ES2339907T3 - Metodo de determinacion de beta-(d)-glucano. - Google Patents

Metodo de determinacion de beta-(d)-glucano. Download PDF

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Abstract

CON EL OBJETIVO DE MEJORAR LA PRECISION Y REPRODUCTIBILIDAD DE LA MEDIDA DE GLUCANO-{BE} MEDIANTE UN METODO DE INYECCION DE CORRIENTE QUE UTILIZA UN CALCOFLUOR, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN METODO EN EL QUE SE COLOCA, ENTRE EL PUERTO DE INYECCION DE LA MUESTRA Y EL DETECTOR DE ESTE SISTEMA, UNA COLUMNA DE FILTRADO DE UN GEL QUE TIENE UN VOLUMEN DE INTERSTICIO EXTERIOR DE LAS PARTICULAS DEL GEL QUE NO SUPERA EL DE VOLUMEN DE LOS EFLUENTES DE LA COLUMNA EN UN CIERTO PERIODO DE TIEMPO, Y UN VOLUMEN DEL CONTENIDO DE LA COLUMNA EL CUAL ES 10 VECES O MAS EL TAMAÑO DEL VOLUMEN DE LA INYECCION DE LA MUESTRA.

Description

Método de determinación de \beta-(D)-glucano.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a un método para medir \beta-(1,3)(1,4)-D-glucano (a continuación en el presente documento denominado \beta-glucano) y, más precisamente, a un método para medir el \beta-glucano que está en diversos cereales tales como cebada, etc., y en malta, mosto, cerveza, etc.
Antecedentes de la técnica
El calcoflúor, que se representa mediante la siguiente fórmula estructural, es un compuesto fluorescente que se une específicamente a \beta-glucano para tener un mayor grado de intensidad de fluorescencia debido a la unión. Jørgensen et al. de Carlsberg Co. en Dinamarca han notificado un método de inyección en flujo usando este compuesto (Carlsberg Res. Commun., vol. 53, págs. 277-285, 1998; Analytica-EBC, 3.11.2).
1
Algunos otros investigadores también han notificado un método de inyección en flujo que usa calcoflúor basándose en el mismo principio (Journal of the Institute of Brewing, vol. 95, pág. 327, 1989; Journal of the Institute of Brewing, vol. 93, pág. 396, 1987). Recientemente, Tecator Co. en Suecia y Fiatron Co. en EE.UU han comercializado un sistema de inyección en flujo comercial que usa calcoflúor (Journal of American Society of Brewing Chemists, vol. 93, pág. 396, 1987).
Éstos son todos sistemas aplicados a partir del sistema mostrado en la figura 1 o la figura 2, en el que un flujo de una muestra o una disolución que contiene una muestra se mezcla con un flujo de una disolución de reactivo preparada disolviendo 8~35 mg/litro de calcoflúor en un tampón de tris o glicina (pH de 8 a 10) mediante el cual el calcoflúor se une al \beta-glucano en la muestra, usando un tubo adecuado, y el aumento en la intensidad de fluorescencia del compuesto así unido se mide usando un detector de fluorescencia.
Para determinar el contenido en \beta-glucano en la muestra tal como mosto, cerveza, etc. mediante estos métodos, se usa como patrón una disolución que contiene una concentración conocida de \beta-glucano purificado extraído de cebada.
Sin embargo, se notificó que tales métodos de inyección en flujo convencionales que usan calcoflúor implican fluctuación de los valores medidos debido a los efectos de los azúcares en el mosto de muestra o del etanol en la cerveza, que también varían dependiendo de las condiciones de medición tales como volumen de inyección de muestra y volumen vacío de la zona de mezclado, dando como resultado una variación en el contenido en \beta-glucano incluso en una muestra idéntica.
Además, recientemente se encontró que los componentes de menor peso molecular (sacáridos, etanol, etc.), que tienen un efecto inhibidor sobre la reacción de fluorescencia del calcoflúor, están presentes en el mosto o la cerveza, y se encontró que los contenidos de tales componentes en el mosto o la cerveza varían dependiendo de la especie y la cantidad de las maltas empleadas.
Es obvio que las sustancias mencionadas anteriormente, que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor tales como sacáridos, etanol, etc., provocan errores en la medición del contenido en \beta-glucano en el mosto o la cerveza, mediante los métodos de inyección en flujo convencionales que usan calcoflúor.
Por consiguiente, es esencial establecer un sistema que no pueda verse afectado por sacáridos, etanol y sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor en una muestra que va a medirse con el fin de mejorar la precisión de la medición de \beta-glucano, y se desea que se desarrolle tal sistema.
Por tanto, un objetivo de la presente invención es mejorar la precisión y reproducibilidad de la medición de \beta-glucano mediante los métodos de inyección en flujo que usan calcoflúor, por medio del establecimiento del sistema y la condición de medición en los que se emplea una columna de filtración en gel corta, para permitir que el \beta-glucano de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, se haga pasar a través sin que se retenga en el soporte de columna, mientras que los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor, se retienen por las partículas de gel, como soporte de columna, durante un periodo de varios segundos a varias decenas de segundos, por lo que se logra la elución a medida que se separa del \beta-glucano.
Además, otro objetivo en la presente invención es la optimización del tamaño de columna para lograr un tiempo de análisis equivalente a aquél en el análisis sin tal columna (varios minutos (preferiblemente 3 minutos) o más corto).
Un método para medir \beta-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor según la presente invención emplea un método en el que se hace pasar un flujo de muestra a través de una columna de filtración en gel, mediante el cual es posible que tras inyectar la muestra en el flujo de un eluente, un objetivo de análisis, concretamente, \beta-glucano de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, se eluya en el plazo de 1 minuto, mientras que se retarda la elución de los componentes de bajo peso molecular tales como maltosa, etanol y sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor, en relación con la elución del \beta-glucano de alto peso molecular, separando de ese modo el \beta-glucano de los componentes que provocan una fluctuación de los valores medidos, y la muestra que se hizo pasar así a través de la columna se midió entonces mediante un detector de fluorescencia.
Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención es un método para medir \beta-glucano en el que se coloca una columna de filtración en gel entre el orificio de inyección de muestra y el detector en el sistema, caracterizándose dicha columna porque el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel (volumen inicial) no es mayor que el volumen del fluido eluido de la columna en el plazo de 1 minuto a la velocidad de flujo empleada, y el volumen de contenido de la columna (el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel más el volumen del disolvente dentro de las partículas de gel (volumen interno)) que corresponde al volumen del eluente con el que se eluye de la columna la sustancia de bajo peso molecular que migra a la red de las partículas de gel, es 10 veces o más, mayor que el volumen de inyección de muestra, logrando de ese modo que el \beta-glucano de alto peso molecular objetivo de análisis no migre a la red de las partículas de gel, sino pueda eluirse fácilmente de la columna cuando se hace pasar el eluente, en el volumen igual al volumen total del intersticio de las partículas de gel, a través del intersticio de las partículas de gel.
Cuando el volumen de contenido de la columna mencionado anteriormente es menor que el volumen de inyección de muestra, no puede lograrse una separación satisfactoria entre el \beta-glucano de alto peso molecular, que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, y los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor.
Descripción de la invención
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para medir \beta-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor, según la reivindicación 1.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un sistema convencional para medir el contenido en \beta-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.
La figura 2 muestra otro sistema convencional para medir el contenido en \beta-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.
La figura 3 muestra un sistema que emplea una columna de filtración en gel para medir el contenido en \beta-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.
La figura 4 muestra otro sistema que emplea una columna de filtración en gel para medir el contenido en \beta-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.
La figura 5 muestra los efectos del volumen vacío en la zona de reacción en el método según la presente invención.
La figura 6 muestra los efectos del volumen de inyección de muestra en el método según la presente invención.
Tal como se muestra en las figuras, se proporcionan en el sistema un fluido de reacción de calcoflúor 1, una bomba 2, un inyector de muestra 3, una zona de reacción 4, un integrador 5 (para el procesamiento de datos, tal como cuantificación de las señales detectadas), un detector de fluorescencia 6, un fluido de desecho 7, un tampón o agua destilada 8 y una columna de filtración en gel 9.
Mejor modo para poner en práctica la invención
El método según la presente invención emplea el sistema mostrado en la figura 3 y figura 4, al que pueden aplicarse sistemas convencionales mostrados en la figura 1 y figura 2 tal cual.
En el método para medir según la presente invención, son críticos los tipos de partículas de gel y volumen de columna que van a usarse. Cuando se emplea una columna de filtración en gel para uso analítico empleada habitualmente, el tiempo de elución de muestra pasa a ser demasiado largo (el análisis requiere 30 minutos o más) como para ser adecuado para el método de inyección en flujo cuya ventaja es una medición en tiempo corto. Sin embargo, cuando se reduce excesivamente el volumen de la columna con el fin de reducir el tiempo de análisis, entonces la separación entre el \beta-glucano de alto peso molecular y la maltosa, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor puede pasar a ser insatisfactoria.
Cuando se retiene el \beta-glucano objetivo dentro de la partícula de gel y se eluye a medida que se separa por pesos moleculares (que se someten a tamiz molecular), la altura del pico varía dependiendo de la distribución de peso molecular del \beta-glucano en una muestra tal como mosto o cerveza y conduce a los valores medidos que también varían dependiendo de la distribución de peso molecular, que no son aceptables en vista del fin de la presente invención que es medir la cantidad total de \beta-glucano de alto peso molecular.
Por consiguiente, se requiere una columna de filtración en gel que pueda separar el \beta-glucano de alto peso molecular de los sacáridos, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor en el plazo de un periodo de tiempo corto y que permita que se eluya el \beta-glucano de alto peso molecular sin que se someta al efecto de tamiz molecular.
En la práctica, dado que en el método de inyección en flujo se requiere eluir el \beta-glucano de alto peso molecular rápidamente, se desea que el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel en la columna sea pequeño y se requiere que no sea mayor que el volumen del efluente que se eluye de la columna en el plazo de 1 minuto a la velocidad de flujo empleada, de modo que se permita que el \beta-glucano de alto peso molecular pase a través en 1 minuto.
Por otro lado, se considera que el volumen de contenido de la columna tras rellenar las partículas de gel debe ser 10 veces o más mayor que el volumen de inyección de muestra, con el fin de separar los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor (del \beta-glucano).
Por tanto, en los ejemplos descritos en la última parte de esta memoria descriptiva, el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel no es mayor que el volumen de efluente de la columna por 1 minuto, con el fin de completar la elución del \beta-glucano de alto peso molecular en el plazo de 1 minuto. Por tanto, el análisis por HPLC puede completarse en el plazo de 1 minuto.
También se requiere usar partículas de gel que tienen un peso molecular de exclusión limitante de 4.000 a 300.000 con el fin de separar el \beta-glucano de alto peso molecular de los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor sin someter el \beta-glucano de alto peso molecular objetivo al efecto de tamiz molecular.
Cuando se usa una partícula de gel que tiene un peso molecular de exclusión limitante que supera 300.000, el \beta-glucano de alto peso molecular en el mosto o la cerveza se somete al efecto de tamiz molecular y se retarda la elución, dando como resultado una pobre separación de los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan en la reacción de fluorescencia del calcoflúor. Cuando se usa una partícula de gel que tiene un peso molecular de exclusión limitante menor que 4.000, entonces la elución de los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor pasa a ser más temprana, dando como resultado una pobre separación del \beta-glucano.
Por los motivos descritos anteriormente, la presente invención emplea partículas de gel que tienen un peso molecular de exclusión limitante de 4.000 a 300.000, preferiblemente de aproximadamente 100.000. Ejemplos de tales partículas de gel son Shodex OHpak SB-803 HQ (nombre comercial, producido por SHOWA DENKO K.K) y Asahipak GS320 HQ (nombre comercial, producido por SHOWA DENKO K.K).
También en la realización de la presente invención, se emplea adecuadamente una columna que tiene un gran número de platos teóricos (índice del rendimiento de separación de la columna), y es preferible una columna que tiene un número de platos teóricos no menor que 10.000.
En el método según la presente invención, aunque un sistema en el que se usa una bomba tal como se muestra en la figura 3 también puede emplear la columna mencionada anteriormente, puede tener la desventaja de que el paso de calcoflúor o tampón para la reacción de fluorescencia del calcoflúor a través de la columna provoque una resolución reducida o un deterioro temprano de la columna. Por consiguiente, tal como se muestra en la figura 4, el sistema en el que el flujo para inyectar y transportar la muestra a la columna se proporciona independientemente del flujo para transportar calcoflúor y entonces tras atravesar la columna se efectúa la reacción de unión de \beta-glucano con calcoflúor es preferible.
La posición en la que se coloca la columna de filtración en gel en el sistema es algún lugar entre el orificio de inyección de muestra y el detector, preferiblemente entre el orificio de inyección de muestra y la zona de reacción de calcoflúor, en la que los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor en la muestra se separan del \beta-glucano, y después de esto la fracción que contiene \beta-glucano de alto peso molecular eluida antes se mezcla con el fluido de reacción de calcoflúor en la zona de reacción, detectando de ese modo el \beta-glucano de alto peso molecular.
En el método según la presente reivindicación, las sustancias que tienen efectos inhibidores, los sacáridos y el etanol descritos anteriormente, también se mezclan con calcoflúor tras la detección de \beta-glucano, y se transportan al detector. Aunque, pueden observarse picos negativos tras el pico de \beta-glucano cuando las sustancias que tienen efectos inhibidores están contenidas en gran cantidad, tales picos se enmascaran habitualmente por la asimetría del pico de \beta-glucano, que no presenta ningún pico aparente particular.
También puede ser posible que dado que las sustancias que tienen efectos inhibidores presentan picos negativos, y la maltosa y el etanol presentan picos positivos, no haya un pico aparente como resultado de compensar unos con otros.
Como un fluido (disolvente) para el flujo en el que se transfiere una muestra a la columna de filtración en gel, se emplea cualquiera de aquéllos que no provocan deterioro de la columna y no tienen efectos sobre la posterior reacción del calcoflúor con \beta-glucano, y normalmente agua destilada.
Cuando se instala una columna de filtración en gel en un dispositivo que emplea un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor, se requiere mantener la atmósfera de la medición (el ambiente en el que se realiza la medición) a una temperatura constante, habitualmente dentro del intervalo de desde 10 hasta 40ºC, preferiblemente dentro de 15 a 30ºC.
El motivo para el requisito de la temperatura mencionado anteriormente, tal como se explica también en la última parte de esta memoria descriptiva, es que si se cambia la temperatura atmosférica durante la medición, se cambia el valor medido de \beta-glucano debido a la variación en la rendimiento de resolución de la columna y en la reactividad del \beta-glucano de bajo peso molecular contenido en la muestra con calcoflúor en respuesta a la variación en la temperatura atmosférica.
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Ejemplos
La presente invención se ilustra además más específicamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos.
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Ejemplo 1
En este ejemplo se empleó el sistema mostrado en la figura 4. Se usó agua destilada como disolvente que fluye a través de la columna, y se usó una disolución tampón de glicina 0,1 M - NaOH (pH 9,2) que contiene calcoflúor 20 mg/l, y Tritón X 100 mg/l como fluido que va a mezclarse con la muestra tras atravesar la columna, ambos a la velocidad de flujo de 2 ml/min. La longitud de onda de excitación del detector empleada era de 360 nm y la longitud de onda de emisión del mismo era de 420 nm. Puede emplearse tampón de Tris 0,1 M - HCl (pH 8,2) en vez de tampón de glicina 0,1 M de - NaOH.
Se construyó la zona de reacción con un tubo de teflón que tiene el diámetro interno de 0,5 mm y el volumen vacío de 0,5 ml. La columna que tiene el diámetro interno de 6,0 mm y la longitud de 50 mm se rellenó con partículas de gel "Shodex OHpak SB-803HQ" producido por SHOWA DENKO K.K. (peso molecular de exclusión limitante: 100.000) (volumen del intersticio fuera de las partículas de gel: 0,5 ml, volumen de contenido de la columna: 0,9 ml), a las que se les inyectaron 0,02 ml de la muestra.
Se prepararon las disoluciones patrón a partir de \beta-glucano extraído de cebada disolviendo en agua destilada a las concentraciones de 30 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l y 250 mg/l, y se preparó la curva de calibración a partir de la altura del pico de las disoluciones patrón medidas.
La muestra A se preparó añadiendo \beta-glucanasa a cerveza para descomponer el \beta-glucano en la cerveza, seguido de la inactivación de \beta-glucanasa mediante calentamiento para obtener una cerveza libre de \beta-glucano, seguido de la disolución de \beta-glucano de cebada a 100 mg/l en la cerveza libre de \beta-glucano, la muestra B se preparó disolviendo \beta-glucano de cebada a 100 mg/l en el mosto libre de \beta-glucano preparado de manera similar, la muestra C se preparó disolviendo \beta-glucano de cebada a 100 mg/l en disolución acuosa al 10% (v/v) de maltosa, y la muestra D se preparó disolviendo \beta-glucano de cebada a 100 mg/l en etanol acuoso al 5% (v/v). Se midió la altura de pico de cada muestra y se determinó el contenido en \beta-glucano en cada muestra haciendo referencia a la curva de calibración preparada tal como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 1. La temperatura atmosférica (temperatura alrededor del dispositivo) era de 20ºC.
TABLA 1 Efecto de la condición de medición sobre el contenido de glucano (ppm)
2 
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Ejemplo 2
Se emplearon mosto E y cerveza F como muestras, y se sometieron a medición de manera similar a como en el ejemplo 1 a temperaturas atmosféricas predeterminadas (la temperatura alrededor del dispositivo era de 18, 22 ó 25ºC) y se determinaron los contenidos en \beta-glucano en las muestras haciendo referencia a la curva de calibración preparada a partir de disoluciones patrón similares a aquéllas en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 2.
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TABLA 2 Cambio en el contenido en \beta-glucano (ppm) a temperatura atmosférica variable
3
Ejemplo 3
Se empleó mosto E y cerveza F como muestras de manera similar a como en el ejemplo 2, y se colocó todo el sistema en una cámara que se mantuvo a 20ºC. Por otra parte, se empleó la misma manera que en el ejemplo 1 para medir las alturas de los picos, a partir de los cuales se determinaron los contenidos en \beta-glucano en las muestras haciendo referencia a la curva de calibración preparada a partir de las disoluciones patrón similares a aquéllas en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 2.
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Ejemplo comparativo 1
A excepción del empleo del sistema mostrado en la figura 2 y la no instalación de la columna de filtración en gel, se midieron las alturas de los picos de las muestras A a D de manera similar a como en el ejemplo 1, y se determinaron los contenidos en \beta-glucano en la muestras haciendo referencia a la curva de calibración preparada a partir de las disoluciones patrón similares a aquéllas en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 1.
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Ejemplo comparativo 2
Excepto porque el volumen de inyección de muestra era de 0,1 ml, se midieron las alturas de los picos de las muestras A a D en el sistema y la condición similares a aquéllos en el ejemplo 1, y se determinaron los contenidos en \beta-glucano en las muestras haciendo referencia a la curva de calibración preparada a partir de las disoluciones patrón similares a aquéllas en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 1.
En este caso, el volumen de contenido de la columna era de 0,9 ml, que correspondió al volumen 9 veces o más mayor que el volumen de inyección de muestra.
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Ejemplo comparativo 3
A excepción del empleo de Shodex OHpak SB-804 HQ (peso molecular de exclusión limitante: 2.000.000) producido por SHOWA DENKO K.K. como partícula de filtración en gel, se midieron las alturas de los picos de las muestras A a D en el sistema y la condición similares a aquéllos en el ejemplo 1, y se determinaron los contenidos en \beta-glucano en las muestras haciendo referencia a la curva de calibración preparada a partir de las disoluciones patrón similares a aquéllas en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 1.
Como resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la tabla 1, los valores medidos en el ejemplo 1 fueron 100 mg/l o valores muy cercanos a éste, tal como se esperaba de manera teórica, mientras que los valores medidos en los ejemplos comparativos fueron menores o mayores que el valor teórico debido a la separación sin éxito e insatisfactoria de \beta-glucano de la maltosa, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor.
Por tanto, se indicó que usando una columna de filtración en gel que cumple ciertos requisitos, es posible separar el \beta-glucano de las sustancias de bajo peso molecular en la cerveza o el mosto que provocan fluctuación en los valores medidos así como los factores, y realizar mediciones más precisas.
También, como resulta evidente a partir del dispositivo y la condición en el ejemplo 1, era posible completar la medición de una muestra en el plazo de 1 minuto, y, considerando la etapa de inyección de muestra, se comprobó que el tiempo de medición no es diferente de aquél de un dispositivo convencional que sustancialmente no emplea columna.
Tal como se muestra en la tabla 2, manteniendo todo el dispositivo a una temperatura constante, pueden obtenerse valores medidos constantes independientemente de la temperatura ambiente, por lo que se logra una precisión más alta.
Por tanto, la temperatura atmosférica durante la medición debe ser constante. Además, la temperatura atmosférica debe ser la misma y constante cuando se repite la misma medición.
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Ejemplo 4
El experimento se realizó de manera similar a como en el ejemplo 1 excepto porque se empleó agua destilada como disolvente que fluye a través de la columna a la velocidad de flujo de 1 ml/min., calcoflúor como fluido que va a mezclarse tras atravesar la columna a la velocidad de flujo de 2 ml/min., se construyó la zona de reacción a partir de un tubo de teflón que tiene un diámetro interno de 0,5 mm cuyo volumen vacío se ha modificado a un valor predeterminado, y el volumen de inyección fue de 0,005 ml.
La medición se realizó con volumen vacío variable de la zona de reacción. Los resultados se muestran en la figura 5.
La ordenada en la figura representa el valor relativo en base al valor medido = 1 con el volumen vacío de la zona de reacción de 300 \mul. Como resulta evidente a partir de la figura, no se observó ninguna variación en el valor medido con el volumen vacío de 500 \mul o menor, posiblemente porque un tubo de mezclado más largo permite que una vez separado el \beta-glucano de alto peso molecular se combine de nuevo con el \beta-glucano de bajo peso molecular.
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Ejemplo 5
En la condición similar a aquélla en el ejemplo 4, se realizó la medición con el volumen vacío de 0,5 ml y el volumen de inyección de muestra variando desde 5 \mul hasta 80 \mul. Los resultados se muestran en la figura 6. La ordenada en la figura representa el valor relativo en base al valor medido = 1, con el volumen de inyección de muestra de 5 \mul. Como resulta evidente a partir de la figura, casi no se produjo ningún error cuando se aumentó el volumen de inyección de muestra hasta aproximadamente 80 \mul. Por tanto, limitando el volumen de inyección de muestra a 1/11 o menos en relación con 900 \mul del volumen de contenido de la columna (el volumen de contenido de la columna es 11 veces o más mayor que el volumen de inyección de muestra), casi no se observó fluctuación en el valor medido.
Posibilidad de utilización industrial
Según el método de la presente invención, puede determinarse el contenido en \beta-glucano en una muestra a una alta precisión y reproducibilidad sin que se vea afectado por sacáridos de bajo peso molecular tales como maltosa, etanol y sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor, todos contenidos en la muestra. Por tanto, puede compararse el contenido en \beta-glucano en una muestra tal como diversos cereales, extracto de malta, mosto y cerveza y evaluarse de manera fiable.

Claims (3)

1. Método para medir \beta-(1,3)(1,4)-D-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor, en el que una columna de filtración en gel (9), que tiene un volumen del intersticio fuera de las partículas de gel que no es mayor que el volumen de efluente de la columna en el plazo de 1 minuto a la velocidad de flujo empleada y un volumen de contenido de la columna que es 10 veces o más mayor que el volumen de inyección de muestra, se coloca entre el puerto de inyección de muestra (3) y el detector (6) en dicho sistema, en el que las partículas de gel tienen un peso molecular de exclusión limitante de 4.000 a 300.000, de modo que permite que el \beta-glucano de alto peso molecular atraviese la columna (9) en el plazo de 1 minuto sin que se retenga en las partículas de gel rellenadas en la columna (9), mientras que se retarda la elución de los componentes de bajo peso molecular.
2. Método para medir \beta-(1,3)(1,4)-D-glucano según la reivindicación 1, en el que agua destilada (8) a la que se ha inyectado una muestra, se hace pasar a través de la columna (9) y entonces se mezcla en un flujo de un fluido (1) que contiene calcoflúor y que tiene una composición adecuada para la reacción de fluorescencia del calcoflúor.
3. Método para medir \beta-(1,3)(1,4)-D-glucano según la reivindicación 1 ó 2, en el que se mantiene la zona alrededor del dispositivo durante la medición a una temperatura constante predeterminada.
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