JP3834332B2 - β−グルカンの測定方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカン（以下、β−グルカンと略記することがある。）の測定方法に関し、さらに詳しくは各種の大麦をはじめとする穀類や麦芽，麦汁，ビールなどに含まれるβ−グルカンを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
下記の構造式で表されるＣａｌｃｏｆｌｕｏｒは、β−グルカンと特異的に結合し、その結合により蛍光強度が増加する蛍光剤であり、この化合物を用いてβ−グルカンを定量するフローインジェクション法がデンマークのカールズベルグ社のヨルゲンセンらによって報告されている（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Vol.５３，p.２７７−２８５，１９８８；Ａｎａｌｙｔｉｃａ−ＥＢＣ，3.１１．2.）。
【０００３】
【化１】

【０００４】
また、同様の原理によるＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法が数名の研究者によって報告されており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Vol.９５，p.３２７，１９８９：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Vol.９３，p.３９６，１９８７）、
近年スウェーデンのＴｅｃａｔｏｒ社やアメリカのＦｉａｔｒｏｎ社（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Vol.９３，p.３９６，１９８７）によってＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクションシステムが市販されている。
【０００５】
これらはいずれも図１もしくは図２に見られる様なシステムを応用したものであり、ｐＨ１０からｐＨ８の範囲のトリス緩衝液もしくはグリシン緩衝液にＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを８〜３５ｍｇ／リットルとなるように溶解させた反応液の流液に試料を注入もしくは試料を注入した溶液の流液を混合し、適当なチューブを用いβ−グルカンと結合させ、蛍光検出器にてその蛍光強度の増加を測定するものである。
【０００６】
これらの方法により麦汁，ビール等のサンプル中のβ−グルカン含量を決定するにあたり、大麦より抽出した精製β−グルカンを溶解させた濃度既知の溶液を標準試料として用いている。
【０００７】
しかし、これまで報告されているＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法においてはサンプルである麦汁中の糖やビール中エタノールの影響により測定値が変化すること、また、それらの影響がサンプル注入量，混合部分の空寸体積量等の測定条件により異なり、同一のサンプルにおいてβ−グルカン含量の測定値が異なることが報告されている。
【０００８】
さらに、最近に至って麦汁やビール中にＣａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応を阻害する低分子成分（糖類，エタノール等）が存在することや、それらの麦汁，ビール中における含量が使用する麦芽の種類，量等によって異なることが明らかとなった。
【０００９】
これらの糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質といったものが、麦汁，ビール中のβ−グルカン含量を従来のＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法によって測定する上で誤差を生む要因となることは明らかである。
【００１０】
そのため、測定するサンプル中の糖やエタノール含量、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質等の影響を受けないシステムを構築することが精度の向上に有効であり、その開発が待たれている。
本発明の目的は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いるフローインジェクション法によるβ−グルカンの測定において、その精度と再現性の向上を図ることにあり、そのための手段として短いゲル濾過カラムを用いて分子量１万以上の高分子のβ−グルカンはカラム担体に保持させることなく素通りさせ、低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質等はカラム担体であるゲル粒子に数秒から数十秒保持させることにより、β−グルカンと分離溶出させるシステム並びに測定条件を設定することである。
【００１１】
また、使用するカラムの容量を最適化して、カラムを使用しない場合と同等の分析時間（数分（好ましくは３分）以内）で分析できるようにすることである。
【００１２】
本発明は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定法において、サンプルを流液に注入後、検出対象である分子量１万以上の高分子β−グルカンを所定時間以内（数分（好ましくは３分）以内）に溶出させ、かつマルトース，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質といった低分子成分の溶出を高分子のβ−グルカンよりも遅らせることが可能なゲル濾過カラムにサンプル流液を通し、目的とするβ−グルカンと測定値変動の要因となる成分を分離させ、そのカラム通過後に蛍光検出器にて測定するシステムである。
【００１３】
以上に述べたように、本発明は検出対象である高分子β−グルカンがゲル粒子の網目構造の内部に入り込むことなく、ゲル粒子間の空隙を経てゲル粒子間の空隙の全体積に等しい液量（ゲル粒子外部容積量あるいはボイド容量という）の溶媒を流した時に速やかにカラムから溶出するようゲル粒子外部容積量が所定時間内（数分以内（好ましくは３分以内））にカラムから溶出する液量以下の範囲であり、かつゲル粒子の網目構造の内部に入り込む低分子物質がカラムから溶出するまでの液量に対応するカラム内部容積量（ゲル粒子外部容積量とゲル粒子内溶媒容積とを合わせた量）がサンプル注入量の１０倍以上であるゲル濾過カラムを、システムのサンプルを注入する箇所より検出器までの間に配置することを特徴とするβ−グルカンの測定法である。
【００１４】
なお、サンプル注入量に対して上記カラム内部容積量が小さいと、分子量１万以上の高分子のβ−グルカンと低分子の糖、エタノール、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質との十分な分離が行えないことになる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定方法において、ゲル濾過カラムを、サンプルを流液に注入する箇所より検出器までの間に配置してなるフローインジェクションシステムに、β−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカンと低分子成分とを含むサンプルを注入し、β−グルカンを該カラムのゲル粒子に保持させることなく素通りさせて１分以内に溶出させ、低分子成分の溶出をβ−グルカンよりも遅らせること、および、該カラムが、
（ａ）ゲル粒子として、限界排除分子量３０万以下４千以上のものを使用し、
（ｂ）ゲル粒子外部容積量が１分以内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、かつ
（ｃ）カラム内部容積量がサンプル注入量の１０倍以上である
ことを特徴とするβ−グルカンの測定方法に関する。
【００１６】
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量の従来型測定システムの１例を示す。
図２は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション
法によるβ−グルカン含有量の従来型測定システムの他の例を示す。
図３は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量のゲル濾過カラム使用測定システムの１例を示す。
図４は、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量のゲル濾過カラム使用測定システムの他の例を示す。
図５は、本発明の方法における反応部分の空寸体積量の影響を示した図である。
図６は、本発明の方法におけるサンプル注入量の影響を示した図である。
図中、１はＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ反応液、２はポンプ、３はサンプル注入器、４は反応部分、５はインテグレータ（検出データの定量計算等のデータ処理を行う）、６は蛍光検出器、７は廃液、８は緩衝液もしくは蒸留水、９はゲル濾過カラムを示す。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、図３および図４に示される様なシステムからなり、図１および図２に示される様な従来用いられていたシステムをそのまま応用することが可能である。
【００１８】
本発明の測定方法における重要な点として、使用する担体粒子の種類，カラムの容積がある。通常、用いられている分析用のゲル濾過カラムを用いた場合、サンプルの溶出に時間がかかりすぎ（分析時間は３０分以上要する）、短時間での測定を特徴とするフローインジェクション法には不適切となる。しかし、逆に分析時間を短縮するためカラムの容積を大幅に減少させると、高分子β−グルカンとマルトース，エタノール、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質の低分子成分との分離が不十分になる恐れがある。
【００１９】
また、目的とするβ−グルカンが担体の粒子に保持され、分子量ごとに分離溶出した場合（分子ふるいがかかると言う）、麦汁，ビール等の試料中のβ−グルカンの分子量分布の違いによってピーク高さが変化し、測定値が分子量分布の影響を受けることになり、高分子β−グルカンの総量を測定するという本発明の目的に適合しなくなる。
【００２０】
したがって、短時間で高分子のβ−グルカンと糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質の低分子物質を分離することが可能で、かつ高分子β−グルカンを分子ふるいにかけることなく溶出できるゲル濾過カラムの要件が必要となる。
【００２１】
具体的にはフローインジェクション法として、高分子β−グルカンを早く溶出する必要があるため、使用するカラムのゲル粒子外部容積量は小さい方が望ましく、高分子β−グルカンを短時間で通過させるためには、所定時間にカラムより溶出される液量以下であることが必要である。
【００２２】
また、低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質を分離するためには、少なくともサンプル注入量の１０倍量以上のゲル粒子充填後のカラム内部容積量が必要と考えられる。
【００２３】
なお、後述する実施例では、高分子β−グルカンを１分以内で溶出させるようにするため、上記のゲル粒子外部容積量は１分当たりのカラム溶出液量以下としてある。すなわち、１分以内にＨＰＬＣで分析することができる。
【００２４】
次に、目的とする高分子β−グルカンを分子ふるいにかけることなく、高分子β−グルカンと低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質を分離するためには、限界排除分子量４千以上３０万以下の担体粒子を用いる必要があると考えられる。
【００２５】
限界排除分子量が３０万を超えるものを用いた場合、麦汁，ビール中の高分子β−グルカンが分子ふるい作用を受けるとともに、溶出が遅れるため、低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質との分離が不十分なものとなる。また、限界排除分子量が４千未満のものを用いた場合、逆に低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質の溶出が早くなるため、β−グルカンとの分離が不十分なものとなる。
【００２６】
以上の理由から、本発明では通常、限界排除分子量４千以上３０万以下の担体粒子を用いるが、特に限界排除分子量１０万前後のものが望ましい。このような条件を満たす担体粒子としては、例えばＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０３ ＨＱ（商品名、昭和電工株式会社製），Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ３２０ ＨＱ（商品名、昭和電工株式会社製）等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明を実施するには、理論段数（カラムの分離能を表す指標）の高いカラムが適しており、１万以上の理論段数を有するゲル濾過担体を用いることが望ましい。
【００２８】
本発明の方法を実施する場合、図３に示した様なポンプ１つを用いたシステムにおいても上記カラムを使用することできるが、ＣａｌｃｏｆｌｕｏｒおよびＣａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応に合わせた緩衝液をカラムに通すことによる分離能の低下やカラムの劣化が早い等の問題がある。それ故、図４に示すように、サンプルを注入しカラムに通す流液とＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを含む流液は別にし、カラム通過後、試料中のβ−グルカンとＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを反応、結合させるシステムとした方がより望ましいと考えられる。
【００２９】
また、該システム中にゲル濾過カラムを設置する位置は、サンプルを流液に注入する部位から検出器までであり、好ましくは該サンプル注入部位からＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ反応部位に至るまでの間に存在し、サンプル中の低分子の糖，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応阻害物質とβ−グルカンとが分離され、先に溶出してくる高分子β−グルカン含有流液とＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ反応液とが反応部分で混合され、高分子β−グルカンが検出される。
【００３０】
なお、本発明の方法では、β−グルカン検出後、前記阻害物質，糖，エタノールも同様にＣａｌｃｏｆｌｕｏｒと混合され、検出器を通り、前記阻害物質が多い場合には、β−グルカンのピークの後にマイナスピークが見受けられるが、通常はβ−グルカンのピークのテーリングに埋もれているため、特別なピークは見受けられない。
【００３１】
なお、前記阻害物質が負のピークを示すのに対し、マルトース，エタノールは正のピークを生じるため、両者が打ち消し合ってピークが表れないものと考えられる。
【００３２】
ゲル濾過カラムにサンプルを運ぶ流液（溶媒）としては、カラムを劣化させず次のＣａｌｃｏｆｌｕｏｒとβ−グルカンとの反応に影響を与えないものが望ましく、具体的には蒸留水等が考えられる。
【００３３】
Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いるフローインジェクション法による測定装置にゲル濾過カラムを組み入れて使用する場合、測定時の環境温度（測定を行う室の温度）を常に一定にしておく必要がある。しかも、その環境温度値を１０〜４０℃の範囲、より好ましくは１５〜３０℃の環境温度範囲に設定することが望ましい。
【００３４】
これは、後述の実施例においても説明するが、測定時の環境温度が変化すると、β−グルカンの測定値が変化するもので、カラムの分離能やサンプル中に含まれる低分子のβ−グルカンとＣａｌｃｏｆｌｕｏｒとの反応性が周囲温度に応じて変化するからである。
【００３５】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
【００３６】
実施例１
図４に示したシステムを使用して実施した。カラム側の溶媒としては蒸留水、カラム通過後の混合液として、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．２）を使用し、流速は両液とも２ｍｌ／ｍｉｎの条件で実施した。なお、蛍光検出器の励起波長は３６０ｎｍ、蛍光波長は４２０ｎｍで測定した。０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液の代わりに、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いてもよい。
【００３７】
反応部分として内径０．５ｍｍ，空寸体積量０．５ｍｌのテフロンチューブを使用した。また、カラムは担体粒子として昭和電工株式会社製の「Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０３ ＨＱ」（限界排除分子量１０万）を内径６．０ｍｍ，長さ５０ｍｍのカラムに充填したもの（ゲル粒子外部容積量０．５ｍｌ，カラム内部容積量０．９ｍｌ）を使用し、サンプル注入量は０．０２ｍｌとした。
標準溶液として大麦より抽出した精製β−グルカン（Ｓｉｇｍａ社製）を３０ｍｇ／リットル、５０ｍｇ／リットル、７５ｍｇ／リットル、１００ｍｇ／リットル、１５０ｍｇ／リットル、２００ｍｇ／リットル、２５０ｍｇ／リットルとなるように蒸留水中に溶解させたものを使用し、各標準溶液により得られる測定ピークの高さより検量線を作成した。
【００３８】
一方、ビールにβ−グルカナーゼを添加したビール中のβ−グルカンを分解後、加熱処理によりβ−グルカナーゼを失活させて調製したβ−グルカンを含まないビールに大麦β−グルカンを１００ｍｇ／リットルとなるように溶解したものをサンプルＡ、同様に調製したβ−グルカンを含まない麦汁に大麦β−グルカンを１００ｍｇ／リットルとなるように溶解したものをサンプルＢ、１０％（ｗ／ｖ）のマルトース水溶液に大麦β−グルカンを１００ｍｇ／リットルとなるように溶解したものをサンプルＣとし、さらに５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液に大麦β−グルカンを１００ｍｇ／リットルとなるように溶解したものをサンプルＤとし、各サンプルのピークの高さを測定し、上記検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第１表に示す。なお、環境温度（測定装置周辺の温度）は２０℃である。
【００３９】
【表１】

【００４０】
実施例２
実施例１と同様にしてサンプルの麦汁ＥおよびビールＦ中のβ−グルカン含量を所定の環境温度（測定装置周辺の温度は１８，２２，２５℃）にて同様に測定し、実施例１と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第２表に示す。
【００４１】
【表２】

【００４２】
実施例３
サンプルとして実施例２と同様に麦汁Ｅ，ビールＦを用い、かつ２０℃の恒温槽にシステム全体を入れて測定を行ったこと以外は実施例１と同様にしてピークの高さを測定し、実施例１と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第２表に示す。
【００４３】
比較例１
図２に示したシステムを使用し、ゲル濾過カラムが取り付けられていないこと以外は実施例１と同一条件で試料のサンプルＡ〜Ｄについてピークの高さを測定し、実施例１と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第１表に示す。
【００４４】
比較例２
サンプル注入量を０．１ｍｌにしたこと以外は実施例１と同一システム、同一条件でサンプルＡ〜Ｄについてピークの高さを測定し、実施例１と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第１表に示す。
この場合、カラム内部容積量は０．９ｍｌであるから、サンプル注入量の９倍の容量を有することとなる。
【００４５】
比較例３
ゲル濾過粒子として昭和電工株式会社製の「Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０４ ＨＱ」（限界排除分子量２００万）を使用したこと以外は実施例１と同一システム、同一条件にてサンプルＡ〜Ｄについてピークの高さを測定し、実施例１と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第１表に示す。
【００４６】
第１表の結果から明らかなように、実施例１の測定値が理論値通り１００ｍｇ／リットルもしくはこれに非常に近い値を示すのに対し、比較例ではいずれもβ−グルカンとマルトース，エタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ蛍光反応阻害物質との分離ができない、もしくは不十分なため、理論値よりも低い値や高い値を示している。
【００４７】
したがって、適切な要件を備えたゲル濾過カラムを使用することにより、ビールや麦汁中に含まれる測定値の変動要因となる低分子物質をβ−グルカンと分離することが可能であり、より正確な測定ができることが示された。
【００４８】
また、実施例１の測定装置，条件を見れば明らかなように、１サンプルの測定時間は１分以内で可能であり、サンプル注入操作を考慮すれば、実質的にカラムを用いない従来の測定装置の場合と測定時間は変わらないことが認められた。
【００４９】
なお、第２表が示すように、測定装置全体を一定温度に保つことにより、室温によらず一定の測定値が得られ、さらに精度が向上することが認められた。
すなわち、測定時の周囲温度は常に一定の温度で行う必要がある。
また、同一測定を繰り返す場合にも環境温度は同一値、かつ一定である必要がある。
【００５０】
実施例４
実施例１において、カラム側の流液として蒸留水を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、カラム通過後の混合液としてＣａｌｃｏｆｌｕｏｒを２ｍｌ／ｍｉｎの流速で実施し、さらに反応部分として内径０．５ｍｍ、空寸体積量を所定値に変化させたテフロンチューブを使用し、さらにサンプル注入量を０．００５ｍｌとしたこと以外は実施例１と同様にして行った。
上記の条件で反応部分の空寸体積量を変化させて測定した。得られた結果を図５に示す。
【００５１】
図の縦軸は反応部分の空寸体積が３００μｌのときの測定値を１とした場合の相対値を示している。この図から明らかなように、空寸体積量５００μｌ以下では測定値の変動が認められない。このことは、ミキシングチューブが長いほど分離された高分子β−グルカンと低分子β−グルカンとが再度混合されてしまうためと考えられる。
【００５２】
実施例５
実施例４と同一条件で、空寸体積量を０．５ｍｌとし、サンプル注入量を５μｌから８０μｌまで変化させて測定を行った。その結果を図６に示す。なお、図６の縦軸はサンプル注入量を５μｌとした時の測定値を１とした場合の相対値を示している。この図から明らかなように、サンプル注入量を８０μｌ程度に増やしても、測定誤差はほとんど生じていない。すなわち、カラム内部容積量９００μｌに対してサンプル注入量を１／１１以下にすること（カラム内部容積量がサンプル注入量の１１倍量以上となること）により、測定値の変動はほとんど認められない。
【００５３】
【産業上の利用可能性】
本発明の方法によれば、サンプルに含まれるマルトース等の低分子糖類やエタノール，Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ蛍光反応阻害物質などの成分による影響を受けないで、サンプル中のβ−グルカン含有量を高い精度で、かつ再現性よく測定することができる。したがって、種々の穀類，麦芽抽出液，麦汁，ビールなどのサンプル中のβ−グルカン含有量を客観的に比較、評価することが可能である。

Claims (3)

1. Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定方法において、ゲル濾過カラムを、サンプルを流液に注入する箇所より検出器までの間に配置してなるフローインジェクションシステムに、β−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカンと低分子成分とを含むサンプルを注入し、β−グルカンを該カラムのゲル粒子に保持させることなく素通りさせて１分以内に溶出させ、低分子成分の溶出をβ−グルカンよりも遅らせること、および、該カラムが、
   （ａ）ゲル粒子として、限界排除分子量３０万以下４千以上のものを使用し、
   （ｂ）ゲル粒子外部容積量が１分以内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、かつ
   （ｃ）カラム内部容積量がサンプル注入量の１０倍以上である
   ことを特徴とするβ−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカンの測定方法。
2. 試料を注入した蒸留水をカラムに通過させた後、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒを含み、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒの蛍光反応に適した組成の流液と混合させる請求項１記載のβ−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカンの測定方法。
3. 測定時における測定装置周辺の温度を１０〜４０℃の範囲内の一定温度に保つ請求項１または２のいずれかに記載のβ−（１，３）（１，４）−Ｄ−グルカンの測定方法。

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