ES2340144T3 - Metodo de medida de sangre completa. - Google Patents
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Abstract
Método para medir un analito en sangre completa, que comprende: una etapa de reacción de formar un sistema de reacción que contiene una muestra que contiene sangre completa, una primera sustancia que está soportada mediante un soporte sólido y se une de manera específica a un analito contenido en la muestra y una segunda sustancia que se une de manera específica al analito para permitir que el analito reaccione con la primera y segunda sustancias, y una etapa de medición de medir un producto de reacción formado, en el que dicho sistema de reacción comprende un detergente en el intervalo de concentración del 0,5 - 5% de manera que se impide la hemólisis.
Description
Método de medida de sangre completa.
La presente invención se refiere a un método
para analizar un componente particular contenido en sangre completa
en el que se usa sangre completa como muestra.
La medición de componentes en sangre, por
ejemplo, antígenos, anticuerpos, proteínas, sustancias endocrinas,
etcétera, es clínicamente muy importante. En general, se usa plasma
o suero como muestra de sangre en muchos casos, y en tales casos,
la sangre completa se separa normalmente en suero o plasma lo más
rápidamente posible con el fin de evitar la hemólisis. Esto es
porque, por ejemplo, en el campo de las pruebas inmunológicas, si
están presentes componentes hemocíticos o se provoca hemólisis en
una muestra, pueden haberse provocado fenómenos alterantes tales
como la influencia de la hemólisis sobre los sistemas ópticos, la
inhibición de la reacción inmunológica por componentes internos de
las células sanguíneas y la agregación o adhesión de componentes de
la membrana citoplasmática de las células sanguíneas sobre un
soporte sólido usado como fase sólida. Por tanto, en las pruebas
clínicas habituales, ha sido una práctica común que se centrifugue
en primer lugar la sangre completa extraída para eliminar las
células sanguíneas, y se use el plasma o suero obtenido como
muestra para medición.
Sin embargo, con el fin de eliminar las células
sanguíneas, se requieren instrumentos especializados tales como la
centrífuga, y el funcionamiento es laborioso. Por tanto, es deseable
usar sangre completa tal cual como muestra para medición para
médicos en consultas que no tienen tales instalaciones y pruebas
urgentes con escaso margen de tiempo.
Para satisfacer los requisitos anteriores, ya se
han propuesto diversos métodos de someter a ensayo la propia sangre
completa sin separar el suero o plasma. En cuanto a los
inmunoensayos, se ha notificado un método que utiliza la
coagulación de látex como ensayo homogéneo (método que no requiere
separación B/F) como método de medición en el que se provoca de
manera intencionada y forzada la hemólisis de las células sanguíneas
(publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público
(Kokai) número 10-48214). En segundo lugar, como
métodos de ensayo sin provocar hemólisis de las células sanguíneas,
se han notificado un método de ensayo homogéneo que usa luz
dispersada por látex (Clinical Chemistry, Vol. 43,
1764-1770 (1997)), un método de ensayo heterogéneo
(método que requiere separación B/F) que usa una cubeta de plástico
como fase sólida (publicación de patente japonesa abierta a
consulta por el público número 6-265554) y un método
que usa perlas de poliestireno o partículas magnéticas como fase
sólida (publicación de patente internacional sin examinar en japonés
(Kohyo) número 2000-508075, documento
WO96/04558).
Sin embargo, no puede decirse que ya se hayan
establecido métodos de ensayo sumamente sensibles y convenientes
que usan sangre completa como muestra incluso mediante el uso de
estos métodos. En primer lugar, aunque se han notificado algunos
inmunoensayos que usan un ensayo homogéneo como métodos
convenientes, un analito es con frecuencia una sustancia contenida
en la sangre en una cantidad traza en las pruebas clínicas etcétera,
y por tanto generalmente se requiere mucho más someter a ensayo
sangre completa usando un ensayo heterogéneo que permite en teoría
un ensayo sumamente sensible. En segundo lugar, con los antecedentes
de que los soportes sólidos tales como partículas magnéticas se
usan ampliamente en un ensayo heterogéneo como fase sólida debido a
la simplicidad de la separación B/F, es probable que micropartículas
tales como partículas magnéticas se vean influidas, en particular,
por células sanguíneas, aunque los soportes sólidos que tienen un
tamaño tal que los soportes sólidos no se agregan no provocan
ningún problema, como en los casos de perlas que tienen un diámetro
del orden de milímetros y placas de plástico. Por ejemplo, cuando se
produce hemólisis, sustancias inhibidoras tales como hemoglobina y
sustancias derivadas del núcleo de las células, que fluyen fuera del
interior de las células sanguíneas hacia un sistema de reacción,
pueden provocar agregación no específica de los soportes sólidos o
reducir la reacción inmunitaria, afectando de este modo gravemente
al ensayo. Además, incluso cuando se usa sangre completa no
hemolizada fresca como muestra, si existen células sanguíneas, se
vuelve probable que los soportes sólidos de adhieran fácilmente
sobre una pared interna del vaso de reacción o una punta de pipeta
debido a sustancias de superficie de la membrana de las células
sanguíneas o similares, y por tanto pueden provocarse daños tales
como imprecisión.
Además, se usan con frecuencia instrumentos y
cartuchos para ensayo automático de modo que se lleven a cabo de
manera rápida y conveniente tales ensayos de sangre completa tal
como se describió anteriormente. Sin embargo, también se producen
problemas similares en cada etapa de tales ensayos automáticos. Es
decir, dado que los componentes de las células sanguíneas en la
sangre completa y los soportes sólidos usados para los ensayos se
precipitan con el tiempo, es esencial incluir una etapa de agitar de
manera suficiente una muestra que contiene sangre completa antes de
los ensayos de modo que se mantienen los componentes de las células
sanguíneas uniformes o agitar de manera suficiente la muestra, el
soporte sólido, los reactivos, etc. en una etapa de reacción o una
etapa de ensayo. En una etapa de agitación de este tipo, se impone
una fuerte fuerza sobre las células sanguíneas, y se alteran las
células sanguíneas, dando como resultado hemólisis extremadamente
fácil. Además, dado que la succión y descarga de la muestra se
realizan en cada etapa para transferir sucesivamente la muestra a
vasos de reacción objetivos siguiendo las etapas, se impone una
fuerte fuerza sobre las células sanguíneas y por tanto se produce
fácilmente hemólisis. Además, también se produce
fácilmente adhesión y agregación no específica. Por tanto, pueden provocarse con frecuencia errores en los ensayos.
fácilmente adhesión y agregación no específica. Por tanto, pueden provocarse con frecuencia errores en los ensayos.
En los últimos años, tales instrumentos y
cartuchos para ensayos automáticos tal como se describieron
anteriormente también se usan ampliamente en el campo de las
pruebas en el lugar de asistencia (POCT), que llaman la atención
como prueba de emergencia o prueba llevada a cabo fácilmente por
médicos y enfermeras. Por consiguiente, se ha requerido el
desarrollo de un método de ensayo que pueda proporcionar resultados
de ensayo correctos incluso mediante un ensayo que use tales
equipos y sangre completa.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar medios para someter a ensayo de manera rápida y
conveniente un analito en sangre completa con alta sensibilidad
usando la sangre completa tal cual es como muestra.
Los inventores de la presente invención llevaron
a cabo diversos estudios con el fin de conseguir el objeto
mencionado anteriormente. Como resultado, se encontró que, en un
método para medir un analito contenido en una muestra que contenía
sangre completa, si se realizaba una reacción en presencia de un
detergente y en un estado en el que no se alteran las células
sanguíneas, la medición podía llevarse a cabo en un corto periodo
de tiempo con alta sensibilidad sin realizar la separación de
suero/plasma mediante centrifugación o similares.
Por tanto, la presente invención proporciona un
método para medir un analito, que comprende una etapa de reacción
de formar de un sistema de reacción que incluye una muestra que
contiene sangre completa, una primera sustancia soportada mediante
un soporte sólido y que se une de manera específica a un analito
contenido en la muestra y una segunda sustancia que se une de
manera específica al analito y permitir que el analito reaccione con
la primera y segunda sustancias y una etapa de ensayo de someter a
ensayo un producto de reacción formado, en el que (1) la etapa de
reacción se realiza en un estado en el que no se alteran las células
sanguíneas, y (2) al menos la etapa de reacción se realiza en
presencia de una cantidad suficiente de detergente que no provoca
hemólisis, no inhibe las reacciones del analito con la primera y
segunda sustancias que se unen de manera específica al analito y
puede impedir la influencia sobre el sistema de reacción de un
componente que existe en el sistema de reacción.
Además, otra realización de la presente
invención es un método para medir un analito en sangre completa, que
comprende:
(1) una etapa de dilución de diluir sangre
completa mezclando la sangre completa con una disolución de
tratamiento de sangre completa;
(2) una primera etapa de reacción de añadir una
primera sustancia, soportada mediante un soporte sólido y que se
une de manera específica al analito a la sangre completa diluida y
permitir que reaccionen para formar un primer producto de reacción
en un sistema de reacción;
(3) una primera etapa de separación de separar
el primer producto de reacción formado en la primera etapa de
reacción del sistema de reacción;
(4) una segunda etapa de reacción de añadir una
segunda sustancia, que se une de manera específica al analito al
primer producto de reacción separado y permitir que reaccionen para
formar un segundo producto de reacción en un sistema de
reacción;
(5) una segunda etapa de separación de separar
el segundo producto de reacción formado en la segunda etapa de
reacción del sistema de reacción; y
(6) una etapa de medición de medir el segundo
producto de reacción separado, en el que
la disolución de tratamiento de sangre completa
contiene una cantidad suficiente de detergente que no provoca
hemólisis, no inhibe las reacciones del analito con la primera y
segunda sustancias y puede impedir la influencia sobre el sistema
de reacción de un componente que existe en el sistema de reacción en
cada etapa cuando se mezcla la disolución con la sangre
completa.
Además, desde otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un kit de reactivos usado en el método de
medición de la presente invención. Una realización del kit de
reactivos es un kit de reactivos para medir un analito en sangre
completa, que comprende una primera sustancia soportada mediante un
soporte sólido y que se une de manera específica al analito, una
segunda sustancia que se une de manera específica al analito y un
detergente que no provoca hemólisis cuando se mezcla con la sangre
completa y no inhibe las reacciones del analito con la primera
sustancia y la segunda sustancia.
A continuación en el presente documento, se
explicará en detalle la presente invención.
El método de medición de la presente invención
es un método para medir un analito en una muestra que contiene
sangre completa.
La expresión "muestra que contiene sangre
completa" significa sangre completa extraída de un paciente tal
cual es, sangre completa mezclada con una determinada disolución de
tratamiento (también denominada "disolución de tratamiento de
sangre completa" a continuación en el presente documento) o
similares. La expresión "sangre completa" significa sangre
completa extraída de un paciente suponiendo que contiene un analito
o puede contener el analito, y se usa sangre fresca preferiblemente
en un plazo de 3 días después de la extracción, más preferiblemente
en un plazo de 24 horas después de la extracción, además
preferiblemente de manera inmediata después de la extracción o en
un plazo de 12 horas después de la extracción. La sangre puede
extraerse mediante un método conocido que usa un tubo para
extracción de sangre o similares tratado con un anticoagulante tal
como EDTA o heparina. La sangre se almacena preferiblemente
mediante almacenamiento en frío, más preferiblemente a de 4 a
0ºC.
El analito no está limitado de manera particular
siempre que esté contenido en sangre completa y sea una sustancia
para la cual existe una sustancia que se une de manera específica a
la misma para formar un producto de reacción. Ejemplos de una
combinación del analito y la sustancia que se une de manera
específica al mismo incluyen antígeno y anticuerpo, anticuerpo y
antígeno, proteína y ligando, cadena de azúcar y lectina, etcétera.
Se prefieren particularmente antígeno y anticuerpo o anticuerpo y
antígeno. Por tanto, en la presente invención, la expresión "que
se une de manera específica a" significa formar un producto de
reacción mediante un enlace bioquímicamente específico. Ejemplos
específicos del analito incluyen antígeno de superficie del virus de
la hepatitis B (HBsAg), anticuerpo y antígeno del virus de la
hepatitis C (VHC), anticuerpo del virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), anticuerpo del virus de la leucemia humana de células
T tipo 1 (VLHT-1), anticuerpo del Treponema
pallidum (TP), etcétera. Además, también pueden mencionarse
diversos marcadores del músculo cardiaco (creatina cinasa (CKMB),
mioglobina, troponina), diversas hormonas, proteínas séricas,
etcétera.
Además, el método de medición de la presente
invención es un ensayo heterogéneo que usa una primera sustancia
soportada mediante un soporte sólido y que se une de manera
específica a un analito y una segunda sustancia que se une de
manera específica al analito. Un método de este tipo puede ser
cualquier método siempre que comprenda una etapa de reacción de
permitir que el analito mencionado anteriormente en una muestra que
contiene sangre completa reaccione con la primera y segunda
sustancias y una etapa de medición de medir el producto de reacción
formado.
De manera específica, se forma un sistema de
reacción que incluye la muestra mencionada anteriormente, la
primera sustancia soportada mediante un soporte sólido y que se une
de manera específica a un analito y una segunda sustancia que se
une de manera específica al analito, y se hace reaccionar el analito
con la primera y segunda sustancias. Aunque pueden hacerse
reaccionar de manera simultánea o sucesiva la primera y segunda
sustancias con el analito, es preferible hacerlas reaccionar de
manera sucesiva. En la primera realización, por ejemplo, se añaden
la primera sustancia y la segunda sustancia a la muestra. En la
segunda realización, el método comprende dos etapas de reacción,
por ejemplo, una primera etapa de reacción de añadir la primera
sustancia a una muestra y permitir que reaccionen para formar un
primer producto de reacción y una segunda etapa de reacción de
añadir la segunda sustancia al primer producto de reacción y
permitir que reaccionen para formar un segundo producto de
reacción. En la presente invención, la expresión "para formar un
sistema de reacción que incluye una muestra, una primera sustancia
y una segunda sustancia" incluye por tanto una realización en la
que los tres componentes se hacen reaccionar de manera simultánea
(es decir, que comprende una etapa de reacción) y una realización
en la que se hacen reaccionar de manera sucesiva (es decir, que
comprende dos etapas de reacción).
Tras la primera etapa de reacción de hacer
reaccionar el analito con la primera sustancia para formar el primer
producto de reacción, es preferible realizar una separación B/F
(primera etapa de separación). Además, tras la segunda etapa de
reacción de hacer reaccionar la segunda sustancia con el primer
producto de reacción después de la separación B/F para formar el
segundo producto de reacción, es preferible realizar la segunda
separación B/F (segunda etapa de separación). Con estos
procedimientos, la medición puede realizarse con una sensibilidad
todavía mayor. Las condiciones en cada una de estas etapas pueden
seleccionarse adecuadamente dependiendo de la combinación de un
analito y las sustancias que se unen de manera específica al
mismo.
De manera específica, por ejemplo, cuando se
hacen reaccionar anticuerpos y antígenos y se mide la cantidad del
producto de reacción, la medición puede realizarse tal como sigue.
Es decir, se mezclan los antígenos o anticuerpos contenidos en la
sangre completa con un soporte sólido que soporta anticuerpos o
antígenos que se unen de manera específica a los mismos (primera
sustancia) y otro tipo de anticuerpos o antígenos marcados (segunda
sustancia) para formar inmunocomplejos. Luego, se eliminan los
anticuerpos y antígenos sin reaccionar mediante lavado (separación
B/F), y se mide la cantidad de sustancia marcada unida al soporte
sólido. De manera más específica, por ejemplo, se colocan una
muestra que contiene sangre completa y partículas magnéticas
(soporte sólido) que soportan la primera sustancia en un vaso de
reacción y se agitan, y entonces se permite la reacción
antígeno-anticuerpo a una temperatura predeterminada
durante un tiempo predeterminado. Tras la reacción, se eliminan las
sustancias sin reaccionar del vaso de reacción mediante separación
B/F usando una fuerza magnética. Posteriormente, se coloca la
segunda sustancia marcada en un vaso de reacción, se hace reaccionar
a una temperatura predeterminada durante un tiempo predeterminado y
se somete a separación B/F usando una fuerza magnética de nuevo
para eliminar las sustancias sin reaccionar. Por último, puede
medirse la cantidad de analito midiendo la cantidad de la sustancia
marcada contenida en el producto de reacción producido.
El soporte sólido no está limitado de manera
particular siempre que sea sustancialmente insoluble en diversas
disoluciones usadas en la medición. Sin embargo, preferiblemente se
usan partículas magnéticas y polímeros tales como poliestireno o
látex del mismo, gelatina, liposoma y similares. Entre éstos,
particularmente se prefieren las partículas magnéticas con vistas a
la realización de una separación B/F rápida y sencilla. Ejemplos
específicos de las mismas incluyen partículas magnéticas compuestas
por micropartículas de metales tales como tetraóxido de trihierro
(Fe_{3}O_{4}), trióxido de dihierro (Fe_{2}O_{3}), diversas
ferritas, hierro, manganeso, níquel, cobalto y cromo, aleaciones de
cobalto, níquel, manganeso, etcétera. Además, también es preferible
usar estas partículas magnéticas preparadas de manera que están
contenidas en látex de polímeros tales como poliestireno, gelatina,
liposoma o similares o inmovilizadas sobre superficies de tales
materiales.
Los tamaños de partícula de estos soportes
sólidos no están limitados de manera particular siempre que pueda
realizarse de manera precisa la separación B/F. Sin embargo, un
tamaño de partícula excesivamente pequeño da como resultado mala
eficiencia de separación, y por tanto se produce fácilmente
agregación. Por otro lado, un tamaño de partícula excesivamente
grande da fácilmente como resultado sedimentación. Por tanto, el
límite inferior del tamaño de partícula es de 0,05 \mum,
preferiblemente 0,1 \mum y el límite superior es adecuadamente de
10 \mum, preferiblemente 4 \mum, más preferiblemente 2 \mum.
El intervalo del tamaño de partícula se define mediante una
combinación de estos límites superiores y límites inferiores. El
intervalo específico del tamaño de partícula del soporte es
habitualmente de 0,05 a 10 \mum, preferiblemente de 0,05 a 4
\mum, más preferiblemente de 0,1 a 2 \mum.
La primera sustancia que se une de manera
específica a un analito puede transportarse mediante tales soportes
sólidos usando métodos convencionales conocidos per se. De
manera específica, por ejemplo, pueden mencionarse métodos de unión
química, métodos de adhesión física, etcétera.
La separación B/F en el método de medición que
usa el soporte sólido preparado tal como se describió anteriormente
puede realizarse mediante métodos de filtración, técnicas de captura
de anticuerpos, métodos de precipitación y similares. En
particular, cuando se usan partículas magnéticas, puede realizarse
de manera rápida y conveniente la separación B/F mediante la
generación de un campo magnético con un imán permanente, electroimán
o similares para utilizar una fuerza magnética.
El método de medición de la presente invención
es un método caracterizado porque (1) la etapa de reacción
mencionada anteriormente se realiza en un estado en el que no se
alteran las células sanguíneas, y (2) al menos la etapa de reacción
se realiza en presencia de una cantidad suficiente de un detergente
que no provoca hemólisis, no inhibe las reacciones del analito con
la primera y segunda sustancias que se unen de manera específica al
analito y puede impedir la influencia de un componente que existe en
el sistema de reacción sobre el sistema de reacción.
La expresión "un estado en el que no se
alteran las células sanguíneas" no está limitada siempre que la
etapa de reacción pueda realizarse sin alterar las células
sanguíneas en la sangre completa. Este estado significa un estado
en el que no se alteran las células sanguíneas o se altera un
pequeño número de células sanguíneas hasta un punto tal que la
medición no debe verse afectada. Como medios para realizar el estado
en el que no se alteran las células sanguíneas, pueden mencionarse
un método de adición de un detergente que no provoca hemólisis en
el sistema de reacción, un método de regulación de la presión
osmótica del sistema de reacción con una disolución isotónica tal
como solución salina fisiológica, un método de adición de iones
magnesio o similares al sistema de reacción para impedir la
alteración de los núcleos de las células, etcétera. Además, estos
métodos pueden usarse en combinación.
El detergente usando en la presente invención no
está limitado de manera particular siempre que sea de una
concentración y tipo que no provoca hemólisis, no inhibe las
reacciones de un analito y la primera y segunda sustancias que se
unen de manera específica al analito y puede impedir la influencia
de un componente que existe en un sistema de reacción sobre el
sistema de reacción. La expresión "no provoca hemólisis" usada
en el presente documento significa que no provoca hemólisis o la
hemólisis es tan débil que la medición no se ve afectada cuando se
mezcla el detergente con una muestra que contiene sangre completa.
La expresión "no inhibe las reacciones de un analito y la primera
y segunda sustancias que se unen de manera específica al
analito" significa que el detergente no inhibe la formación de un
producto de reacción mediante la unión bioquímicamente específica
de estas sustancias, o la inhibición es tan débil que la medición no
se ve afectada. La expresión "impide la influencia de un
componente que existe en un sistema de reacción sobre el sistema de
reacción" significa que el detergente suprime la agregación no
específica, la adhesión sobre la pared interna de un vaso de
reacción o a una punta de pipeta, las uniones diferentes de las
uniones específicas objetivo, etcétera, provocadas por las células
sanguíneas, otros componentes o similares que existen en el sistema
de reacción para impedir la influencia de los mismos durante la
etapa de reacción.
Mediante la adición de un detergente al sistema
de reacción tal como se describió anteriormente, puede impedirse la
hemólisis, puede impedirse la adhesión no específica de soportes
sólidos tales como partículas magnéticas sobre la pared interna de
un vaso de reacción o una punta de pipeta, y puede evitarse la
influencia provocada por componentes de células sanguíneas y
células sanguíneas durante la medición, y de ese modo puede
realizarse una medición precisa.
En la presente invención, de manera
particularmente preferible se usan detergentes del tipo éster de
polioxietileno-sorbitano o del tipo
sulfobetaína.
Ejemplos de detergentes del tipo éster de
polioxietileno-sorbitano incluyen monolaurato de
polioxietileno-sorbitano (Tween 20), monooleato de
polioxietileno-sorbitano (Tween 80), etcétera. Entre
éstos, se usa deseablemente monooleato de
polioxietileno-sorbitano (Tween 80), que tiene
acción hemolítica débil.
Ejemplos de los detergentes del tipo
sulfobetaína incluyen propanosulfonato de dimetiletilamonio,
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato,
propanosulfonato de dimetilbencilamonio,
n-octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
n-decil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
n-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
n-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
n-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
etcétera. Entre éstos, se usan de manera particularmente deseable
propanosulfonato de dimetiletilamonio,
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato,
propanosulfonato de dimetilbencilamonio,
n-octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
que tienen acción hemolítica débil.
Estos detergentes pueden mezclarse con la sangre
completa mediante su adición a la disolución de tratamiento de
sangre completa como tratamiento previo antes de la etapa de
reacción de formar un sistema de reacción que incluye una muestra y
primera y segunda sustancias que se unen de manera específica a un
analito contenido en la muestra y hacer reaccionar el analito y la
primera y segunda sustancias. Sin embargo, dado que los detergentes
mencionados anteriormente no inhiben sustancialmente las reacciones
del analito y la primera y segunda sustancias que se unen de manera
específica al mismo, por ejemplo, cuando se usa una disolución de
anticuerpos inmovilizados sobre una fase sólida como la primera
sustancia soportada mediante el soporte sólido, los detergentes
pueden añadirse a la disolución de antemano de manera que se
permite que la disolución reaccione directamente con la muestra que
contiene sangre completa. Además, es suficiente que se añadan los
detergentes al menos durante la primera etapa de reacción, en la
que muchas células sanguíneas están contenidas en la mezcla de
reacción. Sin embargo, dado que también tienen un efecto de
inhibición de la adhesión o agregación no específica del soporte
sólido, preferiblemente también se añaden los detergentes
durante la segunda etapa de reacción. Pueden añadirse durante todas las etapas incluyendo la etapa de medición.
durante la segunda etapa de reacción. Pueden añadirse durante todas las etapas incluyendo la etapa de medición.
Tales detergentes pueden añadirse a cualquier
concentración siempre que se añadan a una concentración tal que
deben ejercerse los efectos mencionados anteriormente. De manera
específica, se añaden a una concentración final durante la etapa de
reacción en el intervalo, por ejemplo, del 0,5 al 5%, más
preferiblemente del 0,5 al 2%. Un tipo de tales detergentes puede
usarse de manera única, o puede usarse una mezcla de dos o más
tipos. Cuando se usan dos o más tipos, también pueden usarse en una
combinación arbitraria a una concentración en un intervalo tal que
deben ejercerse los efectos mencionados anteriormente. Además,
cuando el detergente se usa en una disolución de tratamiento de
sangre completa, la disolución de tratamiento de sangre completa
puede prepararse de manera que la concentración de detergente en la
disolución debe estar en el intervalo del 0,5 al 30%, y usarse. La
razón de mezclado de la disolución de tratamiento de sangre completa
que contiene un detergente, la que se prepara tal como se describió
anteriormente, y la sangre completa puede ser una razón tal que el
detergente debe tener una concentración en el intervalo de
concentración mencionado anteriormente en la muestra que contiene
sangre completa después del mezclado. Además, la razón de mezclado
se determina preferiblemente teniendo en cuenta la cantidad de
analito contenido en la muestra. Cuando debe medirse una sustancia
de cantidad traza contenida en la muestra en una cantidad pequeña,
se determina preferiblemente que la proporción de la disolución de
tratamiento de sangre completa sea pequeña. De manera específica,
por ejemplo, la razón de mezclado de sangre completa y la
disolución de tratamiento de sangre completa puede estar en el
intervalo de 99:1 a 5:95.
La disolución de tratamiento de sangre completa
usada en la presente invención puede seleccionarse de manera
arbitraria y usarse siempre que la disolución esté en una cantidad
tal o tenga una característica tal que no deben hemolizarse los
componentes de células sanguíneas en la sangre completa, o no deben
desnaturalizarse diversos componentes. Ejemplos específicos de la
misma incluyen disoluciones ajustadas a pH fisiológico, presión
osmótica, concentración de sales, etcétera, tales como tampón
fosfato (solución salina tamponada con fosfato; PBS), solución
salina fisiológica y disoluciones de sales fisiológicas. Además,
cualquier disolución diferente de las disoluciones preparadas tal
como se describió anteriormente también puede mezclarse siempre que
esté en una cantidad tal que no deben verse afectados los
componentes de las células sanguíneas y otros componentes. Sin
embargo, si el analito es una sustancia contenida en la sangre
completa solamente en una cantidad extremadamente pequeña, la
medición se realiza preferiblemente con la propia sangre completa o
sangre completa mezclada con una disolución de tratamiento de
sangre completa a una proporción de mezclado baja.
Preferiblemente se marca la segunda sustancia.
Ejemplos de la sustancia de marcaje incluyen enzimas, sustancias
luminiscentes, sustancias fluorescentes, isótopos radioactivos,
sustancias colorantes, diversas partículas coloreadas, etcétera.
Entre éstas, se usan preferiblemente las enzimas. Ejemplos de
enzimas usadas con frecuencia en el inmunoensayo enzimático por
quimioluminiscencia (CLEIA) incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa,
galactosidasa, glucoxidasa, etcétera. Como substratos de estas
enzimas, pueden seleccionarse aquellos que corresponden a estas
enzimas. Por ejemplo, puede usarse
adamantilmetoxifenilfosforildioxetano (AMPPD) para la fosfatasa
alcalina, luminol/peróxido para la peroxidada, y
adamantilmetoxifenil-\beta-D-galactosildioxetano
(AMPGD) para la galactosidasa.
Como el método de medición del producto de
reacción, puede usarse cualquier método convencional conocido per
se. Por ejemplo, cuando se usa la segunda sustancia marcada tal
como se describió anteriormente, la medición puede realizarse de
manera conveniente midiendo la cantidad de la sustancia marcada en
el producto de reacción. Por ejemplo, cuando se usa el inmunoensayo
enzimático por quimioluminiscencia (CLEIA), puede medirse la
intensidad de la luminiscencia de la sustancia marcada en el
producto de reacción usando un tubo fotomultiplicador (PMT) o
similares.
Es decir, en la presente invención, la expresión
"medir un producto de reacción" no sólo significa la medición
directa de la cantidad del propio producto de reacción, sino que
también incluye la medición de la cantidad de sustancias
cuantitativamente relacionadas con la cantidad del producto de
reacción. La cantidad de un analito que se mide en la muestra puede
calcularse a partir de la cantidad del producto de reacción medido
tal como se describió anteriormente. Además, la medición
cualitativa para determinar la presencia o ausencia del producto de
reacción también cae dentro del alcance de la medición del producto
de reacción según la presente invención.
Además, cuando se usa sangre completa para la
medición, generalmente se requiere la corrección del hematocrito
después de la medición. En la mayoría de las muestras, los valores
de hematocrito se vuelven aproximadamente del 40 al 50%. Además,
cuando se realiza la medición cualitativa como elemento de medición
para la determinación positiva o negativa como en el caso de
enfermedades infecciosas, la corrección del hematocrito no es tan
importante. Por tanto, no existe ningún problema práctico incluso
cuando no se mide el valor de hematocrito para cada muestra. Cuando
el valor de hematocrito está disponible, por supuesto puede
obtenerse un resultado más preciso del ensayo mediante la
realización de la corrección del hematocrito [resultado del ensayo x
100/(100 - valor de hematocrito (%))].
El kit de reactivos de la presente invención es
un kit de reactivos para medir un analito en sangre completa, que
comprende una primera sustancia soportada mediante un soporte sólido
y que se une de manera específica al analito, una segunda sustancia
que se une de manera específica al analito y un detergente que no
provoca hemólisis ni inhibe las reacciones del analito con la
primera sustancia y la segunda sustancia cuando se mezcla con la
sangre completa. El kit de la presente invención se proporciona con
la misma configuración que la de kits convencionales para medir un
analito en plasma o suero excepto porque se incluye el detergente
mencionado anteriormente. Es decir, el kit de reactivos de la
presente invención se usa en el método de medición mencionado
anteriormente de la presente
invención.
invención.
Preferiblemente, el kit de reactivos incluye
además una disolución de tratamiento de sangre completa. La
disolución de tratamiento de sangre completa puede contener un
detergente de este tipo tal como se describió anteriormente. Como
componentes arbitrarios, el kit de reactivos puede incluir además un
diluyente de la reacción, una disolución de sustrato, una
disolución que disuelve el sustrato, una disolución de lavado, una
disolución de terminación de la reacción, etcétera. Mediante el uso
de un kit de reactivos de este tipo, el método de medición de la
presente invención puede realizarse de manera rápida y conveniente
con precisión y estabilidad buenas.
El método de medición de la presente invención
puede realizarse usando instrumentos, cartuchos, etcétera, para
medición automática conocidos per se. Ejemplos específicos de
los mismos incluyen los cartuchos e instrumentos descritos en el
documento WO01/84152, la publicación de patente japonesa abierta a
consulta por el público número 11-316226, etcétera.
Además, el kit de reactivos de la presente invención también se
envasa en un cartucho de este tipo para medición automática y se
usa de manera adecuada en los instrumentos para medición automática
mencionados anteriormente. Mediante el uso del kit de reactivos de
la presente invención en combinación con tales instrumentos y
cartuchos para medición automática, puede proporcionarse un método
de medición rápido, conveniente y sumamente sensible.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará de manera más
específica con referencia a los siguientes ejemplos. Si embargo, el
alcance de la presente invención no está limitado por estos
ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adhirieron físicamente anticuerpos
policlonales anti-HBsAg sobre partículas magnéticas
(0,3 \mum) en tampón fosfato 50 mM (pH 4,0) y luego se trataron
con tampón Tris (0,1 M, pH 8,0) que contenía BSA al 0,2% a 37ºC
durante 1 día para producir partículas unidas a anticuerpos
anti-HBsAg. Se suspendieron las partículas
magnéticas producidas en tampón Tris 0,1 M (pH 8,0) a una
concentración de 100 a 200 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se conjugaron anticuerpos monoclonales
anti-HBsAg con fosfatasa alcalina bovina (ALP)
mediante el método de maleimida para producir anticuerpos
anti-HBsAg marcados con ALP. Se suspendieron los
anticuerpos marcados producidos en tampón Tris 0,1 M (pH 8,0) a una
concentración de 0,2 a 0,5 \mug/ml y se usaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó tampón Tris 0,1 M que contenía Tween
20 al 1% y NaCl 0,15 M (pH 8,0).
\vskip1.000000\baselineskip
Como un sustrato de luminiscencia, se usó la
disolución de AMPPD 25 mM (Tropix).
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se confirmó el rendimiento de
los reactivos producidos en el ejemplo 1. Se evaluó el rendimiento
usando suero control positivo y suero control negativo para HBsAg
como muestras, si usar sangre completa. En el ensayo, a 60 \mul
de muestra se les añadieron 150 \mul de partículas magnéticas, se
agitaron y se incubaron a 42ºC durante 10 minutos. Luego, se
recogieron las partículas magnéticas mediante un imán y se lavaron
con la disolución de lavado B/F. Posteriormente, a las partículas
magnéticas lavadas se les añadieron 150 \mul de anticuerpos
marcados, se agitaron y se incubaron a 42ºC durante 10 minutos de
nuevo. Luego, se recogieron las partículas magnéticas mediante un
imán y se lavaron suficientemente con la disolución de lavado B/F.
Además, a las partículas magnéticas lavadas se les añadieron 200
\mul de la disolución de AMPPD, se mezclaron suficientemente y se
incubaron a 42ºC durante 5 minutos. Entonces, se midió la intensidad
de la luminiscencia usando un tubo fotomultiplicador (PMT).
Se repitió la medición anterior durante 12 días,
y se examinó la reproducibilidad entre las mediciones diarias. Como
resultado, se obtuvieron resultados favorables tal como se muestra
en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un examen suponiendo que se
añadió un detergente al sistema de reacción mediante la adición del
detergente a una disolución de tratamiento de sangre completa de
antemano. Se prepararon las disoluciones de tratamiento de sangre
completa disolviendo diversos detergentes en tampón Tris 0,1 M (pH
8,0) que contenía BSA al 1% y NaCl 0,15 M, y se examinó qué
detergente era adecuado para el método de medición de la presente
invención.
Se extrajo sangre usando un tubo para extracción
de sangre con EDTA. Luego, se añadió 1 U/ml de HBsAg a cada una de
la sangre completa almacenada a 4ºC durante 3 días y el plasma
obtenido a partir de la sangre completa mediante centrifugación, y
se realizó una prueba de recuperación para determinar HBsAg usando
la intensidad de la luminiscencia obtenida en la medición usando
plasma, que se consideró como el 100%. En la sangre completa, los
componentes de las células sanguíneas se precipitaron durante el
almacenamiento a 4ºC, y se observó una ligera hemólisis en la parte
de plasma. Se midió la cantidad de las células hemolizadas mediante
otro método, y se encontró que la hemólisis se produjo en
aproximadamente el 5% de los eritrocitos totales.
El ensayo se realizó de la misma manera que en
el ejemplo 2. La sangre completa y cada una de las diversas
disoluciones de tratamiento de sangre completa se mezclaron a una
razón de 9:1, el plasma se mezcló con agua purificada a una razón
de 9:1, y se midió inmediatamente el HBsAg. Además, se mezcló sangre
completa con el tampón mencionado anteriormente (tampón Tris 0,1 M
(pH 8,0) que contenía BSA al 1% y NaCl 0,15 M) sin añadir un
detergente en lugar de una disolución de tratamiento de sangre
completa, y se midió el HBsAg de la misma manera. La presencia o
ausencia de hemólisis en el sistema de reacción, la adhesión no
específica de partículas magnéticas sobre el vaso de reacción
(hecho de polipropileno) y la agregación no específica de partículas
magnéticas durante la reacción se confirmaron mediante inspección
visual. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tal como se muestra en la tabla 2, cuando se usó
sangre completa como muestra, los resultados de medición para la
razón de recuperación fueron el 85% o mayores en las muestras
mezcladas con Tween 20, Tween 80 ó
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato,
o una muestra que no contenía detergente (tampón Tris 0,1 M (pH
8,0) que contenía BSA al 1% y NaCl 0,15 M). Entre éstos, la razón
de recuperación de la muestra que no contenía un detergente apareció
favorable. Sin embargo, una gran cantidad de partículas magnéticas
se adhirieron sobre la pared interna del vaso de reacción, por
tanto no se realizó bien el lavado B/F, y por tanto no podía
considerarse que se habían obtenido resultados correctos del
ensayo. Por tanto, posteriormente se examinaron adicionalmente las
muestras mezcladas con Tween 20, Tween 80 y
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato.
Además, en este experimento se demostró que,
mediante el uso de la técnica descrita anteriormente, podían
seleccionarse fácilmente de diversos detergentes las concentraciones
y los tipos de los detergentes que no causaban hemólisis
sustancial, no inhibían las reacciones de un analito y las
sustancias que se unen de manera específica al analito y que podían
impedir la influencia de componentes que existían en el sistema de
reacción sobre el sistema de reacción en un sistema de reacción
objetivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo sangre usando un tubo para extracción
de sangre tratado con heparina como anticoagulante. Se añadieron
0,5 U/ml de HBsAg a cada una de sangre completa almacenada durante
la noche a 4ºC y plasma obtenido a partir de la misma, y se realizó
una prueba de adición y recuperación de la misma manera que en el
ejemplo 3 usando la intensidad de luminiscencia en el plasma, la
que se consideró como el 100%. Para las disoluciones de tratamiento
de sangre completa, se usaron Tween 20, Tween 80 y
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato
seleccionados en el ejemplo 3 así como Triton X-100
para la comparación. Se añadió cada detergente a una concentración
del 0,01, 0,1, 0,5, 1 y 10% como concentración final después del
mezclado con sangre completa. La presencia o ausencia de hemólisis
en el sistema de reacción, la adhesión no específica de partículas
magnéticas sobre el vaso de reacción (hecho de polipropileno) y la
agregación no específica de partículas magnéticas durante la
reacción se confirmaron mediante inspección visual para cada
detergente en cada sistema de reacción, y se determinó la razón de
recuperación con respecto a la cantidad añadida. Los resultados se
muestran en la tabla 3.
A partir de los resultados del ensayo, se
seleccionaron los detergentes que proporcionaron una razón de
recuperación favorable con respecto a la cantidad añadida sin
provocar hemólisis o adhesión no específica de partículas
magnéticas sobre el vaso de reacción. Como resultado, se obtuvieron
resultados particularmente favorables cuando se añadió Tween 80 a
una concentración del 0,5 al 10%, o cuando se añadió
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato
a una concentración del 1%. Cuando se añadió Triton
X-100 a una concentración del 0,5%, se observó
hemólisis, aunque la razón de recuperación fue el 75%, que fue
generalmente favorable. Además, cuando se añadió Tween 20 a una
concentración del 1 al 10%, no pudo obtenerse suficiente razón de
recuperación con respecto a la cantidad añadida, aunque no se
observaron hemólisis ni adhesión no específica de partículas
magnéticas sobre el vaso de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Posteriormente, se examinaron
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato
y Tween 80 seleccionados en el ejemplo 4 usando sangre fresca. En
pruebas emergentes, en particular, es deseable realizar un ensayo
inmediatamente después de la extracción de sangre, y los
eritrocitos en la sangre completa pueden hemolizarse gradualmente
durante el almacenamiento, afectando posiblemente a la medición.
Por tanto, se realizó un examen usando sangre fresca inmediatamente
después de la extracción de sangre. Se realizó una prueba de adición
y recuperación para determinar HBsAg de la misma manera que en el
ejemplo 3. Se prepararon disoluciones de tratamiento de sangre
completa añadiendo
3-(1-piridino)-1-propanosulfonato,
Tween 80 y una mezcla de los mismos. Los resultados se muestran en
la tabla 4.
Como resultado de la medición, se obtuvo una
razón de recuperación favorable del 86 al 102%, incluso cuando se
usó sangre completa fresca.
Según el método de la presente invención, puede
medirse un analito de manera rápida y conveniente con alta
sensibilidad usando sangre completa tal cual es como muestra.
Claims (13)
1. Método para medir un analito en sangre
completa, que comprende:
una etapa de reacción de formar un sistema de
reacción que contiene una muestra que contiene sangre completa, una
primera sustancia que está soportada mediante un soporte sólido y se
une de manera específica a un analito contenido en la muestra y una
segunda sustancia que se une de manera específica al analito para
permitir que el analito reaccione con la primera y segunda
sustancias, y
una etapa de medición de medir un producto de
reacción formado,
en el que dicho sistema de reacción comprende un
detergente en el intervalo de concentración del 0,5 - 5% de manera
que se impide la hemólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el detergente se selecciona del grupo que consiste en detergentes
del tipo éster de polioxietileno-sorbitano y
detergentes del tipo sulfobetaína.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la muestra que contiene sangre completa se obtiene mezclando
sangre completa y una disolución que contiene el detergente, y la
sangre completa y la disolución se mezclan de manera que la
concentración de detergente es del 0,5 - 5%.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
el detergente se selecciona del grupo que consiste en detergentes
del tipo éster de polioxietileno-sorbitano y
detergentes del tipo sulfobetaína.
5. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el
que la razón de sangre completa y la disolución que contiene el
detergente está en el intervalo de 99:1 a 5:95.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la disolución que contiene el
detergente contiene además la primera sustancia que se une de
manera específica al analito.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa de reacción de permitir
que el analito reaccione con la primera y segunda sustancias
comprende una primera etapa de reacción de permitir que la primera
sustancia reaccione con la muestra que contiene sangre completa para
formar un primer producto de reacción y una segunda etapa de
reacción de permitir que la segunda sustancia reaccione con el
primer producto de reacción para formar un segundo producto de
reacción.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la segunda sustancia se marca con
una sustancia de marcaje.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera y segunda sustancias
que se unen de manera específica al analito son antígeno o
anticuerpo.
10. Método según la reivindicación 1, que
comprende:
(1) una etapa de dilución de diluir sangre
completa mezclando la sangre completa con una disolución que
contiene un detergente de manera que la concentración de detergente
es del 0,5 - 5%;
(2) una primera etapa de reacción de añadir una
primera sustancia, que está soportada mediante un soporte sólido y
se une de manera específica al analito a la sangre completa diluida
para permitir que reaccionen para formar un primer producto de
reacción en un sistema de reacción;
(3) una primera etapa de separación de separar
el primer producto de reacción que se forma en la primera etapa de
reacción del sistema de reacción;
(4) una segunda etapa de reacción de añadir una
segunda sustancia, que se une de manera específica al analito al
primer producto de reacción separado para permitir que reaccionen
para formar un segundo producto de reacción en un sistema de
reacción;
(5) una segunda etapa de separación de separar
el segundo producto de reacción que se forma en la segunda etapa de
reacción del sistema de reacción; y
(6) una etapa de medición de medir el segundo
producto de reacción separado.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Método según la reivindicación 10, en el que
la segunda sustancia se marca con una sustancia de marcaje.
12. Método según la reivindicación 11, en el
que la primera y segunda sustancias que se unen de manera específica
al analito son antígeno o anticuerpo.
13. Kit de reactivos para medir un analito en
sangre completa, que comprende una primera sustancia que está
soportada mediante un soporte sólido y se une de manera específica
al analito, una segunda sustancia que se une de manera específica
al analito, y una disolución que contiene un detergente que se
ajusta de manera que la concentración de detergente es del
0,5-5% cuando se mezcla la disolución con la sangre
completa.
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