ES2340604T3 - Lineas celulares estables que expresan herg. - Google Patents
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Abstract
Una línea celular eucariota estable que consiste esencialmente en CHO crelox-hERG UG 7, ATCC PTA-6812, o su progenie, derivados o descendientes.
Description
Líneas celulares estables que expresan hERG.
Esta invención está relacionada en general con
unas líneas celulares estables que expresan el canal de potasio
hERG activado por voltaje, y los métodos para utilizar dichas
células para probar la capacidad de los compuestos de inhibir la
corriente de hERG.
Los canales iónicos constituyen una clase
relativamente pequeña de dianas farmacéuticas, en parte porque ha
sido difícil la automatización de los ensayos de cribaje de los
canales iónicos y su formato a gran escala. Sin embargo, avances
recientes en electrofisiología (P.B. Bennett et al., Trends
in Biotech (2003) 21(12):563-69; C. Wood
et al., Fármaco Disc Today (2004)
9(10):434-41) han renovado el interés en los
canales iónicos como dianas para el descubrimiento de fármacos.
Varios canales iónicos se han relacionado con enfermedades
hereditarias, lo que conduce a estudiar los moduladores de los
canales iónicos para el tratamiento y prevención de enfermedades
(D. Owen et al., Drug Disc World (2002)
48-61).
hERG es un canal iónico de particular interés
para la industria farmacéutica, aunque más como un problema de
seguridad/toxicológico que como diana para el desarrollo de
moduladores (ICH S7B Guidance for Industry, Oct. 2005; J.I.
Vandenberg et al., Trends Pharm Sci (2001) 22(5):
240-46). El canal de potasio activado por voltaje
hERG contribuye a la corriente de potasio rectificadora tardía de
rápida activación (IKr) del potencial de acción cardiaco. La
interacción de fármacos con el canal de potasio hERG se ha visto
implicada en la prolongación del intervalo QT del
electrocardiograma y la arritmia cardiaca conocida como Torsades de
Pointes ("TdP"; véase C.E. Chiang y D.M. Roden, J Am Coll
Cardiol (2000) 36(1):1-12.; D.M. Roden, N Eng
J Med (2004) 350:1013-22.). La TdP puede ser fatal,
y el riesgo de inducirla conduce al abandono y a la falta de
aprobación de productos farmacéuticos.
Se ha comprobado que el cribaje a gran escala de
fármacos candidatos para determinar su posible efecto sobre hERG es
difícil, en gran parte debido a la falta de disponibilidad de una
línea celular estable que exprese hERG con la suficiente
concentración en superficie, y que sea un sujeto adecuado para los
instrumentos de medida del flujo iónico a gran escala.
Los inventores han creado líneas celulares que
expresan hERG que de forma reproducible forma sellos estables con
gran amplitud de la corriente utilizando análisis estándar y
automatizados de control en parche (del inglés patch clamp).
Las líneas celulares de la invención producen valores de CI_{50}
que son representativos de los que se han descrito en la
bibliografía utilizando métodos a pequeña escala.
Un aspecto de la invención es una línea celular
eucariota estable que expresa hERG, y muestra una corriente de
prueba que varía en menos de aproximadamente un 20% de amplitud de
la corriente del pico bajo las condiciones control durante
alrededor de una hora.
Otro aspecto de la invención es un método para
determinar la propensión de un compuesto de prueba a inhibir la
actividad conductiva de hERG, poniéndose en contacto una célula de
la invención con dicho compuesto de prueba, midiendo una corriente
de prueba bajo condiciones electrofisiológicas, y determinando si la
corriente de prueba es menor en presencia del compuesto de
prueba.
A no ser que se indique de otro modo, los
siguientes términos utilizados en esta solicitud, incluyendo la
especificación y las reivindicaciones, tiene el significado que se
proporciona a continuación. Debe notarse que, tal y como se
utilizan en la especificación y las reivindicaciones anexas, las
formas singulares "un", "una", "el" y "la"
incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto claramente
los dicte de otro modo.
"Agonista" se refiere a un compuesto que
potencia la actividad de otro compuesto o receptor.
"Antagonista" se refiere a un compuesto que
disminuye o evita la acción de otro compuesto o receptor.
El término "fármaco candidato" se refiere a
un compuesto o preparación del que se va a probar su posible efecto
en el tratamiento de una enfermedad en un animal, independientemente
de si dicho fármaco candidato posee una actividad biológica
conocida.
El término "homólogo" como se utiliza aquí
se refiere a una proteína que realiza sustancialmente la misma
función en otra especie dada y comparte una identidad de secuencia
sustancial, hasta el punto que se reconocen en el campo como
versiones diferentes de la misma proteína, que difieren
principalmente en la especie en la que se encuentran. Así, por
ejemplo, el ERG humano, el ERG de ratón y el ERG de rata se
consideran todos homólogos entre ellos.
"Modulador" significa una molécula que
interacciona con una diana. Las interacciones incluyen, pero no se
limitan a, un agonista, un antagonista y similares, como se definen
aquí. "Enfermedad" significa cualquier enfermedad, estado,
síntoma, trastorno o indicación.
El término "línea celular" se refiere a un
clon de células de mamífero inmortalizadas. Una línea celular
"estable" es una línea celular que muestra características
sustancialmente consistentes a lo largo del tiempo (por ejemplo
tras doblarse). Una línea celular estable dentro del alcance de esta
invención proporciona una proporción sustancial de células que son
capaces de ejercer una resistencia de sellado superior a alrededor
de 50 MOhm, una amplitud de la corriente superior a alrededor de
200 pA, y una amplitud de la corriente que no varía en más de
aproximadamente un 20% a lo largo de una hora bajo condiciones
control.
Los términos "progenie" y
"descendientes" tal y como se utilizan aquí se refieren a las
células obtenidas mediante cultivo o de cualquier otro modo de
obtener una célula de la invención. El término "derivado" tal
y como se utiliza aquí se refiere a una célula que se obtiene
mediante modificación, fusión, transfección, transformación o de
cualquier otro modo de cambiar una célula de la invención. Por
ejemplo, pueden crearse derivados trasfectando una célula de la
invención con un plásmido o virus, fusionándola con una célula de
hibridoma y similares.
El término "medidas electrofisiológicas" o
"experimento de control en parche" se refiere a un
procedimiento experimental en el que el potencial de voltaje de
parte o la totalidad de una membrana celular (típicamente en una
célula aislada) se mantiene a un voltaje predeterminado, luego se
somete a uno o más cambios en el voltaje, durante y/o tras los
cuales se mide la corriente que pasa a través de la membrana. En el
experimento de medida de hERG utilizado aquí, se fija inicialmente
el voltaje de una célula que expresa hERG en su superficie a un
potencial de mantenimiento de -80 mV, y se calculó la diferencia de
escape entre un pulso de 100 ms hasta -40 mV, seguido de 1000 ms a
20 mV (pre-pulso), y 500 ms a -40 mV (pulso de
prueba). La corriente de hERG se midió como el pico (al inicio del
pulso de prueba) a -40 mV tras la corrección con la corriente de
escape. Pueden utilizarse variaciones de este protocolo. La
inhibición de la corriente de hERG debida a la interacción de un
fármaco con el canal de potasio hERG se mide durante el pulso de
prueba y se indica como "corriente de prueba". En las líneas
celulares de la invención, la corriente de prueba varía en menos de
aproximadamente el 20% en una situación control, que dura hasta una
hora. El término "instrumento de control en parche" se refiere
a cualquier instrumento o dispositivo adecuado para realizar tales
medidas, como por ejemplo, un control en parche estándar como
IonWorks HT, IonWorks Quattro, PatchXpress 7000A y similares.
"Sujeto" incluye mamífero y aves.
"Mamíferos" significa cualquier miembro de la clase
mammalia, lo que incluye pero no se limita a los humanos,
primates no humanos como los chimpancés y otras especies de simios
y monos; animales de granja como vacas, caballos, ovejas, cabras y
cerdos, animales domésticos como conejos, perros y gatos, animales
de laboratorio, lo que incluye roedores, como las ratas, ratones y
conejillos de indias, y similares. El término "sujeto" no
indica una edad o sexo particular.
"Tratar" o "tratamiento" de una
enfermedad incluye (i) prevenir la enfermedad, es decir conseguir
que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un
sujeto que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad,
pero que aun no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad;
(ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de la
enfermedad o sus síntomas clínicos; o (iii) aliviar la enfermedad,
es decir, causar una regresión temporal o permanente de la
enfermedad o sus síntomas clínicos.
La invención proporciona líneas celulares que
expresan hERG y son adecuadas para su utilización en ensayos de
electrofisiología a gran escala automatizados y en métodos que
utilizan tales células para el cribaje de compuestos con una
potencial actividad inhibidora de hERG.
Las líneas celulares de la invención están
diseñadas para su utilización en sistemas electrofisiológicos de
parches planos gracias al hecho de que están adaptadas a crecer en
suspensión. Se han utilizado en sistemas como el sistema de parche
plano IonWorks HT y el PatchXpress 7000A, pero también pueden
utilizarse en otros dispositivos o sistemas.
Las líneas celulares pueden cultivarse en
suspensión utilizando Ex-cell 301 (JRH, Nº cat.
JRH-14331), suero fetal bovino al 10% (Gibco, Nº
cat. 16140-089) y 0,25 mg/ml de geneticina (Gibco,
Nº cat. 10131-035). Las células se cultivan
preferiblemente a 35 \pm 2ºC, se suplementan con CO_{2} al 5%,
en volúmenes de 50-100 ml en frascos de un litro,
en agitación a 90-100 rpm (amplitud del agitador de
dos pulgadas). Para un funcionamiento óptimo, se mantienen los
títulos de células entre alrededor de 10^{5} y alrededor de
10^{6} células/ml.
La expresión de hERG puede verificarse mediante
métodos estándar, por ejemplo, mediante Western blot tras una la
lisis celular. La expresión de la corriente de hERG puede variar
dependiendo de las condiciones de cultivo celular.
La estabilidad de una línea celular puede
valorarse utilizando un método estándar de control en parche,
fijando las células obtenidas de la línea celular, sometiéndolas a
un pulso y midiendo las corrientes resultantes en una serie de
puntos temporales. En una línea celular estable de la invención, la
corriente no varía en más del 20% a lo largo de una hora bajo
condiciones control.
Para las células adherentes, la recogida
normalmente requiere la utilización de un reactivo de disociación,
como el medio de cultivo suplementado con tripsina o Versene^{TM}.
Para las células adaptadas al crecimiento en suspensión,
típicamente no es necesario un reactivo de disociación. Las células
se resuspenden en la solución de registro electrofisiológico
previamente a su uso en un experimento.
Las medidas de la corriente de HERG se realizan
en las células de la invención en presencia y ausencia de los
compuestos de prueba. Para el cribaje, es suficiente registrar la
concentración a la que el compuesto de prueba inhibe la corriente
de hERG en alrededor del 50% o más.
En la práctica de los métodos de la invención,
las células de una línea celular de la invención se ponen en
contacto o se exponen a los compuestos de prueba, lo que
opcionalmente incluye compuestos control positivo y negativo, y se
mide el grado en el que se inhibe la actividad de hERG mediante la
determinación del efecto (si lo hay) sobre la corriente durante las
medidas electrofisiológicas. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden
aplicar las células de la invención en un substrato de un
instrumento de control en parche, y poner en contacto células
individuales con un compuesto de prueba. Los compuestos de prueba
pueden utilizarse en diferentes concentraciones, o pueden
utilizarse a una concentración predeterminada (por ejemplo, 10
\muM, 20 \muM, 50 \muM y similares). Los compuestos
normalmente se disuelven en una solución de registro
electrofisiológico. Las células entonces se fijan en parches y se
someten a un pulso como el descrito aquí, y se detecta la corriente
de prueba. Los compuestos que causan una reducción sustancial de la
corriente de prueba se consideran inhibidores de la actividad de
hERG a esa concentración. Preferiblemente, la corriente de prueba se
compara con uno o más controles, que pueden ser las mismas células
de la invención previamente a la aplicación de los compuestos de
prueba, o pueden ser células sustancialmente idénticas (por ejemplo,
derivadas del mismo cultivo celular) y sometidas a compuestos
control positivo y/o negativo.
Las líneas celulares de la invención son útiles
ya que proporcionan una expresión de hERG en la superficie de la
célula con un rendimiento estable, y sirven como sustratos adecuados
para el cribaje a gran escala de la actividad de hERG utilizando
métodos electrofisiológicos. Por lo tanto, utilizando las líneas
celulares de la invención, se puede realizar un cribaje de fármacos
candidatos rápidamente y de forma eficiente de su posible
interacción con hERG. Los métodos de la invención son útiles para el
cribaje a gran escala de fármacos candidatos y otros compuestos,
para determinar su interacción y/o modulación de hERG, y por lo
tanto, en parte determinar su potencial cardiotoxicidad.
Las siguientes preparaciones y ejemplos se
proporcionan para permitir a los expertos en la materia una
comprensión clara y como práctica de la presente invención. No
deben considerarse como limitantes del alcance de la invención,
sino meramente ilustrativos y representativos de la misma.
Los componentes del medio de cultivo celular
incluyen Ex-cell 301 (JRH, Nº cat.
JRH-14331), suero fetal bovino al 10% (Gibco, Nº
cat. 16140-089) y 0,25 mg/ml geneticina (Gibco, Nº
cat. 10131-035). Las células se cultivan a 35 \pm
2ºC, suplementadas con CO_{2} al 5%, en volúmenes de
50-100 ml en frascos de 1 litro en agitación a
90-100 rpm (amplitud del agitador de 2 pulgadas).
Para un funcionamiento óptimo, el título de células se mantiene
entre 10^{5} y 10^{6} células/ml.
Las soluciones de registro electrofisiológico
tanto para el control en parche estándar como automatizado
(PatchXpress 7000A) incluye un tampón interno (en mM, de Sigma a no
ser que se indique de otro modo): 140 KCl (Nº cat.
P-9541), 6 EGTA (Nº cat. E-3889), 5
Hepes (Nº cat. H-3784), 5 MgCl_{2} (Nº cat.
M-1028), 5 ATP-Na^{2} (Nº cat.
A-2383) y pH 7,2 con KOH (J.T. Baker, Nº cat.
3143-01); un tampón externo (en mM, de Sigma a no
ser que se indique de otro modo): 150 NaCl (Nº cat.
S-3014), 10 Hepes (Nº cat. H-3784),
4 KCl (Nº cat. P-9541), 1.2 CaCl_{2} (Nº cat.
C-3306), 1 MgCl_{2} (Nº cat.
M-1028), pH hasta 7,4 con HCl (J.T. Baker Nº cat.
5619-02). Los sustratos de control en parche
incluyen PatchPlates^{TM} (Nº cat. 9000-0688) y
SealChips^{TM} (1-SealChip16-K)
distribuidos por Molecular Devices Corp.
Electrofisiología: Protocolo del pulso de
voltaje: el potencial de mantenimiento fue de -80 mV, la sustracción
del escape se calculó a partir de un pulso de 100 ms a -40 mV,
seguido de 1000 ms a 20 mV (pre-pulso), y 500 ms a
-40 mV (pulso de prueba). La corriente de hERG se midió como el pico
(al inicio del pulso de prueba) a -40 mV tras la corrección con la
corriente de escape.
Generación de la curva de CI_{50} y
estadística: Se representaron las curvas de
concentración-respuesta utilizando Excel Fit
(versión 3, ID-BS) con el modelo logístico de cuatro
parámetros o el modelo de dosis respuesta sigmoideo, ecuación 205.
Inhibición fraccional (I_{Compuesto}/I_{Control}) = 1/(1+
[Compuesto]/IC_{50})^{nH}, donde I es la corriente,
IC_{50} es la concentración de compuesto necesario para inhibir
la corriente en un 50% y nH es el coeficiente de Hill.
\vskip1.000000\baselineskip
(A) Una línea celular CHO-K1 que
expresa de forma estable niveles elevados de canales hERG
funcionales se generó como sigue. Inicialmente, las células
CHO-K1 salvajes se trasfectaron con un plásmido que
codifica una casete (promotor de CMV - proteína cian fluorescente -
IRES - marcador de resistencia a higromicina). En esta construcción
se localizan dos puntos loxP no idénticos, uno entre el promotor CMV
y el ORF de la proteína cian fluorescente, y otro en el extremo 3'
del marcador de resistencia a higromicina. A partir de trasfectantes
al azar de células CHO en crecimiento en higromicina, se seleccionó
una línea celular en base a sus niveles de expresión de proteína
cian fluorescente. Estos niveles permanecieron estables a lo largo
de múltiples generaciones; y mediante una transferencia de DNA
genómico se verificó que había ocurrido un único evento de
integración cromosómico. A continuación se recombinó una casete
(loxP - hERG - IRES - marcador de resistencia a neomicina - loxP)
con esta línea celular receptora mediante un intercambio mediado por
la recombinasa CRE. El paso de recombinación correcta se verificó
en clones de células CHO seleccionadas mediante i) ausencia de
fluorescencia cian, ii) sensibilidad a la higromicina y iii) éxito
en la PCR de DNA genómico utilizando un cebador directo localizado
en el promotor del CMV y un cebador reverso en el ORF de hERG. La
transfección y subsiguiente selección de 5 millones de células
resultó en 16 clones que cumplían los tres criterios anteriores.
Estos clones se escalaron y se analizó su expresión de la proteína
hERG mediante Western blot y la actividad del canal iónico hERG en
el instrumento Ionworks. Una de las líneas celulares resultantes, la
"CHO crelox hERG UG#7", se adaptó a continuación al
crecimiento en suspensión. Se preparó un cultivo en suspensión
inicial mediante la dilución de células a 0,75 millones/ml en medio
Ex-cell 301, FBS al 5%, 0,25 mg/ml G418. Este
cultivo se mantuvo durante 24 horas y alcanzó una densidad de
alrededor de 10^{6} células/ml. Luego se diluyó a 0,2 millones de
células/ml en medio fresco y se cultivó durante 72 horas, hasta
alcanzar una densidad de 10^{6} células/ml. Este paso de
dilución-transferencia se repitió cuatro veces, y en
este punto se consideró que las células estaban adaptadas al
cultivo en suspensión. Esta línea celular (CHO crelox hERG UG#7) se
depositó en la ATCC bajo las condiciones del tratado de Budapest
con el número de registro PTA-6812 el 22 de Junio de
2005.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha documentado una descripción de la línea
celular utilizando el instrumento IonWorks HT: H. Guthrie, et
al. (2005). "A Place for High Throughput Electrophysiology in
Cardiac Safety: Generating a Novel hERG Cell Line and Screening
Early with IonWorks HT". J Biomol Screening (2005)
10(8):832-40.
Se ha documentado una descripción de la línea
celular utilizando el instrumento PatchXpress 7000A: L. Guo y H.
Guthrie (2005). "The Role of Automated Electrophysiology in the
Prediction of QT Prolongation". J Pharmacol Toxicol Methods
52(1):123-35.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular CHO crelox hERG UG#7 mostró una
amplitud de corriente media de 800 pA, un éxito de la tasa de
sellos de > 80%, sellos entre 100-200 MOhm y
registros de éxito globales superiores al 80%, y se escogió para su
utilización en el cribaje de una biblioteca de compuestos. Se
cribaron trescientos compuestos para encontrar aquellos que
inhibían > 50% de la corriente de hERG tras una aplicación de
compuesto a 30 \muM. Para el cribaje se utilizaron compuestos de
varios proyectos, algunos de los cuales ya se había descrito que
bloqueaban los canales hERG cuando se estudiaron mediante control en
parche estándar, aunque estos experimentos se realizaron a ciegas.
Se prepararon tres placas de compuestos en placas de 96 pocillos y
cada una de ellas se analizó dos veces, con aproximadamente 90
compuestos por placa (cada compuesto se probó cuatro veces).
Utilizando la placa de 384 pocillos PatchPlate, el cribaje de un
único punto de los 300 compuestos se completó en una jornada de
ocho horas. El análisis utilizando una placa de compuestos dura
aproximadamente 40 min. En total, cada compuesto se utilizó en ocho
pocillos de la PatchPlate, lo que generalmente permite entre tres y
ocho células correctas (puntos de datos) a esa concentración.
Durante el cribaje, cada concentración de
compuesto se analizó dos veces para asegurar un número suficiente
de células por punto de datos. La redundancia de ocho pocillos era
necesaria a causa de la variabilidad en la tasa de éxito. Así es
posible disponer de un rango en n valores de uno a ocho para cada
compuesto. Los pocillos replicados en la PatchPlate también son
importantes debido a la variabilidad entre las células de una línea
celular. La Fig. 1 muestra la variabilidad observada en la línea
celular CHO crelox hERG UG#7 a lo largo de nueve días de
experimento (no consecutivos). Durante este tiempo, tras la
evaluación inicial de la línea celular, esta línea celular presentó
una amplitud de corriente media de 650 pA, que se redujo desde los
800 pA observados en la fase de evaluación de la línea celular de
este estudio. La estabilidad de la corriente fue elevada y se
aproximó al 90%. Aunque los replicados utilizados en estos
experimentos pueden haber aumentado el tiempo que se empleó en el
cribaje, se obtuvieron suficientes datos en el tiempo de cribado
planificado. Con el nuevo Ion-Works Quattro, una
tecnología que incorpora la tecnología de control en parche en
poblaciones (Population Patch Clamp^{TM}, con un mayor número de
puntos de registro en el pocillo de la PatchPlate), se eliminará la
redundancia que se ha utilizado aquí.
A 30 \muM, 160 compuestos bloquearon la
corriente de hERG en > 50%. Los 160 compuestos así identificados
se reanalizaron utilizando una estrategia de
concentración-respuesta de ocho puntos con el
sistema de IonWorks HT. Se cribaron cinco fármacos por ronda, junto
con los controles positivo (haloperidol) y negativo (PBS con DMSO
al 0,1%). La CI_{50} media del haloperidol obtenida con el
IonWorks HT fue de 0,74 + 0,36 \muM (a partir de 31
experimentos). Los datos históricos de control en parche estándar
del haloperidol recogidos a 37ºC con una línea celular diferente
bajo condiciones experimentales diferentes variaba de 0,025 a 0,12
\muM. El cribaje de 160 compuestos tardó cinco días en
completarse con una concentración individual testada en 16 pocillos
de la PatchPlate. Como se ha discutido anteriormente, la redundancia
en el análisis de los compuestos pretende asegurar que se obtiene
un gran número de puntos de datos para mejorar el nivel de confianza
del grupo de datos. Se seleccionó un conjunto de datos originado en
un proyecto para una evaluación en más detalle, ya que todos los
compuestos de este subgrupo se habían analizado mediante control en
parche estándar. Los datos históricos de control en parche y los
datos del IonWorks HT se compararon con una correlación positiva
(Spearman r = 0,53, p < 0,004). Los compuestos que resultaron en
un valor de CI_{50} de hERG > 30 \muM en el IonWorks HT
habían resultado en un valor medio de CI_{50} mediante control en
parche estándar de 20,2 + 10,0 \muM (DE). Los valores de control
en parche estándar se obtuvieron bajo condiciones ligeramente
diferentes, lo que incluye una configuración de célula completa
(frente a parche perforado), el protocolo de pulso de voltaje, las
soluciones de registro, la línea celular (CHO-hERG),
temperatura (37ºC) y los métodos de análisis. Algunos compuestos
parecían menos potentes con el sistema IonWorks HT, y algunos
incluso ligeramente más potentes. Sin embargo, los valores medios
de CI_{50} de ambos grupos no mostraron una diferencia
estadística.
Claims (6)
1. Una línea celular eucariota estable que
consiste esencialmente en CHO crelox-hERG UG#7, ATCC
PTA-6812, o su progenie, derivados o
descendientes.
2. Un método para determinar la capacidad de un
compuesto de prueba de inhibir hERG, u dicho método comprende:
a) proporcionar una célula eucariota estable de
la reivindicación 1;
b) poner en contacto dicha célula con un
compuesto de prueba;
c) medir una corriente de prueba en un
instrumento de control en parche (patch clamp); y
d) determinar si la corriente de prueba se
reduce en presencia de dicho compuesto de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha corriente de prueba en dicha célula se compara antes y
después de poner en contacto dicha célula con dicho compuesto de
prueba.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una
corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica en
ausencia de dicho compuesto de prueba.
5. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una
corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica que se
pone en contacto con un compuesto del que se sabe que no posee
efectos inhibitorios de hERG.
6. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una
corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica que se
pone en contacto con un compuesto del que se sabe que muestra un
nivel inaceptable de inhibición de hERG.
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