ES2340892T3 - Anticuerpos monoclonales cataliticos con actividad proteasa para la lisis selectiva del componente de proteina de placas y agregados relacionados con estados patologicos. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales cataliticos con actividad proteasa para la lisis selectiva del componente de proteina de placas y agregados relacionados con estados patologicos. Download PDFInfo
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Abstract
Aczima o fragmento de la misma que tiene actividad proteasa contra el péptido Aβ1-42 agregado en conformación de lámina β, obteniéndose dicha aczima mediante inmunización con el péptido Aβ1-42 agregado en conformación de lámina β.
Description
Anticuerpos monoclonales catalíticos con
actividad proteasa para la lisis selectiva del componente de
proteína de placas y agregados relacionados con estados
patológicos.
La presente invención se refiere a anticuerpos
monoclonales catalíticos según se definen en las reivindicaciones,
para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento o la
prevención de patologías caracterizadas por la presencia de
agregados de proteína que comprenden el péptido
A\beta_{1-42} en conformación de lámina
\beta.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una
enfermedad degenerativa que afecta al sistema nervioso central,
principalmente al nivel de las zonas relacionadas con las funciones
intelectuales, que produce necrosis de las células neuronales y,
como consecuencia, la pérdida progresiva de capacidades cognitivas,
mentales y mnemónicas de los pacientes en cuestión, inevitablemente
con un desenlace mortal.
La EA, que sólo puede diagnosticarse de manera
segura mediante la autopsia, se caracteriza por estructuras
patológicas que pueden diferenciarse en:
- -
- placas seniles o de amiloide, situadas en el espacio extracelular, que se depositan en el cerebro y en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales;
- -
- marañas neurofibrilares situadas en el interior de las células.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de dichas estructuras provoca una
pérdida notable de neuronas en la neocorteza, el hipocampo y otras
estructuras relacionadas, con una gran reducción de la concentración
de neurotransmisores. Dichos efectos se deben a la toxicidad
determinada tanto directa como indirectamente por las estructuras
neuropatológicas citadas y la muerte neuronal da como resultado, a
su vez, la pérdida progresiva de las capacidades cognitivas.
Las estructuras anatomopatológicas citadas
anteriormente consisten en componentes específicos:
- 1
\;
- - Péptido \beta-amiloide (péptido A\beta, A4, A4\beta, \beta, \beta), que se deriva del procesamiento de la proteína precursora del amiloide (\betaAPP), y es una mezcla de un pequeño grupo de péptidos, de 28 a 43 aminoácidos de longitud, dispuestos en estructuras de lámina plana.
- 2
\;
- - Apolipoproteína E (Apo E).
- 3
\;
- - Proteína tau.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido A\beta es el principal componente
de las placas de amiloide; existen al menos dos formas diferentes
de placas, que es probable que representen dos etapas posteriores
del proceso de polimerización de A\beta:
- a)
- placas difusas o preamiloideas, que consisten en depósitos amorfos, no congófilos de A\beta insoluble, con algunas deposiciones de amiloide, que contienen microglia o algunos astrocitos reactivos; éstos están situados habitualmente en la materia gris del cerebro y aparentemente no producen efectos notables sobre los tejidos adyacentes;
- b)
- placas seniles o neuríticas que consisten en un centro de depósitos fibrilares, congófilos de A\beta, que contienen microglia o astrocitos reactivos y están rodeados por neuritas distróficas, degenerativas.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína tau asociada con microtúbulos, en
forma hiperfosforilada, es el principal componente de las marañas
neurofibrilares. Éstas están formadas habitualmente por filamentos
helicoidales apareados (PHF, paired helical filaments) que,
a su vez, se derivan de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP,
microtubule associated proteins) y consisten en una
acumulación anómala en las neuronas degenerativas de proteínas
citoesqueléticas con propiedades bioquímicas y antigénicas
específicas. En condiciones normales, las MAP probablemente regulan
el movimiento y estabilizan la disposición de neuronas durante el
crecimiento de los axones y de las dendritas.
ApoE está presente en combinación con las placas
de amiloide, con las formas neurofibrilares y con los depósitos de
amiloide de los vasos cerebrales. ApoE podría desempeñar un papel
bioquímico en el desarrollo de la EA, relacionado con su capacidad
de unirse a A\beta. Se supone que ApoE desempeña el papel de
transportador molecular y podría ayudar en el secuestro de A\beta
en las placas.
El análisis genético de la EA temprana reveló
mutaciones de algunos genes en diferentes cromosomas.
En correlación con la presencia característica
de A\beta, se ha identificado una mutación del gen que codifica
para \betaAPP en el cromosoma 21, en los niveles de los codones
717 y 670/671. Una mutación puntiforme en dichos niveles puede
cambiar el procesamiento de \betaAPP, impidiendo la escisión
fisiológica en péptidos que no se agregan y favoreciendo, por el
contrario, la ruta amiloidogénica. Sin embargo, debe observarse que
sólo un pequeño porcentaje de casos tempranos de EA familiar
(4-5%) se han relacionado con mutaciones en el
cromosoma 21.
Se ha identificado una segunda mutación
relacionada estrictamente con la EA familiar, temprana en el brazo
largo del cromosoma 14. En el gen implicado, denominado S182, se
detectaron al menos 15 mutaciones diferentes, relacionadas con la
EA familiar, apareciendo dichas mutaciones en el 80% de los casos de
EA temprana. El producto del gen S182 es una proteína integral de
la membrana, cuya función no se ha aclarado aún.
Un tercer gen, cuya mutación está relacionada
con aproximadamente el 15% de los casos de EA familiar temprana,
está situado en el cromosoma 1 y se denomina STM2. La función de la
proteína codificada por dicho gen no se conoce aún, pero parece
producir un aumento en la producción de
\beta-amiloide.
En lo que se refiere a la EA senil, ésta podría
ser el resultado de mutaciones oligogénicas. Se ha observado que
esto está relacionado con mutaciones en el cromosoma 19, en
particular contra el gen que codifica para ApoE.
\betaAPP es una glicoproteína transmembrana
(695-770 aa) que en su mayor parte sobresale en el
espacio extracelular. El procesamiento fisiológico de \betaAPP
consiste en la escisión por la enzima
\alpha-secretasa dentro de la secuencia de
A\beta, inmediatamente fuera de la región transmembrana (aa 16),
con la formación y la liberación de formas solubles de amiloide
(AAP) en el líquido extracelular. La acción de la
\alpha-secretasa, por tanto, impide la formación
de A\beta. La secuencia de aminoácidos de \betaAPP que
corresponde a A\beta está situada en parte en el espacio
extracelular y en parte en la membrana (los 28 aa del extremo
amino-terminal con respecto al único dominio
transmembrana del precursor, más los primeros 11-15
residuos del dominio transmembrana). La expresión de \betaAPP y
la liberación de las APP están moduladas por factores neutróficos y
por citocinas. La expresión de \betaAPP aumenta cuando tiene
lugar la diferenciación neuronal y las APP pueden afectar al
crecimiento de neuritas y a la supervivencia neuronal en los
cultivos celulares. La función de \betaAPP no está clara:
aparentemente puede desempeñar un papel como adhesivo/receptor y
estar implicado en la plasticidad sináptica. Las APP controlan la
[Ca^{2+}]_{i} y modifican la respuesta de Ca^{2+} al
glutamato. Las APP se transportan a lo largo del axón y entonces se
liberan en las sinapsis mediante los conos axónicos en crecimiento
y mediante los terminales axónicos.
Brevemente, las funciones de \betaAPP y de las
APP son:
- -
- regulación de la proliferación celular en células no neuronales,
- -
- adhesión celular,
- -
- fomento de la supervivencia neuronal,
- -
- protección frente a la excitotoxicidad o frente a daños isquémicos,
- -
- regulación del crecimiento neuronal,
- -
- regulación de los niveles intracelulares de calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando no tiene lugar fisiológicamente la
degradación de \betaAPP, o bien debido a la presencia de la
mutación puntiforme o bien al ataque de enzimas diferentes a la
\alpha-secretasa o a una producción excesiva de
\betaAPP, se forman fragmentos amiloidogénicos, es decir
fragmentos insolubles de A\beta, con una estructura de lámina
\beta plana, se agregan en formaciones fibrosas cada vez más
complejas hasta que se forman placas de amiloide extracelulares
insolubles (Cummings, Neuroscience 48:763 (1992); Kuo, Neurobiol.
Aging 14:547-560 (1993)).
En el centro de las placas neuríticas, se ha
identificado una forma prevalente de A\beta de 42 aminoácidos de
longitud, concretamente A\beta_{1-42} (Rohrer,
Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10836-10840 (1993);
Gravina, J. Biol. Chem. 270: 7013-7016 (1995);
Motter, Ann. Neurol. 38: 643-648 (1995); Cummings,
Neurobiol. Aging. 17: 653-659 (1996). Este
fragmento, además de ser el principal componente de las placas de
amiloide, es, entre los diversos fragmentos, el que tiene las
mayores características amiloidogénicas, es decir, está altamente
capacitado para asociarse en agregados cada vez más complejos y
formar fibrillas. Se ha evidenciado, de hecho, un dominio más
hidrófobo en la molécula de A\beta_{1-42} que
parece ser crítico para el ensamblaje de las fibrillas de amiloide,
porque aumenta la tasa de agregación de las mismas (Pike, J.
Neuroscience 13:1676 (1993); por tanto,
A\beta_{1-42} podría desempeñar un papel más
importante que los fragmentos más cortos en la formación de placas.
Tras la formación de los primeros agregados fibrilares que consisten
en A\beta_{1-42}, también se agregan otros
fragmentos más cortos en las placas; por tanto,
A\beta_{1-42} serviría como centro de
nucleación para la agregación.
A\beta_{1-42} se deposita de
manera temprana y selectiva en las placas seniles y esto es una
característica constante de todas las formas de EA.
A\beta_{1-42} se agrega en fibrillas y, ya en
esta fase, es decir, antes de que se depositen las fibrillas en las
placas de amiloide, las propias fibrillas pueden empezar el proceso
neurodegenerativo y también inducir hiperfosforilación de la
proteína tau. Aparentemente, el aminoácido
C-terminal es crítico para la agregación del péptido
(Jarrett, Biochemistry 32:4693-4697 (1993).
Existe una relación directa entre la agregación
del péptido y la posibilidad de neurotoxicidad. A\beta tiene, de
hecho, un efecto tóxico directo sobre neuronas humanas in
vitro y tal toxicidad es directamente proporcional al estado de
agregación. A\beta se acumula en o sobre la membrana plasmática
(se incorpora en la bicapa lipídica) en la que forma canales de
flujo selectivos para Ca^{2+}, produciendo así un cambio
estructural en la membrana plasmática, con formación de canales
específicos que alteran la permeabilidad al Ca^{2+}. Por tanto,
la actividad como conducto de los canales iónicos estaría en el
fondo del efecto neurotóxico de A\beta.
Los efectos de A\beta pueden resumirse
así:
- -
- alteración del crecimiento de neuritas,
- -
- aumento de la vulnerabilidad de las neuronas frente a la excitotoxicidad,
- -
- desestabilización de la homeostasis neuronal de calcio,
- -
- toxicidad como consecuencia de la agregación,
- -
- formación de poros para el transporte de Ca^{2+} en la membrana,
- -
- fomento de la liberación de citocinas proinflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
En la actualidad, no existen terapias
farmacológicas contra la EA. El único medicamento comercializado que
lleva dicha indicación es la tacrina (DCI), un inhibidor de la
acetilcolinesterasa, cuya actividad farmacológica se basa en el
bloqueo del catabolismo del neurotransmisor acetilcolina.
Los enfoques terapéuticos actuales basados en el
péptido \beta recurren a diferentes estrategias:
- -
- inhibición de las enzimas implicadas en la ruta amiloidogénica (\beta-secretasa),
- -
- productos que o bien bloquean la neurotoxicidad inducida por A\beta o bien estabilizan las células neuronales impidiendo su sensibilización al calcio intracelular,
- -
- bloqueadores o modificadores de los canales iónicos de A\beta
- -
- compuestos que inhiben la agregación de A\beta, incluso que modifican el dominio hidrófobo que aparentemente provoca las propiedades amiloidogénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La aterosclerosis es una patología
extremadamente compleja y variable en la que algunos componentes de
diferente naturaleza se depositan en placas que se adhieren a la
capa íntima de los vasos sanguíneos. Dichas formaciones producen un
daño local al vaso y un aumento de las resistencias circulatorias
con un aumento de presión consiguiente, así como una disminución en
el aflujo de sangre a órganos y tejidos y por tanto una
descompensación funcional.
La caracterización histológica de las placas
ateroscleróticas no se ha definido aún por completo: los parámetros
responsables de la evolución de la placa, los mecanismos de
formación y las fases de la evolución todavía no están claros en
parte y varían dependiendo de factores determinantes tales como la
edad, el sexo, la dieta y el entorno. El estudio de la morfología y
la composición de placas ateromatosas complejas, extraídas de
pacientes sometidos a cirugía periférica, mostró una heterogenicidad
notable en la composición química/biológica de los agregados:
algunas formaciones consisten principalmente en lipoproteínas y
lípidos, otras en células inflamatorias, otras en cápsulas
fibrosas, otras, las más complejas, en vasos neoformados.
Por otro lado, las fases de formación tempranas
de las placas ateromatosas tienen aparentemente algunas
características comunes: en particular, la presencia de
lipoproteínas del grupo de las LDL (Hoff HF et al. J. Lipid
Res 34: 789-798 (1993); Srinivasan SR et al.
Atherosclerosis 38: 137-147 (1981); Piotrowski JJ
Life Sci. 58: 735-740 (1996)) parece representar
una característica estructural común de las placas ateromatosas en
la fase temprana de depo-
sición.
sición.
Westermark y colaboradores (Am. J. Pathol. 147:
1186-1192 (1995) evidenciaron que los depósitos de
amiloide en la capa íntima de la aorta son muy comunes en
combinación con patologías ateroscleróticas y envejecimiento. Estos
investigadores purificaron una proteína fibrilar presente en los
depósitos extracelulares de pacientes con aterosclerosis: dicha
proteína es el fragmento N-terminal de 69
aminoácidos de longitud de la apolipoproteína A1.
En la actualidad, no existen terapias
farmacológicas eficaces para el tratamiento de las fases tempranas
de la formación de placas ateromatosas. Aunque la cirugía es la
estrategia de elección cuando están presentes placas evolucionadas,
complejas, los pacientes que se sabe que son propensos a la
aterosclerosis no pueden recibir terapias preventivas
adecuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las gammapatías monoclonales o discrasias de
células plasmáticas son un grupo de enfermedades clínica y
bioquímicamente diferentes caracterizadas por la proliferación
anómala de un clon celular normalmente implicado en la síntesis de
inmunoglobulinas.
La característica inmunoquímica de estas
enfermedades es la presencia de inmunoglobulinas estructural y
electroforéticamente homogéneas (monoclonales) o de subunidades
polipeptídicas de las mismas en el suero o la orina del
paciente.
Algunos de estos estados son asintomáticos y
aparentemente estables, otros, tales como el mieloma múltiple y la
amiloidosis, son progresivos y mortales.
La etiología de las gammapatías monoclonales es
desconocida.
La amiloidosis consiste en un grupo de estados
bioquímica y clínicamente heterogéneos, que habitualmente se
caracterizan por la deposición de proteínas en forma fibrilar en los
tejidos. Tal acumulación produce un daño funcional en los órganos
implicados con un desenlace a menudo mortal.
Más particularmente, la amiloidosis AL se debe a
la deposición de fibrillas formadas por fragmentos de cadenas
ligeras de inmunoglobulina. Esta amiloidosis se diferencia en
amiloidosis primaria, si el clon de células plasmáticas no es muy
grande y amiloidosis asociada a mieloma múltiple.
La amiloidosis AL es una de las discrasias de
células plasmáticas más graves para la que no existen tratamientos
eficaces. La evolución de la enfermedad es rápida y mortal, con una
supervivencia media de sólo 12 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo el término prión para definir una
clase de partículas responsables de la transmisión de algunas
enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de
Creutzfeld-Jakob, kuru, síndrome de
Gerstmann-Straussler-Scheinker
(GSS), insomnio familiar mortal (FFI, familial fatal
imsomnia), encefalopatía espongiforme bovina (EEB).
Este tipo de patologías se caracteriza por la
acumulación en el cerebro de una proteína resistente a proteasas
(PrPres), que se deriva de una proteína sensible a proteasas
(PrPsen) de 33-35 kDa. La secuencia de aminoácidos
de las dos proteínas es la misma y difieren en la conformación. Los
signos clínicos de las enfermedades coinciden con la modificación
estructural de PrPsen a PrPres, acumulándose esta última en
estructuras fibrilares. La característica histopatológica del
tejido nervioso de los pacientes con enfermedades priónicas es, de
hecho, la presencia de agregados cristalinos con una estructura
esférica situada en las evaginaciones postsinápticas. En extractos
cerebrales en bruto de roedores infectados, se han identificado
estructuras fibrilares con una morfología bien definida: existen
dos tipos de fibrillas, formadas por dos o cuatro subfilamentos
helicoidales; el avance de rotación de los subfilamentos así como
el espacio entre ellos son regulares. Esta estructura microscópica
característica permite distinguir entre los agregados presentes en
las enfermedades priónicas y aquellos que caracterizan otras
enfermedades con acumulaciones de placas, tales como la enfermedad
de Alzheimer. Los priones son altamente resistentes a la acción de
las proteasas y habitualmente se inactivan por medios químicos y
físicos.
Algunos anticuerpos monoclonales pueden
catalizar reacciones químicas que implican componentes que puede
reconocer el propio anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales
catalíticos se denominan aczimas y habitualmente se preparan usando
como antígeno el análogo estable del estado de transición de la
reacción que va a catalizar la propia aczima.
Para la preparación de aczimas con actividad
proteasa, se emplea habitualmente el análogo del estado de
transición del enlace peptídico entre dos aminoácidos
seleccionados, es decir, un análogo dipeptídico; por otro lado, se
obtiene de esta manera una aczima con actividad proteasa
inespecífica, y cualquier proteína que contenga dicho dipéptido en
su propia secuencia puede ser la diana de la aczima. Para aumentar
la especificidad del anticuerpo, en la actualidad se han hecho
intentos para usar inmunógenos en los que están presentes no más de
8 aminoácidos unidos al análogo dipeptídico. También en este caso,
sin embargo, la especificidad y selectividad resultantes no podrían
garantizar la ausencia de reacciones cruzadas entre la aczima y
otras moléculas de proteína diferentes a la diana.
Además, las aczimas se han producido hasta ahora
con el fin de aumentar las velocidades de reacción. Por el
contrario, no se conocen aczimas producidas con el fin de ejercer
actividades ausentes o deficientes en el organismo afectado con una
de las patologías descritas anteriormente.
Solomon B et al.: PNAS, vol. 94, abril de
1997 (04-1997) da a conocer el uso de anticuerpos
monoclonales (Acm) que se unen al péptido A\beta y para disgregar
y deteriorar fibrillas de amiloide formadas por
A\beta_{1-42} agregado para tratar enfermedades
caracterizadas por un aumento de péptidos amiloidogénicos, tales
como la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades priónicas. Sin
embargo, los anticuerpos dados a conocer por Solomon no son
catalíticos, sino que simplemente son anticuerpos monoclonales
dirigidos al sitio, es decir, no ejercen una actividad peptidasa,
sino que solamente se unen a un epítopo expuesto en forma agregada,
posiblemente induciendo un cambio conformacional dentro del mismo
péptido que permite su solubilización.
Sorprendentemente, se ha descubierto que pueden
prepararse anticuerpos monoclonales catalíticos (a continuación,
aczimas) con actividad proteasa sin usar el análogo estable del
estado de transición. De la manera más inesperada, usando como
inmunógeno el agente de proteína responsable o implicado en
patologías caracterizadas por placas o agregados con un componente
de proteína, pueden obtenerse aczimas con actividad proteasa
extremadamente selectiva frente al componente de proteína de la
placa o del agregado característico de la patología en cuestión.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
una aczima o un fragmento de la misma o un fragmento modificado por
ingeniería genética de la misma que participa en la reacción de
escisión de moléculas de proteína cuya presencia, o bien en forma
libre o bien agregada, está relacionada con patologías de diversos
aparatos y órganos.
Un objeto adicional de la presente invención es
un procedimiento para la preparación de dicha aczima.
Todavía un objeto adicional de la presente
invención son composiciones farmacéuticas que contienen dicha aczima
o mezcla de aczimas y medicamentos útiles para el tratamiento o la
prevención de patologías relacionadas con proteínas en forma libre
o agregada contra diversos aparatos y órganos.
Estos y otros objetos de la invención, en las
diversas realizaciones de la misma, se describirán a continuación
con mayor detalle también por medio de ejemplos.
Según la presente invención, la aczima según se
define en las reivindicaciones tiene actividad proteasa frente a
moléculas de proteína cuya presencia, o bien en forma libre o bien
agregada, está relacionada con patologías de diversos aparatos y
órganos.
Como norma, según la presente invención, la
aczima se obtiene usando directamente su diana proteica como agente
inmunógeno, sin necesidad de un derivado sintético del análogo del
estado de transición.
El procedimiento comprende:
- a)
- inmunizar un animal no humano con el péptido A\beta_{1-42} agregado en lámina \beta
- b)
- obtener el hibridoma
- c)
- seleccionar los hibridomas por su actividad proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento para la preparación de la
aczima se efectúa con técnicas convencionales para la preparación
de anticuerpos monoclonales, tales como inmunización in vivo,
inmunización in vitro y presentación en fago.
El anticuerpo resultante puede ser entero, o
puede aislarse y usarse sólo la parte de la molécula que mantiene
la actividad catalítica. La presente invención también comprende
cualquier modificación que se derive de procedimientos de
ingeniería genética, tales como fragmento variable de cadena
sencilla (ScFv), o de procedimientos de modificación, tales como
fragmento de unión a antígeno (Fab) y análogos equivalentes.
La aczima se dirige contra
A\beta_{1-42} agregado en conformación de lámina
\beta.
Dicha aczima reconoce selectivamente el
A\beta_{1-42} ensamblado en placas seniles y
puede ejercer una actividad catalítica peptidasa específicamente
frente al mismo, escindiéndolo en fragmentos más pequeños, que
pueden metabolizarse fácilmente y que no muestran actividades de
agregación. Un enfoque de este tipo permitiría el tratamiento de
pacientes tanto en fases tempranas como tardías de la enfermedad,
aunque en este último estado el proceso neurodegenerativo ya está
avanzado y es irreversible.
Es esencial para la aczima frente a
A\beta_{1-42} que el inmunógeno, es decir, el
propio fragmento del fragmento 1-42 del amiloide
\beta esté en una conformación de lámina \beta.
El uso pretendido del fragmento
A\beta_{1-42} como agente inmunógeno se debe al
hecho de que el centro de los depósitos extracelulares insolubles
de amiloide consiste principalmente en
A\beta_{1-42}. Además,
A\beta_{1-42} es, entre los diversos
fragmentos, el que tiene mayores propiedades amiloidogénicas, es
decir está altamente capacitado para asociarse en agregados cada
vez más complejos y ensamblarse en fibras.
A\beta_{1-42}, de hecho, es más hidrófobo que
otros fragmentos y su tasa de agregación es mayor.
Se ha encontrado que la estructura secundaria
del péptido es de extrema importancia para su actividad neurotóxica
(Simmons, Mol. Pharmacol. 45:373-379 (1994), y el
fragmento 1-42 ejerce su acción sólo tras alcanzar
la conformación de lámina \beta plana. Considerando que
A\beta_{1-42} tiene una conformación de lámina
\beta plana también en las placas de amiloide, es necesario usar
el péptido en su estructura secundaria como inmunógeno. El
A\beta_{1-42} comercial (recién preparado)
tiene una estructura helicoidal aleatoria; la conformación de lámina
\beta puede obtenerse mediante incubación del
A\beta_{1-42} recién preparado en disolución
acuosa durante algunos días (envejecimiento): este tratamiento
determina una transición conformacional desde la hélice aleatoria
hasta la lámina \beta (Simmons, 1994), obteniéndose
A\beta_{1-42} envejecido.
El inmunógeno puede unirse opcionalmente a una
proteína transportadora, cuando el propio inmunógeno no tiene un
tamaño suficiente para provocar una respuesta inmunitaria adecuada o
si esto se considera útil en la práctica de la presente
invención.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al método para la selección de hibridomas. De manera
convencional, los hibridomas se seleccionan con técnicas de
afinidad. Sin embargo, dichas técnicas no seleccionan las aczimas
basándose en la actividad catalítica, de modo que las aczimas
seleccionadas a veces no son las que tienen la mejor actividad.
Según la presente invención, la selección se lleva a cabo poniendo
en contacto los hibridomas con un reactivo de tinción que revela
que ha tenido lugar la reacción catalítica en cuestión. La
detección de las especies que han reaccionado puede llevarse a cabo
mediante procedimientos convencionales, por ejemplo técnicas
colorimétricas o espectrofotométricas.
El siguiente ejemplo ilustra adicionalmente la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha usado el fragmento sintético
A\beta_{1-42} en disolución acuosa, preparado
según un procedimiento ilustrado a continuación, como antígeno que
se inyecta a ratones Balb/c de 8 semanas de edad. También pueden
usarse placas procedentes de pacientes con EA.
Tras llevar a cabo la inmunización, según
esquemas convencionales, se fusionan los esplenocitos del animal
inmunizado con células de mieloma de ratón, para producir
hibridomas.
La selección de los hibridomas que resultan de
la fusión se efectúa según un procedimiento espectrofotométrico
descrito a continuación.
El colorante rojo Congo (RC) se une
selectivamente al \beta-amiloide cuando está en su
configuración de lámina \beta plana; una conformación estructural
de este tipo está relacionada con el estado de agregación del propio
péptido en las placas de amiloide.
Cuando se añade RC a una disolución que contiene
agregado de A\beta (envejecido), los agregados retienen el
colorante y, una vez que se centrifuga la muestra, permanece
atrapado en el sedimento, con una consiguiente disminución de su
concentración en el sobrenadante. La diferencia de Absorción a una
longitud de onda de 485 nm (pico de Absorbancia de RC) indica la
presencia del péptido soluble en el sobrenadante y, por tanto, es un
índice de la actividad proteasa y de la presencia de la aczima
deseada.
Se prepara una disolución 100 \muM de RC.
Se prepara el A\beta 25 \muM envejecido en
PBS.
Se dispensan 100 \mul de A\beta envejecido
en tubos de ensayo.
Se toman 100 \mul de cada muestra de cada
pocillo que contiene los hibridomas y se dispensan en el tubo de
ensayo correspondiente, que se agita y se incuba a 37ºC durante 1
hora. Se extingue la reacción en hielo.
Se mantienen en hielo los tubos de ensayo y se
les añaden 100 \mul de RC frío, luego se agitan, se incuban en
hielo durante 1 hora, luego se centrifugan a 14.000 g durante 5
minutos.
Se incubó el A\beta envejecido 25 \muM en
PBS con el sobrenadante en el clon de hibridomas seleccionados. Tras
la centrifugación a 14.000 g, se resuspendió el precipitado.
Se añadió gota a gota al tubo de ensayo que
contenía el precipitado resuspendido una disolución al 1% de rojo
Congo en agua destilada.
Tras una incubación de una hora en hielo, se
llevó a cabo una siembra en placa sobre un portaobjetos que se
observó al microscopio óptico.
Claims (8)
1. Aczima o fragmento de la misma que tiene
actividad proteasa contra el péptido
A\beta_{1-42} agregado en conformación de
lámina \beta, obteniéndose dicha aczima mediante inmunización con
el péptido A\beta_{1-42} agregado en
conformación de lámina \beta.
2. Fragmento según la reivindicación 1, que se
selecciona de ScFv y Fab.
3. Procedimiento para la preparación de una
aczima según la reivindicación 1, que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- inmunizar un animal no humano con el péptido A\beta_{1-42} agregado en conformación de lámina \beta;
- b)
- obtener hibridomas;
- c)
- seleccionar los hibridomas por su actividad proteasa;
caracterizado porque la selección de la
etapa c) se lleva a cabo poniendo en contacto los hibridomas con un
reactivo de tinción que revela que ha tenido lugar la reacción
catalítica en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la etapa de inmunización se realiza con
A\beta_{1-42} sintético agregado en
conformación de lámina \beta.
5. Composiciones farmacéuticas que contienen una
cantidad eficaz de la aczima o fragmento de la misma según la
reivindicación 1 ó 2.
6. Uso de la aczima o fragmento de la misma
según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento
útil para el tratamiento o la prevención de patologías
caracterizadas por la presencia de agregados de proteína que
comprenden el péptido A\beta_{1-42} en
conformación de lámina \beta.
7. Uso según la reivindicación 6, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de
la enfermedad de Alzheimer.
8. Uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que
el fragmento se selecciona de ScFv y Fab.
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