ES2340020T3 - Soluciones de coenzimas estabilizadas y su uso para la determinacion de deshidrogenasas o bien sus sustratos. - Google Patents
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Abstract
Solución acuosa estabilizada de un coenzima para enzimas transmisores de hidrógeno, que se caracteriza por que la solución de NAD, NADP o de un derivado correspondiente en forma oxidada o reducida así como de uno o varios compuestos orgánicos o sales correspondientes consta de un valor pKa entre 1,5 y 6,0 y de ácido cítrico o de sal de citrato y de un compuesto de nitrógeno de fórmula general (I) **(Ver fórmula)** donde el radical R1 es hidrógeno, un grupo alquilo o arilo saturado o insaturado y los radicales R2 =R3 = H.
Description
Soluciones de coenzimas estabilizadas y su uso
para la determinación de deshidrogenasas o bien sus sustratos.
La invención se refiere a soluciones acuosas
estabilizadas de un coenzima para enzimas que llevan hidrógeno así
como a su utilización para determinar un analito correspondiente
(sustrato) en forma reducida o a la actividad enzimática de una
deshidrogenasa correspondiente. La solución estabilizada contiene un
compuesto orgánico o las sales respectivas con un valor de pKa
entre 1,5 y 6,0 y/o un derivado de hidroxilamina.
La determinación de las actividades enzimáticas
(o de las concentraciones de sustrato), en particular en suero
sanguíneo o en plasma tiene un importante papel en el diagnóstico
clínico químico. Frecuentemente se emplean para ello métodos
analíticos que se basan en la reducción de la
Nicotinamida-adenin-dinucleótido
("NAD") o bien
Nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato
("NADP") y en el registro fotométrico del cambio que ha tenido
lugar en el comportamiento de la absorción en el campo de longitudes
de onda ultravioleta (\lambda=334, 340 o 365 nm). Al elegir las
condiciones de prueba adecuadas este cambio es linealmente
proporcional a la actividad enzimática que se va a determinar (o
bien a la concentración de sustrato).
Para determinar la actividad enzimática de la
lactatodeshidrogensasa (LDH, E.C.1.1.1.127) se recomienda hoy en
día el método descrito en Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 31, 897
(1994) y Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 32, 639 (1994). El
principio de análisis prevé la oxidación de lactato a piruvato bajo
la reducción simultánea de un coenzima como el NAD o NADP a NADH o
NADPH. Dicha reacción - como aquí por ejemplo la catalizada por LDH
- tiene lugar en un medio alcalino (pH 9,4). Esta inestabilidad se
exterioriza en un aumento moderadamente rápido de la extinción (del
llamado valor blanco reactivo), en un margen de longitudes de onda
correspondiente a la medición, de manera que transcurrido poco
tiempo (3 meses) incluso en el almacenamiento en frío (2 hasta 8ºC)
la combinación de reactivos es inútil. Este problema se plantea en
especial para la fabricación de reactivos líquidos estables durante
largo tiempo, preparados para el uso, que deben facilitar al usuario
una realización a ser posible segura y simple de los análisis en la
rutina diaria.
De la JP 84/82398 se conoce un método para la
estabilización de coenzimas acuosos, utilizando formadores de
quelatos y azidas. Sin embargo, el inconveniente de este método es
que se requiere la adición de azida y el anión azida se ha
clasificado como cancerígeno en la actualidad y además tiene un
efecto inhibidor de muchas enzimas.
Se sabe además como estabilizar soluciones de
coenzimas mediante la adición de sales de metales pesados, por
ejemplo, en forma de iones de cobre (II) y de este modo
contrarrestar un incremento del valor del blanco de reactivos (DE
195 43 493 o bien EP 0 804 610) Para un periodo de almacenamiento
más largo o bien para temperaturas de almacenamiento superiores
(incluso a partir de 10ºC) se pueden formar productos de degradación
que inhiban la enzima deshidrogenasa que se va a determinar y por
tanto produzcan valores de medición inferiores. Un reactivo
estabilizable durante un periodo de tiempo largo (3 y más meses) con
una calidad uniforme, donde entre otras cosas se puedan evitar las
calibraciones reiteradas, no se encuentra disponible en la
actualidad.
La presente invención tiene por tanto el
cometido de conseguir un reactivo líquido estable mejorado que
presente un coenzima para enzimas transmisores de hidrógeno, que
sea adecuado para la determinación de la actividad de la
deshidrogenasa o del sustrato correspondiente.
El cometido se resuelve mediante una solución
acuosa conforme a la reivindicación 1. Como grupos alquilo son
especialmente adecuados aquellos radicales que presentan uno hasta
diez átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser de cadena
lineal o ramificada. Los grupos arilo pueden ser grupos fenilo
sustituidos o no sustituidos, si fuera preciso enlazados por un
grupo alquenilo, que puede presentan uno hasta 8 átomos de carbono.
En particular son especialmente adecuados los compuestos de
nitrógeno de la fórmula (I) ya conocida, es decir, derivados de
hidroxilamina como la hidroxilamina, O- o
N-alquilhidroxilamina con uno hasta seis átomos de
carbono o bien la O-benzilhidroxilamina y las sales
derivadas de la misma, como por ejemplo, sulfatos, fosfatos o sales
de amonio. Los derivados de hidroxilamina correspondientes se
caracterizan además por una acción complejante frente a los
productos de degradación del coenzima.
La estabilidad de las soluciones se puede
mejorar además cuando se añade un formador de complejos, es decir
un ligando, que presenta dos o más puntos o lugares de coordinación.
Pueden darse ligandos bidentados, como por ejemplo la etilendiamina
y ligandos polidentados, como la etilendiamina-N, N,
N, el ácido tetraacético (EDTA) o las sales correspondientes, en
particular la sal disódica, el éter corona o los criptandos. Lo que
equivale a una concentración del formador de complejos de
aproximadamente 0,5 hasta 30 mM, preferiblemente 1,0 hasta 5,0
mM.
Los compuestos orgánicos adicionados conforme a
la invención o las sales derivadas de los mismos con un valor de
pKa entre 1,5 y 6,0 son aquellos ácidos orgánicos, que disponen de
más de un efecto complejante y una acción amortiguadora en el
margen de pH entre 1,0 y 7,0, como el ácido cítrico y las sales
solubles en agua derivadas del mismo.
Las concentraciones de los compuestos orgánicos,
sales o derivados de hidroxilamina adicionados pueden variar en
límites amplios, es decir entre 0,001 y 1,0 M. Una concentración de
aprox. 5 hasta 200 mM para el ácido cítrico o el citrato puede ser
especialmente adecuada. En numerosos casos concentraciones de aprox.
50 mM de ácido cítrico o citrato producían el efecto deseado. El
margen de concentración preferido para el derivado de hidroxilamina
que se ha añadido conforme a la invención en presencia de un
compuesto orgánico con un valor de pKa correspondiente se sitúa
entre 2 y 300 mM. El valor del pH de la solución acuosa estabilizada
puede oscilar entre 1,0 y 7,0, de forma que el valor del pH se ha
comprobado que preferiblemente se encuentra entre 2,0 y 4,0 o bien
alrededor de 3,0.
Se ha comprobado que lo más preferible es que un
derivado de hidroxilamina al que se ha añadido una sal de citrato
se encuentren en un reactivo que contiene NAD o NADP y si fuera
preciso, en otro reactivo que contenga un analito transmisor de
hidrógeno, que contenga además sustratos y sustancias auxiliares,
además de ácido bórico o una sal de borato, para la determinación
del tampón correspondiente, como por ejemplo,
N-metilglucamina (MEG). Para esta configuración
sirven también los datos de concentración ya indicados. Además se ha
comprobado que se prefieren aprox. 20 hasta 200 mM de citrato o
ácido cítrico y aprox. 10 hasta 150 mM del derivado de
hidroxilamina correspondiente. Para el derivado de ácido bórico que
se ha añadido a la solución de sustrato que no contiene NAD/NADP
(llamado reactivo 1) se ha comprobado que lo apropiado es un margen
de concentración entre 50 y 200 mM.
Como tampón son adecuadas aquellas sustancias
para el reactivo que contiene el sustrato, que presentan una buena
capacidad amortiguadora entre un pH de 8,5 y 10,0, como por ejemplo,
los llamados buenos tampones (tricina, bicina, TAPS, AMPSO, CHES,
CAPSO, AMP, CAPS), carbonatos de iones de metales alcalinos, MEG,
TRIS así como tampón fosfato. También se ha comprobado que las
mezclas de las llamadas sustancias tampón son muy adecuadas. Lo
preferido es que la concentración tampón oscile entre 10 y 1000 mM,
preferiblemente entre 200 y 600 mM. En la solución tampón alcalina
(reactivo 1), que fija el valor del pH de trabajo se ha comprobado
que lo preferible es la adición de ácido bórico o de sus sales y
derivados solubles. La concentración de los componentes de ácido
bórico correspondiente se sitúa entre 50 y 200 mM, preferiblemente
alrededor de 100 mM.
Como coenzimas en el sentido de la presente
invención se tienen en cuenta el NAD o el NADP, pero también los
coenzimas modificados, como por ejemplo tioNAD(P) o NHxDP (=
nicotinamidahipoxantina-dinucleótidofosfato). Los
coenzimas pueden presentarse en una concentración de aproximadamente
1,0 hasta 100 mM en la cubeta de reacción, preferiblemente en un
margen de 5,0 hasta 15,0 mM.
Las soluciones de coenzimas estabilizadas
conforme a la invención se emplean en forma de soluciones acuosas.
El reactivo preparado para ello es estable también como granulado,
mezcla en polvo así como liofilizado durante un periodo de tiempo
amplio. Se ha podido constatar que no existen síntomas de
descomposición del reactivo a temperaturas de 2 hasta 8ºC en un
periodo de tiempo de 15 meses. Se ha podido demostrar que bajo una
carga, es decir a una temperatura de aproximadamente 35ºC durante 2
semanas o bajo un tratamiento a 42ºC durante cinco días, la
solución se mantiene estable con uno o varios aditivos conforme a la
invención.
Otro objetivo de la invención es un método para
la determinación de un analito transmisor de hidrógeno o bien de
una deshidrogenas correspondiente en presencia de un coenzima que
absorbe hidrógeno, donde el coenzima se presenta en una solución
acuosa estabilizada tal como se ha descrito antes.
La determinación se lleva a cabo preferiblemente
en muestras de origen biológico como, por ejemplo, sangre entera,
suero o plasma o bien otras fuentes animales o humanas o en
extractos vegetales. La muestra se puede preparar con solución
salina fisiológica. Como valor de control sirve en dicho caso una
solución de NaCl al 0,9%.
Para el caso de que se deba determinar la
actividad enzimática de una deshidrogenasa como, por ejemplo, la
lactatodeshidrogenasa, se emplea una solución de sustrato, por
ejemplo, una solución de lactato, en una sustancia (mezcla)
tamponada a aproximadamente pH 9,4 (37ºC). El sustrato se puede
emplear pues en las concentraciones habituales conocidas por el
experto, preferiblemente en un intervalo de 40 hasta 80 mM.
Para la determinación de un analito transmisor
de hidrógeno como por ejemplo el lactato, se ha propuesto la
correspondiente deshidrogenasa, como por ejemplo la LDH en una
sustancia tamponada entre pH 8,5 y 20,0. En general, es suficiente
con una cantidad de deshidrogenasa del orden de 70 hasta 500 U/l,
preferiblemente de 110 hasta 220 U/l. La determinación se realiza
normalmente a unos 37ºC.
Además del lactato mencionado como ejemplo se
puede determinar de forma similar el glutamato o amoníaco,
alcoholes,
glicerinaldehido-3-fosfato, glucosa
o bien otros parámetros, los cuales pueden ser modificados por una
deshidrogenasa adecuada dependiente del coenzima. Lo mismo sirve
para determinar la actividad enzimática de dichas
deshidrogenasas.
Otro objetivo de la invención es un kit o equipo
de pruebas para realizar la determinación del analito o enzima. El
equipo consta básicamente de dos reactivos. El primer reactivo
contiene - para el caso de la determinación de la actividad de una
deshidrogenasa - un analito (sustrato) transmisor de hidrógeno en un
sistema tapón adecuado entre pH 8,5 y 10,0. El segundo reactivo
contiene un enzima para los enzimas transmisores de hidrógeno, como
por ejemplo el NAD o NADP, así como un compuesto orgánico con un
valor de pKa entre 1,5 y 6,0 y/o un derivado de hidroxilamina
conforme a la invención. Además el segundo reactivo puede contener
otras sustancias auxiliares, como por ejemplo, sales de metales
pesados o un formador de complejos. Lo mismo ocurre para la
determinación del analito o del sustrato, como por ejemplo de
lactato.
AMP =
2-amino-2-metil-1-propanol
AMPSO =
3-[(1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino-2-hidroxipropanosulfónico]
Bicina =
N,N-bis(2-hidroxietil)glicina
CAPS =
3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico
CAPSO =
3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico
CHES =
2-(N-ciclohexilamino)-etanosulfónico
MEG = N-metilglucamina
TAPS =
N-tris-(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico
Tricina =
N-tris(hidroximetil)metilglicerina
TRIS =
2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanol
Los ejemplos siguientes aclaran la
invención:
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Ejemplo
1
Reactivo 1: N-metilglucamina 390
mmol/l, pH 9,4(37ºC); lactato L de litio 60 mmol/l.
Reactivo 2: NAD(P) 60 mmol/l como
liofilizado, mezcla en polvo, granulado o solución acuosa.
Temperatura de incubación: 37 \pm 0,1ºC;
Longitud de la longitud de onda 340 \pm 2 nm; capa de grosor 7
mm;
Incubación previa: 5 minutos; fase lag: 2
minutos; tiempo de medición: 2 minutos
Reactivo 1 = 250 \mul; Reactivo 2 = 50 \mul;
Muestra = 7 \mul de solución de NaCl (0,9% p/v)
Se realizan las siguientes determinaciones
(IFCC: referencia reconocida para la determinación del lactato que
contiene LDH, NAD/NADH y N-metilglucamina, pH 9,4;
Eur. J.Clin.Chem. Biochem. vol. 32, p.63
9-655(1994), tabla 1:
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Ejemplo
2
Se emplean las soluciones de partida tal como se
ha descrito en el ejemplo 1 y se procede del modo correspondiente.
Al reactivo 2 se añadía citrato y/o diferentes derivados de
hidroxilamina en distintas concentraciones y combinaciones (tabla
2).
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Ejemplo
3
Además se ha demostrado que aparecen isoenzimas
distintos en la fórmula conforme a la invención. Este hecho debe
corresponder a los valores hallados en la admitida recomendación
IFCC (tabla 3).
Las determinaciones se realizaban con el
reactivo IFCC descrito en el ejemplo 1 en comparación al reactivo
conforme a la invención.
Las modificaciones mencionadas son tenidas en
cuenta en la fórmula por lo que se puede disponer de un reactivo
líquido LDH que se mantendrá estable durante el almacenamiento
(>12 meses) y en el transporte (incluso a temperaturas >8ºC).
Las ventajas para el usuario derivadas de todo ello se dan a conocer
o se deducen de la descripción realizada.
Claims (15)
1. Solución acuosa estabilizada de un coenzima
para enzimas transmisores de hidrógeno, que se caracteriza
por que la solución de NAD, NADP o de un derivado correspondiente en
forma oxidada o reducida así como de uno o varios compuestos
orgánicos o sales correspondientes consta de un valor pKa entre 1,5
y 6,0 y de ácido cítrico o de sal de citrato y de un compuesto de
nitrógeno de fórmula general (I)
donde el radical R^{1} es
hidrógeno, un grupo alquilo o arilo saturado o insaturado y los
radicales R^{2} =R^{3} =
H.
2. Solución estabilizada conforme a la
reivindicación 1, que se caracteriza por, que como compuesto
orgánico contiene un ácido o una sal correspondiente con un efecto
amortiguador en el margen de pH de 1,0 hasta 7,0.
3. Solución estabilizada conforme a la
reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por, que contiene
aproximadamente 5 hasta 500 mM de ácido cítrico o sal de
citrato.
4. Solución estabilizada conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por, que el
valor del pH de la solución se encuentra entre 1,0 y 7,0.
5. Solución estabilizada conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 4, que contiene un hidroxilo-, O- o
N-alquilhidroxil-,
O-benzilhidroxilamina.
6. Solución estabilizada conforme a la
reivindicación 5, que se caracteriza por, que contiene un
derivado de hidroxilamina en una concentración entre 2 y 300
mM.
7. Método para la determinación de un analito
transmisor de hidrógeno o de una deshidrogenasa en presencia de un
coenzima que absorbe hidrógeno, que se caracteriza por que el
coenzima se encuentra en una solución acuosa estabilizada conforme
a las reivindicaciones 1 hasta 6.
8. Método para la determinación conforme a la
reivindicación 7, que se caracteriza por que el analito
lactato, glutamato, amoníaco, alcohol,
glicerinaldehido-3-fosfato o glucosa
se determina en presencia de un lactato-, glutamato-, alcohol-,
glicerina-3-fosfato o
glucosa-deshidrogenasa.
9. Método conforme a una de las reivindicaciones
7 ó 8, que se caracteriza por que el valor del pH se sitúa
entre 8,5 y 10,0 y la concentración final de la sal de citrato y/o
del derivado de hidroxilamina se sitúa entre 2 y 50 mM.
10. Kit o equipo para la determinación de un
analito transmisor de hidrógeno en una muestra que consta de los
siguientes componentes:
- un primer reactivo, que contiene una
deshidrogenasa en un sistema tamponado a un pH adecuado entre 8,5 y
10,0, y
- un segundo reactivo conforme a la
reivindicación 1, que contiene un coenzima para un enzima transmisor
de hidrógeno y un compuesto orgánico con un valor pKa entre 1,5 y
6,0 y ácido cítrico o sal de citrato y un compuesto de nitrógeno de
fórmula general (I)
donde el radical R^{1} es
hidrógeno, un grupo alquilo o arilo saturado o insaturado y los
radicales R^{2} =R^{3} =
H.
11. Kit o equipo para la determinación de la
actividad enzimática de una deshidrogenasa en una muestra que
consta de los siguientes componentes:
- un primer reactivo, que contiene un analito
transmisor de hidrógeno en un sistema tamponado a un pH adecuado
entre 8,5 y 10,0, y
- un segundo reactivo conforme a la
reivindicación 1, que contiene un coenzima para un enzima transmisor
de hidrógeno y un compuesto orgánico con un valor de pKa entre 2,0
y 4,0 y ácido cítrico o sal de citrato y un derivado de
hidroxilamina de fórmula general (I) conforme a la reivindicación
10.
12. Kit o equipo conforme a una de las
reivindicaciones 10 ó 11, que se caracteriza por que el
segundo reactivo contiene ácido cítrico, una sal de citrato y un
derivado de hidroxilamina.
13. Kit o equipo conforme a las reivindicaciones
10 hasta 12, que se caracteriza por que el segundo reactivo
presenta un valor de pH entre 1,0 y 7,0.
14. Kit o equipo conforme a una de las
reivindicaciones 10 hasta 13, que se caracteriza por que el
segundo reactivo presenta un valor de pH de aproximadamente
3,0.
15. Kit o equipo conforme a una de las
reivindicaciones 10 hasta 14, que se caracteriza por que
contiene aproximadamente de 5 hasta 200 mM de una sal de citrato
y/o 2 hasta 300 mM de un derivado de hidroxilamina en un primero o
segundo reactivo.
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