JPH04229192A - 安定な水性ｎａｄｈ試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は生物学的液体の成分を検出するた
めの診断用試薬及びキットに関し、特に、使用の際、Ｎ
ＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化するような試薬類及びキット類
に関する。

【０００２】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補
酵素のその還元体（通常、ＮＡＤＨと略される）から酸
化体（通常、ＮＡＤ＋と略される）への酸化は、生体内
（インビボ）及び生体外（インビトロ）の種々の酵素的
過程の間に起こる。その例には、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋へ
の酸化に伴ってピルビン酸を乳酸へ還元する乳酸デヒド
ロゲナーゼ酵素（ＬＤＨ）の作用がある。

【０００３】診断用キットはこのような酵素的反応を使
用してこのような反応に直接関与する成分を測定する（
例えば、ＬＤＨ測定）が、しかし、このような反応に間
接的に影響を受ける成分をも測定する。例えば、アラニ
ンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を、アラニン、
アルファ−ケトグルタレート、ＬＤＨ、ＮＡＤＨ及び種
々の塩と緩衝剤を含むキットにより定量する。同様に、
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を
、アスパルテート、アルファ−ケトグルレート、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ＬＤＨ、ＮＡＤＨ及び
種々の塩と緩衝剤を含むキットにより定量する。 同様のキットが、ＬＤＨ、全炭酸（ＴＣＯ２）、トリグ
リセライド、尿素（ＢＵＮ）並びに種々のその他の酵素
及び酵素基質を定量するために周知である。

【０００４】製造と使用との間でキットに有用な安定性
を与えるために、通常、一種以上の成分を凍結乾燥する
ことが、そして、特に、ＮＡＤＨを含有する試薬を凍結
乾燥することが必要であった。典型的には、湿気のない
状態を保つように貯蔵されている凍結乾燥ＮＡＤＨは、
その限られた液体安定性のために、後に別に再構成され
る。分解すると、ＮＡＤＨ補酵素活性が損失するばかり
でなく、もっと重要なことは所望の反応を妨害又は阻害
する分解産物を形成することである。Ｇｅｒｈａｒｄｔ
氏等の「ＮＡＤＨの品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎ
ｔｒｏｌ　Ｏｆ　ＮＡＤＨ）」Ｓｃａｎｄ．　Ｊ．　ｏ
ｆ　Ｃｌｉｎ．＆　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，第３３
巻，第１〜５１頁（１９７４年）を参照されたい。従っ
て、特に、ＮＡＤＨが小割合でしか分解しなくても、使
用時にＬＤＨ活性を阻害する。

【０００５】Ｍｏｄｒｏｖｉｃｈ氏に対する米国特許第
４，３９４，４４９号明細書（１９８３年）は、各キッ
トをＮＡＤＨ以外の総ての試薬をもつ一溶液及びＮＡＤ
Ｈとジオール（例えば、１，２−プロパンジオール）と
を含有する第二試薬（補酵素試薬溶液と呼ぶことがある
）に分け、ここで、この補酵素試薬溶液は厳密に無水で
ある。使用直前に、この補酵素試薬溶液を他の試薬と合
わせる。不都合なことに、ジオールも酵素阻害剤として
（特に、ＬＤＨの阻害剤として）作用し、従って、混合
するとき希釈度を高くしなければならない。従って、高
混合比（２０：１又はそれ以上）が必要であり、その結
果、補酵素試薬溶液中に高濃度のＮＡＤＨ（例えば、１
０ミリモルのＮＡＤＨ）も必要である。

【０００６】ｐＨが高く（例えば、９．５〜１１、特に
、１０．０〜１０．４）、ＮＡＤＨ濃度が低く且つ緩衝
剤系を注意深く選択するならば、ＮＡＤＨを水溶液中で
分解することなく長期間保存できるということが見いだ
された。酵素反応の作用ｐＨは、典型的には低い（例え
ば、６〜８）ので、緩衝剤濃度も、この試薬をその他の
試薬と混合するときに、その高ｐＨを中和することがで
きるように可及的に低くすべきである。低下させた緩衝
剤濃度も、ＮＡＤＨの安定性を改良する。アルカリ金属
カーボネート／ビカーボネート緩衝剤系を選択していた
が、アンモニウムカーボネート／ビカーボネートも一定
の試験では使用できる。ＡＳＴ及びＡＬＴのようなその
他の試験に対しては、ＮＡＤＨ組成物により作用試薬に
与えられるアンモニウムイオンは多くの条件下でその他
の妨害を与えるかもしれない。

【０００７】従って、本発明は、一形態では、生物試料
の成分（ＮＡＤＨが補酵素となる酵素反応に直接的又は
間接的に影響する成分）を測定するためのキットを提供
することであり、該キットは、ａ）測定しようとする成
分により影響を受ける反応系のための共反応物を含有す
る一試薬、及びｂ）追加の試薬として、約１〜４ミリモ
ルの濃度のＮＡＤＨと約２〜１５ミリモルの濃度のアル
カリ金属又はアンモニウムビカルボネート緩衝剤とを含
有する、約９．５〜１１．０のｐＨの水溶液からなる。

【０００８】本発明は、別の形態では、診断用補酵素試
薬として有用な水性組成物も提供し、該組成物は、水、
約１〜４ミリモル濃度のＮＡＤＨ及び２〜１５ミリモル
濃度のアルカリ金属カーボネート／ビカーボネート緩衝
剤からなり、約９．５〜１１．０のｐＨを有する。

【０００９】本発明のＮＡＤＨ水溶液は、特に、０〜５
℃のような貯蔵温度において、長期間安定性のために選
択される。この溶液は、水、緩衝剤及びＮＡＤＨを含有
し、好ましくは、これらの成分に限定される。従って、
この溶液は、好ましくは、これらの三成分から本質的に
なる。

【００１０】使用するＮＡＤＨは、好ましくは、高純度
（９８％以上）であり、ＬＤＨ活性を阻害する種類の分
解産物を実質的に含まないものでなければならない。例
えば、ベーリンガー・マンハイムから、ＢＭＤグレード
ＩＩとして入手できる物質である。ＮＡＤＨの精製法は
周知であり、例えば、Ｃ．Ｊ．　Ｎｅｗｔｏｎ氏等のＡ
ｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１３２巻，第５０頁（
１９８３年）及びＧ．Ａ．　Ｏｒｒ氏等のＡｎａｌ．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１４２巻，第２３２頁（１９８４
年）に記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣ法、並びに
Ｓ．Ａ．　Ｍａｒｇｏｌｉｓ氏等のＣｌｉｎ．　Ｃｈｅ
ｍ．，第２２巻，第１３２２頁（１９７６年）に記載さ
れている逆相ＨＰＬＣ法がある。ＮＡＤＨは約１〜約４
ミリモル、特に、約２ミリモルの濃度で組成物中に存在
する。

【００１１】組成物中に使用される水は高純度を有して
いなければならず、診断薬グレードの脱イオン化されて
いる水であることができる。避けなければならない水中
の不純物には、ホスフェート類、ヒ酸塩類、サルフェー
ト類等の多塩基アニオン類、アセテート類等の一塩基ア
ニオン類等がある。ＡＬＴ及びＡＳＴのような多くの試
験には、アンモニウムイオンも避けなければならない。

【００１２】溶液の高ｐＨを確立するのに使用される緩
衝剤は、カーボネート／ビカーボネート型であるべきで
あり、アルカリ金属カーボネート／ビカーボネート（特
に、ナトリウム又はカリウム）がより好ましく、そして
、アンモニウムカーボネート／ビカーボネートはそんな
に好ましくない。一旦所望のｐＨを決定したなら、カー
ボネートとビカーボネート塩の（例えば、炭酸二ナトリ
ウム対重炭酸ナトリウムの）適当な比を使用することに
より達成できる。ＮＡＤＨは相対的に低濃度なので、そ
の他の試薬及び試料との混合比も低い。従って、緩衝剤
塩の総濃度は低くあるべきであり、その結果、水溶液の
高ｐＨを、酵素活性が最適化される場合中性ｐＨ範囲に
下げて中和することができる。この理由のため、緩衝剤
塩（例えば、炭酸二ナトリウム及び重炭酸ナトリウム）
の総濃度は、約２〜１５ミリモルの範囲、好ましくは約
３〜８ミリモル、特に約５ミリモルの範囲で相対的に低
い。この緩衝剤の低濃度はＮＡＤＨ（その分解は一般的
な酸触媒作用を示す）の安定性を維持させるのにも重要
でもある。

【００１３】水溶液のｐＨは、ＮＡＤＨの安定性に顕著
な影響を与えることが見いだされた。ｐＨが低すぎる又
は高すぎるとＮＡＤＨは経時的に分解する。酵素活性（
例えば、ＬＤＨ活性）を阻害する不純物を形成するＮＡ
ＤＨ分解を可及的に少なくするための最も好適なｐＨ範
囲（特に、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝剤に
対して）に、ｐＨ１０．０〜１０．４が選択されている
。

【００１４】一般に、酵素反応に積極的に関与するその
他の成分はこの水溶液中に存在すべきではないが、種々
の少量の成分（特に、塩類）を存在できる。しかし、存
在するこのような塩類は、好ましくは、イオン強度を低
く保つような低濃度のものであるべきである。

【００１５】ＮＡＤＨを含有する水溶液に加えて、診断
用キットは一種以上のその他の試薬を含有する。これら
の試薬及び試料は一緒になって酵素反応又は一連の酵素
反応に必要な成分を与え、これらの酵素反応により、試
料中の目的の成分の量の関数としてＮＡＤＨがＮＡＤ＋
に酸化される。この原理をまずＡＬＴを決定するための
キットについて例証しよう。

【００１６】ＡＬＴキットでは、第二試薬はアラニン、
アルファケトグルタレート（ＡＫＧ）、ＬＤＨ及び種々
の塩類を含有できる。第二試薬は水性補酵素試薬よりも
高濃度の緩衝剤系で緩衝化されており、低いｐＨである
。例えば、 アラニン　　　　　　　　　　　　３００ミリモルＡＫ
Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　３７ミリモルＬＤ
Ｈ　　　　　　　　　　　　２７２０ＩＵ／Ｌトリス　
　　　　　　　　　　　　　１００ミリモル水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　残量で、７．６のｐＨで
ある。上述の試薬を凍結乾燥後長期間貯蔵でき、０〜５
℃で液状で長期間安定でありうる。 下記の組成の水性試薬を０〜５℃で長期間貯蔵できる。 すなわち、 ＮＡＤＨ　　　　　　　　　　　　　　２ミリモル炭酸
ナトリウム　　　　　　　　１．６ミリモル重炭酸ナト
リウム　　　　　　３．４ミリモル水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　残量である。

【００１７】容量比２．７５：１でこの二種類の試薬を
合わせるとき、ＬＤＨ含有試薬の高緩衝剤濃度（ｐＨ７
．６）は１０．０の高いｐＨから最終作用試薬の７．６
に中和する。少量の試料（１５μｌ）（標準的には中性
ｐＨまたはそれ付近でも）に反応混合物の最終ｐＨに重
大な影響はない。

【００１８】ＡＳＴキットのその他の試薬の例示的な組
成は下記の通りである。すなわち、 　　　　　　　　　　ＬＤＨ　　　　　　　　　　　　
　　　　８２０　　ＩＵ／Ｌ　　　　　　　　　　ＭＤ
Ｈ　　　　　　　　　　　　　　２０４０　　ＩＵ／Ｌ
　　　　　　　　　　ＡＫＧ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４１　　ミリモル　　　　　　　　　　Ａ
ｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　１８０　　ミリ
モル　　　　　　　　　　トリス　　　　　　　　　　
　　　　　　２５３　　ミリモル（ｐＨ７．６）　　　
　　　　　　　水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　残量である。

【００１９】共通の水性試薬（ＮＡＤＨとカーボネート
緩衝剤を含む）について各々有用な、同様な試薬を、日
常的な実験によりその他の各々の試験（ＬＤＨ，ＴＣＯ
２，ＢＵＮ及びトリグルセライドのような）に展開でき
る。従って、酵素、基質、ＮＡＤＨ及び塩類の最終濃度
並びに試料と両試薬との混合物の最終ｐＨ（例示した処
方で７．６）、更に二種類の液体を、凍結乾燥したＮＡ
ＤＨを使用するときに達成される最終濃度及び最終ｐＨ
と同一又は類似であることができる。

【００２０】本発明の幾つかの形態では、総ての酵素及
び基質（ＮＡＤＨ補酵素以外の）は単一の試薬であるが
、その他の形態では二種以上のその他の試薬を使用する
。例えば、アルファ−ケトグルタレート（ＡＫＧ）は、
ＡＳＴ試薬中のアスパルテートのようなその他の成分で
非酵素的アミノ交換反応を受け得る。このような分解反
応は第三の試薬としてＡＫＧをパッケージングすること
により避け得る。別のＡＫＧ試薬のための最適濃度は開
発されていないが、水（３１１ミリモルのトリス中でｐ
Ｈ７．６に緩衝化されている）中で２１８ミリモルＡＫ
Ｇが満足いくものと思われる。

【００２１】試料、ＮＡＤＨ含有水性試薬、酵素含有試
薬及び（もし存在するなら、ＡＫＧ含有試薬）の混合を
手動的に行うことができる。しかし、好ましくは、試料
及び種々の試薬を自動化された装置によりピペットかさ
もなくば他の手段で反応室又は反応／分析室に移す。米
国特許第４，７３８，８２５号及び第４，７８８，１５
０号各明細書に記載されている種類のシステムを使用す
るのが好ましい。即ち、遠心回転子中のセルの内側の室
（内室）及び外側の室（外室）中にピペットで移し、次
いで、各セルに充填したのち、回転子を回転させて各内
室中の試料又は試薬をダムからオーバーフローさせ、対
応する外室中で試料又は試薬と混合させる。酵素試薬と
ＮＡＤＨ試薬を含むキットでは、内室中に（試料と共に
）ＮＡＤＨ試薬を入れ、外室に酵素試薬を入れるのが好
ましい。酵素試薬、ＮＡＤＨ試薬及びＡＫＧ試薬を含有
するキットでは、装置上に置かれている試薬容器にＡＫ
Ｇ試薬と酵素試薬を混合して入れ、同様にＮＡＤＨ試薬
を含有する別の試薬容器を置く。各試験について、装置
はＮＡＤＨ試薬を内室に入れ、酵素試薬とＡＫＧ試薬と
を、回転子の各セルの外室中で合わせ、そこで、かかる
試験がなされる。

【００２２】各試薬を貯蔵する容器は、米国特許第４，
７６４，３４２号明細書に示されている種類のものが好
ましい（ＢｏａｔＩＬ　容器としてＩｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ部門により市販さ
れている）。酵素溶液と凍結乾燥ＮＡＤＨとの双方を加
える単一の容器の使用と比べると、本発明は、単一の試
験用に装置のボード上に一又はそれ以上の追加の試薬容
器が必要である。しかし、単一容器中の単一水性ＮＡＤ
Ｈ試薬を多試験（例えば、ＡＬＴについての一種の酵素
試薬との組み合わせ及びＡＳＴについての別の酵素試薬
との組み合わせ）に使用できることが了解されるべきで
ある。従って、二つの容器が実施しようとする単一試験
（例えば、ＡＬＴ）用の円形コンベヤー上に必要とされ
るかもしれないが、別の試験（例えば、ＡＳＴ，ＬＤＨ
，ＢＵＮ，ＴＣＯ２及びトリグリセリド）をなし得るの
に各々に一個の別の試薬容器を必要とするのみであろう
。ＡＫＧを別の試薬として（同様の容器中に）与えた場
合、それは数種の異なる試験にも、各試験について（例
えば、あるものはＡＬＴについてそしてあるものはＡＳ
Ｔについて）別の酵素試薬へ混合することにより使用で
きる。

【００２３】

【実施例】本発明を次の実施例により例証する。

【００２４】実施例１−ＬＤＨ分析 ＬＤＨ活性の測定のために二種類の試薬を調製した。第
一の試薬は、０．９６３ミリモルのピルビン酸一ナトリ
ウム（分子量１１０．０）と１１８．７５ミリモルの燐
酸塩（９．７７３ｇ／Ｌの燐酸水素二ナトリウム及び６
．７９３ｇ／Ｌの燐酸二水素一カリウム）とのｐＨ７．
０の水溶液であった。この第一試薬四部（典型的には８
ｍｌ）を、１ミリモルのＮＡＤＨと５ミリモルのアンモ
ニウムビカーボネートを含有する第二試薬（ｐＨ１０．
０）一部（典型的には２ｍｌ）と混合した。下記の実施
例３では、このアンモニウムビカーボネートを炭酸二ナ
トリウムと重炭酸ナトリウムとの混合物により置換した
。この混合物を次いで遠心分析器（ＭＯＮＡＲＣＨ又は
ＭＵＬＴＩＳＴＡＴ　ＩＩＩ）上で、内部区画に５μｌ
の試料及び１５μｌ試料希釈液をそして外部区画に２０
０μｌの試薬（上記混合物）及び１０μｌの試薬希釈液
を共に使用した。 従って、最終濃度は、０．１７４ミリモルのＮＡＤＨ、
０．６７０ミリモルのピルベート及び８２．６１ミリモ
ルのホスフェートを２３０μｌの総容量中に含有した。

【００２５】評価した各試料は市販の血清対照（Ｓｅｒ
ａＣｈｅｍ　ｌｅｖｅｌ　１，　ＳｅｒａＣｈｅｍ　ｌ
ｅｖｅｌ　２　及びＳｉｇｍａ　Ｍｕｌｔｉ−Ｅｎｚｙ
ｍｅ　Ｌｉｎｔｒｏｌ（１％，２％，５％及び１０％）
を含有した。 又、アマノ社より供給されたスタフィロコカス・エピデ
ルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓ）からの　Ｄ−ＬＤＨのストック溶液の
希釈液（１０，３０，５０及び６０％）も評価した。各
場合で、製造直後の試薬用の標準ソフトウエアを使用し
て測定したＬＤＨ値を１００％とした。種々の時間で種
々の温度におけるＮＡＤＨ試薬の貯蔵についての測定値
の低下をモニターした。各貯蔵時間の終了時に、ＮＡＤ
Ｈアリコットを採取し、製造直後のピルベート試薬と混
合し、前記分析器で試験した。 ４℃で貯蔵したＮＡＤＨ試薬では、得られた値は、１か
月、２．５か月、７か月、１５か月及び２８か月後で８
．３％，７．６％，５．６％，２．６％及び７．８％阻
害（種々の「試料」の平均値）を示した。１５℃で貯蔵
したＮＡＤＨ試薬では、得られた値は、同じ５間隔で、
５．２％、４．４％、５．８％、８．３％及び３５．８
％阻害を示した。２５℃で貯蔵したＮＡＤＨ試薬では、
得られた値は、１か月、２．５か月及び７か月後で、各
々０．１％、５．１％及び４８．８％阻害を示した。３
７℃で貯蔵したＮＡＤＨ試薬では、得られた値は、１か
月及び２．５か月後で、各々２．４％及び６５％阻害を
示した。５０℃で貯蔵したＮＡＤＨ試薬では、得られた
値は、１か月及び２．５か月後で、各々１２．８％及び
９６．０％阻害を示した。

【００２６】比較例２ 使用したＮＡＤＨ試薬（上述した第一試薬で１：４０比
）をプロパンジオール中の１０ミリモルＮＡＤＨであっ
た以外は実施例１の方法に従った。４℃で１か月、６か
月及び１３．５か月貯蔵した後、得られた値は、各々２
１．８％、２３．２％及び２９．５％阻害を示し、３７
℃で１か月及び６か月貯蔵した後、各々２９．２％及び
６８．８％阻害を示した。同様の結果が、このプロパン
ジオール系ＮＡＤＨ試薬（米国特許第４，３９４，４４
９号明細書参照）及び市販されているＭＡＳ製剤（この
特許に基づいていると思われる。）を使用して得られた
。

【００２７】実施例３ ＮＡＤＨ試薬中のアンモニウムビカーボネートの代わり
に重炭酸ナトリウムを使用（該試薬のｐＨ１０．０を依
然として維持した）して、実施例１の方法を繰り返した
。４℃で３か月及び２３．５か月間貯蔵したこの修正Ｎ
ＡＤＨ試薬では、得られた値は、各々４．９％及び８．
０％阻害を示した。３７℃で３か月間貯蔵したこの修正
ＮＡＤＨ試薬では、得られた値は、２１．４％阻害を示
した。５０℃で１か月及び２．５か月間貯蔵したこの修
正ＮＡＤＨ試薬では、得られた値は、各々６．２％及び
８８．９％阻害を示した。

【００２８】実施例４　　ＡＳＴ分析 実施例１で製造したアンモニウムビカーボネート／ＮＡ
ＤＨ試薬（製造直後のもの並びに４℃及び１５℃で貯蔵
後のものの双方）を、上記のＡＫＧ／アスパルテート／
酵素試薬を使用してＡＳＴ分析における評価をした。Ｍ
ＯＮＡＲＣＨ装置で、各内部区画に１５μｌの試料（Ｓ
ｅｒａＣｈｅｍ又はＬｉｎｔｒｏｌ血清対照のうちの一
方）、２５μｌの希釈液及び４０μｌのＮＡＤＨ試薬を
入れ、各外部区画に１１０μｌのＡＳＴ試薬及び１０μ
ｌの希釈液を入れた。製造直後のアンモニウムビカーボ
ネート／ＮＡＤＨ試薬と比較すると、４℃で２８か月間
貯蔵した試薬では１０２％の回収率（指示ＡＳＴ活性よ
り２％高い）をもたらし、１５℃で２８か月間貯蔵した
試薬では９３％の回収率（指示ＡＳＴ活性より７％低い
）をもたらした。４℃で２８か月間貯蔵後、結果は７０
％Ｌｉｎｔｒｏｌ又は４００Ｕ／Ｌまで直線性を示し、
１５℃で２８か月間貯蔵後、結果は５０％Ｌｉｎｔｒｏ
ｌ又は２７５Ｕ／Ｌまで直線性を示した（直線性実験を
３０℃で分析した）。

【００２９】実施例５　　ＡＬＴ分析 実施例１で製造したアンモニウムビカーボネート／ＮＡ
ＤＨ試薬（製造直後のもの及び４℃で貯蔵後のものの双
方）を、上記のＡＫＧ／アラニン／酵素試薬を使用して
ＡＬＴ分析における評価をした。ＭＯＮＡＲＣＨ装置で
、各内部区画に１５μｌの試料（ＳｅｒａＣｈｅｍ又は
Ｌｉｎｔｒｏｌ血清対照のうち一方）、２５μｌの希釈
液及び４０μｌのＮＡＤＨ試薬を入れ、各外部区画に１
１０μｌのＡＬＴ試薬及び１０μｌの希釈液を入れた。 製造直後のアンモニウムビカーボネート／ＮＡＤＨ試薬
と比較すると、４℃で２８か月間貯蔵した試薬では９８
％の回収率（指示ＡＬＴ活性より２％低い）をもたらし
た。４℃で２８か月間貯蔵した試薬における直線性研究
は、７０％Ｌｉｎｔｒｏｌ又は４００Ｕ／Ｌまで直線性
を示した。本実施例も、分析を３０℃で行った。

【００３０】実施例６　　ＡＳＴ分析 実施例３で製造した重炭酸ナトリウム／ＮＡＤＨ試薬（
製造直後のもの及び４℃で２４か月間貯蔵後のものの双
方）を、「試料」として同じ対照を用いて実施例４で記
載したのと同様のＡＳＴ分析における評価をした。４℃
で貯蔵した試薬での実験の回収率は、１０３％回収率（
製造直後のＮＡＤＨ試薬を用いたよりも３％高い）を得
た。製造直後のＮＡＤＨ試薬も４℃で貯蔵した試薬も種
々のＬｉｎｔｒｏｌ標準で７０％（ＡＳＴの３７５ＩＵ
／Ｌまで）まで直線性の結果を示した。本実施例も、分
析は３０℃で行った。

【００３１】実施例７−ＡＬＴ分析 実施例３で製造したソジウムビカーボネート／ＮＡＤＨ
試薬（製造直後のもの及び４℃で２４か月間貯蔵後のも
のの双方）を、「試料」と同じ対照を用いて実施例５で
記載したのと同様のＡＬＴ分析における評価をした。結
果は、１０２％回収率（製造直後のＮＡＤＨ試薬を用い
た試験と比較して貯蔵ＮＡＤＨ試薬を用いた試験につい
て２％より高い）を示した。製造直後の試薬も貯蔵試薬
も共に７０％Ｌｉｎｔｒｏｌ標準（ＡＬＴの３７５ＩＵ
／Ｌ）まで直線性を与えた。

【００３２】実施例８−ＡＳＴ及びＡＬＴの同時分析三
種の異なる試薬をＭＯＮＡＲＣＨ装置の各ＢｏａｔＩＬ
容器に入れた。

【００３３】ＡＳＴ−１４０．９ミリモルのＡＫＧ、１
７８．８ミリモルのＬ−アスパルテート、２０４０ＩＵ
／Ｌ　ＭＤＨ、８１６ＩＵ／Ｌ　ＬＤＨ、２５３．０ミ
リモルのトリス塩基（ｐＨ７．６）。

【００３４】ＡＬＴ−１ ３７．３ミリモルのＡＫＧ、２９７．８ミリモルのＬ−
アラニン、２７２０ＩＵ／Ｌ　ＬＤＨ、１００．６ミリ
モルのトリス塩基（ｐＨ７．６）。

【００３５】ＮＡＤＨ−２ ２ミリモルのＮＡＤＨ、５ミリモルの重炭酸ナトリウム
（ｐＨ１０．０）。

【００３６】ＡＳＴ−１及びＡＬＴ−１の各々について
、ＡＫＧ試薬を別に調製し、次いで、共通のＢｏａｔＩ
Ｌ容器にアスパルテート、ＭＤＨ、ＬＤＨ及びトリス塩
基（ＡＳＴ−１について）又はアラニン、ＬＤＨ、及び
トリス塩基（ＡＬＴ−１について）と共に入れた。ＡＫ
Ｇ試薬の安定性を評価するために、ＡＫＧ試薬並びにＡ
ＳＴ−１の他の成分及びＡＬＴ−１の他の成分を５２日
間（４℃と３７℃）貯蔵し、次いで、試験の日にＢｏａ
ｔＩＬ容器中で合わせた。

【００３７】装置を共通の回転子上で各セル中に入れる
ようにセットし、ここでＡＳＴ試験を行った。即ち、１
５μｌ試料、２５μｌ希釈液及び４０μｌの製造直後の
ＮＡＤＨ−２試薬（これら総ては内部区画）並びに１１
０μｌの試薬ＡＳＴ−１及び１０μｌの緩衝剤（これら
は外部区画）を入れた。装置を共通の回転子上で各セル
中に入れるようにセットし、ここでＡＬＴ試験を行った
。即ち、１５μｌ試料、２５μｌ希釈液及び４０μｌの
製造直後のＮＡＤＨ−２試薬（これら総ては内部区画）
並びに１１０μｌの試薬ＡＬＴ−１及び１０μｌの緩衝
剤（これらは外部区画）を入れた。このようにして、Ａ
ＳＴ及びＡＬＴの両試験を共通の「試料」（ＳｅｒａＣ
ｈｅｍ　ｌｅｖｅｌ　１及びｌｅｖｅｌ　２の２対照）
で行い、次の結果を得た。

【００３８】ＡＳＴの結果 製造直後のＡＳＴ−１試薬の結果とＡＳＴ−１試薬の成
分を４℃で５２日間貯蔵した場合の結果を比較すると、
貯蔵試薬は製造直後のＡＳＴ値の１００．６％を回収し
た（０．６％高かった）。ＡＳＴ−１試薬の成分を３７
℃で５２日間貯蔵したとき、分析は製造直後の試薬のＡ
ＳＴ値の１０３．７％を回収した（３．７％高かった）
。これらの回収率は多酵素Ｌｉｎｔｒｏｌ希釈液および
ＳｅｒａＣｈｅｍ１および２対照のパネルの平均を表す
。直線性は１００％Ｌｉｎｔｒｏｌ又はＡＳＴの約５６
０Ｕ／Ｌまで示した（３０℃で分析）。

【００３９】ＡＬＴの結果 ＢｏａｔＩＬ容器中で合わせる前に４℃で５２日間貯蔵
したＡＬＴ−１試薬の成分は、製造直後の試薬のＡＬＴ
値の９８．８％を回収した（１．２％低かった）。３７
℃で５２日間貯蔵したＡＬＴ−１の成分は、製造直後の
試薬のＡＬＴ値の１０２．３％を回収した（２．３％高
かった）。これらの回収率は、多酵素Ｌｉｎｔｒｏｌ希
釈液並びにＳｅｒａＣｈｅｍ１および２対照のパネルの
平均を表す。直線性は１００％Ｌｉｎｔｒｏｌ又はＡＬ
Ｔの約５７０Ｕ／Ｌまで示した（３０℃で分析）。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ＮＡＤＨが補酵素となる酵素反応に直
   接的又は間接的に影響をうける、生物学的試料の成分を
   決定するためのキットであって、ａ）決定しようとする
   成分により影響を受ける反応系のための共反応物を含有
   する一試薬、並びにｂ）追加の試薬として、ＮＡＤＨを
   約１〜４ミリモルの濃度及びアルカリ金属若しくはアン
   モニウムカーボネート／ビカーボネート緩衝剤を約２〜
   １５ミリモルの濃度で含み、約９．５〜１１．０のｐＨ
   の水溶液、からなる前記キット。
2. 【請求項２】　　一試薬が乳酸デヒドロゲナーゼを含有
   する請求項１記載のキット。
3. 【請求項３】　　決定しようとする成分がＡＬＴである
   請求項２記載のキット。
4. 【請求項４】　　決定しようとする成分がＡＳＴであり
   、且つ一試薬がリンゴ酸デヒドロゲナーゼを更に含有す
   る請求項２記載のキット。
5. 【請求項５】　　追加の試薬がｉ）約１〜４ミリモル濃
   度のＮＡＤＨ、 ｉｉ）アルカリ金属カーボネート、 ｉｉｉ）アルカリ金属ビカーボネート（アルカリ金属カ
   ーボネート及びビカーボネートは一緒で約３〜１０ミリ
   モル濃度である）、及び ｉｖ）水から本質的になる、請求項１〜４のいずれかに
   記載のキット。
6. 【請求項６】　　アルカリ金属カーボネートが炭酸ナト
   リウムであり、アルカリ金属ビカーボネートが重炭酸ナ
   トリウムである請求項１〜５のいずれかに記載のキット
   。
7. 【請求項７】　　ＮＡＤＨが約２ミリモルの濃度であり
   、炭酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムが一緒で約５ミ
   リモルの濃度であり、そして、ｐＨが約１０．０〜１０
   ．５である請求項６記載のキット。
8. 【請求項８】　　水、約１〜４ミリモル濃度のＮＡＤＨ
   及び２〜１５ミリモル濃度のアルカリ金属カーボネート
   ／ビカーボネート緩衝剤からなり、約９．５〜１１．０
   のｐＨを有する、診断用補酵素試薬として有用な水性組
   成物。
9. 【請求項９】　　ＮＡＤＨ、アルカリ金属カーボネート
   、アルカリ金属ビカーボネート及び水から本質的になる
   請求項８記載の水性組成物。
10. 【請求項１０】　　アルカリ金属カーボネートが炭酸ナ
    トリウムであり、アルカリ金属ビカーボネートが重炭酸
    ナトリウムであり、これらは３〜１０ミリモル濃度で一
    緒に存在し、且つＮＡＤＨが約２ミリモル濃度で存在し
    、ｐＨが約１０．０〜約１０．５である、請求項８又は
    ９記載の水性組成物。