JP4585708B2 - 複合体を形成する物質の測定方法及び測定試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、そのリガンドと複合体を形成する物質の、遊離状態における前記物質だけを測定することができる測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野、食品衛生分野、若しくは環境衛生分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
そのリガンドと複合体を形成する物質は、種々存在するが、このような物質を測定する場合には様々な問題が生じる。
なお、ここで、リガンドとは、ある特定のタンパク質物質と特異的に結合する物質を意味する。
【０００３】
リガンドと複合体を形成する物質について、以下、プロテインＳを例に挙げて説明を行う。
プロテインＳは、主にヒト血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する第Ｖａ因子、及び第ＶＩＩＩａ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
【０００４】
プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質、Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。
【０００５】
このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、下記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。
【０００６】
（なお、本明細書において、「測定対象物質」、「リガンド」、「プロテインＳ」、又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に記載が無い場合は、それぞれ他の物質とは結合しておらず遊離状態にあるものを意味する。）
【０００７】
【化１】
【０００８】
このプロテインＳの測定法の一つとして、最近、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらが、下記の方法を示した。〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年、及びＷＯ９８／２３９６３号公報〕
【０００９】
（１） まず、Ｃ４ｂ結合タンパク質をウェルに固定化したマイクロプレートに、試料であるヒト血漿を室温下で接触させて、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に試料中のプロテインＳを特異的に結合させて、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合によりプロテインＳをマイクロプレートに間接的に固定化させた後に洗浄し、固定化されない成分を除去する。
【００１０】
（２） その後、プロテインＳに対するマウス抗体（抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体）にホースラディッシュ由来のパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識化させたパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を、前記（１）の操作を行ったマイクロプレートのウェルに室温下で接触させることによりプロテインＳに特異的に結合させて、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体−プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合を形成させた後洗浄し、結合しなかった遊離のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を除去する。
【００１１】
（３） ここに、１，２−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と過酸化水素を添加し、標識パーオキシダーゼの酸化触媒作用によりロイコ型色素を室温下で生成させ、このロイコ型色素の発色、又はその吸光度を測定することにより、試料中におけるプロテインＳの存在の有無、又は濃度を知ることができるものである。（図１８を参照願います。）
【００１２】
この測定方法は、担体に固相化した測定対象物質のリガンドと、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うものであるので、担体に固相化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）と、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay；固相酵素免疫測定法）のサンドイッチ法の変法と考えることができるが、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらは上記の測定方法をＥＬＳＡ法（enzyme-linked ligandsorbent assay）と称している。
【００１３】
しかしながら、本発明者らは、以上のような測定方法にも下記のような重大な問題点があることに気付いた。
それは、測定対象物質のプロテインＳだけではなく、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体も測り込んでしまい、プロテインＳの測定値に正の誤差が生じてしまうことである。
【００１４】
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合することができないので、本来はＤａｈｌｂｅａｃｋらの測定法では、測定されない（シグナルが出ない）はずである。
【００１５】
しかしながら、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の精製品を試料として測定した場合、プロテインＳの精製品を試料とした時と同じようにシグナルが生成し、測定された。
【００１６】
すなわち、試料中のプロテインＳの測定を、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの測定法で行った場合、試料中に含まれるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をも測り込んでしまい、正の誤差が生じた。
【００１７】
この理由は、次のような理由によるものと考える。
試料中に含まれていたプロテインＳが、マイクロプレートのウェルに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合すると、遊離状態のプロテインＳの反応液中における濃度は減少する。
【００１８】
そうすると、下記の反応の平衡が左に移動し、やはり試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離して、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質がそれぞれ１分子ずつ生成する。
【００１９】
【化２】
【００２０】
ここでプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体より生じたプロテインＳが、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合して固定化されることより、結果的にシグナルが生成してしまう。
【００２１】
以上のことより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が、プロテインＳとして測り込まれてしまうため、プロテインＳの測定時に正誤差を生じてしまう。
【００２２】
以上、試料中のプロテインＳを前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法で測定する場合を例に説明したが、測定方法（測定原理）が、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法（原理）のものであって、かつ、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合には、いずれの場合でも同じ問題が生じる可能性がある。
【００２３】
つまり、試料中の測定対象物質の測定時に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応が起こり、この複合体の解離により生じた測定対象物質が測定対象物質に特異的に結合する物質と結合することにより、測定に正の誤差が生じてしまうという問題である。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前述の従来の測定法及び測定試薬が有する問題点の解決であり、すなわち、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができる測定方法、及び測定試薬を提供することである。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせることを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定方法である。
【００２６】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００２７】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００２８】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００２９】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００３１】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００３２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ〜以下の濃度であることが好適である。
【００３３】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００３４】
また、本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせるようにしたことを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定試薬である。
【００３５】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００３６】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００３７】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００３８】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３９】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００４０】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００４１】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００４２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬は、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質ということがある。）との結合反応を行わせることを特徴とするものである。
【００４４】
すなわち、下の反応式（１）における右から左への解離反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応〔反応式（２）〕を行わせることを特徴とするものである。
【００４５】
【化３】
【００４６】
本発明においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができるのであれば、いかなる方法、手段であっても特に制限無く用いることができる。
【００４７】
例えば、この測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００４８】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００４９】
また、前記の条件の例として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００５０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００５１】
更に、前記の条件の例として、塩濃度（イオン強度）を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００５２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００５３】
このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせることにより、以下のことを達成することができる。
【００５４】
また、測定試薬においては、このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるように試薬の成分を選択、調整することにより、以下のことを達成することができる。
【００５５】
すなわち、測定時に、試料中に含有される測定対象物質が、特異的結合物質と結合することにより、測定反応系中では、遊離状態の測定対象物質の濃度が減少し、これにより下記の反応の平衡が左に移動して、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質が生成することを防ぐことができることである。
【００５６】
【化４】
【００５７】
これにより、試料中にもともと含有される測定対象物質だけを、下記の反応により特異的結合物質に結合させて、検出を行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みを防止して、正確な試料中の測定対象物質の測定が行えるようになる。
【００５８】
【化５】
【００５９】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬において、試料とは、測定対象物質を含有する可能性がある物質であって、そして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体をも含有する可能性があるものである。
【００６０】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト、動物、又は植物などに由来する試料）、食品、飲料、環境試料等を挙げることができる。
【００６１】
生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、糞便、精液、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液；糞便の抽出液若しくは懸濁液、菌体などの抽出液、又は植物の抽出液等を挙げることができる。
【００６２】
食品としては、例えば、肉、魚介類、野菜、果物、若しくは加工食品などの抽出液又は懸濁液等を挙げることができる。
【００６３】
飲料としては、例えば、水道水、井戸水、又は牛乳等を挙げることができる。
環境試料としては、例えば、土壌、若しくは大気などの抽出液又は懸濁液、あるいは海水、河川水、湖沼水等を挙げることができる。
【００６４】
また、本発明の測定方法、及び測定試薬において、測定対象物質とは、試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を測定しようとする物質であって、そして、この「測定対象物質」と、「測定対象物質とそのリガンドとの複合体」の両方の物質が試料中に共に含有される可能性がある物質のことである。
【００６５】
この測定対象物質として、例えば、心身の状態を反映する物質、疾患のマーカー物質、食品若しくは飲料の安全性、栄養などを示す物質、又は環境の状況を示す物質等を挙げることができる。
【００６６】
この測定対象物質をより具体的に例示すると、例えば、血液凝固・線溶系にかかわる物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
プロテインＳ〔Ｃ４ｂ結合タンパク質〕等。
【００６７】
また、ホルモンを挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
総サイロキシン（Ｔ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離サイロキシン（ＦＴ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ3）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、リバース・トリヨードサイロニン〔Ｔ4結合グロブリンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、インスリン様成長因子（ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ）〔ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）〕、コルチコステロン〔コルチコステロイド結合タンパク質（ＣＢＧ）〕、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）〔アルブミン、又はテストステロン〕等。
【００６８】
そして、電解質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
鉄（トランスフェリン）、銅（セルロプラスミン）、カルシウム（タンパク質）、ヨウ素（タンパク質）等。
【００６９】
更に、抗原、抗体等の免疫反応に関する物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
補体Ｃ１ｑ〔免疫グロブリンとこれに対する抗原との免疫複合体〕等。
【００７０】
本発明における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬であるが、これは公知の免疫学的測定方法若しくは免疫学的測定試薬、又は遺伝子測定方法若しくは遺伝子測定試薬等を適用することができ、例えば、ラテックス凝集反応若しくは赤血球凝集反応などの間接凝集反応測定法、ラテックス比濁法、免疫比濁法、酵素免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法、又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された被検物質に対する特異的結合物質が固定され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる方法等を適用する測定方法及び測定試薬を挙げることができる。
【００７１】
本発明においては、前記の測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるものである。
【００７２】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応としては、抗原と抗体の抗原抗体反応（免疫反応）、主にタンパク質よりなる物質とそのリガンドとの反応、糖とレクチンの反応、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖の反応、又はレセプターとそれに対する物質の反応等、測定対象物質とこの測定対象物質に特異的な親和性を有し結合する物質（特異的結合物質）の間の反応を挙げることができる。
【００７３】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬キットにおいて、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、複数種類のものを組み合わせて利用してもよい。
【００７４】
例えば、特異的結合物質が測定対象物質に対する抗体であり、この抗体と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗体、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗体、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗体等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７５】
また、試料中の測定対象物質が抗体であって、特異的結合物質が測定対象物質である抗体にとっての抗原であり、この抗原と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗原、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗原、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗原等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７６】
更に、特異的結合物質が試料中の測定対象物質にとってのリガンドであり、このリガンドと測定対象物質との特異的結合反応を利用して測定を行う場合は、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記リガンド、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記リガンド等と、測定対象物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンド（前記リガンドと同種又は異種のリガンド）との複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７７】
そして、試料中の測定対象物質とこの測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）との結合反応における、測定対象物質と競合する物質（競合物質；例えば、測定対象物質自体、測定対象物質の一部、又は測定対象物質の一部若しくは全部の誘導体）と測定対象物質との競合を利用して測定を行う場合は、測定対象物質又は競合物質と、特異的結合物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７８】
なお、本発明により、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う場合において、一度、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせ、その後、洗浄操作を行い除去すること等により測定反応系に測定対象物質とそのリガンドとの複合体が既に存在しなくなっている場合には、特異的結合物質に結合している測定対象物質に更に特異的結合物質（先の特異的結合物質と同種又は異種のもの）を反応させ、結合させるとしても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる必要はない。
【００７９】
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬であるが、特異的結合物質などの試料中の測定対象物質の測定に必要な成分、及び測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制するための成分等よりなる試薬である。
【００８０】
この本発明の測定試薬は、その成分を分けた複数のものからなるものであってもよい。
【００８１】
◎ 本発明の測定を間接凝集反応測定法に適用して行う場合の説明
【００８２】
本発明の測定を、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応測定法などの担体粒子の凝集形成により測定を行う間接凝集反応測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【００８３】
この測定の手順の一例を以下に示す。
【００８４】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を溶液収容部分に固定化した測定容器を用意し、この第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に一定量の試料を添加して接触させる。
これにより、試料中の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化した第１特異的結合物質との結合反応を行わせる。
【００８５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００８６】
（例えば、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００８７】
▲２▼ この添加・接触と同時に又は一定時間のうちに、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）が固定化された粒子担体の一定量をこの溶液収容部分に添加して接触させる。
【００８８】
▲３▼ そして、これをミキサー等で一定時間撹拌した後静置して、試料中に測定対象物質が存在する場合には「測定容器の溶液収容部分−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合を形成させる。
【００８９】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００９０】
（例えば、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００９１】
▲４▼ 静置後、一定時間内にこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の溶液収容部分内における像を目視により判定又はマイクロプレートリーダー等の測定装置により測定し、凝集像が検出できれば試料中に測定対象物質が存在すると判定し、凝集像が検出できなければ試料中に測定対象物質は存在しないと判定することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【００９２】
この測定においては、測定容器の溶液収容部分内壁と粒子担体が試料中の測定対象物質を介して、「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」と結合することにより、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集像を得ることができるものである。
【００９３】
試料中の測定対象物質は、測定容器の溶液収容部分の内壁に固定化された第１特異的結合物質と、粒子担体に固定化した第２特異的結合物質の両方に結合するので、前記の結合を形成することができ、試料中の測定対象物質の量を反映した凝集像（測定容器の溶液収容部分の内壁面底部に広がった像、陽性像）が得られることになる。
【００９４】
これを図１９のＢに示した。
【００９５】
一方、試料中に測定対象物質が存在しない場合は、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合が形成されることはなく、つまり「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合は形成されないので、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体は測定容器の溶液収容部分の内壁面上を転がり（滑り）落ちてしまい、凝集像は得られずに底部に収束した像（陰性像）が生じる。
【００９６】
これを図１９のＡに示した。
【００９７】
よって、これにより試料中の測定対象物質のみを選択的に測定することができることとなる。
【００９８】
なお、段階的に希釈した試料のそれぞれを測定した時の、粒子担体による凝集像が得られる最大の希釈倍数である凝集価を求めることにより、試料中に含まれる測定対象物質の量を確かめることができる。
【００９９】
この凝集価の測定は、常法に従って行えばよく、例えば、まず、第１特異的結合物質を固定化した測定容器（マイクロプレート等）のウェル等の溶液収容部分に試料を添加し、これを緩衝液等よりなる試料の希釈液で段階的に希釈してその希釈列を作る。
【０１００】
この際、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０１】
次に各溶液収容部分に第２特異的結合物質の抗体を固定化した粒子担体を添加し、混合撹拌する。
【０１０２】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０３】
その後、静置してこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体による凝集の有無を判定又は測定し、凝集像が得られた最大の希釈倍数を凝集価として採用し、求めることができる。
【０１０４】
また、予め規定した希釈倍数で希釈した試料を本発明により測定し、この時の凝集の有無から試料中における測定対象物質の存在の有無を定性的に測定することもできる。
【０１０５】
なお、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第２特異的結合物質を固定化する粒子担体として磁性粒子を用い、この第２特異的結合物質を固定化した粒子担体に磁力を作用させることにより短時間で凝集像を生じさせることができる、特開平４−２１６４６６号公報及び特開平４−２４２１６７号公報に記載されているような測定方法を適用することもできる。
【０１０６】
そして、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、まず第２特異的結合物質を固定化した粒子担体と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質の測定を行うこともできる。
【０１０７】
この場合、粒子担体と試料を混合、接触させ反応させること、及びこれを測定容器の溶液収容部分に添加、接触させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０８】
更に、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に、予め第２特異的結合物質を固定化した粒子担体を存在させておき、この測定容器の溶液収容部分に試料を添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質を測定することもできる。
【０１０９】
この場合、粒子担体を存在させておいた測定容器の溶液収容部分に試料を添加、接触させ反応させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１１０】
本発明による試料中の測定対象物質の測定を間接凝集反応測定法により行う場合、測定容器としては、溶液を収容することができるものであれば、その種類、材質、形状等は特に制限されずに用いることができる。
【０１１１】
これは、赤血球やゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法において一般的に測定に用いられている容器については、問題なく用いることができる。
【０１１２】
例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を用いることができる。
【０１１３】
なお、測定容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが望ましい。
【０１１４】
粒子担体としては、一般に粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法に使用される粒子担体であれば特に制限無く用いることができる。
【０１１５】
例えば、ヒツジ赤血球等の動物赤血球、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子担体、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子担体又はその他の人工担体等を挙げることができる。
【０１１６】
また、前記の高分子粒子担体を強磁性体で被覆又は粒子成型時に強磁性体を分散させて調製した磁性粒子担体等を用いることもできる。
【０１１７】
これらの粒子担体は、粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲のものが好ましく、特に好ましくは０．５〜１０μｍのものである。
【０１１８】
また、これらの粒子担体の比重は、１〜１０の範囲が好ましく、特に好ましくは１〜２である。
【０１１９】
測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体に、特異的結合物質を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１２０】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１２１】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させ、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１２２】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体と特異的結合物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定容器の溶液収容部分の内壁面、粒子担体、特異的結合物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１２３】
更に非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質を固定化させた測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１２４】
特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１２５】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１２６】
また、特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１２７】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１２８】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１２９】
◎ 本発明の測定を標識物質を用いる測定法に適用して行う場合の説明
【０１３０】
本発明の測定を、ＥＬＩＳＡ法、ＥＬＳＡ法などの標識物質を用いる測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【０１３１】
この測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）に結合した標識物質、又は測定対象物質と競合する物質（競合物質）に結合した標識物質を検出し測定を行うことは、ＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法、又は前述したＥＬＳＡ法等のサンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等の手法により行うことができる。
【０１３２】
これらの標識物質を用いる測定法により測定を行う場合は、公知の方法の手順に従って行うことができるが、サンドイッチ法により測定を行う場合の一例を以下に示す。
【０１３３】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を固定化した固相担体を用意し、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。
【０１３４】
これにより、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質」の結合を形成させる。
【０１３５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１３６】
（例えば、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１３７】
▲２▼ この添加・接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記固相担体に固定化した第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して一定時間接触させる。
【０１３８】
この操作により、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させる。
【０１３９】
この際も、洗浄を行ったとき以外は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１４０】
（例えば、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１４１】
〔洗浄を行った場合は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が、洗浄除去されてしまっており、測定反応系に存在しないので、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で結合形成反応を行わせる必要がない。〕
【０１４２】
▲３▼ 次に、固相担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した第２特異的結合物質」を洗浄分離する。（Ｂ／Ｆ分離）
【０１４３】
▲４▼ そして、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質を検出することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【０１４４】
この測定においては、固相担体と標識物質が試料中の測定対象物質を介して、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」と結合するので、固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより試料中に含まれていた測定対象物質の有無、又は量を測定することができるものである。
【０１４５】
「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法、又はＥＬＳＡ法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【０１４６】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【０１４７】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【０１４８】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【０１４９】
いずれの場合においても、標識物質を用いる測定法の公知の手法に従って、標識物質の検出を行うことができる。
【０１５０】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合には、まず酵素等の標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質の量を測定することによって、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５１】
この場合には、標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合、接触させ反応させる際、及び、次にこの混合物を固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体上に、予め酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておき、この固相担体に試料を添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５３】
ここでは、標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておいた固相担体に、試料を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５４】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、特開平１−１２３１４８号公報に記載されている、連続する一連の反応を触媒する２種類の酵素をそれぞれ別々に測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）と共に不溶性担体に結合した２種類の酵素標識物質を用いて、これらを特異的結合部位を二つ以上有する測定対象物質を介して近接させ連続した酵素反応により測定対象物質量を求める、均一系（ホモジニアス系）による特異的結合部位を有する物質の測定法に適用して測定を行うこともできる。
【０１５５】
例えば、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体を用意し、これらに測定対象物質を含有すると推測される試料及びグルコースを混合し接触させ、測定対象物質を介して近接したグルコースオキシダーゼ及びパーオキシダーゼより生じた過酸化水素の量を、４−アミノアンチピリン等及びフェノール誘導体若しくはアニリン誘導体等を用いるトリンダー反応系により測定して、試料中に含まれている測定対象物質を均一系（ホモジニアス系）により測定することもできる。
【０１５６】
なお、ここで、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体と、試料を混合、接触させて反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５７】
あるいは、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体、標識物質を結合させていない第２特異的結合物質、及び酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質に特異的に結合する物質を用いて、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−第２特異的結合物質に特異的に結合する物質−標識物質」の結合を形成させて、固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５８】
ここで、固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に試料を添加、接触させ反応させる際、及び、更にこれに第２特異的結合物質を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５９】
更に、酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を過剰に添加し、その後、この標識物質を結合させた第２特異的結合物質の未結合のものの量を別に定量することにより、試料中の測定対象物質の量を測定することもできる。
【０１６０】
また、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、固相担体として磁性体よりなる物質又は磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。
【０１６１】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合、固相担体としては、特異的結合物質を固定化することができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に限定することなく使用することができる。
【０１６２】
これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法、又はＥＬＳＡ法などの標識物質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用いられている担体については、問題なく用いることができる。
【０１６３】
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の固相担体を用いることができる。
【０１６４】
また、前記の固相担体を強磁性体で被覆又は固相担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性固相担体等を用いることもできる。
【０１６５】
標識物質を、特異的結合物質、又は測定対象物質等に結合させる方法は、化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６６】
この化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、酵素、蛍光物質又は放射性物質等の標識物質と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標識物質、特異的結合物質又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０１６７】
固相担体に、特異的結合物質、又は測定対象物質等を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１６９】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させ、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１７０】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、固相担体又は固相担体の固定化したい部分と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、固相担体、固相担体の固定化したい部分、特異的結合物質、又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１７１】
更に、非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質又は測定対象物質等を固定化させた固相担体のこの固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１７２】
標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１７３】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１７４】
また、標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１７５】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１７６】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１７７】
標識物質としては、測定を酵素免疫測定法により行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素若しくはα−アミラーゼ等の酵素を、蛍光免疫測定法により行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート若しくはジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を、そして放射免疫測定法により行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【０１７８】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２ −ルシフェラーゼ系等により固相担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【０１７９】
【実施例】
以下、本発明を、実施例、及び参考例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０１８０】
〔実施例１〕 種々の温度での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０１８１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の温度で行わせ測定を行った。
【０１８２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０１８３】
▲１▼ Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１８４】
▲２▼ この調製したＣ４ｂ結合タンパク質を、炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））に２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解した。
これを、９６ウェル−マイクロプレート（「MODULE PLATE F8」（商品名）；ヌンク社製）の各ウェルに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置して、Ｃ４ｂ結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。
【０１８５】
▲３▼ このマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液〔０．０５％ツイーン２０（Tween20）を含む５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕で３回洗浄した後、ブロッキング液〔「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）を純水に溶解し、２５％の濃度としたもの〕を１ウェル当たり２５０μＬずつ加え、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。
【０１８６】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０１８７】
▲１▼ 本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従ってモノクローナル抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
【０１８８】
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
【０１８９】
▲２▼ 次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９０】
▲３▼ ２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ、又はＨＲＰ）〔ホースラディシュ由来；東洋紡績社製〕を、０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
これに、０．２５ｍｇのＮ−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを３０μＬ加えて、３０℃で６０分間インキュベートした。
【０１９１】
その後、これを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。
【０１９２】
▲４▼ 前記▲２▼で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．２５ｍＬに溶解した。
これに、前記▲３▼で調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを添加した。
【０１９３】
この混合物を、３０℃で２０時間インキュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいた、ウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９４】
▲５▼ 前記▲４▼で得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、検体希釈液〔２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７.５）〕で、１μｇ／ｍＬになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を調製した。
【０１９５】
（３） 試料の調製
【０１９６】
◎ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１９７】
これを、前記の検体希釈液で希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」を調製した。
【０１９８】
なお、この３種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの３種類の「プロテインＳ試料−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」とも、ｐＨは７．５であり、塩濃度は１００ｍＭであった。
【０１９９】
そして、検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２００】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２０１】
前記（１）で調製した「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）で調製した「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用いることにより、試料中の遊離状態のプロテインＳの測定を行うことができるが、この試薬を用いて前記（３）で調製した「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定を種々の温度で行った。
【０２０２】
▲１▼ 前記（３）で調製した、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
この操作を、前記マイクロプレートの９枚について行った。
【０２０３】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、２９℃、３３℃、又は３７℃の９種類の温度で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２０４】
▲２▼ この各温度での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０５】
▲３▼ 前記（２）で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２０６】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２０７】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０８】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２０９】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２１０】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２１１】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２１２】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、前記（３）で調製した検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２１３】
これらの測定の結果を、表１に示した。
【０２１４】
【表１】
【０２１５】
また、これらの測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度差）とし、横軸を試料中のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度として表した図を、図１〜図９に示した。
【０２１６】
ここで、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、０℃で行った時のものが図１、５℃で行った時のものが図２、１０℃で行った時のものが図３、１５℃で行った時のものが図４、２０℃で行った時のものが図５、２５℃で行った時のものが図６、２９℃で行った時のものが図７、３３℃で行った時のものが図８、そして、３７℃で行った時のものが図９である。
【０２１７】
これらの図において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２１８】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度として表した図を、図１０〜図１２に示した。
【０２１９】
ここで、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１０であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭの試料の結果が図１１であり、そして、２．７Ｍの試料の結果が図１２である。
図１０〜図１２において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２２０】
（５） 考察
【０２２１】
▲１▼ プロテインＳは、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質とは、一対一でしか結合できない。
よって、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、更にＣ４ｂ結合タンパク質とは結合できない。
【０２２２】
従って、前記（４）のＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による測定においても、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合できないので、マイクロプレートに間接的に固定化されることはなく、発色は生じず吸光度の増加は見られないはずである。
【０２２３】
しかしながら、例えば、前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った場合には、前記の図９より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、吸光度が生じてしまっていることが分かる。
【０２２４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０２２５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を３７℃で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０２２６】
▲２▼ ２０℃以上の温度で、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行った場合も、先の３７℃で反応を行った場合と同じことが言える。
これは、前記の表１、及び各図に示された結果より明らかである。
【０２２７】
つまり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が０．２７ｎＭ、又は２．７ｎＭの濃度で含まれており、かつプロテインＳは含まれていない試料においては、いずれも、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度が、２０℃未満の場合は、プロテインＳの測定値〔吸光度差、濃度〕がゼロ（又はほとんどゼロ）であるのに対して、２０℃以上の場合は、温度が上がるほど高い吸光度差（又は濃度）のプロテインＳの測定値が得られてしまっている。
【０２２８】
つまり、２０℃未満においては、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができるが、２０℃以上では、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離し、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じてしまい、試料中のプロテインＳの測定において正の誤差が発生することが確かめられた。
【０２２９】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、２０℃未満で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０２３０】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、０℃〜１５℃で行うことが正確性の点でより好ましく、更に０℃〜１０℃で行うことが特に好ましい。
【０２３１】
〔実施例２〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２３２】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２３３】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２３４】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２３５】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２３６】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２３７】
（３） 試料の調製
【０２３８】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２３９】
▲２▼ プロテインＳ添加血漿試料の調製
プロテインＳ欠損血漿、つまりプロテインＳ濃度が０ｎＭの血漿を作製し、前記▲１▼のプロテインＳを添加して、プロテインＳ濃度が、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、及び４０ｎＭの４種類の血漿試料を調製した。
プロテインＳ欠損血漿は、実施例１の（２）で作製したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）を作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。
なお、前記アフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）は、CNBr activated Sepharose（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。
【０２４０】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２４１】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した４種類の「プロテインＳ添加血漿試料」及び「プロテインＳ欠損血漿試料」について、試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２４２】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２４３】
（５） 測定結果
【０２４４】
測定結果を、図１３に示した。
なお、この図で、横軸は測定を行った試料中に含まれるプロテインＳの濃度（ｎＭ）を、縦軸は測定で得られたプロテインＳ濃度測定値（ｎＭ）を表す。
【０２４５】
この結果より、プロテインＳ欠損血漿に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
これよりも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２４６】
〔実施例３〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２４７】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２４８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２４９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２５０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２５１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２５２】
（３） 試料の調製
【０２５３】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２５４】
▲２▼ プロテインＳ添加健常人血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が１１７ｎＭの健常人血漿と、１３３ｎＭ、２６７ｎＭ、４００ｎＭ、５３３ｎＭ、６６７ｎＭ、８００ｎＭ、９３３ｎＭ、１０６７ｎＭ及び１２００ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、９種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この９種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々１２５ｎＭ、１９２ｎＭ、２５９ｎＭ、３２５ｎＭ、３９２ｎＭ、４５９ｎＭ、５２５ｎＭ、５９２ｎＭ及び６５９ｎＭとなる。
【０２５５】
▲３▼ プロテインＳ添加妊婦血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が４８ｎＭの妊娠３３週の妊婦血漿と、２７ｎＭ、５３ｎＭ、８０ｎＭ、１０７ｎＭ、１３３ｎＭ、１６０ｎＭ、１８７ｎＭ及び２１３ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、８種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この８種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々３８ｎＭ、５１ｎＭ、６４ｎＭ、７８ｎＭ、９１ｎＭ、１０４ｎＭ、１１８ｎＭ、及び１３１ｎＭとなる。
【０２５６】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２５７】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した９種類の「プロテインＳ添加健常人血漿試料」及び８種類の「プロテインＳ添加妊婦血漿試料」について、各々試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２５８】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２５９】
（５） 測定結果
【０２６０】
測定結果を、表２に示した。
【０２６１】
【表２】
【０２６２】
表２から明らかなように、健常人血漿及び妊婦血漿ともに、添加したプロテインＳの濃度がいずれの場合にもプロテインＳの回収率は高く、試料に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
このことからも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２６３】
〔実施例４〕 種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０２６４】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０２６５】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２６６】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２６７】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２６８】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２６９】
（３） 試料の調製
【０２７０】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．６）」とした。
【０２７１】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」とした。
【０２７２】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０２７３】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ６．８）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」とした。
【０２７４】
ｅ） 検体希釈液（ｐＨ６．３）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」とした。
【０２７５】
ｆ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０２７６】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０２７７】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、ｐＨが６．８であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、ｐＨが６．３であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０２７８】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は１００ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２７９】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２８０】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０２８１】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０２８２】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２８３】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０２８４】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ６．８、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合はｐＨ６．３、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合はｐＨ５．５であった。
【０２８５】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８６】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２８７】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２８８】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８９】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２９０】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２９１】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２９２】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２９３】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２９４】
これらの測定の結果を、表３に示した。
【０２９５】
【表３】
【０２９６】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０２９７】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、この図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２９８】
（５） 考察
【０２９９】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．６で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３００】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．６で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３０１】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．６で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３０２】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３０３】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．６で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３０４】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨで行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３０５】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点で特に好ましい。
【０３０６】
〔実施例５〕 種々の塩濃度（イオン強度）での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３０７】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の塩濃度（イオン強度）において行わせ測定を行った。
【０３０８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３０９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３１０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３１１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３１２】
（３） 試料の調製
【０３１３】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（２００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２００ｍＭ）」とした。
【０３１４】
ｂ） 検体希釈液（１００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１００ｍＭ）」とした。
【０３１５】
ｃ） 検体希釈液（５０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（５０ｍＭ）」とした。
【０３１６】
ｄ） 検体希釈液（２０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２０ｍＭ）」とした。
【０３１７】
ｅ） 検体希釈液（１０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１２．５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１０ｍＭ）」とした。
【０３１８】
ｆ） 検体希釈液（０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（０ｍＭ）」とした。
【０３１９】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３２０】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（２００ｍＭ）」、「検体希釈液（１００ｍＭ）」、「検体希釈液（５０ｍＭ）」、「検体希釈液（２０ｍＭ）」、「検体希釈液（１０ｍＭ）」、又は「検体希釈液（０ｍＭ）」により希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、塩化ナトリウム濃度が２０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、塩化ナトリウム濃度が１０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及び塩化ナトリウム濃度が０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０３２１】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、ｐＨは７．４であった。
そして、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３２２】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３２３】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々の塩濃度（イオン強度）で行った。
【０３２４】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３２５】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３２６】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の塩濃度（イオン強度）で行われることになる。
【０３２７】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合は塩化ナトリウム濃度２００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合は塩化ナトリウム濃度１００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合は塩化ナトリウム濃度５０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合は塩化ナトリウム濃度２０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合は塩化ナトリウム濃度１０ｍＭ、そして「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合は塩化ナトリウム濃度０ｍＭであった。
【０３２８】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３２９】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３３０】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３３１】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３３２】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３３３】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３３４】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３３５】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより、測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３３６】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３３７】
これらの測定の結果を、表４に示した。
【０３３８】
【表４】
【０３３９】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の塩化ナトリウム濃度〔塩濃度（イオン強度）〕として表した図を、図１６及び図１７に示した。
【０３４０】
ここで、各塩化ナトリウム濃度における、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果が図１６であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１７である。
【０３４１】
図１６において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１７において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０３４２】
（５） 考察
【０３４３】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、前記の図１６より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３４４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３４５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３４６】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３４７】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせることにより、塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３４８】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３４９】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、塩濃度（イオン強度）２０ｍＭ以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に１０ｍＭ以下で行うことが特に好ましい。
【０３５０】
〔実施例６〕 低い塩濃度における種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３５１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、低い塩濃度（イオン強度）における種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０３５２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３５３】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３５４】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３５５】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３５６】
（３） 試料の調製
【０３５７】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．１）」とした。
【０３５８】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０３５９】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ６．４）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」とした。
【０３６０】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０３６１】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３６２】
これを、前記▲１▼の４種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．１）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが６．４であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」を調製した。
【０３６３】
なお、この４種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの４種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は０ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３６４】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３６５】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０３６６】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の４種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３６７】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３６８】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０３６９】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ６．４、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ５．５であった。
【０３７０】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７１】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３７２】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３７３】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７４】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３７５】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３７６】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３７７】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３７８】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３７９】
これらの測定の結果を、表５に示した。
【０３８０】
【表５】
【０３８１】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０３８２】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「○」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「○」で表している。
【０３８３】
（５） 考察
【０３８４】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．１で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３８５】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．１で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３８６】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．１で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３８７】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３８８】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．１で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３８９】
更に、前記の図１４より明らかなように、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせた場合は、塩化ナトリウム濃度１００ｍＭで行わせた場合に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになることが分かる。
【０３９０】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨ及び低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質をより正確に測定することができることを確認できた。
【０３９１】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に低い塩濃度（イオン強度）で行うことが特に好ましい。
【０３９２】
【発明の効果】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が試料中に共に含有されるものである場合においても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができるという効果を有する測定方法、及び測定試薬である。
【図面の簡単な説明】
【図１】０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図２】５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図３】１０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図４】１５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図５】２０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図６】２５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図７】２９℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図８】３３℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図９】３７℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１０】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１１】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．２７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１２】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が２．７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１３】試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定したときの添加回収試験の結果を示した図である。
【図１４】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１５】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１６】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１７】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１８】プロテインＳをＥＬＳＡ法・サンドイッチ法により測定するときの模式図である。
【図１９】間接凝集反応測定法により試料中の測定対象物質の測定を行ったときの凝集像を示した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、そのリガンドと複合体を形成する物質の、遊離状態における前記物質だけを測定することができる測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野、食品衛生分野、若しくは環境衛生分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
そのリガンドと複合体を形成する物質は、種々存在するが、このような物質を測定する場合には様々な問題が生じる。
なお、ここで、リガンドとは、ある特定のタンパク質物質と特異的に結合する物質を意味する。
【０００３】
リガンドと複合体を形成する物質について、以下、プロテインＳを例に挙げて説明を行う。
プロテインＳは、主にヒト血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する第Ｖａ因子、及び第ＶＩＩＩａ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
【０００４】
プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質、Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。
【０００５】
このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、下記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。
【０００６】
（なお、本明細書において、「測定対象物質」、「リガンド」、「プロテインＳ」、又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に記載が無い場合は、それぞれ他の物質とは結合しておらず遊離状態にあるものを意味する。）
【０００７】
【化１】
このプロテインＳの測定法の一つとして、最近、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらが、下記の方法を示した。〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年、及びＷＯ９８／２３９６３号公報〕
【０００９】
（１） まず、Ｃ４ｂ結合タンパク質をウェルに固定化したマイクロプレートに、試料であるヒト血漿を室温下で接触させて、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に試料中のプロテインＳを特異的に結合させて、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合によりプロテインＳをマイクロプレートに間接的に固定化させた後に洗浄し、固定化されない成分を除去する。
【００１０】
（２） その後、プロテインＳに対するマウス抗体（抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体）にホースラディッシュ由来のパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識化させたパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を、前記（１）の操作を行ったマイクロプレートのウェルに室温下で接触させることによりプロテインＳに特異的に結合させて、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体−プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合を形成させた後洗浄し、結合しなかった遊離のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を除去する。
【００１１】
（３） ここに、１，２−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と過酸化水素を添加し、標識パーオキシダーゼの酸化触媒作用によりロイコ型色素を室温下で生成させ、このロイコ型色素の発色、又はその吸光度を測定することにより、試料中におけるプロテインＳの存在の有無、又は濃度を知ることができるものである。（図１８を参照願います。）
【００１２】
この測定方法は、担体に固相化した測定対象物質のリガンドと、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うものであるので、担体に固相化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）と、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay；固相酵素免疫測定法）のサンドイッチ法の変法と考えることができるが、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらは上記の測定方法をＥＬＳＡ法（enzyme-linked ligandsorbent assay）と称している。
【００１３】
しかしながら、本発明者らは、以上のような測定方法にも下記のような重大な問題点があることに気付いた。
それは、測定対象物質のプロテインＳだけではなく、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体も測り込んでしまい、プロテインＳの測定値に正の誤差が生じてしまうことである。
【００１４】
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合することができないので、本来はＤａｈｌｂｅａｃｋらの測定法では、測定されない（シグナルが出ない）はずである。
【００１５】
しかしながら、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の精製品を試料として測定した場合、プロテインＳの精製品を試料とした時と同じようにシグナルが生成し、測定された。
【００１６】
すなわち、試料中のプロテインＳの測定を、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの測定法で行った場合、試料中に含まれるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をも測り込んでしまい、正の誤差が生じた。
【００１７】
この理由は、次のような理由によるものと考える。
試料中に含まれていたプロテインＳが、マイクロプレートのウェルに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合すると、遊離状態のプロテインＳの反応液中における濃度は減少する。
【００１８】
そうすると、下記の反応の平衡が左に移動し、やはり試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離して、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質がそれぞれ１分子ずつ生成する。
【００１９】
【化２】
ここでプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体より生じたプロテインＳが、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合して固定化されることより、結果的にシグナルが生成してしまう。
【００２１】
以上のことより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が、プロテインＳとして測り込まれてしまうため、プロテインＳの測定時に正誤差を生じてしまう。
【００２２】
以上、試料中のプロテインＳを前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法で測定する場合を例に説明したが、測定方法（測定原理）が、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法（原理）のものであって、かつ、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合には、いずれの場合でも同じ問題が生じる可能性がある。
【００２３】
つまり、試料中の測定対象物質の測定時に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応が起こり、この複合体の解離により生じた測定対象物質が測定対象物質に特異的に結合する物質と結合することにより、測定に正の誤差が生じてしまうという問題である。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前述の従来の測定法及び測定試薬が有する問題点の解決であり、すなわち、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができる測定方法、及び測定試薬を提供することである。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせることを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定方法である。
【００２６】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００２７】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００２８】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００２９】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００３１】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００３２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ〜以下の濃度であることが好適である。
【００３３】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００３４】
また、本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせるようにしたことを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定試薬である。
【００３５】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００３６】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００３７】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００３８】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３９】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００４０】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００４１】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００４２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬は、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質ということがある。）との結合反応を行わせることを特徴とするものである。
【００４４】
すなわち、下の反応式（１）における右から左への解離反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応〔反応式（２）〕を行わせることを特徴とするものである。
【００４５】
【化３】
本発明においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができるのであれば、いかなる方法、手段であっても特に制限無く用いることができる。
【００４７】
例えば、この測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００４８】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００４９】
また、前記の条件の例として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００５０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００５１】
更に、前記の条件の例として、塩濃度（イオン強度）を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００５２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００５３】
このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせることにより、以下のことを達成することができる。
【００５４】
また、測定試薬においては、このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるように試薬の成分を選択、調整することにより、以下のことを達成することができる。
【００５５】
すなわち、測定時に、試料中に含有される測定対象物質が、特異的結合物質と結合することにより、測定反応系中では、遊離状態の測定対象物質の濃度が減少し、これにより下記の反応の平衡が左に移動して、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質が生成することを防ぐことができることである。
【００５６】
【化４】
これにより、試料中にもともと含有される測定対象物質だけを、下記の反応により特異的結合物質に結合させて、検出を行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みを防止して、正確な試料中の測定対象物質の測定が行えるようになる。
【００５８】
【化５】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬において、試料とは、測定対象物質を含有する可能性がある物質であって、そして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体をも含有する可能性があるものである。
【００６０】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト、動物、又は植物などに由来する試料）、食品、飲料、環境試料等を挙げることができる。
【００６１】
生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、糞便、精液、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液；糞便の抽出液若しくは懸濁液、菌体などの抽出液、又は植物の抽出液等を挙げることができる。
【００６２】
食品としては、例えば、肉、魚介類、野菜、果物、若しくは加工食品などの抽出液又は懸濁液等を挙げることができる。
【００６３】
飲料としては、例えば、水道水、井戸水、又は牛乳等を挙げることができる。
環境試料としては、例えば、土壌、若しくは大気などの抽出液又は懸濁液、あるいは海水、河川水、湖沼水等を挙げることができる。
【００６４】
また、本発明の測定方法、及び測定試薬において、測定対象物質とは、試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を測定しようとする物質であって、そして、この「測定対象物質」と、「測定対象物質とそのリガンドとの複合体」の両方の物質が試料中に共に含有される可能性がある物質のことである。
【００６５】
この測定対象物質として、例えば、心身の状態を反映する物質、疾患のマーカー物質、食品若しくは飲料の安全性、栄養などを示す物質、又は環境の状況を示す物質等を挙げることができる。
【００６６】
この測定対象物質をより具体的に例示すると、例えば、血液凝固・線溶系にかかわる物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
プロテインＳ〔Ｃ４ｂ結合タンパク質〕等。
【００６７】
また、ホルモンを挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
総サイロキシン（Ｔ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離サイロキシン（ＦＴ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ3）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、リバース・トリヨードサイロニン〔Ｔ4結合グロブリンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、インスリン様成長因子（ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ）〔ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）〕、コルチコステロン〔コルチコステロイド結合タンパク質（ＣＢＧ）〕、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）〔アルブミン、又はテストステロン〕等。
【００６８】
そして、電解質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
鉄（トランスフェリン）、銅（セルロプラスミン）、カルシウム（タンパク質）、ヨウ素（タンパク質）等。
【００６９】
更に、抗原、抗体等の免疫反応に関する物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
補体Ｃ１ｑ〔免疫グロブリンとこれに対する抗原との免疫複合体〕等。
【００７０】
本発明における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬であるが、これは公知の免疫学的測定方法若しくは免疫学的測定試薬、又は遺伝子測定方法若しくは遺伝子測定試薬等を適用することができ、例えば、ラテックス凝集反応若しくは赤血球凝集反応などの間接凝集反応測定法、ラテックス比濁法、免疫比濁法、酵素免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法、又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された被検物質に対する特異的結合物質が固定され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる方法等を適用する測定方法及び測定試薬を挙げることができる。
【００７１】
本発明においては、前記の測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるものである。
【００７２】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応としては、抗原と抗体の抗原抗体反応（免疫反応）、主にタンパク質よりなる物質とそのリガンドとの反応、糖とレクチンの反応、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖の反応、又はレセプターとそれに対する物質の反応等、測定対象物質とこの測定対象物質に特異的な親和性を有し結合する物質（特異的結合物質）の間の反応を挙げることができる。
【００７３】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬キットにおいて、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、複数種類のものを組み合わせて利用してもよい。
【００７４】
例えば、特異的結合物質が測定対象物質に対する抗体であり、この抗体と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗体、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗体、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗体等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７５】
また、試料中の測定対象物質が抗体であって、特異的結合物質が測定対象物質である抗体にとっての抗原であり、この抗原と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗原、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗原、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗原等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７６】
更に、特異的結合物質が試料中の測定対象物質にとってのリガンドであり、このリガンドと測定対象物質との特異的結合反応を利用して測定を行う場合は、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記リガンド、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記リガンド等と、測定対象物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンド（前記リガンドと同種又は異種のリガンド）との複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７７】
そして、試料中の測定対象物質とこの測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）との結合反応における、測定対象物質と競合する物質（競合物質；例えば、測定対象物質自体、測定対象物質の一部、又は測定対象物質の一部若しくは全部の誘導体）と測定対象物質との競合を利用して測定を行う場合は、測定対象物質又は競合物質と、特異的結合物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７８】
なお、本発明により、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う場合において、一度、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせ、その後、洗浄操作を行い除去すること等により測定反応系に測定対象物質とそのリガンドとの複合体が既に存在しなくなっている場合には、特異的結合物質に結合している測定対象物質に更に特異的結合物質（先の特異的結合物質と同種又は異種のもの）を反応させ、結合させるとしても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる必要はない。
【００７９】
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬であるが、特異的結合物質などの試料中の測定対象物質の測定に必要な成分、及び測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制するための成分等よりなる試薬である。
【００８０】
この本発明の測定試薬は、その成分を分けた複数のものからなるものであってもよい。
【００８１】
◎ 本発明の測定を間接凝集反応測定法に適用して行う場合の説明
【００８２】
本発明の測定を、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応測定法などの担体粒子の凝集形成により測定を行う間接凝集反応測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【００８３】
この測定の手順の一例を以下に示す。
【００８４】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を溶液収容部分に固定化した測定容器を用意し、この第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に一定量の試料を添加して接触させる。
これにより、試料中の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化した第１特異的結合物質との結合反応を行わせる。
【００８５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００８６】
（例えば、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００８７】
▲２▼ この添加・接触と同時に又は一定時間のうちに、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）が固定化された粒子担体の一定量をこの溶液収容部分に添加して接触させる。
【００８８】
▲３▼ そして、これをミキサー等で一定時間撹拌した後静置して、試料中に測定対象物質が存在する場合には「測定容器の溶液収容部分−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合を形成させる。
【００８９】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００９０】
（例えば、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００９１】
▲４▼ 静置後、一定時間内にこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の溶液収容部分内における像を目視により判定又はマイクロプレートリーダー等の測定装置により測定し、凝集像が検出できれば試料中に測定対象物質が存在すると判定し、凝集像が検出できなければ試料中に測定対象物質は存在しないと判定することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【００９２】
この測定においては、測定容器の溶液収容部分内壁と粒子担体が試料中の測定対象物質を介して、「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」と結合することにより、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集像を得ることができるものである。
【００９３】
試料中の測定対象物質は、測定容器の溶液収容部分の内壁に固定化された第１特異的結合物質と、粒子担体に固定化した第２特異的結合物質の両方に結合するので、前記の結合を形成することができ、試料中の測定対象物質の量を反映した凝集像（測定容器の溶液収容部分の内壁面底部に広がった像、陽性像）が得られることになる。
【００９４】
これを図１９のＢに示した。
【００９５】
一方、試料中に測定対象物質が存在しない場合は、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合が形成されることはなく、つまり「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合は形成されないので、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体は測定容器の溶液収容部分の内壁面上を転がり（滑り）落ちてしまい、凝集像は得られずに底部に収束した像（陰性像）が生じる。
【００９６】
これを図１９のＡに示した。
【００９７】
よって、これにより試料中の測定対象物質のみを選択的に測定することができることとなる。
【００９８】
なお、段階的に希釈した試料のそれぞれを測定した時の、粒子担体による凝集像が得られる最大の希釈倍数である凝集価を求めることにより、試料中に含まれる測定対象物質の量を確かめることができる。
【００９９】
この凝集価の測定は、常法に従って行えばよく、例えば、まず、第１特異的結合物質を固定化した測定容器（マイクロプレート等）のウェル等の溶液収容部分に試料を添加し、これを緩衝液等よりなる試料の希釈液で段階的に希釈してその希釈列を作る。
【０１００】
この際、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０１】
次に各溶液収容部分に第２特異的結合物質の抗体を固定化した粒子担体を添加し、混合撹拌する。
【０１０２】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０３】
その後、静置してこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体による凝集の有無を判定又は測定し、凝集像が得られた最大の希釈倍数を凝集価として採用し、求めることができる。
【０１０４】
また、予め規定した希釈倍数で希釈した試料を本発明により測定し、この時の凝集の有無から試料中における測定対象物質の存在の有無を定性的に測定することもできる。
【０１０５】
なお、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第２特異的結合物質を固定化する粒子担体として磁性粒子を用い、この第２特異的結合物質を固定化した粒子担体に磁力を作用させることにより短時間で凝集像を生じさせることができる、特開平４−２１６４６６号公報及び特開平４−２４２１６７号公報に記載されているような測定方法を適用することもできる。
【０１０６】
そして、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、まず第２特異的結合物質を固定化した粒子担体と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質の測定を行うこともできる。
【０１０７】
この場合、粒子担体と試料を混合、接触させ反応させること、及びこれを測定容器の溶液収容部分に添加、接触させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０８】
更に、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に、予め第２特異的結合物質を固定化した粒子担体を存在させておき、この測定容器の溶液収容部分に試料を添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質を測定することもできる。
【０１０９】
この場合、粒子担体を存在させておいた測定容器の溶液収容部分に試料を添加、接触させ反応させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１１０】
本発明による試料中の測定対象物質の測定を間接凝集反応測定法により行う場合、測定容器としては、溶液を収容することができるものであれば、その種類、材質、形状等は特に制限されずに用いることができる。
【０１１１】
これは、赤血球やゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法において一般的に測定に用いられている容器については、問題なく用いることができる。
【０１１２】
例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を用いることができる。
【０１１３】
なお、測定容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが望ましい。
【０１１４】
粒子担体としては、一般に粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法に使用される粒子担体であれば特に制限無く用いることができる。
【０１１５】
例えば、ヒツジ赤血球等の動物赤血球、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子担体、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子担体又はその他の人工担体等を挙げることができる。
【０１１６】
また、前記の高分子粒子担体を強磁性体で被覆又は粒子成型時に強磁性体を分散させて調製した磁性粒子担体等を用いることもできる。
【０１１７】
これらの粒子担体は、粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲のものが好ましく、特に好ましくは０．５〜１０μｍのものである。
【０１１８】
また、これらの粒子担体の比重は、１〜１０の範囲が好ましく、特に好ましくは１〜２である。
【０１１９】
測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体に、特異的結合物質を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１２０】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１２１】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させ、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１２２】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体と特異的結合物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定容器の溶液収容部分の内壁面、粒子担体、特異的結合物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１２３】
更に非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質を固定化させた測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１２４】
特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１２５】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１２６】
また、特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１２７】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１２８】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１２９】
◎ 本発明の測定を標識物質を用いる測定法に適用して行う場合の説明
【０１３０】
本発明の測定を、ＥＬＩＳＡ法、ＥＬＳＡ法などの標識物質を用いる測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【０１３１】
この測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）に結合した標識物質、又は測定対象物質と競合する物質（競合物質）に結合した標識物質を検出し測定を行うことは、ＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法、又は前述したＥＬＳＡ法等のサンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等の手法により行うことができる。
【０１３２】
これらの標識物質を用いる測定法により測定を行う場合は、公知の方法の手順に従って行うことができるが、サンドイッチ法により測定を行う場合の一例を以下に示す。
【０１３３】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を固定化した固相担体を用意し、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。
【０１３４】
これにより、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質」の結合を形成させる。
【０１３５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１３６】
（例えば、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１３７】
▲２▼ この添加・接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記固相担体に固定化した第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して一定時間接触させる。
【０１３８】
この操作により、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させる。
【０１３９】
この際も、洗浄を行ったとき以外は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１４０】
（例えば、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１４１】
〔洗浄を行った場合は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が、洗浄除去されてしまっており、測定反応系に存在しないので、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で結合形成反応を行わせる必要がない。〕
【０１４２】
▲３▼ 次に、固相担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した第２特異的結合物質」を洗浄分離する。（Ｂ／Ｆ分離）
【０１４３】
▲４▼ そして、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質を検出することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【０１４４】
この測定においては、固相担体と標識物質が試料中の測定対象物質を介して、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」と結合するので、固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより試料中に含まれていた測定対象物質の有無、又は量を測定することができるものである。
【０１４５】
「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法、又はＥＬＳＡ法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【０１４６】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【０１４７】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【０１４８】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【０１４９】
いずれの場合においても、標識物質を用いる測定法の公知の手法に従って、標識物質の検出を行うことができる。
【０１５０】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合には、まず酵素等の標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質の量を測定することによって、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５１】
この場合には、標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合、接触させ反応させる際、及び、次にこの混合物を固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体上に、予め酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておき、この固相担体に試料を添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５３】
ここでは、標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておいた固相担体に、試料を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５４】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、特開平１−１２３１４８号公報に記載されている、連続する一連の反応を触媒する２種類の酵素をそれぞれ別々に測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）と共に不溶性担体に結合した２種類の酵素標識物質を用いて、これらを特異的結合部位を二つ以上有する測定対象物質を介して近接させ連続した酵素反応により測定対象物質量を求める、均一系（ホモジニアス系）による特異的結合部位を有する物質の測定法に適用して測定を行うこともできる。
【０１５５】
例えば、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体を用意し、これらに測定対象物質を含有すると推測される試料及びグルコースを混合し接触させ、測定対象物質を介して近接したグルコースオキシダーゼ及びパーオキシダーゼより生じた過酸化水素の量を、４−アミノアンチピリン等及びフェノール誘導体若しくはアニリン誘導体等を用いるトリンダー反応系により測定して、試料中に含まれている測定対象物質を均一系（ホモジニアス系）により測定することもできる。
【０１５６】
なお、ここで、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体と、試料を混合、接触させて反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５７】
あるいは、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体、標識物質を結合させていない第２特異的結合物質、及び酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質に特異的に結合する物質を用いて、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−第２特異的結合物質に特異的に結合する物質−標識物質」の結合を形成させて、固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５８】
ここで、固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に試料を添加、接触させ反応させる際、及び、更にこれに第２特異的結合物質を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５９】
更に、酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を過剰に添加し、その後、この標識物質を結合させた第２特異的結合物質の未結合のものの量を別に定量することにより、試料中の測定対象物質の量を測定することもできる。
【０１６０】
また、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、固相担体として磁性体よりなる物質又は磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。
【０１６１】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合、固相担体としては、特異的結合物質を固定化することができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に限定することなく使用することができる。
【０１６２】
これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法、又はＥＬＳＡ法などの標識物質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用いられている担体については、問題なく用いることができる。
【０１６３】
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の固相担体を用いることができる。
【０１６４】
また、前記の固相担体を強磁性体で被覆又は固相担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性固相担体等を用いることもできる。
【０１６５】
標識物質を、特異的結合物質、又は測定対象物質等に結合させる方法は、化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６６】
この化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、酵素、蛍光物質又は放射性物質等の標識物質と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標識物質、特異的結合物質又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０１６７】
固相担体に、特異的結合物質、又は測定対象物質等を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１６９】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させ、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１７０】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、固相担体又は固相担体の固定化したい部分と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、固相担体、固相担体の固定化したい部分、特異的結合物質、又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１７１】
更に、非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質又は測定対象物質等を固定化させた固相担体のこの固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１７２】
標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１７３】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１７４】
また、標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１７５】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１７６】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１７７】
標識物質としては、測定を酵素免疫測定法により行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素若しくはα−アミラーゼ等の酵素を、蛍光免疫測定法により行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート若しくはジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を、そして放射免疫測定法により行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【０１７８】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２ −ルシフェラーゼ系等により固相担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【０１７９】
【実施例】
以下、本発明を、実施例、及び参考例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０１８０】
〔実施例１〕 種々の温度での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０１８１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の温度で行わせ測定を行った。
【０１８２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０１８３】
▲１▼ Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１８４】
▲２▼ この調製したＣ４ｂ結合タンパク質を、炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））に２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解した。
これを、９６ウェル−マイクロプレート（「MODULE PLATE F8」（商品名）；ヌンク社製）の各ウェルに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置して、Ｃ４ｂ結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。
【０１８５】
▲３▼ このマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液〔０．０５％ツイーン２０（Tween20）を含む５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕で３回洗浄した後、ブロッキング液〔「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）を純水に溶解し、２５％の濃度としたもの〕を１ウェル当たり２５０μＬずつ加え、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。
【０１８６】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０１８７】
▲１▼ 本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従ってモノクローナル抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
【０１８８】
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
【０１８９】
▲２▼ 次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９０】
▲３▼ ２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ、又はＨＲＰ）〔ホースラディシュ由来；東洋紡績社製〕を、０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
これに、０．２５ｍｇのＮ−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを３０μＬ加えて、３０℃で６０分間インキュベートした。
【０１９１】
その後、これを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。
【０１９２】
▲４▼ 前記▲２▼で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．２５ｍＬに溶解した。
これに、前記▲３▼で調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを添加した。
【０１９３】
この混合物を、３０℃で２０時間インキュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいた、ウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９４】
▲５▼ 前記▲４▼で得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、検体希釈液〔２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７.５）〕で、１μｇ／ｍＬになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を調製した。
【０１９５】
（３） 試料の調製
【０１９６】
◎ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１９７】
これを、前記の検体希釈液で希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」を調製した。
【０１９８】
なお、この３種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの３種類の「プロテインＳ試料−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」とも、ｐＨは７．５であり、塩濃度は１００ｍＭであった。
【０１９９】
そして、検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２００】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２０１】
前記（１）で調製した「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）で調製した「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用いることにより、試料中の遊離状態のプロテインＳの測定を行うことができるが、この試薬を用いて前記（３）で調製した「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定を種々の温度で行った。
【０２０２】
▲１▼ 前記（３）で調製した、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
この操作を、前記マイクロプレートの９枚について行った。
【０２０３】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、２９℃、３３℃、又は３７℃の９種類の温度で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２０４】
▲２▼ この各温度での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０５】
▲３▼ 前記（２）で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２０６】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２０７】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０８】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２０９】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２１０】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２１１】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２１２】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、前記（３）で調製した検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２１３】
これらの測定の結果を、表１に示した。
【０２１４】
【表１】
また、これらの測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度差）とし、横軸を試料中のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度として表した図を、図１〜図９に示した。
【０２１６】
ここで、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、０℃で行った時のものが図１、５℃で行った時のものが図２、１０℃で行った時のものが図３、１５℃で行った時のものが図４、２０℃で行った時のものが図５、２５℃で行った時のものが図６、２９℃で行った時のものが図７、３３℃で行った時のものが図８、そして、３７℃で行った時のものが図９である。
【０２１７】
これらの図において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２１８】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度として表した図を、図１０〜図１２に示した。
【０２１９】
ここで、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１０であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭの試料の結果が図１１であり、そして、２．７Ｍの試料の結果が図１２である。
図１０〜図１２において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２２０】
（５） 考察
【０２２１】
▲１▼ プロテインＳは、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質とは、一対一でしか結合できない。
よって、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、更にＣ４ｂ結合タンパク質とは結合できない。
【０２２２】
従って、前記（４）のＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による測定においても、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合できないので、マイクロプレートに間接的に固定化されることはなく、発色は生じず吸光度の増加は見られないはずである。
【０２２３】
しかしながら、例えば、前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った場合には、前記の図９より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、吸光度が生じてしまっていることが分かる。
【０２２４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０２２５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を３７℃で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０２２６】
▲２▼ ２０℃以上の温度で、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行った場合も、先の３７℃で反応を行った場合と同じことが言える。
これは、前記の表１、及び各図に示された結果より明らかである。
【０２２７】
つまり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が０．２７ｎＭ、又は２．７ｎＭの濃度で含まれており、かつプロテインＳは含まれていない試料においては、いずれも、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度が、２０℃未満の場合は、プロテインＳの測定値〔吸光度差、濃度〕がゼロ（又はほとんどゼロ）であるのに対して、２０℃以上の場合は、温度が上がるほど高い吸光度差（又は濃度）のプロテインＳの測定値が得られてしまっている。
【０２２８】
つまり、２０℃未満においては、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができるが、２０℃以上では、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離し、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じてしまい、試料中のプロテインＳの測定において正の誤差が発生することが確かめられた。
【０２２９】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、２０℃未満で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０２３０】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、０℃〜１５℃で行うことが正確性の点でより好ましく、更に０℃〜１０℃で行うことが特に好ましい。
【０２３１】
〔実施例２〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２３２】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２３３】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２３４】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２３５】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２３６】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２３７】
（３） 試料の調製
【０２３８】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２３９】
▲２▼ プロテインＳ添加血漿試料の調製
プロテインＳ欠損血漿、つまりプロテインＳ濃度が０ｎＭの血漿を作製し、前記▲１▼のプロテインＳを添加して、プロテインＳ濃度が、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、及び４０ｎＭの４種類の血漿試料を調製した。
プロテインＳ欠損血漿は、実施例１の（２）で作製したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）を作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。
なお、前記アフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）は、CNBr activated Sepharose（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。
【０２４０】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２４１】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した４種類の「プロテインＳ添加血漿試料」及び「プロテインＳ欠損血漿試料」について、試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２４２】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２４３】
（５） 測定結果
【０２４４】
測定結果を、図１３に示した。
なお、この図で、横軸は測定を行った試料中に含まれるプロテインＳの濃度（ｎＭ）を、縦軸は測定で得られたプロテインＳ濃度測定値（ｎＭ）を表す。
【０２４５】
この結果より、プロテインＳ欠損血漿に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
これよりも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２４６】
〔実施例３〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２４７】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２４８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２４９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２５０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２５１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２５２】
（３） 試料の調製
【０２５３】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２５４】
▲２▼ プロテインＳ添加健常人血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が１１７ｎＭの健常人血漿と、１３３ｎＭ、２６７ｎＭ、４００ｎＭ、５３３ｎＭ、６６７ｎＭ、８００ｎＭ、９３３ｎＭ、１０６７ｎＭ及び１２００ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、９種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この９種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々１２５ｎＭ、１９２ｎＭ、２５９ｎＭ、３２５ｎＭ、３９２ｎＭ、４５９ｎＭ、５２５ｎＭ、５９２ｎＭ及び６５９ｎＭとなる。
【０２５５】
▲３▼ プロテインＳ添加妊婦血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が４８ｎＭの妊娠３３週の妊婦血漿と、２７ｎＭ、５３ｎＭ、８０ｎＭ、１０７ｎＭ、１３３ｎＭ、１６０ｎＭ、１８７ｎＭ及び２１３ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、８種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この８種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々３８ｎＭ、５１ｎＭ、６４ｎＭ、７８ｎＭ、９１ｎＭ、１０４ｎＭ、１１８ｎＭ、及び１３１ｎＭとなる。
【０２５６】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２５７】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した９種類の「プロテインＳ添加健常人血漿試料」及び８種類の「プロテインＳ添加妊婦血漿試料」について、各々試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２５８】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２５９】
（５） 測定結果
【０２６０】
測定結果を、表２に示した。
【０２６１】
【表２】
表２から明らかなように、健常人血漿及び妊婦血漿ともに、添加したプロテインＳの濃度がいずれの場合にもプロテインＳの回収率は高く、試料に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
このことからも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２６３】
〔実施例４〕 種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０２６４】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０２６５】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２６６】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２６７】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２６８】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２６９】
（３） 試料の調製
【０２７０】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．６）」とした。
【０２７１】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」とした。
【０２７２】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０２７３】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ６．８）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」とした。
【０２７４】
ｅ） 検体希釈液（ｐＨ６．３）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」とした。
【０２７５】
ｆ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０２７６】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０２７７】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、ｐＨが６．８であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、ｐＨが６．３であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０２７８】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は１００ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２７９】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２８０】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０２８１】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０２８２】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２８３】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０２８４】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ６．８、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合はｐＨ６．３、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合はｐＨ５．５であった。
【０２８５】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８６】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２８７】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２８８】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８９】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２９０】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２９１】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２９２】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２９３】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２９４】
これらの測定の結果を、表３に示した。
【０２９５】
【表３】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０２９７】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、この図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２９８】
（５） 考察
【０２９９】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．６で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３００】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．６で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３０１】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．６で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３０２】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３０３】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．６で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３０４】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨで行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３０５】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点で特に好ましい。
【０３０６】
〔実施例５〕 種々の塩濃度（イオン強度）での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３０７】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の塩濃度（イオン強度）において行わせ測定を行った。
【０３０８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３０９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３１０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３１１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３１２】
（３） 試料の調製
【０３１３】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（２００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２００ｍＭ）」とした。
【０３１４】
ｂ） 検体希釈液（１００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１００ｍＭ）」とした。
【０３１５】
ｃ） 検体希釈液（５０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（５０ｍＭ）」とした。
【０３１６】
ｄ） 検体希釈液（２０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２０ｍＭ）」とした。
【０３１７】
ｅ） 検体希釈液（１０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１２．５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１０ｍＭ）」とした。
【０３１８】
ｆ） 検体希釈液（０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（０ｍＭ）」とした。
【０３１９】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３２０】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（２００ｍＭ）」、「検体希釈液（１００ｍＭ）」、「検体希釈液（５０ｍＭ）」、「検体希釈液（２０ｍＭ）」、「検体希釈液（１０ｍＭ）」、又は「検体希釈液（０ｍＭ）」により希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、塩化ナトリウム濃度が２０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、塩化ナトリウム濃度が１０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及び塩化ナトリウム濃度が０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０３２１】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、ｐＨは７．４であった。
そして、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３２２】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３２３】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々の塩濃度（イオン強度）で行った。
【０３２４】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３２５】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３２６】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の塩濃度（イオン強度）で行われることになる。
【０３２７】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合は塩化ナトリウム濃度２００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合は塩化ナトリウム濃度１００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合は塩化ナトリウム濃度５０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合は塩化ナトリウム濃度２０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合は塩化ナトリウム濃度１０ｍＭ、そして「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合は塩化ナトリウム濃度０ｍＭであった。
【０３２８】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３２９】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３３０】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３３１】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３３２】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３３３】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３３４】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３３５】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより、測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３３６】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３３７】
これらの測定の結果を、表４に示した。
【０３３８】
【表４】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の塩化ナトリウム濃度〔塩濃度（イオン強度）〕として表した図を、図１６及び図１７に示した。
【０３４０】
ここで、各塩化ナトリウム濃度における、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果が図１６であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１７である。
【０３４１】
図１６において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１７において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０３４２】
（５） 考察
【０３４３】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、前記の図１６より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３４４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３４５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３４６】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３４７】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせることにより、塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３４８】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３４９】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、塩濃度（イオン強度）２０ｍＭ以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に１０ｍＭ以下で行うことが特に好ましい。
【０３５０】
〔実施例６〕 低い塩濃度における種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３５１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、低い塩濃度（イオン強度）における種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０３５２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３５３】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３５４】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３５５】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３５６】
（３） 試料の調製
【０３５７】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．１）」とした。
【０３５８】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０３５９】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ６．４）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」とした。
【０３６０】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０３６１】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３６２】
これを、前記▲１▼の４種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．１）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが６．４であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」を調製した。
【０３６３】
なお、この４種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの４種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は０ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３６４】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３６５】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０３６６】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の４種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３６７】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３６８】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０３６９】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ６．４、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ５．５であった。
【０３７０】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７１】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３７２】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３７３】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７４】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３７５】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３７６】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３７７】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３７８】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３７９】
これらの測定の結果を、表５に示した。
【０３８０】
【表５】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０３８２】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「○」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「○」で表している。
【０３８３】
（５） 考察
【０３８４】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．１で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３８５】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．１で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３８６】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．１で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３８７】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３８８】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．１で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３８９】
更に、前記の図１４より明らかなように、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせた場合は、塩化ナトリウム濃度１００ｍＭで行わせた場合に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになることが分かる。
【０３９０】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨ及び低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質をより正確に測定することができることを確認できた。
【０３９１】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に低い塩濃度（イオン強度）で行うことが特に好ましい。
【０３９２】
【発明の効果】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が試料中に共に含有されるものである場合においても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができるという効果を有する測定方法、及び測定試薬である。
【図面の簡単な説明】
【図１】０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図２】５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図３】１０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図４】１５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図５】２０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図６】２５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図７】２９℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図８】３３℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図９】３７℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１０】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１１】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．２７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１２】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が２．７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１３】試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定したときの添加回収試験の結果を示した図である。
【図１４】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１５】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１６】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１７】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１８】プロテインＳをＥＬＳＡ法・サンドイッチ法により測定するときの模式図である。
【図１９】間接凝集反応測定法により試料中の測定対象物質の測定を行ったときの凝集像を示した図である。
Claims (4)
- プロテインＳとプロテインＳに特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中のプロテインＳの測定を行うに当り、温度を０〜１５℃の温度とすること、ｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ７．１のｐＨとすること、又は塩濃度を０〜２０ｍＭの濃度とすることから選ばれる少なくとも一つの条件下で、プロテインＳとプロテインＳに特異的に結合する物質との結合反応を行わせることを特徴とする、試料中のプロテインＳの測定における正誤差の発生を防止する方法。
- 温度を０〜１５℃の温度とすること、ｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ７．１のｐＨとすること、又は塩濃度を０〜２０ｍＭの濃度とすることから選ばれる少なくとも一つの条件が、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制する条件である、請求項１記載の試料中のプロテインＳの測定における正誤差の発生を防止する方法。
- 温度を０〜１０℃の温度とすることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の試料中のプロテインＳの測定における正誤差の発生を防止する方法。
- 塩濃度を０〜１０ｍＭの濃度とすることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中のプロテインＳの測定における正誤差の発生を防止する方法。
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