La metaloporfirina conjugada con polímero obtenida es fácilmente hidrosoluble y puede usarse como solución de inyección bien por vía intravenosa o arterial.
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Ejemplos
El procedimiento para preparar el PEG-ZnPP, la actividad inhibidora del PEG-ZnPP hacia la hemooxigenasa y el efecto anticanceroso del PEG-ZnPP mediante inyección intravenosa de acuerdo con la presente invención se explicará con detalle con los ejemplos siguientes.
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Ejemplo de fabricación
Síntesis de ZnPP conjugado con polietilenglicol (PEG-ZnPP)
Se disolvieron 100 mg de protoporfirina IX en 20 ml de tetrahidrofurano y a esta solución se añadieron 2,45 ml de trietilamina. Esta solución se conservó a aproximadamente 0ºC en hielo, después, a esto se añadieron 1,7 ml de cloroformiato de etilo gota a gota y en agitación, y se dejó reaccionar durante dos horas. Posteriormente la sal de HCl trietilamina formada se eliminó mediante filtración y se añadieron 1,2 ml de etilendiamina y la reacción continuó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se sometió después a evaporación al vacío para eliminar el tetrahidrofurano y el material sólido obtenido se lavó 7 veces con 50 ml de agua destilada, lo que da 60 mg de derivado de porfirina que tiene dos grupos amino por molécula (reacción a y b).
Se disolvieron cinco mg del compuesto (3) en 25 ml de cloroformo y a esta solución se añadieron 800 mg de succinimidoéster de polietilenglicol (Shearwater; PEG, PM 5000) y se hicieron reaccionar durante 24 horas en agitación a temperatura ambiente [reacción c].
La protoporfirina conjugada con PEG obtenida de este modo se sometió a cromatografía por filtración en gel en Sephadex LH60 usando cloroformo como eluyente. El resultado de la cromatografía por filtración en gel mostró que el compuesto aminado sin reaccionar (3) no existía en la preparación de protoporfirina conjugada con PEG en absoluto. Mostró que toda la protoporfirina aminada reaccionaba con PEG para formar la forma polimérica de protoporfirina. La protoporfirina sin modificar, en caso de que existiera algo, se eluyó en la fracción nº 20, en la que el volumen de elución fue similar al de la protoporfirina aminada.
A la solución de PEG-PP se añadieron 40 mg de acetato de cinc y se dejó durante dos horas a temperatura ambiente, lo que da protoporfirina de cinc conjugada con PEG (PEG-ZnPP) (reacción d).
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Ejemplo experimental 1
Actividad inhibidora de PEG-ZnPP contra la hemooxidasa
Esto se examinó usando la fracción de hemooxigenasa purificada derivada de bazo de rata. Se analizó a 37ºC en presencia de hemina, el sustrato de la hemooxigenasa, cofactor (NADPH, nicotinadenina dinucleótido) y la fracción citosólica que contenía bilirrubina reductasa, en la que la biliverdina formada por la oxigenasa se convierte en bilirrubina.
La bilirrubina se extrajo con cloroformo y se cuantificó mediante absorción a 465 nm. Mediante la adición de PE-ZnPP, o ZnPP, o sin inhibidor, se analizó su efecto sobre la hemooxidasa y el gráfico de Lineweaver-Burk de la actividad de la hemooxigenasa se representó durante la inhibición por PEG-ZnPP-El resultado se muestra en la figura 2, lo que indica que PEG-ZnPP inhibe la hemooxigenasa de un modo dependiente de la dosis y la constante de inhibición (Ki) fue de 0,13 \muM. El modo de inhibición fue competitivo y el valor era equivalente al del ZnPP sin modificar (Ki = 0,12 \muM).
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Ejemplo experimental 2
Efecto de PEG-ZnPP sobre las células tumorales cultivadas
La línea de células de adenocarcinoma pulmonar A549 se sembró en una placa de plástico y, después de un cultivo durante la noche, a las placas de cultivo se añadieron 5 \muM y 10 \muM de PEG-ZnPP disuelto en agua destilada. Después, 8 horas después del cultivo a 37ºC, se añadió un reactivo que cuantifica la tensión oxidativa, denominado éster diacetílico de diclorohidrofluoresceína (DCDHF) y se siguió de cultivo celular durante 30 minutos. En tensión oxidativa, este DCDHF se oxidará y brillará debido a la tensión oxidativa generada por la formación de fluoresceína en las células.
La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia representa la extensión de la tensión oxidativa inducida en las células. Después, las células cultivadas se tripsinizaron y las células recuperadas se sometieron a análisis por citometría de flujo y se cuantificó la población de células con fluorescencia. Los resultados se muestran en la figura 3, en la que el efecto de PEG-ZnPP a 5 \muM, 10 \muM se compara con el de la ausencia de fármaco. A partir de estos datos de la figura 3 queda claro que el PEG-ZnPP provoca un estado oxidativo intracelular mayor de forma dependiente de la dosis de PEG-ZnPP.
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Ejemplo experimental 3
Inhibición de la hemooxigenasa en el modelo de tumor sólido en ratones
En ratones ddY macho con un peso corporal medio de 35 g se implantaron células de sarcoma S180 en la piel del dorso y cuando el tamaño del tumor sólido llega a 5 mm de diámetro transversal tras aproximadamente una semana, el PEG-ZnPP disuelto en agua destilada se inyectó a través de la vena de la cola (IV) a 0,5 mg de ZnPP equivalente por kg de peso corporal. Los tumores sólidos se extrajeron tras 24 horas y la actividad hemooxigenasa se cuantificó de un modo similar tal como se describe en el ejemplo 1. Un ratón control recibió agua destilada sin PEG-ZnPP. Las muestras de tumor se obtuvieron y trataron de forma similar. Como se muestra en la tabla 1, el PEG-ZnPP administrado IV (cola) mostró una reducción significativa de la actividad hemooxigenasa. El ZnPP no modificado no se pudo administrar IV por su dificultad para solubilizarse.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
4
Experimento 4
Efecto antitumoral de PEG-ZnPP y cambio de peso corporal en ratones portadores de tumor sólido
De un modo similar al experimento 3 anterior, con sarcoma S180 de ratones implantados bajo la piel del dorso de ratones ddY, y tras 10, 13 y 15 días después de la implantación del tumor, se inyectó PEG-ZnPP a 30 nmol, 30 nmol y 50 nmol (sólo 3 veces), respectivamente, en la vena de la cola respectivamente (véase también las marcas de flecha en la figura 4). Los ratones control recibieron agua destilada en lugar de PEG-ZnPP. Los tamaños de los tumores se midieron cada día de la semana como se muestra en la figura 4. Queda claro que el grupo que recibió PEG-ZnPP mostró una considerable supresión del crecimiento tumoral en comparación con el grupo control.
El peso corporal de los ratones tratados y no tratados se midió de forma simultánea como se ve en la figura 5. No se observó ninguna pérdida considerable de peso corporal en el grupo tratado con PEG-ZnPP.
Aplicabilidad de la invención en el sentido industrial
De acuerdo con la presente invención, los derivados de porfirina metálica que son inhibidores contra la hemooxigenasa se pueden hacer tanto hidrosolubles como liposolubles. Hacen que los derivados se conviertan en un medicamento inyectable por vía intravenosa mediante conjugación con polímeros antipáticos o hidrosolubles. Este es un medicamento nuevo que tiene una acumulación selectiva tumoral excelente. También se encontró un procedimiento efectivo para la preparación de este compuesto.
Los agentes anticancerosos de acuerdo con la presente invención tienen un excelente efecto anticanceroso sin generar ningún efecto secundario o toxicidad apreciables.
Por tanto, los agentes anticancerosos conjugados con polímero de acuerdo con la presente invención son fármacos altamente útiles que tienen una excelente propiedad selectiva dirigida al tumor con un nuevo modo de acción diferente de muchos de los fármacos anticancerosos conocidos de bajo peso molecular.

Claims (4)

1. Agente anticanceroso que comprende como ingrediente activo una derivado de metaloporfirina inhibidor de la hemooxigenasa que contiene un átomo de metal quelado con la porfirina y que está modificado con un polímero, que se caracteriza porque el polímero modificador es un copolímero de estireno-ácido maleico.
2. Agente anticanceroso que contiene como ingrediente activo una derivado de metaloporfirina inhibidor de la hemooxigenasa que contiene un átomo de metal quelado con la porfirina y que está modificado con un polímero, que se caracteriza por la fórmula general (A).
5
en la que R significa un polímero anfipático o hidrosoluble, y Me es un átomo de metal.
3. Agente anticanceroso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque el átomo de metal es cinc o estaño.
4. Procedimiento para preparar un derivado de metaloporfirina inhibidor de la hemooxigenasa tal como se ha definido en la reivindicación 3, que se caracteriza por las etapas siguientes:
(a) Activar una protoporfirina de fórmula (1), que es protoporfirina IX,
6
con cloroformiato de etilo en tetrahidrofurano para obtener la protoporfirina activada de fórmula (2).
7
en la que Et significa el grupo etilo,
(b) añadir etilendiamina al compuesto de fórmula (2) para obtener una protoporfirina de fórmula (3),
8
(c) introducir polietilenglicol en el anillo de la protoporfirina mediante la adición de polietilenglicol activado a la protoporfirina de fórmula (3) para obtener un compuesto de fórmula (4),
9
en la que PEG significa un resto de polietilenglicol, y
(d) añadir acetato de cinc al compuesto de fórmula (4) para obtener un compuesto de fórmula (5)
10
en la que PEG es como se ha definido en lo que antecede.
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